KR20210098382A - 인슐린유사성장인자-1 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

인슐린유사성장인자-1 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 활성을 갖는 인간 인슐린유사성장인자-1 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 샤페론 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP로 융합된 인간 인슐린유사성장인자-1(hIGF-1) 단백질은 IGF 결합단백질(Insulin-like growth factor biding protein, IGFBP)이 없이도 생물학적 활성을 갖고 안정적이며, 인슐린유사성장인자-1의 수용체인 IGF 수용체(Insulin-like growth factor 1 receptor, IGFR-1R)를 자극할 수 있어, 성장호르몬 결핍 치료를 위한 용도로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

인슐린유사성장인자-1 융합단백질 및 이의 용도{Insulin-like growth factor-1 fusion protein and use thereof}
본 발명은 생물학적 활성을 갖는 인간 인슐린유사성장인자-1 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 태그 단백질(샤페론 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP)로 융합된 인간 인슐린유사성장인자-1(hIGF-1) 단백질은 IGF 결합단백질(Insulin-like growth factor biding protein, IGFBP)이 없이도 생물학적 활성을 갖고 안정적이며, 인슐린유사성장인자-1의 수용체인 IGF 수용체(Insulin-like growth factor 1 receptor, IGFR-1R)를 자극할 수 있어, 성장호르몬 결핍 치료를 위한 용도로 유용하게 활용될 수 있다.
성장호르몬은 191개의 아미노산으로 구성된 단일 분자 폴리펩타이드로서, 뇌하수체 전구에서 분비되는 호르몬이다. 성장호르몬 수용체와 결합하여 IGF-1 (Insulin like Growth Factor-1)을 발현시킴으로써 세포의 성장 및 재생에 관여한다. 성장호르몬은 정상인의 몸에서는 뇌하수체에서 생산되며 사춘기까지 생산량이 늘어나고 나이가 들면서 차차 생산량이 감소하는 것으로 알려져 있다.
대표적인 성장호르몬의 결핍 증상에는 성인 성장호르몬 결핍증 (adult growth hormone deficiency, AGHD)과 소아 성장호르몬 결핍증 (pediatric growth hormone deficiency, PGHD)이 있다. 성인 성장호르몬 결핍증의 경우 뇌종양, 뇌출혈 등의 치료과정에서 방사선이나 수술에 의하여 환자의 뇌하수체가 손상되는 경우 또는 특발성으로 발생한다. 성장호르몬의 분비가 제대로 되지 않으면 체중 감소, 뼈의 무기질 밀도 감소, 지방 증가, HDL의 감소, LDL의 증가, 근육강도 감소 등의 증상이 나타나 삶의 질이 저하된다. 소아 성장호르몬 결핍증은 뇌하수체의 손상 또는 발달 장애가 있는 경우 발생한다. 성장호르몬의 분비 장애가 있으면 저신장증이 나타나는데, 신장이 또래의 성장곡선에서 하위 3% 또는 한해 5cm 이하의 성장을 보이며, 저혈당, 체력저하, 우울증 및 정신적 미성숙 등의 증상이 나타나기도 한다.
한편, 소마토메딘-C(somatomedin-C)로도 알려진 인간 인슐린유사성장인자 1(Human Insulin-like growth factor, hIGF1)은 아동기 성장에 중요한 역할을 하며 성인에게 계속 동화 작용을 한다.
인슐린유사성장인자 1(hIGF1)은 심각한 1 차 인슐린유사성장인자 결핍 또는 성장 호르몬 불감증이 있는 어린이의 성장 실패 및 단신의 장기 치료에 승인된 약물이다. 인슐린유사성장인자는 기본적으로 체내에서 인슐린과 유사한 작용을 하는 성장 인자로, 골격근 세포, 골 세포, 연골 세포, 간 세포, 신장 세포, 신경 세포, 피부 세포, 조혈 세포 등을 예로 들 수 있는 체내 모든 종류의 세포의 성장을 증진시킬 수 있다고 알려져 있다. 또한, 인슐린유사성장인자는 인간만능줄기세포(human pluripotent stem cells, hPSC)의 자가 재생능(self-renewal) 및 다능성(pluripotency)을 유지하고, 인간만능줄기세포(hPSC)를 베타 세포 및 모발 세포로 분화시킬 수 있다. 인슐린유사성장인자 1(hIGF1)은 인슐린유사성장인자 1 수용체(IGF1R)에 결합하며 인슐린 수용체 (INSR)에 낮은 친화도를 갖는다.
성숙한 인슐린유사성장인자가 단독인 경우 생리학적 조건에서 불안정하고, 변성된 인슐린유사성장인자의 경우 그의 수용체인 인슐린유사성장인자의 수용체에 결합하지 않는 한계가 있다. 한편, IGF 결합단백질(Insulin-like growth factor biding protein, IGFBP)은 용액에서 인간 인슐린유사성장인자(hIGF-1)의 구조를 안정화 시키지만, 인간 인슐린유사성장인자가 인슐린유사성장인자 수용체에 결합하기 전에 분리되어야 한다.
이러한 배경 하에서, 본 발명의 발명자들은 IGF 결합단백질(IGFBP) 없이도 안정된 인슐린유사성장인자가 인슐린유사성장인자 수용체를 자극함으로써 성인 성장호르몬 결핍증 (adult growth hormone deficiency, AGHD)과 소아 성장호르몬 결핍증 (pediatric growth hormone deficiency, PGHD) 등의 성장호르몬 결핍 치료에우수한 합성 펩타이드를 개발하고자 하였다.
(0001) 미국등록특허 제7,355,018호 (2008.04.08. 등록)
본 발명의 발명자들은 IGF 결합단백질(IGFBP) 없이도 안정된 인슐린유사성장인자가 인슐린유사성장인자 수용체를 자극함으로써 성인 성장호르몬 결핍증(adult growth hormone deficiency, AGHD)과 소아 성장호르몬 결핍증(pediatric growth hormone deficiency, PGHD) 등의 성장호르몬 결핍 치료에 우수한 합성 펩타이드를 개발하고자, 샤페론 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP를 인간 인슐린유사성장인자-1(hIGF-1)의 N-말단에 융합된 형태의 융합단백질을 제조하고 이의 생물학적 활성을 확인하였다. PDIb'a'는 MBP 보다 길쭉한 형상으로 수용체 결합하는 IGF1의 부담을 줄여주고, PDIb'a'의 b' 도메인 및 a' 도메인은 유연한 링커(linker)에 의해 연결되어 있어 입체 장애를 덜 부과하기 때문에 생물학적 활성이 더 우수함을 확인하였다. 이로서 본 발명의 발명자들은 PDIb'a'-hIGF1 또는 MBP-hIGF1가 hIGF1 또는 hIGF1/IGFBP 복합체를 대체할 수 있는 합성 펩타이드임을 알게 되어 본 발명은 완성하게 되었다. 이에, 본 발명의 목적은 인간 인슐린유사성장인자(human insulin-like growth factor 1, hIGF-1)의 N-말단에 태그 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP가 결합된 인슐린유사성장인자 융합단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인슐린유사성인자 융합단백질을 함유하는, 성장호르몬 결핍을 치료하기 위한 약학조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 인간 인슐린유사성장인자(human insulin-like growth factor 1, hIGF-1)의 N-말단에 태그 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP가 결합된 인슐린유사성장인자 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인슐린유사성인자 융합단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 백터를 유효성분으로 함유하는, 성장호르몬 결핍을 치료하기 위한 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 융합단백질은 태그 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP의 부착으로 인해 안정적이고 용해도를 향상시키며, 생물학적 활성을 띈다. 이에, IGF 결합단백질(IGFBP) 없이도 안정된 인슐린유사성장인자가 인슐린유사성장인자 수용체를 자극함으로써 성인 성장호르몬 결핍증 (adult growth hormone deficiency, AGHD)과 소아 성장호르몬 결핍증 (pediatric growth hormone deficiency, PGHD) 등의 성장호르몬 결핍 치료에 우수하다.
특히, PDIb'a'는 MBP 보다 길쭉한 형상으로 수용체 결합하는 IGF1의 부담을 줄여주고, PDIb'a'의 b' 도메인 및 a' 도메인은 유연할 수 있는 링커에 의해 연결되어 있어 입체 장애를 덜 부과하기 때문에 성장호르몬 결핍 치료에 있어서 더욱 효과적이다.
본 발명에 따른 PDIb'a' 또는 MBP의 부착된 융합 단백질은 hIGF1 또는 hIGF1/IGFBP 복합체의 대체물이 되어 성장호르몬 결핍 치료를 위한 용도로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 hIGF1 및 IGFBP 복합체의 결정 구조를 나타낸 것이다(hIGF1: 자홍색, IGFBP1: 노란색 및 IGFBP4: 회색, PDB 코드는 2DSQ).
도 2(A)는 Tag-hIGF 1 발현벡터의 제작과정과 TEVrs를 갖는 융합 단백질 구조의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 7개의 서로 다른 태그 단백질과 융합된 hIGF 1의 발현 및 용해도를 SDS-PAGE를 이용하여 발현 및 용해도를 분석한 결과이다: M - 분자량 크기 마커, C - 대조군, T - 초음파 처리 후의 총계, S - 가용성 분획물, I - 불용성 분획물. (A) 18℃에서 유도된 BL21(DE3)에 7개의 태그를 표시한 것이다. (B) 37℃에서 유도된 BL21 (DE3)의 태그를 표시한 것이다. (C) 및 (D)는 각각 18℃ 및 37℃에서 유도된 Origami 2 균주를 표시한 것이다. (E) 및 (F)는 각각 18℃ 및 37℃에서 유도된 Shuffle 균주를 표시한 것이다. 빨간색 화살표는 예상되는 단백질 크기 밴드를 나타낸 것이다.
도 4는 정제한 결과로서, (A) PDIb'a'-hIGF 1 정제의 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 분석 결과이고, (B) PDIb'a'-hIGF 1 정제의 양이온 교환 크로마토그래피 분석 결과이고, (C) PDIb'a'-hIGF 1 정제의 모든 정제 공정으로부터의 SDS-PAGE 겔 분석한 결과이다; M - 분자량 마커, 1 - 초음파 처리 후의 총계(이전에 0.5 mM IPTG로 유도된 배양물로부터 수득), 2 - 초음파 처리된 것으로부터 가용성 분획물, 3 - 친화성 컬럼으로부터 용해된 분획물, 4 - 양이온 교환 컬럼에서 용출 된 생성물, 5 - 투석 및 내 독소 제거 후 최종 산물(환원 상태), 6 - 투석 및 내 독소 제거 후 최종 산물(비환원 상태), (D) MBP-hIGF 1 정제의 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 분석 결과이다; M - 분자량 마커, 1- 초음파 처리 후의 용해된 분획물(이전에 0.5 mM IPTG로 유도된 배양물로부터 수득), 2 - 친화성 칼럼으로부터 용해된 분획물.
도 5는 정제과정을 나타낸 흐름도이다. (A) PDIb'a'-IGF 1 정제 흐름도를 나타낸 것이다. (B)는 MBP-IGF 1 정제 흐름도를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 유방암 세포주인 MCF-7의 hIGF1 융합 단백질에 대한 용량 의존적 활성화를 나타낸 결과이다: A - PDIb'a'-hIGF1. EC50은 348.0 pg/mL이며, 이는 88.0 pg/mL hIGF1에 상응한다. B - MBP-hIGF1. EC50은 6.96 ng/mL이며, 이는 1.46 ng/mL의 hIGF1에 상응한다.
도 7은 IGF1, IGF1R 복합체, PDIb'a' 및 MBP의 원자 구조를 나타낸 것이다. (A) IGF1 및 IGF1R 복합 구조를 나타낸 것으로, IGF1의 N-말단 및 C-말단을 가리킨다. 회색은 IFG1R이다. PDB 코드는 6PYH이다. (B) PDIb'a' 구조. PDB 코드는 6PYH이다. (C) MBP 구조. PDB 코드는 1ANF이다.
도 8은 PDIb'a'-hIGF1의 단백질 안정성을 SYPRO Orange Fluorescent Dye를 사용하여 측정한 결과이다.
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 IGF 결합단백질(IGFBP) 없이도 안정된 인슐린유사성장인자가 인슐린유사성장인자 수용체를 자극함으로써 성인 성장호르몬 결핍증 (adult growth hormone deficiency, AGHD)과 소아 성장호르몬 결핍증 (pediatric growth hormone deficiency, PGHD) 등의 성장호르몬 결핍 치료에 우수한 합성 펩타이드에 관한 것으로, 상세하게 샤페론 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP를 인간 인슐린유사성장인자-1(hIGF-1)의 N-말단에 융합된 형태의 융합단백질을 제조하고 이의 생물학적 활성을 확인하였다. PDIb'a'는 MBP 보다 길쭉한 형상으로 수용체 결합하는 IGF1의 부담을 줄여주고, PDIb'a'의 b' 도메인 및 a' 도메인은 유연한 링커(linker)에 의해 연결되어 있어 입체 장애를 덜 부과하기 때문에 생물학적 활성이 더 우수함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 hIGF1 또는 hIGF1/IGFBP 복합체를 대체할 수 있는, 인간 인슐린유사성장인자(human insulin-like growth factor 1, hIGF-1)의 N-말단에 태그 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP가 결합된, 생물학적 활성을 갖은 인슐린유사성장인자 융합단백질을 제공한다.
상세하게, 상기 태그 단백질인 PDIb'a' 단백질은 서열번호 1이고, MBP 단백질은 서열번호 2 일 수 있다. 도 1은 hIGF1 및 IGFBP 복합체의 결정 구조를 나타낸 것이다(hIGF1: 자홍색, IGFBP1: 노란색 및 IGFBP4: 회색, PDB 코드는 2DSQ). 또한 도 2는 Tag-hIGF 1 발현벡터의 제작과정과 TEVrs를 갖는 융합 단백질 구조의 모식도를 나타낸 것이다.
일 예로서, 인간 인슐린유사성장인자(human insulin-like growth factor 1, hIGF-1)의 N-말단에 태그 단백질인 PDIb'a' 가 결합한 경우 서열번호 3을 나타낼 수 있다. 인간 인슐린유사성장인자(human insulin-like growth factor 1, hIGF-1)의 N-말단에 MBP 가 결합한 경우 서열번호 4를 나타낼 수 있다(표 1).
구분 No. Sequence
PDIb’a’tag 1 MKHHHHHHHHEGGGGLIEFTEQTAPKIFGGEIKTHILLFLPKSVSDYDGKLSNFKTAAESFKGKILFIFIDSDHTDNQRILEFFGLKKEECPAVRLITLEEEMTKYKPESEELTAERITEFCHRFLEGKIKPHLMSQELPEDWDKQPVKVLVGKNFEDVAFDEKKNVFVEFYAPWCGHCKQLAPIWDKLGETYKDHENIVIAKMDSTANEVEAVKVHSFPTLKFFPASADRTVIDYNGERTLDGFKKFLESGGQDGAGDDDDLEDLEEAEEPDMEEDDDQKAV
MBP tag 2 MGSSHHHHHHGTKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQT
PDIb’a’-IGF1 3 MKHHHHHHHHEGGGGLIEFTEQTAPKIFGGEIKTHILLFLPKSVSDYDGKLSNFKTAAESFKGKILFIFIDSDHTDNQRILEFFGLKKEECPAVRLITLEEEMTKYKPESEELTAERITEFCHRFLEGKIKPHLMSQELPEDWDKQPVKVLVGKNFEDVAFDEKKNVFVEFYAPWCGHCKQLAPIWDKLGETYKDHENIVIAKMDSTANEVEAVKVHSFPTLKFFPASADRTVIDYNGERTLDGFKKFLESGGQDGAGDDDDLEDLEEAEEPDMEEDDDQKAVGTGSYITSLYKKAGFENLYFQGGTGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYRM*
MBP-IGF1 4 MGSSHHHHHHGTKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTGTGSYITSLYKKAGFENLYFQGGTGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYRM*
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다. “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다. 상기 숙주세포는 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포, 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않고 당업계에서 재조합 단백질 생산에 사용되는 모든 숙주세포가 이용 가능하다.
따라서, 본 발명은 상기 융합단백질을 암호화하는 유전자 또는 상기 융합단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용한 Gateway Vector system은 엔트리벡터와 목적벡터로 구성되며, 상기 엔트리벡터는 목적유전자의 양말단에 attL1, attL2을 갖는 벡터이며, 목적벡터는 attR1, attR2를 포함하는 벡터이다. 상기 엔트리벡터와 상기 목적벡터는 재조합효소에 의해 LR반응을 일으키며, 목적벡터의 attR1과 attR2를 엔트리벡터의 attL1과 attL2로 치환하게 된다. 이 과정에서 엔트리벡터에 포함되어 있던 목적유전자가 목적벡터로 전달되게 된다.
본 발명에 따른 융합단백질은 IGF 결합단백질(IGFBP)이 없이도 생물학적 활성을 갖으며 IGFRs(Insulin-like growth factor)를 자극할 수 있다. 또한 상기 태그 단백질인 PDIb'a' 단백질과 MBP 단백질은 용해도를 향상시키며 열적 안정성도 향상시킨다. 특히 PDIb'a'의 b' 도메인 및 a ' 도메인은 유연한 링커(linker)에 의해 연결되어 있어 입체 장애를 덜 부과하기 때문에 생물학적 활성이 MBP 단백질 보다 더 우수하다.
또한, 본 발명은 인간 인슐린유사성장인자(human insulin-like growth factor 1, hIGF-1)의 N-말단에 태그 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP가 결합된 생물학적 활성을 갖은 인슐린유사성장인자 융합단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 백터를 유효성분으로 함유하는, 성장호르몬 결핍증을 치료하기 위한 약학조성물을 제공한다.
대표적인 성장호르몬의 결핍증상에는 성인 성장호르몬 결핍증 (adult growth hormone deficiency, AGHD)과 소아 성장호르몬 결핍증 (pediatric growth hormone deficiency, PGHD)이 있다. 성인 성장호르몬 결핍증의 경우 뇌종양, 뇌출혈 등의 치료과정에서 방사선이나 수술에 의하여 환자의 뇌하수체가 손상되는 경우 또는 특발성으로 발생한다. 성장호르몬의 분비가 정상적으로 이루어지지 않으면 체중 감소, 뼈의 무기질 밀도 감소, 지방 증가, HDL의 감소, LDL의 증가, 근육강도의 감소 등 증상이 나타나 삶의 질이 저하된다. 소아 성장호르몬 결핍증은 뇌하수체의 손상 또는 발달 장애가 있는 경우 발생한다. 성장호르몬의 분비 장애가 있으면 저신장증이 나타나는데, 신장이 또래의 성장곡선에서 하위 3% 또는 한해 5cm 이하의 성장을 보이며, 저혈당, 체력저하, 우울증 및 정신적 미성숙 등의 증상이 나타나기도 한다. 동일 연령대에서 키가 평균보다 3 SD 이상 낮은 경우, 부모의 키 평균보다 1.5 SD 이상 낮은 경우, 평균 키보다 2 SD이상 낮으며 또래의 성장에 비하여 1년이상 1 SD 이상 낮은 경우, 2세 이상이나 SD 값이 0.5 이상 낮은 경우, 또는 저신장 증상이 나타나지 않았으나, 1년 이상 2 SD 미만이거나 2년 이상 1.5 를 유지하는 경우 소아 성장호르몬 결핍증으로 판정할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학 조성물은 첨가제 및 보조제로서 충진제, 중량제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 붕해제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 방향제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 및 멸균 주사용액으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 흉골내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여, 국소 투여, 경구 투여 및 흡입을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물의 상기 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 PDIb'a'-hIGF1 및 MBP-hIGF1은 IGFBP 없이 안정적이며 태그가 부착된 IGFR을 자극하여 활성화 할 수 있고 기존의 반감기가 증가한 효과를 나타냄으로써, hIGF1 또는 hIGF1/IGFBP 복합체를 대체 할 수 있어, 성장호르몬 결핍증을 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
1. 재료
디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT) 및 1-티오-β-d-갈락토피라노시드(1-thio-β-d-galactopyranoside, IPTG)는 AnaSpec(프리몬트, 캘리포니아) 및 Coomassie brilliant blue R-250 및 Tris는 Amresco(솔론, 오하이오)로부터 입수하였다. 이미다졸(Imidazole)과 암피실린(ampicillin)은 대정화학(시흥, 한국)과 DuchefaBiochemie(하를렘, 네덜란드)에서 각각 입수하였다. 람다 인테그라제(Lambda integrase) 및 절제 효소(excisionase)는 엘피스 바이오 테크(대전, 한국)에서 구입하였다. 염화나트륨(NaCl)과 글리세롤은 삼천화학(평택, 한국)에서, 2-머캅토 에탄올은 Yakuri Pure Chemicals(교토, 일본)에서 구입하였다. 모든 정제 컬럼은 GE healthcare(피스카타웨이, 뉴저지)로부터 입수하였고, Limulus Amebocyte Lysate 시험 키트는 Lonza(바젤, 스위스)에서 얻었다. E. coli BL21 (DE3) 및 Origami 2 (DE3) 세포는 Novagen(와디슨, 매디슨)으로부터 입수하였다. Amicon Ultra-15 원심 분리 필터 장치는 Millipore(빌레리카, MA)에서, 상업용 HSA 및 1-아르기닌은 Sigma-Aldrich(MO, St. Louis, MO) 에서 구입하였다. Guanidine-HCl은 Biosesang(성남, 한국)에서 공급받았으며, BODIP FL l-cystine 및 Native polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) 겔은 각각 Thermo Fisher Scientific Korea Ltd(서울, 한국) 및 Koma Biotech(서울, 한국)에서 구입하였다. 상기 구입한 모든 화학물질은 분석 등급을 갖는다.
2. pDestH8G4-Pb'a'-TEVrs-IGF1 클론의 구축 및 발현 설계
상업적으로 얻은 플라스미드(21C Frontier Human Gene Bank, 클론 ID : KU029721, full, gene bank : NM_000618)로부터 유전자를 수득하였다. 상세하게, 유전자를 먼저 "pOTB7" 벡터에 삽입한 후, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 말단에 제한효소부위(KpnI : GGTACC 및 XbaI : TCTAGA)가 있고, 프라이머(포워드 프라이머 : ATA GGTACC GGA CCG GAG ACG CTC TGC 및 리버스 프라이머 : CGC TCTAGA CTA CAT CCT GTA GTT CTT)가 삽입된 선형으로 수득하였다. pENTR-His-ccdb 벡터는 동일한 효소로 분해되었다. 유전자 및 소화(digested)된 벡터(vector)는 리가아제(Ligase)에 의해 연결되었고, 새로운 클론은‘His Tagged IGF 1’로 불렸다.
두 번째 클론은 동일한 효소 및 플라스미드에 의해 제조되었다: His Tagged IGF 1 및 pDONR 207을 리가아제 효소를 사용하여 연결하였다. His Tagged IGF 1- pDONR 207 반응에서 생성된 서브 클론을 pENTR-IGF 1로 명명하였으며, 원하는 대상 벡터 pDestH8G4-Pb'a'를 생성하는 LR 반응(게이트웨이 클론, Invitrogen, CA, USA)을 통해 제출되었다. hPDIb'a'- hIGF1로 불리는 발현벡터는 PDIb'a '태그, hIGF1 유전자 및 free hIGF1의 확보를 위한 담배 식각 바이러스 인식 부위 (tobacco etch virus recognition site, TEVrs)의 구조를 생성하였다(도 2).
3. 재조합 융합 단백질의 발현 및 용해도 측정(Expression and solubility of recombinant fusion protein)
대장균 BL21 균주를 열충격 방법으로 형질전환 시키고, 밤새 배양물을 Luria Bertani(LB 배지) 및 50 ug/mL 암피실린이 1 : 100 비율에서 OD 0.5에 도달할 때까지 37℃, 180 rpm/분으로 쉐이킹하면서 계대배양 하였다. 3 개 분획으로 나눈 후에 2개 분획물은 0.5mM IPTG로 유도하였다(3번째는 비유도성 대조군(non-inducted control)로 사용됨). 1개 분획물과 대조군은 37℃에서 4 시간 동안 쉐이킹하면서 배양하였다. 다른 1개 분획물은 동일한 속도로 밤새 17℃에서 배양하였다. 분획물을 수거하고, 펠렛을 초음파 처리하여 총 가용성, 불용성 분획물을 수득하였다. 대조군은 전체 부분(total portion)만 관찰되었다. 분획물을 SDS-페이지 겔 10 % 트리신을 통해 가시화하고 백분율은 GelAnalyzer 소프트웨어(Copyright 2010, Istvan Lazar 및 Dr Istvan Lazar)에서 겔 분석을 통해 얻었다.
4. 세포 분쇄(Cell disruption)
유도된 세포 배양물을 4℃에서 20 분당 3000 rpm으로 수확하고 펠렛을 용해(Lysis) 완충액[20 mM Tris-HCl, pH 8, 5% 글리세롤, 250 mM NaCl, 1X Protease Inhibitor Cocktail, Sigma P2714-IBTL]에 재현탁시켰다. 그런 다음, 얼음에서 3초 파열 및 27초 휴식을 60 사이클로 반복하여 초음파 처리하였다. 초음파 처리한 생성물을 4℃에서 20 분당 13000 rpm으로 원심 분리하였다. 상층액을 친수성 멤브레인 필터(0.45 ㎛, 폴리에테르설폰, 현대 마이크로 (주))를 통해 여과시켰다.
5.1. 재조합 PDIb'a'-hIGF1 융합 단백질의 정제
a) 친화성 컬럼(Affinity column)
세포용해물의 가용성 분획물을 미리 5 컬럼 부피의 완충액 A(20 mM Tris-HCl, pH8, 5 % 글리세롤, 250 mM NaCl)로 평형화된 HiTrap HisTrap(GE Healthcare, Bucks, UK) 컬럼에 적용하였다. 샘플이 바인딩되면, 컬럼을 2 컬럼 부피의 완충액 A 및 완충액 A에서 5 부피의 50 mM 이미다졸로 세척한 다음 완충액 A에서 500 mM 이미다졸로 등분비적으로 용출시켰다(도 5).
b) 탈염(Desalting step) 단계 및 양이온 교환 컬럼(Cation Exchange column)
친화성 컬럼으로부터 용리된 생성물을 10 KDa 투석막을 사용하여 A1 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5% 글리세롤)에 대한 투석을 이용하여 탈염시키고, 미리 5 컬럼 볼륨의 A1 버퍼로 평형화시킨 이온 교환 HiTrap SP HP column(GE Healthcare, Bucks, UK)에 적용하였다. 일단 샘플을 적용하면, 결합하지 않은 샘플을 5 컬럼 부피의 A1 완충액으로 세척한 다음, 10 컬럼 부피당 완충액 A1에서 농도구배 0-1 M NaCl로 용출을 수행하였다. 한번 더 분획물을 10% tricine gel SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 통해 확인하였다(도 5).
5.2. 재조합 MBP-hIGF1 융합 단백질의 정제
세포 용해물의 가용성 분획을 이전에 5 컬럼 부피의 완충액 A(20 mM Tris-HCl, pH8, 5% 글리세롤, 250 mM NaCl)로 평형화된 HiTrap MBP HP (GE Healthcare, Bucks, UK) 컬럼에 적용하였다.
샘플이 바이딩되면, 컬럼을 10 컬럼 부피의 완충액 A로 세척하고 완충액 A에서 10 mM 말토오스로 등비적으로 용출시켰다. 용출된 분획물은 10% tricine gel SDS-PAGE에서 전기영동을 통해 확인하였다.
6. 최종 완충액의 투석
융합 단백질을 AMICON 초원심분리 필터 10 KDa(밀리포아(주), 매사추세츠 주, 미국)를 사용하여 농축시키고, 인산 완충 식염수, pH 7.4에 대해 투석하였다.
7. 내독소(Endotoxin) 제거 및 정량
Triton® X-114 (시그마, 알드리치)를 최종 농도 1 %로 첨가하여 내독소를 제거하고, 4℃에서 30 분 동안 배양하여 혼합물이 흐려질 때까지 실온에서 배양하고 실온에서 10 분당 10000 rpm으로 원심분리 하였다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 수집하고 0.2 μm, 13 mm, 폴리에테르설폰(PES), 멸균 주사기 필터(현대 마이크로, 한국)를 통해 여과한 후 추가 분석을 위해 -20에 보관하였다. 농도는 Bradford Assay로 측정하였다. 내독소 정량을 위해 ToxinSensorTM Chromogenic LAL 내 독소 분석 키트(GenScript, USA)를 제조 지침에 따라 사용하였다(도 5).
8. 활성 측정(Activity Assay)
MCF-7 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. MCF-7 세포를 웰당 5 x 104 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 24 시간 배양 후 배지를 제거하고 각 웰을 0.5 mL PBS로 2 회 세척하였다. 그런 다음 배지를 무혈청 배지로 변경하고 다른 농도의 PDIb'a'-IGF를 세포에 처리하였다. 단백질과 함께 72 시간 배양에서 배지를 제거하고 0.5 mL의 MTT 용액(무혈청배지에서 0.04 mg/mL)을 첨가하고 2 시간 동안 배양하였다. 그 후, MTT 용액을 제거하고 0.5 mL DMSO를 첨가 하였다. 2 시간 배양한 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식(Cell proliferation)은 다음 방정식과 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)로 계산하였다.
Re = Bl + (Max Bl)/(1 + (EC50/conc) Hs ) (Max Bh)/(1 + (IC50/conc) Hi )
여기서, Re는 세포의 반응(response of the cells)을 의미하고, Bl는 저농도의 기준선(the baseline at low concentration), Max는 최대 반응(maximum response), conc는 단백질의 농도(concentration of the protein), Hs는 Hill 자극 계수(Hill coefficient of stimulation), Bh는 고농도 기준선(baseline at high concentration), Hi는 Hill 억제 계수(Hill coefficient of inhibition)를 의미한다.
9. 통계(Statistics)
모든 데이터는 평균 ± 표준 오차(SE)로 표시된다. 실험은 독립적으로 3 회 수행하였다.
<실시예 1> 재조합 단백질의 구성
융합 단백질을 얻기 위해 사용된 최종 발현 벡터에 도달하기 위해, 먼저 상업적으로 얻은 유전자를 각 말단에 제한 효소 부위를 추가하는 PCR 반응을 수행하였다. 벡터 pENTR-His-ccdb를 동일한 제한효소로 처리하고 플라스미드 유전자를 리가제 효소로 연결한 후 His Tagged IGF 1 클론을 성공적으로 획득하였다. 그런 다음 동일한 사이트를 사용하여 한 번 더 제한반응(restriction reaction)을 통해 클로닝하였다. 이때 클론 pENTR-IGF 1 유래 pDONR 207 벡터에 삽입되었다.
pENTR-IGF 1 클론을 사용하여 pDESTH8G4 pb'a'벡터로 LR 반응을 수행하여 발현 클론 (gateway clone, Invitrogen, CA, USA) pDESTH8G4 pb'a'(도 2a)를 생성하였다.
발현 클론이 획득되면, T7 프로모터에 대한 IPTG 유도를 통해 과발현을 유도하였으며, 최종 생성물로 도 2b에 나타낸 융합 단백질을 얻었다(hPDIb'a' 태그, 담배 식각 바이러스 인식 사이트(TEVrs), hIGF 1 순으로 구성됨).
<실시예 2> 용해도 및 발현
두 개의 서로 다른 태그(PDIb'a' 및 MBP)와 두 가지 서로 다른 온도(37℃ 및 18℃)에서 발현 수준과 용해도를 비교하였다. 두 태크 모두 과발현이 낮지만 높은 용해도를 나타냈다(표 2 내지 표 4). 특히 PDIb'a'에서 두드러지게 나타났다. 상세하게, MBP는 37℃에서 약 31.57%, 18℃에서 약 26.6%를, PDIb'a'는 37℃에서 38.85%, 18℃에서 20.1%에서 과발현을 보였다. BL21 균주에서 MBP는 18℃에서 94.3% 가용성 및 PDIb'a'는 18℃에서 99.4% 가용성을 나타냈다(도 2a 및 도 2b, 표 2). 시험한 다른 균주의 경우 값은 약간의 변화를 보일 수 있지만 높은 용해도와 낮은 과발현은 동일하게 유지됨을 확인할 수 있었다(표 3 및 표 4).
BL21 균주에서 hIGF의 발현 수준 및 용해도.
hIGF1
(11.7 kDa) 		태그 태그 크기
(kDa)		 융합단백질 크기(kDa) 발현 수준(%) 용해도(%)
18℃ 37℃ 18oC 37℃
MBP 40.2 55.79 26.6 31.57 94.3 92.2
PDIb'a' 30.6 46.66 20.1 38.85 99.4 53.8
His 6 3.77 15.46 - 16.37 - 89.41
Sumo 15.42 22.11 - - - -
Trx 15.58 27.27 16.37 25.5 29.54 40.86
GST 29.47 41.16 13.44 14.82 61.36 38.62
NusA 58.64 70.33 51.73 21.49 97.81 71.21
Origami 2 균주에서 hIGF 1의 발현 수준 및 용해도
hIGF1
(11.7 kDa) 		태그 태그 크기
(kDa)		 융합단백질 크기(kDa) 발현 수준(%) 용해도(%)
18℃ 37℃ 18℃ 37℃
MBP 40.2 55.79 43.18 40.91 97.46 90.2
PDIb'a' 30.6 46.66 32.78 23.63 99.43 43.81
His 6 3.77 15.46 20.79 27.98 100 97.1
Sumo 15.42 22.11 - - - -
Trx 15.58 27.27 41.36 48.62 93.66 52.68
GST 29.47 41.16 13.73 41.38 40.56 22.01
NusA 58.64 70.33 56.95 51.45 97.7 60.65
Shuffle strain 균주에서 hIGF 1의 발현 수준 및 용해도
hIGF1
(11.7 kDa) 		태그 태그 크기
(kDa)		 융합단백질 크기 (kDa) 발현 수준(%) 용해도(%)
18℃ 37℃ 18℃ 37℃
MBP 40.2 55.79 24.45 19.35 97.84 72.01
PDIb'a' 30.6 46.66 33.85 36.96 99.05 26.96
His 6 3.77 15.46 26.98 41.42 80.32 15.23
Sumo 15.42 22.11 - - - -
Trx 15.58 27.27 44.1 54.43 93.11 63.71
GST 29.47 41.16 19.36 31.39 73.42 14.42
NusA 58.64 70.33 39.63 53.13 87.9 94.56
<실시예 3> PDIb'a'-hIGF 1 정제
IPTG로 세포를 유도하고 펠릿을 확보한 후, 초음파 처리로 용해하고 가용성 분획물을 His Trap FF 컬럼(GE Healthcare, Bucks, UK)에 적용하였다.
친화성 컬럼으로 부터 용출된 최종 생성물은 대부분의 불순물을 제거하기 위해 투석(Dialysis)에 의해 탈염된 다음 HiTrap SP HP 컬럼(GE Healthcare, Bucks, UK)에 적용하였다.
양이온 교환 컬럼의 생성물을 PBS로 투석하고 Triton® X-114(Sigma - Aldrich)로 내 독소를 제거하고 0.2 um 주사기 필터로 여과하였다. 내독소는 ToxinSensorTM Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, USA)를 사용하였다. 측정 결과, 최종 정제물은 0.13 EU/mL 이였다.
태그가 제거되면, rhIGF1가 응집하였다. NaCl 민감성의 경우 NMDG 대신 NaCl을 대체하였지만 태그 절단 후에도 응집이 여전히 발생하였다. 이에 본 발명자들은 추가적으로 활성을 측정하였다.
<실시예 4> MBP-hIGF 1 정제
초음파 처리된 가용성 분획물인 PDIb’a’-hIGF 1과 동일한 방식으로 HiTrap MBP HP 컬럼 (GE Healthcare, Bucks, UK)에 적용하고, 용출된 생성물을 PBS에 대해 투석하고, Triton® X-114 (Sigma-Aldrich)로 내독소를 제거하고 0.2um 주사기 필터에서 여과하였다. hIGF1과 MBP 태그의 융합은 PDIb'a'-hIGF1에서 절단 후 응집되는 등 동일한 행동을 나타냈다(도 4).
<실시예 5> 생물학적 활성 측정(Biological Activity)
PDIb'a'-hIGF1 및 MBP-hIGF1에 대한 시험관 내 활성(in vitro activity)은 인간 유방 암종 세포주인 MCF-7를 사용하여 측정하였다(도 6). 도 6은 인간 유방암 세포주인 MCF-7의 hIGF1 융합 단백질에 대한 용량 의존적 활성화를 나타낸 결과로서, PDIb'a'-hIGF1의 EC50은 348.0 pg/mL이며, 이는 88.0 pg/mL hIGF1에 상응한다. MBP-hIGF1의 EC50은 6.96 ng/mL이며, 이는 1.46 ng/mL의 hIGF1에 상응한다.
PDIb'a'-hIGF1 및 MBP-hIGF1은 서로 다른 용량 반응성을 보여주었다. PDIb'a'-hIGF1은 3 nM에서 최대 반응이 437%인 종 모양의 2상 용량-반응 곡선을 나타났고(도 6), EC50 및 IC50 값은 각각 0.35 nM 및 30 nM로 계산되었다. Hill 자극 계수와 Hill 억제 계수는 각각 2.3와 1.6 이였다.
반면에 MBP-hIGF1은 최대 반응이 305%인 단상 시그모이드 용량-반응 곡선을 나타냈다(도 6). EC50과 Hill 계수는 각각 6.5 nM와 1.15 이였다.
PDIb'a'-hIGF1의 EC50은 348 pM로서, 이는 hIGF1의 87.2 pg/mL에 해당한다. hIGF1을 사용한 다른 연구에서는 EC50이 300 ~ 1,500 pg/mL로 보고된 바 있다. E. coli에서 생산된 rhIGF1의 ED50은 FDC-P1 세포를 사용한 세포 증식 분석으로 측정한 결과 5 ng/ml 미만이었으며, 이는 2.0 x 105 units/mg 이상의 활성에 해당한다 (Cancer Res. 1988 Jul 15; 48(14):4083-92.).
태그의 큰 크기가 여전히 hIGF1의 N-말단에 있다는 점을 고려할 때 PDIb'a'-hIGF1이 여전히 좋은 활동을 보이는 것은 상당히 주목할 만하다. MBP-hIGF1이 PDIb'a'-hIGF1 또는 hIGF1만큼 활성화되지 않는다는 점을 고려하면 더욱 그렇다. 활성 상태에서 전장 IGF1R-IGF1 복합체의 cryo-EM 구조는 IGF1의 N-말단과 C-말단이 IGF1R에서 멀어지면서 일부 태그 단백질을 위한 공간을 허용하고 있음을 보여준다(도 7). 이는 PDIb'a'가 IGF1에 대한 더 나은 태그임을 시사한다. 첫째, PDIb'a' 및 MBP는 각각 227-잔기 단백질 및 370-잔기 단백질인데, PDIb'a'는 IGF1에 MBP보다 적은 입체 장애를 제공한다. 둘째, PDIb'a'는 길쭉한 모양인 반면 MBP는 구형 모양이며, 이는 PDIb'a가 수용체에 결합하는 IGF1에 대한 부담을 덜어 줄 수 있다. 셋째, PDIb'a'의 b'도메인과 a' 도메인은 유연한 링커에 의해 연결되다는 점이다. PDIb'a'-hIGF1은 3nM에서 피크를 갖는 종 모양의 2상 용량-반응 곡선을 보여주었다(도 6). hIGF1의 또 다른 연구에서 유사한 2상 용량 의존적 반응이 관찰되었다.
한편 MBP-hIGF1이 종 모양의 용량 반응 곡선(bell-shaped dose-response curve)이 아니라 단상 시그모이드 용량 반응 곡선(monophasic sigmoid dose-response curve)을 보여주었다. 이는 PDIb'a'-hIGF1의 EC50이 MBP-hIGF1 보다 낮다는 점을 고려할 때, MBP-hIGF1가 더 높은 농도에서 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<실시예 6> 열적 안정성
단백질의 열 안정성은 SYPRO Orange Fluorescent Dye를 사용하여 측정하였다. 도 8의 결과, PDIb'a'-IGF1의 경우 용융 온도는 약 61.4℃ 이였고 hIGF1의 경우 약 40℃ 이였다. 이는 태그가 지정되었을 때 IGF1 단백질의 열 안정성이 증가했음을 시사한다.
종합하여 보건데, 성숙한 hIGF1 단독은 안정하지 않고 생리적 조건에서 변성된다. 변성된 hIGF1은 수용체에 대한 결합 친화력이 없다. 따라서 성숙한 hIGF1은 안정화를 위해 IBP4, IBP1 또는 그 수용체에 결합하여야 한다. 본 발명에 따르면 태그가 제거되었을 때 성숙한 rhIGF1이 응집되어 더 이상 갈 수 없었다. 따라서 본 발명자들은 태그 단백질이 융합 시의 효과를 확인하였으며, 흥미롭게도 PDIb'a'-hIGF1과 MBP-hIGF1 모두 시험관 내 생물학적 활성을 나타냈다. 따라서 PDIb'a' 또는 MBP 태그는 rhIGF1을 안정화시킬 뿐만 아니라 융합 단백질이 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않고 세포 반응을 유발하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명에 따른 융합단백질인 PDIb'a'-hIGF1 및 MBP-hIGF1은 IGFBP 없이 안정적이며 태그가 부착된 IGFR을 자극한다. 특히 PDIb'a'-hIGF1은 실험 및 치료를 위해 hIGF1 또는 hIGF1/IGFBP 복합체를 대체 할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Insulin-like growth factor-1 fusion protein and use thereof <130> ADP-2021-0011 <150> KR10-2020-0011469 <151> 2020-01-31 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDIb'a'tag <400> 1 Met Lys His His His His His His His His Glu Gly Gly Gly Gly Leu 1 5 10 15 Ile Glu Phe Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile 20 25 30 Lys Thr His Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp 35 40 45 Gly Lys Leu Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys 50 55 60 Ile Leu Phe Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile 65 70 75 80 Leu Glu Phe Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu 85 90 95 Ile Thr Leu Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu 100 105 110 Leu Thr Ala Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Lys Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp 130 135 140 Lys Gln Pro Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala 145 150 155 160 Phe Asp Glu Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys 165 170 175 Gly His Cys Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr 180 185 190 Tyr Lys Asp His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala 195 200 205 Asn Glu Val Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe 210 215 220 Phe Pro Ala Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg 225 230 235 240 Thr Leu Asp Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly 245 250 255 Ala Gly Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro 260 265 270 Asp Met Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val 275 280 <210> 2 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP tag <400> 2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Thr Lys Thr Glu Glu 1 5 10 15 Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu 20 25 30 Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr 35 40 45 Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala 50 55 60 Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala 85 90 95 Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn 100 105 110 Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile 115 120 125 Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile 130 135 140 Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met 145 150 155 160 Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp 165 170 175 Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp 180 185 190 Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val 195 200 205 Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile 210 215 220 Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly 225 230 235 240 Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val 245 250 255 Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala 275 280 285 Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala 290 295 300 Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu 305 310 315 320 Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala 325 330 335 Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp 340 345 350 Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr 355 360 365 Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr 370 375 <210> 3 <211> 413 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDIb'a'-IGF1 <400> 3 Met Lys His His His His His His His His Glu Gly Gly Gly Gly Leu 1 5 10 15 Ile Glu Phe Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile 20 25 30 Lys Thr His Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp 35 40 45 Gly Lys Leu Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys 50 55 60 Ile Leu Phe Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile 65 70 75 80 Leu Glu Phe Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu 85 90 95 Ile Thr Leu Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu 100 105 110 Leu Thr Ala Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Lys Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp 130 135 140 Lys Gln Pro Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala 145 150 155 160 Phe Asp Glu Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys 165 170 175 Gly His Cys Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr 180 185 190 Tyr Lys Asp His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala 195 200 205 Asn Glu Val Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe 210 215 220 Phe Pro Ala Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg 225 230 235 240 Thr Leu Asp Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly 245 250 255 Ala Gly Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro 260 265 270 Asp Met Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val Gly Thr Gly Ser Tyr 275 280 285 Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 290 295 300 Gly Gly Thr Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala 305 310 315 320 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr 325 330 335 Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp 340 345 350 Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 355 360 365 Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg 370 375 380 His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala 385 390 395 400 Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met *** 405 410 <210> 4 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-IGF1 <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Thr Lys Thr Glu Glu 1 5 10 15 Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu 20 25 30 Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr 35 40 45 Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala 50 55 60 Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala 85 90 95 Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn 100 105 110 Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile 115 120 125 Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile 130 135 140 Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met 145 150 155 160 Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp 165 170 175 Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp 180 185 190 Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val 195 200 205 Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile 210 215 220 Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly 225 230 235 240 Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val 245 250 255 Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala 275 280 285 Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala 290 295 300 Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu 305 310 315 320 Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala 325 330 335 Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp 340 345 350 Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr 355 360 365 Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Gly Thr Gly Ser Tyr Ile 370 375 380 Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 385 390 395 400 Gly Thr Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu 405 410 415 Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly 420 425 430 Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu 435 440 445 Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala 450 455 460 Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His 465 470 475 480 Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser 485 490 495 Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met *** 500 505

Claims (8)

  1. 인간 인슐린유사성장인자(human insulin-like growth factor 1, hIGF-1)의 N-말단에 태그 단백질인 PDIb'a' 또는 MBP가 결합된 인슐린유사성장인자 융합단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합단백질은 IGF 결합단백질(IGFBP)이 없이도 생물학적 활성을 갖으며 IGFRs(Insulin-like growth factor)를 자극하는 것을 특징으로 하는, 인슐린유사성장인자 융합단백질.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 태그 단백질은 용해도를 향상시키는 것을 특징으로 하는, 인슐린유사성장인자 융합단백질.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 PDIb'a' 단백질은 서열번호 1이고, MBP 단백질은 서열번호 2인 것을 특징으로 하는, 인슐린유사성장인자 융합단백질.
  5. 제 1 항의 단백질을 암호화하는 유전자.
  6. 제 1 항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중에서 선택된 어느 한 항의 인슐린유사성인자 융합단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 백터를 유효성분으로 함유하는, 성장호르몬 결핍증을 치료하기 위한 약학조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 성장호르몬 결핍증은 성인 성장호르몬 결핍증(adult growth hormone deficiency, AGHD) 또는 소아 성장호르몬 결핍증(pediatric growth hormone deficiency, PGHD)인 것을 특징으로 하는 성장호르몬 결핍증을 치료하기 위한 약학조성물.
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