KR20210141453A - 인간 간세포 성장 인자 돌연변이체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

인간 간세포 성장 인자 (hHGF) 돌연변이체가 개시된다. 상기 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 담체, 및 상기 핵산 분자 또는 담체를 포함하는 숙주 세포도 개시된다. 또한, hHGF 돌연변이체 또는 상기 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물, 및 hHGF 돌연변이체 또는 상기 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자의 용도가 개시된다.

Description

인간 간세포 성장 인자 돌연변이체 및 그의 용도
본 출원은 인간 간세포 성장 인자 (hHGF)의 돌연변이체에 관한 것이다. 본 출원은 또한, 상기 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 출원은 또한, hHGF 돌연변이체 또는 상기 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 hHGF 돌연변이체 또는 상기 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. hHGF 돌연변이체 또는 상기 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자는 예를 들어 내피 세포 성장 및/또는 이동 촉진, 혈관 형성 촉진, 또는 천연 hHGF의 활성으로부터 혜택을 얻을 수 있는 질환의 치료 (예를 들어, 하지 동맥 허혈, 심근경색 및/또는 당뇨병성 말초 신경병증의 치료)에 사용될 수 있고, 따라서 의약품 제조에 사용될 수 있다.
간세포 성장 인자 (HGF)는 최초 래트 혈장 및 혈소판에서 단리되었으며 산란 인자 (SF)라고도 알려진 헤파린 친화성 분비 당단백질이다. HGF는 현재 중간엽 세포에 의해 생성되고, 수용체 c-Met에 결합하여 수용체의 티로신 키나제 활성을 활성화하고, 간세포, 상피 세포, 내피 세포, 멜라닌 세포, 조혈 세포 및 다른 유형의 세포의 성장, 이동 및 형태 발생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. HGF는 배아 간 및 태반의 발달에 중요한 역할을 하고 간, 폐, 신장 및 기타 기관의 세포 유지 및 재생에 참여하며 이러한 기관의 재생 및 손상 후 이들 기관의 복구를 촉진한다. 또한, HGF는 다양한 기원으로부터의 종양 세포에 대한 친침입 (pro-invasion) 또는 성장 억제 효과가 있다. 따라서 HGF는 광범위한 임상 적용 전망을 가진 다기능성 사이토카인이다.
성숙한 HGF는 사슬 간 이황화 결합으로 연결된 중쇄 (α 사슬)와 경쇄 (β 사슬)로 구성된 이종이량체로, α 사슬은 약 69 kD로 463 개의 아미노산을 포함하고; β 사슬은 약 34 kD로 234 개의 아미노산을 포함한다. α 사슬의 N-말단은 헤어핀 구조를 가지고 있고, C-말단 근처에는 4 개의 플라스민 유사 크링글 구조 (차례로 K1, K2, K3, K4 영역이라고 함)가 있으며, 각 크링글 구조는 약 80 개의 아미노산으로 구성된다. 현재 헤어핀 구조와 K1 영역이 HGF가 수용체 c-Met에 결합하는데 핵심 부분이라고 알려져 있고; 헤어핀 구조와 K2 영역은 함께 HGF와 헤파린 및 헤파란 설페이트와의 친화성에 필요한 구조를 구성하며; β 사슬은 세린 프로테아제 유사 접힘 영역을 포함하지만 세린 프로테아제 활성은 없다. 전체 HGF 분자에는 각각 Asn 294, Asn 402, Asn 566 및 Asn 653에 위치한 4 개의 N-글리코실화 부위가 있고, 중쇄 및 경쇄에는 각각 2 개의 N-글리코실화 부위가 포함되어 있다 (Molecular biology research of hepatocyte growth factor. Journal of Bioengineering, 2002, 18:1-4).
C-Met는 HGF의 특이적 세포막 수용체로 심근 세포, 혈관 내피 세포 등 다양한 세포에서 발현되며 HGF의 생물학적 효과를 매개한다. HGF/C-Met 시스템은 다양한 조직에서 광범위하게 발현되며, 세포 성장, 이동 및 조직 형태 발생 및 기타 복잡한 생물학적 과정의 조절에 참여한다. HGF는 그의 특이적 수용체 C-Met에 결합하여 수용체 티로신 잔기의 인산화를 유발하고 후 수용체 신호 전달 과정을 시작하는 내피 성장 인자이다; 이것은 또한, ERK의 인산화를 일으켜 STAT3 (Ser727) 인산화로 이어져 이량체를 형성하고 핵으로 들어가 c-fos와 같은 초기 성장 반응 유전자의 발현을 촉진함으로써 전사 수준에서 세포 성장을 조절한다. 연구에 의해서 HGF가 MEK, P42/44MAPK 및 P90RSR을 활성화하고 과산화수소로 인한 세포 사멸을 감소시키고 BCL-2 유전자 발현을 활성화하고 Bax 단백질의 미토콘드리아 막 표면으로의 전좌를 억제하여 미토콘드리아 막 내부 및 외부에서 전기화학적 구배를 유지하고 미토콘드리아에서 사이토크롬 C의 누출을 방지하고 캐스파제-3 및 캐스파제-9의 활성을 억제함으로써 항세포 사멸 효과를 발휘한다는 것이 또한 밝혀졌다. HGF는 또한, 혈관 내피 세포 및 혈관 평활근 세포에서 MMP-1, VEGF, HGF 및 C-Met의 발현을 자극할 수 있으며, Ets-1의 mRNA 발현 및 전사 활성을 현저히 증가시켜 혈관 신생 과정에서 중요한 역할을 한다 (간세포 성장 인자의 혈관 신생 특성은 혈관 형성을 위한 필수 전사 인자 ets-1의 상향 조절에 의존한다. Circulation, 2003, 107:1411-1417). Ets 경로가 또한, HGF가 혈관 형성을 촉진하는 분자 메커니즘 중 하나이다 (Therapeutic the formation of a blood vessel using hepatocyte growth factor. Current Gene Therapy, 2004, 4: 199-206). Ets 패밀리 전사 인자는 DNA 결합 도메인을 가지고 있으며, DNA 서열 GGA의 코어에 결합할 수 있고, 유사 분열 신호에 관여하는 다양한 유전자의 발현에 매우 중요한 역할을 하며, 이들 유전자의 전사를 제어함으로써 혈관의 형성 조절에 참여할 수 있다. HGF 유전자는 B 세포 및 대식세포 특이적 전사 인자 접합 영역, 인터루킨 26 반응 요소 (IL26RE), 형질전환 성장 인자 억제 요소 (TNFIE) 및 cAMP 반응 요소 (CRE)와 같은 많은 조절 영역을 포함한다. 따라서 외인성 HGF는 ets의 활성을 유도하여 내인성 HGF의 발현을 자극할 수 있으며, 내인성 HGF는 자동 전도 기능을 통해 소혈관 형성을 촉진할 수 있다.
본 출원의 발명자들은 연구 후 hHGF를 돌연변이시켜 생물학적 활성이 강화된 hHGF 돌연변이체를 얻을 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 내용
본 출원에서 특별히 언급하지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 본원에서 사용되는 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험실 절차는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 일상적인 절차이다. 동시에, 본 출원을 보다 잘 이해하기 위해 관련 용어의 정의 및 설명을 아래에 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "천연 hHGF" 및 "야생형 hHGF"는 생물학적으로 활성적이고 자연적으로 발생하는 인간 간세포 성장 인자 (hHGF)를 지칭하고, 둘 다 동일한 의미를 가지며 상호호환적으로 사용될 수 있다. 천연 hHGF 또는 야생형 hHGF의 아미노산 서열은 다양한 공개 데이터베이스 (예를 들어, GenBank 데이터베이스)에서 쉽게 얻을 수 있다. 예를 들어 천연 hHGF의 아미노산 서열은 GenBank 데이터베이스에서 수탁 번호: NP_000592.3으로 찾을 수 있다.
본 명세서에 사용된 경우, 천연 hHGF의 아미노산 서열을 언급할 때, 이는 서열 번호 1에 제시된 서열을 사용하여 기술된다. 예를 들어, "천연 hHGF의 130 번째 아미노산 잔기"라는 표현은 서열 번호 1에 제시된 단백질의 130 번째 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당업자는 천연 hHGF가 실질적으로 동일한 1 차 구조 (즉, 아미노산 서열) 및 고수준 구조 (즉, 공간 구조)를 갖고 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가지나 아미노산 서열에 여전히 약간의 차이가 있을 수 있는 복수의 버전을 가질 수 있음을 이해한다. 따라서, 본 출원에서 천연 hHGF는 서열 번호 1에 제시된 단백질에 국한되지 않고 공지된 모든 천연 hHGF를 포괄하고자 한다. 따라서, 본 출원에서 용어 "천연 hHGF"는 예를 들어 서열 번호 1에 제시된 hHGF 및 그의 자연 발생 변이체를 포함해 생물학적 기능을 갖는 다양한 자연 발생 hHGF를 포함할 것이다. 더욱이, hHGF의 아미노산 위치를 기술할 때, 그것은 서열 번호 1에서의 특정 아미노산 위치뿐만 아니라 특정 아미노산 위치에 상응하는 자연 변이체의 아미노산 위치도 포함한다. 예를 들어, "천연 hHGF의 130 번째 아미노산 잔기"라는 표현은 서열 번호 1의 130 번째 아미노산 잔기 및 그의 천연 변이체에서 상응하는 아미노산 위치를 포함한다. 본 출원에 따르면, "상응하는 아미노산 위치"라는 표현은 서열이 최적으로 정렬된 경우, 즉 서열이 가장 높은 퍼센트 동일성을 얻기 위해 정렬될 때 비교할 서열에서 등가 위치에 있는 아미노산 위치를 의미한다. 유사하게, "서열 번호 1의 130 번째 위치에 상응하는 위치"라는 표현은 서열이 최적으로 정렬된 경우, 즉, 서열이 가장 높은 퍼센트 동일성을 얻기 위해 서열 번호 1과 정렬된 경우 비교 서열에서 서열 번호 1의 130 번째 위치와 동등한 아미노산 위치를 의미한다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 천연 hHGF는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 천연 hHGF는 생물학적 기능을 갖는 자연 발생 인간 간세포 성장 인자이고, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 1과 비교하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 천연 hHGF는 생물학적 기능을 갖는 자연 발생 인간 간세포 성장 인자이고, 그의 아미노산 서열은 하나 이상 (예를 들어, 1 내지 10 또는 1 내지 5 또는 1 내지 3)의 아미노산 차이 (예를 들어, 아미노산의 보존적 치환)를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "동일성"은 2 개의 폴리펩티드 사이 또는 2 개의 핵산 사이의 서열 일치 정도를 지칭하기 위해 사용된다. 비교할 두 서열에서 특정 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브 유닛에 의해 점유되는 경우 (예를 들어, 두 DNA 분자 각각에서 특정 위치가 아데닌에 의해 점유되거나, 두 폴리펩티드 각각에서 특정 위치가 리신에 의해 점유됨), 각 분자는 해당 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 "퍼센트 동일성"은 두 서열이 공유하는 일치하는 위치 수를 비교 위치 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어 두 서열에서 10 개 위치 중 6 개가 일치하면 두 서열은 60%의 동일성을 가진다. 예를 들어, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 동일성을 갖는다 (6 개 위치 중 3 개 일치). 일반적으로, 비교는 최대 동일성을 생성하도록 두 서열이 정렬된 경우 수행된다. 이러한 정렬은 예를 들어 정렬 프로그램 (DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램으로 편리하게 수행할 수 있는 Needleman 등의 방법 ((1970) J. Mol. Biol. 48:443-453)을 사용하여 달성할 수 있다. 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl Biosci., 4:11-17 (1988)) 알고리즘을 사용하고 PAM120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 결정할 수도 있다. 또, 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용 가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (J MoI Biol. 48:444-453 (1970))을 사용하고 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정될 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보존적 치환" 또는 "보존적 대체"는 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩티드의 필수 특성에 불리하게 영향을 미치거나 변화시키지 않는 아미노산 치환 또는 대체를 의미한다. 예를 들어, 보존적 치환은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 당 업계에 알려진 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 치환, 예를 들어 상응하는 아미노산 잔기와 물리적 또는 기능적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환되는 치환 (예를 들어, 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 비롯한 화학적 특성을 가짐)을 포함한다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리가 당 업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있는 아미노산이 포함된다. 따라서, 상응하는 아미노산 잔기를 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환을 확인하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl Acad. Set USA 94:412-417 (1997) 참조).
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 가지며 상호호환적으로 사용될 수 있다. 또 본 발명에서, 아미노산은 일반적으로 당 업계에 잘 알려진 한 글자 및 세 글자 약어로 표시된다. 예를 들어, 알라닌은 A 또는 Ala로 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "염기성 측쇄를 갖는 아미노산"은 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 아미노산은 일반적으로 다음과 같은 구조를 가지고 있다:
Figure pct00001
상기에서, R은 측쇄기이다.
따라서 측쇄기 R이 염기성인 경우, 아미노산은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산이다. 염기성 측쇄를 가진 아미노산 용액에서 아미노산의 측쇄는 해리되어 염기성인 OH-를 생성할 수 있다. 따라서, 해리 후 아미노산의 측쇄는 양전하를 띠게 된다. 이에 따라, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 염기성 아미노산 또는 양전하를 띤 측쇄기를 갖는 아미노산으로도 지칭된다. 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 전형적인 예는 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된" 또는 "단리되는"은 인공적인 수단에 의해 자연 상태로부터 얻는 것을 지칭한다. 자연의 특정 물질 또는 성분이 "단리된" 경우, 이는 해당 물질이 위치한 자연 환경이 변경되었거나, 물질이 자연 환경으로부터 단리되었거나, 둘 다일 수 있다. 예를 들어, 특정 비단리 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 살아있는 동물에 자연적으로 존재하고, 이러한 자연 상태로부터 단리된 고순도의 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이라고 지칭된다. 용어 "단리된" 또는 "단리되는"은 인공 또는 합성 물질의 혼합을 배제하지 않으며 물질의 활성에 영향을 주지 않는 다른 불순 물질의 존재도 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 전달 비히클을 지칭한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질을 발현할 수 있는 경우, 벡터를 발현 벡터라고 한다. 벡터는 형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 통해 숙주 세포에 도입될 수 있으므로, 벡터가 운반하는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 플라스미드); 파지미드; 코스미드; 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공 염색체; λ 박테리오파지 또는 M13 박테리오파지와 같은 박테리오파지; 및 바이러스 벡터 등. 벡터로 사용될 수 있는 바이러스에는 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 (예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종 바이러스, 파포바바이러스 (예를 들어, SV40)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 발현을 제어하는 다양한 요소를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기점 부위를 포함할 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 벡터의 도입에 사용될 수 있는 세포를 지칭하며, 여기에는 대장균 (Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 원핵 세포, 효모 세포 또는 아스퍼길루스 (Aspergillus) 등와 같은 진균 세포, S2 드로소필라 (Drosophila) 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포, 또는 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포와 같은 동물 세포가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은 제약 분야에서 인식되는 동물, 특히 인간에게 허용되는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제"는 대상 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리 학적으로 상용성인 담체 및/또는 부형제를 지칭하고, 당 업계에 잘 알려져 있으며 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조), pH 조절제 (인산염 완충액을 포함하나 이에 제한되지 않음), 계면활성제 (양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 Tween-80을 포함하나 이에 제한되지 않음), 아주반트, 이온 강도 향상제 (염화나트륨을 포함하나 이에 제한되지 않음), 희석제, 부형제 및 치료제를 함유하거나 투여하기 위한 매질, 및 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "아주반트"는 항원에 대한 신체의 면역 반응을 향상 시키거나 항원과 함께 또는 미리 체내로 전달될 때 면역 반응의 형태를 변경할 수 있는 비특이적 면역 증강제를 의미한다. 아주반트의 전형적인 예는 알루미늄 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄), 프로인트 아주반트 (예를 들어, 완전 프로인트 아주반트 및 불완전 프로인트 아주반트), 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum), 지질다당류, 사이토카인 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있으며, 석유, 동물, 식물성 또는 합성으로부터 유래된 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함한다. 약학적 조성물이 정맥 내로 투여되는 경우, 물이 바람직한 담체이다. 식염수 용액과 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 특히 주사 용액의 액체 담체로 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 약학적으로 허용되는 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 분유, 글리세린, 프로필렌, 에틸렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 필요에 따라, 약학적 조성물은 또한, 습윤제, 또는 히알루론산나트륨과 같은 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 원하는 효과 또는 적어도 부분적으로 원하는 효과를 얻기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 예방적 유효량은 질환의 발생을 예방, 중지 또는 지연하기에 충분한 양을 지칭하고; 치료적 유효량은 이미 질환을 앓은 환자에서 질환의 진행 및 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 지연시키기에 충분한 양을 지칭한다. 이같은 유효량을 결정하는 것은 전적으로 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료 용도의 유효량은 치료할 질환의 중증도, 환자 자신의 면역 체계의 전반적인 상태, 연령, 체중 및 성별과 같은 환자의 일반적인 상태, 투여 방식, 동시에 투여되는 기타 치료에 따라 달라진다.
본원에서 사용되는 용어 "대상"은 인간, 설치류 (마우스, 래트, 기니피그), 개, 말, 소, 고양이, 돼지, 원숭이, 침팬지 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물을 지칭한다. 바람직하게는 대상은 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "천연 hHGF의 활성으로부터 혜택을 얻을 수 있는 질환"은 HGF의 향상된 발현 및/또는 활성이 질환의 증상을 완화하거나 질환의 진행을 지연시키거나, 또는 질환을 치유하거나 부분적으로 치유할 수 있는 질환을 지칭한다.
이전에 보고된 바와 같이, HGF는 다음 활성 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 생물학적 활성을 가지고 있다: (1) 내피 세포의 성장 및/또는 이동 촉진; (2) 혈관 (예를 들어, 미세 혈관) 형성 촉진 및/또는 (3) 신경 장해 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증과 같은 말초 신경병증)의 회복 촉진. 따라서, HGF는 (1) 내피 세포의 성장 및/또는 이동 촉진; (2) 혈관 (예를 들어, 미세 혈관) 형성 촉진; (3) 허혈성 질환, 예를 들어 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD), 예컨대 하지 동맥 허혈의 치료; (4) 대사 증후군 및 당뇨병 및 이의 합병증 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증) 치료; (5) 재협착 억제; 및 (6) 신경 장해 (예를 들어, 신경 퇴행성 질환, 외상성 신경 손상, 말초 신경병증)의 회복 촉진을 포함하나 이에만 제한되지 않는 다양한 측면에서 응용 가능성을 가질 수 있다.
따라서, 용어 "천연 hHGF의 활성으로부터 혜택을 얻을 수 있는 질환"의 예로는 상기 언급된 질환, 예를 들어 허혈성 질환, 대사 증후군, 당뇨병 및 이의 합병증, 재협착, 신경 장해 등이 포함되지만 이에만 제한되지 않는다.
본 출원의 발명자들은 연구 후 천연 hHGF를 돌연변이시켜 생물학적 활성이 강화된 hHGF 돌연변이체를 얻을 수 있음을 발견하였다. 구체적으로, 본 출원의 발명자들은 천연 hHGF의 130 번째 아미노산 (참조로서 서열 번호 1)을 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 히스티딘, 리신 등)으로 돌연변이시키면 생성된 hHGF 돌연변이체가 천연 hHGF보다 더 강한 생물학적 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 이에 따라, hHGF 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자를 유전자 치료 약물로 사용하면 천연 hHGF를 암호화하는 핵산 분자보다 대상에서 더 강력한 치료 효과를 나타낸다.
따라서, 한 측면에서, 본 출원은 천연 hHGF에 비해 다음과 같은 돌연변이를 포함하는 인간 간세포 성장 인자 (hHGF)의 돌연변이체를 제공한다: 서열 번호 1의 130 번째 위치에 상응하는 위치에 천연 hHGF의 아미노산이 염기성 측쇄를 가진 아미노산으로 돌연변이된 것.
특정의 바람직한 실시양태에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로부터 선택된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 아르기닌이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 히스티딘이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 리신이다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 천연 hHGF는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 천연 hHGF는 생물학적 기능을 갖는 자연 발생 인간 간세포 성장 인자이고, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 1과 비교하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 가진다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 천연 hHGF는 생물학적 기능을 갖는 천연 발생 인간 간세포 성장 인자이고, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 1과 비교하여 하나 이상 (예를 들어, 1 내지 10 또는 1 내지 5 또는 1 내지 3)의 아미노산 차이 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환)를 갖는다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 1에 제시된 천연 hHGF와 비교하여, 돌연변이체는 다음 돌연변이를 포함한다: 서열 번호 1의 130 번째 위치에 있는 아미노산 (즉, 세린)이 아르기닌으로 돌연변이된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 1에 제시된 천연 hHGF와 비교하여, 돌연변이체는 다음 돌연변이를 포함한다: 서열 번호 1의 130 번째 위치에 있는 아미노산 (즉, 세린)이 히스티딘으로 돌연변이된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 1에 제시된 천연 hHGF와 비교하여, 돌연변이체는 다음 돌연변이를 포함한다: 서열 번호 1의 130 번째 위치에 있는 아미노산 (즉, 세린)이 리신으로 돌연변이된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
따라서, 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 서열 번호 2, 3 및 4로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
단백질에 원하는 특성을 부여하기 위해 단백질에 다양한 변형을 가할 수 있음이 쉽게 이해될 것이다. 예를 들어, 단백질을 폴리에틸렌 글리콜로 변형시켜 (페길화) 생체 내 단백질의 반감기를 개선할 수 있다. 따라서, 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 화학적으로 변형된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 페길화에 의해 변형된다.
본 출원의 hHGF 돌연변이체는 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, hHGF 돌연변이체는 재조합 발현에 의해 제조된다. 일부 바람직한 실시양태에서, hHGF 돌연변이체는 화학적 합성에 의해 제조된다. 그러나, 본 출원의 hHGF 돌연변이체는 그 제조 방법에 의해 제한되지 않음이 쉽게 이해될 것이다.
천연 hHGF와 비교하여, 본 출원의 hHGF 돌연변이체는 더 강력한 생물학적 활성을 갖는다. 이론에 구애없이, 본 출원의 발명자들은 천연 hHGF α 쇄의 N-말단에 있는 제 1 헤어핀 구조에 위치한 130 번째 위치의 아미노산 (참조로서 서열 번호 1)이 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 히스티딘, 리신)으로 돌연변이된 경우, 헤어핀 구조의 형태가 변경되어 hHGF 단백질의 수용체 c-Met에 대한 결합을 향상시켜 hHGF 단백질의 생물학적 활성을 증대시킨다고 생각한다. 따라서, 본 출원의 hHGF 돌연변이체는 예를 들어, 다음으로부터 선택된 하나 이상의 측면에서 더 강력한 활성을 나타낼 수 있다: (1) 내피 세포의 성장 및/또는 이동 촉진; (2) 혈관 (예를 들어, 미세 혈관) 형성 촉진 및/또는 (3) 신경 장해 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증과 같은 말초 신경병증)의 회복 촉진.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본 발명의 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 2, 3 및 4로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체를 암호화한다.
단리된 핵산 분자를 사용하여 본 발명의 돌연변이체를 복제하거나 발현할 수 있음이 쉽게 이해될 것이다. 일부 경우에는 효율성을 향상시키기 위해 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 세포 선호도에 따라 코돈 최적화할 수 있다. 따라서, 특정의 바람직한 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포 선호도에 따라 코돈 최적화된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 CHO 세포 선호도에 따라 코돈 최적화된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 6, 7 및 8로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 또한, 상기 기재된 바와 같은 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 예를 들어 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공 염색체; λ 박테리오파지 또는 M13 박테리오파지와 같은 박테리오파지; 및 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터로 사용될 수 있는 바이러스는 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 (예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종 바이러스, 파포바바이러스 (예를 들어, SV40)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 (예를 들어, 단순 포진 바이러스 벡터), 폭스바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터를 포함하나 이에만 제한되지는 않는 바이러스 벡터이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로부터 선택된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 본 발명의 돌연변이체를 발현할 수 있거나, 발현하는데 사용될 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 대상 (예를 들어, 인간과 같은 포유동물)에서 본 발명의 돌연변이체를 발현할 수 있거나, 발현하는데 사용될 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 유전자 치료용으로 사용된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 대상 (예를 들어, 인간과 같은 포유동물)에서 본 발명의 돌연변이체를 발현하고 유전자 요법을 수행하기 위한 유전자 치료 벡터로서 사용될 수 있다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 네이키드 플라스미드와 같은 상기 기재된 바와 같은 단리된 핵산 분자를 함유하는 플라스미드이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 상기 기재된 바와 같은 단리된 핵산 분자를 함유하는 pSN 벡터이다. pSN 벡터는 중국 특허 CN 108611367 B에 개시되어 있으며, 서열 번호 9에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 또한, 단리된 핵산 분자 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대 대장균 세포, 및 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포 (예를 들어, 마우스 세포와 같은 포유동물 세포, 인간 세포 등)를 포함하지만 이에만 제한되지는 않는다. 본 발명의 세포는 또한, CHO 세포와 같은 세포주일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 또한, 본 발명의 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하고, 숙주 세포의 세포 배양물로부터 본 발명의 돌연변이체를 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 돌연변이체의 제조 방법을 제공한다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 본 발명의 돌연변이체 (예를 들어, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제하는 단계;
(2) 발현 벡터를 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에 도입하고, 단백질 발현을 허용하는 조건에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(3) 숙주 세포의 세포 배양물로부터 본 발명의 돌연변이체를 분리 및 회수하는 단계.
일부 바람직한 실시양태에서, 단계 (3)에서, 음이온 교환 크로마토그래피 및 헤파린 친화성 크로마토그래피에 의해 본 발명의 돌연변이체를 단리하고 회수한다.
본 출원의 hHGF 돌연변이체는 천연 hHGF에 비해 강력한 생물학적 활성을 가짐으로써 의약으로 유리하게 사용될 수 있다. 이에 상응하여, 천연 hHGF를 암호화하는 핵산 분자와 비교하여, 본 출원의 hHGF 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자는 대상에서 더 강력한 치료 효과를 나타내며, 또한, 의약으로 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 출원은 또한, 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터, 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 본 발명의 돌연변이체를 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형되지 않는다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형되고, 예를 들어 페길화된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 유전자 치료를 위해 사용된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 플라스미드), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터와 같은 본 발명의 돌연변이체를 발현할 수 있는 유전자 치료 벡터이다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제는 pH 조절제 (인산염 완충액을 포함하나 이에 제한되지 않음), 계면활성제 (양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 Tween-80을 포함하나 이에 제한되지 않음), 아주반트, 이온 강도 향상제 (염화나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않음), 희석제, 부형제, 치료제를 함유하거나 투여하기 위한 매질, 및 이들의 임의의 조합로부터 선택된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 물 및 석유, 동물, 식물성 또는 합성으로부터 유래된 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세린 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세릴 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 분유, 글리세린, 프로필렌, 에틸렌 글리콜, 물, 에탄올 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환약, 캡슐, 분말 (예를 들어, 동결 건조 분말), 서방성 제형 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 투여 방식은 정맥 내, 피내, 피하, 경구, 비강 내 (예를 들어, 흡입), 경피 (예를 들어, 국소), 경점막 및 직장 투여와 같은 비경구 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 통상적인 절차에 따라 인간에게 정맥 내, 피하, 근육 내, 경구, 비강 내 또는 국소 투여에 적합한 약학 제제로 제형화된다.
일반적으로, 주사용 약학적 조성물 (예: 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 정맥 내 투여)은 멸균되고 등장성이다. 필요한 경우, 이러한 약학적 조성물은 또한, 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위해 에르고타민과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 또한, 주사용 약학적 조성물은 방부제를 포함할 수도 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 주사용 약학적 조성물은 또한, 단위 투여 형태로 제공될 수 있다 (예를 들어, 앰플 또는 다회 투여 용기에 저장됨).
주사용 약학적 조성물은 유성 또는 수성 매질 중에 현탁액, 용액 또는 에멀젼 형태일 수 있으며, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이러한 약학적 조성물은 또한, 사용 전에 적합한 매질 (예를 들어, 멸균 및 발열원이 없는 물)에 용해되는 분말 형태일 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 0.01% 내지 0.2%의 hHGF 돌연변이체, 5%의 만니톨 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 동결 건조 주사제이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 1 내지 10 mg의 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 동결 건조 주사제이다.
비경구 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적합한 매질은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 비경구 투여 형태에 적합한 매질은 주사용수; 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 포도당 주사액, 포도당 및 염화나트륨 주사액, 및 락틸화 링거 주사액을 포함하나 이에 제한되지 않는 수성 매질; 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수혼 화성 매질; 및 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참기름, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 비수성 매질을 포함하나 이에만 제한되지 않는다.
이전 연구는 HGF가 내피 세포의 성장과 이동을 자극할 수 있고 (Bussolino et al., J Cell Biol. 119:629 (1992); Nakamura et al., J Hypertens 14:1067 (1996)); HGF가 재내피화 자극제로 사용될 수 있음을 보여주었다 (Yasuda et al., Circulation 101: 2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther 7: 1664 (2000)).
또한, HGF는 내피 세포 성장 및 혈관 평활근 세포 이동을 조절하여 혈관 형성을 자극할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 혈관 신생 활성으로 인해 HGF는 혈관의 치료 형성에 대한 유망한 후보로 간주된다. 예를 들어, 이전 연구에서는 HGF가 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD)과 같은 허혈성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다고 보고하였다 (Miyagawa et al., Circulation 105: 2556 (2002); Azuma et al., Gene Ther. 13: 1206 (2006); Aoki et al., Gene Ther. 7:417 (2000); Funatsu et al., J. Thoracic Cardiovasc. Surg. 124: 1099 (2002)).
또한, HGF는 당뇨병으로 인한 혈관 합병증을 개선할 수 있는 것으로 보고되었으며 (Peng et al., 2011), 대사 증후군과 당뇨병 및 이의 합병증 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증)을 치료하는 데 사용되고 있다.
또한, HGF는 재협착을 억제하는 약제로 사용될 수 있다고 보고되었다. 연구에 따르면 신속한 내피 표면 재건은 평활근 세포 증식을 억제하여 재협착을 억제할 수 있다고 입증되었다 (Bauters et al., Prog Cardiovasc Dis. 40:107 (1997)). 손상된 혈관에 내피 성장 인자 (예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 간세포 성장 인자 (HGF))의 국소 전달은 재협착을 억제하는 효과를 보여주었다 (Asahara et al., Circulation 94:3291 (1996); Yasuda et al., Circulation 101:2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther 7:1664 (2000); Walter et al., Circulation 110:36 (2004)).
또한, HGF는 여러 뇌 영역에서 운동 뉴런을 포함한 많은 유형의 뉴런 세포 (Elsen et al., 2009; Hayashi et al., 2006), 해마 뉴런 (Lim et al., 2008), 소뇌 과립 세포 (i.e.raci et al., 2002) 및 교감 신경 세포 (1999)에 영향을 미칠 수 있는 효과적인 신경 영양 인자이며 (Kato et al., 2009; Ebens et al., 1996), 신경 발생 및 시냅스 생성을 동시에 자극할 수 있다 (Shang et al., 2011; Wang et al, 2011)고 입증되었다. HGF/c-Met 신호 전달은 특히 국소 허혈성 뇌 손상 이후 (Takeo et al., 2007)에 뉴런의 상처 치유를 촉진할 수 있다고 보고되었다 (Takeo et al., 2008). 또한, 가족성 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 질환이 있는 뮤린 또는 래트 모델에서 간세포 성장 인자 (HGF)를 투여하면 운동 뉴런의 퇴행을 상당히 늦출 수 있고 (Aoki et al., 2009); 퇴행성 과정에 기여하는 아교 증식을 감소시키고 (Kadoyama et al., 2007); 마비 발병을 지연시키고 (Kadayama et al., 2009); 수명을 늘릴 수 있다고 (Sun et al., 2002) 보고되었다. 이러한 발견은 HGF가 신경 퇴행성 질환 (예컨대, ALS, 파킨슨병, 치매), 외상성 뇌 손상 및 외상성 척수 손상과 같은 다양한 신경 질환에서 치료 및 신경 보호 효과가 있음을 나타낸다.
따라서, HGF는 다음과 같은 여러 측면에서 적용 가능성이 있는 것으로 나타났다: (1) 내피 세포의 성장 및/또는 이동 촉진; (2) 혈관 (예를 들어, 미세 혈관) 형성 촉진 (3) 관상 동맥 질환 (CAD)과 같은 허혈성 질환 또는 하지 동맥 허혈과 같은 말초 동맥 질환 (PAD)의 치료; (4) 대사 증후군 및 당뇨병 및 그 합병증 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증)의 치료; (5) 재협착 억제; 및 (6) 신경 장해 (예를 들어, 신경 퇴행성 질환, 외상성 신경 손상, 말초 신경병증)의 회복 촉진. 본 출원의 hHGF 돌연변이체는 천연 hHGF보다 더 강력한 생물학적 활성을 지녀 전술한 응용에 유리하게 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 출원은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 돌연변이체 또는 핵산 분자를 또는 벡터 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 천연 hHGF의 활성으로부터 혜택을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 허혈성 질환, 대사 증후군, 당뇨병 및 이의 합병증, 재협착 및 신경 장해로부터 선택된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 관상 동맥 질환 (CAD)과 같은 허혈성 질환 또는 심근경색 또는 하지 동맥 허혈과 같은 말초 동맥 질환 (PAD)이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 당뇨병 또는 당뇨병성 말초 신경병증과 같은 이의 합병증이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 재협착, 예컨대 수술 후 재협착 및 관류 후 재협착이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 신경 퇴행성 질환 (예컨대, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 치매), 외상성 신경 손상, 말초 신경병증 (예컨대, 당뇨병성 말초 신경병증)과 같은 신경 장해이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 하지 동맥 허혈, 심근경색 및 당뇨병성 말초 신경병증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 치료적 유효량의 본 발명의 돌연변이체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 질환 (예를 들어, 하지 동맥 허혈, 심근경색 및/또는 당뇨병성 말초 신경병증)이 치료된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형되지 않는다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형되고, 예를 들어 페길화된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 치료적 유효량의 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 대상의 질환 (예를 들어, 하지 동맥 허혈, 심근 허혈, 심근경색 및/또는 당뇨병성 말초 신경병증)이 치료된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 플라스미드), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터와 같은 본 발명의 돌연변이체를 발현할 수 있는 유전자 치료 벡터이다.
당업자는 투여 방식, 빈도 및 투여량이 장애, 상태 및 치료되는 개인에 따라 달라질 것임을 알고 있다. 일반적으로, 투여는 주사 (예를 들어, 피내, 근육 내, 정맥 내 또는 피하), 국소 투여 (예를 들어, 표피 투여) 또는 점적 투여에 의해 수행될 수 있다. 또한, 환자 개개인에 따라 합리적인 투여 경로 및 투여 방식을 선택할 수도 있다. 적절한 용량은 상기 언급된 약학적 조성물의 투여 후 질환 (예를 들어, 하지 동맥 허혈, 심근경색 및/또는 당뇨병성 말초 신경병증)을 효과적으로 치료할 수 있는 양이다.
본 발명의 돌연변이체를 포함하는 약학적 조성물의 경우, 단위 투여형에 포함되는 활성 성분의 양은 예를 들어 약 10 μg 내지 5 mg일 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 상태 및 투여 방식에 따라 다르며, 예를 들어 체중 1 kg 당 약 1 μg 내지 100 μg일 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 약학적 조성물의 경우, 단위 투여형에 포함되는 활성 성분의 양은 예를 들어 약 1 내지 10 mg일 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 상태 및 투여 방식에 따라 다르며, 예를 들어 체중 kg 당 약 10 내지 200 μg일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 천연 hHGF의 활성으로부터 혜택을 얻을 수 있는 대상에서 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터의 용도를 제공한다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 허혈성 질환, 대사 증후군, 당뇨병 및 이의 합병증, 재협착 및 신경 장해로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 질환은 관상 동맥 질환 (CAD)과 같은 허혈성 질환 또는 심근경색증 또는 하지 동맥 허혈과 같은 말초 동맥 질환 (PAD)이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 당뇨병 또는 당뇨병성 말초 신경병증과 같은 이의 합병증이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 재협착, 예컨대 수술 후 재협착 및 관류 후 재협착이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 신경 퇴행성 질환 (예컨대, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 치매), 외상성 신경 손상, 말초 신경병증 (예컨대, 당뇨병성 말초 신경병증)과 같은 신경 장해이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 하지 동맥 허혈, 심근경색 및 당뇨병성 말초 신경병증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 본 발명의 돌연변이체를 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형되지 않는다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형되고, 예를 들어 페길화된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 유전자 치료를 위해 사용된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 플라스미드), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터와 같은 본 발명의 돌연변이체를 발현할 수 있는 유전자 치료 벡터이다.
또 다른 측면에서, 천연 hHGF의 활성으로부터 혜택을 얻을 수 있는 대상에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 약학적 조성물이 제공된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 허혈성 질환, 대사 증후군, 당뇨병 및 이의 합병증, 재협착 및 신경 장해로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 관상 동맥 질환 (CAD)과 같은 허혈성 질환 또는 심근경색 또는 하지 동맥 허혈과 같은 말초 동맥 질환 (PAD)이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 당뇨병 또는 당뇨병성 말초 신경병증과 같은 이의 합병증이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 재협착, 예컨대 수술 후 재협착 및 관류 후 재협착이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 신경 퇴행성 질환 (예컨대, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 치매), 외상성 신경 손상, 말초 신경병증 (예컨대, 당뇨병성 말초 신경병증)과 같은 신경 장해이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 질환은 하지 동맥 허혈, 심근경색 및 당뇨병성 말초 신경병증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형되지 않는다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체는 변형되고, 예를 들어 페길화된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 핵산 분자 또는 벡터는 유전자 치료에 사용된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 플라스미드), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터와 같은 본 발명의 돌연변이체를 발현할 수 있는 유전자 치료 벡터이다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 유효량의 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 약학적 조성물을 내피 세포 또는 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 내피 세포의 성장 및/또는 이동을 촉진하는 방법을 제공한다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 방법은 생체 내에서 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 약학적 조성물은 대상에서 내피 세포의 성장 및/또는 이동을 촉진하기 위해 대상에게 투여될 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 방법은 시험관 내에서 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 약학적 조성물은 배양 중 내피 세포의 성장 및/또는 이동을 촉진하기 위해 시험관 내에서 배양된 내피 세포에 투여될 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 내피 세포는 제대 정맥 내피 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 유효량의 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관 형성을 촉진하는 방법을 제공한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 혈관 형성은 미세 혈관의 형성이다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 약학적 조성물의 제조에서 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터의 용도를 제공하며, 여기서 약학적 조성물은 내피 세포의 성장 및/또는 이동을 촉진하거나 혈관 형성을 촉진하기 위해 사용된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 내피 세포는 제대 정맥 내피 세포이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 혈관 형성은 미세 혈관의 형성이다.
또 다른 측면에서, 내피 세포의 성장 및/또는 이동을 촉진하거나 혈관 형성을 촉진하는 데 사용하기 위한 본 발명의 돌연변이체 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 약학적 조성물이 제공된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 내피 세포는 제대 정맥 내피 세포이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 혈관 형성은 미세 혈관의 형성이다.
본 발명의 유익한 효과
본 출원의 hHGF 돌연변이는 천연 hHGF와 비교하여 더 강력한 생물학적 활성을 갖는다. 특히, 본 출원의 발명자들은 연구를 통해 본 발명의 hHGF 돌연변이체가 예를 들어 다음과 같은 측면에서 더 강한 생물학적 활성을 나타낼 수 있음을 발견하였다: (1) 내피 세포의 성장 및/또는 이동 촉진; (2) 혈관 (예를 들어, 미세 혈관) 형성 촉진 및/또는 (3) 신경 장해 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증과 같은 말초 신경병증)의 회복 촉진.
따라서, 본 발명의 hHGF 돌연변이체 및 hHGF 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자는 다음 측면 중 하나 이상에 보다 유익하게 적용될 수 있다: (1) 내피 세포의 성장 및/또는 이동 촉진; (2) 혈관 (예를 들어, 미세 혈관) 형성 촉진 (3) 관상 동맥 질환 (CAD)과 같은 허혈성 질환 또는 하지 동맥 허혈과 같은 말초 동맥 질환 (PAD)의 치료; (4) 대사 증후군 및 당뇨병 및 이의 합병증 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증) 치료; (5) 재협착 억제; 및 (6) 신경 장해 (예를 들어, 신경 퇴행성 질환, 외상성 신경 손상, 말초 신경병증)의 회복 촉진.
본 출원의 실시양태가 도면 및 실시예를 참조하여 이하에서 상세히 설명될 것이다. 그러나, 당업자는 이하의 도면 및 실시예가 본 출원을 설명하기 위해서만 사용되며 본 출원의 범위를 제한하지 않음을 이해할 것이다. 첨부된 도면 및 바람직한 실시양태의 다음 상세한 설명에 따라, 본 출원의 다양한 목적 및 유리한 측면이 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1은 실시예 1에서 제조된 4 개의 표적 단백질 (즉, 천연 hHGF, 130Arg-hHGF, 130His-hHGF 및 130Lys-hHGF)의 SDS-PAGE 검출 결과를 나타내며, 여기서 레인 1: 천연 hHGF; 레인 2: 130Arg-hHGF; 레인 3: 130His-hHGF; 레인 4: 130Lys-hHGF; 레인 5: 단백질 분자량 마커임.
서열 정보에 대한 설명
본 발명에 관련된 서열 정보는 다음과 같다.
서열 번호 1 (천연 hHGF의 아미노산 서열)
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서열 번호 2 (130Arg-hHGF의 아미노산 서열)
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서열 번호 3 (130His-hHGF의 아미노산 서열)
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서열 번호 4 (130Lys-hHGF의 아미노산 서열)
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서열 번호 5 (천연 hHGF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)
caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat cagcaaagac taccctaatc 60
aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga atactgcaga ccaatgtgct 120
aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca aggcttttgt ttttgataaa 180
gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt caagtggagt gaaaaaagaa 240
tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca ttagaaactg catcattggt 300
aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga gtggcatcaa atgtcagccc 360
tggagttcca tgataccaca cgaacacagc tttttgcctt cgagctatcg gggtaaagac 420
ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag ggggaccctg gtgtttcaca 480
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atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc atacagaatc aggcaagatt 600
tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat tcttgcctga aagatatccc 660
gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg gccagccgag gccatggtgc 720
tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa ttaaaacatg cgctgacaat 780
actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840
ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900
cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960
aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020
atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080
tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140
tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200
gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260
tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320
gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380
caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440
agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500
gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560
gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620
tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680
gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740
tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800
gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860
ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920
gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980
gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040
tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094
서열 번호 6 (130Arg-hHGF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)
caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat cagcaaagac taccctaatc 60
aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga atactgcaga ccaatgtgct 120
aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca aggcttttgt ttttgataaa 180
gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt caagtggagt gaaaaaagaa 240
tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca ttagaaactg catcattggt 300
aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga gtggcatcaa atgtcagccc 360
tggagttcca tgataccaca cgaacacaga tttttgcctt cgagctatcg gggtaaagac 420
ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag ggggaccctg gtgtttcaca 480
agcaatccag aggtacgcta cgaagtctgt gacattcctc agtgttcaga agttgaatgc 540
atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc atacagaatc aggcaagatt 600
tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat tcttgcctga aagatatccc 660
gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg gccagccgag gccatggtgc 720
tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa ttaaaacatg cgctgacaat 780
actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840
ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900
cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960
aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020
atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080
tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140
tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200
gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260
tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320
gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380
caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440
agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500
gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560
gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620
tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680
gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740
tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800
gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860
ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920
gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980
gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040
tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094
서열 번호 7 (130His-hHGF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)
caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat cagcaaagac taccctaatc 60
aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga atactgcaga ccaatgtgct 120
aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca aggcttttgt ttttgataaa 180
gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt caagtggagt gaaaaaagaa 240
tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca ttagaaactg catcattggt 300
aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga gtggcatcaa atgtcagccc 360
tggagttcca tgataccaca cgaacaccac tttttgcctt cgagctatcg gggtaaagac 420
ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag ggggaccctg gtgtttcaca 480
agcaatccag aggtacgcta cgaagtctgt gacattcctc agtgttcaga agttgaatgc 540
atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc atacagaatc aggcaagatt 600
tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat tcttgcctga aagatatccc 660
gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg gccagccgag gccatggtgc 720
tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa ttaaaacatg cgctgacaat 780
actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840
ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900
cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960
aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020
atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080
tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140
tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200
gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260
tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320
gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380
caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440
agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500
gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560
gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620
tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680
gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740
tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800
gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860
ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920
gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980
gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040
tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094
서열 번호 8 (130Lys-hHGF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)
caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat cagcaaagac taccctaatc 60
aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga atactgcaga ccaatgtgct 120
aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca aggcttttgt ttttgataaa 180
gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt caagtggagt gaaaaaagaa 240
tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca ttagaaactg catcattggt 300
aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga gtggcatcaa atgtcagccc 360
tggagttcca tgataccaca cgaacacaag tttttgcctt cgagctatcg gggtaaagac 420
ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag ggggaccctg gtgtttcaca 480
agcaatccag aggtacgcta cgaagtctgt gacattcctc agtgttcaga agttgaatgc 540
atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc atacagaatc aggcaagatt 600
tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat tcttgcctga aagatatccc 660
gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg gccagccgag gccatggtgc 720
tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa ttaaaacatg cgctgacaat 780
actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840
ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900
cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960
aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020
atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080
tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140
tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200
gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260
tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320
gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380
caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440
agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500
gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560
gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620
tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680
gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740
tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800
gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860
ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920
gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980
gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040
tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094
서열 번호 9 (pSN 벡터의 뉴클레오티드 서열)
gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag 60
gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180
ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240
tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 300
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 360
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg 420
ctagccaccg cggccgcaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 480
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 540
aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tccaggataa tatatggtag ggttcatagc 600
cagagtaacc ttttttttta atttttattt tattttattt tgagctgcag gcatgcaagc 660
tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 720
atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 780
atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc 840
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct 900
ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 960
gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 1020
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac 1080
gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt 1140
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 1200
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 1260
tgctggggag tcgaaattca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 1320
gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 1380
tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 1440
cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 1500
gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgctcgcctt gagcctggcg 1560
aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 1620
ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 1680
caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 1740
tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 1800
cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 1860
gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 1920
gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 1980
cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 2040
gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 2100
tcagatcttg atccctgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 2160
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 2220
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 2280
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 2340
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 2400
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 2460
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 2520
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 2580
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 2640
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 2700
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 2760
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 2820
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 2880
gcaacgcgg 2889
본 발명을 수행하기 위한 특정 모델
본 출원이 본 출원을 예시하기 위한 (본 출원을 제한하지 않음) 하기 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 분자 생물학 실험 방법 및 면역 분석 방법은 기본적으로 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 및 FM Ausubel et al., Compiled Molecular Biology Experiment Guide, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995에 대한 것이며; 제한 효소는 제품 제조업체에서 권장하는 조건에 따라 사용되었다. 당업자는 실시예가 예로서 본 출원을 설명하고, 본 출원에 의해 보호하고자 하는 범위를 제한하려는 의도가 아님을 알고 있다.
실시예 1: hHGF 및 그 돌연변이체의 제조
천연 hHGF (서열 번호 1)의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000592.3에서 찾을 수 있다. 서열 번호 1을 주형으로 사용하여 다음 3 개의 hHGF 돌연변이체를 설계하였다:
(1) 서열 번호 1의 130 번 위치에서 Ser을 Arg로 돌연변이시켜 얻은 hHGF 돌연변이체 130Arg-hHGF, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 2로 제시됨.
(2) 서열 번호 1의 130 번 위치에서 Ser을 His로 돌연변이시켜 얻은 hHGF 돌연변이체 130His-hHGF, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 제시됨.
(2) 서열 번호 1의 130 번 위치에서 Ser을 Lys로 변이시켜 얻은 hHGF 돌연변이체 130Lys-hHGF, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 4로 제시됨.
천연 hHGF (서열 번호 1) 및 상기 3 개의 hHGF 돌연변이체 (서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4)를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해 전체 유전자 (full-gene) 합성을 수행하는 것으로, 제한 효소 절단 부위와 개시 코돈을 5 '말단에 도입하고, 제한 효소 절단 부위와 종결 코돈을 3' 말단에 도입하여 천연 hHGF 및 다양한 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자를 수득하였다.
상기와 같이 제조된 핵산 분자를 발현 벡터로 클로닝하고, 각각 CHO 숙주 세포로 형질전환시켰다. 외래 단백질의 발현이 가능한 조건에서 형질전환된 CHO 숙주 세포를 배양한 후 배양물을 수집하고 원심분리하여 표적 단백질 (천연 hHGF, 130Arg-hHGF, 130His-hHGF, 130Lys-hHGF)이 포함된 상등액을 얻었다. 제조업체의 지침에 따라, 음이온 교환 크로마토그래피 매질 (DEAE Sepharose Fast Flow, GE Healthcare, 17-0709-10)을 사용하여 상등액에서 표적 단백질을 분리하고 헤파린 친화성 크로마토그래피 매질 (Heparin Sepharose 6 Fast Flow, GE healthcare, 17-0998-01)을 사용하여 표적 단백질을 추가로 정제하였다.
정제된 표적 단백질을 비환원 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (비환원 SDS-PAGE, Molecular Cloning Experiment Guide, 4th Edition)에 의해 검출하고, 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 수득한 정제된 네 표적 단백질 (천연 hHGF, 130Arg-hHGF, 130His-hHGF 및 130Lys-hHGF)은 모두 순도가 98% 이상으로 후속 연구에 사용할 수 있었다.
실시예 2: hHGF 및 그 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 제조
전체 유전자 합성을 수행하여 각각 서열 번호 5 내지 8에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가지는, 천연 hHGF (서열 번호 1)와 상기 3 개의 hHGF 돌연변이체 (서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4)를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 얻었다. 상기와 같이 제조된 폴리뉴클레오티드 분자를 각각 pSN 벡터에 클로닝 (예를 들어, 중국 특허 CN 108611367 B 참조; 그 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 9에 제시됨)한 후 대장균으로 형질전환시켰다. 스크리닝 및 시퀀싱 검증 후, 표적 재조합 플라스미드를 포함하는 조작된 균주를 얻었다. 작제된 조작 균주를 발효시키고 플라스미드를 추출하여 표적 재조합 플라스미드를 포함하는 스톡 용액을 얻었다. 표적 재조합 플라스미드는 구체적으로 다음과 같았다:
(1) 천연 hHGF (서열 번호 1)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열 번호 5)를 보유한 pSN-hHGF;
(2) 130Arg-hHGF (서열 번호 2)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열 번호 6)를 보유한 pSN-130Arg-hHGF;
(3) 130His-hHGF (서열 번호 3)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열 번호 7)를 보유한 pSN-130His-hHGF; 및
(4) 130Lys-hHGF (서열 번호 4)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열 번호 8)를 보유한 pSN-130Lys-hHGF.
제조된 스톡 용액의 플라스미드 함량을 자외선 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 그 결과 제조된 다양한 스톡 용액 중 플라스미드 함량은 2.0 내지 2.2 mg/mL 범위인 것으로 나타났다. 구체적으로, 4 가지 스톡 용액에서 재조합 플라스미드의 함량은 각각 2.12 mg/mL (pSN-hHGF), 2.05 mg/mL (pSN-130Arg-hHGF), 2.15 mg/mL (pSN-130His-hHGF) 및 2.10 mg/mL (pSN-130Lys-hHGF)이었다.
표적 재조합 플라스미드를 포함하는 스톡 용액을 취하고, 약 30 μg/ml의 플라스미드 농도로 주사용수로 희석한 다음 HPLC로 순도 검출을 수행하였다. 사용된 검출 조건은 다음과 같다:
사용된 크로마토그래피 컬럼은 20 mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH 8.8의 완충액으로 평형화된 음이온 교환 HPLC 분석 컬럼 DNA-NPR이었다. 평형화 후, 샘플을 로딩하고 검출하였다. 로딩 부피는 100 μl, 유속은 0.5 ml/분, 검출 파장은 260 nm였다. 샘플 로딩 후, 20 mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH 8.8 (5 분)의 완충액을 사용하여 평형을 수행한 후 다음과 같은 조건에서 선형 구배 용리를 수행하였다: (1) 100%의 용액 A (용액 A는 20 mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH 8.8임)에서 100%의 용액 B (용액 B는 20 mM Tris-HCl, 0.8 M NaCl임)로의 선형 구배로 용출을 30 분 수행하고; 이어 (2) 20 mM Tris-HCl, 0.8 M NaCl, pH 8.8의 완충액을 사용하여 5 분 동안 용출을 수행하였다. 그 결과 제조된 스톡 용액의 다양한 샘플에서 플라스미드는 모두 95.0% 이상의 HPLC 순도를 가지는 것으로 나타났다. 구체적으로, 4 가지 스톡 용액에서 재조합 플라스미드의 HPLC 순도 값은 각각 97.5% (pSN-hHGF), 98.2% (pSN-130Arg-hHGF), 98.0% (pSN-130His-hHGF), 97.8% (pSN- 130Lys-hHGF)이었다.
실시예 3: hHGF 돌연변이체 및 천연 hHGF의 시험관 내 생물학적 활성 평가
본 실시예에서는, hHGF 돌연변이체와 천연 hHGF가 내피 세포 이동에 미치는 영향을 평가하기 위해 시험관 내 내피 세포 이동 실험을 사용하여 hHGF 돌연변이체와 천연 hHGF의 시험관 내 생물학적 활성을 평가하였다.
1. 재료 및 방법
1.1 단백질 샘플
상기와 같이 제조된 hHGF 돌연변이체 (130Arg-hHGF, 130His-hHGF 및 130Lys-hHGF) 및 천연 hHGF를 사용 전에 생리 식염수를 사용하여 필요한 농도로 제제화하였다.
1.2 세포주
ECV304 세포주 (제대 정맥 내피 세포)를 사용하여 HGF의 생물학적 활성을 시험하였다.
1.3 시약
DMEM 배지: Hyclone에서 제공. 제조 방법은 다음과 같다: DMEM 배지 분말 (규격 1L) 1 포를 취하고 물에 용해시켜 1000 ml로 희석한 후 중탄산나트륨 2.1 g을 첨가하였다. 이후 준비된 배지를 멸균 및 여과하여 4 ℃에서 보관하였다.
완전 배지: 100 ml의 소 태아 혈청을 취하고 DMEM 배지에 1000 ml로 첨가하였다.
트랜스웰 (Transwell): Costar에서 제공.
1.4 장비
이산화탄소 세포 배양기: Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd.의 의료 장비 공장에서 제공, 모델: HH. CP.
도립 현미경: Chongqing Optoelectronic Instrument Corporation에서 제공, 모델: XDS-1B.
초청정 작업대: Suzhou Purification Equipment Co., Ltd.에서 제공, 모델: SW-CJ-1F.
탁상형 세포 세척 원심분리기: Hunan Xingke Scientific Instrument Co., Ltd.에서 제공, 모델 TDL-50B.
광학 현미경: Chongqing Optoelectronic Instrument Corporation에서 제공, 모델: BP104.
1.5 실험 방법
"시험관 내 HGF 활성 검출 시험" (다형핵 백혈구에 대한 항체와 항원 혼합물의 화학 주성 효과. J. Exp. Med., 1962, 115:453-466) 방법에 따라, 세포 이동 시험을 수행하였다. 요약하면, 트랜스웰이 잠기도록 이동 플레이트의 하부 탱크의 각 웰에 600 μl의 DMEM 배지를 첨가하였다. 0.1% 트립신으로 소화시킨 ECV304 세포를 10% 우 태아 혈청을 함유하는 1640 배지에 준비하고 1 ml 당 1×106 세포를 함유하는 세포 현탁액을 형성하였다. 각 웰에 200 μl의 세포 현탁액을 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 이동 플레이트의 하부 탱크에 있는 원래의 DMEM 배지를 2 μg의 천연 hHGF 또는 hHGF 돌연변이체를 포함하는 600 μl의 배지로 교체하고 2 시간 동안 인큐베이션을 계속하였다. 인큐베이션 후, 트랜스웰을 20% 파라포름알데히드와 함께 다른 웰로 옮기고 10 분 동안 고정시켰다. 이동하지 않은 막의 세포를 면봉으로 부드럽게 닦아낸 후 크리스탈 바이올렛으로 5 분 동안 염색하였다. 메스 블레이드를 사용하여 막을 조심스럽게 제거하고 유리 슬라이드 (세포가 있는 면이 위로 향함)에 놓고 광학 현미경으로 관찰하였다. 또한, 천연 hHGF 또는 hHGF 돌연변이체를 사용하지 않은 블랭크 대조 그룹도 제공하였다.
이 시험에서는, 이동하는 세포 수를 사용하여 시험할 단백질 (천연 hHGF 또는 hHGF 돌연변이체)의 생물학적 활성을 평가하였다. 광학 현미경으로 세포 이동을 정량적으로 평가하는 방법은 다음과 같다: 먼저 저전력 (4× 대물 렌즈) 광학 현미경으로 균일한 세포 분포 영역을 선택한 다음, 접안 렌즈에 그리드가 부착된 중전력 (20× 대물 렌즈) 현미경을 사용하여 5 개의 시야를 무작위로 연속적으로 선택하고 이동하는 세포의 수를 계산하였다. 측정 결과를 통계적 t 검정 방법으로 분석하고 평가하였다.
1.6 통계 분석
데이터를 평균±표준 편차
Figure pct00002
로 표시하였다. SPSS16.0 통계 소프트웨어를 사용하여 다변량 요인 설계 데이터에 대한 분산 분석을 통계 분석에 사용하였다.
2. 실험 결과
상술한 바와 같이, hHGF 돌연변이체 및 천연 hHGF로 내피 세포 이동 시험을 수행하여 시험관 내 시험에서 hHGF 돌연변이체와 천연 hHGF가 내피 세포 이동에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과는 표 1과 같다.
내피 세포 이동에 대한 hHGF 돌연변이체 및 천연 hHGF의 효과
그룹 횟수 이동 세포수 (세포/시계)
블랭크 대조 그룹
천연 hHGF
130Arg-hHGF
130His-hHGF
130Lys-hHGF		 3
3
3
3
3		 30.7±8.1
98.1±11.5*
415.7±33.1**##
355.3±27.3**##
388.9±35.6**##
상기에서, "*"는 블랭크 대조 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"**"는 블랭크 대조 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미하고;
"#"은 천연 hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"##"는 천연 hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 블랭크 대조 그룹 웰에서는 이동 막을 통과한 내피 세포가 거의 없었다; hHGF 돌연변이체 또는 천연 hHGF를 포함하는 시험 웰에서는 이동하는 세포의 수가 현저하게 증가하였다. 블랭크 대조 그룹 웰과 비교하여 유의한 차이가 있었다 (천연 hHGF를 포함하는 시험 웰: p <0.05; hHGF 돌연변이체를 포함하는 시험 웰: p <0.01). 또한, hHGF 돌연변이체를 포함하는 시험 웰에서 이동하는 세포의 수가 천연 hHGF를 포함하는 시험 웰보다 유의하게 높았다 (p <0.01). 이러한 결과는 hHGF 돌연변이체와 천연 hHGF 모두가 내피 세포의 이동을 유도/자극할 수 있고, hHGF 돌연변이체가 천연 hHGF에 비해 내피 세포 이동을 유도하는 능력이 더 강하다는 것을 나타낸다. 본 출원의 3 개의 hHGF 돌연변이체 (130Arg-hHGF, 130His-hHGF 및 130Lys-hHGF)는 세포 이동을 더욱 촉진할 수 있었다.
실시예 4: 토끼 하지 동맥 허혈 모델에 대한 hHGF 돌연변이체 및 천연 hHGF의 치료 효과 평가
본 실시예에서는, 토끼 하지 허혈 모델에서 hHGF 돌연변이체 및 천연 hHGF가 혈관 재형성 및 부행 순환에 미치는 영향을 평가하기 위해 토끼 하지 동맥 허혈 모델을 사용하여 hHGF 돌연변이체 및 천연 hHGF의 치료 효과를 평가하였다.
1. 재료 및 방법
1.1 단백질 샘플
상기와 같이 제조된 hHGF 돌연변이체 (130Arg-hHGF, 130His-hHGF 및 130Lys-hHGF) 및 천연 hHGF를 사용 전에 생리 식염수로 필요한 농도로 제제화하였다.
1.2 동물 모델
Beijing Weitong Lihua Company에서 제공한 체중 3.5 내지 4.0 kg의 12 내지 14 월령 뉴질랜드 수컷 흰 토끼. 다케시타 등 (Takeshita et al.)에 의해 설명된 방법 (Therapeutics the formation of a blood vessel. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. J. Clin. Invest., 1994, 93: 662-670)에 따라, 토끼 하지 동맥 허혈 모델을 수립하였다. 5 mg/kg 용량의 자일라진 근육 주사 후, 토끼를 50 mg/kg 용량의 케타민으로 마취시켰다. 왼쪽 허벅지 안쪽 피부를 알콜과 요오드로 소독하였다. 무균 상태에서 사타구니 중간 지점에서 왼쪽 무릎 관절까지 허벅지 피부를 절단하고 근막 막을 절단하고 근육을 분리하여 대퇴 동맥을 완전히 노출시키고 주요 몸통과 가지를 결찰한 뒤, 대퇴 동맥 뿌리에서 슬와 동맥까지의 동맥과 대복재 동맥의 분기점에 있는 동맥을 절제하였다. 출혈이 없는 것을 확인한 후 근막과 피부를 봉합하였다. 수술 후, 감염 예방을 위해 겐타마이신 (3 mg/kg/d)을 3 일 동안 지속적으로 근육 내 주사하고, 진통용으로 모르핀 (0.3 mg/kg/d)을 10 일 동안 근육 내 주사하였다. 수술 후 10 일째에, 동맥 캐뉼라를 우 경동맥에 삽입하고, 3F 카테터 (일본 Terumo제)를 왼쪽 내장골 동맥 입구에 삽입하고 조영제 5 ml를 초당 1 ml의 비율로 주입한 후, 병든 동물 모델의 수립을 확인하기 위해 선택적 내장골 혈관 조영술을 수행하였다.
1.3 동물 그룹화
동물 모델 수립 후 10 일째에 동물을 무작위로 모델 대조 그룹 (6), hHGF 시험 그룹 (8), 130Arg-hHGF 시험 그룹 (8), 130His-hHGF 시험 그룹 (8), 130Lys-hHGF 시험 그룹 (8)으로 나누었다.
1.4 투여 방법
각 동물의 왼쪽 허벅지 안쪽 허혈 부위 4 곳 (내전근 1 곳과 반막근 3 곳)을 채취하고 250 μg/250 μl의 시험 약물을 각 지점에 1 일 1 회 근육 내 주사로 투여하였다 (즉, 1 mg/1 ml의 시험 약물을 동물 당 1 회 투여). 모델 대조 그룹에는 동일한 부피의 식염수가 제공되었다. 투여는 15 일 동안 지속되었고 총 15 회 투여되었다.
1.5 선택적 내장골 혈관 조영술에 의한 혈관 형성에 대한 약물의 효과 평가
하지 동맥 허혈 모델 동물의 부행 순환이 내장골 동맥의 가지에서 유래되었기 때문에, 수술 후 10 일과 40 일 (첫 투여 후 30 일)째에 선택적 내장골 혈관 조영술을 시행하여 투여 전후의 부행 순환 형성을 관찰하였다. 3F 카테터 (일본 Terumo제)를 오른쪽 경동맥에 삽입하고 복부 대동맥을 통과하여 왼쪽 내장골 동맥 입구에 배치하였다. 총 5 ml의 조영제를 1 ml/초의 속도로 주입하고 시네 필름 촬영을 수행하였다. 네 번째 2 차 혈관 조영술에서 대퇴골에 수직인 3 개의 직선을 대퇴골에 4 분할하여 대퇴골에 그리고, 직선을 가로지르는 혈관의 수를 세고 3 회 반복하여 그 평균을 취하였다.
1.6 모세관 밀도의 조직학적 결정
수술 후 40 일째에, 하지의 허혈성 근육 조직 (내전근과 반막근)을 채취하고 O.C.T. 화합물 (Miles Inc., Elkhart, USA) 용액에 넣어 액체 질소로 급속 냉동시킨 다음 조직을 냉동하고 절편화하였다. 인독실-테트라졸륨 방법에 따라, 모세혈관 내피 세포를 알칼리성 포스파타제로 염색하였다. 현미경 (×200)으로 조직 내 모세혈관 내피 세포의 수를 세어 근육 세포 1,000 개당 모세혈관 수로 환산하여 모세혈관의 밀도를 정량화하였다.
1.7 통계 분석
데이터를 평균±표준 편차
Figure pct00003
로 표시하였다. SPSS16.0 통계 소프트웨어를 사용하여 다중인자 요인 설계 데이터에 대한 분산 분석을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
2. 실험 결과
각 실험 동물 그룹의 투여 전후 허혈 부위에서 측부 혈관수와 허혈 부위에서 새로운 측부 혈관수의 검출 결과를 표 2에 나타내었다.
각 동물 그룹의 측부 혈관 계수 결과
그룹 동물 수 투여 전
(수)		 투여 후 30 일
(수)		 증가
(수)
모델 대조 그룹
hHGF
130Arg-hHGF
130His-hHGF
130Lys-hHGF		 6
8
8
8
8		 39.87±3.10
38.73±3.22
40.47±2.76
42.29±1.87
45.07±3.61		 43.52±2.16
51.39±3.82*
62.37±2.27
60.73±3.25
64.35±1.97		 3.65±2.25
12.66±2.96**
21.90±2.47**##
18.44±2.48**#
19.28±2.65**##
상기에서, "*"는 모델 대조 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"**"는 모델 대조 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미하고;
"#"은 hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"##"는 hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 투여 전 각 그룹에서 실험 동물의 측부 혈관 수에는 유의한 차이 (5 그룹간)가 없었다 (p >0.05). 투여 후, 모델 대조 그룹에서 측부 혈관 수는 투여 전과 통계적으로 다르지 않았으나 (p >0.05); 4 개 시험 그룹의 측부 혈관 수는 투여 전보다 유의하게 증가하였다. 그룹 간 비교하였을 때, 3 개의 hHGF 돌연변이체 시험 그룹의 혈관 증가는 모두 hHGF 시험 그룹보다 유의하게 컸다 (p <0.05).
표 2의 실험 결과는 3 개의 hHGF 돌연변이체와 천연 hHGF가 하지 동맥 허혈에 대해 우수한 치료 효과를 가짐을 나타내었다. 모델 대조 그룹과 비교하여 각 시험 그룹은 혈관 조영술에서 볼 수 있듯이 측부 혈관 형성을 크게 촉진할 수 있다. 치료 후 30 일째에 (투여 첫날부터 계산), 실험 그룹 토끼의 왼쪽 뒷다리 세동맥 밀도는 모델 대조 그룹의 것보다 유의하게 높았다. 또한, 3 개의 hHGF 돌연변이체의 처리 결과는 천연 hHGF 시험 그룹과 유의하게 달랐다. hHGF 돌연변이체를 투여받은 토끼의 왼쪽 뒷다리 세동맥의 밀도는 천연 hHGF를 투여받은 토끼의 밀도보다 높았다; 130Arg-hHGF 시험 그룹 (p <0.01), 130His-hHGF 시험 그룹 (p <0.05), 130Lys-hHGF 시험 그룹 (p <0.01)이 천연 hHGF 시험 그룹에 비해 측부 혈관 형성 촉진에 있어 유의하게 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 출원의 세 hHGF 돌연변이체가 하지 동맥 허혈의 치료에 있어서 천연 hHGF보다 예상외로 우수하다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 토끼 하지 동맥 허혈 모델에 대한 hHGF 또는 그의 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 치료 효과 평가
본 실시예에서는, 토끼 하지 동맥 허혈 모델을 사용하여 hHGF 또는 그 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드가 측부 혈관 형성을 촉진하는 효과를 평가하여 hHGF 또는 그 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 치료 효과를 평가하였다.
1. 재료 및 방법
1.1 플라스미드 샘플
상기와 같이 제조된 4 개의 재조합 플라스미드 (pSN-hHGF, pSN-130Arg-hHGF, pSN-130His-hHGF 및 pSN-130Lys-hHGF)를 사용하기 전에 생리 식염수를 사용하여 필요한 농도로 제제화하였다.
1.2 동물 모델
Beijing Weitong Lihua Company에서 제공한 체중 3.5 내지 4.0 kg의 12 내지 14 월령 뉴질랜드 수컷 흰 토끼. 다케시타 등 (Takeshita et al.)에 의해 설명된 방법 (Therapeutics the formation of a blood vessel. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. J. Clin. Invest., 1994, 93: 662-670)에 따라, 토끼 하지 동맥 허혈 모델을 수립하였다. 5 mg/kg 용량의 자일라진 근육 주사 후, 토끼를 50 mg/kg 용량의 케타민으로 마취시켰다. 왼쪽 허벅지 안쪽 피부를 알콜과 요오드로 소독하였다. 무균 상태에서 사타구니 중간 지점에서 왼쪽 무릎 관절까지 허벅지 피부를 절단하고 근막 막을 절단하고 근육을 분리하여 대퇴 동맥을 완전히 노출시키고 주요 몸통과 가지를 결찰한 뒤, 대퇴 동맥 뿌리에서 슬와 동맥까지의 동맥과 대복재 동맥의 분기점에 있는 동맥을 절제하였다. 출혈이 없는 것을 확인한 후 근막과 피부를 봉합하였다. 수술 후, 감염 예방을 위해 겐타마이신 (3 mg/kg/d)을 3 일 동안 지속적으로 근육 내 주사하고, 진통용으로 모르핀 (0.3 mg/kg/d)을 10 일 동안 근육 내 주사하였다. 수술 후 10 일째에, 동맥 캐뉼라를 우 경동맥에 삽입하고, 3F 카테터 (일본 Terumo제)를 왼쪽 내장골 동맥 입구에 삽입하고 조영제 5 ml를 초당 1 ml의 비율로 주입한 후, 병든 동물 모델의 수립을 확인하기 위해 선택적 내장골 혈관 조영술을 수행하였다.
1.3 동물 그룹화
동물 모델 수립 후 10 일째에 동물을 무작위로 모델 대조 그룹 (8), pSN-hHGF 시험 그룹 (8), pSN-130Arg-hHGF 시험 그룹 (8), pSN-130His-hHGF 시험 그룹 (8) 및 pSN-130Lys-hHGF 시험 그룹 (8)으로 나누었다.
1.4 투여 방법
각 동물의 왼쪽 허벅지 안쪽 허혈 부위 4 곳 (내전근 1 곳과 반막근 3 곳)을 채취하고 250 μg/250 μl의 시험 약물을 각 지점에 근육 내 주사로 총 1 회 투여로 투여하였다 (즉, 1 mg/1 ml의 시험 약물을 동물 당 1 회 투여). 모델 대조 그룹에는 동일한 부피의 식염수가 제공되었다.
1.5 선택적 내장골 혈관 조영술에 의한 혈관 형성에 대한 약물의 효과 평가
하지 동맥 허혈 모델 동물의 부행 순환이 내장골 동맥의 가지에서 유래되었기 때문에, 수술 후 10 일과 40 일 (첫 투여 후 30 일)째에 선택적 내장골 혈관 조영술을 시행하여 투여 전후의 부행 순환 형성을 관찰하였다. 3F 카테터 (일본 Terumo제)를 오른쪽 경동맥에 삽입하고 복부 대동맥을 통과하여 왼쪽 내장골 동맥 입구에 배치하였다. 총 5 ml의 조영제를 1 ml/초의 속도로 주입하고 시네 필름 촬영을 수행하였다. 네 번째 2 차 혈관 조영술에서 대퇴골에 수직인 3 개의 직선을 대퇴골에 4 분할하여 대퇴골에 그리고, 직선을 가로지르는 혈관의 수를 세고 3 회 반복하여 그 평균을 취하였다.
1.6 통계 분석
데이터를 평균±표준 편차
Figure pct00004
로 표시하였다. SPSS16.0 통계 소프트웨어를 사용하여 다중인자 요인 설계 데이터에 대한 분산 분석을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
2. 실험 결과
각 실험 동물 그룹의 투여 전후 허혈 부위에서 측부 혈관수와 허혈 부위에서 새로운 측부 혈관수의 검출 결과를 표 3에 나타내었다.
각 동물 그룹의 측부 혈관 계수 결과
그룹 동물 수 투여 전
(수)		 투여 후 30 일
(수)		 증가
(수)
모델 대조 그룹
pSN-hHGF
pSN-130Arg-hHGF
pSN-130His-hHGF
pSN-130Lys-hHGF		 8
8
8
8
8		 45.62±2.15
42.51±4.30
46.73±5.22
48.32±2.84
46.72±5.14		 48.92±3.75
55.78±4.57*
78.37±3.32*
80.54±6.28*
78.41±4.20*		 3.30±2.82
13.27±4.32**
31.64±4.80**##
32.22±4.91**##
31.69±4.18**##
상기에서, "*"는 모델 대조 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"**"는 모델 대조 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미하고;
"#"은 pSN-hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"##"는 pSN-hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 투여 전 각 그룹에서 실험 동물의 측부 혈관 수에는 유의한 차이 (5 그룹간)가 없었다 (p >0.05). 투여 후, 모델 대조 그룹에서 측부 혈관 수는 투여 전과 통계적으로 다르지 않았다 (p >0.05); 4 개 시험 그룹의 측부 혈관 수는 투여 전보다 유의하게 증가하였다. 그룹 간 비교하였을 때, hHGF 돌연변이체 (pSN-130Arg-hHGF, pSN-130His-hHGF 및 pSN-130Lys-hHGF)를 암호화하는 3 개의 재조합 플라스미드 그룹의 혈관 증가는 모두 천연 hHGF (pSN-hHGF)를 암호화하는 재조합 플라스미드 시험 그룹보다 유의하게 컸다 (p <0.01).
표 3에서의 실험 결과는 hHGF 또는 그 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드가 모두 하지 동맥 허혈에 대해 우수한 치료 효과를 가짐을 나타내었다. 모델 대조 그룹과 비교하여 각 시험 그룹은 측부 혈관 형성을 상당히 촉진할 수 있었다. 또한, 표 3의 실험 결과는 hHGF 돌연변이체를 암호화하는 세 재조합 플라스미드의 치료 결과가 천연 hHGF를 암호화하는 재조합 플라스미드의 것과 유의한 차이가 있는 것으로 나타났으며 (p <0.01), 즉 pSN-130Arg-hHGF 시험 그룹 (p<0.01), pSN-130His-hHGF 시험 그룹 (p<0.01) 및 pSN-130Lys-hHGF 시험 그룹 (p<0.01)은 모두 측부 혈관 형성을 촉진하는데 pSN-hHGF 시험 그룹보다 유의하게 우수하였다. 이러한 결과는 hHGF 돌연변이체를 암호화하는 세 재조합 플라스미드 (pSN-130Arg-hHGF, pSN-130His-hHGF, 및 pSN-130Lys-hHGF)가 하지 동맥 허혈에 대한 치료 효과 측면에서 천연 hHGF (pSN-hHGF)를 암호화하는 재조합 플라스미드보다 예상외로 우수하다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 래트 당뇨병성 말초 신경병증 모델에 대한 hHGF 돌연변이체 및 천연 hHGF의 치료 효과 평가
본 실시예에서는, 래트 당뇨병성 말초 신경병증 모델을 사용하여 당뇨병성 말초 신경병증의 치료에서의 hHGF 돌연변이체 및 천연 hHGF의 효과를 평가하였다.
1. 재료 및 방법
1.1 단백질 샘플
상기와 같이 제조된 hHGF 돌연변이체 (130Arg-hHGF, 130His-hHGF 및 130Lys-hHGF) 및 천연 hHGF를 사용 전에 생리 식염수를 사용하여 필요한 농도로 제제화하였다.
1.2 장비
원-터치 선택 간편 혈당 측정기: Johnson & Johnson에서 제공;
Neuromatic-2000 근전도 장비: Dandi에서 제공;
EG1160 파라핀 포매기: 독일 Leica에서 제공;
RM2255 슬라이서: 독일 Leica에서 제공;
DM6000B 광학 현미경: 독일 Leica에서 제공.
1.3 동물 모델
위스타 (Wistar) 래트 (SPF 등급, 수컷, 체중 180-200 g, 2.5 내지 3 월령)을 Beijing Weitong Lihua Company에서 공급받았다. 래트를 받은 후, 5 일 동안 순응화시키고 동물들의 상태가 양호한 것을 확인하였다. 래트 10 마리를 무작위로 정상 대조 그룹으로 선정하고 나머지 60 마리는 다음과 같이 모델링하였다. 래트를 물은 공급하면서 12 시간 동안 금식시킨 다음 체중을 측정하고 혈당을 측정하고 번호를 매겼다. 스트렙토조토신 (STZ)을 빙냉 환경하에 미리 준비한 0.1 mol/L 시트르산/시트르산나트륨 완충액 (pH 4.4)에 첨가하여 2% STZ 용액을 제조하였다. STZ를 65 mg/kg의 용량으로 좌측 복강 내 주사에 의해 모델링된 동물에게 1 회 투여하였다; 정상 대조 그룹의 동물에게는 좌측 복강 내 주사에 의해 동일한 용량의 동일한 완충액을 투여하였다. 72 시간 후 래트의 혈당치를 측정하였다. 혈당 >16.7 mmol/L이고 요당이 +++에서 ++++까지인 총 52 마리의 래트를 모델 동물로 선택하였다. 먹이 공급 10 주 후, 당뇨병성 말초 신경병증이 있는 모델 래트를 얻었다.
1.4 동물 그룹화
52 마리의 모델 래트를 무작위로 모델 대조 그룹 (10), hHGF 시험 그룹 (10), 130Arg-hHGF 시험 그룹 (10), 130His-hHGF 시험 그룹 (11), 130Lys-hHGF 시험 그룹 (단 11)으로 나누었다.
1.5 투여 방법
성공적인 모델링 10 주 후에 시험 그룹의 동물에 약물을 투여하기 시작하였다. 각 동물의 왼쪽 허벅지 안쪽에 4 곳 (내전근 1 곳과 반막근 3 곳)을 취하고, 각 지점에 250 μg/250 μl의 시험 약물을 1 일 1 회 근육 내 주사로 투여하였다 (즉, 총 1 mg/1 ml의 시험 약물이 각 동물에게 1 회 투여됨). 모델 그룹은 20 일 동안 총 20 회 주사로 동일한 부피의 생리 식염수를 투여받았다.
1.6 운동 신경 전도 속도 (MNCV) 및 감각 신경 전도 속도 (SNCV) 측정
첫 투여 후 10 주째에 측정을 수행하였다. 래트를 마취시킨 후, 왼쪽 좌골 신경을 외과적으로 분리하고, 래트의 MNCV와 SNCV를 Neuromatic-2000 근전도 검사기로 측정하였다. MNCV 측정 방법은 다음과 같다: 기록 전극을 전경골근의 복부 중앙에 수직으로 천공하고 자극 전극을 사용하여 좌골 신경의 근위 말단을 20 mA의 자극 전류로 자극하고, 근전도 검사기로 오실로스코프에 활성 전위를 표시하고 기록한 다음, 두 전극 사이의 거리에 따라 MNCV를 계산하였다. SNCV 측정 방법은 다음과 같다: 기록 전극을 좌골 신경의 근위 말단에 배치하고, 자극 전극을 사용하여 30 mA의 자극 전류로 장딴지 신경의 근위 말단을 자극하고, 근전도 검사기로 얻은 파형을 기록한 뒤, 두 전극 사이의 거리에 따라 SNCV를 계산하였다.
1.7 장딴지 신경의 유수 신경 섬유의 정량 분석
첫 투여 후 10 주째에 측정을 수행하였다. 우측 장딴지 신경의 원위 말단을 3% 글루타르알데히드/0.1 mol/L 인산염 완충액에 고정하고 밤새 4 ℃에서 보관하였다; PBS 완충액으로 헹구고, 1% 오스뮴산으로 고정한 다음 헹구고, 탈수하고, 에폭시 수지로 포매하였다. 1 μm의 반박형 단면 섹션을 준비하고, 1% 톨루이딘 블루 용액으로 30 분 동안 염색한 다음, 85% 알콜로 세척하고 배경이 청색이 될 때까지 탈색한 다음 검으로 슬라이드에 장착하였다. 유수 신경 단면 영상을 200 배 확대하여 수집하고, 유수 신경 섬유를 다기능 트루 컬러 병리 영상 분석 시스템을 이용하여 계수하고 유수 신경 섬유의 총 단면적, 신경 섬유 밀도 및 신경 섬유의 평균 단면적을 계산하여 장딴지 신경의 병리학적 변화를 관찰하였다.
1.8 통계 처리
데이터를 평균±표준 편차
Figure pct00005
로 표시하였다. SPSS16.0 통계 소프트웨어를 사용하여 다중인자 요인 설계 데이터에 대한 분산 분석을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
2. 실험 결과
2.1 각 그룹에서 실험 동물의 MNCV 및 SNCV 결정
표 4는 각 그룹의 실험 동물의 MNCV 및 SNCV 측정 결과를 나타낸다.
첫 투여 후 10 주째에 각 그룹의 동물의 MNCV 및 SNCV
그룹 MNCV SNCV
정상 대조 그룹
모델 대조 그룹
hHGF 그룹
130Arg-hHGF 그룹
130His-hHGF 그룹
130Lys-hHGF 그룹		 43.5±4.7
31.6±3.5**
35.2±3.2*
42.8±4.7
40.3±4.3
39.5±3.8		 46.7±5.3
33.2±5.7**
38.9±4.5*
44.8±5.6
39.7±3.8
42.6±4.5
상기에서, "*"는 정상 대조 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"**"는 정상 대조 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 첫 투여 후 10 주째에 모델 대조 그룹의 MNCV와 SNCV가 가장 낮았으며 (정상 대조 그룹보다 현저히 느림, p <0.01); hHGF 시험 그룹이 뒤를 이었다 (정상 대조 그룹보다 현저히 느림, p <0.05). hHGF 돌연변이체 그룹의 MNCV와 SNCV는 정상 대조 그룹에 비해 약간 낮았지만 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (p >0.05). 이러한 결과는 천연 hHGF 및 hHGF 돌연변이체가 당뇨병성 말초 신경병증의 회복을 촉진하고 손상된 MNCV 및 SNCV를 회복시킬 수 있으며 hHGF 돌연변이체의 치료 효과가 천연 hHGF보다 우수하다는 것을 나타낸다.
2.2 장딴지 신경의 유수 신경 섬유의 정량 분석
각 그룹에서 실험 동물의 장딴지 신경의 유수 신경 섬유를 정량 분석한 결과를 표 5에 나타내었다.
첫 투여 후 10 주째에 각 동물 그룹에서 장딴지 신경 중 유수 신경 섬유의 정량 분석
그룹 총 신경 단면적
(μm2)		 평균 신경 섬유 면적
(μm2)
정상 대조 그룹
모델 대조 그룹
hHGF 그룹
130Arg-hHGF 그룹
130His-hHGF 그룹
130Lys-hHGF 그룹		 31771±1265
16449±1082**
20454±1571*
27539±1852#
25991±1451#
26193±1615# 		23.5±2.1
13.7±1.4**
17.3±2.5*
22.9±1.7#
20.3±1.1#
19.9±2.1#
여기서, "*"는 정상 대조 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"**"는 정상 대조 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
"#"은 hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"##"는 hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 첫 투여 후 10 주째에 정상 대조 그룹에 비해 모델 대조 그룹의 전체 신경 단면적과 평균 신경 섬유 면적이 현저히 감소하였고 유의한 차이가 있었다 (p <0.01); hHGF 시험 그룹 동물의 전체 신경 단면적과 평균 신경 섬유 면적도 유의하게 감소하였으나 (p <0.05), 감소 정도는 저하되었다; hHGF 돌연변이체 실험 그룹에서 동물의 전체 신경 단면적과 평균 신경 섬유 면적은 뚜렷하지 않은 감소를 보였으며 유의한 차이는 없었다. 또한, hHGF 시험 그룹에 비해 hHGF 돌연변이체 시험 그룹의 전체 신경 단면적과 평균 신경 섬유 면적이 유의하게 증가하였다 (p <0.05). 이러한 결과는 천연 hHGF 및 hHGF 돌연변이가 당뇨병성 말초 신경병증의 회복을 촉진하고, 유수 신경 섬유의 총 단면적과 장딴지 신경에서 신경 섬유의 평균 면적을 회복할 수 있으며, hHGF 돌연변이의 치료 효과가 천연 hHGF보다 낫다는 것을 나타낸다.
표 4 내지 5의 결과는 hHGF 돌연변이체와 천연 hHGF 모두 당뇨병성 말초 신경병증에 우수한 치료 효과를 보였고, 당뇨 래트에서 MNCV 및 SNCV를 유의하게 증가시킬 수 있으며, 당뇨 래트에서 장딴지 신경 섬유의 총 단면적 및 신경 섬유의 평균 면적을 유의하게 향상시킬 수 있음을 보여준다. 또한, 세 hHGF 돌연변이체의 치료 결과는 천연 hHGF의 치료 결과보다 훨씬 더 좋았다. 본 출원의 세 hHGF 돌연변이체는 래트의 당뇨병성 말초 신경병증 치료에서 천연 hHGF보다 예상외로 우수하였다.
실시예 7: 래트 당뇨병성 말초 신경병증 모델에 대한 hHGF 또는 그의 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 치료 효과 평가
본 실시예에서는, 래트 당뇨병성 말초 신경병증 모델을 사용하여 당뇨병성 말초 신경병증에 대한 hHGF 또는 그 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 효과를 평가하였다.
1. 재료 및 방법
1.1 플라스미드 샘플
상기와 같이 제조된 4 개의 재조합 플라스미드 (pSN-hHGF, pSN-130Arg-hHGF, pSN-130His-hHGF 및 pSN-130Lys-hHGF)를 사용하기 전에 생리 식염수를 사용하여 필요한 농도로 제제화하였다.
1.2 장비
원-터치 선택 간편 혈당 측정기: Johnson & Johnson에서 제공;
Neuromatic-2000 근전도 장비: Dandi에서 제공;
EG1160 파라핀 포매기: 독일 Leica에서 제공;
RM2255 슬라이서: 독일 Leica에서 제공;
DM6000B 광학 현미경: 독일 Leica에서 제공.
1.3 동물 모델
위스타 (Wistar) 래트 (SPF 등급, 수컷, 체중 180-200 g, 2.5 내지 3 월령)을 Beijing Weitong Lihua Company에서 공급받았다. 래트를 받은 후, 5 일 동안 순응화시키고 동물들의 상태가 양호한 것을 확인하였다. 래트 10 마리를 무작위로 정상 대조 그룹으로 선정하고 나머지 60 마리는 다음과 같이 모델링하였다. 래트를 물은 공급하면서 12 시간 동안 금식시킨 다음 체중을 측정하고 혈당을 측정하고 번호를 매겼다. 스트렙토조토신 (STZ)을 빙냉 환경하에 미리 준비한 0.1 mol/L 시트르산/시트르산나트륨 완충액 (pH 4.4)에 첨가하여 2% STZ 용액을 제조하였다. STZ를 65 mg/kg의 용량으로 좌측 복강 내 주사에 의해 모델링된 동물에게 1 회 투여하였다; 정상 대조 그룹의 동물에게는 좌측 복강 내 주사에 의해 동일한 용량의 동일한 완충액을 투여하였다. 72 시간 후 래트의 혈당치를 측정하였다. 혈당 >16.7 mmol/L이고 요당이 +++에서 ++++까지인 총 52 마리의 래트를 모델 동물로 선택하였다. 먹이 공급 10 주 후, 당뇨병성 말초 신경병증이 있는 모델 래트를 얻었다.
1.4 동물 그룹화
52 마리의 모델 래트를 무작위로 모델 대조 그룹 (10), pSN-hHGF 시험 그룹 (10), pSN-130Arg-hHGF 시험 그룹 (10), pSN-130His-hHGF 시험 그룹 (11), 및 PSN-130Lys-hHGF 시험 그룹 (11 마리 동물)으로 나누었다.
1.5 투여 방법
성공적인 모델링 10 주 후에 시험 그룹의 동물에 약물 투여를 시작하였다. 각 동물의 왼쪽 허벅지 안쪽에 4 곳 (내전근 1 곳과 반막근 3 곳)을 취하고, 각 지점에 250 μg/250 μl의 시험 약물을 총 1 회 근육 내 주사로 투여하였다 (즉, 총 1 mg/1 ml의 시험 약물이 각 동물에게 1 회 투여됨). 모델 그룹은 동일한 부피의 생리 식염수를 투여 받았다.
1.6 운동 신경 전도 속도 (MNCV) 및 감각 신경 전도 속도 (SNCV) 측정
투여 후 10 주째에 측정을 수행하였다. 래트를 마취시킨 후, 왼쪽 좌골 신경을 외과적으로 분리하고, 래트의 MNCV와 SNCV를 Neuromatic-2000 근전도 검사기로 측정하였다. MNCV 측정 방법은 다음과 같다: 기록 전극을 전경골근의 복부 중앙에 수직으로 천공하고 자극 전극을 사용하여 좌골 신경의 근위 말단을 20 mA의 자극 전류로 자극하고, 근전도 검사기로 오실로스코프에 활성 전위를 표시하고 기록한 다음, 두 전극 사이의 거리에 따라 MNCV를 계산하였다. SNCV 측정 방법은 다음과 같다: 기록 전극을 좌골 신경의 근위 말단에 배치하고, 자극 전극을 사용하여 30 mA의 자극 전류로 장딴지 신경의 근위 말단을 자극하고, 근전도 검사기로 얻은 파형을 기록한 뒤, 두 전극 사이의 거리에 따라 SNCV를 계산하였다.
1.7 장딴지 신경의 유수 신경 섬유의 정량 분석
투여 후 10 주째에 측정을 수행하였다. 우측 장딴지 신경의 원위 말단을 3% 글루타르알데히드/0.1 mol/L 인산염 완충액에 고정하고 밤새 4 ℃에서 보관하였다; PBS 완충액으로 헹구고, 1% 오스뮴산으로 고정한 다음 헹구고, 탈수하고, 에폭시 수지로 포매하였다. 1 μm의 반박형 단면 섹션을 준비하고, 1% 톨루이딘 블루 용액으로 30 분 동안 염색한 다음, 85% 알콜로 세척하고 배경이 청색이 될 때까지 탈색한 다음 검으로 슬라이드에 장착하였다. 유수 신경 단면 영상을 200 배 확대하여 수집하고, 유수 신경 섬유를 다기능 트루 컬러 병리 영상 분석 시스템을 이용하여 계수하고 유수 신경 섬유의 총 단면적, 신경 섬유 밀도 및 신경 섬유의 평균 단면적을 계산하여 장딴지 신경의 병리학적 변화를 관찰하였다.
1.8 통계 처리
데이터를 평균±표준 편차
Figure pct00006
로 표시하였다. SPSS16.0 통계 소프트웨어를 사용하여 다중인자 요인 설계 데이터에 대한 분산 분석을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
2. 실험 결과
2.1 각 그룹에서 실험 동물의 MNCV 및 SNCV 결정
표 6은 각 그룹의 실험 동물의 MNCV 및 SNCV 측정 결과를 나타낸다.
투여 후 10 주째에 각 그룹의 동물의 MNCV 및 SNCV
그룹 MNCV SNCV
정상 대조 그룹
모델 대조 그룹
pSN-hHGF 시험 그룹
pSN-130Arg-hHGF 시험 그룹
pSN-130His-hHGF 시험 그룹
pSN-130Lys-hHGF 시험 그룹		 51.2±3.6
33.6±3.0**
36.2±2.8*
45.4±4.6
48.8±4.0
47.5±4.6		 48.5±4.8
31.5±3.7**
37.6±3.1*
48.3±5.1
47.9±3.1
46.3±3.5
상기에서, "*"는 정상 대조 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"**"는 정상 대조 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 투여 후 10 주째에 모델 대조 그룹의 MNCV와 SNCV가 가장 낮았다 (정상 대조 그룹보다 현저히 느림, p <0.01); pSN-hHGF 시험 그룹이 뒤를 이었다 (정상 대조 그룹보다 현저히 느림, p <0.05). hHGF 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드 시험 그룹의 MNCV와 SNCV는 정상 대조 그룹에 비해 약간 낮았지만 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (p >0.05). 이러한 결과는 천연 hHGF 및 그 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드가 당뇨병성 말초 신경병증의 회복을 촉진하고 손상된 MNCV 및 SNCV를 회복하며 hHGF 돌연변이체 (pSN-130Arg-hHGF, pSN-130His-hHGF 및 pSN-130Lys-hHGF)를 암호화하는 재조합 플라스미드가 천연 hHGF (pSN-hHGF)를 암호화하는 재조합 플라스미드보다 우수하다는 것을 나타낸다.
(2) 장딴지 신경의 유수 신경 섬유의 정량 분석
각 그룹에서 실험 동물의 장딴지 신경의 유수 신경 섬유를 정량 분석한 결과를 표 7에 나타내었다.
투여 후 10 주째에 각 그룹에서 동물의 장딴지 신경 중 유수 신경 섬유의 정량 분석
그룹 총 신경 단면적
(μm2)		 평균 신경 섬유 면적
(μm2)
정상 대조 그룹
모델 대조 그룹
pSN-hHGF 시험 그룹
pSN-130Arg-hHGF 시험 그룹
pSN-130His-hHGF 시험 그룹
pSN-130Lys-hHGF 시험 그룹		 36054±2122
15398±971**
18123±1025*
31352±1659#
28232±1321#
29269±1217# 		25.7±2.0
10.6±1.2**
15.2±1.8*
23.9±1.4#
21.5±0.9#
24.1±1.2#
상기에서, "*"는 정상 대조 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"**"는 정상 대조 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
"#"은 pSN-hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.05를 의미하고;
"##"는 pSN-hHGF 시험 그룹과 비교하여 p <0.01을 의미한다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 투여 후 10 주째에 정상 대조 그룹에 비해 모델 대조 그룹의 총 신경 단면적과 평균 신경 섬유 면적이 현저히 감소하였으며 유의한 차이가 있었다 (p <0.01); pSN-hHGF 시험 그룹 동물의 총 신경 단면적과 평균 신경 섬유 면적도 유의하게 감소하였으나 (p <0.05) 감소 정도는 저하되었다; hHGF 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 시험 그룹에서 동물의 총 신경 단면적 및 평균 신경 섬유 면적은 불명확한 감소를 보였으며 유의한 차이가 없었다. 또한, pSN-hHGF 시험 그룹에 비해 hHGF 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드 시험 그룹에서 동물의 총 신경 단면적 및 평균 신경 섬유 면적이 유의하게 증가하였다 (p <0.05). 이러한 결과는 천연 hHGF와 그 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드가 당뇨병성 말초 신경병증의 회복을 촉진하고, 유수 신경 섬유의 총 단면적과 수랄 신경의 신경 섬유의 평균 면적을 회복시킬 수 있으며, hHGF 돌연변이체 (PSN-130Arg-hHGF, pSN-130His-hHGF 및 pSN-130Lys-hHGF)를 암호화하는 3 개의 재조합 플라스미드가 천연 hHGF (pSN-hHGF)를 암호화하는 재조합 플라스미드보다 우수하다는 것을 나타낸다.
표 6 내지 7의 결과는 hHGF 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드와 천연 hHGF를 암호화하는 재조합 플라스미드가 당뇨병성 말초 신경병증에 우수한 치료 효과를 보였고, 당뇨 래트에서 MNCV 및 SNCV를 현저하게 증가시킬 수 있으며 당뇨 래트에서 장딴지 섬유의 총 단면적과 신경 섬유의 평균 면적을 크게 향상시킬 수 있음을 보여준다. 또한, hHGF 돌연변이체 (pSN-130Arg-hHGF, pSN-130His-hHGF 및 pSN-130Lys-hHGF)를 암호화하는 세 재조합 플라스미드의 치료 결과는 천연 hHGF (pSN-hHGF)를 암호화하는 재조합 플라스미드보다 현저히 우수하였다.
3. 결론
실시예 3, 4 및 6의 결과는 본 출원의 hHGF 돌연변이체가 제대 정맥 혈관 내피 세포의 이동을 촉진하고, 하지 동맥의 성장을 촉진하며, 당뇨병성 말초 신경병증의 회복을 촉진한다는 점에서 천연 hHGF보다 유의하게 높은 활성을 가진다는 것을 나타낸다.
실시예 5 및 7의 결과는 hHGF 돌연변이체를 암호화하는 재조합 플라스미드가하지 동맥의 성장을 촉진하고 대상에서 당뇨병성 말초 신경병증의 회복을 촉진하는 유전자 치료 약물로 사용될 수 있으며, 그 치료 효과는 천연 hHGF를 암호화하는 재조합 플라스미드보다 상당히 높다는 것을 나타낸다.
본 출원의 구체적인 실시양태를 상세히 설명하였지만, 당업자라면 개시된 모든 교시 내용에 따라 세부 사항에 대한 다양한 변형 및 변경이 가능하며, 이러한 변화들은 본 출원의 보호의 범위 내에 있음을 이해할 것이다. 본 출원의 전체 범위는 아래 청구범위 및 그의 임의 등가물에 의해 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> BEIJING NORTHLAND BIOTECH. CO., LTD. <120> Human hepatocyte growth factor mutant and uses thereof <130> IEC180227PCT <150> 201910010091.X <151> 2019-01-07 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 697 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys 20 25 30 Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly 35 40 45 Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln 50 55 60 Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu 65 70 75 80 Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn 85 90 95 Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr 100 105 110 Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu 115 120 125 His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn 130 135 140 Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr 145 150 155 160 Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser 165 170 175 Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met 180 185 190 Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr 195 200 205 Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe 210 215 220 Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr 245 250 255 Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr 260 265 270 Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr 275 280 285 Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His 290 295 300 Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu 305 310 315 320 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr 325 330 335 Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys 340 345 350 Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr 355 360 365 Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp 370 375 380 Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp 385 390 395 400 Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala 405 410 415 His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr 420 425 430 Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn 435 440 445 Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val 450 455 460 Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu 465 470 475 480 Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser 485 490 495 Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp 500 505 510 Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu 515 520 525 Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu 530 535 540 Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp 545 550 555 560 Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro 565 570 575 Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile 580 585 590 Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn 595 600 605 Glu Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser 610 615 620 Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly 625 630 635 640 Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val 645 650 655 Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro 660 665 670 Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile 675 680 685 Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 690 695 <210> 2 <211> 697 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of 130Arg-hHGF <400> 2 Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys 20 25 30 Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly 35 40 45 Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln 50 55 60 Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu 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cctacgagaa 960 aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020 atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080 tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140 tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200 gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260 tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320 gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380 caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440 agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500 gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560 gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620 tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680 gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740 tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct 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acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840 ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900 cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960 aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020 atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080 tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140 tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200 gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260 tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320 gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380 caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440 agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500 gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560 gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620 tatggccctg aaggatcaga tctggtttta 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catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200 gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260 tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320 gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380 caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440 agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500 gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560 gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620 tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680 gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740 tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800 gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860 ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920 gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980 gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040 tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094 <210> 9 <211> 2889 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence of pSN vector <400> 9 gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag 60 gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120 cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180 ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240 tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 300 cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 360 agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg 420 ctagccaccg cggccgcaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 480 gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 540 aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tccaggataa tatatggtag ggttcatagc 600 cagagtaacc ttttttttta atttttattt tattttattt tgagctgcag gcatgcaagc 660 tggcactggc 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gagatcctcg ccgtcgggca tgctcgcctt gagcctggcg 1560 aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 1620 ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 1680 caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 1740 tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 1800 cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 1860 gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 1920 gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 1980 cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 2040 gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 2100 tcagatcttg atccctgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 2160 ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 2220 tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 2280 cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 2340 taccagcggt ggtttgtttg 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Claims (12)

  1. 인간 간세포 성장 인자 (hHGF)의 돌연변이체로서, 천연 hHGF와 비교하여, 서열 번호 1의 130 번째 위치에 상응하는 위치에서 천연 hHGF의 아미노산이 염기성 측쇄를 가진 아미노산으로 돌연변이된 돌연변이를 포함하는 hHGF의 돌연변이체.
  2. 제1항에 있어서, 다음 중에서 선택된 하나 이상의 특성을 갖는 돌연변이체:
    (1) 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로부터 선택됨;
    (2) 천연 hHGF는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 가짐;
    (3) 돌연변이체는 서열 번호 2, 3 및 4에서 선택된 아미노산 서열을 가짐;
    (4) 돌연변이체는 변형, 예를 들어 화학적 변형, 예를 들어 페길화에 의해 변형됨;
    (5) hHGF 돌연변이체는 재조합 발현 방법에 의해 제조되거나 화학적 합성 방법에 의해 제조됨; 및
    (6) hHGF 돌연변이체는 천연 hHGF보다 더 강력한 생물학적 활성을 가지며, 예를 들어 (a) 내피 세포의 성장 및/또는 이동 촉진; (b) 혈관 (예를 들어, 미세 혈관) 형성 촉진 및/또는 (c) 신경 장해 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증과 같은 말초 신경병증)의 복구 촉진 중에서 선택된 하나 이상의 측면에서 더 강력 활성을 나타냄.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서;
    바람직하게는, 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 선호도에 따라 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 갖고;
    바람직하게는, 서열 번호 6, 7 및 8 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는,
    단리된 핵산 분자.
  4. 제3항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터로서; 바람직하게는 다음 중에서 선택된 하나 이상의 특성을 가질 수 있는 벡터:
    (1) 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 플라스미드); 파지미드; 코스미드; 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공 염색체; 람다 파지 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지; 및 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터), 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 (예를 들어, 단순 포진 바이러스 벡터), 폭스바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택됨;
    (2) 벡터는 돌연변이체를 발현 (예를 들어, 대상 (예컨대 인간과 같은 포유동물)에서 발현)하는데 사용됨; 및
    (3) 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 플라스미드), 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터와 같은 유전자 치료용 벡터이고; 바람직하게는 벡터는 핵산 분자를 포함하는 pSN 벡터임.
  5. 제3항에 따른 단리된 핵산 분자 또는 제4항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 바람직하게는, 원핵 세포, 예컨대 대장균 세포, 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 마우스 세포, 인간 세포 등)로부터 선택되는 숙주 세포.
  6. 제5항에 따른 숙주 세포를 적절한 조건하에 배양하고, 상기 숙주 세포의 세포 배양물로부터 돌연변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 돌연변이체의 제조 방법으로서,
    바람직하게는, 다음 단계를 포함하는 제조 방법:
    (1) 돌연변이체 (예를 들어, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제하는 단계;
    (2) 상기 발현 벡터를 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에 도입하고, 단백질 발현을 허용하는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (3) 상기 숙주 세포의 세포 배양물로부터 돌연변이체를 단리 및 회수하는 단계 (예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 및 헤파린 친화성 크로마토그래피에 의해 분리 및 회수하는 단계).
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 돌연변이체 또는 제3항에 따른 핵산 분자 또는 제4항에 따른 벡터, 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 따른 돌연변이체 또는 제3항에 따른 핵산 분자 또는 제4항에 따른 벡터 또는 제7항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 천연 hHGF의 활성으로부터 혜택을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법으로서;
    바람직하게는, 질환은 허혈성 질환 (예를 들어, 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD), 예컨대 심근경색 또는 하지 동맥 허혈), 대사 증후군, 당뇨병 및 이의 합병증 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증), 재협착 (예를 들어, 수술 후 재협착 및 관류 후 재협착) 및 신경 장해 (예를 들어, 신경 퇴행성 질환 (예컨대, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 치매), 외상성 신경 손상, 말초 신경병증 (예컨대, 당뇨병성 말초 신경병증))으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는 대상은 인간과 같은 포유동물인,
    방법.
  9. 대상에서 천연 hHGF의 활성으로부터 혜택을 얻을 수 있는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에서의 제1항 또는 제2항에 따른 돌연변이체 또는 제3항에 따른 핵산 분자 또는 제4항에 따른 벡터의 용도로서;
    바람직하게는, 질환은 허혈성 질환 (예를 들어, 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD), 예컨대 심근경색 또는 하지 동맥 허혈), 대사 증후군, 당뇨병 및 이의 합병증 (예를 들어, 당뇨병성 말초 신경병증), 재협착 (예를 들어, 수술 후 재협착 및 관류 후 재협착) 및 신경 장해 (예를 들어, 신경 퇴행성 질환 (예컨대, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 치매), 외상성 신경 손상, 말초 신경병증 (예컨대, 당뇨병성 말초 신경병증))으로 구성된 군으로부터 선택되는,
    용도.
  10. 유효량의 제1항 또는 제2항에 따른 돌연변이체 또는 제3항에 따른 핵산 분자 또는 제4항에 따른 벡터 또는 제7항에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 내피 세포 또는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 내피 세포 (예를 들어, 제대 정맥 내피 세포)의 성장 및/또는 이동을 촉진하는 방법.
  11. 유효량의 제1항 또는 제2항에 따른 돌연변이체 또는 제3항에 따른 핵산 분자 또는 제4항에 따른 벡터 또는 제7항에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 혈관 형성 (예를 들어, 미세 혈관 형성)을 촉진하는 방법.
  12. 내피 세포 (예를 들어, 제대 정맥 내피 세포)의 성장 및/또는 이동을 촉진하거나, 혈관 형성 (예를 들어, 미세 혈관 형성)을 촉진하기 위해 사용되는 약학적 조성물의 제조에서의, 제1항 또는 제2항에 따른 돌연변이체 또는 제3항에 따른 핵산 분자 또는 제4항에 따른 벡터의 용도.
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