KR20210145136A

KR20210145136A - Cd3 결합 분자

Info

Publication number: KR20210145136A
Application number: KR1020217028751A
Authority: KR
Inventors: 피어터 포코 반 루
Original assignee: 메뤼스 엔.페.
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2021-12-01
Also published as: US20220356251A1; JP2022527935A; JP2023179541A; WO2020204708A1; IL286013A; EP3947456A1; CA3133624A1; AU2020254215A1; MX2021010877A; SG11202109535SA; BR112021018632A2; TW202039578A

Abstract

본 발명은 인간 CD3에 특이적인 중쇄 가변 영역, 결합 도메인 및 항체, 및 CD3 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암 또는 자가면역 질환의 치료에서 본 발명의 CD3 결합 단백질, 바람직하게는 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

CD3 결합 분자

본 발명은 항체 분야, 특히 치료적 항체 분야에 관한 것이다. 항체는 인간의 치료에 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 종양의 치료를 위한 항체 및 바람직하게는 이중특이성 또는 다중특이성 항체에 관한 것이다.

인간 CD3에 결합하는 단일클론 항체는 인간에서 치료적 용도로 개발된 최초의 항체 중 하나이다. 단일클론 CD3 결합 항체는 전형적으로, 예를 들어 이식 거부반응에서, 그의 면역 억제 특성에 사용된다. T 세포 상의 CD3 및 암 세포 상의 표면 표적 항원에 대해 이중특이성인 항체는 T-세포 수용체 특이성, 공동자극 또는 펩티드 항원 제시와 무관하게 어떤 종류의 T 세포라도 암 세포에 연결할 수 있다. 이러한 이중특이성 T-세포 결합 항체는 다양한 암 및 종양성 증식의 치료에 있어서 큰 가능성을 보여준다.

본 발명의 목적은, T-세포 및 이펙터 세포 결합을 위한 면역-종양학 적용에 적합한, 상대적으로 낮은 친화도를 갖는, 반드시 양이 아닌 종류에서 특성이 개선된 CD3 결합 특성과 더 높은 세포독성을 갖는 새로운 항체, 및 역으로, T-세포 및 이펙터 세포 하향-조절을 위한 자가면역 적용에 적합한, 상대적으로 높은 친화도를 갖는 CD3 결합과 더 낮은 세포독성을 갖는 새로운 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 적어도 하나의 추가의 막 관련 분자에 결합하는 상기 특성을 갖는 T-세포 결합 CD3 결합 단백질 및 항체를 제공하는 것이다.

본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : SFGIS

CDR2 : GFIPVLGTANYAQKFQG

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는

하기 아미노산 서열:

CDR1 : SX₁TFTIS;

CDR2 : GIIPX₂FGTITYAQKFQG;

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하고;

여기서,

X₁ = K 또는 R;

X₂ = L 또는 I이다.

바람직한 실시 형태에서, X₁ = K; 및 X₂ = L이다.

다른 바람직한 실시 형태에서, X₁ = R; 및 X₂ = I이다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : SKTLTIS;

CDR2 : GIIPIFGSITYAQKFQD;

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는

하기 아미노산 서열:

CDR1 : GSGIS;

CDR2 : GFIPFFGSANYAQKFRD;

CDR3 : RGNWNPX₁₃DP를 포함하고;

여기서,

X₁₃ = L 또는 F이다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRSFGISWVRQAPGQGLEWMGGFIPVLGTANYAQKFQGRVTIIADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS;

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDAFKSKTFTISWVRQAPGQGLEWLGGIIPLFGTITYAQKFQGRVTITADKSTNTAFMELSSLRSEDTAMYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS;

EVQLVQSGSELKKPGSSVKVSCKASGVTFNSRTFTISWVRQAPGQGLEWLGSIIPIFGTITYAQKFQGRVTITADKSTSTAFMELTSLRSEDTAIYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS;

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRGSGISWVRQAPGQGLEWVGGFIPFFGSANYAQKFRDRVTITADKSATTAYMELSSLRSEDTAIYYCAKRGNWNPLDPWGQGTLVTVSS;

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGVTFKSKTLTISWVRQAPGQGLEWLGGIIPIFGSITYAQKFQDRVSITADKSTNTAYLELNSLRSEDTAIYYCARRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS; 또는

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRGSGISWVRQAPGQGLEWVGGFIPFFGSANYAQKFRDRVTITADKSATTAYMELSSLRSEDTAIYYCAKRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS를 포함하고;

상기 아미노산 서열은 CDR 이외의 하나 이상의 위치에서, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다.

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체가 추가로 제공되며, 여기서 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : RX₃WIG;

CDR2 : IIYPGDSDTRYSPSFQG;

CDR3 : X₄IRYFX₅WSEDYHYYX₆DV를 포함하고;

여기서,

X₃ = F 또는 Y;

X₄ = H 또는 N;

X₅ = D 또는 V;

X₆ = L 또는 M이다.

일 실시 형태에서, X₃ = F; X₄ = H; X₅ = D; 및 X₆ = L이다. 다른 실시 형태에서, X₃ = Y; X₄ = N; X₅ = V; 및 X₆ = M이다.

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTRFWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSTSTAYLQWSSLKASDTGMYYCVRHIRYFDWSEDYHYYLDVWGKGTTVTVSS; 또는

EVQLVESGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTRYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCVRNIRYFVWSEDYHYYMDVWGKGTTVTVSS를 포함하고;

CDR1 : SYALS;

CDR2 : GISGSGRTTWYADSVKG;

CDR3 : DGGYSYGPYWYFDL을 포함한다.

CDR1 : SYALS;

CDR2 : AISGSGRTTWYADSVKG;

CDR3 : DGGYTYGPYWYFDL을 포함한다.

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체가 추가로 제공되며, 여기서 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:

QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFKFSSYALSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS; 또는

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFISYALSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYTYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS를 포함하고;

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체가 또한 제공되며, 여기서 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : DYTMH;

CDR2 : DISWSSGSIGYADSVKG;

CDR3 : DHRGYGDYEGGGFDY를 포함한다.

CDR1 : DYTMH;

CDR2 : DISWSX₇GX₈X₉X₁₀YADSVKG;

CDR3 : DHX₁₁GYGDYEGGGFDX₁₂를 포함하고;

여기서,

X₇ = S 또는 G;

X₈ = S 또는 T;

X₉ = I 또는 T;

X₁₀ = G 또는 Y;

X₁₁ = R 또는 M;

X₁₂ = H 또는 Y이다.

일 실시 형태에서, X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 S, S, I 및 G이고, X₁₁ 및 X₁₂는 R 및 H이다. 다른 실시 형태에서, X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 G, S, I 및 Y이고, X₁₁ 및 X₁₂는 R 및 Y이다. 다른 실시 형태에서, X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 S, T, T 및 G이고, X₁₁ 및 X₁₂는 M 및 Y이다.

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFNFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLWLQMNSLRTEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS; 또는

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDHWGQGTLVTVSS; 또는

EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGRGTLVTVSS; 또는

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVTSGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGTTGYADSVKGRFTISRDNAKDSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDHMGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS를 포함하고;

본 발명의 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체 내의 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 공통 경쇄 가변 영역을 포함한다. 공통 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 IgVκ1-39 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 생식세포계열 IgVκ1-39*01 가변 영역이다. 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. 일 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 인간 생식세포계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. 상기 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 하기 아미노산 서열:

DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK 또는 DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK를 포함하고

아미노산 서열은 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다.

항원-결합 단백질은 바람직하게는 항체, 바람직하게는 이중특이성 또는 다중특이성 항체이다.

상기 항체는 바람직하게는 본 명세서에 표시된 바와 같은 인간 CD3에 결합하는 H/L 사슬 조합, 및 종양-항원에 결합하는 H/L 사슬 조합을 포함한다. 종양-항원에 결합하는 상기 H/L 사슬 조합은 바람직하게는 인간 BCMA, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CD44, CD123, CD138, CEA, CLEC12A, CS-1, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, DLL3, LGR5, MSLN, FOLR1, FOLR3, HER2, HM1.24, MCSP, PD-L1, PSMA 단백질 또는 이의 변이체, 바람직한 실시 형태에서, EGFR, PD-L1 또는 CLEC12A에 결합한다.

항체, 이중특이성 또는 다중특이성 항체는 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다.

이중특이성 또는 다중특이성 항체는 바람직하게는 양립가능한 이종이량체화 도메인을 갖는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 상기 양립가능한 이종이량체화 도메인들은 바람직하게는 양립가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 이종이량체화 도메인들이다.

이중특이성 또는 다중특이성 항체는 바람직하게는 Fc-감마 수용체에 대한 이중특이성 또는 다중특이성 IgG 항체의 상호작용이 감소되게 하는 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인을 갖는 IgG 항체이다. 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인은 바람직하게는 (EU 넘버링에 따라) 위치 235 및/또는 236에서의 아미노 치환, 바람직하게는 L235G 및/또는 G236R 치환을 포함한다.

이중특이성 또는 다중특이성 항체는 바람직하게는 공통 경쇄를 포함한다.

본 발명은 추가로, 본 명세서에 표시된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 항체를, 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위해, 제공한다. 대상체는 바람직하게는 암에 걸렸거나 암 치료를 받는다. MF8057, MF8058, MF8078, 또는 MF8508의 CDR 및/또는 VH 서열을 갖는 항원-결합 단백질 또는 항체, 또는 0 내지 10개의 아미노산 치환, 변이, 삽입, 부가 또는 결실을 갖는 이의 변이체는 치료, 특히 항원-결합 단백질 또는 항체의 국소 투여 및/또는 국소 방출을 포함하는 치료에 바람직하다. MF9249, MF9267, MF8397의 CDR 및/또는 VH 서열을 갖는 항원-결합 단백질 또는 항체, 또는 0 내지 10개의 아미노산 치환, 변이, 삽입, 부가 또는 결실을 갖는 이의 변이체는 과활성 면역 시스템, 예컨대 자가면역 질환을 갖는 대상체의 치료에 바람직하다.

본 발명의 항체는, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 바람직하게는 이중특이성 항체이다. 이중특이성 항체는 바람직하게는 적어도 인간 CD3에 결합한다. 더욱이, 이중특이성 항체는 바람직하게는 인간 종양 세포에서 우선적으로 발현되는 적어도 표면 분자에 결합한다. 바람직한 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 BCMA, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CD44, CD123, CD138, CEA, CLEC12A, CS-1, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, DLL3, LGR5, MSLN, PD-L1, FOLR1, FOLR3, HER2, HM1.24, MCSP, 또는 PSMA에 결합한다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 EGFR 또는 CLEC12A에 결합한다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 EGFR 및 PD-L1에 결합한다.

본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.

추가로, 표지, 바람직하게는 생체내 이미징을 위한 표지를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 항체가 제공된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖거나 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료를 위한 방법을 제공한다. 종양을 갖거나 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이성 또는 다중특이성 항체가 또한 제공된다. 종양을 갖거나 종양을 가질 위험에 있는 대상체의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도가 추가로 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 종양은 EGFR 또는 CLEC12A 양성 종양 또는 EGFR 및 PD-L1 양성 종양이다.

도 1
기능적 활성의 평가: EGFRxCD3 이중특이성 항체에 의한 처리 시 BxPC3 표적 세포를 이용한 T 세포 세포독성 검정. 각각의 이중특이성 항체는 MF 번호로 지정된 중쇄 가변 영역으로 구성된 CD3 결합 도메인, 및 중쇄 가변 영역 MF8233을 포함하는 EGFR 결합 도메인을 포함한다. 이러한 가변 영역은 공통 경쇄와 쌍을 이루어 EGFRxCD3 이중특이성 항체를 형성한다. BxPC3 용해에 대한 친화도(HPB-ALL 결합). 본 발명의 소정 항체는 항체의 CD3 결합 도메인이 비교적 낮은 친화도로 인간 CD3에 결합함을 나타내는 HPB-ALL 세포에 대한 비교적 낮은 수준의 결합을 나타낸다. 상대적으로 낮은 친화도가 BxPC3 세포의 종양 항원 매개 T 세포 세포독성(BxPC3 용해, 수직 축)을 반드시 억제하지는 않는 것이 분명하다. 이중특이성 항체 MF8233 x MF8508 및 MF8233 x MF8057은 BxPC3 세포를 효율적으로 용해할 수 있는 반면, 이중특이성 항체 MF8233 x MF8397 및 MF8233 x MF9249는 유사한 결합을 가지면서도 그렇게 효율적으로 용해하지 못한다. 추가로, 이중특이성 항체 MF8233 x MF6955의 비교는 HPB-ALL(즉, 인간 CD3)에 더 높은 친화도로 결합하지만, CD3에 더 낮은 정도로 결합하는 이중특이성 항체 MF8233 x MF8508 및 MF8233 x MF8057보다 BxPC3 세포를 더 효율적으로 용해하지는 못한다. MF6955는, 공통 경쇄와 조합되어 비교 서열로서 사용되는 중쇄 가변 영역이며, US2014/0088295 A1호에서 H1H7232B(1129) VH에 상응한다. MF6955 및 동일한 EGFR 결합 도메인을 별개로 갖는 비교 이중특이성 항체는 MF9267보다 인간 CD3에 대해 더 높은 친화도를 갖고, MF9267보다 더 효율적인 사멸을 나타낸다. 대조적으로, MF8058과 같은 본 발명의 CD3 결합 도메인을 포함하는 다른 항체는 MF6955와 거의 동일한 결합 활성을 갖지만 MF8233 x MF8058과 같은 BxPC3 세포의 더 효율적인 사멸을 입증한다. CD3에 결합할 수 있는 본 발명의 결합 도메인을 포함하는 다른 이중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 특정 적용에 유용한 MF8233 x MF8078과 같은 상대적으로 높은 결합 및 더 효율적인 사멸을 입증한다. 반면에 CD3에 결합할 수 있는 본 발명의 결합 도메인을 포함하는 다른 이중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 대안적인 적용에 유용한 MF8233 x MF9249 및 MF8233 x MF8397과 같은 상대적으로 낮은 친화도 및 낮은 사멸을 입증한다.
도 2
항체 대조군이 없는 것과 비교하여 BxPC3 표적 세포의 T 세포 매개 사멸률(%)을 유도하는 능력을 나타내는 항체 적정 곡선. 항체 MF8233 x MF8078, MF8233 x MF8397; 및 MF8233 x MF8508에 대한 곡선이 도시되어 있다.
도 3
BxPC3 표적 세포에 의한 T 세포 세포독성에서 다양한 이중특이성 항체의 적정 곡선 데이터의 요약. CD3 Fab 컬럼은 CD3 결합 아암의 MF 번호를 나타낸다. EGFR 아암은 표시된 MF8233 번호를 갖는다. 컬럼은 동일한 VH 유전자 세그먼트에 기초하여 변이체를 제시하는 수퍼클러스터 번호를 나타낸다. CD3 결합을 나타내는 컬럼은 HBP-ALL 결합 실험의 결과를 반영한다.
BxPC3 표적 세포의 T 세포 매개 용해를 유도하는 능력을 결정하기 위한 2개의 독립적인 세포독성 검정의 결과를 나타낸다.
도 4
발현을 갖는 CD8+ T 세포 상의 BxPC3 표적 세포를 이용한 T 세포독성 검정에서의 T 세포 활성화. 변이 CD3 결합 도메인을 제시하는 다양한 수퍼클러스터 번호의 항체 적정 곡선. 이중특이성 항체의 다른 아암은 MF8233의 중쇄 결합 도메인을 갖는다. 비교를 위해, 이중특이성 항체 MF8233 x MF6955 및 MF8233 x MF6964를 또한 시험하였으며, 여기서 MF6955 및 MF6964는, 공통 경쇄와 결합되고 비교 서열로서 사용되는 중쇄 가변 영역이며, 각각 US2014/0088295 A1호에서 H1H7232B (1129) VH 및 HH7241B (1145)에 상응한다.
도 5
BxPC3 표적 세포를 이용한 T 세포 활성화 T 세포 세포독성 검정에서 다양한 항체의 적정 곡선 데이터의 요약. MF 번호 컬럼은 CD3 결합 도메인의 MF 번호를 나타낸다. EGFR 결합 도메인은 표시된 MF8233 번호를 갖는다. 다양한 CD3 결합 도메인 서열의 수퍼클러스터 정보는 "수퍼클러스터" 컬럼에 표시된다. CD3 친화도를 나타내는 컬럼은 HBP-ALL 결합 실험의 결과를 반영한다.
CD4+ 및 CD8+ 세포의 결과는 마커 CD69 및 CD25에 대해 나타난다. 표시된 이중특이성 항체는 이중특이성 항체의 더 큰 풀로부터의 예이다.
도 6
기능적 활성 평가: BxPC3 표적 세포를 이용한 T 세포 세포독성 검정. CD69 발현에 의해 측정된 CD8+ T 세포 활성화에 대한 친화도(HPB-ALL 결합) 본 발명의 소정 항체는 항체의 CD3 결합 도메인이 비교적 낮은 친화도로 인간 CD3에 결합함을 나타내는 HPB-ALL 세포에 대한 상대적으로 낮은 수준의 결합을 나타낸다. 이러한 친화도가 CD8 양성 CD69 활성화 분석의 결과에 의해 예시된 바와 같이 종양 항원 매개 T-세포 활성화를 반드시 억제하지는 않는다. 이중특이성 항체 MF8233 x MF8508 및 MF8233 x MF8057은 T 세포를 효율적으로 활성화시킬 수 있는 반면, 이중특이성 항체 MF8233 x MF8397 및 MF8233 x MF9249는 그렇게 효율적으로 활성화시키지 못한다. 이러한 세포에 효율적으로 결합하지 못하는 소정 CD3 결합 도메인은 또한 T 세포를 활성화시키지 못한다(하부 좌측 코너를 참조). 반면에 비교 CD3 결합 도메인 MF6955보다 HPB-ALL 세포에 덜 결합하는 다른 CD3 결합 도메인 MF8508 및 MF8057은, 예를 들어, T 세포를 유사한 정도로 활성화시킨다. CD3에 결합할 수 있는 본 발명의 결합 도메인을 포함하는 다른 이중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 특정 적용에 사용되는 MF8078과 같은 상대적으로 높은 결합 및 높은 수준의 활성화를 입증한다. 반면에 CD3에 결합할 수 있는 본 발명의 결합 도메인을 포함하는 다른 이중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 대안적인 적용에 유용한 MF9249 및 MF8397과 같은 상대적으로 낮은 친화도 및 낮은 활성화를 입증한다.
도 7
기능적 활성 평가: HCT116 표적 세포를 이용한 T 세포 세포독성 검정. HCT-116 용해에 대한 친화도(HPB-ALL 결합).
본 발명의 소정 이중특이성 항체는 항체의 CD3 결합 도메인이 비교적 낮은 친화도로 인간 CD3에 결합함을 나타내는 HPB-ALL 세포에 대한 낮은 수준의 결합을 나타낸다. 낮은 친화도가 HCT-116 세포의 종양 항원 매개 세포 용해(수직 축)를 반드시 억제하지는 않는 것이 분명하다. 이중특이성 항체 MF8233 x MF8508 및 MF8233 x MF8057은 HCT-116 세포를 효율적으로 용해할 수 있는 반면, 이중특이성 항체 MF8233 x MF8397 및 MF8233 x MF9249는 그렇게 효율적으로 용해하지 못한다. 비교를 위해, 이중특이성 항체 MF8233 x MF6955 및 MF8233 x MF6964는, 본 명세서에 제시된 바와 같은 시험에서, 예를 들어 MF8233 x MF8508, MF8233 x MF8057 및 MF8233 x MF9267보다 더 높은 친화도로 HPB-ALL(즉, 인간 CD3)에 결합하지만, 결합 차이에 대해 MF8233 x MF8508 또는 MF8233 x MF9267보다 더 효율적으로, 또는 MF8233 x MF8057보다 더 유의하게 HCT-116 셀을 용해하지 못한다. CD3에 결합할 수 있는 본 발명의 결합 도메인을 포함하는 다른 이중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 특정 적용에 사용되는 MF8078과 같은 상대적으로 높은 결합 및 높은 수준의 사멸을 입증한다. 반면에 CD3에 결합할 수 있는 본 발명의 결합 도메인을 포함하는 다른 이중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 대안적인 적용에 유용한 MF9249 및 MF8397과 같은 상대적으로 낮은 친화도 및 낮은 사멸을 입증한다.
도 8
항체 대조군이 없는 것과 비교하여 HCT-116 세포의 사멸률(%)을 나타내는 HCT-116 표적 세포를 이용한 T 세포 세포독성 검정에서의 항체 적정 곡선. 다양한 이중특이성 항체에 대한 곡선이 나타나 있다.
도 9
HCT-116 표적 세포를 이용한 T 세포 세포독성 검정에서 다양한 항체의 적정 곡선 데이터의 요약. CD3 Fab 컬럼은 CD3 결합 도메인의 MF 번호를 나타낸다. EGFR 결합 도메인은 표시된 MF8233 번호를 갖는다. 컬럼은 동일한 VH 유전자 세그먼트에 기초하여 변이체를 제시하는 수퍼클러스터 번호를 나타낸다. CD3 결합을 나타내는 컬럼은 HBP-ALL 결합 실험의 결과를 반영한다.
HCT-116 세포의 용해 백분율 및 용해에 대한 EC50 값(ng/mL)은 다음 컬럼에 표시되어 있다. 표시된 이중특이성 항체는 이중특이성 항체의 더 큰 풀로부터의 예이다.
도 10
도 10a 및 도 10b는 MV1624 발현 벡터 및 MV1625 발현 벡터의 개략도를 제시한다.
도 11
단일특이성 및 이중특이성 IgG에 사용되는 공통 경쇄.
도 11a: 공통 경쇄 아미노산 서열. 도 11b: 공통 경쇄 가변 도메인 DNA 서열 및 번역(IGKV1-39/jk1). 도 11c: 공통 경쇄 불변 영역 DNA 서열 및 번역. 도 11d: IGKV1-39/jk5 공통 경쇄 가변 도메인 번역. 도 11e: V-영역 IGKV1-39A; 도 11f: 공통 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3.
도 12
이중특이성 분자의 생성을 위한 IgG 중쇄. 도 12a: CH1 영역. 도 12b: 힌지 영역. 도 12c: CH2 영역. 도 12d: L235G 및 G236R 침묵 치환을 함유하는 CH2. 도 12e: 치환 L351K 및 T366K(KK)를 함유하는 CH3 도메인. 도 12f; 치환 L351D 및 L368E(DE)를 포함하는 CH3 도메인.
도 13
명세서에 기재된 중쇄 가변 영역 및 이의 일부를 인코딩하는 다양한 DNA의 서열 및 그의 아미노산 서열.
도 14
클론 MF8057 및 MF8058과 비교하여 수퍼클러스터 1로부터의 추가 클론의 특성화. 도 14a: FACS 검정에서 인간 CD3-TCR 복합체를 발현하는 HPB-ALL 인간 세포와 선택된 MF 클론의 결합 도 14b: HCT-116 세포의 사멸률(%)을 나타내는 HCT-116 세포를 이용한 T 세포 세포독성 검정. 도 14c 내지 도 14e: T 세포 활성화를 나타내는 FACS에서 활성화 마커 CD25 및 CD69의 정량화. 도 14f 및 도 14g: 세포독성 검정으로부터의 상청액에서의 사이토카인 생성.
도 15
수퍼클러스터 4로부터의 클론의 특성화. 도 15a: HPB-ALL 인간 세포에 대한 선택된 MF 클론의 결합. 도 15b: BXP3 세포의 사멸률(%)을 나타내는 BxPC3 세포를 이용한 T 세포 세포독성 검정. 도 15c 내지 도 15e: 세포독성 검정으로부터의 상청액에서의 사이토카인 생성.
도 16
CD3 기능적 활성의 평가. 도 16a: 수퍼클러스터 1(MF8048, MF8101, MF8056), 수퍼클러스터 3(MF8562) 및 수퍼클러스터 4(MF8998)로부터의 추가 클론에 대한, Y-축의 HCT-116 용해에 대한 X-축의 친화도(HPB-ALL). 도 16b: 세포독성 검정 및 상이한 결합 친화도에서 유사한 활성을 나타내는 수퍼클러스터 1 및 수퍼클러스터 4에 속하는 항체. 도 16c: 유사한 결합 친화도 및 차등 용해 활성을 나타내는 수퍼클러스터 1 및 수퍼클러스터 3에 속하는 항체.
도 17
이중특이성 CD3xEGFR 포맷에서 CD3 Fab MF8998 및 MF8058의 활성.
도 18
CD3에 특이적인 IgG의 대형 패널의 FACS 결합 데이터. 항체 MF5196, MF6955 및 MF6964의 경우, 결합은 CD3δε-Fc 항원 상의 BIAcore™에 의해 결정된 반면, HPB-ALL 세포에 대한 FACS 결합 데이터는 나머지 클론에 대해 나타난다.
도 19
인간 CLEC12A의 뉴클레오티드 서열.
도 20
인간 CD3γ-, δ-, ε- 및 ζ-사슬의 아미노산 서열.

"항체"는 항원 상의 에피토프와 결합하는 하나 이상의 도메인을 함유하는, 단백질의 면역글로불린 부류에 속하는 단백질성 분자이며, 여기서 그러한 도메인은 항체의 가변 영역으로부터 유래되거나 그와 서열 상동성을 공유한다.

항체 결합은 특이성 및 친화성을 포함하여 다양한 특성을 갖는다. 특이성은 어느 항원 또는 그의 에피토프가 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는지를 결정한다. 친화도는 특정 항원 또는 에피토프에 대한 결합의 강도에 대한 척도이다. 본 명세서에서, 항체의 '특이성'은 특정 항원에 대한 그의 선택성을 지칭하는 반면에, '친화성'은 항체의 항원 결합 부위와 이것이 결합하는 에피토프 간의 상호작용 강도를 지칭한다는 것에 주목하는 것이 편리하다. 항체는 전형적으로 기본 구조 단위들로 구성되며, 이들 각각은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는다. 치료적 용도를 위한 항체는 바람직하게는 가능한 한 치료하고자 하는 대상체의 천연 항체와 근접한다(예를 들어, 인간 대상체의 경우 인간 항체). 본 발명에 따른 항체는 임의의 특정 포맷 또는 그의 생성 방법으로 제한되지 않는다.

따라서, 본 명세서에서 사용되는 "결합 특이성"은 항원결정기와 반응하는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체의 결합 부위는 가변 도메인, 가변 도메인을 포함하는 Fab 부분에 위치되고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로 구성된다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 IgG 항체, 바람직하게는 IgG1 항체이다. 전장 IgG 항체는 그의 유리한 반감기 및 면역원성의 이유로 완전 자가 (인간) 분자에 가깝게 유지하려고 바라기 때문에 바람직할 수 있다. IgG1은 인간에서의 그의 긴 순환 반감기에 기초하여 유리하다. 인간에서의 면역원성을 방지하거나 회피하기 위하여, 본 발명에 따른 이중특이성 전장 IgG 항체는 인간 IgG1인 것이 바람직하다.

"이중특이성 항체"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체로서, 여기서 항체의 하나의 가변 도메인은 제1 항원에 결합하고, 한편 항체의 제2 가변 도메인은 제2 항원에 결합하며, 상기 제1 항원과 제2 항원은 동일하지 않다. 용어 "이중특이성 항체"는 또한, 항체의 하나의 가변 도메인이 항원 상의 제1 에피토프에 결합하는 한편 항체의 제2 가변 도메인이 항원 상의 제2 에피토프에 결합하는 이중파라토프성(biparatopic) 항체를 포함한다. 이 용어는 적어도 하나의 VH가 제1 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, 면역글로불린 가변 도메인 내에서 적어도 하나의 VH와 쌍을 이룬 VL이 제2 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 추가로 포함한다. 생성된 VH/VL 쌍은 항원 1 또는 항원 2에 결합할 것이고, 예를 들어 WO 2008/027236호, WO 2010/108127호 및 문헌[Schaefer et al (Cancer Cell 20, 472-486, October 2011)]에 기재되어 있는 "투-인-원(two-in-one) 항체"로 지칭된다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 임의의 특정 이중특이성 포맷 또는 그의 생성 방법으로 제한되지 않는다. 이중특이성 항체는 다중특이성 항체이다.

본 명세서에서 언급된 바와 같은 다중특이성 다량체 또는 항체는 항원 상의 에피토프에 결합하는 2개 이상의 도메인을 함유하는 면역글로불린 부류의 단백질에 속하는 단백질성 분자를 포함하는데, 여기서 이러한 도메인은 항체의 가변 영역으로부터 유래되거나 항체의 가변 영역과 서열 상동성을 공유하고, WO2019/190327호에 기재된 것을 포함한 당업계에 공지된 바와 같은 3개 이상의 항원에 결합하는 단백질성 분자를 포함한다.

"항원"은 숙주 생물에서 (항체를 생성하기 위해) 면역반응을 유도할 수 있고/있거나 항체에 의해 표적화될 수 있는 분자이다. 분자 레벨에서, 항원은 항체의 항원 결합 부위에 의해 결합되는 그의 능력을 특징으로 한다. 또한, 항원의 혼합물은 '항원'으로 간주될 수 있는데, 즉, 당업자는 때때로 종양 세포 용해물 또는 바이러스 입자가 '항원'으로 표시될 수 있는 반면에, 이러한 종양 세포 용해물 또는 바이러스 입자 제제는 많은 항원결정기가 존재한다는 것을 인식할 것이다. 항원은 하나 이상의, 그러나 종종 더 많은 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 결합 단백질 및 항체의 경우, 항원은 전형적으로 세포막과 회합되고, 세포막의 세포외 부분 상에 존재한다.

"에피토프" 또는 "항원결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위이다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩(tertiary folding)에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다(각각, 직선상 및 입체구조 에피토프라고 함). 연속 선형 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출되면 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리하면 입체구조가 상실된다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간 입체구조 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함할 수 있다.

용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하며, 달리 명시되지 않는 한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 용어 "중쇄 가변 도메인"은 달리 명시되지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인(N 말단에서 C 말단까지) 다음에, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능성 단편은 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, 하나 이상의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다.

용어 "경쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 또는 V_L, 또는 이의 기능성 단편; 및 면역글로불린 불변 도메인, 또는 C_L, 또는 이의 기능성 단편 서열을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "경쇄"는 인간 카파, 람다 및 이들의 조합으로부터 선택되는 경쇄를 포함할 수 있다. 경쇄 가변(V_L) 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 전형적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 V_L 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 경쇄는 예를 들어, 중쇄에 의해 선택적으로 결합된 에피토프에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다.

본 발명의 항체에 사용하기에 적합한 경쇄는 기존 항체 라이브러리(습식 라이브러리 또는 인실리코(in silico))에서 가장 일반적으로 사용되는 경쇄를 스크리닝하여 확인될 수 있는 것과 같은 공통 경쇄(cLC)를 포함하며, 경쇄는 중쇄의 에피토프-결합 도메인의 친화성 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않지만, 다수의 중쇄와 페어링되는 데에도 적합하다. 예를 들어, 적합한 경쇄는 게놈에 통합된 공통 경쇄를 갖는 형질전환 동물, 예컨대 MeMo®로부터의 것을 포함하고, 이는 중쇄에 다양성을 갖고 상기 항원에 노출시 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 공통 경쇄 항체의 대형 패널을 생성하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 용어 "공통 경쇄"는 동일할 수 있거나, 본 발명의 항체의 결합 특이성에 영향을 주지 않으면서 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있으며, 즉, 상기 차이가 기능성 결합 영역의 형성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 경쇄를 지칭한다.

예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 공통 경쇄의 정의의 범위 내에서는, 예를 들어 보존적 아미노산 변화, 동족 사슬과 페어링할 때에 결합 특이성에 기여하지 않거나 단지 부분적으로 기여하는 영역 내에서의 아미노산의 변화 등을 도입 및 시험함으로써, 동일하지 않지만 여전히 기능적으로 등가인 가변 사슬을 제조하거나 찾아내는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 변이체는 또한 다양한 동족 사슬에 결합하고, 기능성 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 용어 '공통 경쇄'는 동일할 수 있거나, 중쇄와 페어링한 후에 생성된 항체의 결합 특이성을 유지하면서 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있는 경쇄를 지칭한다. 특정 공통 경쇄와 이러한 기능적으로 동등한 변이체의 조합은 용어 "공통 경쇄" 내에 포함된다. 공통 경쇄의 사용에 대한 상세한 설명을 위해 WO2004/009618호 및 WO2009/157771호를 참조한다.

"Fab"는 가변 영역을 포함하는 결합 도메인, 전형적으로 페어링된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 의미한다. Fab는 불변 경쇄 도메인(CL) 및 VL 도메인과 페어링된 CH1 및 VH 도메인을 포함하는 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 페어링은 예를 들어, CH1 및 CL 도메인에서의 다이설파이드 가교를 통한 공유결합으로서 일어날 수 있다.

"단일쇄 가변 단편"(scFv)은 링커, 예를 들어 펩티드 링커, 예를 들어 약 10 내지 약 25개의 아미노산 길이의 링커를 통해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 결합 도메인을 의미한다.

본 발명에 따른 용어 '전장 IgG' 또는 '전장 항체'는 본질적으로 완전한 IgG를 포함하는 것으로 정의되지만, 이것은 반드시 온전한 IgG의 모든 기능을 갖는 것은 아니다. 오해를 피하기 위하여, 전장 IgG는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유한다. 각각의 사슬은 불변(C) 및 가변(V) 영역을 함유하며, 이들은 CH1, CH2, CH3, VH, 및 CL, VL로 지정된 도메인들로 분해될 수 있다. IgG 항체는 Fab 부분 내에 함유된 가변 영역 도메인을 통해 항원에 결합하고, 결합 후에는 불변 도메인을 통해, 대개 Fc 부분을 통해 면역 시스템의 분자 및 세포와 상호작용할 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 원하는 특성을 제공하는 돌연변이가 존재할 수 있는 IgG 분자를 포함한다. 전장 IgG는 임의의 이들 영역의 실질적인 부분의 결실을 가져서는 안 된다. 그러나, 생성된 IgG 분자의 결합 특성을 본질적으로 변경하지 않으면서, 한 개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 결실된 IgG 분자는 용어 "전장 IgG"에 포함된다. 예를 들어, 이러한 IgG 분자는, 바람직하게는 비-CDR 영역 내에 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 결실을 가질 수 있으며, 이때 결실된 아미노산은 IgG의 결합 특이성에 필수적이지 않다.

본 명세서에서 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 언급될 때 "퍼센트(%) 동일성"은 최적의 비교 목적을 위하여 선택된 서열과 후보 서열을 정렬시킨 후, 선택된 서열 내의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 잔기의 백분율로서 정의된다. 2개의 서열 사이의 정렬을 최적화하기 위하여, 비교되는 2개의 서열 중 임의의 서열 내에 2개의 서열 갭(gap)이 도입될 수 있다. 그러한 정렬은 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 수행될 수 있다. 대안적으로, 정렬은 더 짧은 길이에 걸쳐, 예를 들어 약 20개, 약 50개, 약 100개 또는 그 이상의 핵산/기반 또는 아미노산에 걸쳐 수행될 수 있다. 서열 동일성은 보고된 정렬 영역에 걸쳐 2개의 서열 사이의 동일한 매치의 백분율이다.

서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 서열 동일성의 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 몇몇 상이한 컴퓨터 프로그램이 2개의 서열을 정렬하고 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하는 데 이용가능하다는 사실을 인식하고 있을 것이다(문헌[Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley]).

본 명세서에서 제시된 발명 및 서열을 위해,

2개의 핵산 서열 사이의 서열 동일성 백분율은 디폴트 설정을 사용하는 Vector NTI Program Advance 10.5.2 소프트웨어의 AlignX 응용 프로그램을 사용하여 결정될 수 있고, 디폴트 설정은 변형된 ClustalW 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680]), swgapdnarnt 스코어 매트릭스, 15의 갭 개방 패널티 및 6.66의 갭 연장 패널티를 사용한다. 아미노산 서열은 디폴트 설정을 사용하는 Vector NTI Program Advance 11.5.2 소프트웨어의 AlignX 응용 프로그램을 사용하여 정렬될 수 있고, 디폴트 설정은 변형된 ClustalW 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J., 1994]), blosum62mt2 스코어 매트릭스, 10의 갭 개방 패널티 및 0.1의 갭 연장 패널티를 사용한다.

본 명세서에서 용어 "수퍼-클러스터" 또는 "수퍼클러스터"는, 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고 HCDR3의 적어도 70% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이를 갖는 클론들의 집단, 및 이들이 생성할 수 있는 결합 도메인을 지칭하는 데 사용된다.

따라서, 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고 HCDR3의 적어도 70% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이를 갖는 클론들의 집단, 및 이들이 생성할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 "수퍼-클러스터" 또는 "수퍼클러스터"를 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 서열 동일성은 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 서열 동일성이며, 단, HCDR3 서열 DGGYSYGPYWYFDL 및 DHRGYGDYEGGGFDY를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론, HCDR2 서열 GFIPVLGTANYAQKFQG, GIIPLFGTITYAQKFQG, 및 SIIPIFGTITYAQKFQG를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 배제되거나, 단, VH 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFKFSSYALSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS;

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFNFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLWLQMNSLRTEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS;

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDAFKSKTFTISWVRQAPGQGLEWLGGIIPLFGTITYAQKFQGRVTITADKSTNTAFMELSSLRSEDTAMYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS;및

EVQLVQSGSELKKPGSSVKVSCKASGVTFNSRTFTISWVRQAPGQGLEWLGSIIPIFGTITYAQKFQGRVTITADKSTSTAFMELTSLRSEDTAIYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS

를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 배제되거나, 단, 상기 집단으로부터의 클론이 이중특이성 항체에 의해 포함되거나 포함되도록 설계된 HCDR3을 코딩하는 핵산을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "수퍼-클러스터 1" 또는 "수퍼클러스터 1"은, 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용(VH1-69)에 기초하고 그 수퍼클러스터의 구성원에 대해 HCDR3의 적어도 70% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이를 갖는 클론들의 집단, 및 이들이 생성할 수 있는 결합 도메인을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어 MF8048, MF8056, MF8057, MF8058, MF8078 및 MF8101이 포함된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서의 항-CD3 항체는 VH1-69의 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고/하거나 HCDR3의 적어도 80% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 더욱 바람직하게는 HCDR3의 90% 또는 가장 바람직하게는 95% 동일성을 갖는다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서의 항-CD3 항체는 VH1-69의 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고/하거나 인코딩된 CDR3 세그먼트 RGNWNPFDP와 비교하여 HCDR3의 적어도 80% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 바람직하게는 HCDR3의 적어도 90% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 동일성 및 동일한 HCD3 길이를 갖고, 단, HCDR2 서열 GFIPVLGTANYAQKFQG, GIIPLFGTITYAQKFQG 및 SIIPIFGTITYAQKFQG를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 배제되거나, 단, VH 서열 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRSFGISWVRQAPGQGLEWMGGFIPVLGTANYAQKFQGRVTIIADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS;

를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 배제되거나, 단, 상기 집단으로부터의 클론이 이중특이성 항체에 의해 포함되거나 포함되도록 설계된 HCDR3을 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 용어 "수퍼-클러스터 3" 또는 "수퍼클러스터 3"은, 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용(VH3-23)에 기초하고 그 수퍼클러스터의 구성원에 대해 HCDR3의 적어도 70% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이를 갖는 클론들의 집단, 및 이들이 생성할 수 있는 결합 도메인을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어 MF8397 및 MF8562가 포함된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서의 항-CD3 항체는 VH3-23의 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고/하거나 HCDR3의 적어도 80% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 더욱 바람직하게는 HCDR3의 90% 또는 가장 바람직하게는 95% 동일성을 갖는다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서의 항-CD3 항체는 VH3-23의 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고/하거나 인코딩된 CDR3 세그먼트 DGGYSYGPYWYFDL과 비교하여 HCDR3의 적어도 80% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 바람직하게는 HCDR3의 적어도 90% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 동일성 및 동일한 HCD3 길이를 갖고, 단, HCDR3 서열 DGGYSYGPYWYFDL을 인코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 배제되거나, 단, VH 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFKFSSYALSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS

본 명세서에서 용어 "수퍼-클러스터 4" 또는 "수퍼클러스터 4"는, 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용(VH3-9)에 기초하고 그 수퍼클러스터의 구성원에 대해 HCDR3의 적어도 70% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이를 갖는 클론들의 집단, 및 이들이 생성할 수 있는 결합 도메인을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어 MF8508, MF8998, MF10401 및 MF10428이 포함된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서의 항-CD3 항체는 VH3-9의 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고/하거나 HCDR3의 적어도 80% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 더욱 바람직하게는 HCDR3의 90% 또는 가장 바람직하게는 95% 동일성을 갖는다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서의 항-CD3 항체는 VH3-9의 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고/하거나 인코딩된 CDR3 세그먼트 DHRGYGDYEGGGFDY와 비교하여 HCDR3의 적어도 80% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 바람직하게는 HCDR3의 적어도 90% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 동일성 및 동일한 HCD3 길이를 갖고, 단, HCDR3 서열 DHRGYGDYEGGGFDY를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 배제되거나, 단, VH 서열 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFNFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLWLQMNSLRTEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS

본 명세서에서 용어 "수퍼-클러스터 7" 또는 "수퍼클러스터 7"은, 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용(VH5-51)에 기초하고 그 수퍼클러스터의 구성원에 대해 HCDR3의 적어도 70% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이를 갖는 클론들의 집단, 및 이들이 생성할 수 있는 결합 도메인을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어 MF9249 및 MF9267이 포함된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서의 항-CD3 항체는 VH5-51의 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고/하거나 HCDR3의 적어도 80% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 더욱 바람직하게는 HCDR3의 90% 또는 가장 바람직하게는 95% 동일성을 갖는다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서의 항-CD3 항체는 V H5-51의 동일한 VH V-유전자 세그먼트 사용에 기초하고/하거나 인코딩된 CDR3 세그먼트 HIRYFDWSEDYHYYLDV와 비교하여 HCDR3의 적어도 80% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 바람직하게는 HCDR3의 적어도 90% 서열 동일성 및 동일한 HCDR3 길이, 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 동일성 및 동일한 HCDR3 길이를 갖는다.

본 발명은 추가로,

- V-유전자 세그먼트 VH1-69; 또는

- 상기 V-유전자 세그먼트의 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 V-유전자 세그먼트 VH1-69의 변이체에 의해 인코딩되는 VH를 갖는 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 제공하는데;

여기서, VH는,

- MF8048, MF8056, MF8057, MF8058, MF8078 또는 MF8101의 HCDR3;

- 또는 상기 HCDR3에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 및 상기 HCDR3과 동일한 길이를 포함하는 상기 HCDR3의 변이체를 추가로 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 HCDR3의 변이체는 상기 HCDR3과 동일한 길이 및 상기 HCDR3에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 상기 HCDR3의 서열에 대해 적어도 90% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 V-유전자 세그먼트 VH1-69에 의해 인코딩되는 VH; 또는 HCDR2 서열 GFIPVLGTANYAQKFQG, 또는 GIIPLFGTITYAQKFQG 또는 SIIPIFGTITYAQKFQG를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH1-69의 변이체를 갖지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 V-유전자 세그먼트 VH1-69에 의해 인코딩되는 VH; 또는 VH 서열 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRSFGISWVRQAPGQGLEWMGGFIPVLGTANYAQKFQGRVTIIADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS; 또는

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDAFKSKTFTISWVRQAPGQGLEWLGGIIPLFGTITYAQKFQGRVTITADKSTNTAFMELSSLRSEDTAMYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS; 또는

EVQLVQSGSELKKPGSSVKVSCKASGVTFNSRTFTISWVRQAPGQGLEWLGSIIPIFGTITYAQKFQGRVTITADKSTSTAFMELTSLRSEDTAIYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH1-69의 변이체를 갖지 않는다.

본 발명은 추가로,

- V-유전자 세그먼트 VH3-23; 또는

- 상기 V-유전자 세그먼트의 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 V-유전자 세그먼트 VH2-23의 변이체에 의해 인코딩되는 VH를 갖는 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 제공하는데;

여기서, VH는,

- MF8397; 또는 MF8562의 HCDR3;

바람직한 실시 형태에서, 상기 HCDR3의 변이체는 상기 HCDR3과 동일한 길이 및 상기 HCDR3에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 상기 HCDR3의 서열에 대해 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 93% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 V-유전자 세그먼트 VH3-23에 의해 인코딩되는 VH; 또는 HCDR3 서열 DGGYSYGPYWYFDL을 갖는 V-유전자 세그먼트 VH3-23의 변이체를 갖지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 V-유전자 세그먼트 VH3-23에 의해 인코딩되는 VH; 또는 VH 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFKFSSYALSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH3-23의 변이체를 갖지 않는다.

본 발명은 추가로,

- V-유전자 세그먼트 VH3-9; 또는

- 상기 V-유전자 세그먼트의 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 V-유전자 세그먼트 VH3-9의 변이체에 의해 인코딩되는 VH를 갖는 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 제공하는데;

여기서, VH는,

- MF8508; MF8998; MF1041; 또는 MF10428의 HCDR3;

일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 V-유전자 세그먼트 VH3-9에 의해 인코딩되는 VH; 또는 HCDR3 서열 DHRGYGDYEGGGFDY를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH3-9의 변이체를 갖지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 V-유전자 세그먼트 VH3-9에 의해 인코딩되는 VH; 또는 VH 서열 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFNFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLWLQMNSLRTEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH3-9의 변이체를 갖지 않는다.

본 발명은 추가로,

- V-유전자 세그먼트 VH5-51; 또는

- 상기 V-유전자 세그먼트의 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 V-유전자 세그먼트 VH5-51의 변이체에 의해 인코딩되는 VH를 갖는 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 제공하는데;

여기서, VH는,

- MF9249 또는 MF9267의 HCDR3;

본 명세서에서 정의된 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 이중특이성 항체는 바람직하게는 PCT/NL2019/050199에서 정의된 바와 같은 CD3 결합 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체가 아니다.

본 발명은 추가로,

- V-유전자 세그먼트 VH1-69; 또는

- 상기 V-유전자 세그먼트의 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 V-유전자 세그먼트 VH1-69의 변이체에 의해 인코딩되는 VH를 제공하는데;

여기서, VH는,

- MF8048, MF8056, MF8057, MF8058, MF8078 또는 MF8101의 HCDR3;

일부 실시 형태에서, 상기 VH는 V-유전자 세그먼트 VH1-69에 의해 인코딩되는 VH; 또는 HCDR2 서열 GFIPVLGTANYAQKFQG, 또는 GIIPLFGTITYAQKFQG 또는 SIIPIFGTITYAQKFQG를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH1-69의 변이체가 아니다.

일부 실시 형태에서, 상기 VH는 V-유전자 세그먼트 VH1-69에 의해 인코딩되는 VH; 또는 VH 서열 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRSFGISWVRQAPGQGLEWMGGFIPVLGTANYAQKFQGRVTIIADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS; 또는

EVQLVQSGSELKKPGSSVKVSCKASGVTFNSRTFTISWVRQAPGQGLEWLGSIIPIFGTITYAQKFQGRVTITADKSTSTAFMELTSLRSEDTAIYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH1-69의 변이체가 아니다.

본 발명은 추가로,

- V-유전자 세그먼트 VH3-23; 또는

- 상기 V-유전자 세그먼트의 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 V-유전자 세그먼트 VH2-23의 변이체에 의해 인코딩되는 VH를 제공하는데;

여기서, VH는,

- MF8397; 또는 MF8562의 HCDR3;

일부 실시 형태에서, 상기 VH는 V-유전자 세그먼트 VH3-23에 의해 인코딩되는 VH; 또는 HCDR3 서열 DGGYSYGPYWYFDL을 갖는 V-유전자 세그먼트 VH3-23의 변이체가 아니다.

일부 실시 형태에서, 상기 VH는 V-유전자 세그먼트 VH3-23에 의해 인코딩되는 VH; 또는 VH 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFKFSSYALSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH3-23의 변이체가 아니다.

본 발명은 추가로,

- V-유전자 세그먼트 VH3-9; 또는

- 상기 V-유전자 세그먼트의 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 V-유전자 세그먼트 VH3-9의 변이체에 의해 인코딩되는 VH를 제공하는데;

여기서, VH는,

- MF8508; MF8998; MF10401; 또는 MF10428의 HCDR3;

일부 실시 형태에서, 상기 VH는 V-유전자 세그먼트 VH3-9에 의해 인코딩되는 VH; 또는 HCDR3 서열 DHRGYGDYEGGGFDY를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH3-9의 변이체가 아니다.

일부 실시 형태에서, 상기 VH는 V-유전자 세그먼트 VH3-9에 의해 인코딩되는 VH; 또는 VH 서열 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFNFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLWLQMNSLRTEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS를 갖는 V-유전자 세그먼트 VH3-9의 변이체가 아니다.

본 발명은 추가로,

- V-유전자 세그먼트 VH5-51; 또는

- 상기 V-유전자 세그먼트의 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 V-유전자 세그먼트 VH5-51의 변이체에 의해 인코딩되는 VH를 제공하는데;

여기서, VH는,

- MF9249 또는 MF9267의 HCDR3;

본 명세서에서 정의된 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 VH는 바람직하게는 PCT/NL2019/050199에서 정의된 바와 같은 CD3 결합 가변 도메인의 VH가 아니다.

또한, 항원-결합 단백질 또는 항체, 바람직하게는 이중특이성 항체가 제공되는데, 여기서 CDR은 청구된 바와 같은 CDR에 대해 70%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90% 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 형태에서, 항원-결합 단백질 또는 항체는 청구된 바와 같은 CDR에 대해 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하 및 더욱 바람직하게는 0개 이하의 아미노산 잔기 변이, 삽입, 치환, 결실 또는 부가를 갖는 CDR을 포함하는 이중특이성 항체이다.

항체에 의한 항원 결합은 전형적으로 항체의 상보성 영역 및 항원 및 가변 도메인 둘 모두의 특이적 3차원 구조를 통해 매개되는데, 특이적 3차원 구조는 이들 2개의 구조가 정밀하게 함께 결합될 수 있게 하며 (자물쇠 및 열쇠와 유사한 상호작용), 이는 항체의 랜덤 비특이적 점착(random, non-specific sticking)과 대조적이다. 항체는 전형적으로 항원의 에피토프를 인식하기 때문에, 그리고 그러한 에피토프는 다른 단백질에도 마찬가지로 존재할 수 있기 때문에, CD3 또는 CLEC12A에 결합하는 본 발명에 따른 항체는 다른 단백질도 마찬가지로, 그러한 다른 단백질이 동일한 에피토프를 함유하는 경우, 인식할 수 있다. 따라서, 용어 "결합하는"은 동일한 에피토프를 함유하는 다른 단백질 또는 단백질(들)에 대한 항체의 결합을 배제하지 않는다. 본 발명의 항체 내의 CD3에 결합하는 중쇄/경쇄 조합은 생후 인간, 바람직하게는 성인에서의 세포의 막 상의 다른 단백질에 결합하지 않는다. 본 발명의 CLEC12A, EGFR, PD-L1 또는 종양 세포 항원에 결합하는 중쇄/경쇄 조합은 생후 인간, 바람직하게는 성인에서의 세포의 막 상의 다른 단백질에 결합하지 않는다. 적합한 종양 항원 특이적 아암은 PCT/NL2019/050199에 개시되어 있다.

"복수"는 2개 이상을 의미한다.

본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 "변이체"는 항체의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함할 수 있다. 이는 항체 모방체, 모노바디 및 압타머를 포함한다.

변이체는 전형적으로 항체의 결합 특이성, 예를 들어 이중특이성 항체의 특이성을 유지한다. 변이체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 결합 도메인, 다량체 또는 항체의 기능성 부분 또는 유도체일 수 있다.

본 명세서에 기술된 바와 같은 결합 도메인, 다량체 또는 항체의 기능성 부분은 이러한 결합 도메인, 다량체 또는 항체와 동일한 표적에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 부분이다.

본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 기능성 유도체는 하나의 표적에 결합하는 가변 도메인 및 연결 영역에 의해 연결된 제2 표적에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 단백질이다. 가변 도메인은 그 자체로서의 가변 도메인일 수 있거나, 또는 Fab 단편 또는 링커를 통해 함께 연결된 VH 및 VL을 포함하는 단일쇄 Fv(scFv) 단편과 같은 가변 도메인 유사 분자일 수 있다. 항체 가변 도메인 또는 항체 가변 도메인 유사 분자는 상이한 방식으로 서로 연결될 수 있다. 1개, 2개 또는 그 이상의 가변 도메인에 결합할 수 있는 다양한 링커 및 캐리어 구조가 설명되었다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질은 이러한 가변 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 단백질이다. 이중특이성 또는 다중특이성 항원 결합 단백질의 경우, 이러한 단백질은 2개 이상의 가변 도메인을 포함하며, 그 중 적어도 2개는 상이한 표적에 결합한다. 가변 도메인은 연결 부분을 통해 서로 연결된다. 이는 전형적으로 0 내지 15개, 바람직하게는 3 내지 12개, 더욱 바람직하게는 대략 5 내지 8개의 아미노산 잔기의 스트레치(stretch)이다. 가변 도메인 유사 분자의 다른 예는 이른바 단일 도메인 항체 단편이다. 단일-도메인 항체 단편(sdAb)은 단일 단량체 가변 항체 영역을 갖는 항체 단편이다. 전 항체(whole antibody)와 마찬가지로, 특이적 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 분자량이 단지 12 내지 15 kDa인 단일-도메인 항체 단편은 2개의 단백질 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 공통 항체(150 내지 160 kDa)보다 훨씬 더 작고, 심지어는 Fab 단편(약 50 kDa, 하나는 경쇄이고 절반은 중쇄임) 및 단일쇄 가변 단편(약 25 kDa, 2개의 가변 영역, 하나는 경쇄로부터 유래되고 하나는 중쇄로부터 유래됨)보다 더 작다. 단일-도메인 항체 그 자체는 정상 항체(전형적으로 90 내지 100 kDa임)보다 그다지 작지 않다. 단일-도메인 항체 단편은 카멜리드(camelid)에서 발견되는 중쇄 항체로부터 조작될 수 있으며; 이들은 VHH 단편(나노바디즈(Nanobodies)^®)으로 불린다. 일부 어류는 또한 중쇄로만 이루어진 항체(IgNAR, '면역글로불린 새로운 항원 수용체')를 가지며, 그로부터 VNAR 단편이라 불리는 단일-도메인 항체 단편이 얻어질 수 있다. 대안적인 접근법은 인간 또는 마우스 유래 공통 면역글로불린 G(IgG)로부터의 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할하는 것이다. 단일-도메인 항체에 대한 대부분의 연구는 현재 중쇄 가변 도메인에 기반하고 있지만, 경쇄로부터 유래된 나노바디가 또한 표적 에피토프에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 가변 도메인-유사 분자의 다른 비제한적인 예는 VHH, 인간 도메인 항체(Human Domain Antibody; dAb) 및 유니바디(Unibody)이다. 바람직한 기능성 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 부분이다. 그러한 가변 도메인의 비제한적인 예는 F(ab)-단편 및 단일쇄 Fv 단편이다. 가변 도메인(-유사) 연결에 대한 이중특이성 포맷은, 예를 들어 2개의 상이한 scFv에 결합된 인간 혈청 알부민(HSA); 이량체화 모티프(dimerization motif) 또는 자기-회합성(self-associating) 2차 구조, 예컨대 나선 번들(helix bundle) 또는 코일드 코일을 통해 함께 결합되어 scFv 단편들의 이량체화를 가져오는 2개의 상이한 scFv를 포함하는 이중특이성 미니-항체이다(문헌[Morrison(2007)Nat. Biotechnol. 25:1233-34]). 적합한 HSA 링커 및 그러한 링커에 scFv를 결합시키는 방법의 예가 WO2009/126920호에 기재되어 있다.

기능성 유도체는 항체 모방체, 폴리펩티드, 압타머 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 단백질 또는 압타머는 전형적으로 하나의 표적에 결합한다. 본 발명의 단백질은 2개 이상의 표적에 결합한다. 이러한 항체, 항체 모방체, 폴리펩티드 및 압타머의 임의의 조합이 당업계에 알려진 방법에 의해 함께 연결될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결합 분자는 접합체 또는 융합 단백질이다.

항체 모방체는, 항체와 마찬가지로, 항원과 특이적으로 결합할 수 있지만 항체와 구조적으로 관련 없는 폴리펩티드이다. 항체 모방체는 통상, 몰질량이 약 3 내지 20 kDa인 인공 펩티드 또는 단백질이다. 항체 모방체의 비제한적인 예는 애피바디(affibody) 분자(전형적으로, 단백질 A의 Z 도메인을 기반으로 함); 애필린(affilin)(전형적으로, 감마-B 결정질 또는 유비퀴틴을 기반으로 함); 애피머(affimer)(전형적으로, 시스타틴을 기반으로 함); 애피틴(affitin)(전형적으로, 설폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) 유래 Sac7d를 기반으로 함); 알파바디(alphabody)(전형적으로, 삼중 나선 코일드 코일(Triple helix coiled coil)을 기반으로 함); 안티칼린(anticalin)(전형적으로, 리포칼린을 기반으로 함); 아비머(avimer)(전형적으로, 다양한 막 수용체의 A 도메인을 기반으로 함); DARPin(전형적으로, 안키린 반복 모티프(ankyrin repeat motif)를 기반으로 함); 피노머(fynomer)(전형적으로, Fyn 7의 SH3 도메인을 기반으로 함); 쿠니츠(kunitz) 도메인 펩티드(전형적으로, 다양한 프로테아제 억제제의 쿠니츠 도메인을 기반으로 함); 및 모노바디(monobody)(전형적으로, 피브로넥틴의 III형 도메인을 기반으로 함)이다.

모노바디는 분자 스캐폴드로서 피브로넥틴 III형 도메인(FN3)을 사용하여 구성되는 합성 결합 단백질이다. 모노바디는 표적-결합 단백질을 생성하기 위한 항체에 대체물이다.

모노바디 및 다른 항체 모방체는 전형적으로 조합 라이브러리(combinatorial library)로부터 생성되는데, 조합 라이브러리에서는 스캐폴드의 일부분들이 분자 디스플레이 및 지향 진화(directed evolution) 기술, 예컨대 파지 디스플레이, mRNA 디스플레이 및 효모 표면 디스플레이를 사용하여 다양화된다.

압타머는 특이적 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자이다. 압타머는 통상, 대형 랜덤 서열 풀(sequence pool)로부터 그것을 선택함으로써 생성되지만, 천연 압타머가 또한 리보스위치(riboswitch) 내에 존재한다. 압타머는 거대분자로서 기초 연구 및 임상 목적 둘 모두에 사용될 수 있다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)", "포함하다(include)" 및 "갖는" 및 변형체, 예컨대 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)" 및 "포함하는(including)"은 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이러한 단어는 문맥상 허용되는 경우, 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소 또는 정수의 포함 가능성을 전달하고자 한다.

관사("a" 및 "an")는 본 명세에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 하나 또는 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미할 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 이중특이성 또는 다중특이성 항체이다. 이중특이성 또는 다중특이성 항체는 바람직하게는 적어도 인간 CD3에 결합한다.

본 발명의 항원-결합 단백질 또는 항체는 바람직하게는 이중특이성 또는 다중특이성 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이중특이성 또는 다중특이성 항원 결합 단백질 또는 항체는 바람직하게는 적어도 인간 CD3에 결합하고, 더욱이, 바람직하게는 인간 종양 세포에서 발현되는 적어도 표면 분자에 결합한다. 바람직한 실시 형태에서, 이중특이성 또는 다중특이성 항원 결합 단백질 또는 항체는 BCMA, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CD44, CD123, CD138, CEA, CLEC12A, CS-1, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, DLL3, LGR5, MSLN, PD-L1, FOLR1, FOLR3, HER2, HM1.24, MCSP, 또는 PSMA에 결합한다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 CLEC12A에 결합한다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 CD3, PD-L1 및 EGFR에 결합한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CLEC12A"는 C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A를 지칭한다. CLEC12A는 C형 렉틴 단백질 CLL-1; MICL; 수지상 세포-관련 렉틴 2; C형 렉틴 수퍼패밀리; 골수계 억제성 C형 렉틴-유사 수용체; C형 렉틴-유사 분자-1; DCAL2; CLL1; C형 렉틴-유사 분자 1; DCAL-2; 살해 세포 렉틴 유사 수용체 서브패밀리 L, 구성원 1(KLRL1); CD371(분화 클러스터 371)(문헌[Bakker A. et al. Cancer Res. 2004, 64, p8843 50]; GenBankTM 수탁 번호: AY547296; 문헌[Zhang W. et al.]; GenBankTM 수탁 번호: AF247788; 문헌[A.S. Marshall, et al. J Biol Chem 2004, 279, p14792-802]; GenBankTM 수탁 번호: AY498550; 문헌[Y.Han et al. Blood 2004, 104, p2858 66]; 문헌[H.Floyd, et al.]; GenBankTM 수탁 번호: AY426759; 문헌[C.H.Chen, et al. Blood 2006, 107, p1459 67])로도 지칭된다. Id: HGNC: 31713; Entrez Gene: 160364; Ensembl: ENSG00000172322; OMIM: 612088; UniProtKB: Q5QGZ9.

CLEC12A는 급성 골수성 백혈병(AML)에서 백혈병 줄기 세포 상에서 그리고 백혈병 아세포 상에서 발현되는 항원으로서, 이에는 CD34 음성 또는 CD34 저발현 백혈병 줄기 세포(측면 집단)가 포함되며(문헌[A.B. Bakker et al. Cancer Res 2004, 64, p8443 50]; 문헌[Van Rhenen et al. 2007 Blood 110:2659]; 문헌[Moshaver et al. 2008 Stem Cells 26:3059]), 이뿐만 아니라 골수이형성 증후군(MDS)에서도 발현되는 항원이다(상기 문헌[Bakker et al. 2004] 및 문헌[Toff-Peterson et al., Br. J. Haematol. 175(3):393-401, 2016]). CLEC12A의 발현은 조혈 계통의 세포로, 특히 말초 혈액 및 골수 내의 골수계 계통, 즉 과립구, 단핵구 및 수지상 세포 전구체로 제한되는 것으로 달리 여겨진다. 더 중요한 점은, CLEC12A는 정상 조혈 줄기 세포 상에는 존재하지 않는다는 것이다. 본 명세서에서 CLEC12A에 대해 언급되는 경우, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 이러한 언급은 인간 CLEC12A(서열 번호 1; 도 19)에 대한 것이다.

용어 "CLEC12A"는 골수계 발현 프로파일(표면 발현 수준 및 mRNA 수준 둘 모두)을 보유하는 본 명세서에서 언급된 모든 변이체(예컨대, 스플라이스 및 돌연변이) 및 이들의 아이소형(isoform)을 의미하며, 이에는 문헌[Bakker et al. Cancer Res 2004, 64, p8443-50] 및 문헌[Marshall 2004 - J Biol Chem 279(15), p14792-802]에 기재된 바와 같은 것이 포함된다. 수탁 번호는 추가의 확인 방법으로서 주로 제공되며, 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다.

용어 "CD3"(분화 클러스터 3)은 CD3γ 사슬(SwissProt P09693), CD3δ 사슬(SwissProt P04234), CD3ε 사슬(SwissProt P07766), 및 CD3 제타 사슬 동종이량체(SwissProt P20963)로 구성되는 단백질 복합체를 지칭한다. CD3ε은 다양한 별칭으로 알려져 있으며, 그 중 일부는 다음과 같다: "CD3e 분자, 엡실론 (CD3-TCR 복합체)"; "CD3e 항원, 엡실론 폴리펩티드 (TiT3 복합체)"; T 세포 표면 항원 T3/Leu-4 엡실론 사슬; T3E; T 세포 항원 수용체 복합체, T3의 엡실론 서브유닛; CD3e 항원; CD3-엡실론 3; IMD18; TCRE. CD3E 유전자에 대한 Id는 HGNC: 1674; Entrez Gene: 916; Ensembl: ENSG00000198851; OMIM: 186830 및 UniProtKB: P07766이다. 이들 사슬은 T 세포 수용체(TCR) 및 ζ-사슬과 결합하여, 세포증식 신호전달 시에 T 림프구에서 활성화 신호를 발생할 수 있는 TCR 복합체를 형성한다. CD3은 T 세포 및 NK T 세포 상에서 발현된다. 본 명세서에서 CD3에 대해 언급되는 경우, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 이러한 언급은 인간 CD3(서열 번호 2 내지 서열 번호 5; 도 20)에 대한 것이다.

BCMA는 또한 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 17(TNFRSF17); TNFRSF13A2; B 세포 성숙 항원; BCM; B-세포 성숙 인자; B-세포 성숙 단백질; CD269 또는 CD269 항원으로 지칭된다. Id: HGNC: 11913; Entrez Gene: 608; Ensembl: ENSG00000048462; OMIM: 109545; UniProtKB: Q02223.

CD19는 또한 CD19 분자; T-세포 표면 항원 Leu-12; CD19 항원; CVID3; 분화 항원 CD19; B4; B-림프구 표면 항원 B4; B-림프구 항원 CD19로 지칭된다. Id: HGNC: 1633; Entrez Gene: 930; Ensembl: ENSG00000177455; OMIM: 107265; UniProtKB: P15391.

CD20은 또한 막-스패닝(Membrane-Spanning) 4-도메인, 서브패밀리 A, 구성원 1(MS4A1); MS4A2; CD20; S7; 백혈구 표면 항원 Leu-16; B-림프구 항원 CD20; Bp35; B-림프구 세포-표면 항원 B1; CD20 항원; CD20 수용체; CVID5; B-림프구 표면 항원 B1; B1; 막-스패닝 4-도메인 서브패밀리 A 구성원 1; LEU-16으로 지칭된다. Id: HGNC: 7315; Entrez Gene: 931; Ensembl: ENSG00000156738; OMIM: 112210; UniProtKB: P11836.

CD30은 또한 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 8(TNFRSF8); Ki-1 항원; CD30; Ki-1; D1S166E; 사이토카인 수용체 CD30; 림프구 활성화 항원 CD30; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 8; CD30L 수용체; CD30 항원으로 지칭된다. Id: HGNC: 11923; Entrez Gene: 943; Ensembl: ENSG00000120949; OMIM: 153243; UniProtKB: P28908.

CD33은 또한 CD33 분자; SIGLEC-3; CD33 항원(Gp67); 골수성 세포 표면 항원 CD33; 시알산 결합 Ig-유사 렉틴 3; Siglec-3; SIGLEC3; CD33 항원 및 gp67로 지칭된다. Id: HGNC: 1659; Entrez Gene: 945; Ensembl: ENSG00000105383; OMIM: 159590; UniProtKB: P20138.

CD38은 또한 CD38 분자; T10; CD38 항원(P45); CADPr 하이드롤라제 1; ADP-리보실 사이클라제 1; ADP-리보실 사이클라제/환형 ADP-리보스 하이드롤라제; NAD(+) 뉴클레오시다제; EC 3.2.2.5; 환형 ADP-리보스 하이드롤라제 1; CD38 항원으로 지칭된다. Id: HGNC: 1667; Entrez Gene: 952; Ensembl: ENSG00000004468; OMIM: 107270; UniProtKB: P28907.

CD44는 또한 CD44 분자(인디언 혈액 그룹(Indian Blood Group)); IN; MDU2; CD44 항원(호밍 기능(Homing Function) 및 인디언 혈액 그룹 시스템); MDU3; CDW44; MIC4; CSPG8; 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 8; HCELL; 조혈 세포 E- 및 L-셀렉틴 리간드; MC56; 세포외 매트릭스 수용체 III; Pgp1; 헤파란 설페이트 프로테오글리칸; 세포 표면 당단백질 CD44; 히알루로네이트 수용체; 에피칸; 식작용 당단백질 1; 호밍 기능 및 인디언 혈액 그룹 시스템; ECMR-III; CDw44; HUTCH-I; 에피칸; LHR; PGP-1; CD44 항원; PGP-I; CP90 림프구 호밍/부착 수용체; 식세포 당단백질 I; 헤르메스 항원으로 지칭된다. Id: HGNC: 1681; Entrez Gene: 960; Ensembl: ENSG00000026508; OMIM: 107269; UniProtKB: P16070.

CD123은 또한 세포 분열 사이클 123; 세포 분열 사이클 123 상동체; C10orf7; 세포 분열 사이클 단백질 123 상동체; D123; 단백질 D123; HT-1080; CCEP123; PZ32; CEP89; 세포 분열 사이클 123 상동체(에스. 세레비지에(S. Cereis)); FLJ14640; 염색체 10 오픈 리딩 프레임 7로 지칭된다. Id: HGNC: 16827; Entrez Gene: 8872; Ensembl: ENSG00000151465; OMIM: 615470; UniProtKB: O75794.

CD138은 또한 신데칸 1(SCD1); CD138; SDC; 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 섬유아세포 성장 인자 수용체; 신데칸 프로테오글리칸 1; 신데칸; SYND1; 신데칸-1; CD138 항원으로 지칭된다. Id: HGNC: 10658; Entrez Gene: 6382; Ensembl: ENSG00000115884; OMIM: 186355; UniProtKB: P18827.

CEA는 또한 암배아(Carcinoembryonic) 항원-관련 세포 부착 분자 5(CEACAM5); 태변(Meconium) 항원 100; CD66e; 암배아 항원; CD66e 항원으로 지칭된다. Id: HGNC: 1817; Entrez Gene: 1048; Ensembl: ENSG00000105388; OMIM: 114890; UniProtKB: P06731.

EGFR은 또한 표피 성장 인자 수용체; 적아구성 백혈병 바이러스성 (V-Erb-B) 발암유전자 상동체(조류); ERBB1; PIG61; 원-발암유전자 C-ErbB-1; 조류 적아구성 백혈병 바이러스성 (V-Erb-B) 발암유전자 상동체; 수용체 티로신-단백질 키나제 ErbB-1; 세포 성장 억제 단백질 40; 세포 증식-유도 단백질 61; HER1; mENA; EC 2.7.10.1; EC 2.7.10; 표피 성장 인자 수용체(조류 적아구성 백혈병 바이러스성 (V-Erb-B) 발암유전자 상동체)로 지칭된다. Id: HGNC: 3236; Entrez Gene: 1956; Ensembl: ENSG00000146648; OMIM: 131550; UniProtKB: P00533.

EGFRvIII은 EGFR의 공통 변이체이다(문헌[Oncogene. 2013 May 23;32(21):2670-81. doi: 10.1038/onc.2012.280. Epub 2012 Jul 16]).

델타 유사 3(DLL3)은 또한 델타-유사 3; 초파리 델타 상동체 3; 델타3; 델타(초파리)-유사 3; SCDO1로 지칭된다. DLL3에 대한 Id는 HGNC: 2909; Entrez Gene: 10683; Ensembl: ENSG00000090932; OMIM: 602768 및 UniProtKB: Q9NYJ7이다.

LGR5는 류신-풍부 반복 함유 G 단백질-결합된 수용체 5이다. 유전자 또는 단백질에 대한 대체명은 류신-풍부 반복 함유 G 단백질-결합된 수용체 5; 류신-풍부 반복-함유 G 단백질-결합된 수용체 5; G-단백질 결합된 수용체 HG38; G-단백질 결합된 수용체 49; G-단백질 결합된 수용체 67; GPR67; GPR49; 고아(Orphan) G 단백질-결합된 수용체 HG38; G 단백질-결합된 수용체 49; GPR49; HG38 및 FEX이다. LGR5와 결합하는 본 발명의 단백질 또는 항체는 인간 LGR5와 결합한다. 본 발명의 LGR5 결합 단백질 또는 항체는, 인간과 다른 포유류 오르토로그(ortholog) 사이의 서열 및 3차 구조 유사성에 기인하여, 그러한 오르토로그와 또한 결합할 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 인간 LGR5 단백질 및 그것을 인코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 (NC_000012.12; NT_029419.13; NC_018923.2; NP_001264155.1; NP_001264156.1; NP_003658.1)이다.

MSLN 또는 메소텔린(mesothelin)은 또한 메소텔린; 프리-프로-거핵구-강화 인자(Pre-Pro-Megakaryocyte-Potentiating Factor); CAK1 항원; MPF; 가용성 MPF 메소텔린 관련 단백질; 거핵구 강화 인자 및 SMRP로 지칭된다. MSLN에 대한 Id는 HGNC: 7371; Entrez Gene: 10232; Ensembl: ENSG00000102854; OMIM: 601051; UniProtKB: Q13421이다.

엽산 수용체 1은 또한 FOLR1; 엽산 수용체 1; 난소 종양-관련 항원 MOv18; 성인 엽산-결합 단백질; 엽산 수용체, 성인; KB 세포 FBP; FR-알파; FOLR; FBP; 엽산 결합 단백질; 및 엽산 수용체 1로 지칭된다. FOLR1에 대한 Id는 HGNC: 3791; Entrez Gene: 2348; Ensembl: ENSG00000110195; OMIM: 136430; UniProtKB: P15328이다.

엽산 수용체 3은 또한 FOLR3; 엽산 수용체 3(감마); FR-감마; 엽산 수용체 3; 감마-HFR; 및 FR-G로 지칭된다. FOLR3에 대한 Id는 HGNC: 3795; Entrez Gene: 2352; Ensembl: ENSG00000110203; OMIM: 602469; 및 UniProtKB: P41439이다.

EPCAM은 또한 상피 세포 부착 분자; EGP40; M4S1; ESA; MIC18; KS1/4; 종양-관련 칼슘 신호 전달물질 1; MK-1; TACSTD1; 인간 상피 당단백질-2; TROP1; 막 성분, 염색체 4, 표면 마커(35kD 당단백질); 선암-관련 항원; EGP; 세포 표면 당단백질 Trop-1; Ep-CAM; 상피 당단백질 314; GA733-2; 주요 위장 종양-관련 단백질 GA733-2; M1S2; EGP314; CD326 항원; KSA; 상피 세포 표면 항원; DIAR5; 상피 당단백질; HNPCC8; hEGP314; 단일클론 항체 AUA1로 동정된 항원; KS 1/4 항원; EGP-2; ACSTD1로 지칭된다. Id: HGNC: 11529; Entrez Gene: 4072; Ensembl: ENSG00000119888; OMIM: 185535; UniProtKB: P16422.

HER2는 또한 V-Erb-B2 조류 적아구성 백혈병 바이러스성 발암유전자 상동체 2; ERBB2; CD340; NGL; HER-2; HER-2/neu2; NEU2; TKR1; 신경/교아세포종 유래 발암유전자 상동체; C-Erb B2/Neu 단백질; 전이성 림프절 유전자 19 단백질; 허스타틴; 원-발암유전자 C-ErbB-2; 신경아세포종/교아세포종 유래 발암유전자 상동체; 원-발암유전자 Neu; 수용체 티로신-단백질 키나제 ErbB-2; 티로신 키나제-유형 세포 표면 수용체 HER2; V-Erb-B2 적아구성 백혈병 바이러스성 발암유전자 상동체 2, 신경/교아세포종 유래 발암유전자 상동체; MLN 19; MLN19; p185erbB2; CD340 항원; EC 2.7.10.1; EC 2.7.10; V-Erb-B2 조류 적아구성 백혈병 바이러스성 발암유전자 상동체 2(신경/교아세포종 유래 발암유전자 상동체)로 지칭된다. Id:

HGNC: 3430; Entrez Gene: 2064; Ensembl: ENSG00000141736; OMIM: 164870; UniProtKB: P04626.

HM1.24는 또한 BST2; 골수 간질 세포 항원 2; 테터린(TETHERIN); BST-2; 골수 간질 항원 2; HM1.24 항원; 테터린; CD317; CD317 항원; NPC-A-7로 지칭된다. Id: HGNC: 1119; Entrez Gene: 684; Ensembl: ENSG00000130303; OMIM: 600534; UniProtKB: Q10589.

MCSP는 또한 정자 미토콘드리아-관련 시스테인-풍부 단백질(SMCP); MCSP; MCS; 미토콘드리아 캡슐 셀레노단백질; HSMCSGEN1; 정자 미토콘드리아-관련 시스테인-풍부 단백질로 지칭된다. Id: HGNC: 6962; Entrez Gene: 4184; Ensembl: ENSG00000163206; OMIM: 601148; UniProtKB: P49901.

PD-L1은 임신, 조직 동종이식편, 자가면역 질환 및 다른 질환 상태(예컨대, 간염)와 같은 특정 사례 동안 면역반응을 억제하는 데 있어서 역할을 하는 1형 막관통 단백질이다. PD-1 또는 B7.1 (CD80)에 대한 PD-L1의 결합은 PD-1 발현 T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전달한다. PD-1은 아폽토시스(apoptosis)를 통해 외래 항원 특이적 T 세포의 축적을 제어할 수 있는 것으로 여겨진다. PD-L1은 다양한 암 세포에 의해 발현되며, 그의 발현은, 적어도 부분적으로, 암 세포에 대한 면역 반응의 둔화의 원인이 되는 것으로 여겨진다. PD-L1은 단백질의 B7-패밀리의 구성원이며, 하기와 같은 다양한 다른 명칭으로 알려져 있다: CD274 분자; CD274 항원; B7 상동체 1; PDCD1 리간드 1; PDCD1LG1; PDCD1L1; B7H1; PDL1; 프로그램된 세포 사멸 1 리간드 1; 프로그램된 사멸 리간드 1; B7-H1; 및 B7-H. CD274에 대한 외부 Id는 HGNC: 17635; Entrez Gene: 29126; Ensembl: ENSG00000120217; OMIM: 605402; UniProtKB: Q9NZQ7이다.

PSMA는 또한 엽산 하이드롤라제(전립선-특이적 막 항원) 1; FOLH1; NAALAD1; FOLH; mGCP; 글루타메이트 카르복시펩티다제 II; N-아세틸화-알파-연결 산성 다이펩티다제 I; PSM; 나알라다제(NAALADase) I; PSMA; EC 3.4.17.21; 글루타메이트 카르복실라제 II; GCP2; 세포 성장-억제 유전자 27 단백질; 나알라다제; 폴릴폴리(Folylpoly)-감마-글루타메이트 카르복시펩티다제; 글루타메이트 카르복시펩티다제 2; 막 글루타메이트 카르복시펩티다제; N-아세틸화 알파-연결 산성 다이펩티다제 1; 프테로일폴리(Pteroylpoly)-감마-글루타메이트 카르복시펩티다제; 전립선 특이적 막 항원 변이체 F; FGCP; 엽산 하이드롤라제 1; GCPII; 전립선-특이적 막 항원으로 지칭된다. Id: HGNC: 3788; Entrez Gene: 2346; Ensembl: ENSG00000086205; OMIM: 600934; UniProtKB: Q04609.

PSMA는 PSMA1이라는 별칭으로도 알려진 프로테아좀(Proteasome)(프로좀(Prosome), 마크로파인(Macropain)) 서브유닛, 알파 유형, 1과 혼동되어서는 안된다.

수탁 번호는 표적의 확인을 위한 추가의 방법을 제공하기 위하여 주로 주어지고, 결합된 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다. 항원 결합 부위는 항원 및 그의 다양한 변이체, 예컨대 일부 항원 양성 면역 또는 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 결합한다.

본 명세서에서 유전자, 단백질이 언급될 때, 그러한 언급은 바람직하게는 유전자 또는 단백질의 인간 형태에 대한 것이다. 본 명세서에서 유전자 또는 단백질이 언급될 때, 천연 유전자 또는 단백질, 및 종양, 암 등에서 검출될 수 있는, 바람직하게는 인간 종양, 암 등에서 검출될 수 있는 바와 같은 유전자 또는 단백질의 변이체 형태가 언급된다.

본 발명의 이중특이성 또는 다중특이성 항체는 바람직하게는 인간 BCMA, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CD44, CD123, CD138, CEA, CLEC12A, CS-1, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, DLL3, LGR5, MSLN, FOLR1, FOLR3, HER2, HM1.24, MCSP, PD-L1, PSMA 단백질 또는 이의 변이체에 결합한다. 항원 결합 중쇄/경쇄 조합은 바람직하게는 항원의 세포외 부분에 결합한다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 바람직하게는 인간 CLEC12A 또는 이의 변이체에 결합한다. 본 발명에 따른 바람직한 이중특이성 항체는 인간 CD3 및 인간 CLEC12A 또는 이의 변이체에 결합한다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 CD3, PD-L1 및 EGFR에 결합한다.

HGNC는 HUGO 유전자 명명 위원회를 나타낸다. 약어 뒤에 오는 숫자는 유전자 및 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 대한 정보가 HGNC 데이터베이스로부터 검색될 수 있는 수탁 번호이다. Entrez Gene은 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 대한 정보가 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스로부터 검색될 수 있는 수탁 번호 또는 유전자 ID를 제공한다. Ensemble은 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 대한 정보가 Ensemble 데이터베이스로부터 획득될 수 있는 수탁 번호를 제공한다. Ensembl은 선택된 진핵생물 게놈에 대한 자동 주석을 생성하고 유지하는 소프트웨어 시스템을 개발하기 위한 EMBL-EBI와 Wellcome Trust Sanger Institute 사이의 공동 프로젝트이다.

본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은

하기 아미노산 서열:

CDR1: SFGIS; CDR2: GFIPVLGTANYAQKFQG; CDR3: RGNWNPFDP를 포함하거나;

또는

하기 아미노산 서열:

CDR1 : SX₁TFTIS;

CDR2 : GIIPX₂FGTITYAQKFQG;

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하고;

여기서,

X₁ = K 또는 R; X₂ = L 또는 I이다.

바람직한 실시 형태에서, X₁ = K; 및 X₂ = L이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, X₁ = R; 및 X₂ = I이다.

CDR1: SKTLTIS; CDR2: GIIPIFGSITYAQKFQD; CDR3: RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는

하기 아미노산 서열:

CDR1: GSGIS; CDR2: GFIPFFGSANYAQKFRD; CDR3: RGNWNPX₁₃DP를 포함하고;

여기서,

X₁₃ = L 또는 F이다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:

CDR1: RX₃WIG; CDR2: IIYPGDSDTRYSPSFQG; CDR3: X₄IRYFX₅WSEDYHYYX₆DV를 포함하고;

여기서,

X₃ = F 또는 Y; X₄ = H 또는 N; X₅ = D 또는 V; 및 X₆ = L 또는 M이다.

바람직한 실시 형태에서,X₃ = F; X₄ = H; X₅ = D; 및 X₆ = L; 또는 X₃ = Y; X₄ = N; X₅ = V; 및 X₆ = M이다.

CDR1: SYALS; CDR2: GISGSGRTTWYADSVKG; CDR3: DGGYSYGPYWYFDL을 포함한다.

CDR1: SYALS; CDR2: AISGSGRTTWYADSVKG; CDR3: DGGYTYGPYWYFDL을 포함한다.

CDR1: DYTMH; CDR2: DISWSSGSIGYADSVKG; CDR3: DHRGYGDYEGGGFDY를 포함한다.

CDR1 : DYTMH;

CDR2 : DISWSX₇GX₈X₉X₁₀YADSVKG;

CDR3 : DHX₁₁GYGDYEGGGFDX₁₂를 포함하고;

여기서,

X₇ = S 또는 G;

X₈ = S 또는 T;

X₉ = I 또는 T;

X₁₀ = G 또는 Y;

X₁₁ = R 또는 M;

X₁₂ = H 또는 Y이며,

바람직하게는 X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 S, S, I 및 G 또는 G, S, I 및 Y 또는 S, T, T 및 G이고, 바람직하게는 X₁₁ 및 X₁₂는 R 및 H, 또는 R 및 Y, 또는 M 및 Y이고, 더욱 바람직하게는 X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁ 및 X₁₂는 S, S, I, G, R 및 H 또는 G, S, I, Y, R 및 Y 또는 S, T, T, G, M 및 Y이거나, 다시 말해서, 바람직하게는 X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 S, S, I 및 G이고, X₁₁ 및 X₁₂는 R 및 H이거나; X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 G, S, I 및 Y이고, X₁₁ 및 X₁₂는 R 및 Y이거나; X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 S, T, T 및 G이고, X₁₁ 및 X₁₂는 M 및 Y이다.

바람직한 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 11a에 나타낸 바와 같은 IgVκ1-39*01 유전자 세그먼트의 아미노산 서열을 포함한다. IgV_K1-39*01의 아미노산 서열은 도 11a에 나타나 있다. IgVκ1-39는 면역글로불린 가변 카파 1-39 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 면역글로불린 카파 가변 1-39; IGKV139; IGKV1-39로도 알려져 있다. 유전자의 외부 Id는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. IgVκ1-39에 대한 바람직한 아미노산 서열이 도 11a에 제공되어 있다. 이것은 V-영역의 서열을 열거한다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 도 11b 및 도 11c는 J-영역과 조합된 IgVκ1-39에 대한 2개의 바람직한 서열을 기재한다. 합쳐진 서열들은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5로 나타내며; 대체명은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (imgt.org에 있는 IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹에 따른 명명법)이다.

경쇄 가변 영역을 포함하는 IgVκ1-39*01은 생식세포계열 서열인 것이 바람직하다. 경쇄 가변 영역을 포함하는 IGJκ1*01 또는 /IGJκ5*01은 생식세포계열 서열인 것이 추가로 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서, IGKV1-39/jk1 또는 IGKV1-39/jk5 경쇄 가변 영역은 생식세포계열 서열이다.

바람직한 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 생식세포계열 IgVκ1-39*01을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, IgVκ1-39*01/IGJκ1*01이다. 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 생식세포계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 생식세포계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01, 바람직하게는 생식세포계열 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01을 포함한다.

경쇄를 갖는 항체를 생성하는 성숙 B-세포는 종종 생식세포계열 서열, 즉 유기체의 비-림프계 세포에서의 정상 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이를 겪은 경쇄를 생성한다. 이들 돌연변이를 담당하는 과정은 종종 체세포 (초)돌연변이로 지칭된다. 생성된 경쇄는 친화성 성숙된(affinity matured) 경쇄로 지칭된다. 생식세포계열 IgVκ1-39*01 서열로부터 유래되는 경우, 이러한 경쇄는 IgVκ1-39*01 유래 경쇄이다. 본 명세서에서, 어구 "IgVκ1-39*01"은 IgVκ1-39*01-유래 경쇄를 포함할 것이다. 체세포 초돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이는 또한 실험실에서 인공적으로 도입될 수 있다. 실험실에서는 또한 경쇄에 대한 다른 돌연변이 또는 변이가, 반드시 양에 있어서는 아니고, 종류에 있어서 경쇄의 특성에 영향을 주지 않으면서 도입될 수 있다. 경쇄가, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 11a, 도 11d 또는 도 11e에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경우, 그것은 적어도 IgVκ1-39*01 경쇄이다. 바람직한 실시 형태에서, IgVκ1-39*01 경쇄는, 0 내지 9개, 0 내지 8개, 0 내지 7개, 0 내지 6개, 0 내지 5개, 0 내지 4개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 11a, 도 11b 또는 도 11c에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄이다. 바람직한 실시 형태에서, IgVκ1-39*01 경쇄는, 0 내지 5개, 바람직하게는 0 내지 4개, 더욱 바람직하게는 0 내지 3개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 11a, 도 11b 또는 도 11c에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄이다. 바람직한 실시 형태에서, IgVκ1-39*01 경쇄는, 0 내지 2개, 더욱 바람직하게는 0 내지 1개, 가장 바람직하게는 0개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 11a, 도 11b 또는 도 11c에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄이다. 바람직한 실시 형태에서, IgVκ1-39*01 경쇄는, 언급된 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 11a 또는 도 11b에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄이다. 바람직한 실시 형태에서, 경쇄는 도 11b의 서열을 포함한다.

경쇄는 바람직하게는 공통 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 공통 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 IgVκ1-39 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 생식세포계열 IgVκ1-39*01 가변 영역이다. 상기 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 생식세포계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. 상기 경쇄 가변 영역은 바람직하게는, 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 아미노산 서열 DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK 또는 DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK를 포함한다.

경쇄 가변 영역은 바람직하게는 아미노산 서열 CDR1 - QSISSY, CDR2 - AAS, CDR3 - QQSYSTP를 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역, 즉, IGKV1-39의 CDR(IMGT에 따름)을 포함한다. 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합은 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR3 영역에 있지 않고, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR1 또는 CDR2 영역에 있지 않다. 바람직한 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 표시된 서열에 대한 결실, 부가 또는 변이, 삽입을 포함하지 않는다. 이러한 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 표시된 아미노산 서열에 대하여 0 내지 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 본 발명의 항체의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 바람직하게는 각각, 아미노산 서열 CDR1 - QSISSY, CDR2 - AAS, CDR3 - QQSYSTP, 즉, IGKV1-39의 CDR(IMGT에 따름)을 포함한다.

항원-결합 단백질은 바람직하게는 항체, 바람직하게는 이중특이성 또는 다중특이성 항체이다. 항체는 바람직하게는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 공통 경쇄 가변 영역 및 본 명세서에서 정의된 바와 같은 경쇄 불변 영역을 포함하는 공통 경쇄를 포함한다.

본 발명의 항체는, 언급된 바와 같이, 바람직하게는 이중특이성 항체이다. "이중특이성 항체"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체로서, 여기서 항체의 하나의 도메인은 제1 항원에 결합하고, 한편 항체의 제2 도메인은 제2 항원에 결합하며, 상기 제1 항원과 제2 항원은 동일하지 않다. 용어 "이중특이성 항체"는 또한 하나의 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역(VH/VL) 조합이 항원 상의 제1 에피토프에 결합하고, 제2 VH/VL 조합이 제2 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 이 용어는 VH가 제1 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, 면역글로불린 가변 영역 내에서 VH와 쌍을 이룬 VL이 제2 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 추가로 포함한다. 생성된 VH/VL 쌍은 항원 1 또는 항원 2와 결합할 것이다. 그러한 이른바 "투-인-원(two-in-one) 항체"는, 예를 들어 WO 2008/027236호, WO 2010/108127호 및 문헌[Schaefer et al (Cancer Cell 20, 472-486, October 2011)]에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 임의의 특정 이중특이성 포맷 또는 그의 생성 방법으로 제한되지 않는다.

이중특이성 항체는 바람직하게는 CD3에 결합하는 하나의 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역(VH/VL) 조합 및 CD3 상의 항원 이외의 항원에 결합하는 제2 VH/VL 조합을 갖는다. 바람직한 실시 형태에서, 항원은 종양 항원이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 VH/VL 조합에서의 VL은 상기 제2 VH/VL 조합에서의 VL과 유사하다. 더 바람직한 실시 형태에서, 제1 VH/VL 조합에서의 VL과 제2 VH/VL 조합에서의 VL은 동일하다. 바람직한 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 CD3에 결합하는 하나의 중쇄/경쇄(H/L 쇄) 조합 및 다른 항원, 바람직하게는 종양 항원에 결합하는 하나의 H/L 쇄 조합을 갖는 전장 항체이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 H/L 쇄 조합에서의 경쇄는 상기 제2 H/L 쇄 조합에서의 경쇄와 유사하다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 제1 및 제2 H/L 쇄 조합에서의 경쇄들은 동일한데, 즉 유사하거나 동일한 인간 경쇄는 소위 '공통 경쇄'이며, 이는 상이한 중쇄와 조합되어 기능성 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 형성할 수 있는 경쇄이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 H/L 쇄 조합에서의 경쇄는 상기 제2 H/L 쇄 조합에서의 경쇄 가변 영역과 유사한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 제1 및 제2 H/L 쇄 조합에서의 경쇄 가변 영역들은 동일한데, 즉 유사하거나 동일한 인간 경쇄 가변 영역은 소위 '공통 경쇄 가변 영역'이며, 이는 상이한 중쇄 가변 영역과 조합되어 기능성 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 형성할 수 있는 경쇄 가변 영역이다. 공통 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄는 바람직하게는 공통 경쇄이다.

이중특이성 항체의 공통 경쇄는 바람직하게는 본 명세서에서 상기에 나타낸 바와 같은 IgVκ1-39 경쇄이다.

본 발명은 또한 문헌[Spiess, C., et al., (Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol. Immunol. (2015) http: //dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003)]에 기술된 것과 같은 대안적인 이중특이성 포맷을 제공한다. 2개의 H/L 조합을 갖는 고전적인 항체가 아닌 이중특이성 항체 포맷은 본 발명의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 가변 도메인을 적어도 갖는다. 이러한 가변 도메인은 제2 결합 활성을 제공하는 단일쇄 Fv-단편, 모노바디(monobody), VHH 및 Fab-단편에 연결될 수 있다.

본 발명의 이중특이성 항체에서, CD3-결합 H/L 쇄 조합에서의 경쇄는 바람직하게는 CD3 이외의 항원, 바람직하게는 종양 항원에 결합할 수 있는 H/L 쇄 조합에서의 경쇄와 유사하다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 두 H/L 쇄 조합에서의 경쇄는 동일한데, 즉 상기 인간 경쇄는 소위 '공통 경쇄'이며, 이는 상이한 중쇄와 조합되어 기능성 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 형성할 수 있는 경쇄이다. 바람직하게는, 공통 경쇄는 생식세포계열(germline) 서열을 갖는다. 바람직한 생식세포계열 서열은, 인간 레퍼토리에서 빈번하게 사용되고 우수한 열역학적 안정성, 수율 및 용해성을 갖는 경쇄 가변 영역이다. 바람직한 생식세포계열 경쇄는 IgVκ1-39이며, 바람직하게는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 그의 단편 또는 기능적 등가물 (즉, IgVκ1-39 유전자 세그먼트는 동일하지만 IGJκ 유전자 세그먼트는 상이함)이다 (명명법은 imgt.org에 있는 IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹에 따름).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '비정상 세포'는 종양 세포, 더 구체적으로는 골수이형성 증후군(MDS)을 야기하는 세포와 같은 전-백혈병 세포를 또한 포함한 혈액학적 기원의 종양 세포, 및 백혈병 세포, 예컨대 급속 골수성 백혈병(AML) 종양 세포 또는 만성 골수원성 백혈병(CML) 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '면역 이펙터 세포' 또는 '이펙터 세포'는 표적 세포의 생존력에 영향을 주도록 활성화될 수 있는 포유류 면역 시스템 내의 세포들의 천연 레퍼토리 내의 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포는 림프계 계통의 세포, 예컨대 천연 살해(NK) 세포, T 세포(세포독성 T 세포를 포함함), 또는 B 세포를 포함하고, 골수계 계통의 세포, 예컨대 단핵구 또는 대식세포, 수지상 세포 및 호중구성 과립구를 포함한다. 따라서, 상기 이펙터 세포는 바람직하게는 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 호중구성 과립구이다. 비정상 세포로의 이펙터 세포의 동원은 면역 이펙터 세포가 비정상 표적 세포에 근접하게 되어, 이펙터 세포가 비정상 세포를 직접 사멸할 수 있도록 하거나, 또는 비정상 세포의 사멸을 간접적으로 개시할 수 있도록 함을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"와 "환자"는 상호교환 가능하게 사용되며, 포유동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 고양이, 개, 원숭이, 소, 말, 돼지 등(예를 들어, 환자, 예컨대 암을 가진 인간 환자)을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 질병과 관련된 증상, 합병증, 질환 또는 생화학적 징후의 진행, 발생, 중증화, 또는 재발의 역전, 경감, 개선, 억제, 또는 둔화 또는 예방 목적을 갖는 대상체에서 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 상기 대상체에 대한 활성제 또는 활성제 병용물의 투여를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유효한 치료" 또는 "양성 치료적 반응"은 유익한 효과, 예를 들어, 질병 또는 장애, 예를 들어 암의 적어도 하나의 증상의 개선을 가져오는 치료를 지칭한다. 유익한 효과는 기저선을 능가하는 개선의 형태로 획득될 수 있으며, 이에는 본 방법에 따른 요법의 개시 전에 이루어진 측정 또는 관찰을 능가하는 개선이 포함된다. 예를 들어, 유익한 효과는, 질병의 임상 또는 진단 증상 또는 암의 마커의 감소 또는 제거에 의해 입증되는 바와 같이, 임의의 임상 단계에서 대상체에서 암의 진행을 둔화, 안정화, 중지 또는 역전시키는 형태를 취할 수 있다. 유효한 치료는, 예를 들어 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 순환 종양 세포의 존재를 감소시키고/시키거나, 종양의 전이를 감소 또는 예방하고/하거나, 종양 성장을 둔화 또는 정지시키고/시키거나, 종양 재발 또는 재연을 예방 또는 지연시킬 수 있다.

용어 "치료량"은 원하는 생물학적, 치료적, 및/또는 예방적 결과를 제공하는 작용제 또는 작용제 병용물의 양을 지칭한다. 그 결과는 질병의 징후, 증상, 또는 원인 중 하나 이상의 감소, 개선, 고식, 완화, 지연, 및/또는 경감, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변경일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 치료량은 종양 발생을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 실시 형태에서, 치료량은 종양 재발을 예방 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 치료량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 약물 또는 조성물의 치료량은: (i) 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; (ii) 종양 크기를 감소시킬 수 있고/있거나; (iii) 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 어느 정도 억제시키고, 지연시키고, 느려지게 하며, 중단시킬 수 있고/있거나; (iv) 종양 전이를 억제할 수 있고/있거나; (v) 종양 성장을 억제할 수 있고/있거나; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 예방 또는 지연시킬 수 있고/있거나; (vii) 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 일 예에서, "치료량"은 암의 감소(예를 들어, 암 세포 수의 감소) 또는 암, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 또는 만성 골수원성 백혈병의 진행의 둔화에 영향을 미치는 CLEC12A/CD3 이중특이성 항체의 양이다.

본 발명은 또한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRGSGISWVRQAPGQGLEWVGGFIPFFGSANYAQKFRDRVTITADKSATTAYMELSSLRSEDTAIYYCAKRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS를 포함하고

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체가 또한 제공되며, 여기서 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFISYALSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYTYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS를 포함하고

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDHWGQGTLVTVSS;

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVTSGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGTTGYADSVKGRFTISRDNAKDSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDHMGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS; 또는

EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGRGTLVTVSS를 포함하고;

아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합은 바람직하게는 중쇄 가변 영역의 CDR3 영역에 있지 않고, 바람직하게는 중쇄 가변 영역의 CDR1 및/또는 CDR2 영역에 있지 않다. 바람직한 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 표시된 서열에 대한 결실, 부가 또는 변이, 삽입을 포함하지 않는다. 일 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 표시된 아미노산 서열에 대하여 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 CDR 이외의 위치에서, 표시된 아미노산 서열에 대하여 0 내지 9개, 0 내지 8개, 0 내지 7개, 0 내지 6개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 바람직하게는 0 내지 3개, 바람직하게는 0 내지 2개, 바람직하게는 0 내지 1개, 및 바람직하게는 0개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가, 또는 이들의 조합을 포함한다. 삽입, 부가, 결실 또는 치환의 조합은 정렬된 서열이 10개 이상, 바람직하게는 5개 이하의 위치에서 상이하지 않으면, 청구된 바와 같은 조합이다. 정렬된 서열 중 하나의 서열에서의 갭은 다른 서열에서 건너뛴 아미노산 수만큼 카운팅된다. 아미노산 치환은 있다면, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 도 13에 도시된 바와 같은 MF8057; MF8058 또는 MF8078의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 도 13에 도시된 바와 같은 MF8397의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 도 13에 도시된 바와 같은 MF8508의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 도 13에 도시된 바와 같은 MF9249 또는 MF9267의 아미노산 서열을 포함한다.

경쇄는 바람직하게는 본 명세서의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함한다. 이는 바람직하게는 본 명세서의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 공통 경쇄 가변 영역 및 바람직하게는 공통 경쇄를 포함한다. 이중특이성 항체는 바람직하게는 다른 항원, 바람직하게는 종양 항원에 결합하는 중쇄 및 경쇄 조합을 추가로 포함한다. 다른 항원에 결합하는 중쇄 및 경쇄 조합의 경쇄는 바람직하게는 본 명세서의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 공통 경쇄이다. 다른 항원에 결합하는 중쇄 및 경쇄 조합의 중쇄는 바람직하게는 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: CDR 이외의 하나 이상의 위치에서 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 MF8233 (EGFR) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDRHWHWWLDAFDYWGQGTLVTVSS; 또는

CDR 이외의 하나 이상의 위치에서, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 MF4327 (CLEC12A) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGTLVTVSS.

본 명세서에서 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 공통 경쇄 영역을 갖는 CLEC12A에 결합하는 가변 도메인은 특히 본 명세서에서 이러한 목적을 위해 구체적으로 언급되고 본 명세서에 참조로 포함되는 WO2014/051433호 및 WO2017/010874호에 기재되어 있다. 인간 EGFR 또는 CLEC12A에 결합하는 중쇄/경쇄 조합의 중쇄 가변 영역은 표시된 아미노산 서열에 대해 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가, 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 표시된 아미노산 서열에 대하여 0 내지 9개, 0 내지 8개, 0 내지 7개, 0 내지 6개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 바람직하게는 0 내지 3개, 바람직하게는 0 내지 2개, 바람직하게는 0 내지 1개, 및 바람직하게는 0개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가, 또는 이들의 조합을 포함한다. 삽입, 결실, 부가 또는 치환의 조합은 정렬된 서열이 5개 이상의 위치에서 상이하지 않으면, 청구된 바와 같은 조합이다. 정렬된 서열 중 하나의 서열에서의 갭은 다른 서열에서 건너뛴 아미노산 수만큼 카운팅된다.

아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합은 바람직하게는 중쇄와 경쇄의 결합 계면에서 행해지지/존재하지 않는다.

아미노산이 H/L 쇄 상호작용의 계면에서 변경되는 경우, 다른 사슬 내의 상응하는 아미노산이 변경을 수용하도록 변경되는 것이 바람직하다. 아미노산의 삽입 또는 부가는 바람직하게는 프롤린의 삽입 또는 부가를 수반하지 않는다.

아미노산의 부가는 원칙적으로 삽입과 동일한 것으로 간주될 수 있다. 폴리펩티드 사슬의 말단들 중 하나에 아미노산을 부가하는 것은 때때로 삽입으로 간주되지 않고, 엄격한 부가(연장)로 간주된다. 본 발명의 경우, 사슬 내 부가 또는 말단들 중 하나에 대한 부가 둘 모두는 삽입으로 간주된다.

아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합은 바람직하게는 중쇄 가변 영역의 CDR3 영역에 있지 않고, 바람직하게는 중쇄 가변 영역의 CDR1 또는 CDR2 영역에 있지 않다. 바람직한 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 표시된 서열에 대한 결실, 부가 또는 변이, 삽입을 포함하지 않는다. 이러한 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 표시된 아미노산 서열에 대하여 0 내지 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 본 발명의 CD3 결합 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 바람직하게는 도 13에 도시된 CD3 결합 VH, 바람직하게는 MF8057; MF8058; MF8078; MF8397; MF8508; MF9249 또는 MF9267 중 하나의 VH의 CDR1, CD2 및 CDR3 조합을 포함한다.

이중특이성 또는 다중특이성 항체를 포함한 본 발명의 항체의 불변 영역은 바람직하게는 인간 불변 영역이다. 불변 영역은 천연 발생 인간 항체의 불변 영역과 1개 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 본 발명에서 생성되는 항체의 다양한 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인 라이브러리로부터 유래된다. 그렇기 때문에, 이들 가변 도메인은 인간이다. 특유의 CDR 영역은 인간으로부터 유래될 수 있거나, 합성될 수 있거나, 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항체는 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 적합한 중쇄 불변 영역이 도 12에 비제한적으로 예시되어 있다.

당업계에는 항체를 생성하기 위한 다양한 방법이 존재한다. 항체는 전형적으로 항체를 인코딩하는 핵산을 발현하는 세포에 의해 생성된다. 항체 생성에 적합한 세포는 하이브리도마 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포 또는 PER.C6 세포이다. 특정 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO 세포이다.

다양한 기관 및 회사는 항체의 대규모 생성을 위하여, 예를 들어 임상 사용을 위하여 세포주를 개발해 왔다. 이러한 세포주의 비제한적인 예는 CHO 세포, NS0 세포 또는 PER.C6 세포이다. 이들 세포는 또한 단백질의 생성과 같은 다른 목적으로 사용된다. 단백질 및 항체의 산업적 규모 생성을 위해 개발된 세포주는 본 명세서에서 산업적 세포주로 추가로 지칭된다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 생성하는 산업용 세포주를 제공한다.

본 발명은 일 실시 형태에서 본 발명에 따른 항체 및/또는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 바람직하게는 동물 세포, 더 바람직하게는 포유동물 세포, 더 바람직하게는 영장류 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 본 발명의 목적을 위하여, 적합한 세포는 본 발명에 따른 항체 및/또는 본 발명에 따른 핵산을 포함할 수 있는, 그리고 바람직하게는 생성할 수 있는 임의의 세포이다.

본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 바람직하게는 상기 세포(전형적으로, 시험관내, 단리된 또는 재조합 세포)는 상기 항체를 생성한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 하이브리도마 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포 또는 PER.C6 세포이다. 특정 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따른 세포를 포함하는 세포 배양물이 추가로 제공된다. 다양한 기관 및 회사는 항체의 대규모 생성을 위하여, 예를 들어 임상 사용을 위하여 세포주를 개발해 왔다. 이러한 세포주의 비제한적인 예는 CHO 세포, NS0 세포 또는 PER.C6 세포이다. 이들 세포는 또한 단백질의 생성과 같은 다른 목적으로 사용된다. 단백질 및 항체의 산업적 규모 생성을 위해 개발된 세포주는 본 명세서에서 산업적 세포주로 추가로 지칭된다. 따라서, 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 생성을 위한 항체의 대규모 생성을 위해 개발된 세포주의 사용을 제공한다. 본 발명은 청구된 바와 같은 항체의 VH, VL, 및/또는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 항체를 생성하기 위한 세포를 추가로 제공한다. 바람직하게는 상기 핵산 분자는 도 13에서 확인된 VH, 번호 4327에 의해 확인되거나 숫자 8233에 의해 확인된 바와 같은 VH를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 이들의 조합을 인코딩한다.

본 발명은 항체를 생성하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 본 방법은 본 발명의 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양물로부터 상기 항체를 수확하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 무혈청 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 상기 세포는 현탁 성장에 적합하다. 본 발명에 따른 항체를 생성하기 위한 방법에 의해 얻을 수 있는 항체가 추가로 제공된다. 항체는 바람직하게는 배양물의 배지로부터 정제된다. 바람직하게는, 상기 항체는 친화성 정제된다.

본 발명의 세포는, 예를 들어 하이브리도마 세포주, CHO 세포, 293F 세포, NS0 세포 또는 임상 목적을 위한 항체 생성에 있어서의 적합성에 대해 알려진 다른 세포 유형이다. 특정 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 바람직하게는, 아데노바이러스 E1 영역 또는 그의 기능적 등가물에 의해 형질전환된 세포이다. 그러한 세포주의 바람직한 예는 PER.C6 세포주 또는 그의 등가물이다. 특정 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO 세포 또는 그의 변이체이다. 바람직하게는, 항체의 발현을 위하여 글루타민 신테타제 (GS) 벡터 시스템을 사용하는 변이체이다.

본 발명은 항체를 생성하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 본 방법은 본 발명의 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양물로부터 상기 항체를 수확하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 무혈청 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 상기 세포는 현탁 성장에 적합하다. 본 발명에 따른 항체를 생성하기 위한 방법에 의해 얻을 수 있는 항체가 추가로 제공된다. 항체는 바람직하게는 배양 배지로부터 정제된다. 바람직하게는, 상기 항체는 친화성 정제된다.

이중특이성 항체는 또한 전형적으로 항체를 인코딩하는 핵산을 발현하는 세포에 의해 생성된다. 이 경우, 세포는 이중특이성 항체를 구성하는 상이한 경쇄 및 중쇄를 발현한다. 이를 위해, 세포는 2개의 상이한 중쇄 및 적어도 1개의 경쇄를 발현한다. 비변형 중쇄들이 서로 쌍을 이루어 이량체를 형성할 수 있기 때문에 이러한 세포는 전형적으로, 이중특이성 항체(이종이량체)에 더하여, 2개의 단일특이성 항체(동종이량체)를 생성한다. 이러한 원리는 또한 1개의 중쇄 가변 영역을 갖는 제1 중쇄 및 적어도 2개의 중쇄 가변 영역을 갖는 제2 중쇄를 포함하는 비변형 중쇄에 적용되어, 이들 2개의 중쇄를 발현하는 세포는 단일특이성 항체(2개의 제1 중쇄의 쌍의 동종이량체), 4가 항체(2개의 제2 중쇄의 쌍의 동종이량체) 및 삼중특이성 항체(제1 및 제2 중쇄의 이종이량체)를 생성한다. 생성된 항체에서의 가능한 중쇄/경쇄 조합의 수는 세포가 2개 이상의 경쇄를 발현할 때 증가한다. 생성된 상이한 항체 종(상이한 중쇄 및 경쇄의 조합)의 수를 감소시키기 위하여 앞서 언급된 "공통 경쇄"가 바람직하다.

공통 경쇄 및 동일한 양의 2개의 중쇄를 발현하는 항체 생성 세포는 전형적으로 50% 이중특이성 항체 및 25%의 각각의 단일특이성 항체(즉, 동일한 중쇄-경쇄 조합을 가짐)를 생성한다. 대안적으로, 상기 예에서, 1개의 가변 영역을 갖는 제1 중쇄 및 2개의 가변 영역을 갖는 제2 중쇄와 관련하여, 2개의 중쇄는 전형적으로 50% 삼중특이성, 25% 단일특이성 및 25% 사중특이성을 생성한다.

이중특이성 항체의 생성을 촉진하거나 역으로 단일특이성 항체의 생성을 촉진하는 몇몇 방법이 공개되었으며, 이는 다중특이성 항체 생성을 촉진하기 위해 추가로 채용될 수 있다. 본 발명에서, 세포는 각각의 단일특이성 항체의 생성에 비하여 이중특이성 항체의 생성에 유리한 것이 바람직하다. 이는 전형적으로 중쇄의 불변 영역을 변형시켜, 이들이 동종이량체화에 비하여 이종이량체화 (즉, 다른 중쇄/경쇄 조합의 중쇄와의 이량체화)를 유리하게 함으로써 달성된다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 갖는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 다양한 양립가능한 이종이량체화 도메인들이 당업계에 기재되어 있다. 양립가능한 이종이량체화 도메인들은 바람직하게는 양립가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 이종이량체화 도메인들이다. 당업계는, '노브 인투 홀(knob into hole)' 이중특이성 항체의 사용을 포함한, 중쇄의 이러한 이종이량체화가 달성될 수 있는 다양한 방법을 기술하고 있다.

US13/866,747호 (현재 US 9,248,181호로 허여됨), US14/081,848호 (현재 US 9,358,286호로 허여됨) 및 PCT/NL2013/050294호 (WO2013/157954호로 공개됨) (이들은 본 명세서에 참고로 포함됨)에는, 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 사용하여 이중특이성 항체를 생성하기 위한 방법 및 수단이 개시되어 있다. 이들 수단 및 방법은 또한 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다. 구체적으로는, 이중특이성 전장 IgG 분자만을 본질적으로 생성하기에 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인 내의 아미노산 치환 L351K 및 T366K(EU 넘버링에 따름) ('KK-변이체' 중쇄) 및 제2 도메인 내의 아미노산 치환 L351D 및 L368E('DE 변이체' 중쇄)이거나, 또는 역으로도 성립된다. 본 출원인의 US 9,248,181호 및 US 9,358,286호 특허뿐만 아니라 PCT 출원인 WO2013/157954호에서, DE-변이체와 KK-변이체가 우선적으로 쌍을 이루어서 이종이량체 (이른바, 'DEKK' 이중특이성 분자)를 형성하는 것으로 이미 입증되었다. DE-변이 중쇄의 동종이량체화(DEDE 동종이량체) 또는 KK-변이 중쇄의 동종이량체화(KKKK 동종이량체)는 동일한 중쇄들 사이의 CH3-CH3 계면에서의 하전된 잔기들 사이의 강한 반발력으로 인해 거의 발생되지 않는다. 일 실시 형태에서, CD3과 결합하는 가변 도메인을 포함하는 중쇄/경쇄 조합은 중쇄의 KK 변이체를 포함한다. 이 실시 형태에서, CD3 이외의 항원에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 중쇄/경쇄 조합은 중쇄의 DE 변이체를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, CD3 이외의 항원은 CLEC12A이다. 바람직한 실시 형태에서, CLEC12A에 결합하는 가변 도메인의 VH는 도 13에 도시된 바와 같이 MF4327이다.

일부 항체는 CH2/하부 힌지 영역에서 변형되어, 예를 들어 Fc-수용체 상호작용을 감소시키거나 C1q 결합을 감소시킨다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인을 갖는 IgG 항체여서, Fc-감마 수용체에 대한 이중특이성 IgG 항체의 상호작용이 감소되게 된다. 이러한 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인은 바람직하게는 (EU 넘버링에 따라) 위치 235 및/또는 236에서의 아미노 치환, 바람직하게는 L235G 및/또는 G236R 치환을 포함한다.

대안적으로, 일부 항체는, 예를 들어 Fc 수용체 상호작용을 향상시키거나 C1q 결합을 향상시키도록 변형된다. 자가면역 적응증에 관한 실시 형태의 경우, 이러한 변형은 바람직할 수 있다.

본 발명은 항원-결합 단백질, 바람직하게는 본 발명의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 항원-결합 단백질, 바람직하게는 본 발명의 항체를, 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위해, 추가로 제공한다. 대상체는 바람직하게는 신체로부터 제거될 세포를 갖는다. 세포는 자가면역 반응을 유도하는 비정상 면역 세포 또는 암 세포 등일 수 있다. 이러한 목적에 적합한 가변 도메인은, 특히, 공통 경쇄 및 MF9249 및 MF8397의 VH를 갖는 도메인이다. 이들은 적합하게 낮은 친화도 및 낮은 세포 사멸 활성을 갖지만, 자가면역 반응 조건 하에서 기능적이다. 이러한 목적에 적합한 가변 도메인은, 특히,

공통 경쇄 및 MF9267, MF8057, MF8058, MF8078 및 MF8508의 VH를 갖는 도메인이다. 이들 가변 도메인은 항암 목적에 적합한 친화도 및 적합한 세포 사멸 활성을 갖는다.

추가로, 본 명세서에서 제시된 발명은, 결합 도메인 MF8078을 포함하여, 국소적으로 투여되거나 국소적으로 발현될 수 있는 높은 세포 사멸 활성을 갖는 고친화성 가변 도메인을 갖는 항원-결합 단백질 또는 항체를 포함한다. 본 발명은, 당업자에게 공지된 바와 같이, 예를 들어, 암용해성 바이러스, 흑색종 또는 뇌와 같은 별도의 구획에 있는 기타 암에 대한 국소 치료를 포함하는 국소 투여 수단을 통해 항원-결합 단백질, 바람직하게는 본 발명의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 항원-결합 단백질, 바람직하게는 본 발명의 항체를, 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위해, 추가로 제공하며, 이는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 것과 같은 중간 내지 높은 친화도 및 상대적 높은 세포독성을 갖는다. 이러한 목적에 적합한 가변 도메인은, 특히,

공통 경쇄 및 MF8057, MF8058, MF9267, MF8508 및 MF8078의 VH를 갖는 도메인이다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 암의 위험을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : SFGIS

CDR2 : GFIPVLGTANYAQKFQG

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는

하기 아미노산 서열:

CDR1 : SX₁TFTIS;

CDR2 : GIIPX₂FGTITYAQKFQG;

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하고;

여기서,

X₁ = K 또는 R;

X₂ = L 또는 I이다.

본 발명은 항원-결합 단백질, 바람직하게는 본 발명의 항체를, 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위해, 추가로 제공하며, 이는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 것과 같은 중간 내지 높은 친화도 및 상대적 높은 세포독성을 갖는다. 이러한 목적에 적합한 가변 도메인은, 특히, 공통 경쇄 및 MF8048, MF8056 및 MF8101의 VH를 갖는 도메인이다.

CDR1 : SKTLTIS;

CDR2 : GIIPIFGSITYAQKFQD;

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는

하기 아미노산 서열:

CDR1 : GSGIS;

CDR2 : GFIPFFGSANYAQKFRD;

CDR3 : RGNWNPX₁₃DP를 포함하고;

여기서,

X₁₃ = L 또는 F이다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 암의 위험을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : RX₃WIG;

CDR2 : IIYPGDSDTRYSPSFQG;

CDR3 : X₄IRYFX₅WSEDYHYYX₆DV를 포함하고;

여기서,

X₃ = F 또는 Y;

X₄ = H 또는 N;

X₅ = D 또는 V;

X₆ = L 또는 M이다.

일 실시 형태에서, X₃ = F; X₄ = H; X₅ = D; 및 X₆ = L이다. 추가 실시 형태에서, X₃ = Y; X₄ = N; X₅ = V; 및 X₆ = M이다.

CDR1 : SYALS;

CDR2 : GISGSGRTTWYADSVKG;

CDR3 : DGGYSYGPYWYFDL을 포함한다.

CDR1 : SYALS;

CDR2 : AISGSGRTTWYADSVKG;

CDR3 : DGGYTYGPYWYFDL을 포함한다.

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFISYALSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYTYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS를 포함하고; 상기 아미노산 서열은 CDR 이외의 하나 이상의 위치에서, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다.

CDR1 : DYTMH;

CDR2 : DISWSSGSIGYADSVKG;

CDR3 : DHRGYGDYEGGGFDY를 포함한다.

CDR1 : DYTMH;

CDR2 : DISWSX₇GX₈X₉X₁₀YADSVKG;

CDR3 : DHX₁₁GYGDYEGGGFDX₁₂를 포함하고;

여기서,

X₇ = S 또는 G;

X₈ = S 또는 T;

X₉ = I 또는 T;

X₁₀ = G 또는 Y;

X₁₁ = R 또는 M;

X₁₂ = H 또는 Y이며,

본 명세서에서 상기에 나타낸 바와 같은 치료에서 항원-결합 단백질, 바람직하게는 항체는 바람직하게는 종양-항원에 결합하는 중쇄-경쇄(H/L) 조합을 포함한다.

항체는 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 바람직하게는, 항체는 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 갖는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 상기 양립가능한 이종이량체화 도메인들은 바람직하게는 양립가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 이종이량체화 도메인들이다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 Fc-감마 수용체에 대한 이중특이성 또는 다중특이성 IgG 항체의 상호작용이 감소되게 하는 면역-종양학 적용을 위한 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인을 갖는 IgG 항체이다. 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인은 바람직하게는 (EU 넘버링에 따라) 위치 235 및/또는 236에서의 아미노 치환, 바람직하게는 L235G 및/또는 G236R 치환을 포함한다. 대안적으로, 자가면역 적용의 경우, Fc-감마 수용체에 대한 이중특이성 또는 다중특이성 상호작용이 향상되거나 ADCC 및 CDC가 CH2 및/또는 CH3 도메인에 대한 변형에 의해 향상된다. 예를 들어, 더 큰 선택성으로 활성화 수용체에 결합하는 Fc 영역을 (아미노산 치환의 도입을 통해) 조작함으로써, 자가면역 관련 질병의 치료를 위한 항암 Mab 또는 CD3 표적화 결합 아암에 의해 요구되는 세포독성 활성을 매개하는 더 큰 능력을 갖는 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체의 ADCC를 향상시키기 위한 보고된 기술은 탈푸코실화(afucosylation)이다. (예를 들어, 문헌[Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489] 참조). 따라서, 탈푸코실화된 본 발명에 따른 이중특이성 항체가 추가로 제공된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들어 당조작(glycoengineering)(Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt (Roche) 및 Eureka Therapeutics) 및 돌연변이유발(Xencor 및 Macrogenics)을 포함하여 ADCC 향상을 달성하기 위해 여러 다른 전략이 사용되는 것으로 보고되었으며, 이들 모두는 저친화도 활성화 FcγRIIIa에 대한 Fc 결합을 개선하고/하거나 저친화도 억제성 FcγRIIb에 대한 결합을 감소시키는 것으로 보인다.

항체는 바람직하게는 공통 경쇄를 포함한다.

본 발명은 추가로 종양-항원에 결합하는 가변 도메인 및 인간 CD3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 단백질, 바람직하게는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기서 가변 도메인 각각은 상이한 중쇄 가변 영역 및 공통 경쇄 가변 영역을 포함하고, 인간 CD3에 결합하는 가변 도메인의 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : SFGIS

CDR2 : GFIPVLGTANYAQKFQG

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는

하기 아미노산 서열:

CDR1 : SX₁TFTIS;

CDR2 : GIIPX₂FGTITYAQKFQG;

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하고;

여기서,

X₁ = K 또는 R;

X₂ = L 또는 I이다.

CDR1 : SKTLTIS;

CDR2 : GIIPIFGSITYAQKFQD;

CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는

하기 아미노산 서열:

CDR1 : GSGIS;

CDR2 : GFIPFFGSANYAQKFRD;

CDR3 : RGNWNPX₁₃DP를 포함하고;

여기서,

X₁₃ = L 또는 F이다.

본 발명은 추가로 종양-항원에 결합하는 가변 도메인 및 인간 CD3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 단백질, 바람직하게는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기서 가변 도메인 각각은 상이한 중쇄 가변 영역 및 공통 경쇄 가변 영역을 포함하고, 인간 CD3에 결합하는 가변 도메인의 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : RX₃WIG;

CDR2 : IIYPGDSDTRYSPSFQG;

CDR3 : X₄IRYFX₅WSEDYHYYX₆DV를 포함하고;

여기서,

X₃ = F 또는 Y;

X₄ = H 또는 N;

X₅ = D 또는 V;

X₆ = L 또는 M이다.

CDR1 : SYALS;

CDR2 : GISGSGRTTWYADSVKG;

CDR3 : DGGYSYGPYWYFDL을 포함한다.

본 발명은 추가로 종양-항원에 결합하는 가변 도메인 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 단백질, 바람직하게는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:

CDR1 : SYALS;

CDR2 : AISGSGRTTWYADSVKG;

CDR3 : DGGYTYGPYWYFDL을 포함한다.

CDR1 : DYTMH;

CDR2 : DISWSSGSIGYADSVKG;

CDR3 : DHRGYGDYEGGGFDY를 포함한다.

CDR1 : DYTMH;

CDR2 : DISWSX₇GX₈X₉X₁₀YADSVKG;

CDR3 : DHX₁₁GYGDYEGGGFDX₁₂를 포함하고;

여기서,

X₇ = S 또는 G;

X₈ = S 또는 T;

X₉ = I 또는 T;

X₁₀ = G 또는 Y;

X₁₁ = R 또는 M;

X₁₂ = H 또는 Y이며,

일 실시 형태에서, 종양 항원에 결합하는 가변 도메인의 중쇄 가변 영역은 바람직하게는 MF8233(EGFR)의 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDRHWHWWLDAFDYWGQGTLVTVSS를 포함하고,

다른 실시 형태에서, 종양 항원에 결합하는 가변 도메인의 중쇄 가변 영역은 바람직하게는

MF4327(CLEC12A)의 아미노산 서열

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGTLVTVSS를 포함하고,

본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 유도체 또는 본 발명의 약제학적 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위해, 추가로 제공한다. 종양을 갖거나 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료를 위해, 항체는 본 발명의 이중특이성 항체인 것이 바람직하다. 바람직하게는, CD3 결합 항체는 종양 항원에 결합하는 중쇄/경쇄 조합을 포함한다.

CD3/종양 항원 이중특이성 항체 및 이러한 이중특이성 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 고형 또는 혈액 종양의 치료에 사용하기 위해 제공된다. 바람직한 고형 종양은 상피 기원의 것; 난소 및 자궁내막 종양과 같은 부인과 암; 전립선암, 뇌암 또는 임의의 다른 고형 종양이다.

다양한 백혈병 및 골수성 기원의 전백혈병(pre-leukemic) 질환뿐만 아니라 B 세포 림프종의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CD3/종양 항원 이중특이성 항체 또는 이의 유도체 또는 이러한 이중특이성 항체 또는 이의 유도체를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 질병은 골수성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS) 및 만성 골수성 백혈병(CML)과 같은 전백혈병 질환, 및 호지킨 림프종 및 대부분의 비-호지킨 림프종을 포함한다. 또한 B-ALL; T-ALL, 외투 세포 림프종이 또한 본 발명의 항체로 치료하기 위한 바람직한 표적이다. 따라서, 본 발명은 골수이형성 증후군(MDS), 만성 골수성 백혈병(CML), 다발성 골수종(MM) 또는 바람직하게는 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에서 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이성 전장 IgG 항체를 제공한다. 또한, MDS, CML, MM 또는 바람직하게는 AML의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 본 발명에 따른 이중특이성 IgG 항체의 용도가 제공된다.

환자에게 투여되는 본 발명에 따른 항체의 양은 전형적으로 치료적 창(therapeutic window) 내에 있어야 하는데, 이는 치료적 효과를 얻는 데 충분한 양이 사용되지만, 그 양은 허용 불가능한 정도의 부작용으로 이어지는 역치 값을 초과하지 않음을 의미한다. 원하는 치료적 효과를 얻는 데 필요한 항체의 양이 낮을수록, 전형적으로 치료적 창은 더 클 것이다. 따라서, 낮은 투여량에서 충분한 치료적 효과를 발휘하는 본 발명에 따른 항체가 바람직하다.

유럽 및 미국에서, 대략 30.000명의 환자가 매년 AML로 진단된다. 이들 환자의 대부분의 연령은 60세 이상이다. 고령은 AML에서 결과의 주요 부정적인 결정요인이며 집중 치료를 받은 고령 AML 환자의 장기 생존(5년)은 대략 10%이다. 유도 화학요법으로 관해에 도달한 거의 모든 환자에서 질병 진행은 3년 이내에 관찰된다. 현재 관해 후 치료는 AML을 갖는 고령 환자에서, 존재하는 경우, 제한된 값을 나타내었다. 따라서, 잔류 저항성 백혈병의 상당한 부하가 남아 있고 약물 내성 백혈병 세포의 생존 하위 집단은 빠르게 재발을 발생시킨다. 완전한 관해를 유도하고 유지하기 위한 노력으로 이러한 화학요법 비반응성 AML 종양 세포를 표적화하기 위해서는 완전히 상이한 작용 방식을 갖는 새로운 유형의 약물이 필요하다. 고령 AML 환자의 50% 초과, 젊은 환자의 약 80%에서 다수의 집중 화학요법 병용으로 완전한 관해(CR)가 달성될 수 있지만, 반응 또는 생존의 진보는 주요 연구 과제로 남아 있다. 고령의 AML 환자에서의 65건의 랜덤 임상 시험(환자 15.110명)의 최근 공개된 네트워크 메타-분석에서, 대부분의 수정된 연구 유도 계획은 다우노루비신 및 시타라빈을 사용한 기존의 3+7 유도 계획과 비교하여 유사하거나 훨씬 더 나쁜 효능 프로파일을 갖는다. AML의 이러한 표준 치료는 높은 이환율 및 심지어 사망률과 관련된다. CR 환자의 대다수는 화학요법 후 남아있는 백혈병 줄기 세포로 인해 재발된다. 추가의 용량 강화는 허용 불가능한 독성으로 인해 제한된다. 따라서, 바람직하게는 독성이 적은 새로운 치료 방식에 대한 긴급한 필요성이 특히 AML이 있는 고령 환자에게 대두되고 있다.

화학요법 비반응성 AML의 치료는, 환자 자신의 면역 체계로부터 AML 종양 세포로 T 세포를 재유도함으로써 그리고 이중특이성 항체를 사용한 T 세포의 후속 종양 표적-특이적 활성화에 의해 달성될 수 있다. 이러한 과정은 또한 소위 "T-세포 결합 접근법"으로 알려져 있다. 이러한 방식으로, 환자의 면역 시스템은 강화되고, AML 종양 세포를 공격 및 근절하기 위해 재표적화된다. 예를 들어, CD3xCLEC12A 이중특이성 IgG 항체는 T 세포를 AML 종양 세포로 효율적으로 재유도하여, 그에 의해 AML 종양 세포 용해를 유도한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예

세포주

BxPC3은 인간 췌장암 세포주이다.

HCT-116은 인간 결장암 세포주이다.

CD3을 이용한 Memo® 마우스의 면역화

CD3에 결합하는 인간 항체의 생성을 위해, 인간 공통 경쇄 및 인간 중쇄(HC) 미니 유전자좌 (인간 V 유전자 단편, 모든 인간 D 및 모든 인간 J의 선택을 포함함)의 트랜스제닉 마우스(본 명세서에 참조로 포함된 W02009/157771호 참조)는 TCR/CD3 함유 리포입자(인터그럴 몰레큘러(Intergral Molecular))로 면역화되었다. 이들 마우스는 'MeMo®' 마우스로 지칭된다. 본 명세서에 개시된 서열을 갖는 특정 중쇄 가변 영역 또는 3가 다량체의 경우, 이는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다.

MeMo® 마우스는 Hek293T 유래의 인간 5D5M TCR/CD3 함유 리포입자로 면역화된 다음에, 항 TCR/CDR3 면역반응 생성 및 항 TCR/CD3 항체 패널 생성을 위해 인간 T 세포로 면역화되었다.

리포입자는 세포 표면으로부터 직접 구조적으로 온전한 막단백질을 농축하여, 이러한 복합 단백질이 항체 면역화 및 스크리닝을 위해 가용성 고농도 단백질로서 조작될 수 있게 한다.

면역화를 위해 본 연구에 사용된 리포입자는 5D5M TCRαβ 조합체를 포함한다. 5D5M TCRαβ 조합을 포함하는 벡터를 합성하고 클로닝하고 HEK293T 세포(인터그럴 몰레큘러(Intergral Molecular))로의 일시적 형질감염에 의해 이러한 TCR/CD3 조합체를 포함하는 리포입자를 생성하는 데 사용하였다.

5D5M TCRα

MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVMDSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

5D5M TCRβ

MRIRLLCCVAFSLLWAGPVIAGITQAPTSQILAAGRRMTLRCTQDMRHNAMYWYRQDLGLGLRLIHYSNTAGTTGKGEVPDGYSVSRANTDDFPLTLASAVPSQTSVYFCASSEAGGNTGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF

MeMo® 마우스를 TCR/CD3 리포입자 및 1차 인간 T 세포를 사용하여 면역화에 사용하였다.

면역화 스케줄은 일수 35, 56, 77 및 98의 시점을 포함하며, 여기서 항원 특이적 lg 혈청 역가는 항 마우스 lgG 검출을 사용하는 QTG 유래 3SDX TCR/CD3 양성 및 음성 리포입자를 사용한 ELISA 및 양성 대조군으로서 CD3c5E-Fc 융합 단백질을 사용한 ELISA에 의해 측정되었다. 일수 35에 채취한 혈청에서 관찰한 반응성은 어떤 마우스가 관련 항-TCR/CD3 반응을 발생시켰는지를 결정할 것이다.

모든 면역화된 마우스에 대해,

역가가 인간 TCR/CD3에 대해 1/300일 때(리포입자를 사용하는 ELISA에서), 또는:

역가가 인간 TCR/CD3에 대해 1/300 미만 내지 1/100 초과이며 최종 부스터 면역화 동안 증가하지 않았을 때, 항체 발견을 위한 림프성 물질을 수집하고 저장하였다.

리포입자를 사용한 프라이밍(priming) 면역화

MeMo® 마우스에서 TCR/CD3에 대한 체액성 면역반응을 프라이밍하기 위해, 인간 5D5M TCRαβ 조합체를 포함하는 리포입자를 면역화에 사용하였다. 리포입자를 첫 번째 및 두 번째 주입을 위해 게르부 애주번트(Gerbu adjuvant)와 함께 사용하였다.

다클론성 T 세포를 사용한 부스터 면역화

마우스를 세포 현탁액의 피하 주사에 의해 면역화시켰다. 제1 부스터 면역물(일수 28)은 PBS 중의 세포와 애주번트

의 혼합체로 구성되었으며, 모든 후속 주사는 PBS 중의 세포로만 구성된다. 일수 35에 인간 TCR/CD3에 대해 1/300의 혈청 lgG 역가(리포입자를 사용하여 ELISA에 의해 결정됨)를 나타낸 마우스는 일수 42, 일수 43 및 일수 44에 세포로 추가 주사를 맞았다. 이러한 기준을 충족시키지 못한 마우스는 세포로 부스터 면역화(일수 42 및 49)를 투여받는다. 모든 후속 면역화는 PBS 중의 세포의 피하 주사로 주어진다. 최종 면역화 후에, 마우스를 희생시키고, 혈청을 채혈하고, 비장 및 좌측 서혜부 림프절을 채취한다.

ELISA에서의 면역화 마우스의 혈청 스크리닝

중간 혈청 lgG 역가를 TCR/CD3 함유 리포입자 및 '널(null)' 리포입자를 사용하여 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 혈청 lgG 역가는 항 마우스 lgG 염색을 사용하여 측정하였는데, 이러한 염색이 가장 감도가 높은 것으로 나타났기 때문이었다.

VH 유전자의 RT-PCR 클로닝에 의한 '면역' 파지 항체 레퍼토리의 생성

'면역' 파지 항체 레퍼토리의 작제를 위하여, 성공적으로 면역화된 마우스로부터, 서혜부 림프절을 사용하였다. Trizol LS를 사용하여 림프구양 조직으로부터 RNA를 추출하고, IgG-CH1 특이적 프라이머를 사용하여 1 ㎍의 총 RNA를 RT 반응에 사용하였다. 이어서, 생성된 cDNA를 사용하여, 자체(in-house) 개발된 VH-특이적 프라이머를 사용하여 VH-인코딩 cDNA의 다중클론 풀(pool)을 증폭시켰는데, 이는 본질적으로 문헌[Marks et al. (J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97)]에 기재된 바와 같다. 이어서, 생성된 PCR 산물을, 경쇄가 모든 항체에 대해 동일하고 벡터에 의해 인코딩되는 것을 제외하고는, 문헌[de Haard et al. (J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30)]에 기재된 바와 같이, 파지 상에서의 Fab 단편의 디스플레이를 위하여 파지미드 벡터에서 클로닝하였다. 연결(ligation) 후에, 파지미드를 사용하여 E. 콜라이(E.coli) TG1 세균을 형질전환시키고, 형질전환된 세균을 암피실린 및 글루코스를 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 모든 파지 라이브러리는 10e6개 초과의 형질전환체를 함유하였고, 80% 초과의 삽입 빈도를 가졌다. 세균을 하룻밤 성장 후에 수집하고, 이를 사용하여 확립된 프로토콜에 따라 파지를 제조하였다 (문헌[de Haard et al., J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30]).

인간 CD3에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 담지하는 파지의 선택.

파지 라이브러리를 표준화된 절차에 따라 구조(rescue)하고(문헌[J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97]; 문헌[J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30]), 면역 파지 항체 레퍼토리의 하나 이상의 라운드의 선택으로 파지를 선택하였다. 제1 라운드에서는, 재조합 CD3 단백질을 maxisorp™ ELISA 플레이트의 웰 상에 또는 NUNC 면역-튜브에 코팅한 반면, 제2 라운드에서는, 인간 CD3 단백질을 과발현하는 세포 또는 재조합 CD3 단백질을 사용하였다. maxisorp™ ELISA 플레이트 또는 면역-튜브를 4% ELK로 차단하였다. 파지 항체 라이브러리를 또한 4% ELK 및 과량의 인간 IgG로 차단하여, 코팅된 항원에 대한 파지 라이브러리의 첨가 전에 Fc 영역 결합제를 고갈시켰다.

파지 라이브러리와 코팅된 단백질과의 인큐베이션을 진탕 조건 하에서 실온에서 2시간 동안 수행하였다. 이어서, 플레이트 또는 튜브를 PBS 중 0.05% Tween-20으로 세척한 후, PBS로 5 내지 10회 세척하였다. 결합된 파지를 50 mM 글리신 (pH 2.2)을 사용하여 용출하고, E. 콜라이 TG-1에 첨가하고, 파지 감염을 위하여 37℃에서 인큐베이션하였다.

후속으로, 감염된 세균을 암피실린 및 글루코스가 담긴 한천 플레이트 상에서 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 선택의 제1 라운드 후에, 콜로니를 플레이트로부터 긁어내어 합하고, 이후에 구조하고 증폭시켜, 합성 레퍼토리를 위한 풍부화된 제1 라운드 파지 풀을 제조하였다. '면역' 레퍼토리의 경우, 파지 선택의 제1 라운드 후에 표적 결합을 위하여 단일 클론을 스크리닝하였다.

항체 클로닝 및 생성

본 명세서에 사용되는 바와 같은 이중특이성 항체는 전형적으로 하나 또는 둘의 가변 도메인의 중쇄 가변 영역의 특정 아미노산 서열에서만 서로 상이하다. 중쇄 가변 영역을 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 발현 벡터 내로 클로닝함으로써 항체를 생성하였다. 이중특이성 항체의 생성을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다.

간략하게 말하면, CD3 표적화된 가변 도메인에 대한 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를, IgG 중쇄 이종이량체의 생성을 위해 CH3 영역에서 KK 잔기(L351K, T366K)를 인코딩하는 MV1624 벡터(도 10a 참조) 내로 클로닝하였다(WO2013/157954호 및 WO2013/157953호). Fc 불변 영역은 Fc 이펙터 기능을 침묵시키기 위해 CH2 내에 돌연변이를 함유한다. 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 작제물 내의 스터퍼(Stuffer) 영역을 대체한다. 가변 영역은 인코딩된 HC 신호 펩티드(도시되지 않음)에 의해 선행된다. EGFR 표적화된 가변 도메인에 대한 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를, CH3 영역에 L351D-L368E 돌연변이를 보유하는 이중특이성 항체의 기본 항체 부분의 제2 중쇄를 발현하는 벡터 MV1625(도 10b) 내로 클로닝하였다(WO2013/157954호 및 WO2013/157953호). 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 작제물 내의 스터퍼 영역을 대체한다. 가변 영역은 인코딩된 HC 신호 펩티드(도시되지 않음)에 의해 선행된다. 두 작제물은 또한 IGKV1-39/jk1 경쇄의 발현을 위한 발현 카세트를 함유한다. 언급된 경쇄와 함께 2개의 중쇄의 발현은 이중특이성 항체의 생성으로 이어진다.

293-F 세포를 24웰 플레이트 포맷으로 설계된 항체의 발현에 사용하였다. 형질감염 2일 전에, 293-F 세포 스톡을 1:1 비로 293-F 배양 배지에서 분할하고 155rpm의 궤도 진탕 속도로 37℃ 및 8%CO₂에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 세포를 형질감염 전날에 5x10⁵ 세포/mL의 밀도로 희석하였다. 4ml의 현탁 세포를 24개의 딥 웰 플레이트 내로 접종하고, 통기성 씰(seal)로 덮고, 285rpm의 궤도 진탕 속도로 37℃ 및 8% CO2에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 형질감염일에 4.8 ml 293-F 배양 배지를 240 ㎍의 폴리에틸렌이민(PEI) 선형(MW 25,000)과 혼합하였다. 생성될 각각의 IgG에 대해, 200 uL의 293F 배양 배지-PEI 혼합물을 8 μl의 DNA(IgG 이종이량체의 경우 각각의 중쇄를 인코딩하는 DNA 4 μl)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20분간 인큐베이션한 후에, 세포에 서서히 첨가하였다. 트랜스펙션 다음 날에, 500 μL의 293 F 배지에 희석된 페니실린-스트렙토마이신(펜 스트렙(Pen Strep))을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 트랜스펙션 7일 후에 채취할 때까지 285 rpm의 오비탈 진탕 속도로 37℃ 및 8% CO₂에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 500 g에서 5분간 원심분리하고, IgG를 포함하는 상청액을 10 내지 12 μm 멜트 블로운 폴리프로필렌 필터 플레이트를 사용하여 여과하여, 정제 전에 -20℃에서 보관하였다.

배양 상청액으로부터의 항체의 정제

항체를 함유하는 배지를 수집하고 원심분리하여 세포 파편을 제거한다. 이어서, 단백질 A 세파로오스 비드를 배지에 첨가한다. 배지 및 단백질 A 세파로오스 비드를 항체와 함께 인큐베이션하여 결합시킨다.

인큐베이션 후에, 상기 비드를 배지로부터 분리하여, 진공 필터에 의해 세척한다. 항체를 용출 완충액과 인큐베이션함으로써 비드로부터 용출시킨다.

임의로, 정제된 IgG의 완충액을 교환하고/탈염한다.

완충액 교환

정제된 항체를 탈염하기 위해, 항체 분획을 필터 플레이트 또는 필터 컬럼을 사용하여 원심분리한다. 상기 플레이트 또는 컬럼은 항체 분획의 부피를 감소시키기 위해 원심분리된다. 이어서, PBS 또는 필요한 완충액을 분획에 첨가하여, 상기 완충액을 저염 완충액으로 대체한다. 임의로, 항체의 저장 완충액을 추가로 탈염하기 위해, 이러한 원심분리 단계에 이어서, 완충액을 첨가하는 것을 반복한다.

항체 종양 항원 특이적 T 세포 활성화 및 BxPC3 세포 또는 HTC-116 세포의 용해.

세포독성 검정에서 종양 항원-특이적 T 세포 활성화 및 종양 항원 양성 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 특정 CD3 x 종양 항원 이중특이성 IgG 조합의 용량을 시험하였다. 이펙터 세포는 건강한 공여자-유래 휴지 T 세포였으며 표적 세포는 BxPC3 세포 또는 HTC-116 세포였다.

표준 기술에 따라 Ficoll 및 EasySep 인간 T 세포 단리 키트를 사용하여, 건강한 공여자로부터의 전혈로부터 정지 T 세포를 단리하고, 유세포측정에 의한 분석을 사용하여 항 CD3 항체로 >95% T 세포 순도를 체크하고, 이어서 동결보존하였다. 세포독성 분석을 위해, 동결보존된 T 세포를 해동하고, 해동 시의 생존율이 >90%이면 사용하여, 표준 트립판 블루 염색에 의해 측정하였다. 요약하면, 세포독성 검정을 위해, 해동된 휴지 T 세포 및 BxPC3 또는 HCT116 표적 세포를 48시간 동안 5:1의 E:T 비율로 공배양하였다. 항체는 희석 범위에서 시험되었다. CD3 단일특이성 항체 및 EGFR 단일특이성 항체뿐만 아니라 비관련 IgG1 동종형 대조 mAb(예를 들어, CD3 및 다른 항원, 예컨대 파상풍 독소(TT)에 결합하는 항체)가 대조군으로서 이 검정에 포함된다. T 세포 활성화를 유세포측정을 사용하여 정량화하였다. CD8 T 세포를 CD8 발현에 기초하여 게이팅하였고, 후속하여 T 세포 상에서 CD69 발현을 측정함으로써 그의 활성화 상태에 대해 분석하였다. 셀타이터글로(프로메가(Promega))에 의해 평가된 ATP 레벨을 측정하여 살아있는 세포의 분획을 측정하여 표적 세포 용해를 결정하였다. 엔비전 마이크로플레이트 리더에서 발광에 의해 측정된 ATP 레벨은 상대 광 단위(Relative light unit, RLU)값을 생성하며, 이를 그래프패드 프리즘을 사용하여 분석하였다.

각각의 샘플에 대한 표적 세포 용해를 다음과 같이 계산하였다:

사멸률(%) = (100-(RLU 샘플/RLU no IgG)×100).

이러한 검정에서, 이중특이성 항체는 2개의 결합 도메인을 갖는다. 결합 도메인들 중 하나는 EGFR에 대해 표적화되고 다른 하나는 CD3에 대해 표적화된다. 두 결합 도메인은 동일한 (공통) 경쇄 가변 영역(VL) 및 상이한 중쇄 가변 영역(VH)을 갖는다. EGFR 표적화된 결합 도메인은 MF8233의 아미노산 서열을 갖는 VH를 갖는다. CD3 표적화된 결합 도메인은 CD3에 대해 표시된 MF들 중 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH를 갖는다. 이중특이성 항체는 Fc 이펙터 기능을 침묵시키기 위해 CH2 내에 돌연변이를 함유한다.

항체 MF8233xMF8397은 5:1의 E ± T 비로 48시간의 공동 배양 후에 측정된 CD4 및 CD8 T 세포에서 CD69(도 4 내지 도 6) 및 CD25(도 4 내지 6)의 상향조절을 유도하였다. T 세포-매개 용해를 48시간 후에 측정하였다.

CD3 이중특이성 항체 특성화

후보 EGFR/CD3 IgG 이중특이성 항체가 임의의 적합한 검정을 사용하여 결합에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, HPB-ALL 세포(DSMZ, ACC 483) 상의 막-발현된 CD3에 대한 결합은 (WO2014/051433호에 이미 기재된 바와 같은 FACS 절차에 따라) 유세포측정에 의해 평가될 수 있다. 일 실시 형태에서, HPB-ALL 세포 상의 CD3에 대한 후보 EGFR/CD3 이중특이성 항체의 결합은 당업계에 알려진 표준 절차에 따라 수행되는 유세포측정에 의해 입증된다. 세포 발현된 CD3에 대한 결합은 CD3δ/ε 또는 CD3γ/ε로 형질감염된 CHO 세포를 사용하여 확인될 수 있다. EGFR에 대한 후보 이중특이성 IgG1의 결합은 BxPC3 및 HCT-116뿐만 아니라 EGFR 발현 작제물로 형질감염된 CHO 세포를 사용하여 결정될 수 있으며; CD3 단일특이성 항체 및 EGFR 단일특이성 항체뿐만 아니라 비관련 IgG1 동종형 대조 mAb(예를 들어, CD3 및 다른 항원, 예컨대 파상풍 독소(TT)에 결합하는 항체)가 대조군으로서 이 검정에 포함된다.

수퍼클러스터 1, 3 및 4로부터의 추가 클론의 생성

('인간 CD3에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 담지하는 파지의 선택' 섹션에 기재된 바와 같은) 면역 파지 라이브러리 스크리닝으로부터, 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 담지하는 추가 클론을 특성화하였다. 수퍼클러스터 1로부터, MF8048, MF8101 및 MF8056을 포함하는 추가 클론을 확인하였다. 수퍼클러스터 3의 MF8562 및 수퍼클러스터 4의 MF8998을 포함한, 수퍼클러스터 3 및 수퍼클러스터 4로부터 추가 클론을 확인하였다.

수퍼클러스터 4로부터, 차세대 시퀀싱(NGS) 분석을 사용하여 추가의 새로운 클론을 확인하였다. 항-CD3 패널을 생성하는 데 사용된 MeMo® 마우스로부터 존재하는 VH 유전자 풀에 대해 NGS를 수행하였다. 이러한 목적을 위하여, 상이한 마우스로부터 얻은 서열 데이터 세트를 수퍼클러스터 4 MF에 속하는 MF 서열과 비교하였다. 이는 수퍼클러스터 4에 속하는 서열 변이체 클론 MF10401 및 MF10428의 확인으로 이어졌다. 몇몇 상이한 돌연변이가 상이한 서열에 대해 HCDR1 및 HCDR2에서 발견되었다.

수퍼클러스터 1, 3 및 4로부터의 모든 추가 클론의 VH 서열을 MV1624(DM-KK) 벡터 내로 클로닝하였고, 상기 '항체 클로닝 및 생성' 섹션에서 설명된 바와 같이, 추가 특성화를 위해 CD3xEGFR 이중특이성 포맷으로 발현시켰다.

수퍼클러스터 1 및 4로부터의 추가 클론의 특성화

수퍼클러스터 1로부터의 추가 클론을 이중특이성 포맷의 그의 기능적 활성에 대하여 특성화하였다. 이중특이성 CD3xEGFR 항체의 EGFR 결합 도메인은 MF8233에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 갖는다. 대조군으로서, 이러한 CD3 클론을 또한, MF1337에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 갖는 다른 항원(예를 들어, 파상풍 독소)으로 시험하였다. 상기된 바와 같은 '항체 종양 항원 특이적 T 세포 활성화 및 BxPC3 세포 또는 HTC-116 세포의 용해' 및 'CD3 이중특이성 항체 특성화' 섹션에 따라 수퍼클러스터 1로부터의 이미 특성화된 MF 클론의 친화도와 서열 변이체의 친화도를 직접 비교기 위해, 수퍼클러스터 1로부터의 참조 MF(MF8057 및 MF8058)를 포함하였다. 유세포측정을 사용한 인간 CD3-TCR 복합체를 발현하는 HPB-All 세포에 대한 결합 친화도(도 14a 및 도 18) 및 세포독성 검정에서 T-세포 활성화 및 종양 항원 양성 표적 세포(HCT-116)의 용해(도 14b 내지 도14e)를 수행하였다. 이중특이성 항체가 MF1337 대조 아암을 갖는 표적 세포 용해는 관찰되지 않았다. 시험된 상이한 CD3 클론의 경우, 표적 세포 용해가 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. 낮은 표적 세포 용해가 MF8048에 대해 관찰되었다. CD4 및 CD8 T 세포에서의 활성화 마커 CD69 및 CD25의 발현 수준을 T-세포 활성화의 평가를 위해 FACS 염색에서 측정하였다. 용량-의존적 T-세포 활성화가 모든 클론에 대해 관찰되었으며, 음성 대조군에 대해서는 T-세포 활성화가 관찰되지 않았다. 마지막으로, 표준 제조업체의 지침에 따라 Luminex® 검정(eBiosciences™)을 사용하여 48시간 후 HCT-116 세포를 사용한 EGFRxCD3 세포독성 검정으로부터 유래된 상청액에서 IFN-γ 및 TNF-α의 사이토카인 생성을 결정하였다(도 14f 및 도 14g).

수퍼클러스터 4에 속하는 추가 클론의 특성화를 위해, FACS에서 HPB-ALL 세포에 대한 결합 친화도를 결정하였다(도 15). 파상풍 독소에 특이적인 2개의 동일한 MF1337 아암을 갖는 1가 항체인 PG1337을 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포독성 검정을 위해, HCT-116 세포 및 BxPC3 세포는 MF8998의 활성을 시험하기 위한 표적 세포로서 사용하였고 BxPC3 표적 세포는 MF10401 및 MF10428의 활성을 시험하기 위해 사용하였다. 알려진 높은 활성을 갖는 CD3xTAA 이중특이성 항체를 양성 대조군으로서 포함시켰다. 표적 세포 용해를 세포 생존율 측정을 이용하여 정량화하였다. Luminex® 검정을 사용하여 IL-6, IFN-γ 및 TNF-α에 대한 사이토카인 수준을 측정하기 위해 세포독성 검정으로부터의 상청액을 사용하였다.

따라서, 시험된 3개의 수퍼클러스터 4 클론은 상이한 결합을 나타내지만 유사한 용해 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이들 클론의 용해 활성이 유사하였지만, 감소된 사이토카인 생성이 관찰되었다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

세포독성 검정에 의해 평가된 바와 같이, 추가로 확인된 모든 MF가 기능적임이 관찰되었다. 다음으로, 그래프를 Y-축의 용해 및 X-축의 결합 친화도 사이에서 플로팅하여(도 16a) 수퍼클러스터 내의 그리고 그에 걸친 용해와 친화도 사이의 관계를 이해하였다. 전체적으로, 다중 수퍼클러스터로 구성되고 다양한 친화도를 커버하는 항-CD3 Fab의 다양한 패널이 생성되었다. 흥미롭게도, 유사한 활성을 나타내지만 상이한 CD3 결합을 나타내는 클론이 수퍼클러스터 1 및 4에서 확인되었다(도 16b). 수퍼클러스터 1과 3의 비교는 유사한 CD3 결합 및 차등 활성을 보이는 클론을 나타내었다(도 16c).

[표 4]

CD3 항원의 특성화

상기된 바와 같이, 수퍼클러스터 1 및 수퍼클러스터 4로부터의 2개 클론, 즉 각각 MF8058 및 MF8998은 종양-세포 항원으로서 EGFR에 결합하는 Fab 아암으로서 클론 MF8233을 갖는 이중특이성 포맷으로 유사한 용해 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 17). 이러한 실험을 위해, HCT-116 세포에 대한 용해 활성을 본 명세서에서 상기된 바와 같이 측정하였다. MF9257xMF8233을 양성 대조군으로서 사용하였고, MF9257xMF1337은 음성 대조군이었다. 도 17 및 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 다중 시험된 이중특이성 항체에 대해 용량-의존적이고 높은 사멸 백분율이 관찰되었다.

[표 5]

결합 친화도

'CD3 이중특이성 항체 특성화' 섹션에 기재된 바와 같이, 추가의 CD3 클론의 결합 친화도를 인간 CD3을 발현하는 HPB-ALL 세포에 대해 FACS에서 분석하였다. CD3에 대한 MF6955 및 MF6964의 친화도를 BIAcore™ T100을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 의해 측정하였다. 항-인간 IgG 마우스 단일클론 항체(Becton and Dickinson, 카탈로그 번호 555784)를 유리 아민 화학(NHS/EDC)을 사용하여 CM5 센서 칩의 표면에 결합시켰다. 이어서, CD3xTAA 이중특이성 항체를 이러한 센서 표면 상에 캡처하였다. 후속으로, 재조합 정제된 항원인 인간 CD3δε-Fc를 결합 속도(on-rate) 및 해리 속도(off-rate)를 측정하기 위한 농도 범위에서 센서 표면 위로 이동시켰다. 매 사이클 후마다, 센서 표면을 HCl의 펄스에 의해 재생하고, CD3xTAA 이중특이성 항체를 다시 캡처하였다. 얻어진 센소그램으로부터, BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 결합 속도 및 해리 속도를 결정하였다. 도 18은 생성된 CD3 패널의 결합 친화도 범위를 설명한다.

SEQUENCE LISTING <110> Merus N.V. <120> CD3 BINDING MOLECULES <130> P122816PC00 <140> PCT/NL2020/050214 <141> 2020-03-27 <150> EP 19166345.9 <151> 2019-03-29 <150> EP 19200931.4 <151> 2019-10-01 <160> 297 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 43942 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctatttagca ttgctgctgc cagccccaac cacatttctg attgcctagg aagaacagcc 60 tttcaaattt gacttctgca tgtggatagg tgagtgtctt ttgtggatac cgacagtggg 120 aatggctcct ctcaatttga gaaattctga aggaatttcc attggcaagt tcagcaaggc 180 caactgacgg agagaggaag caccctgact gttccagttc agacactctt ggggcttgtt 240 agtaattgag tatgtgtctg gataagtgag tgtcatttgt gggtccagac agcaggatct 300 gcttttctca atttgagaaa ttccgaagga atctccattt gcagattgaa ctagcccaac 360 aaacagggag aaagcaactc aactgtttca gtttggactc tcttgggact tgcttattgt 420 tgcagcagtt agattgtatt ctggtggttg tttgtgtgtt gatgtagttg tgggagatca 480 gggtttgatc tgagtgcaga ccgcttgggt gtattcttca gggttggtct gcatgtggct 540 gtgggccagt ggagtgaggg aacatctcta cccgtatcac gctgaacatg cccaatctca 600 tctgatctca 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cataaagttt gtttaaacat cttaaatttt ataattctgt taacctgtat gtttttgttt 36480 gtttttttgt tttgttttgt ttttagcccc agatcatttt accttttctt tctttctttt 36540 atttatttat ttttttttga gacagagtct cgctcttgtc acccaggctg gagtgcagtg 36600 gcatgatctt ggctcactgc aacctccgcc tccttggttc aagtgattct cctgcctcag 36660 cctaccaact agctgggatt acaggtgccc accatcacac ctggctaatt tttgtatttt 36720 ttgggctgtg gactgttgag ttaatgctaa aatgagttaa gactttgggg gacttttggg 36780 aagacatgat tgattttgaa atgtgaggac atgagatttg ggaggtccag ggatggagtg 36840 atatggtttg gctgtgtctc cacccaaatc taatcttgaa ttgtagctcc cataattcaa 36900 catgatgcag gaggggacct ggtgggagat aattaaatca tgagggtggt tcccctatac 36960 tgttctcatg ttagacctaa aaccataaaa atcctagaag aaaacctagg cattaccatt 37020 caggacacag gcatgggcaa ggacttcatg tctaaaacac caaaagcaat ggcatcaaaa 37080 gccaaaattg acaaatggga tctaattaaa ctcaagagct tctgcacagc aaaagaaact 37140 accatcagag tgtacaggca acctacaaaa tgggagaaag tttttgcaat ctactcatct 37200 gacaaagggc taatatccag aatctacgaa gaactcaaac aaatttacaa 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Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Glu Ala Gly Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser 115 120 125 Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val 130 135 140 Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala 145 150 155 160 Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu 165 170 175 Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp 180 185 190 Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys 195 200 205 Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg 210 215 220 Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp 225 230 235 240 Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala 245 250 255 Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln 260 265 270 Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 275 280 285 Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met 290 295 300 Val Lys Arg Lys Asp Phe 305 310 <210> 15 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKV1-39/jk1 <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 15 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cca 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKV1-39/jk5 <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 17 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKV1-39/jk5 common light chain variable domain translation <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V-region IGKV1-39A <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 common light chain <400> 21 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 22 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 common light chain <400> 22 Ala Ala Ser 1 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> 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aag 288 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aga gtt 294 Arg Val <210> 25 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG heavy chain hinge region <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <400> 26 gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 45 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 28 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG heavy chain CH2 region <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 28 gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 48 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 96 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 144 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 192 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 240 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 288 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa 330 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 30 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG heavy chain CH2 domain containing L235G and G236R silencing substitutions <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 30 gca cct gaa ctc ggc agg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 48 Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 96 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 144 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 192 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 240 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 288 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa 330 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 32 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG heavy chain CH3 domain containing substitutions L351K and T366K (KK) <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 32 ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc aag ccc cca tcc cgg gag 48 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg aag tgc ctg gtc aaa ggc ttc 96 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag 144 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc 192 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg 240 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac 288 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt tga 321 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 33 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 34 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG heavy chain CH3 region containing substitutions L351D and L368E (DE) <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 34 ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc gac ccc cca tcc cgg gag 48 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc gag gtc aaa ggc ttc 96 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe 20 25 30 tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag 144 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc 192 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg 240 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac 288 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt tga 321 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 35 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 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15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Gly Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 294 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1H7232B (1129) VH-MF6955 in combination with common light chain, VH gene: IGHV3-9 <400> 294 gcggcccagc cggccatggc cgaggtgcag ctggtggagt cggggggagg cttggttcac 60 cctggcaggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcacctttga tgattatacc 120 atgcactggg tccggcaagc tccagggaag ggcctggaat gggtctcaga tattagttgg 180 aatagtggta gcagaggcta tgcggactct gtgaagggcc gattcaccat ctccagagat 240 aatgccgaga actccctgta cctgcaaatg aacagtctga gagctgagga cacggccttg 300 tattactgtg caaaagataa aagtggctac ggccactact actactacgc tatggacgtc 360 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tca 393 <210> 295 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1H7232B (1129) VH - MF6955 in combination with common light chain VH gene: IGHV3-9 <400> 295 Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Val His Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 30 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 35 40 45 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Asp Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 65 70 75 80 Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 85 90 95 Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Lys Ser Gly Tyr Gly His 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 296 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1H7241B (1145) VH - MF6964 in combination with common light chain VH gene: IGHV3-9 <400> 296 gcggcccagc cggccatggc cgaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggttcag 60 cctggcaggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat ttacctttgc tgactatacc 120 atgcactggg tccggcaagg tccagggaag ggcctggagt gggtctcaga tattggttgg 180 aatagtaata ctataggcta tgcggactct gtgaagggcc gattcgccat ctccagagac 240 aacgccaaga actccctgta tcttcaaatg aacagtctgc gacctgagga cacggcctta 300 tattactgtg taaaggataa aagtggctac gggaaattcc aatacggttt ggacgtctgg 360 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 390 <210> 297 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1H7241B (1145) VH - MF6964 in combination with common light chain VH gene: IGHV3-9 <400> 297 Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 30 Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro 35 40 45 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Asp Ile Gly Trp Asn Ser Asn Thr 50 55 60 Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp 65 70 75 80 Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu 85 90 95 Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Lys Ser Gly Tyr Gly Lys 100 105 110 Phe Gln Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130

Claims

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:
CDR1 : SFGIS
CDR2 : GFIPVLGTANYAQKFQG
CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는
하기 아미노산 서열:
CDR1 : SX₁TFTIS;
CDR2 : GIIPX₂FGTITYAQKFQG;
CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하고;
여기서,
X₁ = K 또는 R;
X₂ = L 또는 I인, 항원-결합 단백질.
제1항에 있어서,
X₁ = K; 및 X₂ = L; 또는
X₁ = R; 및 X₂ = I인, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:
CDR1 : SKTLTIS;
CDR2 : GIIPIFGSITYAQKFQD;
CDR3 : RGNWNPFDP를 포함하거나; 또는
하기 아미노산 서열:
CDR1 : GSGIS;
CDR2 : GFIPFFGSANYAQKFRD;
CDR3 : RGNWNPX₁₃DP를 포함하고;
여기서,
X₁₃ = L 또는 F인, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRSFGISWVRQAPGQGLEWMGGFIPVLGTANYAQKFQGRVTIIADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS;
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDAFKSKTFTISWVRQAPGQGLEWLGGIIPLFGTITYAQKFQGRVTITADKSTNTAFMELSSLRSEDTAMYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS; 또는
EVQLVQSGSELKKPGSSVKVSCKASGVTFNSRTFTISWVRQAPGQGLEWLGSIIPIFGTITYAQKFQGRVTITADKSTSTAFMELTSLRSEDTAIYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS; 또는
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRGSGISWVRQAPGQGLEWVGGFIPFFGSANYAQKFRDRVTITADKSATTAYMELSSLRSEDTAIYYCAKRGNWNPLDPWGQGTLVTVSS; 또는
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGVTFKSKTLTISWVRQAPGQGLEWLGGIIPIFGSITYAQKFQDRVSITADKSTNTAYLELNSLRSEDTAIYYCARRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS; 또는
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRGSGISWVRQAPGQGLEWVGGFIPFFGSANYAQKFRDRVTITADKSATTAYMELSSLRSEDTAIYYCAKRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS를 포함하고;
상기 아미노산 서열은 CDR 이외의 하나 이상의 위치에서, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:
CDR1 : RX₃WIG;
CDR2 : IIYPGDSDTRYSPSFQG;
CDR3 : X₄IRYFX₅WSEDYHYYX₆DV를 포함하고;
여기서,
X₃ = F 또는 Y;
X₄ = H 또는 N;
X₅ = D 또는 V;
X₆ = L 또는 M인, 항원-결합 단백질.
제5항에 있어서,
X₃ = F; X₄ = H; X₅ = D; 및 X₆ = L; 또는
X₃ = Y; X₄ = N; X₅ = V; 및 X₆ = M인, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTRFWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSTSTAYLQWSSLKASDTGMYYCVRHIRYFDWSEDYHYYLDVWGKGTTVTVSS; 또는
EVQLVESGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTRYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCVRNIRYFVWSEDYHYYMDVWGKGTTVTVSS를 포함하고;
상기 아미노산 서열은 CDR 이외의 하나 이상의 위치에서, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:
CDR1 : SYALS;
CDR2 : GISGSGRTTWYADSVKG;
CDR3 : DGGYSYGPYWYFDL을 포함하는, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:
CDR1 : SYALS;
CDR2 : AISGSGRTTWYADSVKG;
CDR3 : DGGYTYGPYWYFDL을 포함하는, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFKFSSYALSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS; 또는
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFISYALSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYTYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS를 포함하고;
상기 아미노산 서열은 CDR 이외의 하나 이상의 위치에서, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:
CDR1 : DYTMH;
CDR2 : DISWSSGSIGYADSVKG;
CDR3 : DHRGYGDYEGGGFDY를 포함하는, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFNFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLWLQMNSLRTEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS;
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDHWGQGTLVTVSS;
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVTSGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGTTGYADSVKGRFTISRDNAKDSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDHMGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS; 또는
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGRGTLVTVSS를 포함하고;
상기 아미노산 서열은 CDR 이외의 하나 이상의 위치에서, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 항원-결합 단백질.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 단백질로서, 상기 중쇄 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기 아미노산 서열:
CDR1 : DYTMH;
CDR2 : DISWSX₇GX₈X₉X₁₀YADSVKG;
CDR3 : DHX₁₁GYGDYEGGGFDX₁₂를 포함하고;
여기서,
X₇ = S 또는 G;
X₈ = S 또는 T;
X₉ = I 또는 T;
X₁₀ = G 또는 Y;
X₁₁ = R 또는 M;
X₁₂ = H 또는 Y이며,
바람직하게는 X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 S, S, I 및 G이고, X₁₁ 및 X₁₂는 R 및 H이거나, 바람직하게는 X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 G, S, I 및 Y이고, X₁₁ 및 X₁₂는 R 및 Y이거나, 바람직하게는 X₇, X₈, X₉ 및 X₁₀은 S, T, T 및 G이고, X₁₁ 및 X₁₂는 M 및 Y인, 항원-결합 단백질.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 공통 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항원-결합 단백질.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공통 경쇄 가변 영역은 IgVκ1-39 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항원-결합 단백질.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 생식세포계열 IgVκ1-39*01 가변 영역인, 항원-결합 단백질.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함하는, 항원-결합 단백질.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 생식세포계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함하는, 항원-결합 단백질.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열:
DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK 또는 DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK를 포함하고,
상기 아미노산 서열은 0 내지 5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 항원-결합 단백질.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 바람직하게는 이중특이성 항체인, 항원-결합 단백질.
제20항에 있어서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 H/L 사슬 조합, 및 종양-항원에 결합하는 H/L 사슬 조합을 포함하는, 이중특이성 항체.
제21항에 있어서, 종양-항원에 결합하는 상기 H/L 사슬 조합은 인간 BCMA, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CD44, CD123, CD138, CEA, CLEC12A, CS-1, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, DLL3, LGR5, MSLN, FOLR1, FOLR3, HER2, HM1.24, MCSP, PD-L1, PSMA 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는, 이중특이성 항체.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체인, 항체 또는 이중특이성 항체.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 양립가능한 이종이량체화 도메인을 갖는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함하는, 이중특이성 항체.
제24항에 있어서, 상기 양립가능한 이종이량체화 도메인은 양립가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 이종이량체화 도메인인, 이중특이성 항체.
제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 Fc-감마 수용체에 대한 이중특이성 IgG 항체의 상호작용이 감소되게 하는 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인을 갖는 IgG 항체인, 이중특이성 항체.
제26항에 있어서, 상기 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인은 (EU 넘버링에 따라) 위치 235 및/또는 236에서의 아미노 치환, 바람직하게는 L235G 및/또는 G236R 치환을 포함하는, 이중특이성 항체.
제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이성 항체.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질 또는 항체를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 항원-결합 단백질 또는 항체.
제29항의 용도를 위한 항원-결합 단백질 또는 항체에 있어서, 상기 대상체는 암에 걸렸거나 암 치료를 받는, 항원-결합 단백질 또는 항체.
제29항 또는 제30항의 용도를 위한 항원-결합 단백질 또는 항체에 있어서, 상기 치료는 제1항 내지 제3항, 및 제11항 내지 제13항의 항원-결합 단백질 또는 항체의 국소 투여 및/또는 국소 방출을 포함하는, 항원-결합 단백질 또는 항체.
제29항의 용도를 위한 항원-결합 단백질 또는 항체에 있어서, 상기 치료는 과활성 면역 시스템을 갖는 대상체에 제4항 내지 제10항의 항원-결합 단백질 또는 항체의 투여를 포함하는, 항원-결합 단백질 또는 항체.
제32항의 용도를 위한 항원-결합 단백질 또는 항체에 있어서, 상기 대상체는 자가면역 질환을 갖는, 항원-결합 단백질 또는 항체.