KR20210096844A

KR20210096844A - 남천 추출물을 이용한 세정제와 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20210096844A
Application number: KR1020200010371A
Authority: KR
Inventors: 윤미영; 최화정; 김선형
Original assignee: 광주여자대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-29
Filing date: 2020-01-29
Publication date: 2021-08-06
Also published as: KR102372227B1

Abstract

본 발명은 남천 추출물을 이용한 세정제와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 남천 추출물을 함유하여 항산화 및 피부보호 효과가 우수하여 피부 또는 모발 세정용으로 안전하게 사용할 수 있는 세정제와 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

남천 추출물을 이용한 세정제와 이의 제조방법{cleansing compositon having Nandina domestica extract and manufacturing method thereof}

일반적으로 피부나 모발을 위한 세정제는 피부와 두피 및 모발의 땀과 피지, 먼지 등의 이물질을 씻어내는 기능을 하는 것으로, 비누, 샴푸, 바디클렌저 등의 다양한 형태로 이용되고 있다.

통상적으로 세정제는 묽은 용액 속에서 계면에 흡착하여 표면장력을 감소시키는 효과가 있는 계면활성제와 세정제 원액을 용해하거나 분산시키는 용제 및 수분을 흡수하거나 보전시키는 보습제로 구성되며 비누, 샴푸, 바디클렌저 등의 제형에 따라 점도제, pH조절제, 증점제, 컨디셔닝제, 색소 등의 조성비를 달리하여 구성된다.

오늘날 사회의 발달에 따른 환경적인 요인과 사회적인 요인 등의 다양한 원인들과 스트레스로 인하여 피부 면역시스템의 기능저하와 신진대사 능력의 저하 및 잦은 세정에 의한 피지의 과다한 제거로 인해 탈모증상 또는 거친 피부, 수분 부족으로 피부의 건조 현상 및 피부트러블, 아토피등의 피부 질환이 증가하고 있다.

따라서 최근에는 단지 세정의 목적만을 가지는 것이 아니라, 세정제에 주름개선, 피부보호, 피부재생 및 보습 기능 등의 다양한 효과를 부가하여 피부와 두피 및 모발을 보호하는 성분이 함유되어 있는 기능성 세정제가 빠르게 확산되고 있는 추세이다.

대한민국 등록특허 제10-1306841호에는 이탄과 모링가를 함유한 세정제 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-1684675호에는 피부세정제 조성물이 개시되어 있다.

한편, 남천(Nandina domestica Thunb)은 미나리아재비목(Ranunculales) 매자나무과(Berberidaceae) 식물로 일명 남촉목(南燭木) 또는 남천촉(南天燭), 천축자(天竺子), 천촉자(天燭子), 남죽자(南竹子), 남천죽(南天竹), 홍파자(紅杷子)이라고 한다. 남천은 중국 남방 지역, 일본, 인도, 한국 남부 지방 등 국가에 분포하여 흔히 볼 수 있는 늘푸른떨기나무이다. 나무 높이는 1.00~3.00m 정도까지 자랄 수 있으며, 잎은 광택이 있고, 가죽 같은 촉감이 있다.

남천의 잎은 남천죽엽이라고 하며, 백일해, 혈뇨, 타박상을 치료효과를 나타낸다. 겨울철에는 푸른색 잎은 빨간색으로 변하고 봄에 되며 다시 푸른색으로 변한다. 남천의 열매는 장과로 둥글고 0.50 ~ 1.00cm 정도로 10월 달에 익으며 홍색으로 바뀐다. 남천 열매는 민간에서 남천실(南天實) 또는 남천(南天), 남천죽자(南天竹子)이라고 하며 약재로서 사용되며, 명목, 지해, 청간의 효능을 가지고 있고, 진해약으로 염폐, 해수, 일본에서 만성 기침, 매독, 자궁출혈, 천식, 백일해 등의 치료에 사용되는 것으로 알려져 있다.

이러한 다양한 효능을 가지고 있는 남천을 소재로 이용한 세정제는 아직까지 알려진 바 없다.

대한민국 등록특허 제10-1306841호: 이탄과 모링가를 함유한 세정제 조성물 대한민국 등록특허 제10-1684675호: 피부세정제 조성물

본 발명은 상기의 문제점을 개선하고자 창출된 것으로서, 남천 추출물을 함유하여 항산화 및 피부보호 효과가 우수하여 피부 또는 모발 세정용으로 안전하게 사용할 수 있는 세정제와 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 남천 추출물을 이용한 세정제는 남천(Nandina domestica Thunb)으로부터 추출한 남천 추출물을 함유한다.

상기 세정제는 비누와 샴푸 중 어느 하나이다.

상기 남천 추출물은 상기 남천에 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나의 추출용매를 가하여 추출한다.

상기 남천 추출물은 상기 남천의 잎으로부터 추출한다.

상기 남천 추출물은 상기 남천의 잎에 에탄올을 가해 20 내지 30℃에서 60 내지 80시간 동안 추출한다.

상기 남천 추출물은 피부 주름개선 효과를 갖는다.

상기 남천 추출물은 피부세포 재생효과를 갖는다.

꽃황새냉이(Cardamine amaraeformis)의 발효물로부처 추출한 꽃황새냉이 발효추출물을 더 함유한다.

상기 꽃황새냉이 발효추출물은 꽃황새냉이 100중량부에 대하여 당 10 내지 30중량부를 혼합하고 발효균주를 첨가한 후 20 내지 40℃에서 20 내지 60일 동안 발효시킨 발효물을 진공추출하여 수득한다.

그리고 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 남천 추출물을 이용한 세정제의 제조방법은 남천(Nandina domestica Thunb)으로부터 남천 추출물을 추출하는 추출단계와; 상기 남천 추출물을 첨가하여 비누와 샴푸 중 어느 하나로 제형화시키는 제형단계;를 포함한다.

상술한 바와 같이 본 발명은 다양한 효능을 가지고 있는 남천을 세정제의 소재로 활용함으로써 기능성이 우수한 세정제를 제공할 수 있다.

본 발명의 세정제는 남천의 잎이나 줄기, 열매로부터 추출한 남천 추출물을 함유하여 항산화 효과,주름 개선 효과 그리고 세포 재생 효과가 우수하고, 피부에 자극 없이 안전하게 사용할 수 있다.

도 1은 남천의 열매(NDF), 줄기(NDB), 잎(NDL)으로부터 추출물을 추출하는 과정을 나타낸 블록도이고,
도 2는 NDF, NDB, NDL 추출물의 총 폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이고,
도 3은 NDF, NDB, NDL 추출물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이고,
도 4는 NDF, NDB, NDL 추출물의 프리라디칼 활성을 나타낸 그래프이고,
도 5는 NDF, NDB, NDL 추출물의 HaCaT 세포에 대한 독성시험결과를 나타낸 그래프이고,
도 6은 NDF, NDB, NDL 추출물의 HDFn 세포에 대한 독성시험결과를 나타낸 그래프이고,
도 7은 NDF, NDB, NDL 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 독성시험결과를 나타낸 그래프이고,
도 8은 NDF, NDB, NDL 추출물의 MC/9 세포에 대한 독성시험결과를 나타낸 그래프이고,
도 9는 HDFn 세포에서 NDF, NDB, NDL 추출물의 MMP-1의 발현을 나타낸 그래프이고,
도 10은 HDFn 세포에서 NDL 추출물에 의한 세포 증식결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 남천 추출물을 이용한 세정제와 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 세정제는 남천 추출물을 유효성분으로 함유한다.

남천 추출물은 남천(Nandina domestica Thunb)으로부터 추출하여 수득할 수 있다.

남천(Nandina domestica Thunb)은 미나리아재비목 매자나무과의 식물로 일명 남촉목(南燭木) 또는 남천촉(南天燭), 천축자(天竺子), 천촉자(天燭子), 남죽자(南竹子), 남천죽(南天竹), 홍파자(紅杷子)이라고 한다. 남천은 중국 남방 지역, 일본, 인도, 한국 남부 지방 등 국가에 분포하여 흔히 볼 수 있는 늘푸른떨기나무이다. 나무 높이는 1.00~3.00m 정도까지 자랄 수 있으며, 잎은 광택이 있고, 가죽 같은 촉감이 있다.

남천의 잎은 남천죽엽이라고 하며, 백일해, 혈뇨, 타박상을 치료효과를 나타낸다. 겨울철에는 푸른색 잎은 빨간색으로 변하고 봄에 되며 다시 푸른색으로 변한다. 남천의 열매는 장과로 둥글고 0.50~1.00cm 정도로 10월 달에 익으며 홍색으로 바뀐다. 남천 열매는 민간에서 남천실(南天實) 또는 남천(南天), 남천죽자(南天竹子)이라고 하며 약재로서 사용되며, 명목, 지해, 청간의 효능을 가지고 있고, 진해약으로 염폐, 해수, 일본에서 만성 기침, 매독, 자궁출혈, 천식, 백일해 등의 치료에 사용되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 남천은 다양한 부위를 이용할 수 있으나 바람직하게는 남천의 잎, 줄기, 열매 중에서 선택된 어느 하나의 부위를 이용한다. 특히 바람직하게는 남천의 잎을 이용한다.

남천 추출물은 남천에 추출용매를 가하여 수득할 수 있다. 이때 추출용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나를 이용할 수 있다.

탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 메탄올, 에탄올 등을 이용할 수 있고, 다가 알코올로 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 그리고 혼합물로는 물 및 저급 알코올의 혼합물, 물 및 다가 알코올의 혼합물, 저급 알코올 및 다가 알코올의 혼합물, 또는 물 및 저급알코올 및 다가 알코올의 혼합물을 이용할 수 있다.

추출의 일 예로 남천에 대하여 추출용매를 중량비로 2 내지 20배로 가한 후 10 내지 150℃에서 2 내지 100시간 동안 열수추출, 냉침 또는 온침 추출 방법으로 추출할 수 있다. 추출의 구체적 일 예로 남천의 잎에 에탄올을 10배로 가해 20 내지 30℃에서 60 내지 80시간 동안 추출하여 남천 추출물을 수득할 수 있다.

그리고 상술한 추출방법 외에도 환류냉각추출, 초음파 추출방법 등을 이용하여 추출할 수 있다. 또한, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 추출물에 포함되는 것이다.

또한, 추출용매를 이용하여 추출한 추출물을 여과, 감압농축 또는 동결건조, 분무건조 방식 등을 통해 분말 형태로 얻을 수 있음은 물론이다.

남천 추출물은 항산화 활성 및 피부 주름개선 효과와 피부세포 재생효과를 갖는다. 이러한 효과를 갖는 남천 추출물을 함유한 본 발명은 기능성이 우수한 세정제를 제공할 수 있다. 본 발명의 세정제는 손 세정용, 세안용, 바디워시용, 모발 세정용 등으로 활용할 수 있다.

본 발명은 세정제 총 중량에 대하여 남천 추출물을 0.01 내지 10중량% 함유할 수 있다. 남천 추출물의 함량이 0.01중량% 미만이면 항산화 효과 및 주름 개선 효과, 세포 재생 효과가 미미하고, 10중량%를 초과하게 되면 함량에 비해 상승된 효과를 가지기 어렵다.

본 발명의 세정제는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 각종 공지의 성분 등을 추가하여 비누 및 샴푸 중 어느 하나의 제형으로 형성될 수 있다. 비누는 고형비누, 액체비누, 크림상 비누일 수 있다. 본 발명의 세정제는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있고, 사용 대상에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

제형의 일 예로, 고형 비누는 남천 추출물 8.0중량%, 글리세린 2.0중량%, 에센스오일 1.0중량%, 지방산을 비누화시킨 비누베이스(잔량)로 조성될 수 있다.

또한, 제형의 일 예로 액체비누는 남천추출물 8.0중량%, 폴리쿼터니움 3.0중량%, 코코베테인 10.0중량%, 올리브리퀴드 2.0중량%, 글리세린 2.0중량%, 에센스 오일 0.5중량%, 정제수(잔량)로 조성될 수 있다.

또한, 제형의 일 예로 헤어샴푸는 남천 추출물 8.0중량%, 폴리쿼터니움 2.0중량%, 내추럴 리퀴드 1.0중량%, 코카미도 프로필베타인 3.0중량%, CDA 7.0중량%, LES 25.0중량%, 코코베테인 10.0중량%, 디엘 판테놀 3.0중량%, 글리세린 4.0중량%, 세붐-A 1.0중량%, 아데노신 2.0중량%, 에센스 오일 0.5중량%, 정제수(잔량)로 조성될 수 있다.

한편, 본 발명은 다른 예로 남천 추출물과 함께 꽃황새냉이 발효추출물을 함유할 수 있다. 꽃황새냉이 발효추출물은 꽃황새냉이를 발효시킨 발효물로부터 추출하여 수득할 수 있다.

꽃황새냉이( Cardamine amaraeformis)는 쌍떡잎식물 양귀비목의 두해살이풀로 산골짜기의 냇가에서 주로 자라는 식물이다.

꽃황새냉이는 전체부위를 이용하거나 잎만을 이용할 수 있다.

꽃황새냉이를 발효시키기 위한 방법으로서, 꽃황새냉이 100중량부에 대하여 당 10 내지 30중량부를 혼합하고 발효균주 0.01 내지 1.0중량부를 첨가한 후 20 내지 40℃에서 20 내지 60일 동안 발효시킨다. 당으로 당밀이나 설탕을 이용할 수 있다. 그리고 발효균주로 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 이용할 수 있다. 발효가 완료되면 발효물에 물을 가해 꽃황새냉이 발효추출물을 추출한다. 추출의 일 예로 저온에서 진공추출하는 방법을 이용할 수 있다. 가령, 진공저온추출기에 물 100중량부에 대하여 발효물 10 내지 50중량부를 투입한 후 진공(100 내지 200torr) 조건하에서 60 내지 80℃로 4 내지 10시간 동안 진공추출한다. 진공저온추출 후 여과하여 꽃황새냉이 발효추출물을 얻을 수 있다.

꽃황새냉이 발효추출물은 항산화 활성이 우수하여 세정제의 보존성을 높이고 피부개선 및 주름방지에 도움을 줄 수 있다. 특히 꽃황새냉이 발효추출물은 남천 추출물과 더해져 남천 추출물이 갖는 효과를 상승시킨다.

꽃황새냉이 발효추출물을 함유할 경우, 본 발명의 세정제는 전체 총 중량에서 남천 추출물을 0.01 내지 10중량%, 꽃황새냉이 발효추출물 0.1 내지 5중량%를 함유할 수 있다.

상술한 본 발명의 세정제의 제조방법은 남천으로부터 남천 추출물을 추출하는 추출단계와, 남천 추출물을 첨가하여 비누와 샴푸 중 어느 하나로 제형화시키는 제형단계를 포함한다.

먼저, 남천 추출물을 추출한다. 남천 추출물의 추출방법은 상술한 바와 같다. 가령, 남천에 대하여 추출용매를 중량비로 2 내지 20배로 가한 후 10 내지 150℃에서 2 내지 100시간 동안 열수추출, 냉침 또는 온침 추출 방법으로 추출할 수 있다. 추출의 구체적 일 예로 남천의 잎에 에탄올을 10배로 가해 20 내지 30℃에서 60 내지 80시간 동안 추출하여 남천 추출물을 수득할 수 있다.

다음으로, 각종 공지의 성분들에 남천 추출물을 첨가하여 비누와 샴푸 중 어느 하나로 제형화시킨다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험을 통하여 구체적으로 설명한다. 이는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위를 하기의 실시예로 한정하는 것은 아니다.

(실시 예: 남천 추출물 추출)

1. 재료 준비

(1)남천 준비

2016년 11월에 광주광역시에서 직접 채취한 남천(Nandina domestica Thunb; 광주광역시, 대한민국)을 열매, 줄기, 잎으로 부위를 나누어 준비하였다. 실험에 사용된 식물 표본은 ㈜코씨드바이오팜(충청북도, 청주)표본실에서 보관하였다.

(2)실험재료

Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), Phenicillin-streptomycin (PS), Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), Fetal bovine serum (FBS), Trypan bule, Phosphate buffered saline (PBS), Ham’nutrient mixture F-12 (F-12)는 Gibco (Rockville, MD, U.S.A.)에서 구입하였다. 6-well plate, 24-well plate, 96-well plate, Subculture plate는 SPL (Korea), L-ascorbic acid, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), Dimethyl sulfoxide (DMSO), Lipopolysaccharide (LPS), Nordihydroguaiaretic acid (NDGA), Etanol, Dexamethasone, Adenosine, Monoclonal anti-β-actin antibody produced in mouse, Compound 48/80, Histamine, Agarose, PMA, T-stim, 2-mercap-toethanol andL-glutamine, Quercetin, Gallic acid, Folin-Ciocaleu reagent 는 sigma (St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하였다. TNF-α, IFN-γ, RANTES ELISA kit, TARC ELISA kit, Histamine 등 ELISA kit는 R&D Systems사 (Minneapolis, U.S.A.)에서 구입하였다. Anti-rabbit lgG HRP-linked antibody, p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody, SAPK/JNK antibody, p38 MAPK antibody, Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) antibody, Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) antibody, and Phospho-p38 MAP Kinase (Thr180/Tyr182) antibody, RIPA는 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, U.S.A.)에서 구입하였다. MMP-1 (SB12e): sc-58377는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (California, Co., U.S.A.)에서 구입하였다. Goat anti-Mouse lgG (H+L) secondary antibody HRP는 ThermoFisher SCIENTIFIC (Waltham, Co., U.S.A.)에서 구입하였다. Bicinchoninic acid assay kit, SDS-PAGE gel (BioRad, U.S.A.)에서 구입하였다. Enhanced chemiluminescence는 (Amersham Pharmacia Biotech, U.S.A.), Griess는 (Promega, Madison, U.S.A.), Competitive-Enzyme linked ImmunoSorbent assay: ELISA는 (ALPCO Diagnostics, NH, U.S.A.), RT PreMix kit, PCR PreMix kit는 (Bioneer, Korea)에서 구입하였다. AlCl₃*?*H₂O, Acetonitrile, Methanol, Na₂CO₃은 DAEJUNG (DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co., Korea)에서 구입하였다.

사용된 기기는 Soxhlet (Wise Therm, korea), High speed refrigerated centrifuge (SUPRA, 21K, korea), Rotary evaporator (EYELA, SB-1200, Co., Japan), Microwave oven (LG, Korea), Voltex-1 (동서과학, Korea), CO₂ incubator (New Brunswick, U.S.A.), Micro centrifuge (Micro 12) (Hanil, Korea), Inverted microscope (NIKON, Japan), UVB 조사기 (U.S.A.), Clean bench (Vision scientific, Korea), Autoclave (Sanyo, Japan), Micro-pipet (Gilson, France), Water bath (Vision scientific, Korea), Vortex mixer (Vision scientific, Korea), Spectrophotometer (Shimazue, Japan), Centrifuge (Sigma, U.S.A.), Plate shaker (Lab-Line, U.S.A.), Micro plate reader (Molecular devices, U.S.A.), High speed refrigerated centrifuge (Hanil, Korea), Rotary evaporator (Heidolph Germany)，Series rotary evaporator (EYELA, Japan), Chemi-Doc (Atto, U.S.A.), Speed Vac (Servant, U.S.A.)를 사용하였다.

2. 남천 추출물 추출

남천의 열매(Nandina domestica Thunb fruit, 이하 NDF라 함), 줄기(Nandina domestica Thunb branches, 이하 NDB라 함), 잎(Nandina domestica Thunb leaf, 이하 NDL이라 함)으로부터 각각 추출물을 추출하였다.

실험에 사용할 NDF, NDB, NDL는 물로 깨끗하게 씻고 열풍건조기에 50℃에서 24시간 동안 건조한 후 각각 30g씩 분쇄기(HBL-3500S, ELEXION, Korea)로 분쇄하여 농도 70%(w/w) 에탄올을 중량비로 10배 가한 후 72시간 동안 상온(25℃)에 침지하여 추출하였다. 추출한 후 각각 추출물은 400mesh 여과지로 1차 여과한 후 1000 rpm에서 15min 동안 원심분리하여 상층액을 whatman No. 2 여과지로 2차 여과하였다. 여과된 NDF, NDB, NDL 추출물은 Rotary evaporator로 통해서 감압 농축하여 시료로 이용하였다. NDF 추출물 수율은 18.50%, NDB 추출물 수율은 10.20%, DNL 추출물 수율은 24.30%였다.

위의 남천 추출물의 추출과정은 도 1에 블록도로 나타내었다.

<실험예>

1. 실험방법

(1)총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀함량은 널리 사용되고 있는 Folin-Denis 방법(Folin & Denis, 1912)으로 측정하였다. 시료는 정제수에 1,000.00mg/ml로 완전히 용해시켜 여과 후 시료로 이용하였다. 먼저 각 well에 시료 샘플 20.00μl에 2N Folin-Ciocaleu 시약 20.00μl를 추가하며 혼합하였다. 5min 동안 방치한 후, 20.00% Na₂CO₃ 100.00μl를 넣고 그 상태에서 30min 동안 상온에서 방치하였다. Gallic acid는 15.63, 31.25, 62.50, 125.00 및 250.00 mg/ml 되도록 희석하며, 각 시료샘플 및 표준품의 흑광도 측정 방법은 micro plate reader로 730nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 작성한 표준곡선 mg/g gallic acid equivalents(GAE) 단위 계산하였다. 각 시료는 최소 3번 반복 실험하여 평균값을 구하였다.

(2)총 플라보노이드함량 측정

총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해, 각 시료는 EtOH에 1,000.00mg/ml 되도록 녹이고 표준품 Quercetin는 7.81, 15.63, 31.25, 62.50mg/ml로 희석하였다. 각 well에 시료를 20.00μl에 EtOH 80.00μl를 놓고 2.00% AlCl₃·6H₂O 100.00μl를 추가하며 5min 동안을 상온에 방치한 후 micro plate reader를 사용하여 430nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 작성한 Quercetin 표준곡선 mg/g Quercetin equivalents(QE) 단위로 따라서 계산하였다. 각 시료는 최소 3번 반복 실험하여 평균값을 구하였다.

(3)Free radical 소거 활성

DPPH 시약을 MeOH에 녹이고 NDF, NDB, NDL 시료는 각각 100.00mg/ml이 되도록 DMSO에 녹인 후 MeOH를 사용해서 희석하였다. 시료와 시료용매 각각 3.00, 10.00, 30.00, 100.00μl로 희석하여 실험을 진행하였다. DPPH군은 시료와 DPPH 180.00μl를 혼합하고 MeOH군은 시료와 MeOH 180.00μl를 혼합하였다.

10min 동안 상온에서 반응 시킨 후 microplate reader를 이용하여 565nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 500.00μM L-ascorbic acid를 사용하였다.

(4)피부 생리활성 효능 평가

가. 세포배양

-HaCaT 세포 배양조건

인간 각질 형성 세포(ATCC^® PCS-200-011^™, Primary Epidermal Keratinocytes, HaCaT, U.S.A.)는 미국 세포주 은행에서 분양을 받아서 시험을 진행하였다. 인간 각질 형성 세포는 DMEM에 10.00% FBS, 1.00% PS를 첨가하여 만든 배지를 사용하였다. CO₂ incubator는 37℃, 5.00% CO₂, full humidity 조건을 설정하여 배양하였다.

-HDFn 세포 배양조건

섬유아세포(ATCC PCS-201-010^™, Human Dermal Fibroblast neonatal, HDFn, U.S.A.)는 미국 세포주 은행에서 분양을 받아서 시험에 사용했다. HDFn 사용된 배지는 F-12과 DMEM를 각 1:3 비율로 혼합하였고 10.00% Fetal bovine serum(FBS), 1.00% phenicillin-streptomycin(PS)를 첨가하여 사용하였다. CO₂ incubator에 37℃, 5.00% CO₂, full humidity조건에 배양하였다.

-MC/9 세포 배양조건

비만세포(ATCC^® CRL-8306^™, Mus musculus, mouse, MC/9, U.S.A.)는 미국 세포주　은행에서 분양받아 시험에 사용하였다. 배지는 10.00% FBS, 10.00% T-stim,　0.05mM 2-mercap-toethanol and 2.00mM L-glutamine 및 100.00μg/ml streptomycin이 함유된 DMEM를 사용하였으며, CO₂ incubator에 37℃, 5.00% CO₂, full humidity 조건에서 배양하였다.

-RAW 264.7 세포 배양조건

대식세포(ATCC TIB-71^™, Mus musculus, mouse, RAW 264.7, U.S.A.)는 미국 세포주 은행에서 분양받아 시험에 이용하였다. 배지는 10.00% FBS를 첨가한 DMEM를 사용하였으며, CO₂ incubator에 37℃, 5.00% CO₂, full humidity조건으로 배양하였다.

나. 세포독성 실험

-HaCaT 세포

HaCaT 세포를 계수하여 1 ×10⁵cells/ml이 되도록 96-well plate에 분주하고 세포를 안정화시켰다. NDF, NDB, NDL 추출물을 DMSO에 용해하여 100.00mg/ml 될 수 있도록 제조하였다. 각 시료는 0.20μm filter를 사용하여 제균 처리한 후 사용하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 농도별로 샘플을 희석하여 처리하고 24hrs 동안 반응시켰다. 양성대조군 Dexamethasone는 0.10, 1.00μM로 2hrs 전 처리하였다. TNF-α + IFN-γ 10.00 mg/ml를 처리하고 24 hrs동안 반응시켰다. 5.00mg/ml의 MTT 용액을 각 well당 20.00 μl씩 첨가하여 37℃ 배양기에서2~3hrs 반응시킨 후, 상층액을 모두 제거하였다. 생성된 formazan을 용해하기 위해 DMSO를 각 well 100.00μl씩 DMSO를 사용하고 micro plate reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

-HDFn 세포

HDFn 세포를 계수하여 1 ×10⁵cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 세포를 안정화시켰다. 24hrs 안정화 시킨 후, NDF, NDB, NDL 추출물을 DMSO에 녹인 후 시료 100.00mg/ml 될 수 있도록 제조하였다. 각 시료는 0.20μm filter를 사용하며 제균하여 사용하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 10.00% FBS 함유된 DMEM로 통해서 10.00, 30.00, 100.00μg/ml 3개 샘플을 희석하여 작은 농도부터 처리하였다. 24hrs 후 MTT 용액을 이용하여 세포독성을 확인하였다. MTT 용액을 각 well당 50.00μl씩 첨가하여 2~ 3hrs 후 배지를 제거하고 생성된 formazan을 용해하기 위해 350μl의 DMSO를 사용하고 micro plate reader을 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

-RAW 264.7 세포

RAW 264.7 세포를 계수하여 4 ×10⁵cells/ml로 96-well plate에 분주하고, 2 hrs 동안 세포 안정화시켰다. NDF, NDB, NDL 추출물을 DMSO에 용해하여 100.00 mg/ml 될 수 있도록 제조하였다. 각 시료는 0.20μm filter를 사용하여 제균 처리한 후 사용하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml로 2.00 μl로 처리하고 24 hrs 동안 반응시켰다. 5.00mg/ml의 MTT 용액을 각 well당 10.00 μl씩 첨가하여 37℃ 배양기에서 2 ~ 3 hrs 반응시킨 후 상층액을 모두 제거하였다. 생성된 formazan을 용해하기 위해 DMSO를 각 well당 100.00 μl씩 DMSO를 사용하고 Micro plate reader를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

-MC/9 세포

MC/9 비만세포를 계수하여 2 ×10⁵cells/ml로 96-well plate에 분주하고 세포를 안정화시켰다. NDL를 DMSO에 용해하여 100.00mg/ml 될 수 있도록 제조하였다. 각 시료는 0.20μm filter를 사용하여 제균 처리한 후 사용하였다. NDL은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml로 2.00μl로 처리하고 24 hrs 동안 반응시켰다. 5.00 mg/ml의 MTT 용액을 각 well당 10.00μl씩 첨가하여 37℃ 배양기에서 2 ~ 3 hrs 반응시킨 후 상층액을 모두 제거하였다. 생성된 formazan을 용해하기 위해 DMSO를 각 well 100.00μl씩 DMSO를 사용하고 Micro plate reader를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

다. 주름 개선 효과

Western blot를 통한 HDFn 세포 내 MMP-1의 발현을 측정하였다. 세포는 4 ×10⁵cells/well로 6-well plate에 분주한 후 37℃, 5.00% CO₂ 배양기에서 over night 안정화시켰다. 배지를 제거하여 37℃ 따뜻한 PBS 1.00ml로 2번씩 washing하여 각 well당 2.00ml씩 PBS로 채우고 7.00cm 높이에 UVB 15min 동안 조사하였다. 15 min 후에 cell 상태를 확인하여 PBS를 제거하며 2.00% FBS함유된 배지를 2.00ml씩 넣고 NDF, NDB, NDL 추출물은 30.00, 100.00 μg/ml로, 양성대조군 adenosine는 100.00 μg/ml로 처리하며 6 hrs 반응을 시킨 후, 세포의 protein를 분리하였다. 세포를 aspirator로 supernatant를 제거하고 완충 용액 인산 원충 식염수 1 x PBS 1.00 ml를 사용하여 세척 후 제거하였다. 다시 1 x PBS를 1.50ml씩 각 well에 추가하고 cell scraper로 긁어서 1.50ml tube에 수득하고 vortex mixer를 사용하여 세포를 침전시켰다. Supernatant를 제거한 후 1 x RIPA를 각 tube에 100.00μl씩 넣고 vortex 세포를 용해하였다. Tube를 얼음에 30min 동안 넣고 10min씩 반응을 시켰다. 30min 후에 12,000 rpm, 15 min 동안, 4℃에서 원심분리하고 supernatant를 수득하였다. 단백질 정량 실험은 bicinchoninic acid assay kit을 사용하여 수득한 상층액을 정량하였다. 20.00μg의 단백질을 8.00% SDS-PAGE gel에서 전기영동을 하였다. 크기에 따라서 분리된 단백질은 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane에 이동한 후 1 x TBST에 5.00% skim milk 제조하여 1hr 실온에 흔들면서 blocking 단계를 진행하였다. 1 hr 후에 1 x TBST로 10min씩 5희 세척하였다. MMP-1의 1차 항체를 1: 800로, β-actin 1차 항체를 1 : 2500로 4℃에서 O/N로 흔들면서 well plate에 고정시켰다. 항체가 고정된 well plate를 4℃에서 꺼내서 실온에 3 hrs 반응시키고 1 x TBST로 10min씩 5회 세척하였다. Goat anti-Mouse lgG(H+L) secondary antibody HRP 2차 antibody는 1 : 3000로 5.00% skim milk에 희석하여 실온에서 흔들면서 반응시켰다. 2 hrs 후에 1 x TBST로 10min씩 5회 세척하였다. Enhanced chemiluminescence를 사용하여 밴드를 확인하며 imageJ 1.47 software를 이용하여 밴드를 수치화하였다.

라. 피부세포 재생 효과

HDFn는 1 ×10⁴cells/well로 96-well plate에 분주한 후 하룻밤 세포를 안정화시켰다. 다음 날 배지를 0.20% FBS 함유된 배지로 바꾸고 시료를 처리하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml로 2.00μl씩 처리하였다. 24 hrs, 48 hrs 반응하여 MTT시약 30.00 μl씩 처리하여 3 hrs 후부터 확인하여 550nm에 흡광도를 측정하며 결과를 분석하였다.

(5)통계분석

실험은 3회 반복하여 실시하였으며 데이터 분석을 위하여 Excel program을 사용하였고 mean±standard deviation(S.D.)로 나타내었으며, 통계적 유의성은 Student's t-test법을 사용하여 ＊p < 0.05의 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

2. 실험결과

(1)추출수율

70.00% 에탄올을 이용하여 추출한 결과, 하기 표 1과 같이 NDF 추출물의 수율은 18.50%, NDB 추출물 수율은 10.20%, NDL 추출물 수율은 24.30%로 나타났다.

추출물	Total Yield (%)
NDF	18.50%
NDB	10.20%
NDL	24.30%

Total yield(%) = (sample extract weight/sample dry weight) ×100%

(2)총 폴리페놀 함량

폴리페놀은 다양한 식물 중에서 광범위하게 존재하고 있으며, 다양한 분자구조와 분자량을 가지고 있는 물질이다. 이 폴리페놀성 물질은 phenolic hydroxyl(OH)을 포함하기 때문에, 다른 거대 분자나 단백질과 쉽게 결합할 수 있어서 항염, 항산화 등 여러 종류의 생리활성을 가지고 있다. 폴리페놀은 Free radical에 의한 DNA 손상, 단백질 변성, 지질 과산화 등의 산화적 영향으로 발병되는 피부노화 및 심혈관질환 등에 대해서 보호하는 역할을 수행한다.

도 2를 참조하면, 총 폴리페놀의 함량은 NDL 추출물에서 85.82±0.05 mg/g로 가장 높은 폴리페놀을 함유되어있는 것으로 나타났고, NDF, NDB 추출물은 각각 67.93±0.09, 44.52±0.03 mg/g로 나타났다.

진의 논문을 보면 와송은 70.00% 에탄올 추출물에서 24.14mg/g으로 나타났고 다른 용매 추출한 추출물 보다 가장 높은 폴리페놀을 함유하는 것으로 관찰되었다(진동혁 등, 와송추출물의 총 페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성 비교. 한국환경과학회지; 25(5), 695-703. 2016). 송 등 논문을 보면 조릿대 에탄올 추출물 총 폴리페놀함량은 41.46mg/g으로 나타났고 열수 추출물과 비교하면 높은 폴리페놀함량을 확인하였다(송원영 등, 조릿대 추출물의 용매별 항산화 및 항염증 활성. 농업생명과학연구; 49(3), 145-154. 2015). 박의 논문 내용을 보면 마치현 70.00% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 결과를 보면 34.14 ±0.28 μg/mg으로 나타났다(박소라 등, 마치현 열수 및 에탄올 추출물의 항산화 활성. 대한본초학회지; 32(4), 39-46. 2017).

위의 논문의 결과와 비교하였을 때 NDF, NDB, NDL 추출물에서 측정한 폴리페놀 함량은 매우 높은 것으로 확인되었다.

(3)총 플라보노이드 함량

대표적인 항산화 물질인 플라보노이드는 Ｃ₁₅화합물로 2개의 페닐 고리가 3개의 탄소와 결합되어 있다. 플라보노이드와 그 배당체는 인체에서 다양한 생리활성을 가지고 있으며, 그 중류는 Chalcones, flavones, flavonols, isoflavonoids 등으로 구분된다.

플라보노이드는 폴리페놀계 화합물의 일종으로 자연에서 폭넓게 분포하고 있는 이차 대사체의 일 종이며 식물과 채소 등의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 열매 등에 함유되어있으며, 과일류, 곡물 등에도 대량적으로 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

플라보노이드는 식물의　성장, 분화, 착색에 연관되어 자외선에 대한 방어 작용, 병원 미생물 대한 방어 작용, 효소 활성 조절 효과 등 여러 기능을 가지고 있다. 플라보노이드는 다양한 약리활성 효과로 항염, 항산화, 항알레르기 효과 및 순환기계 질환의 예방, 지질저하, 면역증강 작용을 나타낸다. 플라보노이드는 내부의 존재하는 여러 화합물과 쉽게 결합이 가능한 히드록실기(-OH)를 가지고 있기 때문에 항산화 작용을 나타낸다.

실험은 표준물질로 Quercetin으로 사용하며 7.81, 15.63, 31.25, 62.50 mg/ml로 작성하는 표준 검량 곡선을 통해서 플라보노이드화합물을 정량하였다.

NDF, NDB, NDL를 1000.00mg/ml에 함유된 총 플라보노이드 함량을 정량한 결과 도 3에 나타난 바와 같이 NDF, NDB, NDL 추출물은 각각 2.37±0.00, 5.05±0.01, 12.96±0.02 mg/g인 것으로 확인되었으며, 그 중에 NDL 추출물에서 가장 많은 플라보노이드가 함유되어 있는 것으로 나타났다.

박 등의 논문에서 70.00% 에탄올 마치현 추출물의 총 플라보노이드 양은 4.40 ±0.22μg/mg으로 나타났다(박소라 등, 마치현 열수 및 에탄올 추출물의 항산화 활성. 대한본초학회지; 32(4), 39-46. 2017). 이 등의 논문에 독활 70.00% 에탄올 추출물 제조한 시료의 플라보노이드 함량은 4.54 mg/g로 나타났다(이성규 등, 독활 에탄올추출물의 항산화 및 항염증 활성. 한국자연치유학회지; 4(1), 10-14. 2015). 이와 비교하면 NDL 추출물은 마치현의 2.9배, 독활의 2.8배 정도 더 높은 농도의 플라보노이드 함량을 나타내었다. 따라서 위의 논문의 결과와 비교하였을 때 NDF, NDB, NDL 추출물에서 플라보노이드의 함량은 높게 나타난 것으로 확인하였다.

(4)프리라디칼 소거 활성

프리라디칼(Free radical) 특히 ROS는 생명체 내에서 전자운반 중 불안전한 환원현상을 일으키거나 cytokine 등의 여러 단계 대사과정에 생성된다. 또한 산화질소, 오존, 스모그, 흡연과 자외선 등 환경적 오염에 의해서도 끊임없이 생성할 수 있다. hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide radical, singlet oxygen 등의 ROS로 다양하게 존재하는 프리라디칼은 세포막을 파괴하여 단백질을 변성시키고, 지질 과산화, DNA를 손상시킨다. 여러 산화에 의해 생성된 물질은 산화적 스트레스(oxidative stress)의 유발을 통하여 노화와 관련된 생리적 장애 및 암, 당뇨병, 동맥경화, 심장질환 등 각종 질환들도 일으킨다고 알려지고 있다.

NDF, NDB and NDL 추출물의 프리라디칼 소거 활성을 확인하기 위해 3.00, 10.00, 30.00, 100.00μg/ml의 4개 농도로 희석하여 실험을 실시하였다.

도 4를 참조하면, 양성대조군인 ascorbic acid은 500.00uM에서는 free radical 소거 활성이 91.41±0.21%로 나타났다. 그리고 NDF 추출물은 농도에 따라 2.46±1.93, 14.88±4.02, 39.97±5.98, 89.69±0.79%로 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 그리고 NDB 추출물은 농도에 따라 1.45±0.33, 5.51±1.78, 15.12±4.15, 53.34±8.44%로 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났으며, NDL 추출물은 농도에 따라 6.87±0.12, 20.73±1.86, 46.61±1.99, 90.87±1.13% 농도 의존적으로 증가를 나타내었다.

실험군은 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있게 증가하여 free radical 소거 활성에 효능이 있는 것으로 확인되었다. 이중 NDL 추출물에서 농도 의존적으로 다른 시료에 비하여 상대적으로 높은 효능을 확인하여 항산화 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

이의 논문에서 독활 70.00% 에탄올 추출물의 free radical 소거 활성과 천연 항산화제 L-ascorbic acid 측정한 결과는 독활 에탄올 추출물 10.00, 50.00, 100.00μg/ml에서 각각 3.16%, 20.53%, 63.16%의 free radical 소거 활성을 확인하였다(이성규 등, 독활 에탄올추출물의 항산화 및 항염증 활성. 한국자연치유학회지; 4(1), 10-14. 2015). 진 등의 논문에 보면 블랙 초크베리 70.00% 에탄올 추출물이 0.40, 0.60 mg/ml에 92.49 ±0.07%, 93.50 ±0.07%의 소거 활성이 나타났다(진동혁 등, 블랙 초크베리 추출물의 항산화 활성 및 아질산염 소거 활성. 한국환경과학회지; 25(4), 567-577. 2016).

위의 논문결과와 비교하면 NDF, NDB과 NDL 추출물 모두 free radical 소거능이 우수한 것으로 나타났으며, 농도 의존적으로 높을수록 free radical 소거 활성 증가하는 것으로 나타났다. 또한 대조군과 비교하였을 때 유의성 있는 증가를 확인하였다. 특히 NDL 추출물의 4개 농도에서는 유의성 있는 증가를 나타내어 높은 항산화 효과가 있는 것으로 보이며, 이는 좋은 천연 항산화제로 활용될 수 있는 것으로 기대된다.

(5)세포독성

-HaCaT cell

HaCaT cell, HDFn cell, RAW 264.7 cell, MC/9 cell을 이용하여 NDF, NDB과 NDL 추출물의 세포독성을 확인하였다. 세포독성 실험을 통해서 시료의 안전한 사용농도를 확인할 수 있으며 독성이 나타나지 않는 범위에서 실험을 진행하였다.

인간 각질형성세포주인 HaCaT를 자극하면 TARC의 생성을 증가시켜서 아토피　피부염에 대한 영향을 줄 수 있다. 또한 HaCaT에 TNF-α + IFN-γ를 사용해서 알레르기 반응 유도하여 중요한 표적물질인 RANTES 같은 chemokine의 형성 억제 효과를 검증하기 위해 실험을 실시하였다.

도 5를 참조하면, NDF 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 90.49±5.24, 103.26±5.83, 93.50±8.92%의 세포생존율을 나타내었고, NDB 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 93.97±3.89, 90.39±2.17, 97.17±7.59%의 세포생존율을 나타내었으며, NDL 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 100.08±3.44, 92.21±3.06, 94.11±9.54%의 세포생존율을 나타내었다.

통계프로그램으로 실험군과 대조군을 비교하였을 때 차이가 없는 것으로 확인되어 200.00μg/ml까지 처리한 HaCaT세포에 유의적인 차이를 나타내지 않아 독성이 없는 것으로 나타났다.

-HDFn cell

피부섬유아세포는 자외선에 조사되면 ROS에 의해 matrix metalloproteinases (MMPs)를 생성한다. 사람 피부 섬유아세포인 HDFn은 주로 MMP-1 발현 억제 효과, Type I procollagen 합성능 실험에 많이 사용된다.

도 6을 참조하면, NDF 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 103.08±0.38, 100.62±0.28, 104.39±0.39%의 세포생존율을 나타내었고, NDB 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 100.81±0.37, 105.60±0.54, 103.67±0.80%의 세포생존율을 나타내었으며, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 104.27±0.78, 99.58±0.65, 101.40±0.49%의 세포생존율을 나타내었다.

실험군과 대조군을 비교하였을 때 100.00μg/ml까지 처리한 HDFn세포에서 유의적인 차이가 나타나지 않아 독성이 없는 것으로 판단되었다.

-RAW 264.7 cell

마우스의 대식세포 세포주인 RAW 264.7는 염증반응에 핵심적인 역할을 담당한다. 대식세포에 LPS로 자극해주면 염증반응을 조절해 주는 염증 전사인자들을 활성화시켜서 NO, cytokine, MAPKs 등 염증에 관한 물질을 생산한다.

도 7을 참조하면, NDF 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 102.05±18.59, 104.08±19.22, 108.64±22.11%의 세포생존율을 나타내었고, NDB 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 95.63±18.33, 95.17±17.05, 94.27±20.88%의 세포생존율을 나타내었으며, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00 μg/ml에서 94.34±19.25, 96.64±20.39, 108.79±26.98%의 세포생존율을 나타내었다.

실험군과 대조군을 비교하였을 때 100.00μg/ml까지 처리한 RAW 264.7 세포에서 유의적인 차이를 나타내지 않아 독성이 없는 것으로 판단되었다.

-MC/9 cell

실험동물　쥐의　mast　cell인 MC/9 세포는 피부, 림프관 주위 등 생체조직에 널리 분포되어 있다. 비만세포는 알레르기 반응에 중요한 역할을 하고 있으며 활성화 되면 탈과립이 유도되어 세포내 과립에 저장되는 histamine 등 지질 매개물질과 cytokine 등 여러 종류의 화학적 매개물질을 생성한다.

도 8을 참조하면, NDL 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 113.61±13.46, 110.42±2.49, 100.68±2.47%의 세포생존율을 나타내었다. 이에 따라 MC/9 세포에 독성이 없는 것으로 확인되었다.

(6)주름 개선 효과

피부 노화는 자연노화, 외인성 노화로 2종류로 구분되어진다. 이중 외인성노화는 자외선으로 인한 피부노화로 광노화라고 한다. 태양광선 중 자외선은 살균 작용, 비타민 D 합성 등의 효과를 나타내지만, 피부에 과도한 자외선이 자주 노출되면, 피부 안에 도달하여 피부를 자극하고 섬유아세포 및 각질형성세포에 작용하여 ROS를 유발하게 되고, MMPs를 생성하게 된다.

MMPs는 섬유아세포 및 각질형성세포 등 피부에 있는 세포들로부터 분비되는 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM) 단백질 성분을 분해에 관련하는 효소의 총칭으로 구체적인 기능과 구조에 따라 interstitial collagenase, gelatinase, stromelysin, membrane-type MMPs로 나뉜다.

MMPs는 피부 구성 물질 glycosaminoglycane(GAG), elastin, collagen, hyaluronic acid의 생산력을 감소시킨다. MMPs는 다양한 원인으로 발현이 증가하여 결합조직에 손상을 주어 깊은 주름을 형성한다. MMPs중에 MMP-1은 진피에 있는 콜라겐을 분해하는 효소로 피부 노화에 영향을 미친다. 진피층은 90.00%이상 콜라겐으로 구성되어 있으며, 그중에 type Ⅰ 콜라겐은 총 콜라겐의 80.00% 이상을 차지하고 있고, type Ⅲ 콜라겐은 약 15.00%를 자지하고 있다. 콜라겐의 주요 역할은 결합조직의 결합력 및 저항력, 세포간의 접착지탱, 세포들 분할 및 분화 과정을 유도한 피부구조를 견고하게 도움을 준다. 이러한 여러 가지 역할 때문에 콜라겐이 감소하게 되면, 주름형성 탄력저하등 피부 노화 형상이 나타난다.

현재 노화작용을 늦추기 위해 여러 가지 약물을 적용하여 사용하고 있으며, 일반적으로 사용되는 주름 개선 약물이나 치료제는 대표적으로 비타민 C 및 그 유도체, 비타민 A 및 그 유도체 retinol 그리고 다양한 항산화제 및 retinyl palmitate, epigallocatechin gallate, adenosine 등을 사용하고 있다.

이에 주름개선 효과를 알아보기 위해 HDFn을 이용한 NDF, NDB and NDL 추출물의 MMP-1 발현량 저해 효과 실험을 실시하였다.

도 9를 참조하면, UV를 15min 동안 HDFn에 조사한 결과, 양성대조군인 adenosine 100.00μg/ml에서는 66.33%의 MMP-1 저해가 나타났다. 그리고 NDF 추출물은 30.00, 100.00μg/ml에서는 MMP-1 저해 효과가 나타나지 않았다. NDB 추출물은 30.00, 100.00μg/ml에서 9.11%, 43.78%의 MMP-1 저해 효과를 나타내었고, 100.00μg/ml에서 유의성이 있는 저해효과를 나타내었다. NDL 추출물은 100.00μg/ml에서만 67.04%의 유의성 있는 MMP-1 저해 효과를 나타내어, 양성대조군 adenosine과 비슷한 저해효과를 갖는 것으로 확인되었다.

황 등 논문에 따르면 HDFn에서 MMP-1의 발현 실험 중에 대조군과 비하여 초석잠 에탄올 추출물 처리한 실험군은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 각각 6.40%, 8.00%, 9.70% MMP-1의 발현을 유의적으로 감소시켰고, 양성대조군 ascorbic acid는 100.00μg/ml에서 16.70%로 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(황지연 등, 체피부섬유아세포에서 초석잠 에탄올 추출물의 주름형성 억제 효능. 대한미용학회지;11(4). 293-301. 2015).

위 논문과 비교하면 NDL 추출물에서 100.00μg/ml의 농도에서 67.04%의 MMP-1 억제효과를 확인하였다. 이는 NDL 추출물이 MMP-1 발현억제로 주름개선 효과가 있는 것으로 추측할 수 있다.

(7)피부세포 재생 효과

각종 환경 오염물질, 자외선 조사 등 외부 요소 및 stress, 영양결핍, 나이의 증가 등 인체 내재요소에 따라서 피부세포들이 손상된다. 피부가 상처를 받으면 정상적인 상처치유 과정은 4 단계로 구성되어 있다. 즉, 지혈과정, 염증과정, 증식과정, 상처 수축과정으로 거치지만 각 단계에서 불균형이 나타나면 상처치유가 늦어지게 되고, 상처 치유 후 흉터가 남는다. 상처를 발생할 때 섬유아세포는 상처부위 쪽으로 이동 및 증식하며 상처 부위를 수축 시키면서 진피층에 세포외 기질인 교원질 등을 합성해주는 역할을 수행하기 때문에 섬유아세포의 증식은 매우 중요하다. 반면, 세포의 증식이 원활하지 않으면 피부에 주름을 생기고 탄력을 손실되면서 각질화 문제를 유발한다. 이와 같은 이유로 천연물의 유효성분들은 섬유아세포의 증식과 콜라겐의 생성을 촉진해주고 주름의 예방도 효과적이고 노화 현상까지도 지연할 수 있다.

HDFn 섬유아세포를 사용해서 NDL 추출물의 세포 재생 효과를 확인하기 위해 10.00, 30.00, 100.00μg/ml로 실험을 실시하였다. 0.20% FBS 함유된 배지에 시료를 처리하여 24 hrs, 48 hrs 후 후실험 결과를 확인하였다.

도 10을 참조하면, 24 hrs에 나타나는 결과는 NDL 추출물 10.00, 30.00, 100.00μg/ml 농도에서 1.20±11.38, 12.76±5.15, 41.54±2.89%의 세포 증식을 나타내었다. NDL 추출물은 농도 100.00μg/ml에서 대조군에 비하여 유의성 있는 증가를 나타내었다. 그리고 농도 의존적으로 세포 증식효과를 확인하였다. 48 hrs에 나타나는 결과에서 NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 3.32±12.42, 34.22±11.52, 66.11±6.45%의 세포 증식을 나타내었다. NDL 추출물은 농도 30.00, 100.00μg/ml에서 농도 의존적으로 대조군에 비하여 유의성 있는 세포 증식효과를 나타내었다.

박 등의 논문에서는 생강나무 물 추출물 200.00μg/ml에 처리한 실험군은 대조군과 비교하면 33.80%의 세포생존율을 확인 되어 세포증식이 유의하게 증가하는 것을 나타났다(박금주 등, 생강나무 추출물의 광노화에 의한 주름형성 억제 효과. 대한화장품학회지; 35(4), 317-323. 2009). 장 등의 논문에 70.00% 주정로 추출한 인삼추출물은 100.00 μg/ml로 처리할 때 실험군은 대조군에 비하면 농도 의존적으로 섬유아세포의 증식 효과를 확인하였다(장정화 등, Hairless Mice에서 UVB로 유도된 피부손상에 인삼추출물(Ginseol K-b1)이 미치는 영향. 동아시아 식생활학회지; 22(2), 224-230. 2012). 김 등의 논문에서 마 에탄올 냉침, 온침 추출물로 처리하였을 때 냉침추출물 200.00 mg/ml 처리할 때 9.70%로 나타냈고, 온침추출물 200.00 mg/ml에 14.00%로 더 높은 증식률을 나타내었다(김대성 등, 마의 항노화 및 피부 보습 효과. 동의생리병리학회지; 25(3), 425-430, 2011).

이와 같은 결과는 논문 결과와 비교하여 NDL추출물이 세포재생에 대한 효과가 저농도에서 높게 나타나고, 세포 재생에 효과적인 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 피부 재생에 효과적인 것으로 보인다.

3. 결론

(1)70.00%의 에탄올로 추출한 NDF 추출물의 수율은 18.50%, NDB 추출물의 수율은 10.20%, NDL 추출물의 수율은 24.30%로 나타났다.

(2)총 폴리페놀 함량은 농도 1000.00 mg/ml에서 NDF, NDB, NDL 추출물 각각 67.93, 44.52, 85.82 mg/g으로 확인하였다.

(3)총 플라보노이드 함량은 농도 1000.00mg/ml에서 NDF, NDB, NDL 추출물 각각 2.37, 5.05, 12.96 mg/g으로 나타났다.

(4)항산화 실험 결과는 NDF, NDB, NDL 추출물 모두 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 10.00μg/ml에부터 free radical 소거 활성이 유의성 있게 나타났다. 특히 NDF, NDL 추출물은 농도 100.00μg/ml에서 양성대조군인 Ascorbic acid 과 대등한 효능을 갖는 것으로 확인되었다.

(5)주름을 형성에 영향을 주는 주요인자인 MMP-1에 대한 발현억제 효과는 NDB 추출물은 농도 30.00μg/ml에서 9.11%, 100.00μg/ml에서 43.78%의 MMP-1 저해효과를 나타냈으며, 농도 100.00μg/ml에서 유의성 있게 감소하였다. NDL 추출물은 농도 100.00μg/ml에서 67.04%의 MMP-1 저해 효과를 갖는 것으로 확인되었고, 양성대조군 Adenosine 100.00 μg/ml과 유사한 저해 효과로 확인되었다.

(6)세포 재생실험 결과는 24 hrs에 NDL 추출물 농도 100.00μg/ml에서 41.54%로 유의하게 세포 증식율을 확인하였다. 48 hrs에 NDL 추출물 농도 30.00μg/ml에서 34.22%, 100.00μg/ml에서 66.11%로 유의한 결과를 확인하였다.

이상의 실험결과를 종합하여 볼때, 남천 추출물은 항산화 효과, 주름 개선 효과 그리고 세포 재생 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서 남천 추출물이 함유된 본 발명의 세정제는 항산화 효과, 주름 개선 효과 그리고 세포 재생 효과가 있어서 피부의 노화를 억제하고, 피부를 개선하며, 피부의 탄력성을 증가시키는 등 우수한 기능성을 갖는다.

(실시 예:세정제 제조)

1. 세정제 제조

남천 추출물과 꽃황새냉이 발효추출물을 이용하여 액체비누 형태의 세정제를 제조하였다.

남천 추출물은 상술한 실험에 사용된 남천 추출물(NDL)을 이용하였다. 그리고 꽃황새냉이 발효추출물은 아래와 같은 방법으로 추출하였다.

꽃황새냉이 잎 100g에 대하여 당밀 20g을 혼합하고 발효균주로 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 0.2g 첨가한 후 30℃에서 40일 동안 발효시켰다. 그리고 발효된 발효물에 물 300g을 가한 후 진공(150torr)하에서 70℃로 6시간 동안 진공추출하였다. 진공추출 후 400mesh 여과지로 1차 여과한 후 1000rpm에서 15min 동안 원심분리하여 상층액을 whatman No. 2 여과지로 2차 여과하여 꽃황새냉이 발효추출물을 얻었다.

제 1세정제샘플은 남천추출물 8.0중량%, 폴리쿼터니움 3.0중량%, 코코베테인 10.0중량%, 올리브리퀴드 2.0중량%, 글리세린 2.0중량%, 에센스 오일 0.5중량%, 정제수(잔량)를 배합하여 제조하였다.

그리고 제 2세정제샘플은 남천추출물 8.0중량%, 꽃황새냉이 발효추출물 3.0중량%, 폴리쿼터니움 3.0중량%, 코코베테인 10.0중량%, 올리브리퀴드 2.0중량%, 글리세린 2.0중량%, 에센스 오일 0.5중량%, 정제수(잔량)를 배합하여 제조하였다.

그리고 대조세정제샘플은 폴리쿼터니움 3.0중량%, 코코베테인 10.0중량%, 올리브리퀴드 2.0중량%, 글리세린 2.0중량%, 에센스 오일 0.5중량%, 정제수(잔량)를 배합하여 제조하였다.

2. 항산화활성 측정

각 세정제샘플의 항산화 활성을 측정하였다. 항산화 활성은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. 세정제샘플 시료 2mL에 0.2mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)용액 2mL를 혼합한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거 활성능은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 라디칼 소거 활성능은 다음과 같은 식에 의해 계산하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 라디칼소거활성능(%)=(1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100

구분	라디칼소거활성능(%)
제1세정제샘플	53.8±1.20
제2세정제샘플	69.2±0.67
대조세정제샘플	25.3±0.42

상기 표 2의 결과를 참조하면, 제 1 및 제 2세정제샘플은 대조세정제샘플에 비해 라디칼소거활성능이 훨씬 더 높게 나타났다. 이는 남천추출물을 첨가한 경우 항산화 효과를 높일 수 있음을 의미한다. 그리고 제 1세정제샘플과 제 2세정제샘플을 비교시, 제 2세정제 샘플의 라디칼소거활성능이 더 높게 나타났다. 남천추출물을 단독으로 사용하는 경우보다 꽃황새냉이 발효추출물을 함께 사용하는 경우 항산화 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. 이는 남천추출물과 꽃황새냉이 발효추출물이 더해지는 시너지 효과에 의해 항산화활성을 크게 향상시킨 결과로 추정된다.

3. 피부테스트 실험

피부 자극 정도를 알아보기 위해 제 1세정제샘플 및 제 2세정제샘플을 이용하여 피부 테스트를 실시하였다. 피부 테스트를 위해 총 20명의 남녀(평균연령 35세)의 등 부위에 시료를 함유한 특수한 첩포(IQ chamber,Chemotechnique, Sweden)를 붙인 후 24시간이 경과하여 떼어내고 30분 후 판독하는 표준화된 안전성 평가방법인 24h single epicutaneous patch test로 수행하였다. 피부의 반응정도는 홍반, 부종, 가피 및 얕은 궤양 등에 관한 ICDRG(international contact dermatitis research group) 평가 기준표에 의해 1~4점으로 결정하여 총 평균값으로 기록하였다. 피부테스트 실험결과를 하기 표 3에 나타내었다.

피부자극의 개연성은 평균평점기준으로 전체 피시험자의 20%인 4명 이상에서 피부반응 2 이상의 반응이 있는 경우로 약 평균평점 45 이상인 경우이다(ICDRG score index 0~15: 피부 자극 없음, 15~25: 피부 자극이 없는 수준의 미약한 홍반, 25~45: 경미한 홍반과 부종으로 추가 확인시험 필요, >45:피부자극의 개연성이 있음).

구분	피부자극도
제1세정제샘플	＜1.5
제2세정제샘플	＜1.5

상기의 표 3의 결과로부터, 2종의 샘플들 모두 피시험자들에게 유의한 피부자극을 일으킬만한 홍반이나 부종반응을 나타내지 않은 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 세정제는 피부에 자극 없이 안전하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims

남천(Nandina domestica Thunb)으로부터 추출한 남천 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
제 1항에 있어서, 상기 세정제는 비누와 샴푸 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 상기 남천에 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나의 추출용매를 가하여 추출한 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 상기 남천의 잎으로부터 추출한 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
제 4항에 있어서, 상기 남천 추출물은 상기 남천의 잎에 에탄올을 가해 20 내지 30℃에서 60 내지 80시간 동안 추출한 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 피부 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 피부세포 재생효과를 갖는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
제 1항에 있어서, 꽃황새냉이(Cardamine amaraeformis)의 발효물로부처 추출한 꽃황새냉이 발효추출물을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
제 8항에 있어서, 상기 꽃황새냉이 발효추출물은 꽃황새냉이 100중량부에 대하여 당 10 내지 30중량부를 혼합하고 발효균주를 첨가한 후 20 내지 40℃에서 20 내지 60일 동안 발효시킨 발효물을 진공추출하여 수득한 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제.
남천(Nandina domestica Thunb)으로부터 남천 추출물을 추출하는 추출단계와;
상기 남천 추출물을 첨가하여 비누와 샴푸 중 어느 하나로 제형화시키는 제형단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 세정제의 제조방법.