JP7246494B2 - ヒト肝細胞増殖因子変異体およびその使用 - Google Patents

Description

本願は、ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の変異体に関する。本願は、当該変異体をコードする核酸分子、当該核酸分子を含むベクター、ならびに当該核酸分子またはベクターを含む宿主細胞にも関する。本願は、当該ｈＨＧＦ変異体または当該変異体をコードする核酸分子を含む医薬組成物、ならびに当該ｈＨＧＦ変異体または当該変異体をコードする核酸分子の使用にも関する。当該ｈＨＧＦ変異体または当該変異体をコードする核酸分子は、例えば、内皮細胞の増殖および／または移動の促進、血管形成の促進、または天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る疾患の治療（例えば、下肢動脈阻血、心筋梗塞、および／または糖尿病性末梢性ニューロパシーの治療）に使用することができ、したがって、医薬の製造に使用することができる。

肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、最初に、ラット血漿および血小板から単離され、分散因子（ＳＦ）としても知られる分泌されたヘパリン親和性糖タンパク質である。ＨＧＦは、間葉細胞によって産生され、受容体ｃ－Ｍｅｔに結合し、当該受容体のチロシンキナーゼ活性を活性化し、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、メラノサイト、造血細胞、および他のタイプの細胞の増殖、移動、および形態形成を促進することが知られている。ＨＧＦは、胎生肝および胎盤の成長において重要な役割を果たし、肝臓、肺、腎臓、およびその他の臓器の細胞の維持および再生（ｒｅｎｅｗｉｎｇ）に関与し、ならびに損傷後のこれらの臓器の再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）およびこれらの臓器の修復を促進する。さらに、ＨＧＦは、異なる供給源由来の腫瘍細胞に対する浸潤促進効果または成長阻害効果を有する。したがって、ＨＧＦは、広範な臨床応用の可能性を有する多機能サイトカインである。

成熟ＨＧＦは、鎖間ジスルフィド結合によって連結された重鎖（α鎖）および軽鎖（β鎖）で構成されたヘテロ二量体であり、α鎖は、約６９ｋＤの４６３のアミノ酸を含み；β鎖は、約３４ｋＤの２３４のアミノ酸を含む。α鎖のＮ末端は、ヘアピン構造を有し、そのＣ末端付近には、４つのプラスミン様クリングル構造が存在し（順番に、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４領域と呼ばれる）、各クリングル構造は、約８０のアミノ酸で構成される。ヘアピン構造およびＫ１領域は、ＨＧＦが受容体ｃ－Ｍｅｔに結合するため重要な部分であることが知られており；ヘアピン構造およびＫ２領域は、一緒に、ヘパリンおよびヘパラン硫酸とのＨＧＦの親和性にとって必要な構造を構成し；β鎖は、セリンプロテアーゼ様折り畳み領域を含むが、セリンプロテアーゼ活性は有さない。ＨＧＦ分子全体は、それぞれ、Ａｓｎ２９４、Ａｓｎ４０２、Ａｓｎ５６６、およびＡｓｎ６５３に位置された４つのＮグリコシル化部位を有し、重鎖および軽鎖はそれぞれ、２つのＮグリコシル化部位を含む（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００２，１８：１～４）。

Ｃ－Ｍｅｔは、ＨＧＦの特異的細胞膜受容体であり、様々な細胞、例えば、心筋細胞、血管内皮細胞など、において発現され、ＨＧＦの生物学的効果を媒介する。ＨＧＦ／Ｃ－Ｍｅｔ系は、様々な組織において広く発現され、細胞増殖の調整、運動および組織形態形成ならびに他の複雑な生物学的プロセスに参加する。ＨＧＦは、内皮増殖因子であり、その特異的受容体Ｃ－Ｍｅｔに結合し、受容体チロシン残基のリン酸化を引き起こし、ポスト受容体シグナル伝達プロセスを開始し；それは、ＥＲＫのリン酸化も引き起こし、ＳＴＡＴ３（Ｓｅｒ７２７）リン酸化を引き起こして二量体を形成し、核に侵入し、初期増殖反応遺伝子、例えば、ｃ－ｆｏｓなど、の発現を促進し、それにより、転写レベルでの細胞増殖を制御する。当該研究は、ＨＧＦが、ＭＥＫ、Ｐ４２／４４ＭＡＰＫ、およびＰ９０ＲＳＲを活性化することができ、過酸化水素によって引き起こされる細胞死を減じることができ、ならびにＢＣＬ－２遺伝子発現を活性化し、ミトコンドリア膜表面へのＢａｘタンパク質の転位を阻害することができ、ミトコンドリア膜の内側および外側での電気化学的勾配を維持し、ミトコンドリア内でのチトクロムＣの漏れを防ぎ、カスパーゼ－３およびカスパーゼ－９の活性を阻害し、それにより、抗アポトーシス効果を発揮することも見出した。ＨＧＦは、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞におけるＭＭＰ－１、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、およびＣ－Ｍｅｔの発現も刺激することができ、ｍＲＮＡ発現およびＥｔｓ－１の転写活性を著しく増加させることができ、新生血管形成のプロセスにおいて重要な役割を果たす（肝細胞増殖因子の血管形成特性は、血管の形成に対する必須転写因子ｅｔｓ－１の上方調節に依存する、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３，１０７：１４１１～１４１７）。Ｅｔｓ経路は、ＨＧＦが血管の形成を促進するための分子メカニズムの１つでもある（肝細胞増殖因子を使用する治療的血管形成、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００４，４：１９９～２０６）。Ｅｔｓファミリーの転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインを有し、ＤＮＡ配列のコアＧＧＡに結合することができ、細胞増殖シグナルに関与する様々な遺伝子の発現において非常に重要な役割を果たし、ならびにこれらの遺伝子の転写を制御することによって血管の形成の調整に参加し得る。ＨＧＦ遺伝子は、多くの調節領域、例えば、Ｂ細胞およびマクロファージ特異的転写因子接合領域、インターロイキン２６応答要素（ＩＬ２６ＲＥ）、形質転換増殖因子阻害要素（ＴＮＦＩＥ）、およびｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）など、を含む。したがって、外因性ＨＧＦは、Ｅｔｓの活性を誘導することによって、内因性ＨＧＦの発現を刺激することができ、内因性ＨＧＦは、自動伝導機能により、微小血管の形成を促進することができる。

本発明者らは、研究の後、ｈＨＧＦを変異させることにより、増強された生物活性を有するｈＨＧＦ変異体を得ることができることを発見した。

本願において、特に明記されない限り、本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、および免疫学の検査法は全て、対応する分野において広く使用医される通常の手順である。同時に、本願をよりよく理解するために、関連する用語の定義および説明が以下に提供される。

本明細書において使用される場合、用語「天然ｈＨＧＦ」および「野生型ｈＨＧＦ」は、生物学的に活性で天然に存在するヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）を意味し、両方は、同じ意味を有し、相互互換的に使用することができる。天然ｈＨＧＦまたは野生型ｈＨＧＦのアミノ酸配列は、様々な公開データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース）から容易に得ることができる。例えば、天然ｈＨＧＦのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号：ＮＰ＿０００５９２．３に見出すことができる。

本明細書において使用される場合、天然ｈＨＧＦのアミノ酸配列に言及する場合、それは、配列番号１に示される配列を使用することによって説明される。例えば、表現「天然ｈＨＧＦの１３０番目のアミノ酸残基」は、配列番号１に示されるタンパク質の１３０番目のアミノ酸残基を意味する。しかしながら、当業者は、天然ｈＨＧＦが、複数の変形を有し得、それらが、実質的に同じ一次構造（すなわち、アミノ酸配列）と高レベルの構造（すなわち、空間構造）とを有し、ならびに実質的に同じ生物学的機能を有するが、それらは、依然として、アミノ酸配列におけるわずかな違いを有することができることを理解する。したがって、本願において、天然ｈＨＧＦは、配列番号１に示されるタンパク質に限定されず、全ての公知の天然ｈＨＧＦを網羅することが意図される。したがって、本願において、用語「天然ｈＨＧＦ」は、生物学的機能を有する様々な天然に存在するｈＨＧＦ、例えば、配列番号１に示されるｈＨＧＦおよびその天然に存在するバリアントなど、を含む。その上、ｈＨＧＦのアミノ酸位置を説明する場合、それは、配列番号１における特定のアミノ酸位置だけでなく、当該特定のアミノ酸位置に対応するその天然のバリアントにおけるアミノ酸位置も含む。例えば、表現「天然ｈＨＧＦの１３０番目のアミノ酸残基」は、配列番号１の１３０番目のアミノ酸残基と、その天然のバリアントにおける対応するアミノ酸位置を含む。本願によれば、表現「対応するアミノ酸位置」は、当該配列が最適に揃えられた場合、すなわち、当該配列が、最も高いパーセント同一性を有するように揃えられた場合に、比較される配列における同等の位置でのアミノ酸位置を意味する。同様に、表現「配列番号１の１３０番目の位置に対応する位置」は、当該配列が、配列番号１に対して最適に揃えられた場合、すなわち、当該配列が、最も高いパーセント同一性を得るように配列番号１に対して揃えられた場合に、配列番号１の１３０番目の位置に等しい、比較される配列におけるアミノ酸位置を意味する。

ある特定の好ましい実施形態において、天然ｈＨＧＦは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。ある特定の好ましい実施形態において、天然ｈＨＧＦは、生物学的機能を有する天然に存在するヒト肝細胞増殖因子であり、そのアミノ酸配列は、配列番号１と比較した場合に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の好ましい実施形態において、天然ｈＨＧＦは、生物学的機能を有する天然に存在するヒト肝細胞増殖因子であり、そのアミノ酸配列は、１つまたは複数（例えば、１から１０または１から５または１から３）のアミノ酸の違いを有する（例えば、アミノ酸の保存的置換）。

本明細書において使用される場合、用語「同一性」は、２つのポリペプチドの間または２つの核酸の間の配列一致度を意味するために使用される。比較される２つの配列のある特定の位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれのある特定の位置がアデニンによって占められているか、または２つのポリペプチドのそれぞれのある特定の位置がリジンによって占められている場合）、各分子は、その位置において同一である。２つの配列の間の「パーセント同一性」は、２つの配列によって共有される一致する位置の数を、比較される位置の数で割って、１００を掛けたものの関数である。例えば、２つの配列の１０箇所の位置のうちの６箇所が一致する場合、当該２つの配列は、６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を有する（６箇所の位置のうち３箇所が一致する）。一般的に、この比較は、２つの配列が最大の同一性を生じるように揃えられた場合に実施される。そのような位置合わせは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３の方法を使用して実施することができ、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムによって簡便に実施される。２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に統合されたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１～１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０ウエイト残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用することによっても特定することができた。さらに、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）に統合されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ．４８：４４４～４５３（１９７０））を使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウエイト、および１、２、３、４、５、または６のギャップ長ウエイトを使用することによっても特定することができた。

本明細書において使用される場合、用語「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「保存的置き換え（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」は、当該アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの必須の特性に悪影響を及ぼさないかまたは変更しないようなアミノ酸の置換または置き換えを意味する。例えば、保存的置換は、当技術分野において公知の標準的技術、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などによって導入することができる。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換、例えば、対応するアミノ酸残基に対して物理的または機能的に同様である（例えば、同様のサイズ、形状、電荷、化学特性、例えば、共有結合または水素結合を形成する能力など、を有する）アミノ酸残基による置換、が挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖：（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐鎖状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で当該対応するアミノ酸残基を置換することが好ましい。保存的アミノ酸置換を識別する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０～１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９～８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ ９４：４１２～４１７（１９９７）を参照されたく、なお、これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる）。

本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同じ意味を有し、相互互換的に使用することができる。ならびに、本発明において、アミノ酸は、通常、当技術分野において周知の１文字および３文字の略語によって表される。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａによって表すことができる。

本明細書において使用される場合、用語「塩基性側鎖を有するアミノ酸」は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。アミノ酸は、通常、以下の構造：

［式中、Ｒは、側鎖基である］を有する。
したがって、側鎖基Ｒが塩基性の場合、当該アミノ酸は、塩基性側鎖を有するアミノ酸である。塩基性側鎖を有するアミノ酸の溶液において、当該アミノ酸の当該側鎖は、解離して、塩基性であるＯＨ^－を生じることができる。それに対応して、解離後の当該アミノ酸の当該側鎖は、正電荷を有するであろう。したがって、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性アミノ酸、または正に帯電した側鎖基を有するアミノ酸とも呼ばれる。塩基性側鎖を有するアミノ酸の典型的な例としては、これらに限定されるわけではないが、リシン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられる。

本明細書において使用される場合、用語「単離された」または「単離される」は、人工的手段によって天然状態から得られることを意味する。ある特定の物資または成分が自然に「単離」される場合、それが置かれた天然環境が変化したか、または当該物質が当該天然環境から分離されたか、またはその両方であり得る。例えば、ある特定の単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然において、生きている動物内に存在し、この天然状態から分離された高い純度を有する同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離された」と呼ばれる。用語「単離された」または「単離される」は、人工物質または合成物質の混合物を排除せず、当該物質の活性に影響を及ぼさない他の不純物質の存在も排除しない。

本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達ビヒクルを意味する。当該ベクターが、当該挿入されたポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質を発現することができる場合、当該ベクターは、発現ベクターと呼ばれる。当該ベクターは、形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって宿主細胞内に導入することができ、それにより、それが運ぶ遺伝物質要素は、宿主細胞において発現することができる。ベクターは、当技術分野において周知であり、例としては、これらに限定されるわけではないが、プラスミド（例えば、裸のプラスミド）；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など；バクテリオファージ、例えば、λバクテリオファージまたはＭ１３バクテリオファージなど；ならびにウイルスベクターなど、が挙げられる。ベクターとして使用することができるウイルスとしては、これらに限定されるわけではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、乳頭腫ウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、発現を制御する様々な要素を含むことができ、その例としては、これらに限定されるわけではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素、レポーター遺伝子が挙げられる。さらに、ベクターは、複製開始点部位も含み得る。

本明細書において使用される場合、用語「宿主細胞」は、ベクターの導入のために使用することができる細胞を意味し、その例としては、これらに限定されるわけではないが、原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など、真菌細胞、例えば、酵母菌またはアスペルギルスなど、昆虫細胞、例えば、Ｓ２ショウジョウバエ細胞またはＳｆ９など、あるいは動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはヒト細胞などが挙げられる。

本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、製剤分野において認識される動物、特にヒトに対して許容可能であることを意味する。本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」は、対象および有効成分に対して薬理学的および／または生理学的に適合性である、当技術分野において周知の担体および／または賦形剤を意味し（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編集，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照されたい）、その例としては、これらに限定されるわけではないが、ｐＨ調節剤（その例としては、これらに限定されるわけではないが、リン酸緩衝液が挙げられる）、界面活性物質（その例としては、これらに限定されるわけではないが、カチオン性、アニオン性、または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０など、が挙げられる）、アジュバント、イオン強度増強剤（その例としては、これらに限定されるわけではないが、塩化ナトリウムが挙げられる）、希釈剤、賦形剤、および治療薬を含有するためまたは投与するための媒体、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

本明細書において使用される場合、用語「アジュバント」は、非特異的免疫エンハンサーを意味し、それらは、抗原と共に身体に送達されるかまたは予め送達される場合に、抗原に対する身体の免疫反応を増強することができ、または免疫反応のタイプを変更することができる。アジュバントの典型例としては、これらに限定されるわけではないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウムパルブム、リポ多糖、サイトカインなどが挙げられる。

本明細書において使用される場合、薬学的に許容される担体は、無菌液体、例えば、水および油などであり得、その例としては、石油、動物、植物または合成に由来する油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油などが挙げられる。当該医薬組成物が、静脈内に投与される場合、水が好ましい担体である。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、とりわけ注射溶液用に、液体担体として用いることができる。

本明細書において使用される場合、薬学的に許容される賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、ライス、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、粉ミルク、グリセリン、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノールなどを含み得る。必要であれば、医薬組成物は、湿潤剤、または乳化剤、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムなど、またはｐＨ緩衝剤も含んでもよい。当該医薬組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末薬、徐放性製剤などの形態であり得る。

本明細書において使用される場合、用語「有効量」は、所望の効果を得るまたは少なくとも部分的に得るのに十分な量を意味する。例えば、予防有効量は、疾患の発症を防ぐ、止める、または遅らせるのに十分な量であり；治療有効量は、既に疾患を患っている患者において当該疾患およびその合併症を回復するのに、またはその進行を少なくとも部分的に遅らせるのに十分な量を意味する。そのような有効量を決定するのは、完全に当業者の能力内である。例えば、治療用途のための有効量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の総合的な状態、患者の全身状態、例えば、年齢、体重、および性別など、投与の方法、同時に投与される他の治療などに依存するであろう。

本明細書において使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物、例えば、これらに限定されるわけではないが、ヒト、齧歯動物（マウス、ラット、モルモット）、イヌ、ウマ、牛、ネコ、ブタ、サル、チンパンジーなどを意味する。好ましくは、対象はヒトである。

本明細書において使用される場合、用語「天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る疾患」は、ＨＧＦの増強された発現および／または活性が、当該疾患の症状を軽減することができるか、当該疾患の進行を遅らせることができるか、あるいは当該疾患を回復または部分的に回復することができる疾患を意味する。

以前に報告されたように、ＨＧＦは、様々な生物活性、例えば、これらに限定されるわけではないが、以下の活性：（１）内皮細胞の増殖および／または移動の促進；（２）血管（例えば、微小血管）の形成の促進；および／または（３）神経損傷（例えば、末梢性ニューロパチー、例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシーなど）の修復の促進、のうちの１つまたは複数を有する。したがって、ＨＧＦは、多くの点、例えば、これらに限定されるわけではないが、（１）内皮細胞の増殖および／または移動の促進；（２）血管（例えば、微小血管）の形成の促進；（３）虚血疾患、例えば、冠動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、下肢動脈虚血などの治療；（４）メタボリック症候群および糖尿病およびその合併症（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）の治療；（５）再狭窄の阻害；ならびに（６）神経損傷（例えば、神経変性疾患、外傷性神経損傷、末梢ニューロパシー）の修復の促進などにおける応用展望を有し得る。

したがって、用語「天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る疾患」の例としては、これらに限定されるわけではないが、上記において言及した疾患、例えば、虚血性疾患、メタボリック症候群、糖尿病およびその合併症、再狭窄、神経損傷などが挙げられる。

本発明者らは、研究の後、天然ｈＨＧＦを変異させることにより、増強された生物活性を有するｈＨＧＦ変異体を得ることができることを発見した。詳細には、本発明者らは、天然ｈＨＧＦ（参照として配列番号１を有する）の１３０番目のアミノ酸を塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジンなど）へと変異させることによって、結果として得られるｈＨＧＦ変異体は、天然ｈＨＧＦよりも強力な生物活性を有することを発見した。それに対応して、当該ｈＨＧＦ変異体をコードする核酸分子が遺伝子治療薬として使用される場合、それは、天然ｈＨＧＦをコードする核酸分子よりも、対象においてより強力な治療効果を示す。

したがって、一態様において、本願は、天然ｈＨＧＦと比較して、以下のような変異：すなわち、配列番号１の１３０番目に対応する位置における天然ｈＨＧＦのアミノ酸が塩基性側鎖を有するアミノ酸へと変異される変異を含む、ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の変異体を提供する。

ある特定の好ましい実施形態において、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンから選択される。ある特定の好ましい実施形態において、当該塩基性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニンである。ある特定の好ましい実施形態において、当該塩基性側鎖を有するアミノ酸は、ヒスチジンである。ある特定の好ましい実施形態において、当該塩基性側鎖を有するアミノ酸は、リジンである。

ある特定の好ましい実施形態において、天然ｈＨＧＦは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。ある特定の好ましい実施形態において、天然ｈＨＧＦは、生物学的機能を有する天然に存在するヒト肝細胞増殖因子であり、そのアミノ酸配列は、配列番号１と比較した場合に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の好ましい実施形態において、天然ｈＨＧＦは、生物学的機能を有する天然に存在するヒト肝細胞増殖因子であり、そのアミノ酸配列は、配列番号１と比較して、１つまたは複数（例えば、１から１０または１から５または１から３）のアミノ酸の違いを有する（例えば、保存的アミノ酸置換）。

ある特定の好ましい実施形態において、配列番号１に示される天然ｈＨＧＦと比較して、当該変異体は、以下の変異：すなわち、配列番号１の１３０番目のアミノ酸（すなわち、セリン）がアルギニンに変異される変異、を含む。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。

ある特定の好ましい実施形態において、配列番号１に示される天然ｈＨＧＦと比較して、当該変異体は、以下の変異：すなわち、配列番号１の１３０番目のアミノ酸（すなわち、セリン）がヒスチジンに変異される変異、を含む。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。

ある特定の好ましい実施形態において、配列番号１に示される天然ｈＨＧＦと比較して、当該変異体は、以下の変異：すなわち、配列番号１の１３０番目のアミノ酸（すなわち、セリン）がリジンに変異される変異、を含む。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。

したがって、ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、配列番号２、３、および４から選択されるアミノ酸配列を有する。
タンパク質に対して様々な修飾を為すことによって当該タンパク質に所望の特性を付与することができることは、容易に理解することができる。例えば、タンパク質をポリエチレングリコールで修飾することにより（ペグ化）、インビボでの当該タンパク質の半減期を向上させることができる。したがって、ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は修飾されている。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、化学修飾されている。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、ペグ化によって修飾されている。

本願のｈＨＧＦ変異体は、様々な公知の方法によって調製することができる。いくつかの好ましい実施形態において、当該ｈＨＧＦ変異体は、遺伝子組換え発現によって調製される。いくつかの好ましい実施形態において、当該ｈＨＧＦ変異体は、化学合成によって調製される。ただし、本願のｈＨＧＦ変異体は、その調製方法によって制限されないことは、容易に理解することができる。

天然ｈＨＧＦと比較して、本願のｈＨＧＦ変異体は、より強力な生物活性を有する。理論に束縛されることを望むわけではないが、本発明者らは、天然ｈＨＧＦのα鎖のＮ末端における第１ヘアピン構造に位置された（参照として配列番号１に対する）１３０番目の位置のアミノ酸が、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン）へと変異される場合、当該ヘアピン構造の立体配置は変わり、それは、受容体Ｃ－ＭｅｔへのｈＨＧＦタンパク質の結合を強化し、結果として、ｈＨＧＦタンパク質の生物活性を増強すると考えている。したがって、本願のｈＨＧＦ変異体は、例えば、以下：（１）内皮細胞の増殖および／または移動の促進；（２）血管（例えば、微小血管）の形成の促進；および／または（３）神経損傷（例えば、末梢性ニューロパチー、例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシーなど）の修復の促進、から選択される１つまたは複数の面においてより強力な活性を示し得る。

別の態様において、本願は、本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。ある特定の好ましい実施形態において、当該核酸分子は、配列番号２、３、および４から選択されるアミノ酸配列を有する変異体をコードする。

当該単離された核酸分子を、本発明の変異体をクローンするためまたは発現させるために使用することができることは理解することが容易である。場合により、効率を向上させるために、当該核酸分子のヌクレオチド配列は、細胞優先性に従ってコドン最適化することができる。したがって、ある特定の好ましい実施形態において、当該核酸分子のヌクレオチド配列は、宿主細胞優先性に従ってコドン最適化される。ある特定の好ましい実施形態において、当該核酸分子のヌクレオチド配列は、ＣＨＯ細胞優先性に従ってコドン最適化される。

ある特定の好ましい実施形態において、当該核酸分子は、配列番号６、７、および８から選択されるヌクレオチド配列を有する。
別の態様において、本願は、上記において説明した単離された核酸分子を含むベクターも提供する。

本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のベクターは、例えば、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など；バクテリオファージ、例えば、λバクテリオファージまたはＭ１３バクテリオファージなど；ならびにウイルスベクターであり得る。ベクターとして使用することができるウイルスとしては、これらに限定されるわけではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、乳頭腫ウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。したがって、ある特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、ウイルスベクター、例えば、これらに限定されるわけではないが、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、単純ヘルペスウイルスベクター）、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、パポーバウイルスベクターなど、である。ある特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択される。

ある特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、本発明の変異体を発現することができるかまたはそれを発現させるために使用することができる。ある特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなど）において本発明の変異体を発現することができるかまたはそれを発現させるために使用することができる。ある特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、遺伝子治療に使用される。ある特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなど）において本発明の変異体を発現させるためおよび遺伝子治療を実施するための、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。

ある特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、上記において説明したような単離された核酸分子を含むプラスミド、例えば、裸のプラスミドなど、である。ある特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、上記において説明した単離された核酸分子を含むｐＳＮベクターである。ｐＳＮベクターは、中国公告特許第１０８６１１３６７（Ｂ）号において開示されており、配列番号９に示されるようなヌクレオチド配列を有する。

別の態様において、本願は、本発明の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供する。そのような宿主細胞としては、これらに限定されるわけではないが、原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞など、および真核細胞、例えば、酵母細胞など、昆虫細胞、植物細胞、ならびに動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）が挙げられる。本発明の細胞は、細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞などでもあり得る。

別の態様において、本願は、本発明の変異体を調製するための方法であって、好適な条件下において本発明の宿主細胞を培養する工程と、当該宿主細胞の細胞培養物から本発明の変異体を回収する工程とを含む方法も提供する。

ある特定の好ましい実施形態において、当該方法は、以下の工程：
（１）発現ベクターを構築する工程であって、当該発現ベクターが、本発明の変異体（例えば、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する変異体）をコードする核酸配列を含む、工程と；
（２）宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内に当該発現ベクターを導入し、タンパク質の発現を可能にする条件下において当該宿主細胞を培養する工程と；
（３）当該宿主細胞の細胞培養物から本発明の変異体を単離および回収する工程と、を含む。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明の変異体は、工程（３）において、陰イオン交換クロマトグラフィおよびヘパリン親和性クロマトグラフィによって単離および回収される。

天然ｈＨＧＦと比較して、本願のｈＨＧＦ変異体は、より強力な生物活性を有し、それにより、当該変異体は、医薬として有利に使用することができる。それに対応して、天然ｈＨＧＦをコードする核酸分子と比較して、本願のｈＨＧＦ変異体をコードする核酸分子は、対象においてより強力な治療効果を示し、さらに、医薬として有利に使用することもできる。したがって、別の態様において、本願は、本発明の変異体または核酸分子またはベクターと、場合により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。

いくつかの好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、本発明の変異体を含む。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、未修飾である。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、修飾され、例えば、ペグ化される。

ある特定の好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、遺伝子治療に使用される。いくつかの好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、本発明の核酸分子またはベクターを含む。ある特定の好ましい実施形態において、当該ベクターは、本発明の変異体を発現することができる遺伝子治療ベクター、例えば、プラスミド（例えば、裸のプラスミド）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどである。

ある特定の好ましい実施形態において、薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、ｐＨ調節剤（その例としては、これらに限定されるわけではないが、リン酸緩衝液が挙げられる）、界面活性物質（その例としては、これらに限定されるわけではないが、カチオン性、アニオン性、または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０などが挙げられる）、アジュバント、イオン強度増強剤（その例としては、これらに限定されるわけではないが、塩化ナトリウムが挙げられる）、希釈剤、賦形剤、治療薬を含有するためまたは投与するための媒体、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。

ある特定の好ましい実施形態において、薬学的に許容される担体は、無菌液体、例えば、水および油など、であり得、その例として、石油、動物、植物または合成に由来する油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油など、が挙げられる。ある特定の好ましい実施形態において、薬学的に許容される担体は、水、塩溶液、水性デキストロース、グリセリン、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。

ある特定の好ましい実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、ライス、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、粉ミルク、グリセリン、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。

いくつかの好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤（例えば、凍結乾燥粉末薬）および徐放性製剤などの形態であり得る。

本発明の医薬組成物は、様々な好適な方法において投与することができる。投与の好適な様式としては、これらに限定されるわけではないが、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜、および直腸投与などが挙げられる。ある特定の好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、従来の手順に従って、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内経路、経口、鼻腔内、または局所投与にとって好適な医薬製剤へと製剤化される。

一般的に、注射用（例えば、ボーラス注射または持続点滴による、静脈内投与など）の医薬組成物は、無菌および等張である。必要であれば、そのような医薬組成物は、注射部位の痛みを軽減するために、可溶化剤および局所麻酔、例えば、エルゴタミンなども含んでもよい。さらに、注射用の医薬組成物は、保存料も含んでもよい。ある特定の好ましい実施形態において、注射用の医薬組成物は、単位剤形（例えば、アンプルまたは複数投与容器に貯蔵された単位剤形）においても提供され得る。

注射用の医薬組成物は、油性または水性媒体における懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態であってもよく、ならびに調製剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤など、を含んでもよい。あるいは、そのような医薬組成物は、粉末形態であってもよく、それは、使用前に好適な媒体（例えば、無菌の発熱物質を含まない水）に溶解される。ある特定の好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、０．０１％から０．２％のｈＨＧＦ変異体と、５％のマンニトールと、薬学的に許容される担体とを含む凍結乾燥注射剤である。いくつかの好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、１ｍｇから１０ｍｇの本発明による核酸分子またはベクターと、薬学的に許容される担体とを含む凍結乾燥注射剤である。

非経口剤形を提供するために使用することができる好適な媒体は、当業者に周知である。ある特定の好ましい実施形態において、非経口剤形にとって好適な媒体としては、これらに限定されるわけではないが、注射用水；水性媒体、例えば、これらに限定されるわけではないが、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射液、ならびにラクチル化リンガー液など；水混和性媒体、例えば、これらに限定されるわけではないが、エタノール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールなど；ならびに非水性媒体、例えば、これらに限定されるわけではないが、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、胡麻油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなど、が挙げられる。

以前の研究は、ＨＧＦが、内皮細胞の成長および移動を刺激することができること（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１９：６２９（１９９２）；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １４：１０６７（１９９６））およびＨＧＦは、再内皮化刺激剤として使用することができること（Ｙａｓｕｄａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０１：２５４６（２０００）；Ｈａｙａｓｈｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７：１６６４（２０００））を示している。

ＨＧＦが、内皮細胞成長および血管平滑筋細胞移動を調整することによって血管の形成を刺激することができることも分かっている。その血管形成活性により、ＨＧＦは、治療的血管形成のための有望な候補と見なされる。例えば、以前の研究では、ＨＧＦが、虚血性疾患、例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）などを治療するために使用することができることが報告された（Ｍｉｙａｇａｗａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５：２５５６（２００２）；Ａｚｕｍａら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１２０６（２００６）；Ａｏｋｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：４１７（２０００）；Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１２４：１０９９（２００２））。

さらに、ＨＧＦが、糖尿病によって引き起こされた血管性合併症を改善することができること（Ｐｅｎｇら、２０１１）、ならびに、メタボリック症候群および糖尿病およびその合併症（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）を治療するために使用されることも報告されている。

さらに、ＨＧＦは、再狭窄を抑制するための薬剤として使用することができることも報告されている。研究では、急速な内皮表面再建が平滑筋細胞増殖を阻害することができ、その結果、再狭窄を阻害することが示されている（Ｂａｕｔｅｒｓら、Ｐｒｏｇ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉｓ．４０：１０７（１９９７））。損傷血管への内皮成長因子（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ））の局所送達は、再狭窄を阻害する効果を示した（Ａｓａｈａｒａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：３２９１（１９９６）；Ｙａｓｕｄａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０１：２５４６（２０００）；Ｈａｙａｓｈｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７：１６６４（２０００）；Ｗａｌｔｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１０：３６（２００４））。

ＨＧＦは、複数の脳領域において効果的な神経栄養因子であり（Ｋａｔｏら、２００９；Ｅｂｅｎｓら、１９９６）、それは、多くのタイプのニューロン細胞、例えば、運動ニューロン（Ｅｌｓｅｎら、２００９；Ｈａｙａｓｈｉら、２００６）、海馬ニューロン（Ｌｉｍら、２００８）、小脳顆粒細胞（すなわち、ｒａｃｉら、２００２）、および交感神経ニューロン（１９９９）などに影響を及ぼすことができ、同時に、神経新生およびシナプス形成を刺激することができる（Ｓｈａｎｇら、２０１１；Ｗａｎｇら、２０１１）ことも分かっている。ＨＧＦ／ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達は、ニューロンの創傷治癒（Ｔｒａｐｐａｌら、２００８）、とりわけ、局部虚血脳損傷後の治癒（Ｔａｋｅｏら、２００７）を促進できることが報告されている。家族性筋萎縮側索硬化（ＡＬＳ）疾患を患うマウスまたはラットモデルにおける肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の投与は、著しく、運動ニューロンの変性を遅くする（Ａｏｋｉら、２００９）；退行変性過程に貢献する膠細胞増殖を減じる（Ｋａｄｏｙａｍａら、２００７）；麻痺症の発症を遅らせる（Ｋａｄａｙａｍａら、２００９）；ならびに、寿命を延ばす（Ｓｕｎら、２００２）ことができることも報告されている。これらの知見は、ＨＧＦが、様々な神経系疾患、例えば、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、パーキンソンの疾病、認知症）、外傷性脳損傷、および外傷性脊髄損傷など、において、治療効果および神経保護効果を有することを示している。

したがって、ＨＧＦは、（１）内皮細胞の増殖および／または移動の促進；（２）血管（例えば、微小血管）の形成の促進；（３）虚血疾患、例えば、冠動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、下肢動脈虚血など、の治療；（４）メタボリック症候群ならびに糖尿病およびその合併症（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）の治療；（５）再狭窄の阻害；および（６）神経損傷（例えば、神経変性疾患、外傷性神経損傷、末梢ニューロパシー）の修復の促進など、多くの面において適用可能性を有することが示されている。本願のｈＨＧＦ変異体は、天然ｈＨＧＦよりも強力な生物活性を有し、したがって、上記において言及した適用において有利に使用することができる。

したがって、別の態様において、本願は、対象において天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に本発明による変異体または核酸分子またはベクターまたは医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む方法を提供する。

ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、虚血性疾患、メタボリック症候群、糖尿病およびその合併症、再狭窄、ならびに神経損傷から選択される。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、虚血性疾患、例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、心筋梗塞または下肢動脈虚血など、である。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、糖尿病またはその合併症、例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシーなど、である。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、再狭窄、例えば、手術後の再狭窄および潅流後の再狭窄など、である。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、神経損傷、例えば、神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、認知症）、外傷性神経損傷、末梢性ニューロパシー（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）など、である。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は下肢動脈虚血、心筋梗塞、および糖尿病性末梢性ニューロパシーからなる群から選択される。

ある特定の好ましい実施形態において、本発明の変異体の治療有効量が、それを必要とする対象に投与され、それにより、疾患（例えば、下肢動脈虚血、心筋梗塞、および／または糖尿病性末梢性ニューロパシー）を治療する。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、未修飾である。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、修飾され、例えば、ペグ化される。

ある特定の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子またはベクターの治療有効量が、それを必要とする対象に投与され、それにより、当該対象の疾患（例えば、下肢動脈虚血、心筋虚血、心筋梗塞、および／または糖尿病性末梢性ニューロパシー）を治療する。ある特定の好ましい実施形態において、当該ベクターは、本発明の変異体を発現することができる遺伝子治療ベクター、例えば、プラスミド（例えば、裸のプラスミド）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなど、である。

当業者は、投与の様式、頻度、および投薬量は障害、状態、または治療される個人に応じて変わるであろうことを知っている。一般的に、投与は、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）_、局所投与（例えば、表皮投与）、または点滴投与によって実施することができる。さらに、個々の患者に応じて合理的な投与経路および投与計画を選択することも可能である。好適な用量は、上記において言及した医薬組成物の投与後に、当該疾患（例えば、下肢動脈虚血、心筋梗塞、および／または糖尿病性末梢性ニューロパシー）を効率的に治療することができる量である。

本発明の変異体を含む医薬組成物の場合、単位剤形に含まれる有効成分の量は、例えば、約１０μｇから５ｍｇであり得る。適切な投薬量は、患者の状態および投与の様式に応じて変わり、例えば、約１μｇから１００μｇ／ｋｇ体重であり得る。

本発明の核酸分子またはベクターを含む医薬組成物の場合、単位剤形に含まれる有効成分の量は、例えば、約１ｍｇから１０ｍｇであり得る。適切な投薬量は、患者の状態および投与の様式に応じて変わり、例えば、約１０μｇから２００μｇ／ｋｇ体重であり得る。

別の態様において、本願は、天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る、対象の疾患の治療のための医薬組成物の製造における、本発明の変異体または核酸分子またはベクターの使用を提供する。

ある特定の好ましい実施形態において、疾患は虚血性疾患、メタボリック症候群、糖尿病およびその合併症、再狭窄、ならびに神経損傷からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、疾患は、虚血性疾患、例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、心筋梗塞、または下肢動脈虚血などである。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、糖尿病またはその合併症、例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシーなどである。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、再狭窄、例えば、手術後の再狭窄および潅流後の再狭窄などである。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、神経損傷、例えば、神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、認知症）、外傷性神経損傷、末梢性ニューロパシー（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）である。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は下肢動脈虚血、心筋梗塞、および糖尿病性末梢性ニューロパシーからなる群から選択される。

いくつかの好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、本発明の変異体を含む。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、未修飾である。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、修飾され、例えば、ペグ化される。

ある特定の好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、遺伝子治療に使用される。いくつかの好ましい実施形態において、当該医薬組成物は、本発明の核酸分子またはベクターを含む。ある特定の好ましい実施形態において、当該ベクターは、本発明の変異体を発現することができる遺伝子治療ベクター、例えば、プラスミド（例えば、裸のプラスミド）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなど、である。

別の態様において、天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る対象の疾患の治療における使用のための、本発明の変異体または核酸分子またはベクターまたは医薬組成物が提供される。

ある特定の好ましい実施形態において、疾患は虚血性疾患、メタボリック症候群、糖尿病およびその合併症、再狭窄、および神経損傷からなる群から選択される。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、虚血性疾患、例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、心筋梗塞または下肢動脈虚血など、である。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、糖尿病またはその合併症、例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシーなどである。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、再狭窄、例えば、手術後の再狭窄および潅流後の再狭窄などである。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は、神経損傷、例えば、神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、認知症）、外傷性神経損傷、末梢性ニューロパシー（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）などである。ある特定の好ましい実施形態において、疾患は下肢動脈虚血、心筋梗塞、および糖尿病性末梢性ニューロパシーからなる群から選択される。

ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、未修飾である。ある特定の好ましい実施形態において、当該変異体は、修飾され、例えば、ペグ化される。ある特定の好ましい実施形態において、当該核酸分子またはベクターは、遺伝子治療に使用される。ある特定の好ましい実施形態において、当該ベクターは、本発明の変異体を発現することができる遺伝子治療ベクター、例えば、プラスミド（例えば、裸のプラスミド）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなど、である。

別の態様において、本願は、内皮細胞の増殖および／または移動を促進するための方法であって、本発明の変異体または核酸分子またはベクターまたは医薬組成物の有効量をそれを必要とする内皮細胞または対象に投与する工程を含む方法を提供する。

ある特定の好ましい実施形態において、当該方法は、インビボにおいて使用される。例えば、本発明の変異体または核酸分子またはベクターまたは医薬組成物は、対象の内皮細胞の増殖および／または移動を促進するために、当該対象に投与することができる。ある特定の好ましい実施形態において、当該方法は、インビトロにおいて使用される。例えば、本発明の変異体または核酸分子またはベクターまたは医薬組成物は、インビトロにおいて培養された内皮細胞に対して、培養での内皮細胞の増殖および／または移動を促進するために投与することができる。ある特定の好ましい実施形態において、当該内皮細胞は、臍帯静脈内皮細胞である。

別の態様において、本願は、血管の形成を促進するための方法であって、本発明の変異体または核酸分子またはベクターまたは医薬組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態において、血管の形成は、微小血管の形成である。

別の態様において、本願は、医薬組成物の製造における本発明の変異体または核酸分子またはベクターの使用を提供する。当該医薬組成物は、内皮細胞の増殖および／または移動を促進するためまたは血管の形成を促進するために使用される。ある特定の好ましい実施形態において、当該内皮細胞は、臍帯静脈内皮細胞である。ある特定の好ましい実施形態において、血管の形成は、微小血管の形成である。

別の態様において、内皮細胞の増殖および／または移動の促進または血管の形成の促進における使用のための、本発明の変異体または核酸分子またはベクターまたは医薬組成物が提供される。ある特定の好ましい実施形態において、当該内皮細胞は、臍帯静脈内皮細胞である。ある特定の好ましい実施形態において、血管の形成は、微小血管の形成である。

本発明の有益効果
天然ｈＨＧＦと比較して、本願のｈＨＧＦ変異体は、より強力な生物活性を有する。特に、本発明者らは、研究により、本発明のｈＨＧＦ変異体が、例えば、以下の面：（１）内皮細胞の増殖および／または移動の促進；（２）血管（例えば、微小血管）の形成の促進；および／または（３）神経損傷（例えば、末梢性ニューロパチー、例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシーなど）の修復の促進、において、より強力な生物活性を示すことができることを発見した。

したがって、本発明のｈＨＧＦ変異体またはそれをコードする核酸分子は、以下の面：（１）内皮細胞の増殖および／または移動の促進；（２）血管（例えば、微小血管）の形成の促進；（３）虚血疾患、例えば、冠動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、下肢動脈虚血などの治療；（４）メタボリック症候群ならびに糖尿病およびその合併症（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）の治療；（５）再狭窄の阻害；ならびに（６）神経損傷（例えば、神経変性疾患、外傷性神経損傷、末梢ニューロパシー）の修復の促進、のうちの１つまたは複数に対して有利に適用することができる。

本願の実施形態は、図面および実施例を参照しながら下記において詳細に説明されるであろう。しかしながら、当業者は、下記の図面および実施例が本願を例証するためにのみ使用されるのであって本願の範囲を限定するためではないことを理解するであろう。添付の図面および好ましい実施形態についての下記の詳細な説明により、本願の様々な目的および有利な面が、当業者に明らかとなるであろう。

実施例１において調製された４つの標的タンパク質（すなわち、天然ｈＨＧＦ、１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、および１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果を示しており、この場合、レーン１：天然ｈＨＧＦ；レーン２：１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ；レーン３：１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ；レーン４：１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ；レーン５：タンパク質分子量マーカーである。

配列情報の説明
本発明に関与する配列の情報は、以下のように提供される。
配列番号１（天然ｈＨＧＦのアミノ酸配列）
QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS
配列番号２（１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦのアミノ酸配列）
QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHRFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS
配列番号３（１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦのアミノ酸配列）
QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHHFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS
配列番号４（１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦのアミノ酸配列）
QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHKFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS
配列番号５（天然ｈＨＧＦをコードするヌクレオチド配列）
caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat cagcaaagac taccctaatc 60
aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga atactgcaga ccaatgtgct 120
aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca aggcttttgt ttttgataaa 180
gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt caagtggagt gaaaaaagaa 240
tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca ttagaaactg catcattggt 300
aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga gtggcatcaa atgtcagccc 360
tggagttcca tgataccaca cgaacacagc tttttgcctt cgagctatcg gggtaaagac 420
ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag ggggaccctg gtgtttcaca 480
agcaatccag aggtacgcta cgaagtctgt gacattcctc agtgttcaga agttgaatgc 540
atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc atacagaatc aggcaagatt 600
tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat tcttgcctga aagatatccc 660
gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg gccagccgag gccatggtgc 720
tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa ttaaaacatg cgctgacaat 780
actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840
ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900
cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960
aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020
atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080
tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140
tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200
gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260
tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320
gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380
caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440
agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500
gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560
gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620
tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680
gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740
tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800
gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860
ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920
gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980
gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040
tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094
配列番号６（１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦをコードするヌクレオチド配列）
caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat cagcaaagac taccctaatc 60
aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga atactgcaga ccaatgtgct 120
aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca aggcttttgt ttttgataaa 180
gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt caagtggagt gaaaaaagaa 240
tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca ttagaaactg catcattggt 300
aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga gtggcatcaa atgtcagccc 360
tggagttcca tgataccaca cgaacacaga tttttgcctt cgagctatcg gggtaaagac 420
ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag ggggaccctg gtgtttcaca 480
agcaatccag aggtacgcta cgaagtctgt gacattcctc agtgttcaga agttgaatgc 540
atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc atacagaatc aggcaagatt 600
tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat tcttgcctga aagatatccc 660
gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg gccagccgag gccatggtgc 720
tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa ttaaaacatg cgctgacaat 780
actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840
ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900
cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960
aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020
atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080
tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140
tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200
gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260
tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320
gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380
caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440
agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500
gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560
gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620
tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680
gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740
tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800
gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860
ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920
gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980
gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040
tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094
配列番号７（１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦをコードするヌクレオチド配列）
caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat cagcaaagac taccctaatc 60
aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga atactgcaga ccaatgtgct 120
aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca aggcttttgt ttttgataaa 180
gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt caagtggagt gaaaaaagaa 240
tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca ttagaaactg catcattggt 300
aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga gtggcatcaa atgtcagccc 360
tggagttcca tgataccaca cgaacaccac tttttgcctt cgagctatcg gggtaaagac 420
ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag ggggaccctg gtgtttcaca 480
agcaatccag aggtacgcta cgaagtctgt gacattcctc agtgttcaga agttgaatgc 540
atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc atacagaatc aggcaagatt 600
tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat tcttgcctga aagatatccc 660
gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg gccagccgag gccatggtgc 720
tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa ttaaaacatg cgctgacaat 780
actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840
ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900
cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960
aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020
atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080
tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140
tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200
gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260
tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320
gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380
caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440
agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500
gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560
gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620
tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680
gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740
tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800
gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860
ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920
gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980
gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040
tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094
配列番号８（１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦをコードするヌクレオチド配列）
caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat cagcaaagac taccctaatc 60
aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga atactgcaga ccaatgtgct 120
aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca aggcttttgt ttttgataaa 180
gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt caagtggagt gaaaaaagaa 240
tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca ttagaaactg catcattggt 300
aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga gtggcatcaa atgtcagccc 360
tggagttcca tgataccaca cgaacacaag tttttgcctt cgagctatcg gggtaaagac 420
ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag ggggaccctg gtgtttcaca 480
agcaatccag aggtacgcta cgaagtctgt gacattcctc agtgttcaga agttgaatgc 540
atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc atacagaatc aggcaagatt 600
tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat tcttgcctga aagatatccc 660
gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg gccagccgag gccatggtgc 720
tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa ttaaaacatg cgctgacaat 780
actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat gcatccaagg tcaaggagaa 840
ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc catgtcagcg ttgggattct 900
cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca agtgcaagga cctacgagaa 960
aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt gttttaccac tgatccaaac 1020
atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata tgtcacatgg acaagattgt 1080
tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc aaacaagatc tggactaaca 1140
tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc atatcttctg ggaaccagat 1200
gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg atgatgctca tggaccctgg 1260
tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc ctatttctcg ttgtgaaggt 1320
gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa tatcttgtgc caaaacgaaa 1380
caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca taggatggat ggttagtttg 1440
agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa aggagagttg ggttcttact 1500
gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg aagcttggct tggaattcat 1560
gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc tcaatgtttc ccagctggta 1620
tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg ccaggcctgc tgtcctggat 1680
gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca caattcctga aaagaccagt 1740
tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact atgatggcct attacgagtg 1800
gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc atcatcgagg gaaggtgact 1860
ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg gatcaggacc atgtgagggg 1920
gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga gaatggttct tggtgtcatt 1980
gttcctggtc gtggatgtgc cattccaaat cgtcctggta tttttgtccg agtagcatat 2040
tatgcaaaat ggatacacaa aattatttta acatataagg taccacagtc atag 2094
配列番号９（ｐＳＮベクターのヌクレオチド配列）
gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag 60
gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180
ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240
tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 300
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 360
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg 420
ctagccaccg cggccgcaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 480
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 540
aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tccaggataa tatatggtag ggttcatagc 600
cagagtaacc ttttttttta atttttattt tattttattt tgagctgcag gcatgcaagc 660
tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 720
atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 780
atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc 840
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct 900
ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 960
gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 1020
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac 1080
gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt 1140
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 1200
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 1260
tgctggggag tcgaaattca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 1320
gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 1380
tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 1440
cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 1500
gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgctcgcctt gagcctggcg 1560
aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 1620
ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 1680
caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 1740
tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 1800
cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 1860
gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 1920
gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 1980
cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 2040
gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 2100
tcagatcttg atccctgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 2160
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 2220
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 2280
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 2340
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 2400
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 2460
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 2520
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 2580
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 2640
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 2700
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 2760
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 2820
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 2880
gcaacgcgg 2889
本発明を実施するための特定のモデル
本願は、本願を例証することを意図する（本願を限定することは意図しない）下記の実施例を参照しながら説明されるであろう。

特に明記されない限り、本願において使用される分子生物学実験法および免疫測定法は、基本的に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＦＭ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｏｍｐｉｌｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５を参照し；制限酵素は、製造元によって推奨される条件に従って使用した。当業者は、実施例は、一例として本願を説明するものであり、本願が保護しようとする範囲を限定することを意図するものではないことを知っている。

実施例１
ｈＧＦおよびその変異体の調製
天然ｈＨＧＦのアミノ酸配列（配列番号１）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０００５９２．３に見出すことができた。テンプレートとして配列番号１を使用して、以下の３つのｈＨＧＦ変異体を設計した：
（１）ｈＨＧＦ変異体１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、これは、配列番号１の位置１３０のＳｅｒをＡｒｇに変異させることによって得られ、そのアミノ酸配列は、配列番号２に示した；
（２）ｈＨＧＦ変異体１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、これは、配列番号１の位置１３０のＳｅｒをＨｉｓに変異させることによって得られ、そのアミノ酸配列は、配列番号３に示した；
（２）ｈＨＧＦ変異体１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ、これは、配列番号１の位置１３０のＳｅｒをＬｙｓに変異させることによって得られ、そのアミノ酸配列は、配列番号４に示した。

天然ｈＨＧＦ（配列番号１）および上記の３つのｈＨＧＦ変異体（配列番号２、配列番号３、配列番号４）をそれぞれコードするポリヌクレオチドを得るために、完全遺伝子合成を実施し、天然ｈＨＧＦおよび様々な変異体をコードする核酸分子を得るために、制限酵素切断部位および開始コドンをそれらの５’末端に導入し、制限酵素切断部位および終止コドンをそれらの３’末端に導入した。

上記において説明したように調製した核酸分子を、発現ベクターへとクローニングし、それぞれ、ＣＨＯ宿主細胞に形質転換させた。外来タンパク質の発現を可能にする条件下において、当該形質転換されたＣＨＯ宿主細胞を培養し、次いで、当該培養物を収集し、遠心分離処理することにより、標的タンパク質（天然ｈＨＧＦ、１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、または１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）を含有する上清を得た。製造元の取扱説明書に従って、陰イオン交換クロマトグラフィ媒体（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－０７０９－１０）を使用して、当該上清中の標的タンパク質を分離し、ヘパリン親和性クロマトグラフィ媒体（Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－０９９８－０１）を使用して、当該標的タンパク質をさらに精製した。

精製した標的タンパク質を、非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ、第４版）によって検出し、その結果を図１に示した。図１に示されるように、得られた４つの精製された標的タンパク質（天然ｈＨＧＦ、１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦおよび１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）は全て、９８％超の純度を有しており、継続調査に使用することができた。

実施例２
ｈＨＧＦおよびその変異体をコードする組換えプラスミドの調製
天然ｈＨＧＦ（配列番号１）および上記の３つのｈＨＧＦ変異体（配列番号２、配列番号３、配列番号４）をそれぞれコードするポリヌクレオチドを得るために、完全遺伝子合成を実施し、それらは、それぞれ、配列番号５～８に示されるヌクレオチド配列を有した。上記のように調製したポリヌクレオチド分子を、それぞれ、ｐＳＮベクターへとクローニグし（例えば、中国公告特許第１０８６１１３６７（Ｂ）号を参照されたく；そのヌクレオチド配列は、配列番号９に示した）、次いで、大腸菌に形質転換した。スクリーニングおよび配列決定検証の後、標的の組換えプラスミドを含む操作された菌株を得た。構築された操作された菌株を発酵させ、プラスミドを抽出することにより、標的組換えプラスミドを含む原液を得た。当該標的組換えプラスミドは、詳細には、以下の通りである：
（１）ｐＳＮ－ｈＨＧＦ、これは、天然ｈＨＧＦ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を有する；
（２）ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、これは、１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を有する；
（３）ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、これは、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ（配列番号３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）を有する；および
（４）ｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ、これは、１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）を有する。

調製した原液中のプラスミドの含有量を、紫外線分光光度計を使用することによって特定した。結果は、調製した様々な原液中のプラスミドの含有量が、２．０ｍｇ／ｍＬから２．２ｍｇ／ｍＬの範囲であることを示した。詳細には、４つの原液中の組換えプラスミドの含有量は、それぞれ、２．１２ｍｇ／ｍＬ（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ）、２．０５ｍｇ／ｍＬ（ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ）、２．１５ｍｇ／ｍＬ（ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ）、および２．１０ｍｇ／ｍＬ（ｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）であった。

標的組換えプラスミドを含有する原液を取り、注射用水で約３０μｇ／ｍｌのプラスミド濃度まで希釈し、次いで、ＨＰＬＣによって純度検出を行った。使用した検出条件は下記の通りであった。

使用したクロマトグラフィカラムは、陰イオン交換ＨＰＬＣ分析カラムＤＮＡ－ＮＰＲであり、これを、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８緩衝液によって平衡化した。平衡化後、試料をロードして検出した。ロード量は１００μｌであり、流量は０．５ｍｌ／分であり、検出波長は２６０ｎｍであった。試料をロードした後、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８の緩衝液を使用して平衡化を実施し（５分）、次いで、以下の条件：（１）１００％の溶液Ａ（溶液Ａは、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８であった）から１００％の溶液Ｂ（溶液Ｂは、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．８ＭのＮａＣｌであった）へと直線的に移行させることによって（溶離は３０分間実行した）、ならびに（２）次いで、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．８ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．８の緩衝液を使用することによって（溶離は５分間実行した）、直線勾配溶離を行った。結果は、調製した原液の様々な試料において、全てのプラスミドが、９５％超のＨＰＬＣ純度を有することを示していた。詳細には、４つの原液の組換えプラスミドのＨＰＬＣ純度の値は、それぞれ、９７．５％（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ）、９８．２％（ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ）、９８．０％（ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ）、９７．８％（ｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）であった。

実施例３
ｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦのインビトロ生物活性の評価
この実施例において、ｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦのインビトロ生物活性を評価するために、インビトロ内皮細胞移動実験を使用して、内皮細胞移動に対するｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦの効果を評価した。

１．材料および方法
１．１タンパク質試料
上記のように調製したｈＨＧＦ変異体（１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、および１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）および天然ｈＨＧＦを、使用前に、生理食塩水によって、必要な濃度を有するように製剤化した。

１．２細胞株
ＥＣＶ３０４細胞株（臍帯静脈内皮細胞）を使用して、ＨＧＦの生物活性を試験した。
１．３試薬
ＤＭＥＭ培地：Ｈｙｃｌｏｎｅによって提供された。調製方法は以下の通りであった：１袋のＤＭＥＭ培地粉末（仕様は１Ｌであった）を取り、水を加えて溶解させ、１０００ｍｌに希釈し、次いで、２．１ｇの重炭酸ナトリウムを加えた。次いで、調製した培地を滅菌し、ろ過し、４℃で貯蔵した。

完全培地：１００ｍｌのウシ胎仔血清を取り、１０００ｍｌまでＤＭＥＭ培地を加えた。
トランスウエル：Ｃｏｓｔａｒによって提供された。

１．４器具
ニ酸化炭素細胞インキュベータ：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｏｘｕｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．の医療機器工場によって提供された。モデル：ＨＨ．ＣＰ。

倒立顕微鏡：Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供された。モデル：ＸＤＳ－１Ｂ。
超清浄作業台：Ｓｕｚｈｏｕ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって提供された。モデル：ＳＷ－ＣＪ－１Ｆ。

ベンチトップ細胞洗浄遠心分離機：Ｈｕｎａｎ Ｘｉｎｇｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって提供された。モデル：ＴＤＬ－５０Ｂ。

光学顕微鏡：Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供された。モデル：ＢＰ１０４。
１．５実験方法
「インビトロＨＧＦ活性検出試験」（多形核白血球に対する抗体および抗原の混合物の走化性効果。 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６２，１１５：４５３～４６６）の方法に従って、細胞移動試験を実施した。簡潔には、６００μｌのＤＭＥＭ培地を移動プレートの下部タンクの各ウェルに加え、そこにトランスウェルを沈めるようにした。１ｍｌあたり１×１０^６個の細胞を含有する細胞懸濁液を形成するために、１０％のウシ胎仔血清を含有する１６４０培地を用いて、０．１％のトリプシンで消化したＥＣＶ３０４細胞を調製した。各ウェルに２００μｌの細胞懸濁液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、移動プレートの下部タンクの元のＤＭＥＭ培地を、２μｇの天然ｈＨＧＦまたはｈＨＧＦ変異体を含有する６００μｌの培地に取り換え、インキュベーションを２時間続けた。インキュベーション後、トランスウェルを、２０％のパラホルムアルデヒドの入った別のウェルに移し、細胞を１０分間かけて固定した。膜上の移動していない細胞を綿棒を使用いてそっと拭き取り、次いで、クリスタルバイオレットによって５分間かけて染色した。手術用メスの刃を使用して当該膜を慎重に除去し、ガラススライド上に置き（細胞のある側を上に向けた）、光学顕微鏡で観察した。さらに、天然ｈＨＧＦまたはｈＨＧＦ変異体を使用しなかったブランクコントロールも提供する。

この試験において、試験されるタンパク質（天然ｈＨＧＦまたはｈＨＧＦ変異体）の生物活性を評価するために、移動細胞の数の計測を使用した。光学顕微鏡によって細胞移動を定量的に評価する方法は以下の通りであった：最初に、低出力（４×の対物レンズ）の光学顕微鏡の下で、細胞が均一に分布したエリアを選択し、次いで、接眼レンズに取り付けられたグリッドを伴う中出力（２０×の対物レンズ）顕微鏡を使用して、５つの視野を無作為に連続して選択し、移動細胞の数の計測を行った。測定結果を、統計的ｔ検定法によって分析および評価した。

１．６統計解析
データは、平均±標準偏差（

）として表現した。統計分析のために、ＳＰＳＳ１６．０統計ソフトウェアを使用して、多変量要因計画データに対する分散分析を使用した。
２．実験結果
上記において説明されるように、インビトロ試験において、ｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦによる内皮細胞移動試験を実施することによって、内皮細胞移動に対するｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦの効果を評価した。実験結果を表１に示した。

表１に示されるように、ブランクコントロールのウェルにおいて、わずかな内皮細胞が、移動膜を通過したが、ｈＨＧＦ変異体または天然ｈＨＧＦを含有する試験ウェルでは、移動細胞の数は著しく増加した。ブランクコントロールのウェルと比較して、有意差があった（天然ｈＨＧＦを含有する試験ウェル：ｐ＜０．０５；ｈＨＧＦ変異体を含有する試験ウェル：ｐ＜０．０１）。その上、ｈＨＧＦ変異体を含有する試験ウェルでは、移動細胞の数は、天然ｈＨＧＦを含有する試験ウェルよりも著しく多かった（ｐ＜０．０１）。これらの結果は、ｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦの両方が、内皮細胞の移動を誘導／刺激することができること、ならびに当該ｈＨＧＦ変異体は、天然ｈＨＧＦと比較して、内皮細胞移動を誘導するより強力な能力を有することを示していた。本願の３つのｈＨＧＦ変異体（１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、および１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）は、細胞移動をより良好に促進することができた。

実施例４
ウサギ下肢動脈虚血モデルに対するｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦの治療効果の評価
この実施例において、ウサギ下肢動脈虚血モデルを使用して、ウサギ下肢動脈虚血モデルにおける血管および副行循環の再形成に対するｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦの効果を評価し、それにより、ｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦの治療効果を評価した。

１．材料および方法
１．１タンパク質試料
上記のように調製したｈＨＧＦ変異体（１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、および１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）および天然ｈＨＧＦを、使用前に、生理食塩水によって、必要な濃度を有するように製剤化した。

１．２動物モデル
Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｃｏｍｐａｎｙによって提供されたニュージーランド雄白ウサギ、１２～１４月齢、体重３．５ｋｇから４．０ｋｇ。Ｔａｋｅｓｈｉｔａら（治療的血管形成。血管内皮増殖因子の単一動脈内ボーラスは、ウサギ虚血後脚モデルにおける脈管再生を増大させる。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９４，９３：６６２～６７０）によって記載された方法に従って、当該ウサギ下肢動脈虚血モデルを確立した。５ｍｇ／ｋｇの用量のキシラジンの筋肉注射の後、当該ウサギを５０ ｍｇ／ｋｇの用量のケタミンによって麻酔した。左大腿の真皮をアルコールおよびヨウ素で消毒した。無菌状態下において、左側の鼠蹊部の中間点から膝関節までの大腿の皮膚を切断し、筋膜を切断し、筋肉を切り離して大腿動脈を完全に露出させ、その本幹および分岐部を結紮した。大腿動脈の根元から膝窩動脈までの動脈と大伏在動脈の分岐部における動脈とを切除した。出血のないことを確認した後、筋膜と皮膚を縫合した。手術後、感染を防ぐために、ゲンタマイシン（３ｍｇ／ｋｇ／日）の持続筋肉注射を３日間行い、痛覚消失のために、モルフィン（０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の筋肉注射を１０日間行った。手術の１０日後に、右の頸動脈に動脈カニューレを挿入し、左内腸骨動脈の入り口に３Ｆカテーテル（Ｔｅｒｕｍｏ、日本）を挿入し、５ｍｌの造影剤を１ｍｌ／秒の速度において注入し、病気動物モデルの確立を確認するために、選択的内腸骨血管造影を実施した。

１．３動物の群分け
動物モデルの確立から１０日後に、当該動物を無作為に、モデルコントロール群（６）、ｈＨＧＦ試験群（８）、１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ試験群（８）、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ試験群（８）、および１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ試験群（８）に分けた。

１．４投与方法
それぞれの動物の左太股の内側の虚血部位の４箇所（閉介筋に対する１箇所、および半膜様筋に対する３箇所）を取り、１日１回、筋肉注射によって各箇所に２５０μｇ／２５０μｌの試験薬を投与した（すなわち、１ｍｇ／１ｍｌの試験薬を動物あたり１回投与した）。モデルコントロール群には、同量の生理食塩水を与えた。投与は、１５日間継続し、すなわち、合計１５回投与した。

１．５選択的内腸骨血管造影による血管の形成に対する薬物の効果の評価
下肢動脈虚血モデル動物の副行循環は、内腸骨動脈の分岐部が元であるため、投与の前後の副行循環の形成を観察するために、手術の１０日後および４０日後（最初の投与から３０日後）に、選択的内腸骨血管造影を実施した。３Ｆカテーテル（Ｔｅｒｕｍｏ、日本）を右頚動脈に挿入し、腹大動脈を通過させ、左内腸骨動脈の入口に置いた。合計で５ｍｌの造影剤を１ｍｌ／秒の速度で注入し、シネフイルム写真撮影を行った。４番目の二次血管造影図に関して、大腿骨を４つの部分に分割する大腿骨に垂直な３つの直線を大腿骨に描き、当該直線と交差する血管の数をカウントし、当該カウントを３回繰り返して、その平均を取った。

１．６毛細血管密度の組織学的特定
手術の４０日後に、下肢の虚血筋組織（閉介筋および半膜様筋）を採取し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．、エルクハート、米国）溶液に入れ、液化窒素で急速に冷凍し、次いで、当該組織を、凍結させて薄片にした。インドキシル－テトラゾリウム法により、毛細血管内皮細胞をアルカリ性ホスファターゼで染色した。顕微鏡下において（２００×）、当該組織における毛細血管内皮細胞の数を計測し、次いで、それを、毛細血管の密度を定量化するために１，０００筋肉細胞あたりの毛細血管数に変換した。

１．７統計解析
データは、平均±標準偏差（

）として表現した。ＳＰＳＳ１６．０統計ソフトウェアを使用することにより、多重因子要因計画データ（ｍｕｌｔｉ－ｆａｃｔｏｒ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｄａｔａ）に対する分散分析を使用して統計分析を実施した。

２．実験結果
実験動物の各群の投与の前後での虚血部位の側副脈管の数および虚血部位の新しい側副脈管の数の検出結果を表２に示した。

表２に示されるように、投与前の各群の実験動物の側副脈管の数には、（５つの群の間において）有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。投与後、モデルコントロール群の側副脈管の数は、投与前とは統計的に異ならず（ｐ＞０．０５）、４つの試験群の側副脈管の数は、投与前より著しく増加した。群の間で比較した場合、３つのｈＨＧＦ変異体試験群の脈管の増分は全て、ｈＨＧＦ試験群より著しく大きかった（（ｐ＜０．０５）。

表２の実験結果は、３つのｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦは、下肢動脈虚血に対して良好な治療効果を有することを示していた。モデルコントロール群と比較した場合、血管造影によって示されるように、各試験群は、側副脈管の形成を著しく促進することができた。投与の３０日後（投与の最初の日から計算して）、実験群のウサギの左後脚の小動脈の密度は、モデルコントロール群より著しく高かった。その上、３つのｈＨＧＦ変異体の治療結果は、天然ｈＨＧＦ試験群とは著しく異なっており、当該ｈＨＧＦ変異体を受けたウサギの左後脚小動脈の密度は、天然ｈＨＧＦを受けたウサギよりも高く、１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ試験群（ｐ＜０．０１）、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ試験群（ｐ＜０．０５）、および１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ試験群（ｐ＜０．０１）は、側副脈管の形成の促進において、天然ｈＨＧＦ試験群よりも著しく良好であった。これらの結果は、本願の３つのｈＨＧＦ変異体は、下肢動脈虚血の治療において天然ｈＨＧＦよりも予想外に優れていることを示していた。

実施例５
ウサギ下肢動脈虚血モデルに対するｈＨＧＦまたはその変異体をコードする組換えプラスミドの治療効果の評価
この実施例において、ｈＨＧＦまたはその変異体をコードする組換えプラスミドの治療効果を評価するために、ウサギ下肢動脈虚血モデルを使用して、側副脈管の形成の促進におけるｈＨＧＦまたはその変異体をコードする組換えプラスミドの効果を評価した。

１．材料および方法
１．１プラスミド試料
上記のように調製した４つの組換えプラスミド（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）を、使用前に生理食塩水によって、必要な濃度を有するように製剤化した。

１．２動物モデル
Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｃｏｍｐａｎｙによって提供されたニュージーランド雄白ウサギ、１２～１４月齢、体重３．５ｋｇから４．０ｋｇ。Ｔａｋｅｓｈｉｔａら（治療的血管形成。血管内皮増殖因子の単一動脈内ボーラスは、ウサギ虚血後脚モデルにおける脈管再生を増大させる。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９４，９３：６６２～６７０）によって説明される方法に従って、当該ウサギ下肢動脈虚血モデルを確立した。５ｍｇ／ｋｇの用量のキシラジンの筋肉注射の後、当該ウサギを５０ ｍｇ／ｋｇの用量のケタミンによって麻酔した。左大腿の真皮をアルコールおよびヨウ素で消毒した。無菌状態下において、左側の鼠蹊部の中間点から膝関節までの大腿の皮膚を切断し、筋膜を切断し、筋肉を切り離して大腿動脈を完全に露出させ、その本幹および枝部を結紮し、大腿動脈の根元から膝窩動脈までの動脈と大伏在動脈の分岐における動脈とを切除した。出血のないことを確認した後、筋膜と皮膚を縫合した。手術後、感染を防ぐために、ゲンタマイシン（３ｍｇ／ｋｇ／日）の持続筋肉注射を３日間行い、痛覚消失のために、モルフィン（０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の筋肉注射を１０日間行った。手術から１０日後に、右の頸動脈に動脈カニューレを挿入し、左内腸骨動脈の入り口に３Ｆカテーテル（Ｔｅｒｕｍｏ、日本）を挿入し、５ｍｌの造影剤を１ｍｌ／秒の速度において注入し、病気動物モデルの確立を確認するために、選択的内腸骨血管造影を実施した。

１．３動物群分け
動物モデルの確立から１０日後に、当該動物を無作為に、モデルコントロール群（８）、ｐＳＮ－ｈＨＧＦ試験群（８）、ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ試験群（８）、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ試験群（８）、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ試験群（８）に分けた。

１．４投与方法
それぞれの動物の左太股の内側の虚血部位の４箇所（閉介筋に対する１箇所、および半膜様筋に対する３箇所）を取り、合計１回の投与に対して、筋肉注射によって各箇所に２５０μｇ／２５０μｌの試験薬を投与した（すなわち、１ｍｇ／１ｍｌの試験薬を動物あたり１回投与した）。モデルコントロール群には、同量の生理食塩水を与えた。

１．５選択的内腸骨血管造影による血管の形成に対する薬物の効果の評価
下肢動脈虚血モデル動物の副行循環は、内腸骨動脈の分岐部が元であるため、投与の前後の副行循環の形成を観察するために、手術の１０日後および４０日後（最初の投与から３０日後）に、選択的内腸骨血管造影を実施した。３Ｆカテーテル（Ｔｅｒｕｍｏ、日本）を右頚動脈に挿入し、腹大動脈を通過させ、左内腸骨動脈の入口に置いた。合計で５ｍｌの造影剤を１ｍｌ／秒の速度で注入し、シネフイルム写真撮影を行った。４番目の二次血管造影図に関して、大腿骨を４つの部分に分割する大腿骨に垂直な３つの直線を大腿骨に描き、当該直線と交差する血管の数を計数し、当該計数を３回繰り返して、その平均を取った。

１．６統計解析
データは、平均±標準偏差（

）として表現した。ＳＰＳＳ１６．０統計ソフトウェアを使用することにより、多重因子要因計画データに対する分散分析を使用して統計分析を実施した。
２．実験結果
実験動物の各群の投与の前後での虚血部位の側副脈管の数および虚血部位の新しい側副脈管の数の検出結果を表３に示した。

表３に示されるように、投与前の各群の実験動物の側副脈管の数において、（５つの群の間において）有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。投与後、モデルコントロール群の側副脈管の数は、投与前とは統計的に異ならず（ｐ＞０．０５）；４つの試験群の側副脈管の数は、投与前より著しく増加した。群の間で比較した場合、ｈＨＧＦ変異体をコードする組換えプラスミドの３つの試験群（ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）の脈管の増分は全て、天然ｈＨＧＦをコードする組換えプラスミド（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ）の試験群よりも著しく多かった（ｐ＜０．０１）。

表３の実験結果は、ｈＨＧＦおよびその変異体をコードする組換えプラスミドは全て、下肢動脈虚血に対して良好な治療効果を有することを示していた。モデルコントロール群と比較した場合、各試験群は、側副脈管の形成を著しく促進することができた。その上、表３の実験結果は、ｈＨＧＦ変異体をコードする３つの組換えプラスミドの治療効果は、天然ｈＨＧＦをコードする組換えプラスミドとは著しく異なっており、すなわち、ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ試験群（ｐ＜０．０１）、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ試験群（ｐ＜０．０１）、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ試験群（ｐ＜０．０１）は全て、側副脈管の形成の促進において ｐＳＮ－ｈＨＧＦ試験群よりも著しく良好であった。これらの結果は、ｈＨＧＦ変異体をコードする３つの組換えプラスミド（ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）は、下肢動脈虚血に対する治療効果の面において天然ｈＨＧＦをコードする組換えプラスミド（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ）よりも予想外に優れていることを示していた。

実施例６
ラット糖尿病性末梢性ニューロパシーモデルに対するｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦの治療効果の評価
この実施例では、ラット糖尿病性末梢性ニューロパシーモデルを使用して、糖尿病性末梢性ニューロパシーの治療におけるｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦの効果を評価した。

１．材料および方法
１．１タンパク質試料
上記のように調製したｈＨＧＦ変異体（１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、および１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）および天然ｈＨＧＦを、使用前に生理食塩水によって、必要な濃度を有するように製剤化した。

１．２器具
ＯＮＥ－ＴＯＵＣＨ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｉｍｐｌｅ血糖メーター：Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎによって提供される；
Ｎｅｕｒｏｍａｔｉｃ－２０００筋電図検査装置：Ｄａｎｄｉによって提供される；
ＥＧ１１６０パラフィン包埋機：Ｌｅｉｃａ（ドイツ）によって提供される；
ＲＭ２２５５スライサー：Ｌｅｉｃａ（ドイツ）によって提供される；
ＤＭ６０００Ｂ光学顕微鏡：Ｌｅｉｃａ（ドイツ）によって提供される。

１．３動物モデル
ウィスターラット（ＳＰＦグレード、雄、体重１８０～２００ｇ、２．５～３カ月齢）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｃｏｍｐａｎｙから提供された。当該ラットを連れ帰った後、それらに５日間、適応的に給餌し；当該動物が良好な状態であることを確認した。１０匹のラットを無作為に正常コントロール群として選択し、残りの６０匹を以下のようにモデル化した。当該ラットを、水を与えながら、１２時間絶食させ、次いで、体重を測り、血糖を特定するために測定し、付番した。事前に調製した０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）に、氷浴環境においてストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を加えることにより、２％のＳＴＺ溶液を調製した。６５ｍｇ／ｋｇの用量での左側への腹腔内注射によって、当該モデル化した動物に対してＳＴＺを一度に投与し：正常コントロール群の動物には、左腹腔内注射によって同じ用量の同じ緩衝液を投与した。７２時間後、当該ラットの血糖値を測定した。血糖＞１６．７ｍｍｏｌ／Ｌおよび＋＋＋から＋＋＋＋の尿糖を有する合計５２匹のラットをモデル動物として選択した。１０週間の給餌の後、糖尿病性末梢性ニューロパシーを有するモデルラットを得た。

１．４動物の群分け
当該５２匹のモデルラットを無作為に、モデルコントロール群（１０匹）、ｈＨＧＦ試験群（１０匹）、１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ試験群（１０匹）、１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ試験群（１１匹）、１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ試験群（１１匹のみ）に分けた。

１．５投与方法
１０週間の好結果のモデル化の後に、試験群の動物に薬物を投与し始めた。各動物の左太股の内側の４箇所（閉介筋に対する１箇所および半膜様筋に対する３箇所）を用いて、１日あたり１回投与において、筋肉注射によって２５０μｇ／２５０μｌの試験薬を各箇所に投与した（すなわち、合計１ｍｇ／１ｍｌの試験薬を各動物に１回で投与した）。モデル群には、同量の生理食塩水を２０日間にわたり合計で２０回注射において与えた。

１．６運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）および感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）の測定
当該測定は、最初の投与から１０週間後に実施した。当該ラットを麻酔した後、左坐骨神経を外科的に分離し、当該ラットのＭＮＣＶおよびＳＮＣＶをＮｅｕｒｏｍａｔｉｃ－２０００筋電図検査装置によって測定した。ＭＮＣＶ測定方法は以下の通りであった：記録用電極を前脛骨筋の腹部の中央へ垂直に刺し込み、刺激用電極を使用して、２０ｍＡの刺激電流で坐骨神経の近位末端を刺激し、筋電図記録装置によってオシロスコープに活動電位を表示させ記録し、次いで、当該２つの電極の間の距離に従ってＭＮＣＶを計算した。ＳＮＣＶ測定方法は以下の通りであった：記録用電極を坐骨神経の近位末端に取り付け、刺激用電極を使用して、３０ｍＡの刺激電流で腓腹神経の近位末端を刺激し、筋電図記録機器によって、得られた波形を記録し、次いで、当該２つの電極の間の距離に従ってＳＮＣＶを計算した。

１．７腓腹神経の有髄神経線維の定量分析
当該測定は、最初の投与から１０週間後に実施した。右腓腹神経の遠位末端を３％グルタルアルデヒド／０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に固定し、４℃で一晩維持し；ＰＢＳ緩衝液で濯ぎ、１％のオスミウム酸で固定し、次いで濯ぎ、脱水し、エポキシ樹脂に埋め込んだ。１μｍの半薄断面切片を調製し、１％トルイジンブルー溶液で３０分間染色し、次いで、８５％アルコールで洗浄して、背景がライトブルーになるまで脱色し、次いで、スライドガラスをゴムによって取り付けた。腓腹神経の断面の画像を２００倍の倍率において収集し、多機能トゥルーカラー病理学画像分析システムによって有髄神経線維をカウントし、腓腹神経の病理学的変化を観察するために、腓腹神経線維の総断面積、神経線維密度、および神経線維の平均断面積を測定した。

１．８統計的処理
データは、平均±標準偏差（

）として表現した。ＳＰＳＳ１６．０統計ソフトウェアを使用することにより、多重因子要因計画データに対する分散分析を使用して統計分析を実施した。
２．実験結果
２．１各群の実験動物のＭＮＣＶおよびＳＮＣＶの測定
表４は、各群の実験動物のＭＮＣＶおよびＳＮＣＶの測定結果を示している。

表４に示されるように、最初の投与から１０週間後において、モデルコントロール群のＭＮＣＶおよびＳＮＣＶは最も低く（正常コントロール群より著しく遅い、＜ｐ０．０１）、ｈＨＧＦ試験群がそれに続いた（正常コントロール群より著しく遅い、＜ｐ０．０５）。ｈＨＧＦ変異体群のＭＮＣＶおよびＳＮＣＶは、正常コントロール群よりわずかに低かったが、差は、統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果は、天然ｈＨＧＦおよびｈＨＧＦ変異体は、糖尿病性末梢性ニューロパシーの修復を促進することができ、損傷したＭＮＣＶおよびＳＮＣＶを回復することができること、ならびにｈＨＧＦ変異体の治療効果は、天然ｈＨＧＦより良好であることを示していた。

２．２腓腹神経の有髄神経線維の定量分析
各群における実験動物の腓腹神経の有髄神経線維の定量分析の結果を表５に示した。

表５に示されるように、最初の投与から１０週間後において、正常コントロール群と比較して、モデルコントロール群の総神経断面積および平均神経線維面積は著しく減少し、有意な差があり（ｐ＜０．０１）；ｈＨＧＦ試験群における動物の総神経断面積および平均神経線維面積も著しく減少したが（ｐ＜０．０５）、減少の程度は低下しており；ｈＨＧＦ変異体試験群における動物の総神経断面積および平均神経線維面積は、明確な減少を示さず、有意な差はなかった。その上、ｈＨＧＦ試験群と比較して、ｈＨＧＦ変異体試験群の総神経断面積および平均神経線維面積は著しく増加した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、天然ｈＨＧＦおよびｈＨＧＦ変異体は、糖尿病性末梢性ニューロパシーの修復を促進することができ、腓腹神経の有髄神経線維の総断面積および神経線維の平均面積を回復することができること、ならびにｈＨＧＦ変異体の治療効果は、天然ｈＨＧＦより良好であることを示していた。

表４～５の実験結果は、ｈＨＧＦ変異体および天然ｈＨＧＦは両方とも、糖尿病性末梢性ニューロパシーに対して良好な治療効果を有し、糖尿病ラットにおいてＭＮＣＶおよびＳＮＣＶを著しく増加させることができ、糖尿病ラットの腓腹神経線維の総断面積および神経線維の平均面積を著しく改善させることができることを示していた。さらに、当該３つのｈＨＧＦ変異体の治療結果は、天然ｈＨＧＦ試験群より著しく良好であった。本願の３つのｈＨＧＦ変異体は、ラットにおける糖尿病性末梢性ニューロパシーの治療において天然ｈＨＧＦよりも予想外に優れていた。

実施例７
ラット糖尿病性末梢性ニューロパシーモデルに対するｈＨＧＦまたはその変異体をコードする組換えプラスミドの治療効果の評価
この実施例では、ネズミ糖尿病性末梢性ニューロパシーモデルを使用して、糖尿病性末梢性ニューロパシーに対するｈＨＧＦまたはその変異体をコードする組換えプラスミドの効果を評価した。

１．材料および方法
１．１プラスミド試料
上記のように調製した４つの組換えプラスミド（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）を、使用前に生理食塩水によって、必要な濃度を有するように製剤化した。

１．２器具
ＯＮＥ－ＴＯＵＣＨ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｉｍｐｌｅ血糖メーター：Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎによって提供される；
Ｎｅｕｒｏｍａｔｉｃ－２０００筋電図検査装置：Ｄａｎｄｉによって提供される；
ＥＧ１１６０パラフィン包埋機：Ｌｅｉｃａ（ドイツ）によって提供される；
ＲＭ２２５５スライサー：Ｌｅｉｃａ（ドイツ）によって提供される；
ＤＭ６０００Ｂ光学顕微鏡：Ｌｅｉｃａ（ドイツ）によって提供される。

１．３動物モデル
ウィスターラット（ＳＰＦグレード、雄、体重１８０～２００ｇ、２．５～３カ月齢）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｃｏｍｐａｎｙから提供された。当該ラットを連れ帰った後、それらに５日間、適応的に給餌し；当該動物が良好な状態であることを確認した。１０匹のラットを無作為に正常なコントロール群として選択し、残りの６０匹を以下のようにモデル化した。当該ラットを、水を与えながら、１２時間絶食させ、次いで、体重を測り、血糖を特定するために測定し、付番した。事前に調製した０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）に、氷浴環境においてストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を加えることにより、２％のＳＴＺ溶液を調製した。６５ｍｇ／ｋｇの用量での左側への腹腔内注射によって、当該モデル化した動物に対してＳＴＺを一度に投与し；正常なコントロール群の動物には、左腹腔内注射によって同じ用量の同じ緩衝液を投与した。７２時間後、当該ラットの血糖値を測定した。血糖＞１６．７ｍｍｏｌ／Ｌおよび＋＋＋から＋＋＋＋の尿糖を有する合計５２匹のラットをモデル動物として選択した。１０週間の給餌後、糖尿病性末梢性ニューロパシーを有するモデルラットを得た。

１．４動物の組分け
当該５２匹のモデルラットを無作為に、モデルコントロール群（１０匹）、ｐＳＮ－ｈＨＧＦ試験群（１０匹）、ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ試験群（１０匹）、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ試験群（１１匹）、ＰＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ 試験群（１１匹の動物）に分けた。

１．５投与方法
１０週間の好結果のモデル化の後に、試験群の動物に薬物を投与し始めた。各動物の左太股の内側の４箇所（閉介筋に対する１箇所および半膜様筋に対する３箇所）を用いて、１回投与の合計において、筋肉注射によって各箇所に２５０μｇ／２５０μｌの試験薬を投与した（すなわち、合計１ｍｇ／１ｍｌの試験薬を各動物に１回で投与した）。モデル群には、同量の生理食塩水を与えた。

１．６運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）および感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）の測定
測定は、投与の１０週間後に実施した。当該ラットを麻酔した後、左坐骨神経を外科的に分離し、当該ラットのＭＮＣＶおよびＳＮＣＶをＮｅｕｒｏｍａｔｉｃ－２０００筋電図検査装置によって測定した。ＭＮＣＶ測定方法は以下の通りであった：記録用電極を前脛骨筋の腹部の中央へ垂直に刺し込み、刺激用電極を使用して、２０ｍＡの刺激電流で坐骨神経の近位末端を刺激し、筋電図記録装置によってオシロスコープに活動電位を表示させ記録し、次いで、当該２つの電極の間の距離に従ってＭＮＣＶを計算した。ＳＮＣＶ測定方法は以下の通りであった：記録用電極を坐骨神経の近位末端に取り付け、刺激用電極を使用して、３０ｍＡの刺激電流で腓腹神経の近位末端を刺激し、筋電図記録機器によって、得られた波形を記録し、次いで、当該２つの電極の間の距離に従ってＳＮＣＶを計算した。

１．７腓腹神経の有髄神経線維の定量分析
当該測定は、投与の１０週間後に実施した。右腓腹神経の遠位末端を３％グルタルアルデヒド／０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に固定し、４℃で一晩維持し；ＰＢＳ緩衝液で濯ぎ、１％のオスミウム酸で固定し、次いで濯ぎ、脱水し、エポキシ樹脂に埋め込んだ。１μｍの半薄断面切片を調製し、１％トルイジンブルー溶液で３０分間染色し、次いで、８５％アルコールで洗浄して、背景がライトブルーになるまで脱色し、次いで、スライドガラスをゴムによって取り付けた。腓腹神経の断面の画像を２００倍の倍率において収集し、多機能トゥルーカラー病理学画像分析システムによって有髄神経線維をカウントし、腓腹神経の病理学的変化を観察するために、腓腹神経線維の総断面積、神経線維密度、および神経線維の平均断面積を測定した。

１．８統計的処理
データは、平均±標準偏差（

）として表現した。ＳＰＳＳ１６．０統計ソフトウェアを使用することにより、多重因子要因計画データに対する分散分析を使用して統計分析を実施した。
２．実験結果
２．１各群における実験動物のＭＮＣＶおよびＳＮＣＶの測定
表６は、各群の実験動物のＭＮＣＶおよびＳＮＣＶの測定結果を示している。

表６に示されるように、投与から１０週間後において、モデルコントロール群のＭＮＣＶおよびＳＮＣＶは最も低く（正常コントロール群より著しく遅い、＜ｐ０．０１）、ｐＳＮ－ｈＨＧＦ試験群がそれに続いた（正常コントロール群より著しく遅い、＜ｐ０．０５）。ｈＨＧＦ変異体をコードする組換えプラスミドの試験群のＭＮＣＶおよびＳＮＣＶは、正常コントロール群よりわずかに低かったが、差は、統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果は、天然ｈＨＧＦおよびその変異体をコードする組換えプラスミドは、糖尿病性末梢性ニューロパシーの修復を促進することができ、損傷したＭＮＣＶおよびＳＮＣＶを回復することができること、ならびにｈＨＧＦ変異体をコードする組換えプラスミド（ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）の治療効果は、天然ｈＨＧＦをコードする組換えプラスミド（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ）よりも良好であることを示していた。

（２）腓腹神経の有髄神経線維の定量分析
各群の実験動物の腓腹神経の有髄神経線維の定量分析の結果を表７に示した。

表７に示されるように、投与から１０週間後において、正常コントロール群と比較して、モデルコントロール群の総神経断面積および平均神経線維面積は著しく減少し、有意な差があり（ｐ＜０．０１）；ｐＳＮ－ｈＨＧＦ試験群の動物の総神経断面積および平均神経線維面積も著しく減少したが（ｐ＜０．０５）、減少の程度は少なく；ｈＨＧＦ変異体をコードする組換えプラスミドの試験群の動物の総神経断面積および平均神経線維面積は、不明確な減少を示し、有意な差はなかった。その上、ｐＳＮ－ｈＨＧＦ試験群と比較して、ｈＨＧＦ変異体をコードする組換えプラスミドの試験群の動物の総神経断面積および平均神経線維面積は著しく減少した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、天然ｈＨＧＦおよびその変異体をコードする組換えプラスミドは、糖尿病性末梢性ニューロパシーの修復を促進することができ、腓腹神経の有髄神経線維の総断面積および神経線維の平均面積を回復することができること、ならびにｈＨＧＦ変異体をコードする３つの組換えプラスミド（ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）の治療効果は、天然ｈＨＧＦをコードする組換えプラスミド（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ）よりも良好であることを示していた。

表６～７の実験結果は、ｈＨＧＦ変異体をコードする組換えプラスミドおよび天然ｈＨＧＦをコードする組換えプラスミドは、糖尿病性末梢性ニューロパシーに対して良好な治療効果を有し、糖尿病ラットにおいてＭＮＣＶおよびＳＮＣＶを著しく増加させることができ、糖尿病ラットの腓腹神経線維の総断面積および神経線維の平均面積を著しく改善させることができることを示していた。さらに、ｈＨＧＦ変異体をコードする３つの組換えプラスミド（ｐＳＮ－１３０Ａｒｇ－ｈＨＧＦ、ｐＳＮ－１３０Ｈｉｓ－ｈＨＧＦ、およびｐＳＮ－１３０Ｌｙｓ－ｈＨＧＦ）の治療結果は、天然ｈＨＧＦをコードする組換えプラスミド（ｐＳＮ－ｈＨＧＦ）よりも著しく良好であった。

３．結論
実施例３、４、および６の結果は、本願のｈＨＧＦ変異体は、臍帯静脈内皮細胞の移動を促進することに関して、天然ｈＨＧＦよりも著しく高い活性を有し、それにより下肢小動脈の成長を促進し、糖尿病性末梢性ニューロパシーの修復を促進することを示した。

実施例５および７の結果は、ｈＨＧＦ変異体をコードする組換えプラスミドは、下肢小動脈の成長を促進するための、および対象の糖尿病性末梢性ニューロパシーの修復を促進するための遺伝子治療薬として使用することができ、ならびにそれらの治療効果は、天然ｈＨＧＦをコードする組換えプラスミドよりも著しく高いことを示した。

本願の具体的実施形態について詳細に説明してきたが、当業者であれば、開示された全ての技術に従い、当該詳細に対して様々な修正および変更を為すことができること、ならびにこれらの変更は、本願の保護の範囲内であることを理解するであろう。本願の完全な範囲は、添付の特許請求の範囲およびその任意の同等物によって与えられる。
本明細書は以下の発明の態様を包含する。
［１］天然ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）と比較して、配列番号１の１３０番目に対応する位置の天然ｈＨＧＦのアミノ酸が、塩基性側鎖を有するアミノ酸へと変異している変異を含む、ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の変異体。
［２］（１）塩基性側鎖を有する前記アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンから選択される；
（２）前記天然ｈＨＧＦが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する；
（３）前記変異体が、配列番号２、３、および４から選択されるアミノ酸配列を有する；
（４）前記変異体が、修飾されている、例えば、化学修飾されている、例えば、ペグ化によって修飾されている；
（５）前記ｈＨＧＦ変異体が、組換え発現法によって調製されるか、または化学合成法によって調製される；ならびに
（６）前記ｈＨＧＦ変異体が、前記天然ｈＨＧＦよりも強力な生物活性を有し、例えば、それは、（ａ）内皮細胞の増殖および／または移動の促進；（ｂ）血管（例えば、微小血管）の形成の促進；および／または、（ｃ）神経損傷（例えば、末梢性ニューロパチー、例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシーなど）の修復の促進、から選択される１つまたは複数の態様においてより強力な活性を示す、
から選択される１つまたは複数の特徴を有する、［１］に記載の変異体。
［３］［１］または［２］に記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、
好ましくは、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）の優先性に従ってコドン最適化されたヌクレオチド配列を有し；
好ましくは、配列番号６、７、および８から選択されるヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
［４］［３］に記載の単離された核酸分子を含むベクターであって、
好ましくは、
（１）プラスミド（例えば、裸のプラスミド）；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など；バクテリオファージ、例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージなど；ならびにウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、単純ヘルペスウイルスベクター）、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、パポーバウイルスベクターなど、からなる群から選択される；
（２）前記変異体を発現させるために（例えば、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなど）において発現させるために）使用される；ならびに
（３）遺伝子治療のためのベクター、例えば、プラスミド（例えば、裸のプラスミド）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなど、であり；好ましくは、前記核酸分子を含有するｐＳＮベクターである、
から選択される１つまたは複数の特徴を有し得るベクター。
［５］［３］に記載の単離された核酸分子または［４］に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞など、真核細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）、からなる群から選択される、宿主細胞。
［６］［１］または［２］に記載の変異体を調製する方法であって、好適な条件下にて［５］に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞の細胞培養物から前記変異体を回収する工程とを含み、
好ましくは、以下の工程：
（１）発現ベクターを構築する工程であって、前記発現ベクターが、前記変異体（例えば、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する前記変異体）をコードする核酸配列を含む、工程と；
（２）宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内に前記発現ベクターを導入し、タンパク質の発現を許容する条件下において前記宿主細胞を培養する工程と；
（３）前記宿主細胞の細胞培養物から前記変異体を単離および回収する工程（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィおよびヘパリン親和性クロマトグラフィによって単離および回収する工程）と
を含む、方法。
［７］［１］もしくは［２］に記載の変異体または［３］に記載の核酸分子または［４］に記載のベクターと、場合により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物。
［８］対象において天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る疾患を治療する方法であって、［１］もしくは［２］に記載の変異体または［３］に記載の核酸分子または［４］に記載のベクターまたは［７］に記載の医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含み；
好ましくは、前記疾患が、虚血性疾患（例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、心筋梗塞または下肢動脈虚血など）、メタボリック症候群、糖尿病およびその合併症（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）、再狭窄（例えば、手術後の再狭窄および潅流後の再狭窄）、ならびに神経損傷（例えば、神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、認知症）、外傷性神経損傷、末梢性ニューロパシー（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー））からなる群から選択され；
好ましくは、対象が哺乳動物、例えば、ヒトなど、である、方法。
［９］対象において天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る疾患を治療するための医薬組成物の製造における、［１］もしくは［２］に記載の変異体または［３］に記載の核酸分子または［４］に記載のベクターの使用であって、
好ましくは、前記疾患が、虚血性疾患（例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、心筋梗塞または下肢動脈虚血など）、メタボリック症候群、糖尿病およびその合併症（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー）、再狭窄（例えば、手術後の再狭窄および潅流後の再狭窄）、ならびに神経損傷（例えば、神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、認知症）、外傷性神経損傷、末梢性ニューロパシー（例えば、糖尿病性末梢性ニューロパシー））からなる群から選択される、
使用。
［１０］内皮細胞（例えば、臍帯静脈内皮細胞）の増殖および／または移動を促進する方法であって、［１］もしくは［２］に記載の変異体または［３］に記載の核酸分子または［４］に記載のベクターまたは［７］に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする内皮細胞または対象に投与する工程を含む、方法。
［１１］血管の形成（例えば、微小血管の形成）を促進する方法であって、［１］もしくは［２］に記載の変異体または［３］に記載の核酸分子または［４］に記載のベクターまたは［７］に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
［１２］医薬組成物の製造における、［１］もしくは［２］に記載の変異体または［３］に記載の核酸分子または［４］に記載のベクターの使用であって、前記医薬組成物が、内皮細胞（例えば、臍帯静脈内皮細胞）の増殖および／または移動を促進するために、または血管の形成（例えば、微小血管の形成）を促進するために使用される、使用。

Claims (16)

1. 配列番号１で示される天然ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）と、配列番号１の１３０番目の位置のアミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンへと変異している変異によって異なる配列を有する、ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の変異体。
2. （１）前記変異体が、配列番号２、３、および４から選択されるアミノ酸配列を有する；
   （２）前記ｈＨＧＦ変異体が、組換え発現法によって調製されるか、または化学合成法によって調製される；
   （３）前記変異体が化学修飾されている；ならびに
   （４）前記変異体がペグ化によって修飾されている、
   から選択される１つまたは複数の特徴を有する、請求項１に記載の変異体。
3. 請求項１に記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
4. （１）前記核酸分子が、宿主細胞の優先性に従ってコドン最適化されたヌクレオチド配列を有する；および
   （２）前記核酸分子が、配列番号６、７、および８から選択されるヌクレオチド配列を有する、
   から選択される１つまたは複数の特徴を有する、請求項３に記載の単離された核酸分子。
5. 請求項３に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
6. （１）前記ベクターが、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、バクテリオファージ、およびウイルスベクター、からなる群から選択される；
   （２）前記ベクターが、裸のプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、ラムダファージ、Ｍ１３ファージ、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、およびパポーバウイルスベクター、からなる群から選択される；
   （３）前記ベクターが、レンチウイルスベクターまたは単純ヘルペスウィルスベクターである；ならびに
   （４）前記ベクターが、遺伝子治療のためのベクターである、
   から選択される１つまたは複数の特徴を有する、請求項５に記載のベクター。
7. 請求項３または４に記載の単離された核酸分子または請求項５または６に記載のベクターを含む宿主細胞。
8. （１）前記宿主細胞が、原核細胞または真核細胞である；
   （２）前記宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞、からなる群から選択される；ならびに
   （３）前記宿主細胞が、マウス細胞またはヒト細胞である、
   から選択される１つまたは複数の特徴を有する、請求項７に記載の宿主細胞。
9. 請求項１または２に記載の変異体を調製する方法であって、（ｉ）好適な条件下にて宿主細胞を培養する工程であって、宿主細胞が変異体をコードする核酸分子を含み、変異体を発現することができる、工程と、（ｉｉ）前記宿主細胞の細胞培養物から前記変異体を回収する工程とを含む、方法。
10. （１）発現ベクターを構築する工程であって、前記発現ベクターが、変異体をコードする核酸配列を含む、工程と；
    （２）宿主細胞内に前記発現ベクターを導入し、タンパク質の発現を許容する条件下において前記宿主細胞を培養する工程と；
    （３）前記宿主細胞の細胞培養物から前記変異体を単離および回収する工程と
    を含む、請求項９に記載の方法。
11. （１）前記変異体が、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する；
    （２）前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である；および
    （３）前記変異体が、陰イオン交換クロマトグラフィおよびヘパリン親和性クロマトグラフィによって細胞培養物から単離および回収される、
    から選択される１つまたは複数の特徴を有する、請求項１０に記載の方法。
12. 請求項１もしくは２に記載の変異体または請求項３もしくは４に記載の核酸分子または請求項５もしくは６に記載のベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
13. 対象において天然ｈＨＧＦの活性が有益であり得る疾患を治療するための医薬組成物の製造における、請求項１もしくは２に記載の変異体または請求項３もしくは４に記載の核酸分子または請求項５もしくは６に記載のベクターの使用。
14. （１）前記疾患が、虚血性疾患、メタボリック症候群、糖尿病およびその合併症、再狭窄、ならびに神経損傷からなる群から選択される；
    （２）前記疾患が、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、手術後の再狭窄、潅流後の再狭窄、神経変性疾患、外傷性神経損傷、および末梢性ニューロパシーからなる群から選択される；
    （３）前記疾患が、心筋梗塞、下肢動脈虚血、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、認知症、または糖尿病性末梢性ニューロパシーである；
    （４）対象が哺乳動物である；ならびに
    （５）対象がヒトである、
    から選択される１つまたは複数の特徴を有する、請求項１３に記載の使用。
15. 医薬組成物の製造における、請求項１もしくは２に記載の変異体または請求項３もしくは４に記載の核酸分子または請求項５もしくは６に記載のベクターの使用であって、前記医薬組成物が、内皮細胞の増殖および／または移動を促進するために、または血管の形成を促進するために使用される、使用。
16. 内皮細胞が臍帯静脈内皮細胞であるか、または血管が微小血管である、請求項１５に記載の使用。

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