KR20210128902A - 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피부재생, 미백 또는 항산화기능이 향상된 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 화장품 조성물 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 피부재생, 미백 또는 항산화기능이 향상된 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 화장품 조성물 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
요유래 줄기세포는 줄기세포를 인체 소변에서 간단한 분리과정을 통해 획득할 수 있는 새로운 줄기세포원으로, 다른 간엽줄기세포에 비해 환자에게 통증과 후유증을 전혀 유발하지 않고 여러 번 획득이 가능하여 초기 배양에 필요한 줄기세포 수를 기존 세포원에 비해 많이 얻을 수 있다. 또한 요유래 줄기세포는 증식률이 높아 단기간에 많은 세포 수를 얻을 수 있기 때문에 상용화 가능성이 높고, HLA-DR의 발현이 낮아 체내 이식 시 면역 반응을 유발하지 않는 자가세포치료제로서 사용 가능하다는 점에서 임상적 접근에 매우 용이하다는 장점을 가지고 있다. 그 외에도 요유래 줄기세포는 적절한 배양환경에서 여러 가지 성장인자를 포함한 사이토카인을 분비하는 등 그 치료적 잠재성이 인정받고 있다.
최근 세포가 분비하는 분비물(Secretome)에 세포 활동을 조절하는 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고 되고 있다. 엑소좀(Exosome)은 세포로부터 분비되는 30-150 nm 크기의 나노소포체이다[1,2]. 엑소좀은 mRNA, miRNA 등의 유전물질과, 사이토카인 등의 단백질 운반물질을 포함하여, 세포 타입에 따라 특이적이고, 분비되는 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸, 괴사 등을 조절한다. 또한 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어있다. 특히 줄기세포 엑소좀은 줄기세포의 특성에 따라 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있어, 조직 재생에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다[3,4,5].
최근 노령화 인구의 증가와 다양한 피부미용 기술들이 증대됨에 따라 피부노화 개선에 대한 소비자의 욕구가 높아지고 있다. 또한 줄기세포 엑소좀에 대한 연구들이 활발히 수행되면서, 안전하며 효능이 우수한 기능성 엑소좀 화장품 개발은 화장품업계의 주요 관심 과제이다. 줄기세포 엑소좀은 피부 노화 현상을 개선할 수 있는 항노화 화장품 원료로 사용될 수 있으며, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
따라서, 본 발명자들은 요 유래 줄기세포 증식 시 분비되는 엑소좀을 효율적으로 분리 및 정제하고, 요 유래 줄기세포 엑소좀의 상처재생, 주름개선, 피부미백에 대한 효능을 입증하여, 인체에 부작용이 없으며 효능이 우수한 새로운 기능성 화장품을 개발하고자 하였다.
선행문헌
[비특허문헌 1] S, E. L. A., Mager, I., Breakefield, X. O. & Wood, M. J. Extracellular vesicles:biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews. Drug discovery 2013. 12, 347-357.
[비특허문헌 2] Sahoo, S. et al. Exosomes from human CD34(+) stem cells mediate their proangiogenic paracrine activity. Circulation research, 2011. 109, 724-728.
[비특허문헌 3] Schorey, J. S. & Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic, 2008, 9, 871-881.
[비특허문헌 4] Thery, C., Zitvogel, L. & Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature reviews. Immunology, 2002. 2, 569-579.
[비특허문헌 5] Vishnubhatla, I., Corteling, R., Stevanato, L., Hicks, C. & Sinden, J. The Development of Stem Cell-derived Exosomes as a Cell-free Regenerative
Medicine. Journal of Circulating Biomarkers, 2014. 1.
본 발명자들은 특허출원 제10-2019-0139702호에서 요 유래 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 요 유래 줄기세포의 배양방법을 공개한바 있다. 본 발명자들은 상기 요 유래 줄기세포에 대한 연구를 지속적으로 수행하던 중, 요 유래 줄기세포에서 분비되는 엑소좀이 상처재생, 주름개선, 피부미백 등과 같은 피부 노화 개선 효능이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 화장품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료에 사용하기 위한 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, 줄기세포의 "증식"은 줄기세포가 구체적인 세포로 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 세포가 분열되어 세포의 전체 수가 증가되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "배양액“은 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “엑소좀”은 세포로부터 분비되며, mRNA, miRNA 등의 유전물질과, 사이토카인 등의 단백질 운반물질을 포함하는. 30-150 nm 크기의 나노소포체를 의미한다.
본 발명에 따른 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 세포 독성이 없어 안전하고(실시예 3), 우수한 세포 증식률(실시예 4)를 가지며, 상처 치료(실시예 5), 피부주름개선(실시예 6) 및 피부미백(실시예 8)를 가지는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 화장품 조성물, 약제학적 조성물 및 식품 조성물로서 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 실시예 1에 따라 TFF 방법에 의해 분리된 엑소좀 내 단백질의 농도를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 입자 크기를 나타낸다.
도 3은 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀 내에 존재하는 마커를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 세포 독성을 나타낸다.
도 5는 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 세포 증식률을 나타낸다.
도 6은 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 인체 피부섬유아세포 및 인체 각질형성세포의 이동에 미치는 효과를 나타낸다.
도 7은 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 주름개선 효과를 나타낸다.
도 8은 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 미백 효과를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 입자 크기를 나타낸다.
도 3은 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀 내에 존재하는 마커를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 세포 독성을 나타낸다.
도 5는 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 세포 증식률을 나타낸다.
도 6은 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 인체 피부섬유아세포 및 인체 각질형성세포의 이동에 미치는 효과를 나타낸다.
도 7은 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 주름개선 효과를 나타낸다.
도 8은 실시예 1에 따라 분리된 엑소좀의 미백 효과를 나타낸다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 화장품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 화장품 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 요 유래 줄기세포를 배양하는 과정에서 분리 및 정제될 수 있으며, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 본 발명자들의 특허출원 제10-2019-0139702호에 기재된 바와 같다. 예를 들면, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하고, 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청, 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)을 포함하거나, 상기로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 상기 요 유래 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위한 배지조성물은 무혈청 및 무항생제 배지조성물인 것을 특징으로 한다. 상기 무혈청 및 무항생제 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 섬유아세포증식인자(FGF2), 하이드로코르티솔, T3(triiodothyronine), 칼시트리올, 인슐린-트랜스페틸-셀레늄-에타놀아민, L-아스코르빈산 2-포스페이트 및 레티노인산을 포함하거나, 상기로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 화장품 조성물에 있어서, 상기 요 유래 줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 화장품 조성물에 있어서, 상기 상처는 베임(cut), 절개(incisions)(예를 들면, 수술적 절개), 찰과상(abrasions), 열상 또는 찢김(lacerations), 골절(fracture), 타박상(contusions), 화상(burns), 또는 절단(amputations)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 화장품 조성물에 있어서, 상기 화장품 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들면 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명에 따른 화장품 조성물에 있어서, 상기 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장품 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장품 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장품 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장품 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
제2구현예에 따르면
본 발명은 또한 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 요 유래 줄기세포를 배양하는 과정에서 분리 및 정제될 수 있으며, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 본 발명자들의 특허출원 제10-2019-0139702호에 기재된 바와 같다. 예를 들면, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하고, 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청, 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)을 포함하거나, 상기로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 요 유래 줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 상처는 베임(cut), 절개(incisions)(예를 들면, 수술적 절개), 찰과상(abrasions), 열상 또는 찢김(lacerations), 골절(fracture), 타박상(contusions), 화상(burns), 또는 절단(amputations)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 마스크 팩, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류도 적절하게 배합할 수 있다.
제3구현예에 따르면,
본 발명은 또한 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처의 예방 또는 완화용 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 요 유래 줄기세포를 배양하는 과정에서 분리 및 정제될 수 있으며, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 본 발명자들의 특허출원 제10-2019-0139702호에 기재된 바와 같다. 예를 들면, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하고, 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청, 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)을 포함하거나, 상기로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 요 유래 줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 상처는 베임(cut), 절개(incisions)(예를 들면, 수술적 절개), 찰과상(abrasions), 열상 또는 찢김(lacerations), 골절(fracture), 타박상(contusions), 화상(burns), 또는 절단(amputations)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 염식품 조성물은 상기 유효 성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. 이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.
제4구현예에 따르면,
본 발명은 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료에 사용하기 위한 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀의 제조 방법을 제공하고자 하는 것으로, 상기 방법은
요 유래 줄기세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 배지조성물에서 배양하는 단계, 및
상기 배양된 요 유래 줄기세포를 무혈청 및 무항생제 배지조성물에서 배양하여 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)을 포함하거나, 상기로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 무혈청 및 무항생제 배양액은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 섬유아세포증식인자(FGF2), 하이드로코르티솔, T3(triiodothyronine), 칼시트리올, 인슐린-트랜스페틸-셀레늄-에타놀아민, L-아스코르빈산 2-포스페이트 및 레티노인산을 포함하거나, 상기로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 인체 요 유래 줄기세포로부터 엑소좀의 추출
인체 요 유래 줄기세포를 계대(passage) 2 내지 7까지 배양한 다음 엑소좀을 추출하기 위한 무혈청, 무항생제 배지로 교체한 후 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, 본 발명자들의 특허출원 제10-2019-0139702호에서 요 유래 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 특허에 공개된 요 유래 줄기세포 배양을 위한 배지조성물(하기의 표 1 및 2 참조)을 통해 인체 요 유래 줄기세포를 계대배양 2회차 내지 7회차까지 배양한 다음, 엑소좀을 추출하기 위한 무혈청 및 무항생제 배지(하기의 표 3 참조)로 교체하여 24시간 내지 96시간 동안 배양하였다.
| Basal media | Supplement | Concentration |
| DMEM (Low glucose) + Ham’s F12 (3:1 mix) |
FBS | 2.5 % |
| Bovine serum albumin | 0.1-50 mg/ml | |
| Chemically defined lipids | 표 2 참조 | |
| FGF23 | 1-500 ng/ml | |
| Triiodothyronine(T3) | 0.1-100 nM | |
| Calcifediol | 10-1000 nM |
| Chemically defined lipids | Concentration |
| Arachidonic acid | 2-20 ng/ml |
| Cholesterol | 220-2200 ng/ml |
| DL-alpha-Tocopherol Acetate | 70-700 ng/ml |
| Linoleic acid | 10-100 ng/ml |
| Myristic acid | 10-100 ng/ml |
| Oleic acid | 10-100 ng/ml |
| Palmitic acid | 10-100 ng/ml |
| Palmitoleic acid | 10-100 ng/ml |
| Pluronic F-68 | 90-900 μg/ml |
| Stearic acid | 10-100 ng/ml |
| Tween 80 | 2.2-22 μg/ml |
| Basal media | Supplement | Concentration |
| DMEM (Low glucose) + Ham’s F12 (3:1 mix) |
EGF | 0.1-20 ng/ml |
| FGF2 | 1-500 ng/ml | |
| Hydrocortisol | 1-300 ng/ml | |
| Triiodothyronine(T3) | 0.1-100 nM | |
| Calcitriol | 10-1000 nM | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | 0.1-10 % | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | 1-1000 nM | |
| Retinoic acid | 0.1-100 μM |
이후, 세포 배양 상층액을 회수하여 300 xg 내지 500 xg에서 5분 내지 15분간 원심분리하여 세포를 제거하였다, 그 후, 12000 xg 내지 20000 xg에서 30분 내지 60분간 고속원심분리하여 세포 잔여물을 제거해주었다. 이후, 세포 및 세포 잔여물이 제거된 배양액은 0.22 μm 필터로 여과하거나, 또는 500 kDa 내지 1000 kDa의 MWCO를 가지는 TFF 필터로 여과하여 그 여과물를 얻음으로써, 100nm 내지 300nm 이상의 크기를 가지는 물질들을 제거하였다. 이후, 엑소좀을 분리하기 위하여 30kDa 내지 100kDa의 MWCO를 가지는 TFF 필터로 여과하여 그 농축물을 얻음으로써, 10 nm 내지 30nm 이하의 크기를 가지는 물질들을 제거하였다. 상기 여과 단계는 농축물의 부피가 1/50 내지 1/100의 부피가 될 때까지 농축하였다. 농축된 엑소좀은 인산염완충용액(PBS)을 이용하여 세척하였다. 이 때, PBS는 농축물 부피의 10배 내지 20배의 부피로 첨가하며 TFF 필터를 이용하여 농축한다. 상기 세척 과정은 1회 내지 10회 실시하였다. 상기 과정을 통해 분리 및 정제된 엑소좀을 이용하여 화장품 조성물을 제조하였고 하기 실험들에 사용하였다. 인체 요 유래 줄기세포 엑소좀의 효능을 비교하기 위하여 대조군으로서 인체 지방 유래 줄기세포로부터 상기 방법과 동일하게 엑소좀을 추출하였다.
실시예 2. 분리된 엑소좀의 특성 분석 (BCA 정량, NTA, Exo-check)
상기 실시예 1의 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(UD-exo) 및 대조군으로서 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(AD-exo)의 단백질 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific)을 이용하여 측정하였다. TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법으로 측정하였다. 그 결과 실시예 1에 따른 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거되는 것으로 나타났다(도 1).
실시예 1의 방법을 따라 분리된 엑소좀의 입자 크기는 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA)을 이용하여 5회 반복하여 측정하였다. 그 결과, 분리한 엑소좀의 크기 분포가 균일한 것으로 나타났다(도 2).
또한, 실시예 1의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 Exo-check(system bioscience)kit를 사용하여 엑소좀 마커를 분석하였다. 그 결과, 분리된 엑소좀 내에 CD63, CD81, EpCAM 마커가 존재하는 것으로 나타났다(도 3).
실시예 3. 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
상기 실시예 1의 분리방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 인체 피부 섬유아세포와 인체 각질 형성 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포 독성을 확인하였다. 인체 피부 섬유아세포와 인체 각질 형성세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO-2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 FBS가 포함되어있지 않은 DMEM을 분주한 뒤 실시예 1로부터 준비된 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀과 대조군으로서 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 각각 농도별로 처리하여 24 내지 48시간 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율은 CCK-8(Cell Counting Kit-8, cat#CK04-11), MTT(abcam, cat#ab211091), 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 엑소좀이 처리되지 않은 DMEM에서 동일시간 배양된 세포군을 기준으로, 시험된 농도범위 내에서 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀과 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 의한 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 엑소좀 처리에 따른 세포 증식률 측정
상기 실시예 1의 분리방법에 따라 수득된 엑소좀 처리에 따른 인체 피부 섬유아세포와 인체 각질 형성 세포의 증식률을 평가하기 위해 인체 피부 섬유아세포와 인체 각질 형성 세포에 농도별 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. 인체 피부 섬유아세포와 인체 각질 형성세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO-2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 FBS가 포함되어있지 않은 DMEM을 분주한 뒤 실시예 1로부터 준비된 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀과 대조군으로서 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 농도별로 처리하여 48시간 내지 72시간 배양 후 엑소좀 농도에 따른 세포 증식률을 평가하였다. 세포 증식률은 trypan blue를 이용한 Cell counting, CCK-8(Cell Counting Kit-8, cat#CK04-11), MTT(abcam, cat#ab211091), 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 엑소좀이 처리되지 않은 DMEM에서 동일시간 배양된 세포군을 기준, 시험된 엑소좀의 전체 농도에서 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀보다 세포증식률이 우수한 것으로 나타났다(도 5).
실시예 5. 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 이용한 인체 피부섬유아세포 및 인체 각질형성세포의 이동 효과
인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(UD-exo)이 인체 피부섬유아세포 및 인체 각질형성세포의 이동에 미치는 영향을 알아보기 위해, 인체 요 유래 줄기세포 배양 배지로부터 추출된 엑소좀과 인체 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(AD-exo)을 각각 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 배지 조성물은 UD-exo는 250 μg/mL 농도로 DMEM 무혈청 배양 배지에 추가하여 사용하였고, AD-exo는 250 μg/mL 농도를 DMEM 무혈청 배양 배지에 추가하여 사용하였다. 음성대조군으로 DMEM 무혈청 배지를 사용하였다. 인체 피부섬유아세포와 인체 각질형성세포는 24 well plate에 설치된 scratch assay 용 틀 안에 각각 2×105cells/well로 분주하고 배양배지(DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 설치된 틀을 조심스럽게 제거하여 일정한 간격의 상처(wound)를 제작하고 엑소좀이 포함된 상기 배지 조성물을 각각의 세포에 처리하였다. 엑소좀이 포함된 배지를 각 세포에 처리 후 0, 6, 12, 18시간 뒤 사진을 찍어 Image J를 통해 세포의 이동정도를 수치화하였다.
그 결과, 12시간이 되었을 때부터 UD-exo를 포함한 배지를 처리한 세포(88.12%)가 음성대조군(26.44%) 및 AD-exo(50.66%)를 처리한 세포보다 이동(migration)되는 정도가 더 높게 나타났으며, 18시간 후 AD-exo가 포함된 배지에 비해 UD-exo가 포함된 배지에서 이동이 빠르게 진행되어 섬유아세포의 이동 효과가 우수한 것으로 확인되었다. 인체 각질형성세포에 UD-exo를 포함한 배지를 처리한 세포(80.75%) 또한 12시간이 되었을 때부터 음성대조군(36.53%) 및 AD-exo(46.51%)를 처리한 세포보다 이동(migration)되는 정도가 더 높게 나타나는 것으로 확인되었다(도 6). 이로써, 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀이 인체 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀보다 상처 회복에 좋은 효과가 있음이 입증되었다.
실시예 6. 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 주름개선 효과
인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 인체 피부섬유아세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 요 유래 줄기세포 배양 배지로부터 추출된 엑소좀(UD-exo), 지방 유래 줄기세포 배양 배지로부터 추출된 엑소좀(AD-exo)을 각각 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. UD-exo를 포함하는 배지 조성물은 DMEM 무혈청 배양 배지에 UD-exo를 250 μg/mL 농도로 추가하여 사용하였고, AD-exo를 포함하는 배지 조성물은 DMEM 무혈청 배양 배지에 AD-exo를 250 μg/mL 농도를 추가하여 사용하였으며, 음성대조군으로 DMEM 무혈청 배지를 사용하였다. 인간 피부섬유아세포는 6 well plate에 각각 3×105cells/well로 분주하고 배양배지(DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 24시간 동안 배양한 후, 세포가 잘 붙었는지 확인한 다음 인산완충식염수로 세포를 세척하고 엑소좀이 포함된 상기 배지 조성물을 각각의 세포에 처리하였다. 엑소좀 처리 48시간 후, 콜라겐의 유전자 발현 수준을 확인하기 위해 각 well의 인체 피부 섬유아세포와 배양액을 각각 회수하여 피부 섬유아세포는 25℃, 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 획득하였고, 배양액은 25℃, 3000 rpm에서 10분 원심분리하여 획득하였다. 회수된 피부 섬유아세포로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조한 뒤 하기의 표 4에 나타낸 프라이머를 이용하여 리얼타임 PCR을 수행하여 콜라겐 유전자의 mRNA 변화량을 측정하였고 회수된 배양액은 원심분리 뒤 얻은 상층액을 취해 수용성 콜라겐(soluble collagen)의 추출 및 정량에 사용하였다. 콜라겐 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 GAPDH 유전자를 사용하였다.
| Gene | Primer sequence | |
| Forward primer (5' → 3') | Reverse primer (5' → 3') | |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| Collagen(Col1A1 type) | GAGTGGTGATCGTGGTGAGACTGGT | CTTTATGCCTCTGTCGCCCTGTTCG |
그 결과, 인체 피부 섬유아세포에 대해 AD-exo가 포함된 배양액과 UD-exo가 포함된 배양액을 처리한 경우 음성대조군에 비해 콜라겐의 mRNA 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었으며 AD-exo가 포함된 배양액보다 UD-exo가 포함된 배양액에서 더욱 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(도 7a).
또한, 각각의 엑소좀이 처리된 인체 피부 섬유아세포로부터 획득한 배양액 내의 콜라겐 정량을 위해 Sirius Red Total Collagen Detection Assay Kit (Cat#. 9062P, Woodinville, USA)를 사용하였다. 상기 획득된 상층액은 0.05M의 acetic acid buffer를 처리하여 4 ℃에서 12시간 이상 유지시켰다. 이후 제공된 콜라겐 흡착 염료(sirius red solution)를 상기 0.05M acetic acid buffer가 첨가된 상층액에 추가하고 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 콜라겐을 농축시켰다. 이후 상층액을 제거하여 흡착되지 않은 염료를 제거하고 펠렛을 워싱버퍼로 세척한 후, 10분간 원심분리하여 한 번 더 콜라겐을 농축시켰다. 이후 alkali reagent를 처리하여 콜라겐에 흡착된 염료를 녹여내고 530nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선의 수식에 흡광도를 대입하여 UD-exo, AD-exo 및 음성 대조물질을 첨가한 well의 수용성 콜라겐의 양을 계산하였다.
그 결과, UD-exo 투여군의 수용성 콜라겐 합성율은 음성 대조군(190㎍)과 비교했을 때 증가하였으며, 특히 250 ㎍/mL의 UD-exo 투여군의 경우 콜라겐 합성량이 457㎍로, 동일양의 AD-exo (211㎍)에 비해 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(도 8b).
이로써, 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 피부 섬유아세포의 콜라겐합성을 촉진시키는 효과가 있음이 입증되었다.
실시예 7. 멜라노사이트(melanocyte)를 이용한 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 타이로시나아제 활성 억제 효과
인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 타이로시나아제 활성 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해, 인체 요 유래 줄기세포 배양 배지로부터 추출된 엑소좀(UD-exo), 인체 지방 유래 줄기세포 배양 배지로부터 추출된 엑소좀(AD-exo)을 이용하여 타이로시나아제 활성 억제 확인시험 (Tyrosinase inhibition assay, abcam, cat#204715)을 진행하였다. 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 250 μg/mL과 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 250 μg/mL을 타이로시나아제 억제 샘플로 사용하였다. 이후 타이로시나아제와 타이로시나아제 기질을 반응시킨 뒤 각각의 엑소좀 샘플을 추가하여 아무것도 첨가하지 않고 반응시킨 음성대조군을 기준으로 30분 내지 60분까지 3분 간격으로 타이로시나아제 활성도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 비교하였다.
그 결과, 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 처리한 군이 타이로시나아제를 34% 억제하였고 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 처리한 군은 타이로시나아제를 16% 억제하는 것으로 나타났다. 이로써, 인체 요 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 인체지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀보다 타이로시나아제 활성 억제 효능이 뛰어남이 입증되었다.
Claims (15)
- 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 화장품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하고,
상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 화장품 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 배양된 요 유래 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위한 배지조성물은 무혈청 및 무항생제 배지조성물인 것을 특징으로 하는 것인, 화장품 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 요 유래 줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래인 것을 특징으로 하는 것인, 화장품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 상처는 베임(cut), 절개(incisions)(예를 들면, 수술적 절개), 찰과상(abrasions), 열상 또는 찢김(lacerations), 골절(fracture), 타박상(contusions), 화상(burns), 또는 절단(amputations)을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 화장품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화장품 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 또는 파우더로 제형화되는 것을 특징으로 하는 것인, 화장품 조성물.
- 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료용 약제학적 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 요 유래 줄기세포의 배양을 위한 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하고,
상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 화장품 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 배양된 요 유래 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위한 배지조성물은 무혈청 및 무항생제 배지조성물인 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 요 유래 줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래인 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 상처는 베임(cut), 절개(incisions)(예를 들면, 수술적 절개), 찰과상(abrasions), 열상 또는 찢김(lacerations), 골절(fracture), 타박상(contusions), 화상(burns), 또는 절단(amputations)을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 마스크 팩, 약물 함유 붕대 또는 로션으로부터 선택되는 피부 외용제인 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
- 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처 치료에 사용하기 위한 요 유래 줄기세포 유래의 엑소좀의 제조 방법으로, 상기 방법은:
요 유래 줄기세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 배지조성물에서 배양하는 단계, 및
상기 배양된 요 유래 줄기세포를 무혈청 및 무항생제 배지조성물에서 배양하여 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(chemically defined lipids), FGF23(fibroblast growth factor 23), T3(triiodothyronine) 및 칼시페디올(calcifediol)을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 무혈청 및 무항생제 배지조성물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham's F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본배지, 섬유아세포증식인자(FGF2), 하이드로코르티솔, T3(triiodothyronine), 칼시트리올, 인슐린-트랜스페틸-셀레늄-에타놀아민, L-아스코르빈산 2-포스페이트 및 레티노인산을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
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