KR20210098689A - 세포자멸사를 유도하는 치환된 아릴우레아 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

세포자멸사를 유도하는 치환된 아릴우레아 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포자멸사를 유도하는 치환된 아릴우레아 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 치환된 아릴우레아 화합물이 암세포의 세포자멸사를 유도하고 암세포의 증식을 억제함으로써 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암 및 피부암과 같은 암질환을 예방, 치료 및 개선할 수 있는 신규 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

Description

세포자멸사를 유도하는 치환된 아릴우레아 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물{SUBSTITUTED ARYLUREA COMPOUNDS FOR INDUCING APOPTOSIS AND COMPOSITION FOR ANTICANCER COMPRISING THE SAME}
본 발명은 세포자멸사를 유도하는 치환된 아릴우레아 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
세포가 죽는 과정에는 세 가지가 있다. 이 중 외부적 문제에 의해 손상된 세포가 그 외부의 요인으로 인하여 죽게 되는 경우를 괴사(Necrosis)라 부른다. 이에 반해 세포가 감염되거나 손상을 받은 경우나 수명이 다한 경우에는 종종 세포 스스로에 의해 조절되는 세포의 자살이 일어나게 되는데, 이를 세포자멸사(Apoptosis)라고 부른다. 또 세포가 스스로를 먹다가 죽는 경우를 자가포식(Autophagy)이라고 부른다. 이 과정 동안에는 DNA가 잘리며, 세포 내 소기관들과 세포질 성분이 조각나게 된다. 이때 나오는 단백질이나 핵산 조각들은 다른 세포에게 흡수되어 재활용된다. 다른 말로는 세포예정사(Programmed Cell Death)라고도 하는데, 세포가 죽도록 되어있는 특별한 프로그램(자살의 신호)을 통해서 세포가 자살을 하는 것이다.
예정된 세포자멸사(Apoptosis)는 생물체들의 발생과 분화에서 일어나는 필수적인 요소다. 예를 들어 자궁 속 태아는 손이 주걱 모양으로 생성된 뒤 손가락 사이 세포가 죽으면서 손가락의 형태를 갖추게 되며, 다른 예시로는 올챙이가 개구리가 되는 과정에서 꼬리가 없어지는 경우를 들을 수 있다. 즉, 이 프로그램이 제대로 작동하지 않을 경우에는 동물에서 구조적 이상을 일으킬 수 있다는 사실을 내포한다. 그리고 세포자멸사(Apoptosis)를 일으키는 부위에 이상이 생기거나, 세포가 세포 자살을 시키는 물질에 면역을 가지고 있어 자살이 일어나지 않으면 암이 생길 수도 있다.
세포자멸사는 type-I(아포토시스; apoptosis)과 type-Ⅱ(자가탐식; autophagic cell death) 두 가지 형태가 있다. 일반적으로 type-I 자기사멸 현상은 염색사(Chromatin)의 응축(Condensation)과 DNA의 단편 형성 그리고 작은 세포 조각(Apoptotic body)들이 생성되는 과정으로 진행된다. 세포자멸사에 의한 과정은 주변 세포의 탐식 작용(phagocytosis)으로 염증을 유발하지 않는 것이 특징이다.
보통 DNA에 변이가 일어나면 p53이나 pRb 같은 단백질이 DNA 교정을 하지만, 이런 방법으로도 통하지 않을 때 쓰는 최후의 수단이 세포 자살이다. 즉, p53이나 pRb와 같은 단백질을 구성하는 DNA에 문제가 생기거나 돌연변이가 생길 경우엔 세포에 문제가 있어도 자살하지 않고 계속 자라게 되며, 결국 암세포로 변할 가능성이 매우 높아진다.
내인성 경로(Intrinsic Pathway)는 세포가 스스로 DNA에 심각한 문제가 생겼다고 느끼는 경우 벌어진다. 일단 미토콘드리아 막이 쪼개지면서 막에 붙어있던 자폭 단백질들이 세포질 속으로 노출되고, 자폭 단백질 중 하나인 사이토크롬 C(Cytochrome C)은 APAF-1과 결합하여 아팝토좀(Apoptosome)을 형성하고, 프로카스파제(Pro-caspase)-9의 말단에 결합해 카스파제-9를 활성화시키며, 연이어 세포자멸사(Apoptosis)의 실행에 관여하는 카스파제-3과 카스파제-7을 활성화시킨다.
또한 외인성 경로(Extrinsic Pathway)에서 자살 신호 수용체(Death receptor)는 세포표면에 존재하는데, 세포에 죽음을 유도하는 물질들을 인지하고 수용하여 세포 내로 신호 전달하는 기능을 한다. 예로 FAS receptor는 바깥쪽에는 시스테인이 많고, 세포 안쪽에 사멸영역(death domain)을 가지고 있는 막단백질이다. 이러한 수용체에 이를 활성화할 수 있는 FAS ligand등이 결합될 경우 수용체의 구조가 변화하면서 사멸영역(death domain)이 활성화하게 되고 이는 비활성 상태인 Pro-caspase를 활성화하여 카스파제를 만들어내게 된다. 카스파제-3과 카스파제-7이 활성화되면 세포자멸사(Apoptosis)로 세포 죽음을 유도하는 물질에 반응하여 세포를 분해하기 시작한다.
암세포는 활발하게 분화하기 때문에 세포사멸에 의한 영향이 정상세포보다 훨씬 크게 되므로 세포사멸을 유도함으로써　암세포를 죽이고자 하는 시도가 항암제 개발에서 활발하게 연구되고 있다. 따라서　카스파제　효소를 활성화하는 물질은 항암제로의 유용성을 갖는다.
이에 본 발명자들은 세포자멸사의 유도에 관여하는 단백질인　카스파제　효소를 활성화하여 세포사멸 기능을 촉진시킴으로써　암세포의 증식을 억제할 수 있는 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 지금까지 보고되지 않은 신규한 다이아릴우레아 유도체 화합물을 합성하였다. 상기 화합물은 약물이 가져야 할 분자량과 유동성(flexibility)을 적절히 가진 구조로서, 카스파제 효소를 활성화하여 암세포의 세포사멸을 촉진시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Susan Elmore, Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death ToxicolPathol, 35(4), 495-516 (2007)
상기와 같은 문제 해결을 위하여, 본 발명은 암세포의 증식을 억제할 수 있는 신규한 화합물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 화합물을 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
일반적으로 아릴우레아 유도체는 생화학적 효과와 제약 응용에서 광범위한 스펙트럼을 가지고 있다. 최근 몇 년 동안 항암제(antitumor agents) 계열의 아릴우레아 유도체를 설계하고 개발하는데 초점을 맞춘 많은 연구가 진행되어 왔다. 여기에는 소라페닙(sorafenib), 레고라페닙(regorafenib), 리니파닙(linifanib), 티보자닙(tivozanib) 및 렌바티닙(lenvatinib)과 같이 임상 시험에 있거나 임상으로 사용되고 있는 몇몇 아릴우레아 유도체가 있다. 아릴우레아 유도체 중 소라페닙(Sorafenib)의 구조활성 상관관계(structure activity relationship; SAR) 연구에 따르면 아릴우레아 부분이 수소결합과 소수성 상호작용을 통해 키나제도메인의 소수성 포켓과 결합을 하기 위해 필요한 중요한 구조성분을 제공하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 소라페닙 구조에서 아릴우레아 구조는 유지하면서 pyridyl ring group을 대체하는 새로운 치환체를 도입하여 암세포 사멸에 우수한 효과를 보이며, 수용체 티로신 키나제 억제제로 작용하는 다이아릴우레아 유도체의 신규 화합물을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 신규 화합물은 치환된 아릴우레아 화합물로, 상기 화합물은 따른 치환된 아릴우레아 화합물은 암세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도함으로써 암질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 약물 및 식품에 적용 가능한 이점이 있다.
구체적으로 본 발명의 치환된 아릴우레아 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 1이다.
[화학식1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 탄소수가 1 내지 10의 저급 알킬, 탄소수가 1 내지 10의 저급 알콕시 및 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 탄소수가 1 내지 10의 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택된 것이고, R6은 피리미딘 유도체, 티아졸 유도체, 사이클로헥사놀 유도체, 퓨린 유도체, 이미다졸 유도체 및 사이클로프로판아민 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
본 발명에 있어서, 용어 '할로겐'은 클로로, 플루오로, 브로모 및 요오드를 의미한다.
상기 화학식 1에서 R6은 구체적으로 하기 화합물 2 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것일 수 있다:
하기 화학식 2로 표시되는 화합물 2;
[화학식 2]
Figure pat00002
하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 3;
[화학식 3]
Figure pat00003
하기 화학식 4로 표시되는 화합물 4;
[화학식 4]
Figure pat00004
하기 화학식 5로 표시되는 화합물 5;
[화학식 5]
Figure pat00005
하기 화학식 6로 표시되는 화합물 6; 및
[화학식 6]
Figure pat00006
하기 화학식 7로 표시되는 화합물 7.
[화학식 7]
Figure pat00007
본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학적 또는 식품학적으로 허용된 염은 인체에 독성이 낮고 모화합물의 생물학적 활성과 물리화학적 성질에 악영향을 주지 않아야 한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염은 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 한 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 바람직한 상기 무기산염의 예로는 염산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 수 있다. 바람직한 상기 유기산염의 예로는 말레산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염,에디실염, 트리플루오로아세트산염, 아세트산염, 프로피온산염, 글리콜산염, 석신산염, 푸마르산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 벤조산염 또는 살리실산염일 수 있다. 바람직한 상기 금속염는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염일 수 있고, 구체적인예로는 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염, 칼륨염 또는 암모늄염일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 예로서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 1은 피리미딘 유도체, 티아졸 유도체, 사이클로헥사놀 유도체, 퓨린 유도체, 이미다졸 유도체, 사이클로프로판아민 유도체 및 여러가지 화합물들을 커플링하여 다양한 화합물들을 합성할 수 있는데, 이의 예로는 하기 화합물 8 내지 11이다:
하기 화학식 8로 표시되는 화합물 8;
[화학식 8]
Figure pat00008
하기 화학식 9로 표시되는 화합물 9;
[화학식 9]
Figure pat00009
하기 화학식 10으로 표시되는 화합물 10; 및
[화학식 10]
Figure pat00010
하기 화학식 11로 표시되는 화합물 11.
[화학식 11]
Figure pat00011
또한 본 발명의 하나의 구체적 예로서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 1은 여러가지 화합물들을 커플링하여 다양한 화합물들을 합성할 수 있는데, 이의 추가적인 예로는 하기 화합물 12 및 13이다:
하기 화학식 12로 표시되는 화합물 12; 및
[화학식 12]
Figure pat00012
하기 화학식 13으로 표시되는 화합물 13.
[화학식 13]
Figure pat00013
한편, 본 발명의 항암용 조성물은 상기 화합물 1을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 화합물 1은 상기 화합물 8 내지 13으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것일 수 있다.
상기 항암용 조성물은 약학적으로 허용가능한 1종 이상의 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 희석제 또는 부형제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 항암용 조성물은 제2의 항암제 또는 항암보조제를 포함할 수 있다. 상기 제2의 항암제 또는 항암보조제로는 인터페론(interferon), 인터루킨-2(interleukin-2), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastin), 독소루비신(doxorrubicin), 에토포시드(etoposide), 이리노테칸히드로클로라이드(irinotecan hydrochloride), 시스플라틴(cisplatin), 암사크린(amsacrine), 사이토신아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루오로우라실(fluoro uracil) 및 탁솔(taxol)을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 항암용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제는 상기 히드록시메톡시칼콘 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
이때, 상기 항암용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 항암용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 항암용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 암질환은 전립선암, 위암, 만성 또는 급성 백혈병, 혈액암, 뇌종양, 방광암, 자궁내막암, 자궁경부암, 간암, 직장암, 유방암, 대장암, 피부암, 폐암, 난소암, 흑색종, 췌장암, 다도암, 림프종 및 신경아세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 전립선암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 항암용 조성물은 암세포에서 카스파제 효소의 활성화를 통해 세포자멸사를 일으켜 세포 사멸 효과를 나타냄으로써 암세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한 암세포의 증식을 효과적으로 억제함으로써 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 아울러 상기 항암용 조성물은 다른 항암제로 치료에 반응성이지 않거나, 이러한 다른 항암제에 대해 내성이 발달된 환자를 치료하는데 효과적일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 화합물 1, 바람직하게는 상기 화합물 8 내지 13으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 항암용 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 개선을 위한 식품을 제공할 수 있다.
상기 식품은 상기 화합물 1을 유효성분으로 하여 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물과 암질환의 예방 및 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
상기 식품은 음료(알코올성 음료포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스등) 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 화합물 1을 포함하는 항암용 조성물을 개체에 투여하여 개체 내 기관에 존재하는 카스파제를 활성화시켜 암세포의 증식억제 또는 세포자멸사 유도 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 상기 항암용 조성물을 개체 내 기관에 존재하는 카스파제를 활성화시킴으로써 암세포의 세포자멸사를 유도하고, 암세포의 증식을 억제함으로써 암질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 화합물 1을 포함하는 항암용 조성물을 이용하여 암을 예방하거나 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 치료방법은 상기 항암용 조성물을 약학적 유효량으로 인체 내에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 항암용 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 비 경우 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함될 수 있다. 바람직한 투여방식은 정맥 주사, 피하주사, 피내주사제, 근육주사 및 점적 주사일 수 있다.
상기 항암용 조성물의 투여량은 다양한 요소에 의해 달라질 수 있으며, 그 투여 경로 또한 환자의 연령, 투여기간, 체중, 질환의 중증도, 환자의 의식 여부, 병용 약물의 종류 등과 같은 다양한 요소에 의해 경구 또는 비경구의 다양한 투여 경로를 사용할 수 있다. 또한 각각을 별개로 동시 또는 연쇄적으로 혹은 시간을 두고 별개로 투여하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 항암용 조성물 또는 항암 보조제를 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 항암용 조성물 또는 항암 보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.
본 발명에 따른 치환된 아릴우레아 화합물은 암세포의 세포자멸사를 유도하고 암세포의 증식을 억제함으로써 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암 및 피부암과 같은 암질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 약물 및 식품에 적용 가능한 이점이 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 화합물 2의 제조방법:
(단계 1) N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine의 합성
Figure pat00014
반응기에 N-(2-methyl-5-nitrophenyl)guanidium HCl 염(4.61g)과 IPA(100ml)를 투입하여 교반 용해하였다. 3-dimethylamino-1-(3-pyridyl)-2-propen-1-one(3.52g), K2CO3(6.22g)을 투입하고 반응물을 가열하여 24시간 동안 환류시켰다. 반응이 완료되면 반응물을 상온으로 냉각시키고 석출된 고체를 여과하였다. 고체를 모아서 H2O(100ml)에 투입하고 상온에서 1시간 교반하고 여과하고 cold IPA(10ml)로 세척하여 미색의 고체로 N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (5.23g, 수율=85%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.48 (d, J=2.25Hz, 1H), 9.27 (d, J=1.5Hz, 1H), 8.75 (d, J=5.0Hz, 1H), 8.58 (d, J=5.25Hz, 1 H), 8.53 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.85 (dd, J=8.5, 2.25Hz, 1H), 7.48 (dd, J=8.5, 5.0Hz, 1H), 7.34 (d, J=8.5Hz, 1H), 7.32 (d, J=5.25Hz, 1H), 7.15 (bs, NH), 2.48 (s, CH3,3H)
(단계 2) 6-methyl-N1-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine의 합성
Figure pat00015
1L 수소반응기에 N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine(5g)과 THF(150ml)를 투입하여 용해한 후 PtO2·H2O(1g)을 투입하고 내부압력 60 psi, 상온에서 2시간 반응하였다. 반응이 완료되면 여과하여 촉매를 제거하고 THF(50ml)로 세척한 후 감압 농축하였다. EA(50ml)를 투입하고 다시 감압 농축한 후 얻어진 잔사에 EA(30ml)를 투입하여 용해한 후 n-Hexane(90ml)를 천천히 투입하여 결정화를 진행하였다. 상온에서 1시간 교반한 후 여과하고 n-Hexane (20ml)으로 2회 세척하여 노란색 고체로 6-methyl-N1-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine (4.2g, 수율=93.1%)를 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.25 (dd, J=2.3, 0.7Hz, 1H), 8.73~8.67 (m, 2H), 8.47 (d, J=5.1Hz, 1H), 8.43~8.39 (m, 1H), 7.54 (ddd, J=8.0, 4.8, 0.8Hz, 1H), 7.37 (d, J=5.1Hz, 1H), 6.87 (d, J=8.2Hz, 1H), 6.77 (d, J=2.3Hz, 1H), 6.33 (dd, J=8.0, 2.3Hz, 1H), 4.87 (s, 2H), 2.06 (s, CH3, 3H)
제조예 2: 화합물 3의 제조방법
(단계 1) 2-tertbutylcarbonylamino-N-(2-chloro-6-methylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide의 합성
Figure pat00016
반응기에 2-tertbutylcarbonylamino-aminothiazole-5-carboxylic acid(50g), chlorobenzene(1000ml), DMF(1.5g), SOCl2(48g)을 투입하고 반응물 온도를 40℃로 가열한 후 1시간 반응하였다. 반응이 완료되면 55~65 ℃에서 전체 반응물이 약 250ml가 되도록 감압 농축하였다. 다른 반응기에 2-chloro-6-methylaniline(24g), chlorobenzene(150ml), Pyridine(81g)을 투입하고 반응물 온도가 90~100℃가 되도록 가열한 후 농축한 반응물을 30분에 걸쳐 천천히 투입하고 3시간 반응하였다. 반응이 완료되면 in-situ 상태의 커플링 화합물을 0~5℃로 냉각하고 2시간 교반하였다. 석출된 고체를 여과한 후 얻어진 미색의 고체를 반응기에 투입하고 메탄올(250ml), 10% K2CO3 용액(100ml)를 투입하고 상온에서 3시간 교반하였다. 여과하고 메탄올(50ml)로 2회 세척하여 45~50℃에서 10~12시간 진공 건조하여 흰색 고체로 2-tertbutylcarbonylamino-N-(2-chloro-6-methylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide(55g, 수율=73%)를 얻었다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 11.22 (bs, 1H), 11.05 (bs, 1H), 8.15 (s, 1H), 7,38~7.21 (m, 3H), 2.18 (s, CH3, 3H), 1.26 (s, CH3 x 3, 9H)
(단계 2) 2-amino-N-(2-chloro-6-methylphenyl)thiazole-5-carboxamide의 합성
Figure pat00017
반응기에 2-tertbutylcarbonylamino-N-(2-chloro-6-methylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide(10g)과 DCM(200ml)를 투입하여 용해한 후 TFA(1ml)를 천천히 투입하고 상온에서 3시간 반응하였다. 반응이 완료되면 35~40℃에서 감압 농축한 후 잔사를 EA(300ml)로 용해하였다. 유기층을 포화 소금물(150ml), 5% NaHCO3 용액(150ml), H2O(150ml) 순으로 세척한 후 무수 Na2SO4로 건조하고 여과하고 EA(50ml)로 세척하였다. 여액을 35~40℃에서 감압 농축한 후 잔사에 EA(20ml)를 투입하여 용해한 후 n-Hexane(60ml)를 천천히 투입하여 결정화를 진행하였다. 상온에서 1시간 교반 후 여과하고 n-Hexane(10ml)로 2회 세척하여 미색의 고체로 2-amino-N-(2-chloro-6-methylphenyl)thiazole-5-carboxamide (6.2g, 수율=85.2%)를 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.66 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.63 (s, 2H), 7.38 (dd, J=7.5, 1.7Hz, 1H), 7.29~7.20 (m, 2H), 2.21 (s, CH3, 3H)
제조예 3: 화합물 4의 제조방법
(단계 1) 2-(1-hydroxycyclohexyl)-2-(4-methoxyphenyl)acetonitrile의 합성
Figure pat00018
반응기에 p-Methoxyphenyl acetonitrile(50g)과 Cyclohexanone(50g)을 투입한 후 반응물 온도를 10~15℃로 조절하였다. DBU(5.2g), H2O(54ml), 45% KOH 용액(10.8g)과 메탄올(50ml)를 투입한 후 15~20℃에서 24시간 반응하였다. 반응이 완료되면 반응물 내부온도를 15~25℃로 유지하며 1N HCl 용액(200ml)를 가해 반응을 종결시키고, 15~20℃에서 교반하며 결정화 하였다. 2시간 교반한 후 여과하여 석출된 고체를 모으고 H2O(500ml)를 이용하여 2회 이상 세척한 후 (EA:n-Hex.=1:4) 용매(250ml)를 가해 세척하였다. 50~60℃에서 6~8시간 건조하여 흰색 고체로 2-(1-hydroxycyclohexyl)-2-(4-methoxyphenyl)acetonitrile (75g, 수율=90%)를 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.21 (d, J=8.7Hz, 2H), 6.85 (d, J=8.7Hz, 2H), 3.74 (s, OCH3, 3H), 3.66 (s, 1H), 1.0~1.6 (m, cyclohexyl, 10H)
(단계 2) 1-(2-amino-1-(4-methoxyphenyl)ethyl)cyclohexanol의 합성
Figure pat00019
1L 수소반응기에 2-(1-hydroxycyclohexyl)-2-(4-methoxyphenyl)acetonitrile(50g), AcOH(100ml)와 메탄올(300ml)를 투입한 후 Ra-Ni(10g)을 투입하고 내부압력 60 psi, 상온에서 20~30시간 반응하였다. 반응이 완료되면 여과하여 Ra-Ni을 제거하고 메탄올(100ml)로 세척한 후 감압 농축하였다. Xylenes(200ml)를 투입하고 감압 농축하여 잔류 AcOH를 제거한 후 EA(250ml)를 투입하여 결정화를 진행하였다. 상온에서 1시간 교반한 후 여과하고 EA(200ml)로 2회 세척하여 흰색 고체로 1-(2-amino-1-(4-methoxyphenyl)ethyl)cyclohexanol (38.1g, 수율=75%)를 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.14 (d, J=8.7Hz, 2H), 6.85 (d, J=8.7Hz, 2H), 3.73 (s, OCH3 , 3H), 3.18 (dd, J=12.6, 5.9Hz, 1H), 2.93 (dd, J=12.5, 8.5Hz, 1H), 2.60 (dd, J=8.3, 6.0Hz, 1H), 1.83 (s, 3H), 1.63~1.39 (m, 5H), 1.33 (d, J=8.4Hz, 3H), 1.09 (dd, J=21.2, 8.8Hz, 2H), 0.95(d, J=12.1Hz, 1H)
제조예 4: 화합물 5의 제조방법
(단계 1) 2-Amino-9-(ethyl 2-carboethoxybutanoate-4-yl) purine의 합성
Figure pat00020
반응기에 2-amino-6-chloropurine(19.5g), K2CO3(23.8g), triethyl 3-bromopropane-1,1,1-tricarboxylate(43.3g)과 DMF(92.6g)을 투입하였다. 반응물 온도를 50~55 ℃로 가열한 후 48시간 반응하였다. TLC (DCM:메탄올=15:1, 2-amino-6-chloropurine Rf=0.2)에서 출발물질이 사라짐을 확인하면, in-situ 상태의 커플링 화합물을 15~25 ℃로 냉각하고 DCM(133g)과 H2O(100g)를 넣고 20분 교반하여유기층(하층)을 분리한 후 물층(상층)을 DCM(66g)으로 추가 추출하고, 모든 유기층을 H2O(100g)으로 세척 후 유기층을 60 ~ 65 ℃에서 감압 농축하였다. 메탄올(600ml)를 투입하여 용해한 후 10 % Pd/C(1.2g)과 ammonium formate(43.5g)을 투입하였다. 반응물을 50~55 ℃로 가열한 후 2시간 반응하였다. TLC (DCM:메탄올=15:1, 커플링 화합물 Rf=0.5)로 반응이 완료되면 in-situ 상태의 dechloride 화합물을 20~25 ℃로 냉각시킨 후 여과하여 Pd/C을 제거하였다. 메탄올 (30g)로 세척하고 여액을 40~45 ℃ 에서 감압 농축한 후 DCM(200g) 투입하고 30분간 교반하였다. 반응물을 여과하여 생성된 고체 (ammonium formate)를 제거하고, DCM(30g)으로 세척하고 여액을 30~35 ℃에서 감압 농축하였다. 무수 에탄올(340ml)를 투입하여 용해한 후 NaOEt(18.8g)을 투입하고 15~30 ℃에서 3시간 반응하였다. TLC (DCM:메탄올=15:1 x 2회, dechloride 화합물 Rf=0.5)에서 반응이 완료되면 in-situ 상태의 diester 화합물 반응액을 여과하고 EtOH(10g)으로 세척한 후 생성된 고체를 회수하였다. 회수된 고체에 DCM(260g)를 넣은 후 30분간 교반하였다.AcOH(10.3g)을 천천히 넣어서 pH 4~5로 조절한 후 H2O(200g)를 넣은 후 30분간 교반한 후 유기층을 분리하고 유기층에 NaHCO3(14.4g)과 H2O(200g)을 투입하고 30분간 교반하여 pH 6~7로 조절하였다. 분리한 유기층에 활성탄(1g)과 anhy. MgSO4(2.5g)를 넣은 뒤 30분간 교반한 후 여과하고 DCM(30g)으로 세척하였다. 여액을 30~35 ℃에서 감압 농축한 후 IPA(29g)을 투입하고 반응물을 55~60 ℃로 가열하여 용해한 후 다시 20~25 ℃로 온도를 서서히 낮춘 후 2시간 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고 IPA(30g)으로 세척한 후 45~50 ℃에서 12~15시간 진공건조를 하여 2-Amino-9-(ethyl 2-carboethoxybutanoate-4-yl) purine (15.12g, 수율=44.7%)를 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.56 (s. 1H), 8.01 (s, 1H), 6.50 (bs, NH2), 4.13 (m, 2H), 4.04 (m, 4H), 3.47 (t, 2H), 2.34 (m, 2H), 1.13 (m, 6H)
(단계 2) 2-(2-(2-amino-9H-purin-9-yl)ethyl)propane-1,3-diacetate의 합성
Figure pat00021
반응기에 2-Amino-9-(ethyl 2-carboethoxybutanoate-4-yl)purine(15.12g)과 메탄올(120g)을 투입하여 용해하였다. 반응물 온도를 20~40 ℃로 유지하며 Sodium borohydride(10.6g)을 2시간 동안 서서히 투입한 후 2시간 반응하였다. 반응이 완료되면 in-situ 상태의 diol 화합물에 H2O(230g)을 투입한 후 35% 염산 용액(22.7g)을 가하여 pH를 6~7로 조정하였다. 반응물을 55~60℃에서 감압 농축한 후 무수에탄올(120g)을 가하여 20~30℃에서 30분 교반하였다. 생성된 이물을 여과하여 제거한 후 무수에탄올(20g)으로 세척하였다. 여액에 Succinic acid(11.12g)을 투입하고 20~30 ℃에서 4시간 교반하여 생성된 결정을 여과한 후 무수에탄올(50g)로 세척하고 55~60 ℃에서 15~20시간 진공 건조하여 2-(2-(2-amino-9H-purin-9-yl)ethyl)propane-1,3-diol succinic acid(14.1g, 수율=84.2%)를 얻었다. 반응기에 2-(2-(2-amino-9H-purin-9-yl)ethyl)propane-1,3-diol succinic acid(14.1g), DCM(180g), Triethylamine(20.1g)과 4-Dimethylaminopyridine(0.5g)을 투입하고 교반 중에 Acetic anhydride(8.3g)을 추가로 투입하였다. 반응액을 20~30 ℃에서 2시간 동안 교반하고 55~60 ℃에서 완전히 감압 농축하였다. 잔사에 H2O(65g)과 DCM(85g)을 투입하고 30 분간 교반한 후 층 분리하였다. 층 분리한 유기층에 anhy. MgSO4(2.5g)을 가하여 30 분간 교반하고 여과한 후 DCM(30g)으로 세척하였다. 여액을 35~40 ℃에서 감압 농축한 후 잔사에 1-Butanol(45g)을 가하고 55~60 ℃로 가온하여 용해시켰다. 용액을 20~25 ℃로 냉각하고 2 시간 동안 교반하여 생성된 결정을 여과한 후 1-Butanol(50g)으로 세척하고 60~65 ℃에서 15~20시간 진공 건조하여 2-(2-(2-amino-9H-purin-9-yl)ethyl)propane-1,3-diacetate (10.8g, 수율=84.8%)를 얻었다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.57 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 6.51(s, NH2), 4.13 (t, J=7.1Hz, 3H), 4.02 (d, J=5.5Hz, 5H), 1.99(s, 7H), 1.96~1.82 (m, 4H)
제조예 5: 화합물 6의 제조방법
3-(trifluoromethyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-1-yl)benzenamine의 합성
Figure pat00022
반응기에 3-bromo-5-(trifluromethyl)aniline(27) 4.8g, 4-methylimidazole(1.97g), K2CO3(3.04g), CuI (0.57g), 8-hydroxyquinoline(0.44g)과 DMSO (20ml)를 투입하고 질소 bubbling으로 내부를 치환한 후 질소풍선을 장착하였다. 반응물 온도를 120 ℃로 가열한 후 15시간 반응하였다. 반응이 완료되면 반응물을 45~50℃로 냉각한 후 14% 암모니아수 용액(20ml)를 투입하고 1시간 교반하였다. 반응물을 상온으로 냉각하고 EA(30ml), H2O(30ml)를 투입하고 30분 교반한 후 층 분리하였다. 하부의 수층에 EA(30ml)를 투입하고 30분 교반 후 층 분리하였다. 유기층을 모아서 short silica gel column을 통과시켜 green-blue Cu salt를 제거하고 EA(30ml)로 세척하였다. 여액을 35~40 ℃에서 감압 농축한 후 잔사에 EA(20ml)를 투입하여 용해한 후 n-Hexane(40ml)를 천천히 투입하여 결정화를 진행하였다. 상온에서 1시간 교반한 후 여과하고 n-Hexane(10ml)로 2회 세척하여 미색의 고체로 3-(trifluoromethyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-1-yl)benzenamine(2.44g, 수율=50%)를 얻었다. 여액은 다시 농축한 뒤 5% 메탄올-DCM eluent 하에서 silica gel column을 진행하여 2nd crop. 3-(trifluoromethyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-1-yl)benzenamine (1.22g, 수율=25%)를 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (d, J=1.3Hz, 1H), 7.37 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.92 (t, J=1.8Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 5.88 (s, 2H), 2.15 (s, CH3, 3H)
제조예 6: 화합물 7의 제조방법
(1R,2S)-2-(3,4-difluorophenyl)cyclopropanamine R-Mandelic acid 염의 합성
Figure pat00023
반응기에 trans (1R,2S)-2-(3,4-Difluorophenyl)cyclopropyl carboxylic acid(1.78g), Triethylamine (2.7ml)와 아세톤/H2O (10:1) 용액 (23ml)틀 투입하고 반응물 온도를 0~5℃로 냉각하였다. Ethylchloroformate(2ml)를 약 5분에 걸쳐 천천히 투입하고 1시간 반응하였다. 반응이 완료되면 in-situ 상태의 acid chloride 화합물에 NaN3(1.52g)을 H2O(6ml)에 용해한 용액을 투입하고 1시간 반응하였다. 반응이 완료되면 in-situ 상태의 azide 화합물에 H2O(350ml)를 투입하여 반응을 종결시키고 Toluene(100ml)로 3회 추출한 후 무수 Na2SO4로 건조하고 여과하여 Toluene(50ml)로 세척하였다. 여액을 가열하여 2시간 환류시킨 후 상온으로 냉각하였다. 6N HCl 용액(50ml)를 투입하고 반응물을 가열하여 3시간 환류시킨 후 상온으로 냉각하였다. H2O(150ml)를 투입한 후 2N NaOH 용액으로 반응물 pH를 9~10으로 조절한 후 DCM(100ml)로 3회 추출한 후 무수 Na2SO4로 건조하고 여과한 후 DCM(50ml)로 세척하였다. 모아진 여액을 35~40 ℃에서 감압 농축한 후 잔사에 무수 에탄올(10ml)를 투입하여 용해한 후 R-Mandelic acid(1.48g)을 무수에탄올(20ml)에 용해한 용액을 천천히 투입하여 결정화를 진행하였다. 상온에서 1시간 교반한 후 여과하여 석출된 고체를 모으고 무수에탄올(10ml)로 2회 세척한 후 45~50℃에서 10~12시간 진공 건조하여 흰색 고체로 (1R,2S)-2-(3,4-difluorophenyl)cyclopropanamine R-Mandelic acid (2.3g, 수율=80%)를 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.40~7.11 (m, 7H), 6.95 (ddd, J=8.5, 4.1, 1.6Hz, 1H), 4.73 (s, 1H), 2.57 (ddd, J=7.7, 4.4, 3.4Hz, 1H), 2.01 (ddd, J=9.3, 6.0, 3.3Hz, 1H), 1.16~1.10(m, 1H), 1.05 (dt, J=7.5, 5.8Hz, 1H)
실시예 1: 화합물 8의 제조방법:
1-(3-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)-4-methylphenyl)-3-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl) urea의 합성
[반응식 1]
Figure pat00024
반응기에 화학식 2의 화합물 6-methyl-N1-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)-benzene-1,3-diamine (1.39g)과 DCM(25ml)를 투입하고 상온에서 교반하였다. 반응물은 맑은 갈색의 용액이 되었다. 1-chloro-2-(trifluoromethyl)-4-isocyanatobenzene(1.33g)을 천천히 한번에 투입하였다. 반응물이 24~31℃로 발열되며, yellow에서 light brown suspension으로 형상이 바뀌었다. 상온에서 12시간 교반하여 반응을 완결하였다. 생성된 고체를 여과하고 DCM(10ml)로 2회 세척하고 40℃ 진공건조기에서 건조하여 Ivory solid로 1-(3-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)-4-methylphenyl)-3-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)urea (2.32g, 수율=93%)를 얻었다.
HPLC method로 측정한 순도는 99.8%이다.
화합물 8의 제조확인
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.25 (d, J=1.56Hz, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.65~8.63( dd, J=1.57, 1.57Hz, 1H), 8.47 (d, J=5.09Hz, 1H), 8.46~8.435 (dt, J=1.96, 1.96Hz, 1H), 8.08(d, J=2.34Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.60~7.53 (m, 2H), 7.48~7.44(dd, J=4.70, 4.70Hz, 1H), 7.38 (d, J=5.09Hz, 1H), 7.11 (d, J=1.17Hz, 1H), 2.17 (s, CH3, 3H)
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 162.0, 161.4, 159.8, 152.8, 151.7, 148.6, 139.8, 138.4, 137.5, 134.8, 132.6, 132.3, 130.6, 127.2, 126.9, 126.2, 124.1, 123.3122.5, 121.9, 117.0, 115.5, 115.3, 108.0, 17.9
실시예 2: 화합물 9의 제조방법:
1-(5-(2-chloro-6-methylphenylcarbamoyl)thiazol-2-yl)-3-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)urea의 합성
[반응식 2]
Figure pat00025
반응기에 화학식 3의 화합물 2-amino-N-(2-chloro-6-methylphenyl)thiazole-5-carboxamide(1.34g)과 THF(25ml) 투입하고 상온에서 교반하였다. 반응물은 맑고 옅은 노란색 용액이 되었다. 1-chloro-2-(trifluoromethyl)-4-isocyanatobenzene(1.33g)을 천천히 한번에 투입하였다. 반응물이 24~28℃로 발열되며, light yellow solution 상태를 유지하였다. 상온에서 교반하며 12시간 반응하였다. TLC 확인하여 반응이 완결되면, 40℃에서 감압 농축한 후 생성된 oily solid를 EA(20ml) 투입하여 용해하였다. 상온에서 교반하며 n-Hexane(75ml)를 30분~1시간 동안 천천히 투입하여 흰색 고체가 석출되도록 유도하였다. 상온에서 2시간 교반한 후 고체를 여과하고 n-Hexane(10ml)로 2회 세척하고 40℃ 진공건조기에서 건조하여 white solid로 1-(5-(2-chloro-6-methylphenylcarbamoyl)thiazol-2-yl)-3-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)urea (1.92g, 수율=78%)를 얻었다.
HPLC method로 측정한 순도는 99.3% 이다.
화합물 9의 제조확인
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.25 (bs, 1H), 9.97 (s, 1H), 9.48 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.09(d, J=2.35Hz, 1H), 7.73~7.70 (dd, J=2.74Hz, 2.34, 1H), 7.63~7.61 (d, J=9.0Hz, 1H), 7.37~7.35 (dd, J=1.95, 1.95Hz, 1H), 7.26~7.20 (m, 2H), 2.17 (s, CH3, 3H)
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 159.7, 139.1, 138.7, 133.6, 132.7, 132.5, 129.4, 128.7, 127.4, 127.3, 127.2, 127.0, 126.7, 124.5, 124.1, 123.9, 121.8, 117.8, 18.7
실시예 3: 화합물 10의 제조방법:
1-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-3-(3-(trifluoromethyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-1-yl)phenyl)urea의 합성
[반응식 3]
Figure pat00026
반응기에 화학식 6의 화합물 1-(2-amino-1-(4-methoxyphenyl)ethyl)-cyclohexanol(1.55g), DCM(25ml)와 H2O(25ml)를 투입하고 상온에서 교반하였다. 25% NaOH 용액(2ml) 투입하면 반응물은 맑은 용액이 되었다. 상온에서 30분 교반 후 층 분리하여 하층의 유기층을 모았다. 1-chloro-2-(trifluoromethyl)-4-isocyanatobenzene(1.33g)을 천천히 한번에 투입하고 상온에서 교반하며 3시간 동안 반응하였다. TLC 확인하여 반응이 완결되면, 40 ℃에서 감압 농축한 후 생성된 yellowish oily solid에 n-Hexane (50ml) 투입하였다. 반응물을 가열하여 30분 정도 환류시킨 후 hot filter하여 고체를 여과하였다. n-Hexane(10ml)로 5회 세척하고 40℃ 진공건조기에서 건조하여 Ivory solid를 얻었다. EA(10ml) 투입하고 상온에서 30분 교반한 후 고체를 여과하고 EA(3ml)로 3회 세척하고 40℃ 진공건조기에서 건조하여 white solid로 1-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-3-(2-(1-hydroxycyclohexyl)-2-(4-methoxyphenyl)ethyl)urea (1g, 수율=42.5%)를 얻었다.
HPLC method로 측정한 순도는 99.0% 이다.
화합물 10의 제조확인
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.87 (s, 1H), 7.95 (d, J=1.57Hz, 1H), 7.46~7.42 (m, 2H), 7.16 (d, J=8.6Hz, 2H), 6.83 (d, J=8.61Hz, 2H), 5.66 (t, J=4.70, 5.47Hz, 1H), 4.12 (bs, OH), 3.82~3.79 (m, 1H), 3.33~3.29 9m, 1H), 2.66~2.62 (m, 1H), 1.59~1.00 (m, 10H)
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 158.1, 155.1, 140.5, 132.8, 132.2, 131.0, 127.1, 126.8, 124.6, 122.3, 121.9, 121.4, 116.1, 113.6, 71.8, 55.2, 54.9, 36.7, 34.8, 25.9, 22.0, 21.6
실시예 4: 화합물 11의 제조방법:
1-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-3-(9-(ethylpropane-1,3-diacetate)-9H-purin-2-yl)urea의 합성
[반응식 4]
Figure pat00027
반응기에 화학식 7의 화합물 2-(2-(2-amino-9H-purin-9-yl)ethyl)propane-1,3-diacetate(1.61g)과 DCM(25ml)를 투입하고 상온에서 교반하였다. 반응물은 맑은 용액이 되었다. 1-chloro-2-(trifluoromethyl)-4-isocyanatobenzene(1.33g)을 천천히 한번에 투입하고 상온에서 교반하며 5시간 동안 반응하였다. TLC 확인하여 반응이 완결되면, EA(25ml)를 천천히 투입하여 결정화를 진행하였다. 반응물이 26~31℃로 발열되며 과량의 흰색고체가 석출되었다. EA(26ml)를 추가로 투입하고 상온에서 30분 교반한 후 고체를 여과하고 EA(10ml)로 5회 세척하고 40℃ 진공 건조기에서 건조하여 white solid로 1-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-3-(9-(ethylpropane-1,3-diacetate)-9H-purin-2-yl)urea (1.83g, 수율=67%)를 얻었다.
HPLC method로 측정한 순도는 99.9% 이다.
화합물 11의 제조확인
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.76 (s, 1H), 10.30 (s, 1H), 8.97 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.18 (d, J=2.35Hz, 1H), 7.85~7.82 (dd, J=2.74Hz, 2.35, 1H), 7.64 (d, J=8.61Hz, 1H), 4.33~4.29 (m, 2H), 4.01~3.98 (m, 4H), 1.93~1.91 (m, 9H)
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 170.7, 153.5, 152.4, 152.0, 148.6, 146.6, 138.7, 138.7, 132.4, 130.1, 127.4, 127.1, 126.8, 124.6, 124.5, 123.9, 121.8, 118.4, 63.8, 41.4, 34.9, 28.0, 20.9
실시예 5: 화합물 12의 제조방법:
1-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-3-(3-(trifluoromethyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-1-yl)phenyl)urea의 합성
[반응식 5]
Figure pat00028
반응기에 화학식 4의 화합물 3-(trifluoromethyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-1-yl)benzenamine (1.207g)과 DCM(25ml)를 투입하고 상온에서 교반하였다. 반응물은 맑은 용액이 되었다. 1-chloro-2-(trifluoromethyl)-4-isocyanatobenzene(1.33g)을 천천히 한번에 투입하였다. 반응물이 24~28℃로 발열되며, white suspension으로 형상이 바뀌었다. 상온에서 12 시간 교반하여 반응을 완결하였다. 생성된 고체를 여과하고 DCM(10ml)로 2회 세척하고 40℃ 진공건조기에서 건조하여 white solid로 1-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-3-(3-(trifluoromethyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-1-yl)phenyl)urea (2.15g, 수율=93%)를 얻었다.
HPLC method로 측정한 순도는 99.6% 이다.
화합물 12의 제조확인
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.41 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 8.16 (d, J=1.56Hz, 1H), 8.07 (d, J=2.73Hz, 1H), 7.83 (t, J=1.96Hz, 1H), 7.80 (s, NH), 7.67~7.64 (dd, J=2.74, 2.35Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.56 (s, NH), 7.44 (t, J=1.17Hz, 1H), 2.13 (s, CH3, 3H)
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 152.7, 141.9, 139.2, 138.4, 135.4, 132.4, 131.2, 127.2, 124.5, 123.8, 123.3, 122.6, 121.8, 117.6, 114.5, 113.6, 113.0, 110.5, 13.9Mass Ion Mode=FAB+, 463.3 (m/z)
실시예 6: 화합물 13의 제조방법:
1-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-3-((1R,2S)-2-(3,4-difluorophenyl)cyclopropyl)urea의 합성
[반응식 6]
Figure pat00029
반응기에 화학식 5의 화합물 (1R,2S)-2-(3,4-difluorophenyl)cyclopropanamine (R)-mandelic acid(1.61g), DCM(25ml)과 H2O(25ml)를 투입하고 상온에서 교반하였다. 25% NaOH 용액(2ml) 투입하여 반응물은 맑은 용액이 되었다. 상온에서 30분 교반한 후 층 분리하여 하층의 유기층을 모았다. 1-chloro-2-(trifluoromethyl)-4-isocyanatobenzene(1.33g)을 천천히 한번에 투입하고 상온에서 교반하며 3시간 동안 반응하였다. TLC 확인하여 반응이 완결되면, 40℃에서 감압 농축한 후 생성된 white oil에 n-Hexane (50ml) 투입하였다. 반응물을 가열하여 30분 정도 환류시킨 후 hot filter하여 고체를 여과하였다. n-Hexane(10ml)로 5회 세척하고 40℃ 진공건조기에서 건조하여 white solid를 얻었다. EA:n-Hex.=1:2 eluent 사용하여 silica gel column을 진행하여 white solid로 1-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-3-((1R,2S)-2-(3,4-difluorophenyl)cyclopropyl)urea (1g, 수율=51%)를 얻었다.
HPLC method로 측정한 순도는 99.8% 이다.
화합물 13의 제조확인
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.89 (s, 1H), 8.02 (d, J=2.35Hz, 1H), 7.57~7.54 (dd, J=2.74, 2.35Hz, 1H), 7.51~7.49 (d, J=8.61Hz, 1H), 7.31~7.23 (m, 1H), 7.19~7.14 (m, 1H), 7.00~6.96 (m, 1H), 6.79 (d, J=2.74Hz, 1H), 2.70~2.67 (m, 1H), 1.99~1.95 (m, 1H), 1.18~1.14 (m, 2H)
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 155.9, 151.0, 149.3, 148.5, 146.9, 140.2, 132.2, 127.1, 124.6, 123.2, 122.0, 117.5, 116.8, 115.2, 33.3, 24.3, 16.1Mass Ion Mode=FAB+, 391.2 (m/z)
실험예 1: 화합물 8 내지 13의 합성결과
상기 실시예 1~6에서 제조된 화합물 8 내지 13에 대하여 in vitro 실험을 실시하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
화합물 8 내지 13의 합성결과
구분 화합물 R6 수율(%) 순도(%)
실시예 1 화합물 8 피리미딘(pyrimidine) 93.0 99.8
실시예 2 화합물 9 티아졸 (thiazole) 78.0 99.3
실시예 3 화합물 10 사이클로헥사놀 (cyclohexanol) 42.5 99.0
실시예 4 화합물 11 퓨린 (purine) 67.0 99.9
실시예 5 화합물 12 이미다졸(imidazol) 93.0 99.6
실시예 6 화합물 13 사이클로프로판아민(cyclopropanamine) 51.0 99.8
상기 표 1의 결과에 의하면, 상기 실시예 1~6에서 제조된 화합물들에 대하여 수율이 40% 이상이며, 순도가 99.0% 이상인 것을 확인하였다.
실험예 2-1: 전립선암세포의 증식 억제능 확인
본 발명에 따른 대표화합물로서 상기 실시예1~6에서 합성된 화합물들에 대하여 전립선암, 유방암 및 대장암의 저해활성을 측정하였으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.
[재료성분]
본 실험에 사용한 사람 암 세포주는 하기 표 2와 같이 전립선암, 유방암, 대장암을 준비하였고, 상기 암 세포주들은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, KCLB)으로부터 분양받아 100units/mL의 Antibiotic Antimycotic과 10% FBS가 첨가된 RPMI를 이용하여 37, 5% CO2 incubator에서 계대 배양하여 사용하였다.
전립선암 유방암 대장암
LNCaP PC-3 RC-58T MCF-7 SW480 HT-29
또한 100 units/mL의 Antibiotic Antimycotic과 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다. 암세포는 37 ℃, 5% CO2 incubator (HERA cell 150, Heraeus, Hanau, Germany)에서 주 2~3회 0.25% trypsin-EDTA 용액으로 계대 배양하여 사용하였으며, passage number가 10회 이상일 때는 폐기하고 새로운 세포를 다시 배양하여 실험하였다.
[실험방법]
암세포 증식 억제능은 SRB(sulforhodaime B)법을 이용하여 측정하였다. SRB법은 생존 세포내의 단백질 총량을 흡광도로 나타내어 세포사멸 정도를 확인하는 방법이다. TCA(trichloroacetic acid)에 의해 생존 세포만 well plate에 부착되며 이 세포의 단백질내 염기성 아미노산 잔기가 SRB와 결합하여 마지막에 처리하는 Tris buffer에 녹아 나와 흡광도를 나타낸다.
Monolayer로 자란 암세포주를 0.25% trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 single cell로 만든 후 배양액으로 최종농도가 1×105 cells/mL가 되도록 희석하여 24 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간 동안 배양한 후, 화합물들을 농도별로 첨가하여 24시간 반응시켜 암세포 증식 정도를 sulforhodamine B(SRB, Sigma-Aldrich Co.) 방법에 의하여 540nm에서 측정하였다. 상기 화합물 8~13이 사람 암 세포의 증식에 어떠한 영향을 미치는지를 SRB assay를 통하여 확인하였다.
SRB(sulforhodaime B) assay 측정 결과
구분 전립선암
LNCaP PC-3 RC-58T
기준 약물 Sorafenib 18.39 22.67 20.59
Imatinib 36.79 66.86 54.37
Poziotinib 3.99 12.61 5.64
Dasatinib 29.09 54.54 48.14
Nilotinib 61.97 30.43 24.89
실시예 1 화합물 8 23.76 14.67 31.39
실시예 2 화합물 9 6.03 9.80 10.68
실시예 3 화합물 10 5.83 8.89 5.34
실시예 4 화합물 11 69.68 58.43 49.65
실시예 5 화합물 12 2.78 8.56 6.47
실시예 6 화합물 13 3.50 7.52 6.19
상기 표 3의 결과에 의하면, 기준 약물 중 가장 활성이 높은 Poziotinib과 비교하면 LNCaP 세포주에 대해서는 상기 실시예 5 및 6의 화합물이 가장 좋은 활성을 보였고, PC-3 세포주에 대해서는 상기 실시예 2, 3, 5 및 6의 화합물이 가장 좋은 활성을 보이는 것을 확인하였다. 또한 RC-58T 세포주에 대해서는 상기 실시예 3의 화합물이 가장 좋은 활성을 보였다. 이를 통해 상기 실시예들의 화합물들이 전립선 암세포주에 대하여 우수한 세포 증식 억제 및 세포자멸사 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 2-2: 유방암세포 증식 억제능 확인
상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 상기 실시예 1~6에서 제조된 화합물 8~13에 대해 사람 유방암 세포의 사멸에 어떠한 영향을 미치는지를 SRB assay를 통하여 확인하였으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다.
SRB(sulforhodaime B) assay 측정 결과
구분 유방암
MCF-7
기준 약물 Sorafenib 32.94
Imatinib 51.81
Poziotinib 7.89
Dasatinib 40.21
Nilotinib 80.94
실시예 1 화합물 8 33.67
실시예 2 화합물 9 8.63
실시예 3 화합물 10 10.77
실시예 4 화합물 11 81.78
실시예 5 화합물 12 6.27
실시예 6 화합물 13 11.25
상기 표 4의 결과에 의하면, 기준 약물 중 가장 활성이 높은 Poziotinib과 비교하면 MCF-7 세포주에 대해서 상기 실시예 5의 화합물이 가장 좋은 활성을 보였으며, 상기 실시예 2, 3 및 6의 화합물들도 Poziotinib과 비슷한 활성을 나타내었다.
실험예 2-3: 대장암세포 증식 억제능 확인
상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 상기 실시예 1~6에서 제조된 화합물 8~13에 대해 사람 대장암 세포의 사멸에 어떠한 영향을 미치는지를 SRB assay를 통하여 확인하였으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다.
SRB(sulforhodaime B) assay 측정 결과
구분 대장암
SW-480 HT-29
기준 약물 Sorafenib 32.00 40.58
Imatinib 65.88 71.87
Poziotinib 67.65 7.06
Dasatinib 90.19 77.79
Nilotinib 42.51 94.57
실시예 1 화합물 8 7.18 41.03
실시예 2 화합물 9 11.05 18.27
실시예 3 화합물 10 8.11 16.86
실시예 4 화합물 11 74.68 82.62
실시예 5 화합물 12 6.54 3.69
실시예 6 화합물 13 20.37 18.22
상기 표 5의 결과에 의하면, SW-480 세포주에 대해 기준 약물 중 가장 활성이 높은 Sorafenib과 비교하면 상기 실시예 1, 2, 3, 5 및 6의 화합물들에서 향상된 활성을 보였으며, HT-29 세포주에 대해서는 Poziotinib과 비교하여 상기 실시예 5의 화합물이 가장 좋은 활성을 보였다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 1, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식1]
    Figure pat00030

    (상기 화학식 1에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 탄소수가 1 내지 10의 저급 알킬, 탄소수가 1 내지 10의 저급 알콕시 및 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 탄소수가 1 내지 10의 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
    R6은 피리미딘 유도체, 티아졸 유도체, 사이클로헥사놀 유도체, 퓨린 유도체, 이미다졸 유도체 및 사이클로프로판아민 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것이다.)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R6은 하기 화합물 2 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것인 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    하기 화학식 2로 표시되는 화합물 2;
    [화학식 2]
    Figure pat00031


    하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 3;
    [화학식 3]
    Figure pat00032


    하기 화학식 4로 표시되는 화합물 4;
    [화학식 4]
    Figure pat00033


    하기 화학식 5로 표시되는 화합물 5;
    [화학식 5]
    Figure pat00034


    하기 화학식 6로 표시되는 화합물 6; 및
    [화학식 6]
    Figure pat00035



    하기 화학식 7로 표시되는 화합물 7.
    [화학식 7]
    Figure pat00036
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화합물 1은 하기 화합물 8 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것인 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    하기 화학식 8로 표시되는 화합물 8;
    [화학식 8]
    Figure pat00037


    하기 화학식 9로 표시되는 화합물 9;
    [화학식 9]
    Figure pat00038


    하기 화학식 10으로 표시되는 화합물 10; 및
    [화학식 10]
    Figure pat00039


    하기 화학식 11로 표시되는 화합물 11.
    [화학식 11]
    Figure pat00040

  4. 제1항의 화합물 1을 포함하는 항암용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 화합물 1은 하기 화합물 8 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것인 항암용 조성물:
    하기 화학식 8로 표시되는 화합물 8;
    [화학식 8]
    Figure pat00041


    하기 화학식 9로 표시되는 화합물 9;
    [화학식 9]
    Figure pat00042


    하기 화학식 10으로 표시되는 화합물 10; 및
    [화학식 10]
    Figure pat00043


    하기 화학식 11로 표시되는 화합물 11.
    [화학식 11]
    Figure pat00044

  6. 제4항에 있어서,
    상기 항암용 조성물은 카스파제를 활성화시켜 세포자멸사를 유도하는 것인 항암용 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 암질환은 전립선암, 위암, 만성 또는 급성 백혈병, 혈액암, 뇌종양, 방광암, 자궁내막암, 자궁경부암, 간암, 직장암, 유방암, 대장암, 피부암, 폐암, 난소암, 흑색종, 췌장암, 다도암, 림프종 및 신경아세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항암용 조성물.

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Susan Elmore, Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death ToxicolPathol, 35(4), 495-516 (2007)

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