KR20210118030A

KR20210118030A - 스타필로코커스속 균주 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20210118030A
Application number: KR1020210124280A
Authority: KR
Inventors: 이동걸; 강승현; 경서연; 여현주; 박명삼
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2021-09-16
Publication date: 2021-09-29
Also published as: CN112442456A; KR102305609B1; KR20210025317A; KR102456734B1

Abstract

스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 에피데르미데스 시카리아(Epidermidis CICARIA) 균주 또는 그의 배양액을 포함하는 피부 상태 또는 탈모 및 육모 관련 상태의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

스타필로코커스속 균주 및 그의 용도 {A genus of Staphylococcus strain and uses thereof}

스타필로코커스속 균주 및 그의 용도에 관한 것이다.

피부장벽은 죽은 각질세포와 세포간 지질로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 즉, 체내에서 지나친 수분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다. 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피에는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질형성세포는 분화를 통해 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다.

탈모는 유전적, 환경적, 정신적 요소 등 다양한 요인으로 인해 두피의 모세혈관이 수축되면서 가려움 증세와 함께 두피조직으로부터 머리카락이 이탈되는 현상을 말하며, 이는 현대인들의 말 못하는 고민거리 중 하나로 자리 잡고 있다. 이와 같은 탈모의 원인은 과도한 정신적 스트레스와 두뇌 노동 그리고 인스턴트화 된 식생활로 인하여 두피 내 원활하지 못한 혈액 순환과 모근 세포의 영양결핍 및 내분비순환계의 기능저하를 초래하여 사멸하는 모근 세포 수에 비해 생장하는 모근 세포의 수가 현격히 감소하여 성장기 중이라도 조기 탈모현상이 발생한다.

이에, 본 발명자들은 건강한 성인의 피부로부터 신규한 스타필로코커스속 균주를 분리 및 동정하였으며, 상기 신규한 균주 또는 이의 배양물이 피부 뿐만 아니라 모근과 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

일 양상은 기탁번호 KCCM12559P로 기탁된, 스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 신규 에피데르미데스 시카리아(Epidermidis CICARIA) 균주를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 피부 상태 개선용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 기탁번호 KCCM12559P로 기탁된, 스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 신규 에피데르미데스 시카리아(Epidermidis CICARIA) 균주를 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 포함하는 16s rRNA를 가질 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 균주는 모근과 관련된 상태, 또는 피부와 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 상기 모근과 관련된 상태의 예는, 탈모, 모근 약화, 모발 주기의 비정상화 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 피부와 관련된 상태의 예는, 피부 노화, 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 구진인설질환, 곤충 및 기생충 매개 질환, 표재성 피부 진균증, 세균 감염 질환, 바이러스 질환, 성인성 질환, 자가면역 수포성 질환, 결체조직 질환, 색소이상증, 색소성 건피증, 여드름 등을 포함할 수 있다.

다른 양상은 에피데르미데스 시카리아 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

일 구체예에서, 상기 화장료 조성물은 다른 피부재생물질을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

상기 피부재생물질은 예를 들면, 아시아티카, 병풀 추출물 또는 분획물, 예를 들면, 마데카인산(madecassic acid), 또는 마데카소시드(madecassoside) 및 EGF(Epidermal growh factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 화장료 조성물은 피부장벽 강화용, 피부 상처 개선용, 피부 노화 예방 또는 개선용 또는 피부 재생용인 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "배양액"은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 지칭하며, "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있다.

상기 배양액은 스타필로코커스 속 또는 에피데르미데스 시카리아를 배지에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

상기 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 본 발명의 모근과 관련된 상태, 또는 피부와 관련된 상태와 관련된 효과를 나타낼 수 있는 추출물인 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 모두 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "상처"는 외부 자극에 의해 조직이 손상되는 현상을 의미하는 것으로서, 일반적인 상처의 치유는 대개 세포의 변성 및 사멸, 주위의 조직으로부터 유주세포, 조직액의 유출, 및 섬유소의 석출과 육아조직의 형성 등의 과정을 거치게 된다. 상기 상처는 바람직하게 창상에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, "피부 재생"은 전반적인 피부 노화 및 피부에 유발된 상처 등에 대응하여 피부 조직이 재구성되는 일련의 반응을 일컫는 것으로서, 이에 따라 피부 탄력 증진, 주름 개선 효과를 나타낸다. 한편, 상기 상처는 바람직하게 창상에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다. 에피데르미데스 시카리아 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.

또 다른 양상은 에피데르미데스 시카리아 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 피부 상태 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 피부 상태는 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 피부외용제 조성물일 수 있다.

또 다른 양상은 에피데르미데스 시카리아 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 피부 질환은 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 약학적 조성물인 것일 수 있다.

또 다른 양상은 에피데르미데스 시카리아 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 모유두 세포의 성장을 촉진하는 것인 탈모방지 또는 육모촉진용 화장료 조성물인 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발택색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스, 또는 헤어스프레이의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 육모촉진용 화장료 조성물인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "탈모"는 두피로부터 모발이 탈락하는 현상 또는 모발이 성기거나 가늘어지는 상태를 의미하며, "육모 촉진"이라 함은 새로운 모발의 생성 촉진뿐만 아니라 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 것을 의미한다.

또 다른 양상은 에피데르미데스 시카리아 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진용 피부외용제 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 에피데르미데스 시카리아 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 에피데르미데스 시카리아 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 상기 건강기능식품 조성물은 스타필로코커스 속 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상술한 유효성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다. 상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 또는 탈모 및 육모와 관련된 상태일 수 있다. 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.

일 양상에 신규 스타필로코커스 속 균주는 다른 또는 동일 속과 비교하여 계통분류학적, 화학분류학적 구분된 특성을 갖고 있으며, 신규 스타필로코커스 균주 또는 그의 배양액은 피부 관련 상태 또는 탈모 및 육모 관련 상태의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 인간 모근세포에서 CICARIA가 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 2는 인간 모근세포에서 CICARIA가 VEGF 및 FGF-7의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 섬유 아세포에서 CICARIA의 세포 재생 효과를 확인한 결과로서, 양성 대조군인 Centella asiatica 추출물과 CICARIA 및 Centella asiatica 추출물을 함께 처리한 것을 비교하여 나타낸 형광현미경 관찰 결과 및 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 분리

건강한 여성의 피부를 멸균 증류수로 세척하여 확보된 샘플(human epidermal keratinocyte)을 R2A(Reasoner's 2A) 배지(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종하였다. 접종 후 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 배양한 뒤 형성된 집락 100개를 순수 분리 배양하여, 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 재배양 하였다. 배양이 완료된 집락은 16s rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도록 고안(서열번호 2 및 3)되었다. PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시 하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다. 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석 하였다. 상동성 97% 이하의 신규성 있는 종들만 선별하여 사용하였고, 그 중 상동성 94% 이하의 신규 미생물(이하 "CICARIA"라 함)을 선별하였다. CICARIA는 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 서열을 갖는다.

본 발명자들은 상기 에피데르미데스 시카리아 균주를 2019년 6월 11일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM12559P를 부여받았다.

실시예 2. 균주의 활성

3.1. 세포 생존률 변화 분석

CICARIA가 모유두세포에 미치는 변화를 측정하기 위해 Tetrazolium-based colormetric (MTT) assay를 수행하여 모유두세포의 세포독성 및 세포증식을 분석하였다.

구체적으로, 인간 모유두세포인 HFDPC(Human Follicle Dermal Papilla Cells) 세포를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco’smodified Eagle’s Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 양성 대조군으로서, Minoxidil(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 10ppm 용량으로 처리하였다. 또한, CICARIA의 배양물은 0.1%, 1.0%, 및 10.0%의 농도로 처리하였다.

24-웰 플레이트에 HFDPC 세포를 2.0 x 10⁴ cells/well 및 1.0 x 10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 후에 PBS로 세척하고 CICARIA 배양액을 0.1, 1.0, 및 10.0%의 농도로 FBS 제거 배지에 희석하여 제작한 후 처리하였다.

24 시간 및 72시간 배양 후 배지 제거하고 PBS로 세척한 뒤, 0.5 mg/mL 농도의 MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 용액을 200 μl/well 넣어 결정화한 후 4시간 동안 더 배양하였다. MTT시약 제거 후 디메틸설폭시드 (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 용해하여 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 무처리군과 비교하여 생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 CICARIA가 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, CICARIA는 고 농도의 범위에서도 세포에 전혀 독성을 미치지 않음을 알 수 있다.

3.2. 성장인자 유전자 발현 분석

CICARIA의 처리에 따른 모유두세포의 성장인자 유전자인 VEGF(Vascular endothelial growth factor, 혈관 확장 인자), FGF7(Fibroblast Growth Factor 7, 표피세포 성장인자) 발현을 분석하기 위해, 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR)을 수행하였다.

구체적으로, HFDPC 세포 (한국 세포주 은행에서 구입)를 6-웰 플레이트에 3ⅹ10⁵cells/well로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후에, PBS로 세척 후 CICARIA 배양액을 0.1, 1.0, 및 10.0%의 농도로 FBS 제거 배지에 희석하여 제작한 후 처리하고, 상기 배양된 세포주의 양성 대조군으로는 Minoxidil을 10 ppm 용량으로 처리하여 추가로 24시간 및 72시간 동안 배양하였다.

이후에, 세포를 회수하여 트리졸 (RNA iso, DAKARA, 일본) 1 ㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. Nanodrop 2000 (Thermo, USA)을 이용해 RNA를 정량한 후, 42℃에서 55분, 70℃에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 VEGF(혈관 확장 인자), FGF7(표피세포 성장인자)에 대하여 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 실시간 PCR 반응 조건은 95℃, 10분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40 사이클의 조건으로 수행하였고 프라이머 서열은 하기 표 1에 기재하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.

프라이머 이름	서열번호	프라이머 방향	프라이머 서열
VEGF	2	정방향	GTGCCCACTGAGGAGTTCAAC
VEGF	3	역방향	CCCTATGTGCTGGCCTTGAT
FGF7	4	정방향	CATGAACACCCGGAGCACTAC
FGF7	5	역방향	CACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTC
β-actin	6	정방향	GGCCATCTCTTGCTCGAAGT
β-actin	7	역방향	GACACCTTCAACACCCCAGC

도 2는 성장 인자인 VEGF 및 FGF-7의 mRNA 상대 수준(relative level)을 측정한 그래프이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, CICARIA를 처리한 경우 VEGF 및 FGF-7 유전자 발현이 증가 하였음을 확인하였다.

따라서 일 양상에 따른 핵산 단편 혼합물은 VEGF 및 FGF-7 발현을 증가시킴으로써 탈모 방지 및 육모 촉진 효과가 우수함을 알 수 있다.

3.3. 피부 재생 활성 분석

CICARIA의 피부 세포 재생 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.

먼저, 사람 섬유아세포를 6-웰 세포 배양 접시에 4ⅹ10⁵의 밀도로 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 세포 스크래퍼(cell scrapper)를 이용하여 배양된 세포 중심을 긁어낸 후, 1% 농도의 CICARIA 배양액, 1%농도의 Centella asiatica 추출물, 1%농도의 CICARIA와 약초나라 온라인몰에서 구입한 Centella asiatica 추출물을 혼합한 샘플을 각각 첨가하여 24시간 동안 배양하고, 세포 증식된 정도를 형광현미경을 이용하여 촬영하였다.

도 3은 피부 세포 재생 효과를 확인한 결과로서, 세포를 긁어낸 후 24시간 후의 세포의 증식 정도를 촬영한 형광현미경 관찰 결과이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 1%농도의 CICARIA와 Centella asiatica 추출물을 혼합한 것이 세포 증식 정도가 매우 우수함을 확인하였다. 따라서, CICARIA는 피부 세포 재생 상승 효과가 우수함을 알 수 있었다.

한국미생물보존센터

KCCM12559P

20190611

<110> COSMAX, INC. <120> A genus of Staphylococcus strain and uses thereof <130> PN125950 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1470 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Staphylococcus epidermidis CICARIA <400> 1 aggatgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcgaacagac gaggagcttg 60 ctcctctgac gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg ataacctacc tataagactg 120 ggataacttc gggaaaccgg agctaatacc ggataatata ttgaaccgca tggttcaata 180 gtgaaagacg gttatgctgt cacttataga tggatccgcg ccgcattagc tagttggtaa 240 ggtaacggct taccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300 gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg 360 cgaaagcctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt cttcggatcg taaaactctg 420 ttattaggga agaacaaatg tgtaagtaac tatgcacgtc ttgacggtac ctaatcagaa 480 agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg 540 aattattggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg tttattaagt ctgatgtgaa agcccacggc 600 tcaaccgtgg agggtcattg gaaactggaa aacttgagtg cagaagagga aagtggaatt 660 ccatgtgtag cggtgaaatg cgcagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt 720 ctggtctgta actgacgctg atgtgcgaaa gcgtggggat caaacaggat tagataccct 780 ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct 840 gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg 900 aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 960 accttaccaa atcttgacat cctctgaccc ctctagagat agagttatcc ccttcggggg 1020 acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080 cccgcaacga gcgcaaccct taagcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaagttg 1140 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200 tttgggctac acacgtgcta caatggacaa tacaaagggc agcgaaaccg cgaggtcaag 1260 caaatcccat aaagttgttc tcagttcgga ttgtagtctg caactcgact atatgaagct 1320 ggaatcgcta gtaatcgtag atcagcatgc tacggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagc cggtggagta accatttgga 1440 gctagccgtc gaaggtggga caaatgattg 1470 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for VEGF <400> 2 gtgcccactg aggagttcaa c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for VEGF <400> 3 ccctatgtgc tggccttgat 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for FGF7 <400> 4 catgaacacc cggagcacta c 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for FGF7 <400> 5 cactgtgttc gacagaagag tcttc 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for beta-actin <400> 6 ggccatctct tgctcgaagt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-actin <400> 7 gacaccttca acaccccagc 20

Claims

스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 에피데르미데스 시카리아(Staphylococcus epidermidis CICARIA) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 피부재생물질을 추가적으로 포함하는 것인 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부장벽 강화용, 피부 상처 개선용, 피부 노화 예방 또는 개선용 또는 피부 재생용인 것인 화장료 조성물.
스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 에피데르미데스 시카리아(Staphylococcus epidermidis CICARIA) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 피부 재생용 피부외용제 조성물.
스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 에피데르미데스 시카리아(Staphylococcus epidermidis CICARIA) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 모유두세포의 성장을 촉진하는 것인 탈모방지 또는 육모촉진용 화장료 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발택색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스, 또는 헤어스프레이의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 육모촉진용 화장료 조성물.
스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 에피데르미데스 시카리아(Staphylococcus epidermidis CICARIA) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진용 피부외용제 조성물.
스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 에피데르미데스 시카리아(Staphylococcus epidermidis CICARIA) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 에피데르미데스 시카리아(Staphylococcus epidermidis CICARIA) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.