KR20210135186A

KR20210135186A - Ask1 억제제 및 그 용도

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Publication number: KR20210135186A
Application number: KR1020210147921A
Authority: KR
Inventors: 김완기; 김은정; 조명래; 권현숙
Original assignee: 아주대학교산학협력단; 한국한의약진흥원
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2021-11-01
Publication date: 2021-11-12
Also published as: KR20210045914A; KR20210135184A; KR20210135185A; KR20210135187A

Abstract

본 발명은 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연물질 유래 특정 화합물과 이를 포함하는 ASK1 억제용 조성물 및 상기 화합물을 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. ASK1 억제제의 경우, 조직 또는 기관 등에 따라 작용 방식이 다양하므로, 다양한 ASK1 억제제 후보 물질 발굴은 ASK1 활성화와 관련된 만성 질환 등의 치료제 개발에 있어서 매우 중요하다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 화합물들은 ASK1 억제제 및 ASK1 관련 질환의 치료제로 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

ASK1 억제제 및 그 용도{ASK1 Inhibitor and Uses Thereof}

본 발명은 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연물질 유래 특정 화합물과 이를 포함하는 ASK1 억제용 조성물 및 상기 화합물을 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

여러 가지 물리적, 화학적, 생물학적 스트레스는 사람을 비롯한 포유류 생물의 기관에서 많은 질병의 발병 원인이 된다. 스트레스 가운데 사람이 가장 노출되기 쉬운 것은 활성산소에 기인한 산화스트레스(oxidative stress)다. 과다한 활성산소가 원인이라고 여겨지는 질병의 종류는 매우 다양하며, 노화와 노인성 질환 거의 전부가 해당된다.

산화스트레스는 p38 MAPK(mitogen activating protein kinase) 신호전달 경로를 통해 이루어진다. ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)은 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5(MAP3K5)로도 알려져 있으며, p38 MAPK 경로의 MAPKKK(MAP kinase kinase kinase; MAP3K)로서 스트레스 신호전달 경로(MAP3K → MAP2K → MAPK)의 가장 앞에 위치하는 kinase이다. 산화스트레스에 의한 ASK1의 활성화는 최종적으로 염증(inflammation), 섬유증(fibrosis), 세포사멸(apoptosis)을 야기한다. 따라서 과다한 활성산소가 원인이라고 여겨지는 질병의 완화 내지 치료를 목적으로 한 ASK1 활성 저해제(또는 억제제)의 개발은 지난 10년간 세계적으로 유수한 제약회사들의 커다란 관심사였다.

ASK1은 거의 모든 조직에서 발현되지만 신장, 심장, 폐, 간, 뇌에서 특히 많이 발현된다. ASK1의 병리학적 연관성은 활성산소에 노출된 조직에서 ASK1의 활성화가 높아진다는 사실이다. ASK1의 활성을 저해함은 염증, 섬유증, 세포사멸을 막고, 여러 가지 질병의 발병 원인을 제거함을 의미한다. 이에, 현재까지 10여 종의 ASK1 inhibitor가 확인되어 주로 신장, 폐, 간 질환 치료제로 개발 중이다. 미국, 캐나다, 일본 등에서 ASK1 연구와 ASK1 저해제의 개발이 활발하다.

ASK1 활성을 저해함으로써 세포 수준 또는 동물 모델 수준에서 진행 완화 내지 증상 호전을 기대하는 질병의 종류는 점점 늘어나고 있다. 특정 저해제의 특정 질병 적용은 특정 저해제와 특정 조직 또는 기관과의 관계(예를 들어 막 투과성, 독성 등)에 의해 결정된다(Am J Physiol Renal Physiol 311: F373-F381(2016)). 과다 활성산소에 기인한 질병 수가 상당히 많기 때문에 ASK1 저해제의 종류는 다양해야 하며, 따라서 ASK1 저해제의 개발은 앞으로도 계속되어야 할 필요성이 있다.

상업적으로 이용 가능한 소분자 라이브러리(예를 들어, Sigma의 1,200여 가지 활성물질 라이브러리) 탐색을 통한 ASK1 저해제 발굴은 탐색 방법에 따라 차이가 있겠지만 덜 독창적일 수 있다. 이에 국내에서 구축한 독자적인 소분자 라이브러리 탐색은 다양한 ASK1 저해제와 독창성을 확보하는 데 매우 유용하다.

ASK1 저해제 후보 물질 발굴은 노인성 질환의 완화제 또는 치료제 개발에 있어서 첫 걸음이다. ASK1 저해제 후보 물질이 발굴된다면 여러 가지 유도체의 합성 및 2차 탐색으로 최상의 후보 물질을 발굴을 시도하고 궁극적으로는 노인성 질환의 완화제 또는 치료제 개발로 이어질 것이다.

이에 본 발명자들은 산화스트레스에 따른 ASK1의 활성화에 의한 ASK1 관련 질병들의 약물 후보로서 ASK1 억제제를 발굴하고 개발하고자 예의 노력한 결과, 한약진흥재단 천연물 물질은행으로부터 입수한 700여개의 물질 중 ASK1 억제 효과를 나타내는 6가지 화합물을 luciferin 기반으로 한 kinase assay를 통해 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 ASK1 억제 기능이 있는 소분자 화합물 및 이를 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 화합물의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 화합물의 사용을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1 내지 화학식 6으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 화학식 1 내지 화학식 6으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한, ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 화합물의 사용을 제공한다.

ASK1 억제제의 경우, 조직 또는 기관 등에 따라 작용 방식이 다양하므로, 다양한 ASK1 억제제 후보 물질 발굴은 ASK1 활성화와 관련된 만성 질환 등의 치료제 개발에 있어서 매우 중요하다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 화합물들은 ASK1 억제제 및 ASK1 관련 질환의 치료제로 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 ASK1-kinase domain 및 MEK6 단백질 발현을 위한 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 ASK1 및 MEK6의 발현 및 정제를 나타낸 것이다.
도 3은 luciferase를 기반으로 한 kinase assay의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 ASK1 활성 검사에 최적화된 ASK1 농도에 따른 MEK6 농도를 확인한 그래프이다.
도 5는 ASK1 억제제에 의한 ASK1의 용량 의존적 억제를 나타낸 그래프이다.
도 6은 0.3mM H₂O₂ 처리 세포의 생존능에 대한 ASK1 저해제의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 2mM H₂O₂ 처리 세포에서 p38 인산화에 대한 ASK1 저해제의 영향을 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

산화스트레스에 의한 ASK1의 활성화는 염증(inflammation), 섬유증(fibrosis), 세포사멸(apoptosis)을 야기하므로, ASK1 활성 저해제 개발을 통해 염증, 섬유증, 세포사멸을 방지할 수 있으며, 이에 따른 여러 가지 질병의 발병 원인을 제거할 수 있다. ASK1 활성을 저해함으로써 세포 수준 또는 동물 모델 수준에서 진행 완화 내지 증상 호전을 기대하는 질병의 종류는 점점 늘어나고 있다. ASK1 저해제 개발의 연구 동향은 하기 표 1에 나타내었으며, 미국, 캐나다, 일본 등에서 연구 및 개발이 활발하다.

선택적 합성 ASK1 저해제(Am J Physiol Renal Physiol 311: F373-F381(2016))

ASK1 Inhibitor	Producer (Location)	IC ₅₀	Efficacy Tests/Trials	Main Outcomes
MSC203294A	Merck Serono (Switzerland)	92nM	EAE model of multiple sclerosis(mice)	Reduced demyelination of spinal cord optic nerve
NQDI-1	Otava Chemicals (Canada)	3μM	Kinase assays(in vitro)	Compound inhibited ATP binding to ASK1 catalytic site
K811	Kyowa Hakku Kirin (Japan)	NA	Xenograft tumor growth(mice)	Reduced cancer cell proliferation and size of xenograft tumors
AOPHA-Me	Georgia Inst. of Technology (USA)	NA	Inflammatory response in macrophages	Inhibited substance P-induced TNFα production by macrophages
GS-459679	Gilead Sciences (USA)	6.1nM	Cardiac ischemia-reperfusion injury(rat)	Cardiomyocyte apoptosis and infarct size reduced
BPyO-34	Otava Chemicals	520nM	Kinase assays(in vitro)	Compound-inhibited ATP binding to ASK1 catalytic site
GS-444217	Gilead Sciences	2.9nM	Diabetic nephropathy(mice)	Glomerulosclerosis halted, renal function improved
Selonsertib (formerly GS-4997)	Gilead Sciences	3nM	Diabetic nephropathy(human, phase 2 clinical trial, trial identifier NCT02177786)	Trial in progress; expected completion August 2016
Selonsertib (formerly GS-4997)	Gilead Sciences	3nM	Non-alcoholic steatohepatitis	Trial in progress

NA: not available.

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 특정 ASK1 저해제의 특정 질병에의 적용은 특정 저해제와 특정 조직 또는 기관과의 관계(예를 들어 막 투과성, 독성 등)에 의해 결정되는 것으로 여겨진다. 즉, 과다한 활성산소에 기인한 질병의 수가 상당이 많으므로, 이미 알려진 저해제 이외에도 다양한 종류의 ASK1 저해제가 개발되어야 할 필요성이 요구된다.

이에 따라 본 발명의 일 실시예에서는, ASK1과 그 기질인 MEK6를 벡터에 클로닝한 후 E.coli에서 과량 발현 및 정제시킨 다음, kinase assay를 이용하여 한약진흥재단 천연물 물질은행으로부터 입수한 순수 천연물 물질 중 ASK1 억제 효과를 나타내는 물질을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1 내지 화학식 6으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 억제용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

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[화학식 2]

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[화학식 3]

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[화학식 4]

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[화학식 5]

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[화학식 6]

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상기 화학식 1 내지 화학식 6에서, R₁ 내지 R₃₁은 각각 독립적으로 수소원자, 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬, 알릴, 히드록시 또는 알콕시이고, 여기서, 알킬 또는 알콕시는 C_1-10, 알릴은 C_2-10인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 알킬 또는 알콕시는 바람직하게는 C_1-10, 더욱 바람직하게는 C_1-5, 가장 바람직하게는 C_1-2인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 알릴은 바람직하게는 C_2-10, 더욱 바람직하게는 C_1-5인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “C_1-10 알킬”은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는, 오직 탄소와 수소 원자로만 이루어진 1가 선형 또는 분지형 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 이러한 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. “분지형 알킬”의 예는 아이소프로필, 아이소부틸, 3급-부틸 등이 있다.

용어 “C_1-10 알콕시”는 화학식 -O-C_1-10알킬을 의미하며, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 아이소프로폭시, 3급-부톡시 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물은 각각 5-하이드록시-4-메톡시칸틴-6-온; 미리세틴; 부로소찰콘 A; (4E)-7-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-1-페닐헵트-4-엔-3-온; 디에콜; 또는 1,6,7-트리하이드록시-2-(1,1-디메틸-2-프로페닐)-3-메톡시잔톤;인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 5-하이드록시-4-메톡시칸틴-6-온; 미리세틴; 부로소찰콘 A; (4E)-7-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-1-페닐헵트-4-엔-3-온; 디에콜; 또는 1,6,7-트리하이드록시-2-(1,1-디메틸-2-프로페닐)-3-메톡시잔톤;은 각각 하기 화학식 1-1 내지 화학식 6-1의 화합물로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

[화학식 1-1]

[화학식 2-1]

[화학식 3-1]

[화학식 4-1]

[화학식 5-1]

[화학식 6-1]

상기 화학식 1-1의 화합물 5-하이드록시-4-메톡시칸틴-6-온(5-Hydroxy-4-methoxycanthin-6-one)은 CAS No. 18110-86-6, 상기 화학식 2-1의 화합물 미리세틴(myricetin; 3,5,7-trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-4H-1-Benzopyran-4-one)은 CAS No. 529-44-2, 상기 화학식 3-1의 화합물 부로소찰콘 A(Broussochalcone A; (E)-1-[2,4-Dihydroxy-5-(3-methyl-2-butenyl)phenyl]-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propen-1-one)는 CAS No. 99217-68-2, 상기 화학식 4-1의 화합물 (4E)-7-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-1-페닐헵트-4-엔-3-온((4E)-7-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3-one)은 CAS No. 79559-60-7, 상기 화학식 5-1의 화합물 디에콜(Dieckol; 4-[4-[6-(3,5-dihydroxyphenoxy)-4,7,9-trihydroxydibenzo-p-dioxin-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyphenoxy]dibenzo-p-dioxin-1,3,6,8-tetrol)은 CAS No. 88095-77-6, 상기 화학식 6-1의 화합물 1,6,7-트리하이드록시-2-(1,1-디메틸-2-프로페닐)-3-메톡시잔톤(1,6,7-Trihydroxy-2-(1,1-dimethyl-2-propenyl)-3-methoxyxanthone)은 CAS No. 1000624-33-8인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 ASK1 억제용 조성물은 바람직하게는 화학식 5-1로 표시되는 화합물인 디에콜 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1-1 내지 화학식 6-1로 표시되는 화합물들은 한약진흥재단 천연물 물질은행으로부터 입수하였으며, 하기 표 2의 특성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

ASK1 억제제 라이브러리

화학식	Name	생약명	물질명	분자량	1mg/ml
1-1	AP 2	고목	5-Hydroxy-4-methoxycanthin-6-one	266.26	3.76mM
2-1	AP 4	소귀나무	Myricetin	318.24	3.14mM
3-1	AP 5	꾸지나무	Broussochalcone A	340	2.94mM
4-1	AP 8	고양강	(4E)-7-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3-one	312.4	3.2mM
5-1	AP 12	감태	Dieckol	742.52	1.35mM
6-1	AP 13	자수근피	1,6,7-Trihydroxy-2-(1,1-dimethyl-2-propenyl)-3-methoxyxanthone	342.34	2.92mM

본 발명에서 용어, “억제”는 결핍, 부조화, 그 밖의 많은 원인에 의하여 생물 활동이나 신호활성이 저하되는 현상을 말하며, ASK1의 활성을 부분적으로 또는 완전히 블로킹하거나, 감소시키거나, 방지하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화 시키거나 또는 하향조절하는 것일 수 있다.

본 발명에서, 용어 “억제제”는 임의의 메커니즘에 의하여 수용체 또는 세포 내 매개체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 저해하는 분자를 의미하며, “저해제”와 동일한 의미로 사용된다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 화학식 1 내지 화학식 6으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 5-하이드록시-4-메톡시칸틴-6-온; 미리세틴; 부로소찰콘 A; (4E)-7-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-1-페닐헵트-4-엔-3-온; 디에콜; 또는 1,6,7-트리하이드록시-2-(1,1-디메틸-2-프로페닐)-3-메톡시잔톤;은 각각 상기 화학식 1-1 내지 화학식 6-1의 화합물로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 ASK1 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게는 화학식 5-1로 표시되는 화합물인 디에콜 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 용어 “ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 관련 질환”은 산화스트레스에 의한 ASK1 활성화에 따라 신장, 심장, 폐, 간, 뇌 등에서 발생하는 다양한 질병을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 상기 화학식 1-1 내지 화학식 6-1의 화합물은 ASK1의 활성화를 억제하는 효과가 우수하여, ASK1 활성화에 의해 발생하는 염증성질환, 신장 질환, 섬유증(fibrosis) 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 AKS1 관련 질환은 염증성질환, 신장 질환, 섬유증(fibrosis) 또는 호흡기 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 염증성질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 습진, 알러지, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 측두 동맥염, 고형암, 알츠하이머병, 동맥경화증, 비알콜성 지방간염(Nonalcoholic steatohepatitis; NASH), 비만 및 바이러스 감염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 신장 질환은 급성, 만성 또는 당뇨병성 신장 질환인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 섬유증은 신장 섬유증, 간 섬유증 또는 폐 섬유증인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD) 또는 급성 폐손상(acute lung injury; ALI)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 화합물을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 약학적으로 유효한 양이란 ASK1 관련 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

상기 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 함께 ASK1 관련 질환 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 자가면역질환 또는 염증성질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화합물의 치료적 유효량을 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 관련 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 화합물의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료방법, 용도 및 사용에 포함되는 구성은 앞서 설명한 발명에 포함되는 구성과 동일하므로, 위 설명은 예방 또는 치료방법, 용도 및 사용에도 동일하게 적용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: ASK1-KD 및 MEK6 발현 플라스미드의 제작

인간 ASK1 kinase domain(ASK1-KD, NCBI Reference Sequence: NP_005914.1의 aa 649-955; 서열번호 1)은 Hela 세포의 cDNA(서열번호 2)를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다(표 3).

ASK1 kinase domain sequence

Name	서열	서열번호
ASK1 kinase domain 아미노산	MVNTITEEKGRSTEEGDCESDLLEYDYEYDENGDRVVLGKGTYGIVYAGRDLSNQVRIAIKEIPERDSRYSQPLHEEIALHKHLKHKNIVQYLGSFSENGFIKIFMEQVPGGSLSALLRSKWGPLKDNEQTIGFYTKQILEGLKYLHDNQIVHRDIKGDNVLINTYSGVLKISDFGTSKRLAGINPCTETFTGTLQYMAPEIIDKGPRGYGKAADIWSLGCTIIEMATGKPPFYELGEPQAAMFKVGMFKVHPEIPESMSAEAKAFILKCFEPDPDKRACANDLLVDEFLKVSSKKKKTQPKLSALS	1
ASK1 kinase domain cDNA	ATGGTGAACACCATTACCGAAGAGAAGGGGAGAAGCACAGAGGAAGGAGACTGTGAAAGTGACTTGCTGGAGTATGACTATGAATATGATGAAAATGGTGACAGAGTCGTTTTAGGAAAAGGCACTTATGGGATAGTCTACGCAGGTCGGGACTTGAGCAACCAAGTCAGAATTGCTATTAAGGAAATCCCAGAGAGAGACAGCAGATACTCTCAGCCCCTGCATGAAGAAATAGCATTGCATAAACACCTGAAGCACAAAAATATTGTCCAGTATCTGGGCTCTTTCAGTGAGAATGGTTTCATTAAAATCTTCATGGAGCAGGTCCCTGGAGGAAGTCTTTCTGCTCTCCTTCGTTCCAAATGGGGTCCATTAAAAGACAATGAGCAAACAATTGGCTTTTATACAAAGCAAATACTGGAAGGATTAAAATATCTCCATGACAATCAGATAGTTCACCGGGACATAAAGGGTGACAATGTGTTGATTAATACCTACAGTGGTGTTCTCAAGATCTCTGACTTCGGAACATCAAAGAGGCTTGCTGGCATAAACCCCTGTACTGAAACTTTTACTGGTACCCTCCAGTATATGGCACCAGAAATAATAGATAAAGGACCAAGAGGCTACGGAAAAGCAGCAGACATCTGGTCTCTGGGCTGTACAATCATTGAAATGGCCACAGGAAAACCCCCATTTTATGAACTGGGAGAACCACAAGCAGCTATGTTCAAGGTGGGAATGTTTAAAGTCCACCCTGAGATCCCAGAGTCCATGTCTGCAGAGGCCAAGGCATTCATACTGAAATGTTTTGAACCAGATCCTGACAAGAGAGCCTGTGCTAACGACTTGCTTGTTGATGAGTTTTTAAAAGTTTCAAGCAAAAAGAAAAAGACACAACCTAAGCTTTCAGCTCTTTCA	2

상기 표 3에서 밑줄로 표시된 부분은 BamHI와 SalI 제한효소 자리를 의미한다.

PCR에 사용된 primer 서열은 다음과 같다:

5’-GATGGATCCATGGTGAACACCATTACCGAAG-3’(sense; 서열번호 3) 및;

5’-GAAGTCGACTGAAAGAGCTGAAAGCTTAGGTTG-3’(antisense; 서열번호 4).

Substrate로 사용한 MEK6 ORF(GenBank: AAQ02601.1; 서열번호 5) 역시 상기와 같이 클로닝하였다.

MEK6 ORF sequence

Name	서열	서열번호
MEK6 ORF 아미노산	MSQSKGKKRNPGLKIPKEAFEQPQTSSTPPRDLDSKACISIGNQNFEVKADDLEPIMELGRGAYGVVEKMRHVPSGQIMAVKRIRATVNSQEQKRLLMDLDISMRTVDCPFTVTFYGALFREGDVWICMELMDTSLDKFYKQVIDKGQTIPEDILGKIAVSIVKALEHLHSKLSVIHRDVKPSNVLINALGQVKMCDFGISGYLVDSVAKTIDAGCKPYMAPERINPELNQKGYSVKSDIWSLGITMIELAILRFPYDSWGTPFQQLKQVVEEPSPQLPADKFSAEFVDFTSQCLKKNSKERPTYPELMQHPFFTLHESKGTDVASFVKLILGD	5
MEK6 ORF cDNA	ATGTCTCAGTCGAAAGGCAAGAAGCGAAACCCTGGCCTTAAAATTCCAAAAGAAGCATTTGAACAACCTCAGACCAGTTCCACACCACCTCGAGATTTAGACTCCAAGGCTTGCATTTCTATTGGAAATCAGAACTTTGAGGTGAAGGCAGATGACCTGGAGCCTATAATGGAACTGGGACGAGGTGCGTACGGGGTGGTGGAGAAGATGCGGCACGTGCCCAGCGGGCAGATCATGGCAGTGAAGCGGATCCGAGCCACAGTAAATAGCCAGGAACAGAAACGGCTACTGATGGATTTGGATATTTCCATGAGGACGGTGGACTGTCCATTCACTGTCACCTTTTATGGCGCACTGTTTCGGGAGGGTGATGTGTGGATCTGCATGGAGCTCATGGATACATCACTAGATAAATTCTACAAACAAGTTATTGATAAAGGCCAGACAATTCCAGAGGACATCTTAGGGAAAATAGCAGTTTCTATTGTAAAAGCATTAGAACATTTACATAGTAAGCTGTCTGTCATTCACAGAGACGTCAAGCCTTCTAATGTACTCATCAATGCTCTCGGTCAAGTGAAGATGTGCGATTTTGGAATCAGTGGCTACTTGGTGGACTCTGTTGCTAAAACAATTGATGCAGGTTGCAAACCATACATGGCCCCTGAAAGAATAAACCCAGAGCTCAACCAGAAGGGATACAGTGTGAAGTCTGACATTTGGAGTCTGGGCATCACGATGATTGAGTTGGCCATCCTTCGATTTCCCTATGATTCATGGGGAACTCCATTTCAGCAGCTCAAACAGGTGGTAGAGGAGCCATCGCCACAACTCCCAGCAGACAAGTTCTCTGCAGAGTTTGTTGACTTTACCTCACAGTGCTTAAAGAAGAATTCCAAAGAACGGCCTACATACCCAGAGCTAATGCAACATCCATTTTTCACCCTACATGAATCCAAAGGAACAGATGTGGCATCTTTTGTAAAACTGATTCTTGGAGACTAA	6

상기 표 4에서 밑줄로 표시된 부분은 BglII와 SalI 제한효소 자리를 의미한다.

PCR에 사용된 primer 서열은 다음과 같다:

5’-ACTAGATCTATGTCTCAGTCGAAAGGCAAGAA-3’(sense; 서열번호 7) 및;

5’-GAAGTCGACGTCTCCAAGAATCAGTTTTACAAAAG-3’(antisense; 서열번호 8).

PCR된 두 개의 증폭된 DNA 조각을 각각 BamHI/SalI과 BglII/SalI 제한효소로 자르고 GST의 3’ 부분에 6xHis 유전자가 tagging되어 있는 pGEX4T-1 벡터(GE Healthcare Life Science)에 클로닝하여 pGST-ASK1-KD와 pGST-MEK6를 얻었다(도 1).

실시예 2: 단백질(GST4T-1-ASK1-KD, GST4T-1-MEK6) 발현 및 정제

단백질을 발현 및 정제하기 위하여, 클로닝한 DNA를 BL21 competent cell(RBC, RH217)에 형질전환(transformation) 시키고 형질전환된 E. coli BL21(DE3)을 선택하였다. LB/ampicillin pate에서 자란 colony를 LB/ampicillin broth에 접종하고 37℃ shaking incubator에서 overnight 배양하였다. 다음날 overnight cell 2-3ml을 2xYT/ampicillin 200ml에 넣고 OD₆₀₀ 0.6~1.0이 될 때까지 37℃에서 shaking한 후, 2ml의 100mM IPTG를 넣고 3-4시간 induction시켰다. Harvest한 후 GST binding buffer에 suspending하여 sonication하였다. 원심분리 후 0.45μm Syringe Filter(Whatman)로 filtration 하였다. 단백질은 10% SDS-acrylamide gel에서 분리 및 확인하였다(도 2).

GST-ASK1-KD와 GST-MEK6 fusion 단백질은 3ml HisㆍBind® Resin(Novagen®)이 packing된 affinity column chromatography(BIO-RAD)를 이용하여 정제하였다. 정제된 ASK1-KD 단백질은 20mM Tris-HCl pH 7.9, 0.5M NaCl, 1M imidazole로 elute하였으며, 다시 한번 Sephadex G-25 Fine(Sigma, G-2580) column에 통과시켜서 salt를 제거하고, Storage buffer(50mM Tris-HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 0.05mM EDTA, 0.2mM PMSF, 5mM DTT, 10% glycerol)로 elution하여 -70℃에 보관하였다.

실시예 3: ASK1 활성 확인을 위한 Kinase Assay

ASK1 kinase domain을 억제하는 약물을 확인하기 위하여, Kinase- Glo® Luminescent Kinase Assay kit(Promega)를 사용하여 kinase reaction에서 남아있는 ATP의 양으로 kinase activity를 측정하는 kinase assay를 실시하였다.

Luciferase를 기반으로 한 kinase assay는 kinase가 ATP를 ADP로 전환시키므로, luciferase와 luciferin의 인광을 이용하여 시간이 지남에 따라 ATP의 고갈을 감지하는 결합 분석법으로 정제된 kinase 효소의 활성을 측정할 수 있다(도 3). Luciferase는 luciferin을 oxyluciferin으로 전환시키기 위해 ATP의 고 에너지 결합으로 빛을 생산하는 효소이다. 산소는 다음과 같은 과정으로 소모됨을 알 수 있다.

luciferin + ATP → luciferyl adenylate + PPi

luciferyl adenylate + O₂ → oxyluciferin + AMP + light

발산산된 형광을 luminometer로 측정한다.

실시예 3-1: 기질(substrate) 농도 결정

Substrate로는 MEK6를 사용하였다. Substrate의 농도를 결정하기 위해 ASK1-KD(1.8μg/μl)를 0.2μl 또는 0.3μl로 고정시키고 substrate의 양을 0~2μg까지 변화시키면서 kinase assay를 실시한 결과, ASK1-KD(1.8μg/μl)는 0.3μl, MEK6(0.5μg/μl)는 2μl를 사용할 때 최적의 효과를 얻을 수 있었다(도 4).

실시예 3-2: Enzyme activity 측정

Enzyme activity를 측정하기 위한 reaction mixture는 하기 표 5에 나타내었다.

Reaction mixture

ASK1	0.5μg
MEK6	1μg
Enzyme buffer	~5μl
Reaction buffer	15μl
DW	10μl
Total	30μl

여기에 3 x ATP solution 15μl를 넣어 total reaction mixture 45μl가 되게 하였다.Enzyme buffer: 50mM Tris-HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 0.05mM EDTA, 0.2mM PMSF, 5mM DTT, 10% glycerol

Reaction buffer: 15mM MOPS pH 7.2, 1.5mM EDTA pH 8.0, 1.5mM EGTA pH 8.0, 0.15mg BSA, 12mM β-glycerophosphate, 0.3mM DTT

30℃ incubator에서 1시간 반응 후 stop buffer로 동량의 Kinase-Glo® luciferase mix를 넣어 실온에서 10분간 두었고 “Synergy2(BioTek)”로 luminescence를 측정하였다.

실시예 4: ASK1 저해제 탐색

한약진흥재단 천연물물질은행으로부터 700여 가지의 순수 천연물 물질을 제공받아 위에서 확립한 방법을 이용하여 ASK1-KD와 MEK6의 반응을 저해하는 ASK1 저해제 탐색을 수행하였다.

기존에 ASK1 저해제로 알려진 MSC203294A(TOCRIS, 5641)와 GS-4997(=Selonsertib)(MCE, HY-18938)를 positive control로 사용하였다(각각 92nM, 3nM). MSC203294A와 GS-4997의 IC₅₀는각각 1.5μM, 32nM로 측정되었다(도 5g 및 도 5h). 반면 천연물질 중 Dieckol(‘AP 12’로 명명), 1,6,7-Trihydroxy-2-(1,1-dimethyl-2-propenyl)-3-methoxyxanthone(‘AP 13’으로 명명), 5-Hydroxy-4-methoxycanthin-6-one(‘AP 2’로 명명), Myricetin(‘AP 4’로 명명), Broussochalcone A(‘AP 5’로 명명), (4E)-7-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3-one(‘AP 8’로 명명)의 IC₅₀은 각각 1.3μM, 4μM, 10μM, 10μM, 10μM, 10μM로 측정되었다(도 5a 내지 도 5f).

결과적으로, 6가지 화합물 중에서도 특히, AP 12의 경우 기존에 알려진 ASK1 저해제보다 더 낮은 IC₅₀을 나타내었으므로, ASK1 저해제로서 더욱 효과적임을 확인할 수 있다.

실시예 5: ASK1 저해제의 ASK1 저해능 확인

실시예 4에서 도출한 ASK1 저해제 AP 2, AP 4, AP 5, AP 8, AP 12 및 AP 13의 ASK1 억제 효과를 확인하기 위하여, H₂O₂에 노출시킨 HEK 293 cell line(ATCC® CRL-1573))의 세포 생존능(cell viability) 및 p38 인산화를 측정하였다. 기존에 ASK1 저해제로 알려진 NQDI-1(SIGMA, SML0185), MSC203294A(TOCRIS, 5641)와 GS-4997(=Selonsertib)(MCE, HY-18938)을 positive control로 사용하였다.

실시예 5-1: 세포 생존능(cell viability) 측정

HEK 293 cell을 0.3mM H₂O₂에 20시간 동안 노출시켰으며, 각 저해제(positive control로 사용한 NQDI-1은 10-20μM, MSC203294A는 1-2μM, GS4997은 1-2μM의 농도, 실험 대상 저해제 AP 2, AP 4, AP 5, AP 8, AP 12 및 AP 13은 1-6μM 농도)를 첨가하였다.

세포 생존능은 96-well plates에 cell을 뿌리고 24시간 후에 저해제를 각각 넣어주었다. 이 때 DMSO 가 0.5% 를 넘지 않도록 하였다. 10분 후 0.3 mM 의 H₂O₂를 처리하고 37℃ CO₂ incubator에 두었다. 20시간 후 CytoX^TM을 각 well에 분주하고 1-4시간 정도 incubation 후에 450nM에서 측정하였다. CytoX^TM cell viability assay kit (LPS solution)를 이용하여 세포 생존능을 측정하였다.

그 결과, NQDI-1 은 20μM, MSC203294A는 2μM, GS4997은 2μM에서 최적 효과를 나타내었으며, AP 2, AP 4, AP 5, AP 8, AP 12, AP 13은 각각 1μM, 6μM, 1μM, 2μM, 4μM, 2μM에서 최적의 효과를 보였다(도 6). 따라서 H₂O₂조건에서, 저해제는 ASK1 활성화를 방해하여 독성을 완화시키는 것을 확인할 수 있다.

실시예 5-2: p38 인산화(phosphorylation) 측정

HEK 293 cell을 2mM H₂O₂에 15분 동안 노출시켰으며, 각 저해제(NQDI-1은 20μM, MSC203294A와 GS4997은 2μM의 농도로 첨가, AP 2, AP 4, AP 5, AP 8, AP 12 및 AP 13은 각각 1μM, 6μM, 1μM, 2μM, 4μM, 2μM)를 첨가하였다. 96-well plates에 cell을 뿌리고 24시간 후에 위와 같은 농도의 저해제를 각각에 넣고 DMSO는 0.5%가 넘지 않도록 하였다. 20시간 후 2mM H2O2에 15분 노출시킨 후 각각의 cell에서 protein을 얻어 SDS-PAGE GEL에 5μg씩 loading하여 western blotting을 실시하고 정량하여 비교 측정하였다. Phospho-p38 MAP Kinase는 Cell Signaling(#9215s)을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 동일한 조건 하에서 H₂O₂에 노출시, 저해제를 넣지 않은 control은 p38 인산화가 일어난 반면, ASK1 저해제를 넣은 lane들은 p38이 인산화되는 것을 방해하여 그 양이 감소한 것을 볼 수 있다(도 7).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION National Institute for Korean Medicine Development <120> ASK1 Inhibitor and Uses Thereof <130> P21-B256 <150> KR 2019-0129199 <151> 2019-10-17 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASK1 kinase domain <400> 1 Met Val Asn Thr Ile Thr Glu Glu Lys Gly Arg Ser Thr Glu Glu Gly 1 5 10 15 Asp Cys Glu Ser Asp Leu Leu Glu Tyr Asp Tyr Glu Tyr Asp Glu Asn 20 25 30 Gly Asp Arg Val Val Leu Gly Lys Gly Thr Tyr Gly Ile Val Tyr Ala 35 40 45 Gly Arg Asp Leu Ser Asn Gln Val Arg Ile Ala Ile Lys Glu Ile Pro 50 55 60 Glu Arg Asp Ser Arg Tyr Ser Gln Pro Leu His Glu Glu Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Lys His Leu Lys His Lys Asn Ile Val Gln Tyr Leu Gly Ser Phe 85 90 95 Ser Glu Asn Gly Phe Ile Lys Ile Phe Met Glu Gln Val Pro Gly Gly 100 105 110 Ser Leu Ser Ala Leu Leu Arg Ser Lys Trp Gly Pro Leu Lys Asp Asn 115 120 125 Glu Gln Thr Ile Gly Phe Tyr Thr Lys Gln Ile Leu Glu Gly Leu Lys 130 135 140 Tyr Leu His Asp Asn Gln Ile Val His Arg Asp Ile Lys Gly Asp Asn 145 150 155 160 Val Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly 165 170 175 Thr Ser Lys Arg Leu Ala Gly Ile Asn Pro Cys Thr Glu Thr Phe Thr 180 185 190 Gly Thr Leu Gln Tyr Met Ala Pro Glu Ile Ile Asp Lys Gly Pro Arg 195 200 205 Gly Tyr Gly Lys Ala Ala Asp Ile Trp Ser Leu Gly Cys Thr Ile Ile 210 215 220 Glu Met Ala Thr Gly Lys Pro Pro Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Pro Gln 225 230 235 240 Ala Ala Met Phe Lys Val Gly Met Phe Lys Val His Pro Glu Ile Pro 245 250 255 Glu Ser Met Ser Ala Glu Ala Lys Ala Phe Ile Leu Lys Cys Phe Glu 260 265 270 Pro Asp Pro Asp Lys Arg Ala Cys Ala Asn Asp Leu Leu Val Asp Glu 275 280 285 Phe Leu Lys Val Ser Ser Lys Lys Lys Lys Thr Gln Pro Lys Leu Ser 290 295 300 Ala Leu Ser 305 <210> 2 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASK1 kinase domain <400> 2 atggtgaaca ccattaccga agagaagggg agaagcacag aggaaggaga ctgtgaaagt 60 gacttgctgg agtatgacta tgaatatgat gaaaatggtg acagagtcgt tttaggaaaa 120 ggcacttatg ggatagtcta cgcaggtcgg gacttgagca accaagtcag aattgctatt 180 aaggaaatcc cagagagaga cagcagatac tctcagcccc tgcatgaaga aatagcattg 240 cataaacacc tgaagcacaa aaatattgtc cagtatctgg gctctttcag tgagaatggt 300 ttcattaaaa tcttcatgga gcaggtccct ggaggaagtc tttctgctct ccttcgttcc 360 aaatggggtc cattaaaaga caatgagcaa acaattggct tttatacaaa gcaaatactg 420 gaaggattaa aatatctcca tgacaatcag atagttcacc gggacataaa gggtgacaat 480 gtgttgatta atacctacag tggtgttctc aagatctctg acttcggaac atcaaagagg 540 cttgctggca taaacccctg tactgaaact tttactggta ccctccagta tatggcacca 600 gaaataatag ataaaggacc aagaggctac ggaaaagcag cagacatctg gtctctgggc 660 tgtacaatca ttgaaatggc cacaggaaaa cccccatttt atgaactggg agaaccacaa 720 gcagctatgt tcaaggtggg aatgtttaaa gtccaccctg agatcccaga gtccatgtct 780 gcagaggcca aggcattcat actgaaatgt tttgaaccag atcctgacaa gagagcctgt 840 gctaacgact tgcttgttga tgagttttta aaagtttcaa gcaaaaagaa aaagacacaa 900 cctaagcttt cagctctttc a 921 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatggatcca tggtgaacac cattaccgaa g 31 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaagtcgact gaaagagctg aaagcttagg ttg 33 <210> 5 <211> 334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEK6 ORF <400> 5 Met Ser Gln Ser Lys Gly Lys Lys Arg Asn Pro Gly Leu Lys Ile Pro 1 5 10 15 Lys Glu Ala Phe Glu Gln Pro Gln Thr Ser Ser Thr Pro Pro Arg Asp 20 25 30 Leu Asp Ser Lys Ala Cys Ile Ser Ile Gly Asn Gln Asn Phe Glu Val 35 40 45 Lys Ala Asp Asp Leu Glu Pro Ile Met Glu Leu Gly Arg Gly Ala Tyr 50 55 60 Gly Val Val Glu Lys Met Arg His Val Pro Ser Gly Gln Ile Met Ala 65 70 75 80 Val Lys Arg Ile Arg Ala Thr Val Asn Ser Gln Glu Gln Lys Arg Leu 85 90 95 Leu Met Asp Leu Asp Ile Ser Met Arg Thr Val Asp Cys Pro Phe Thr 100 105 110 Val Thr Phe Tyr Gly Ala Leu Phe Arg Glu Gly Asp Val Trp Ile Cys 115 120 125 Met Glu Leu Met Asp Thr Ser Leu Asp Lys Phe Tyr Lys Gln Val Ile 130 135 140 Asp Lys Gly Gln Thr Ile Pro Glu Asp Ile Leu Gly Lys Ile Ala Val 145 150 155 160 Ser Ile Val Lys Ala Leu Glu His Leu His Ser Lys Leu Ser Val Ile 165 170 175 His Arg Asp Val Lys Pro Ser Asn Val Leu Ile Asn Ala Leu Gly Gln 180 185 190 Val Lys Met Cys Asp Phe Gly Ile Ser Gly Tyr Leu Val Asp Ser Val 195 200 205 Ala Lys Thr Ile Asp Ala Gly Cys Lys Pro Tyr Met Ala Pro Glu Arg 210 215 220 Ile Asn Pro Glu Leu Asn Gln Lys Gly Tyr Ser Val Lys Ser Asp Ile 225 230 235 240 Trp Ser Leu Gly Ile Thr Met Ile Glu Leu Ala Ile Leu Arg Phe Pro 245 250 255 Tyr Asp Ser Trp Gly Thr Pro Phe Gln Gln Leu Lys Gln Val Val Glu 260 265 270 Glu Pro Ser Pro Gln Leu Pro Ala Asp Lys Phe Ser Ala Glu Phe Val 275 280 285 Asp Phe Thr Ser Gln Cys Leu Lys Lys Asn Ser Lys Glu Arg Pro Thr 290 295 300 Tyr Pro Glu Leu Met Gln His Pro Phe Phe Thr Leu His Glu Ser Lys 305 310 315 320 Gly Thr Asp Val Ala Ser Phe Val Lys Leu Ile Leu Gly Asp 325 330 <210> 6 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEK6 ORF <400> 6 atgtctcagt cgaaaggcaa gaagcgaaac cctggcctta aaattccaaa agaagcattt 60 gaacaacctc agaccagttc cacaccacct cgagatttag actccaaggc ttgcatttct 120 attggaaatc agaactttga ggtgaaggca gatgacctgg agcctataat ggaactggga 180 cgaggtgcgt acggggtggt ggagaagatg cggcacgtgc ccagcgggca gatcatggca 240 gtgaagcgga tccgagccac agtaaatagc caggaacaga aacggctact gatggatttg 300 gatatttcca tgaggacggt ggactgtcca ttcactgtca ccttttatgg cgcactgttt 360 cgggagggtg atgtgtggat ctgcatggag ctcatggata catcactaga taaattctac 420 aaacaagtta ttgataaagg ccagacaatt ccagaggaca tcttagggaa aatagcagtt 480 tctattgtaa aagcattaga acatttacat agtaagctgt ctgtcattca cagagacgtc 540 aagccttcta atgtactcat caatgctctc ggtcaagtga agatgtgcga ttttggaatc 600 agtggctact tggtggactc tgttgctaaa acaattgatg caggttgcaa accatacatg 660 gcccctgaaa gaataaaccc agagctcaac cagaagggat acagtgtgaa gtctgacatt 720 tggagtctgg gcatcacgat gattgagttg gccatccttc gatttcccta tgattcatgg 780 ggaactccat ttcagcagct caaacaggtg gtagaggagc catcgccaca actcccagca 840 gacaagttct ctgcagagtt tgttgacttt acctcacagt gcttaaagaa gaattccaaa 900 gaacggccta catacccaga gctaatgcaa catccatttt tcaccctaca tgaatccaaa 960 ggaacagatg tggcatcttt tgtaaaactg attcttggag actaa 1005 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 actagatcta tgtctcagtc gaaaggcaag aa 32 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaagtcgacg tctccaagaa tcagttttac aaaag 35

Claims

하기 화학식 4-1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 활성 억제용 조성물:
[화학식 4-1]

.
하기 화학식 4-1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 4-1]

,
여기서, 상기 ASK1 관련 질환은 염증성 질환, 신장 질환, 섬유증(fibrosis) 또는 호흡기 질환이며,
상기 염증성 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 습진, 알러지, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 측두 동맥염, 고형암, 알츠하이머병, 동맥경화증, 비알콜성 지방간염(Nonalcoholic steatohepatitis), 비만 및 바이러스 감염으로 구성된 군에서 선택되고,
상기 신장 질환은 급성, 만성 또는 당뇨병성 신장 질환이며,
상기 호흡기 질환은 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD) 또는 급성 폐손상(acute lung injury; ALI)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 섬유증은 신장 섬유증, 간 섬유증 또는 폐 섬유증인 것을 특징으로 하는 ASK1 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물.