KR20210091254A - 인간 혈청 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 인간 혈청 알부민에 결합하는 단일 V_H 도메인 항체에 관한 것이다.

Description

인간 혈청 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체

단백질 및 펩티드의 약동학은 흡수, 생체분포, 대사 및 제거의 파라미터에 의해 좌우된다. 단백질 및 펩티드에 대한 가장 일반적인 청소 (clearance) 경로는 큰 단백질의 경우 세포내이입 (endocytosis) 및 간 간세포 (liver hepatocytes)에 의한 막-수송 매개 청소 (membrane transport-mediated clearance)를 포함하고, 작은 단백질 및 펩티드의 경우 신장에 의한 사구체 여과 (glomerular filtration)를 포함한다.

치료 및/또는 진단 목적에 유용할 수 있는 활성을 가진 많은 약물은 투여되는 경우 신체로부터 빠르게 제거되기 때문에 제한적인 가치를 갖는다. 예를 들어, 치료적으로 유용한 활성을 가진 많은 폴리펩티드는 순환계로부터 신장을 통해 빠르게 청소된다.

따라서, 원하는 치료 효과를 얻기 위해서는 다량으로 투여되어야 한다. 개선된 약동학적 특성을 갖는 개선된 치료제 및 진단제에 대한 필요성이 존재한다.

그러므로 더 작은 단백질 및 펩티드의 약동학을 개선하기 위해, 단백질 또는 펩티드의 크기 및 유체역학적 반경의 증가, 표적 단백질 또는 펩티드의 음전하의 증가, 또는 알부민에의 결합을 통해 펩티드 또는 단백질의 혈청 단백질 결합 수준의 증가를 포함하는 다양한 전략이 사용되었다. 이는 만성 질환에서 중요할 수 있다. 노출 연장은 내인성 알부민을 표적으로 하는 반감기 연장 모이어티에 의해 달성된다. 이는 생물학적으로 활성인 단백질 또는 펩티드의 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HSA)에의 융합, 인간 면역글로불린 (Ig) G의 불변 단편 (Fc) 도메인에의 융합 또는 비-구조화된 폴리펩티드 (non-structured polypeptides) 예컨대 XTEN에의 융합을 포함한다 (Reviewed in Stroh "Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters BioDrugs". 2015; 29(4): 215-239).

적용이 상이하면 다른 반감기가 필요하므로, 맞춤형 반감기 연장 분자를 제공해야 할 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결하기 위한 것이다.

본 발명은 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 특히 인간 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인, 예컨대 구체적으로 재배열되지 않은 인간 V, D, J 유전자 세그먼트를 발현하는 유전자이식 마우스로부터 수득되거나 또는 수득 가능한 인간 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인에 관한 것이다.

일 양상에서, 본 발명은 서열번호: 1 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 90% 또는 95%의 서열 동일성/상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호: 1의 변이체이고 서열번호: 1과 비교하여 아미노산 치환, 예를 들어 1 내지 20개의 아미노산 치환을 갖는 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호: 19 또는 20, 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 90% 또는 95%의 서열 동일성/상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은 또한 단백질의 반감기를 연장하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 단백질을 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인에 결합시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인이 융합 단백질에서 상기 치료용 모이어티에 연결되는 경우 상기 치료용 모이어티의 반감기를 연장하는데 있어서 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호: 1 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 90% 또는 95%의 서열 동일성/상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된, HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인이 다른 표적에 결합하는 다른 모이어티에 연결된 예를 들어 펩티드 링커 (peptide linker) 연결 융합 단백질 (fusion protein)에 관한 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 본원에 기재된 단백질 또는 구조체를 포함하는 약학적 조성물 (pharmaceutical composition)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (nucleic acid sequence)에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터 (vector)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 서열 또는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포 (host cell)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 본원에 기재된 단백질 또는 구조체, 또는 본원에 기재된 약학적 조성물을 포함하는 키트 (kit)에 관한 것이다.

본 발명의 구체예가 추가적으로 기재될 것이다. 하기에, 다양한 구체예가 기재된다. 정의된 각 양상은 명확하게 반대로 지시하지 않는 한 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수 있다.

일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 병리학, 종양학, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기술은 당 분야에 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 달리 지시하지 않는 한, 당 분야에 잘 알려져 있는 종래 방법 및 본 명세서를 통해 인용되고 토의된 다양한 일반적이고, 보다 특별한 참조문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들면, Green and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Zhiqiang An (Editor), Wiley, (2009); and Antibody Engineering, 2nd Ed., Vols 1 and 2, Ontermann and Dubel, eds., Springer-Verlag, Heidelberg (2010)를 참조한다.

효소 반응 및 정제 기술은 당 분야에서 통상적으로 수행되거나 또는 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 명세에 따라서 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술이 당 분야에 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 의약품 제조, 제제, 및 전달, 및 환자 치료에 대한 표준 기술이 사용된다.

본 발명은 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합하는 아미노산 서열 및 이러한 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자 예컨대 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단일 도메인 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 특히 본원에 기재된 아미노산을 갖고, 치료 방법 및 용도뿐만 아니라 본원에 기재된 약학적 제제에 활용될 수 있는 인간 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인 (V_H) 항체에 관한 것이다.

본원에 기재된 단일 도메인 항체는 야생형 인간 혈청 알부민 (UniProt 수탁번호 Q56G89)에 특이적으로 결합한다. 상기 야생형 인간 혈청 알부민에 대한 아미노산 서열이 하기에 제시되어 있다 (서열번호: 5).

인간 혈청 알부민 (HSA, 2BXN)은 혈장 단백질의 약 60%를 차지한다. HSA는 3개의 상동 도메인 (I, II 및 III)을 포함하는, 585개의 아미노산 길이의 단일 사슬로 구성된다. 도메인 I은 잔기 5-197로 구성되고, 도메인 II는 잔기 198-382를 포함하며, 도메인 III은 잔기 383-569로부터 형성된다. 각 도메인은 A 및 B라고 하는 2개의 서브-도메인 (sub-domains)으로 구성된다 (IA; 잔기 5-107, IIA; 잔기 108-197, IIA; 잔기 198-296, IIB; 잔기 297-382, IIIA; 잔기 383-494, IIIB; 잔기 495-569).

관심 항원, 예컨대 인간 혈청 알부민에 "결합하거나" 또는 "결합할 수 있는" 본 발명의 단일 도메인 항체 (sdAb), 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 단백질은 상기 단일 도메인 항체가 본원에 기재된 항원 인간 혈청 알부민을 발현하는 세포 또는 조직을 표적으로 하는데 있어서 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하는 것이다.

본원에 기재된 단일 도메인 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 단백질은 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합한다. 즉, 인간 혈청 알부민 항원에 대한 결합은 비-특이적 상호작용과는 현저하게 상이하다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 단일 도메인 항체는 마우스 인간 혈청 알부민과 교차 반응하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 단일 도메인 항체는 실시예에 개시된 바와 같이 인간 혈청 알부민에 결합하고, 또한 원숭이 혈청 알부민에 결합한다.

본원에서 사용된 용어 "항체 (antibody)"는, 4개의 폴리펩티드 사슬인, 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)로 이루어진, 임의의 면역글로불린 (Ig) 분자, 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 Ig 분자의 필수 에피토프 결합 특성 (epitope binding features)을 유지하는, 이의 임의의 기능적 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭한다.

전장 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 또는 도메인 (본원에서 HCVR로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인, C_H1, C_H2 및 C_H3으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 또는 도메인 (본원에서 LCVR로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 C_L로 이루어진다.

상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 프레임워크 영역 (framework regions: FR)으로 불리는, 좀 더 보존되는 영역에 산재된 (interspersed) 상보성 결정 영역 (complementarity determining regions: CDR)으로 불리는 초가변 (hypervariability) 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고, 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

면역글로불린 분자는 임의의 타입 (예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예: IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 서브클래스 (subclass)를 가질 수 있다. 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내에 상보성-결정 영역을 지칭한다. 상기 중쇄 및 경쇄의 각 가변 영역에는 3개의 CDR이 있으며, 이는 상기 각 가변 영역에 대해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 나타낸다. 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 나타나는 3개의 CDR의 그룹을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 당 분야에 알려져 있는 다양한 시스템에 따라 상이하게 정의될 수 있다.

Kabat 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기반하며, 가장 일반적으로 사용된다 (Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 and Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Chothia refers instead to the location of the structural loops (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987)). 상기 Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인에서 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1 -113)를 언급할 때 사용된다. 다른 시스템은 ImMunoGeneTics (IMGT) 넘버링 체계이다. 상기 IMGT 넘버링 체계는 Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)에 기재되어 있다.

Kabat에 의해 개시된 시스템이 본원에서 사용된다. 용어 "Kabat 넘버링 (Kabat numbering)", "Kabat 정의 (Kabat definitions)" 및 "Kabat 라벨링 (Kabat labeling)"이 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 당 분야에서 인정되는 이들 용어들은 항체 또는 항원 결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기들보다 더 많이 가변하는 (즉, 초가변) 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다.

용어 "항원 결합 부위 (antigen binding site)"는 항원에 특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항원 결합 부위는 전형적으로 항체 또는 항체 단편의 관련된 V_H 및 V_L 내에 포함된다.

항체 단편은 항체의 일부, 예를 들어 F(ab')2, Fab, Fv, scFv, 중쇄, 경쇄, 가변 중쇄 (V_H), 가변 경쇄 (V_L) 도메인 및 유사물이다. 전장 항체의 기능적 단편은 전장 항체의 표적 특이성을 유지한다. 그러므로 재조합 기능적 항체 단편, 예컨대 Fab (단편, 항체), scFv (단쇄 가변 사슬 단편) 및 단일 도메인 항체 (dAb)가 mAb에 기반한 치료제에 대한 대안으로서 치료제를 개발하는데 사용되었다.

scFv 단편 (~25kDa)은 2개의 가변 도메인인, V_H 및 V_L로 구성된다. 본래, V_H 및 V_L 도메인은 소수성 상호작용을 통해 비-공유적으로 결합되고, 해리되는 경향이 있다. 그러나 상기 도메인을 친수성 가요성 링커와 연결하여 단쇄 Fv (scFv)를 형성함으로써 안정한 단편이 조작 (engineered)될 수 있다.

최소 항원 결합 단편은 단일 가변 단편, 즉 가변 중쇄 (V_H) 또는 가변 경쇄 (V_L) 도메인이다. V_H 및 V_L 도메인은 각각 항원에 결합할 수 있다. 경쇄/중쇄 파트너에의 각 결합 또는 실제로 전장 항체의 다른 부분의 존재는 표적 결합에 요구되지 않는다. 크기가 하나의 단일 도메인 (V_H 또는 V_L 도메인에 해당함)으로 감소된 항체의 항원-결합 엔티티 (antigen-binding entity)는 일반적으로 "단일 도메인 항체" 또는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"으로서 지칭된다. 따라서 단일 도메인 항체 (~12 내지 15 kDa)는 V_H 또는 V_L 도메인을 가지며, 즉 이는 전장 항체의 다른 부분은 갖지 않는다. 인간 중쇄 도메인을 갖는 단일 도메인 항체뿐만 아니라 본래 경쇄가 없는 카멜리드 (camelid) 중쇄 단독 항체 유래의 단일 도메인 항체가 개시되어 있다. 항원 결합 단일 V_H 도메인은 또한 예를 들어 면역화된 마우스의 비장으로부터 게놈 DNA로부터 증폭된 뮤린 (murine) V_H 유전자 라이브러리로부터 동정되고, 대장균 (E. coli)에서 발현되었다 (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546). Ward 등은 "도메인 항체"의 경우 단리된 단일 V_H 도메인을 "dAb"라고 명명하였다. 용어 "dAb"는 일반적으로 항원에 특이적으로 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 (V_H, V_HH 또는 V_L) 폴리펩티드를 지칭한다. 치료에 사용하는 경우, 인간 단일 도메인 항체는 카멜리드 유래의 V_HH보다 바람직하며, 이는 환자에게 투여되는 경우 면역 반응을 유발할 가능성이 없기 때문이다.

용어 "단일 도메인 항체 (sdAb), 단일 가변 도메인, 단일 가변 도메인 항체 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISV)"은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 표적 항원에 결합하는 항체의 단일 가변 단편을 서술한다. 이들 용어는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 이들 용어들 "단일 중쇄 도메인 항체, 단일 가변 중쇄 도메인, 단일 가변 중쇄 도메인, 면역글로불린 단일 중쇄 가변 도메인 (ISV), 면역글로불린 단일 중쇄 가변 도메인, 인간 V_H 단일 도메인"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 경쇄 또는 다른 항체 단편이 없이 항원에 대한 결합 특이성을 유지하고, 단리된 형태, 즉 전장 항체의 일부가 아닌 형태로 사용되는 전장 항체의 단일 중쇄 가변 단편을 서술한다. 단일 가변 중쇄 도메인 항체는 전장 항체의 임의의 다른 사슬 또는 도메인을 포함하지 않으며; 이는 임의의 경쇄 또는 불변 도메인을 갖지 않는다. 따라서, 이는 경쇄 없이 항원에 결합할 수 있다.

일 양상에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 결합하는, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 구체적으로 면역글로불린 단일 중쇄 가변 도메인에 관한 것이다. 하기에서 설명되는 바와 같이, 본 구체예는 HSA 항원에 결합하는 단일 가변 중쇄 도메인 항체 /면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인에 관한 것이다. 따라서, 상기 단일 가변 중쇄 도메인 항체는 경쇄 없이 HSA에 결합할 수 있다. 인간 단일 가변 중쇄 도메인 항체 ("V_H 단일 도메인 항체/ 단일 V_H 도메인 항체")가 특히 바람직하다. 이러한 결합 분자는 또한 본원에서 Humabody®라고 한다. Humabody®는 Crescendo Biologics Ltd의 등록 상표이다.

따라서, 일부 구체예에서, 상기 단리된 결합 제제/분자는 적어도 하나의 단일 도메인 항체를 포함하거나 또는 이로 구성되며, 상기 도메인은 인간 면역글로불린 가변 중쇄 도메인이고; 이들은 V_L 도메인 또는 다른 항체 단편이 없으며, 표적 항원에 결합한다.

용어 "단리된 (isolated)"은 이의 자연 환경으로부터 단리된 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "단리된 (isolated)"은 다른 단일 도메인 항체, 항체 또는 항체 단편이 실질적으로 부재하는 단일 도메인 항체를 지칭한다. 더욱이, 단리된 단일 도메인 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 부재할 수 있다.

각 V_H 도메인 항체는 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함하며, 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 하기 순서로 배열된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 도메인은 하기 식 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 갖는 인간 가변 중쇄 (V_H) 도메인이다.

C 또는 N-말단 V_H 프레임워크 서열에 대한 변형이 본 발명의 단일 도메인 항체에 대해 수행되어 이들의 특성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 V_H 도메인은 C- 또는 N-말단 연장을 포함할 수 있다. C-말단 연장이 잔기 VTVSS (서열번호: 6)로 종결되는 V_H 도메인의 C-말단 단부에 부가될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 단일 도메인 항체는 1 내지 50개의 잔기, 예를 들어 1 내지 10, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 1-20, 1-30 또는 1-40개의 추가 아미노산의 C-말단 연장을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 단일 도메인 항체는 인간 C_H1 도메인의 추가 아미노산을 포함하여, C 말단 단부가 C_H1 도메인으로 연장된다.

추가의 C 또는 N-말단 잔기는 예를 들어 본 발명의 단일 도메인 항체를 다른 모이어티에 접합시키는데 사용되는 펩티드 링커, 또는 상기 분자의 검출을 돕는 태그일 수 있다. 이러한 태그는 당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 링커 His 태그, 예컨대 헥사-His (HHHHHH, 서열번호: 7) 또는 myc 태그를 포함한다.

본원에서 사용된, 용어 "상동성 (homology)" 또는 "동일성 (identity)"은 일반적으로, 서열들을 정렬시킨 후에, 일부 구체예에서, 최대 상동성 퍼센트를 수득하기 위해서 필요하다면 갭 (gap)을 도입한 후에, 아미노산 잔기가 비교되는 참조 폴리펩티드의 잔기와 서열에서 동일한 퍼센트를 나타내며, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않았다. 따라서, 2개의 아미노산 서열들 사이의 상동성 퍼센트는 2개의 서열들 사이의 동일성 퍼센트와 동등하다. N- 또는 C-말단 연장, 태그 또는 삽입 어느 것도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되어서는 안된다. 상기 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램이 잘 알려져 있다. 2개의 아미노산 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 잘 알려져 있는 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

본원에 기재된 단일 도메인 항체의 가변 도메인은 전장 (fully) 인간 또는 실질적으로 전장 (substantially fully) 인간이다. 본원에서 사용된 용어 V_H 도메인 항체는 단일 인간 가변 중쇄 도메인 항체를 지정한다 (카멜리드 중쇄 도메인을 지정하는 V_HH와 반대). 본원에서 사용된, 인간 V_H 도메인은 전장 인간 또는 실질적으로 전장 인간 V_H 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된, 용어 인간 V_H 도메인은 또한 예를 들어 WO2016/062990 및 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 특히 관심 항원 (즉, HSA)으로의 면역화에 반응하여, 전장 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 발현하는 유전자이식 마우스에 의해 제조된 중쇄 단독 항체로부터 단리된 V_H 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, 인간 V_H 도메인은 또한 인간 V_H 도메인 아미노산으로부터 유래되거나 또는 이에 기반하거나 또는 인간 V_H 핵산 서열로부터 생성되는 V_H 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 인간 V_H 도메인은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 또는 이에 의해 코딩되고, 예를 들어 전장 인간 재배열되지 않은 V, D, J 유전자 세그먼트를 발현하는 유전자이식 마우스에서 생성된 중쇄 단독 항체로부터 수득되는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 실질적으로 인간 V_H 도메인 또는 인간 V_H 도메인으로부터 유래되거나 또는 이에 기반한 V_H 도메인은 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예: 인 비트로 예컨대 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이화에 의해 도입되거나, 또는 인 비보 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러므로 용어 "인간 V_H 도메인"은 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형되어, 예를 들어 서열 책임 (sequence liabilities)을 제거한 실질적으로 인간 V_H 도메인을 포함한다. 예를 들어, 실질적으로 인간 V_H 도메인 V_H 도메인은 생식세포 인간 서열과 비교하여, 최대 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 최대 20개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.

그러나 본원에서 사용된 용어 "인간 V_H 도메인" 또는 "실질적으로 인간 V_H 도메인"은 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 일 구체예에서, 본원에서 사용된 용어 "인간 V_H 도메인"은 또한 카멜화 (camelized) V_H 도메인을 포함하는 것으로 의도되지 않으며, 즉 예를 들어 V_H 도메인 서열에서 미리결정된 위치를 선택하고, 미리결정된 위치에서 하나 이상의 미리결정된 잔기를 카멜리드 V_HH 도메인에서 발견될 수 있는 특정 잔기로 변경시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 도입하는 기존의 돌연변이화 방법에 의해 인 비트로에서 특이적으로 변형되어진 인간 V_H 도메인이다.

본 발명의 분자는 전장 인간이므로 면역원성이 아니기 때문에 유익하다. 이는 인간화가 요구되지 않는다.

HSA는 도메인 I, 도메인 II 및 도메인 III의 3개의 도메인을 갖는다. 도메인 III은 혈청 알부민의 FcRn에의 결합에 관여한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 서열번호: 1을 포함하거나 또는 이로 구성되는 본원에서 Humabody® 1로 명명된 단일 가변 중쇄 도메인 항체가 HSA의 도메인 III에 결합하는 것을 개시하였다. 이론에 얽매이지 않고, 도메인 III과의 상호작용은 반감기를 조정하는데 유익할 수 있다고 여겨진다. 이러한 상호작용은 HSA 및 FcRn 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 일부 효능제 분자에 필요할 수 있는 더 짧은 반감기를 유도할 수 있다.

제1 양상에서, 본 발명은 따라서 HSA의 도메인 III (즉, HSA의 아미노산 잔기 383-569)에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인에 관한 것이다. 일 구체예에서, 그것은 도메인 I 및 II에 결합하지 않는다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 1 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

서열번호: 1이 하기에 제시된다:

CDR1, CDR2 및 CDR3 각각에 대한 서열은 상기에서 진하게 표시되어 있다. Humabody® 1의 CDR은 하기 서열을 갖는다:

서열 상동성/동일성은 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 예를 들어 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하기를 포함한다:

a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 2와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1,

b) 서열번호: 3 또는 서열번호: 3과 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및/또는

c) 서열번호: 4 또는 서열번호: 4와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3.

아미노산 서열의 차이는 아미노산의 결실, 치환 또는 부가일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 차이는 아미노산 치환이다.

일 구체예에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본원에 정의된 CDR들, 예컨대 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 하나를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 CDR은 각각 서열번호: 2, 3 또는 4로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 CDR은 변이체이고, 상기 정의된 바와 같은 치환을 갖는다. 다른 구체예에서, CDR 서열들 중 2개의 서열에 대해 하나는 서열번호: 2, 3 또는 4로부터 정의된 바와 같고, 나머지 CDR은 적용 가능한 경우 각각의 CDR 서열 2, 3 또는 4의 변이체이다.

일 구체예에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인은 서열번호: 1에 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 최대 20개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 치환, 하나 이상의 결실, 하나 이상의 삽입 또는 기타 변형을 가지며, 상기 단일 도메인 항체의 생물학적 기능, 즉 HSA에 결합하는 기능은 유지하는, 서열번호: 1의 변이체이다. 따라서, 변이체 V_H 단일 도메인 항체는 서열이 조작될 수 있다. 변형은 상기 단일 도메인 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있으며, 이는 네이티브 서열 V_H 단일 도메인 항체 또는 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열의 변화를 초래한다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체, 예컨대 류신을 세린으로 대체, 즉 보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1 내지 25, 예를 들어 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20개의 아미노산의 범위, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산일 수 있다. 허용되는 변이는 상기 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 전장 또는 성숙한 네이티브 서열이 나타내는 활성에 대해 수득된 변이체를 테스트함으로써 결정될 수 있다.

본원에 기재된 V_H 단일 도메인 항체의 변이체는 비-변이체 분자에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성/동일성을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변형은 보존적 서열 변형이다. 본원에서 사용된 용어 "보존적 서열 변형 (conservative sequence modifications)"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나 또는 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 본 발명의 sdAb로 당 분야에 알려져 있는 표준 기술, 예컨대 부위-지향 돌연변이화 및 PCR-매개 돌연변이화에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 당 분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예: 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예: 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가진 아미노산 (예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산 (예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 단일 도메인 항체의 CDR 영역 내에 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 상기 변경된 항체는 본원에 기재된 기능성 분석법을 사용하여 유지된 기능 (즉, HSA 결합)에 대해 테스트될 수 있다.

따라서, 이들 아미노산 변경이 전형적으로 폴리펩티드의 생물학적 활성, 기능 또는 다른 원하는 특성, 예컨대 항원에 대한 이의 친화도 또는 이의 특이성을 변경하지 않고 수행될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수 영역에서 단일 아미노산 치환은 실질적으로 생물학적 활성을 변경하지 않는다. 또한, 구조 또는 기능이 유사한 아미노산의 치환은 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 방해할 가능성이 적다. 본원에 기재된 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하는 아미노산 잔기에 대한 약어, 및 이들 아미노산 잔기의 보존적 치환이 하기 표 1에 기재되어 있다.

아미노산 잔기 및 보존적 아미노산 치환의 예

원래의 잔기 3문자 코드, 단문자 코드	보존적 치환
알라닌, Ala, A	Gly, Ser
아르기닌, Arg, R	Lys, His
아스파라긴, Asn, N	Gln, His
아스파르트산, Asp, D	Glu, Asn
시스테인, Cys, C	Ser, Ala
글루타민, Gln, Q	Asn
글루탐산, Glu, E	Asp, Gln
글리신, Gly, G	Ala
히스티딘, His, H	Asn, Gln
이소류신, Ile, I	Leu, Val
류신, Leu, L	Ile, Val
리신, lys, K	Ar, His
메티오닌, Met, M	Leu, Ile, Tyr
페닐알라닌, Phe, F	Tyr, Met, Leu
프롤린, Pro, P	Ala
세린, Ser, S	Thr
트레오닌, Thr, T	Ser
트립토판, Trp, W	Tyr, Phe
티로신, Tyr, Y	Try, Phe
발린, Val, V	Ile, Leu

일부 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 1과 비교하여 하나 이상의 서열 변형을 포함하고, 비변형된 단일 도메인 항체와 비교하여 결합 친화도, 특이성, 열안정성, 발현 수준, 이펙터 기능, 글리코실화, 감소된 면역원성 또는 용해도와 같은 하나 이상의 특성이 향상된 V_H 단일 도메인 항체의 변이체인 V_H 단일 도메인 항체를 제공한다.

당업자는 인 비트로 및 인 비보 발현 라이브러리를 포함하여, 본원에 기재된 항원 결합 분자를 동정, 수득 및 최적화하는 다양한 방법이 있다는 것을 알 것이다. 이는 실시예에 추가로 기재되어 있다. 당 분야에 알려져 있는 최적화 기술, 예컨대 디스플레이 (예: 리보솜 및/또는 파지 디스플레이) 및/또는 돌연변이화 (예: 오류-유발 돌연변이화 (error-prone mutagenesis))가 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 본원에 기재된 단일 도메인 항체의 서열 최적화된 변이체를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 단일 도메인 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 변형이 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 인간 생식세포 서열로 복귀 (revert)시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 단일 도메인 항체는 상기 단일 도메인 항체가 유래되는 생식세포 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 상기 단일 도메인 항체 프레임워크 서열을 상기 단일 도메인 항체가 유래되는 생식세포 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 일 구체예에서, 모든 프레임워크 서열은 생식세포 서열이다.

상기 프레임워크 영역 서열에서 아미노산 잔기들 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 이의 생식세포 형태로 되돌리기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어, 부위-지향 돌연변이화 또는 PCR-매개 돌연변이화에 의해 생식세포 서열로 "역돌연변이 (backmutated)"될 수 있다.

다른 타입의 프레임워크 변형으로는 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해, 프레임워크 영역 내에, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내에 하나 이상의 잔기를 돌연변이화하는 것을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 아글리코실화 (aglycoslated) 항체가 제조될 수 있다 (즉, 상기 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 상기 항체의 항원에 대한 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 상기 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 수행될 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항체의 항원에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다.

일 구체예에서, 상기 하나 이상의 치환이 CDR1, 2 또는 3 영역에 있다. 예를 들어, 상기 CDR1, 2 또는 3에서 1, 2, 3, 4, 5개 또는 초과의 아미노산 치환이 있을 수 있다. 다른 예에서, 1 또는 2개의 아미노산 결실이 있을 수 있다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 치환이 프레임워크 영역에 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역에 1 내지 10개 또는 초과의 아미노산 치환이 있을 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 서열번호: 1을 참조하여 하기 치환들 중 하나 이상 또는 이들의 조합을 포함한다:

일 구체예에서, 상기 변이체는 상기에 열거된 변형 중 1, 2, 3, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 변형을 포함한다. 따라서, 상기 변형들의 조합이 구체적으로 구상된다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 E111 → D 및 R115 → Q의 변형을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 서열번호: 19 또는 20, 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 90%의 서열 동일성을 갖고, 서열번호: 19 또는 20에 제시된 CDR 서열을 유지하는 서열을 갖는다. 따라서, 본 발명은 또한 서열번호: 1, 19 또는 20을 포함하거나 또는 이로 구성된 단일 V_H 도메인 항체 및 이의 변이체에 관한 것이다.

또한, 본원에 기재된 sdAb의 단편, 예를 들어 HAS, 예컨대 CDR 서열들 중 하나 이상을 포함하거나 또는 이로 구성된 펩티드에의 결합을 유지하는 서열번호: 1, 19 또는 20의 단편을 포함한다.

언급된 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 아미노산 서열은 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있고, 특히 (본원에 기재된 바와 같이) 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 따라서, 이들은 예를 들어 치료용 화합물, 모이어티 또는 엔티티에 반감기 (본원에 정의된 바와 같음)의 증가를 부여하기 위해, 인간 혈청 알부민에 결합하기 위한 결합 단위 또는 결합 도메인으로서 사용될 수 있다.

사용된 용어 "반감기 ("half-life)"는 일반적으로 예를 들어 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 서열 또는 화합물의 천연 기전에 의한 청소 또는 분리로 인해, 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가 인 비보에서 50%만큼 감소되는데 걸리는 시간을 지칭할 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 인 비보 반감기는 약동학적 분석과 같이 그 자체로 알려진 임의의 방식으로 결정될 수 있다. 당업자에게 적합한 기술이 명백할 것이다. 상기 반감기는 파라미터 예컨대 tl/2-알파, tl/2-베타 및 곡선하 면적 (AUC)을 사용하여 표시될 수 있다. 반감기 (t 알파 및 t 베타) 및 AUC는 시간에 대한 접합체 또는 융합의 혈청 농도 곡선으로부터 결정될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "반감기 (half-life)"는 특히 t1/2-베타 또는 말단 반감기를 지칭한다 (여기서 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 이들 모두가 고려되지 않을 수 있음).

예를 들어, 제1 단계 (알파 단계)에서 약물 조성물 (예: 약물 접합체, 비공유 약물 접합체, 약물 융합)은 일부 제거와 함께 환자에서 주로 분포되어 있다. 제2 단계 (베타 단계)는 약물 조성물 (예: 약물 접합체, 비공유 약물 접합체, 약물 융합)이 분배되고 약물 조성물이 환자로부터 청소됨에 따라 혈청 농도가 감소하는 최종 단계이다. 상기 t 알파 반감기는 제1 단계의 반감기이고, 상기 t 베타 반감기는 제2 단계의 반감기이다.

본 발명의 HSA 결합 면역글로불린 가변 도메인은:

인간 (man)에서 1 내지 72시간, 예를 들어 2, 4, 6, 8 또는 10시간, 예를 들어 10시간 이상, 예를 들어 10, 11, 12, 14, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20시간, 예를 들어 약 18시간, 예를 들어 최대 20시간 또는 12, 24, 36 또는 48시간의 반감기 (t1/2로 표시됨)를 가지며, 및/또는

치료용 모이어티에 연결되는 경우, 인간에서 1 내지 72시간, 예를 들어 10시간 이상, 예를 들어 2, 4, 6, 8 또는 10시간, 예를 들어 10, 11, 12, 14, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20시간, 예를 들어 약 18시간, 또는 최대 20시간 또는 12, 24, 36 또는 48시간의 혈청 중 반감기 (serum half life)를 수득된 융합 단백질에 부여한다.

일 구체예에서, 본 발명의 HSA 결합 면역글로불린 가변 중쇄 도메인은 분자, 예를 들어 인간화 마우스 모델 (humanized mouse model)에서 또 다른 단일 가변 중쇄 도메인 항체의 반감기를 약 18시간까지 연장시킨다. 예를 들어, HSA 결합 면역글로불린 가변 중쇄 도메인이 i.v. 투여에 의해 제공되는 경우의 실시예에서 개시되는 바와 같이, genOway® HSA/FcRn 인간화 마우스 모델에서 본 발명의 HSA 결합 면역글로불린 가변 중쇄 도메인은 분자, 예를 들어 또 다른 단일 가변 중쇄 도메인 항체의 반감기를 약 18시간까지 연장시킨다.

본 발명의 HSA 결합 면역글로불린 가변 도메인은 또한 실시예 8에 개시된 바와 같이 우수한 저장 안정성 (storage stability)을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 HSA 결합 면역글로불린 가변 도메인은 4°에서 14일 동안 안정하게 유지된다. 이들은 실시예에 개시된 바와 같이 V_H 단일 도메인 항체의 반감기를 연장하는데 특히 적합하다.

따라서, 본 발명은 또한 서열번호: 1을 포함하거나 또는 이로 구성된 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 또 다른 표적에 결합하는 제2 모이어티를 포함하는 결합 분자, 예를 들어 HSA 결합 면역글로불린 가변 도메인 및 또 다른 모이어티를 포함하거나 또는 이로 구성되는 융합 단백질에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 모이어티는 치료용 모이어티이다. 상기 결합 분자는 폴리펩티드, 단백질 또는 구조체일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 치료용 모이어티는 예를 들어 항체 또는 항체 단편 (예: Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv 단편 (scFv) 또는 단일 도메인 항체, 예를 들어 V_H 또는 V_HH 도메인) 또는 항체 모방 단백질로부터 선택된 결합 분자이다. 일 구체예에서, 본 발명의 단일 도메인 항체는 C_H2 및 C_H3 도메인 중 하나 또는 둘 다, 및 선택적으로 힌지 영역 (hinge region)을 포함하는, 항체 Fc 영역 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 적어도 제2 모이어티는 단일 도메인 항체, 예컨대 단일 V_H 도메인 항체이다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같이 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 모이어티를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드는 융합 단백질이다. 일 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같이 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 모이어티를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드는 약물 접합체이다.

본원에서 사용된 "접합체 (conjugate)"는 약물에 결합/접합되는 본원에 기재된 혈청 알부민에 결합하는 단일 V_H 도메인 항체를 포함하는 조성물을 지칭한다.

이러한 접합체에는 약물이 공유 결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 "약물 접합체 (drug conjugates)" 및 약물이 비공유 결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 "비-공유 약물 접합체 (non-covalent drug conjugates)"를 포함한다.

본원에서 사용된, "약물 접합체 (drug conjugate)"는 약물이 공유 결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 지칭한다. 상기 약물은 적절한 링커 모이어티를 통해 직접 또는 간접적으로 항원-결합 단편에 공유 결합될 수 있다. 상기 약물은 아미노-말단, 카복실-말단과 같은 임의의 적절한 위치에서 또는 적절한 아미노산 측쇄를 통해 항원-결합 단편에 결합될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 제2 모이어티에 상기 2개의 모이어티를 연결하기 위한 펩티드 링커 또는 다른 적절한 링커를 사용하여 연결된다.

용어 "펩티드 링커 (peptide linker)"는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 펩티드 링커는 1 내지 50개의 아미노산, 예를 들어 1 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 펩티드 링커는 당 분야에 알려져 있고, 본원에 비-제한적인 예가 기재되어 있다. 적절한 비-면역원성 링커 펩티드는 예를 들어, G 및/또는 S 잔기를 포함하는 링커, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커이며, 여기서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 수이다. 일 구체예에서, 상기 펩티드는 예를 들어 GGGGS (서열번호: 8), GGGGSGGGGS (서열번호: 9), SGGGGSGGGG (서열번호: 10), GGGGSGGGGSGGGG (서열번호: 11), GSGSGSGS (서열번호: 12), GGSGSGSG (서열번호: 13), GGSGSG (서열번호: 14) 및 GGSG (서열번호: 15)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

상기 결합제는 다중특이적 (multispecific), 예를 들어 이중특이적 (bispecific)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 본원에 기재된 바와 같이 HSA에 결합하는 제1 V_H 단일 도메인 항체 (V_H (A)) 및 다른 항원에 결합하는 제2 V_H 단일 도메인 항체 (V_H (B))를 포함하며, 하기 식을 갖는다: V_H (A)- L -V_H (B). V_H (A)는 예를 들어 펩티드 링커를 사용하여 V_H (B)에 접합되며, 즉 V_H (B)에 연결된다. L은 링커를 나타낸다.

각 V_H는 CDR 및 FR 영역을 포함한다. 따라서, 상기 결합 분자는 하기 식을 가질 수 있다: FR1(A)-CDR1(A)-FR2(A)-CDR2(A)-FR3(A)-CDR3(A)-FR4(A)-L-FR1(B)-CDR1(B)-FR2(B)-CDR2(B)-FR3(B)-CDR3(B)-FR4(B).

상기 단일 V_H 도메인들 A 및 B의 순서는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 폴리펩티드 내에 단일 가변 도메인 A는 N-말단에 위치할 수 있고, 단일 가변 도메인 B는 C-말단에 위치할 수 있으며, 또는 그 반대일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 결합 분자는 이중특이적이다. 따라서, 일 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 단일 도메인 항체가 상기 단일 도메인 항체와는 상이한 결합 특이성을 갖는 제2 기능적 모이어티에 연결된 이중특이적 분자에 관한 것이다.

일 구체예에서, 상기 결합 분자 예컨대 단백질 또는 구조체는 다중특이적이고, 추가의, 즉 제3, 제4, 제5 모이어티 등을 포함한다.

다중특이적 단백질의 일 구체예에서, 상기 HSA 결합 V_H 도메인은 단백질의 C 말단에 위치한다.

제2 또는 추가의 치료용 모이어티는 예를 들어 종양 항원 또는 면역항암 표적에 결합하는 모이어티로부터 선택될 수 있지만, 당업자는 본 발명이 이에 제한되지 않음을 알 것이다.

본 발명은 또한 청구항들 중 어느 한 항에 따른 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 융합 단백질에서 치료용 모이어티에 연결되는 경우 상기 치료용 모이어티의 반감기를 연장하는데 있어서 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 청구항들 중 어느 한 항에 따른 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 융합 단백질에서 치료용 모이어티에 연결되는 경우 상기 치료용 모이어티의 반감기를 연장하는데 있어서 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 이는 본원에 기재된 바와 같이 CD137에 결합하는 sdAb 및 PSMA에 결합하는 sdAb를 포함하는 단백질의 반감기를 연장하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 상기 분자는 V_H (A)-V_H (B)-V_H (C), V_H (B)-V_H (A)-V_H (C), V_H (C)-V_H (A)-VH(B) 또는 V_H (C)-V_H (B)-V_H (A)의 형식으로 존재할 수 있으며, 여기서 A는 CD137에 결합하는 sdAb이고, B는 PSMA에 결합하는 sdAb이며, C는 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예: 서열번호: 1)이다. 예를 들어, 상기 분자는 서열번호: 17을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

따라서, 본 발명의 융합 단백질에서, 상기 치료용 모이어티는 예를 들어 항암 표적 (oncology target), 예를 들어 면역항암 표적 (immunooncology target)에 결합할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 단일 가변 중쇄 도메인 항체는 재배열되지 않은 인간 V, D 및 J 영역을 포함하는 이식유전자를 발현하는 유전자이식 설치류, 특히 인간 중쇄 단독 항체를 생성하는 설치류로부터 수득되거나 또는 수득될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 설치류는 기능적 내인성 경쇄 및 중쇄를 생성하지 않는다.

일반적으로, 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 본원에서 언급된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 단백질 및 다른 화합물 및 구조체는 인간 (및/또는 선택적으로 또한 온혈 동물에서, 특히 포유동물)에서 질병 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다. 따라서, 일반적으로, 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 단백질 및 다른 화합물 및 구조체는 바람직하게는 이들이 (생물학적) 약물 또는 다른 약학적 또는 치료적으로 활성인 화합물 및/또는 의약품 또는 조성물로서 사용될 수 있고 및/또는 적합하게는 이의 일부일 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드, 단백질 또는 구조체를 포함하는 약학적 조성물 또는 제제, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 HSA-결합 단일 도메인을 포함하는 결합 분자 또는 융합 단백질에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드, 단백질 또는 구조체 또는 약학적 조성물은 경구, 국소, 비경구, 설하, 직장, 질, 안구, 비강내, 폐, 피부내, 유리체내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 뇌내, 경피, 경점막, 흡입, 또는 국소, 특히 귀, 코, 눈 또는 피부로의 국소, 또는 흡입을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 편리한 경로로 투여될 수 있다.

비경구 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 복강내, 비강내, 직장, 방광내, 피부내, 국소 또는 피하 투여를 포함한다. 바람직하게, 상기 조성물은 비경구로 투여된다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클은 입자상 (particulate)일 수 있으므로, 상기 조성물은 예를 들어 정제 또는 분말 형태이다. 용어 "담체 (carrier)"는 본 발명의 약물 항체 접합체와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트 또는 부형제를 지칭한다. 이러한 약학적 담체는 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있으며, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 및 유사물을 포함한다. 상기 담체는 식염수, 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 및 유사물일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 활택제 및 착색제가 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 동물에게 투여되는 경우, 본 발명의 단일 도메인 항체 또는 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균된다. 본 발명의 약물 항체 접합체가 정맥내로 투여되는 경우 물이 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적절한 약학적 담체는 또한 부형제 예컨대 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크 (chalk), 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 모노스테아르산 글리세롤, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 유사물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 요구되는 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 액체 형태, 예컨대 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있다. 상기 액체는 주사 (injection), 주입 (infusion) (예: IV 주입) 또는 피하 전달에 유용할 수 있다. 경구 투여를 의도하는 경우, 상기 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이며, 여기서 반-고체, 반-액체, 현탁액 및 겔 형태가 본원에서 고려된 형태 안에서 고체 또는 액체로서 포함된다.

경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 상기 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 환제, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼 (wafer) 또는 유사 형태로 제제화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 비활성 희석제를 함유한다. 또한, 하나 이상의 하기 성분이 존재할 수 있다: 결합제 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정 셀룰로스 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분, 락토스 또는 덱스트린, 붕해제 예컨대 알긴산, 알긴산 나트륨, 옥수수 전분 및 유사물; 활택제 예컨대 스테아르산 마그네슘; 윤활제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 풍미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 풍미제; 및 착색제. 상기 조성물이 캡슐 형태 (예: 젤라틴 캡슐)인 경우, 이는 상기 타입의 물질에 추가하여, 액체 담체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 시클로덱스트린 또는 지방 오일을 함유할 수 있다.

상기 조성물은 액체 형태, 예컨대 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있다. 상기 액체는 경구 투여 또는 주사에 의한 전달에 유용할 수 있다. 경구 투여를 의도하는 경우, 조성물은 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 풍미 증진제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 주사 투여용 조성물에서, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산화제, 현탁화제, 버퍼, 안정화제 및 등장제 중 하나 이상이 또한 포함될 수 있다.

조성물은 하나 이상의 투여 단위 (dosage units) 형태를 취할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 조성물을 치료를 필요로 하는 영역에 국소로, 또는 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 제제 또는 본원에 기재된 HSA-결합 단일 도메인을 포함하는 결합 분자 또는 융합 단백질의 투여를 포함하는, 암과 같은 질병을 치료하는 방법으로 확장된다. 또한, 질병 치료에 사용하기 위한; 예컨대 암 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 제제, 또는 본원에 기재된 HSA-결합 단일 도메인을 포함하는 결합 분자 또는 융합 단백질이 계획된다. 또한, 암 치료용 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 제제, 또는 본원에 기재된 HSA-결합 단일 도메인을 포함하는 결합 분자 또는 융합 단백질의 용도가 계획된다.

특정 장애 또는 병태 치료에서 유효/활성인 치료제의 양은 상기 장애 또는 병태의 특성에 좌우될 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적의 투여량 범위 확인을 돕기 위한 인 비트로 또는 인 비보 분석법이 선택적으로 사용될 수 있다. 상기 조성물에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질병 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이며, 의사의 판단 및 각 환자 상황에 따라 결정되어야 한다. 연령, 체중, 성별, 식단, 투여 시간, 배출 속도, 숙주 상태, 약물 병용, 반응 민감도 및 질병 중증도와 같은 요인이 고려되어야 한다.

전형적으로, 상기 양은 본 발명의 단일 도메인 항체가 조성물의 중량을 기준으로 적어도 약 0.01 중량%이다. 경구 투여를 의도하는 경우, 상기 양은 상기 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 80 중량%의 범위에서 가변될 수 있다. 바람직한 경구 조성물은 본 발명의 단일 도메인 항체를 상기 조성물의 약 4 중량% 내지 약 50중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 조성물은 비경구 투여량 단위가 본 발명의 단일 도메인 항체를 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량%로 함유하도록 제조된다.

주사로 투여하는 경우, 상기 조성물은 전형적으로 대상의 체중 1kg당 약 0.1 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 바람직하게는 동물의 체중 1kg당 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 동물의 체중 1kg당 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 약 1 내지 30 mg/kg, 예컨대 약 5 내지 25 mg/kg, 약 10 내지 20 mg/kg, 약 1 내지 5 mg/kg, 또는 약 3 mg/kg의 용량으로 투여된다. 상기 투약 계획은 예컨대, 1주 1회 내지 2, 3, 또는 4주마다 1회로 가변될 수 있다.

본원에서 사용된, "치료하다 (treat)", "치료하는 (treating)" 또는 "치료 (treatment)"는 질환 또는 장애를 억제 또는 완화시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료는 질환 또는 장애와 관련된 증상 발생의 연기, 및/또는 질환으로 발생 또는 발생이 예상되는 이러한 증상의 중증도의 감소를 포함할 수 있다. 상기 용어는 기존 증상의 개선, 추가적인 증상의 예방, 및 이러한 증상의 기초 원인을 개선 또는 예방하는 것을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 치료되는 포유동물, 예컨대 인간 환자의 적어도 일부에게 유익한 결과가 부여되고 있음을 나타낸다. 많은 의학적 치료는 치료를 받은, 전부는 아니지만 일부 환자에게 효과적이다.

용어 "대상 (subject)" 또는 "환자 (patient)"는 치료, 관찰 또는 실험 목적인 동물을 지칭한다. 예로서, 대상은 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 뮤린, 소 (bovine), 말 (equine), 개 (canine), 양 (ovine) 또는 고양이 (feline)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 포유동물을 포함한다.

본 발명의 분자 또는 약학적 조성물은 단독 활성 성분으로서 또는 하나 이상의 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 치료제는 질병 치료에 유용한 화합물 또는 분자이다. 치료제의 예로는 항체, 항체 단편, 약물, 독소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 아폽토시스유발제 (pro-apoptotic agents), 항-혈관생성제 (anti-angiogenic agent), 붕소 화합물, 광활성제 (photoactive agents) 또는 염료 및 방사성동위원소를 포함한다.

본 발명은 또한 단백질을 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인에 결합시키는 단계를 포함하는, 단백질의 반감기를 연장하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 핵산은 서열번호: 16 또는 이에 대해 적어도 75%, 80% 또는 90%의 서열 상동성을 갖는 핵산이다. 일 구체예에서, 상기 핵산 서열은 링커를 사용하여 제2 핵산 서열에 연결된다. 일 구체예에서, 상기 제2 핵산은 치료용 모이어티를 코딩한다. 일 구체예에서, 상기 링커는 핵산 링커이다. 예시되는 핵산이 하기에 제시된다. 그러나 당업자는 유전자 코드의 축퇴로 인해 다른 서열이 상정된다는 것을 이해할 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 서열 또는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 약학적 조성물, 본원에 기재된 단백질 또는 구조체, 또는 본원에 기재된 약학적 조성물, 및 선택적으로 사용 지침을 포함하는 키트에 관한 것이다.

본원에 기재된 단일 도메인 항체는 HSA 항원에 의한 자극 시에 중쇄 단독 항체를 발현하는, 유전자이식 포유동물, 예를 들어 설치류로부터 수득될 수 있다. 상기 유전자이식 설치류, 예를 들어 마우스는 바람직하게는 내인성 항체 유전자를 발현하는 능력이 감소되었다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 설치류는 내인성 경쇄 및/또는 중쇄 항체 유전자를 발현하는 능력이 감소되었다. 그러므로 상기 설치류는 내인성 카파 및 람다 경쇄 및/또는 중쇄 항체 유전자의 발현을 방해하는 변형을 포함하여, 예를 들어 하기에서 추가로 설명되는 바와 같이 기능적 경쇄 및/또는 중쇄가 생성되지 않는다.

또한, HSA에 결합할 수 있는 인간 중쇄 단독 항체를 제조하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 유전자이식 설치류, 예컨대 마우스를 HSA 항원으로 면역화하는 단계로서, 상기 설치류는 재배열되지 않은 인간 중쇄 V 유전자를 포함하는 핵산 구조체를 발현하고, 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 제조할 수 없는 단계,

b) 인간 중쇄 단독 항체를 단리하는 단계.

예를 들어 상기 설치류, 예컨대 마우스로부터 V_H 도메인 서열을 포함하는 서열 라이브러리를 생성하고, 상기 라이브러리로부터 V_H 도메인 서열을 포함하는 서열을 단리하는 단계에 의해, 상기 중쇄 단독 항체로부터 V_H 도메인을 단리하는 추가 단계를 포함할 수 있다.

또한, 인간 HSA에 결합할 수 있는 단일 V_H 도메인 항체를 제조하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 유전자이식 설치류, 예컨대 마우스를 HSA 항원으로 면역화하는 단계로서, 상기 설치류는 재배열되지 않은 인간 중쇄 V 유전자를 포함하는 핵산 구조체를 발현하고, 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 제조할 수 없는 단계,

b) 상기 설치류, 예컨대 마우스로부터 V_H 도메인 서열을 포함하는 서열 라이브러리를 생성하는 단계, 및

c) 상기 라이브러리로부터 V_H 도메인 서열을 포함하는 서열을 단리하는 단계.

예를 들어 실시예에 기재된 기능성 분석법을 사용하여, HSA에 결합하는 단일 V_H 도메인 항체 또는 중쇄 단독 항체를 동정하는 추가 단계를 포함할 수 있다.

인 비트로 발현 라이브러리를 사용하여 본원에 기재된 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 산물 및 조성물을 제조 또는 생성하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계; 및

b) HSA에 결합할 수 있는/이에 대해 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열에 대한 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 및

c) HSA에 결합할 수 있는/이에 대해 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열(들)을 단리하는 단계.

상기 방법에서, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 예컨대 스크리닝을 용이하게 하기 위해, 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적절한 미생물 (예컨대 효모) 상에 디스플레이될 수 있다. 아미노산 서열 (의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리)을 디스플레이 및 스크리닝하는데 적절한 방법, 기술 및 숙주 유기체가 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press; 1st edition (October 28, 1996) Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty 참조). 라이브러리, 예를 들어 파지 라이브러리는 항원-특이적, 중쇄-단독 항체를 발현하는 세포 또는 조직을 단리하는 단계, 상기 단리된 세포 또는 조직으로부터 유래된 mRNA로부터 V_H 도메인(들)을 코딩하는 서열을 클로닝하는 단계, 및 라이브러리를 사용하여 코딩된 단백질을 디스플레이하는 단계에 의해 생성된다. 상기 V_H 도메인(들)은 박테리아, 효모 또는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다.

또한, 다른 양상은 인간 V_H 생식세포 서열의 아미노산 산물을 포함하거나 또는 이로부터 유래된 아미노산 산물을 포함하는 HSA에 결합하는 V_H 도메인을 포함하는 단리된 V_H 단일 도메인 항체 또는 단리된 중쇄 단독 항체에 관한 것이다. 상기 중쇄 단독 항체는 전장 인간일 수 있거나 또는 마우스 서열을 포함할 수 있다.

본원에 제시된 다양한 양상 및 구체예에서, 용어 설치류 (rodent)는 마우스 (mouse) 또는 래트 (rat)와 관련될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 설치류는 마우스이다. 상기 마우스는 비-기능적 내인성 람다 경쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 마우스는 기능적 내인성 람다 경쇄를 생성하지 않는다. 일 구체예에서, 상기 람다 경쇄 유전자좌가 부분적으로 또는 완전히 결실되거나 또는 삽입, 역전, 재조합 이벤트, 유전자 에디팅 또는 유전자 사일런싱을 통해 비-기능적이 된다. 예를 들어, 적어도 불변 영역 유전자 C1, C2 및 C3이 결실되거나 또는 상기에 기재된 바와 같이 삽입 또는 다른 변형을 통해 비-기능적이 될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 유전자좌가 기능적으로 침묵되어 상기 마우스는 기능적 람다 경쇄를 만들지 못한다.

또한, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 카파 경쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 마우스는 기능적 내인성 카파 경쇄를 만들지 못한다. 일 구체예에서, 상기 카파 경쇄 유전자좌가 부분적으로 또는 완전히 결실되거나 또는 삽입, 역전, 재조합 이벤트, 유전자 에디팅 또는 유전자 사일런싱을 통해 비-기능적이 된다. 일 구체예에서, 상기 유전자좌가 기능적으로 침묵되어 상기 마우스는 기능적 카파 경쇄를 만들지 못한다.

기능적으로 침묵된 내인성 람다 및 카파 L-사슬 유전자좌를 갖는 마우스는 예를 들어 WO 2003/000737에 개시된 바와 같이 제조될 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.

또한, 상기 마우스는 예를 들어 WO 2004/076618 (본원에 그 전문이 참조로 통합됨)에 기재된 바와 같이, 비-기능적 내인성 중쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 마우스는 기능적 내인성 중쇄를 만들지 못한다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 유전자좌가 부분적으로 또는 완전히 결실되거나 또는 삽입, 역전, 재조합 이벤트, 유전자 에디팅 또는 유전자 사일런싱을 통해 비-기능적이 된다. 일 구체예에서, 상기 유전자좌가 기능적으로 침묵되어 상기 마우스는 기능적 중쇄를 만들지 못한다.

일 구체예에서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 중쇄 유전자좌, 비-기능적 내인성 람다 경쇄 유전자좌 및 비-기능적 내인성 카파 경쇄 유전자좌를 포함한다. 그러므로 상기 마우스는 어떠한 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄도 생성하지 못한다. 따라서, 상기 마우스는 삼중 녹아웃 (triple knockout: TKO) 마우스이다.

상기 유전자이식 마우스는 이종, 바람직하게는 인간, 중쇄 유전자좌를 발현하는 벡터, 예를 들어 효모 인공 염색체 (Yeast Artificial Chromosome: YAC)를 포함할 수 있다. YAC는 효모에서 매우 큰 DNA 삽입물의 클로닝을 위해 사용될 수 있는 벡터이다. 천연의 효모 염색체와 같이 거동하는데 필수적인 모두 3개의 시스-작용 구조적 요소 (cis-acting structural element) (자가 복제 서열 (autonomously replicating sequence: ARS), 센트로미어 (centromere: CEN) 및 두 개의 텔로미어 (telomere: TEL))를 포함할 뿐만 아니라, 큰 DNA 삽입물을 수용할 수 있는 능력은 이들이 염색체-유사 안정성 및 효모 세포에서 전달의 정확도에 필요한 최소 크기 (150 kb)에 도달할 수 있도록 한다. YAC의 제작 및 사용은 당 분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences, 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group).

예를 들어, 상기 YAC는 다수의 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 J 유전자를 CH1 도메인, 마우스 인핸서 (enhancer) 및 조절 영역이 결여된 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자와 조합하여 포함할 수 있다. 상기 인간 VH, D 및 J 유전자는 인간 VH, D 및 J 유전자좌이며, 이들은 전장 인간인 재배열되지 않은 유전자이다. 상기 YAC는 WO2016/062990에 기재된 바와 같을 수 있다.

CH1 도메인, 마우스 인핸서 및 조절 영역이 결여된 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자와 조합하여 인간 V, D 및 J 유전자의 도입 및 내인성 마우스 또는 래트 면역글로불린 유전자의 결실 또는 불활성화를 위해 당 분야에 알려져 있는 대체 방법이 사용될 수 있다.

유전자이식 마우스는 실시예에 예시된 바와 같이 표준 기술에 따라 형성될 수 있다. 유전자이식 마우스를 형성하기 위한 2개의 가장 특성화된 경로는 유전자 물질을 새롭게 수정된 난모세포로의 전핵 미세주입 (pronuclear microinjection)을 통해 또는 안정하게 형질감염된 배아 줄기세포를 상실배 또는 배반포 단계의 배아로의 도입을 통한 것이다. 유전자 물질이 도입되는 방법과 관계없이, 조작된 배아는 가임신한 (pseudo-pregnant) 암컷 수여자에게 전달되어, 임신이 지속되고 후보 유전자이식 새끼 (pups)가 태어났다.

이들 광범위한 방법들 간의 주요 차이점은 ES 클론이 유전자이식 동물을 형성하기 위해 이를 사용하기 전에 광범위하게 스크리닝될 수 있다는 것이다. 반대로, 전핵 미세주입은 이의 도입 이후에 숙주 게놈으로 통합되는 유전자 물질에 의존하며, 일반적으로 이식유전자의 성공적인 혼입은 새끼가 태어날 때까지 확인할 수 없다.

당 분야에는 이식유전자가 성공적으로 통합되는지 여부를 결정하고 이를 보조하는 많은 방법이 알려져 있다. 유전자이식 동물은 구조체를 게놈으로의 무작위 통합, 부위-특이적 통합, 또는 상동 재조합을 포함하는 다수의 수단에 의해서 생성될 수 있다. 이식유전자 통합의 유도 및 선택과, 재조합 효율을 개선하기 위한 약물 저항성 마커 (양성 선택), 재조합 효소, 재조합-매개 카세트 교환, 음성 선택 기술 및 뉴클레아제의 사용을 포함하는 후속 변형 모두에 사용될 수 있는 다양한 수단과 기술이 있다. 이들 방법의 대부분은 통상 ES 세포의 변형에서 사용된다. 그러나 일부 기술은 전핵 주입을 통해 매개되는 유전자이식을 향상시키는데 유용성을 가질 수 있다.

원하는 배경 내에서 유전자이식 계통의 더 효율적인 생성을 위해서 추가적인 개선 (refinements)이 사용될 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 상기 내인성 마우스 면역글로불린 발현을 침묵시켜서 약물 개발을 위해 이용될 수 있는 중쇄 단독 레퍼토리의 발현을 위해 도입된 이식유전자의 단독 사용을 허용한다. 유전자 조작된 마우스, 예컨대 모든 내인성 면역글로불린 유전자좌 (마우스 중쇄, 마우스 카파 사슬 및 마우스 람다 사슬)가 침묵된 TKO 마우스를 상기에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 임의의 도입된 이식유전자의 이러한 TKO 배경으로의 전달은 통상적으로 또는 공정의 효과적인 스케일링을 제공하기 위해 IVF 단계를 포함하는 육종 (breeding)을 통해 달성될 수 있다. 그러나 유전자이식 과정 중에 TKO 배경을 포함하는 것도 가능하다. 예를 들어, 미세주입의 경우, 난모세포는 TKO 공여체로부터 유래될 수 있다. 유사하게, TKO 배아 유래의 ES 세포가 유전자이식에 사용하기 위해 유도될 수 있다.

면역글로불린 유전자좌를 발현시키기 위해 이식유전자가 도입된 3중 녹아웃 마우스는 본원에서 TKO/Tg로 지칭된다.

일 구체예에서, 상기 마우스는 WO2016/062990에 기재된 바와 같다. 본 발명은 또한 인간 중쇄 유전자좌를 발현하고, HSA 항원으로 면역화된 설치류, 바람직하게는 마우스에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기에 기재된 바와 같은 설치류, 바람직하게는 인간 HSA에 결합하는 인간 VH 도메인을 포함하는 중쇄 단독 항체를 발현하는 마우스에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 설치류는 기능적 내인성 카파 및 람다 경쇄 및/또는 중쇄를 제조할 수 없다. 상기 인간 중쇄 유전자좌는 상기에 기재된 바와 같이 존재할 수 있는 이식유전자 상에 위치한다.

또한, 본 발명은 인간 V_H 도메인을 포함하거나 또는 인간 HSA 항원으로 면역화된 설치류, 바람직하게는 마우스로부터 수득되거나 또는 수득 가능하며, 인간 중쇄 유전자좌를 발현하는 항-인간 HSA 단일 V_H 도메인 항체 또는 항-인간 HSA 중쇄 단독 항체에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 설치류는 기능적 내인성 카파 및 람다 경쇄 및/또는 중쇄를 제조할 수 없다. 상기 인간 중쇄 유전자좌는 상기에 기재된 바와 같이 존재할 수 있는 이식유전자에 위치한다.

본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 상기 개시내용은 본 개시내용을 이루고 사용하는 방법뿐만 아니라 이의 최선의 방식을 포함하는 본 개시내용의 범위 내에 포함된 주제의 일반적 서술을 제공하며, 하기 실시예는 당업자가 본 개시내용을 실시할 수 있도록 제공된다. 그러나 당업자는 이들 실시예의 세부사항이 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 이의 범위는 본 개시내용에 첨부된 청구범위 및 이의 등가물로부터 이해되어야 하는 것을 알 것이다. 본 개시내용의 다양한 추가적인 양상 및 구체예는 본 개시내용의 관점에서 당업자에게는 명백할 것이다.

유전자 수탁 번호, 과학 간행물의 언급 및 특허 공보에 대한 언급을 포함하는 본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 전문이 참조로 본원에 통합된다.

"및/또는 (and/or)"이 본원에 사용된 경우, 2개의 명시된 특성 또는 구성요소 모두 또는 각각을 나타내는 특정 개시내용으로 취급되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 이들이 각각 개별적으로 본원에 제시되는 것과 같이, (ⅰ) A, (ⅱ) B 및 (ⅲ) A 및 B 각각의 특정 개시내용으로 취급되어야 한다. 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 상기에 제시된 특성의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양상 또는 구체예에 제한되지 않으며, 기재된 모든 양상 및 구체예에 동등하게 적용된다.

본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에서 추가로 서술된다.

실시예

실시예 1. Tg /TKO 마우스의 제작

내인성 중쇄 및 경쇄 항체 발현을 침묵시킨 배경 내에서 생식세포 형태로 중쇄 항체 유전자이식 유전자좌를 보유하는 마우스 (3중 녹아웃 또는 TKO)를 이전에 개시된 바와 같이 형성하였다 (WO2004/076618 and WO2003/000737, Ren et al. Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003). 요약하면, 유전자이식 마우스는 WO2016/062990에 기재된 바와 같이 CH1 도메인, 마우스 인핸서 및 조절 영역이 결여된 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자와 조합된 다수의 인간 V_H, D 및 J 유전자를 포함하는 효모 인공 염색체 (YAC)를 갖는 새롭게 수정된 난모세포의 전핵 미세주입 후에 유래되었다. 효모 인공 염색체 (YAC)는 효모에서 매우 큰 DNA 삽입물의 클로닝을 위해 사용될 수 있는 벡터이다. 천연의 효모 염색체와 같이 거동하는데 필수적인 모두 3개의 시스-작용 구조적 요소 (자가 복제 서열 (ARS), 센트로미어 (CEN) 및 두 개의 텔로미어 (TEL))를 포함할 뿐만 아니라, 큰 DNA 삽입물을 수용할 수 있는 능력은 이들이 염색체-유사 안정성 및 효모 세포에서 전달의 정확도에 필요한 최소 크기 (150 kb)에 도달할 수 있도록 한다. YAC의 제작 및 사용은 당 분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group / www.els.net).

실시예 2. 면역화를 위한 항원

면역화는 재조합 정제된 단백질을 사용하였다. 재조합 인간 HSA 단백질을 Sigma (cat# A9731)로부터 구입하였다.

실시예 3. 면역화 프로토콜

3마리의 8-12주령의 Crescendo 마우스를 완전 Freund 아쥬반트 (Complete Freund's Adjuvant) 중에 유화시킨 HSA 10μg을 피하로 전달하여 초기 면역화를 제공하고, 그 후에 불완전 Freund 아쥬반트 (Incomplete Freund's Adjuvant) 중에 유화시킨 HSA 10μg으로 피하 투여하여 초기 프라임 이후에 매주 간격으로 3회 부스트 (boosts)하였다. 아쥬반트 없이 인산염 완충 식염수 중에 HSA의 최종 용량을 복강내 투여하였다. 초기 면역화 후 28일차에, 상기 마우스를 희생시키고, 상완 및 사타구니 림프절 및 비장을 RNAlater (Qiagen cat# 76104)로 수확하였다. 혈청을 수집하고, 반응을 테스트하기 위해 저장하였다.

실시예 4. 혈청 ELISA

Nunc Maxisorp 플레이트를 PBS 용액 중에 5 μg/ml의 HSA로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그 다음에 상기 플레이트를 0.05% Tween 20이 보충된 PBS를 사용하여 세척하고, 그 다음에 Tween이 부가되지 않은 PBS로 세척하고, PBS 중 3% 탈지분유 (Marvel) 용액으로 실온에서 적어도 1시간 동안 차단하였다. 혈청의 3% Marvel/PBS에서의 희석액을 폴리프로필렌 튜브 또는 플레이트에서 제조하고, 차단된 ELISA 플레이트로 옮기기 전에 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하고, 여기서 적어도 1시간의 추가 인큐베이션이 수행되었다. PBS/Tween 및 PBS로 세척한 후, PBS/3% Marvel에서 1:10000 희석으로 제조된, 비오틴-접합된 염소 항 마우스 IgG, Fc감마 서브클래스 1 특이적 항체 (Jackson 115-065-205)의 용액을 부가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한 다음에, PBS/Tween 및 PBS를 사용하여 세척하였다. 3% Marvel/PBS에서 1:1000으로 희석된 뉴트라비딘-HRP 용액 (Pierce 31030)을 ELISA 플레이트에 부가하고, 적어도 30분 동안 인큐베이션하였다. 추가 세척 후에, ELISA를 TMB 기질 (Sigma cat. no. T0440)을 사용하여 현상하고, 0.5M H₂SO₄ 용액을 부가하여 10분 후에 반응을 정지시켰다. 흡광도는 450nm에서 판독하여 결정하였다. 모든 마우스에서 양성 반응이 관찰되었다.

실시예 5. 면역화된 마우스로부터 라이브러리의 생성

a. 조직 처리, RNA 추출 및 cDNA 제조

각 면역화된 동물로부터 비장, 사타구니 및 상완 림프절을 RNAlater로 수집하였다. 각 동물에 대해, 비장의 1/3 및 4개의 림프절을 개별적으로 처리하였다. 처음에, 상기 조직을 균질화하였고; 그 후에 조직을 Lysing matrix D 비드 튜브 (MP Bio cat# 116913100)로 옮긴 후에, β-메르캅토에탄올 (Qiagen RNeasy kit cat# 74104)을 함유하는 RLT 버퍼 600ul를 6m/s 40초 주기를 사용하여 MP Bio Fastprep 균질화기 (cat # 116004500)에서 균질화하기 전에 부가하였다. 상기 균질화된 조직을 함유하는 튜브를 얼음으로 옮기고, 파편 (debris)을 10g으로 5분 동안 미세원심분리 (microcentrifugation)하여 펠릿화하였다. 상등액의 400ul를 꺼내고, RT-PCR에 사용하였다.

초기에, Qiagen RNeasy kit cat# 74104를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. 그 다음에 Superscript III RT-PCR 고-정확도 키트 (Invitrogen cat # 12574-035)를 사용하여 cDNA를 만드는데 각 RNA 샘플을 사용하였다. 각 비장 및 LN RNA 샘플의 경우, 5개의 RT-PCR 반응은 각각 V_H 패밀리에 대한 프라이머와 조합된 VH_J/F (긴) 프라이머로 수행하였다. 각 마우스에 대해, V_H 산물은 표준 프로토콜을 사용하여 비장 및 림프절의 혼합물로부터 증폭되었다.

b. 파지미드 벡터로의 클로닝

파지미드 벡터인 pUCG3을 본 연구에 사용하였다. 지시된 바와 같이, NcoI 및 XhoI를 사용한 제한 효소 소화, 결찰 및 형질전환과 같은 당 분야에서 널리 사용되는 통상적인 방법을 사용하여 V_H를 pUCG3로 클로닝할 수 있다. 여기에서, 대체 PCR-기반 방법이 하기에 기재된 바와 같이 V_H 파지미드 라이브러리를 제작하는데 사용되었다.

상기 정제된 V_H RT-PCR 산물은 벡터 pUCG3와 함께 메가프라이머 (megaprimers)로 사용되어 형질전환 및 라이브러리 생성을 위한 파지미드 산물을 제공하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 분석하였다.

V_H/파지미드 PCR 산물을 원래의 동물 (animal-of-origin)에 의해 풀링하고, 제조자의 지침에 따라 Fermentas PCR 정제 키트 (cat. no. K0702)를 사용하여 정제하였다. 용출된 DNA는 Bio-Rad GenePulser Xcell를 사용한 전기영동에 의해 TG1 대장균 (Lucigen, cat. no. 60502-2)을 형질전환시키는데 사용하였다. 전기영동된 세포를 풀링하였다. 상기 형질전환의 10배 희석 계열을 2% (w/v)의 글루코스 및 100μg/ml의 암피실린을 갖는 2xTY 아가 패트리 플레이트 (agar petri plates)에 플레이팅하였다. 상기 디쉬에서 수득된 콜로니를 사용하여 라이브러리 크기를 추정하였다. 나머지 형질전환은 2% (w/v)의 글루코스 및 100μg/ml의 암피실린이 보충된 대형 2xTY 아가 Bioassay 디쉬에 플레이팅하였다. 모든 아가 플레이트를 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 대형 bioassay 디쉬에 2xTY 배양액 10ml를 부가하여 라이브러리를 수확하였다. 박테리아 콜로니를 부드럽게 긁어 내고, OD600을 기록하였다. 알리코트 (aliquots)는 50% (v/v) 글리세롤 용액의 동일한 부피를 부가한 후 냉동바이알 (cryovials)에서 -80℃에서 저장하거나 또는 파지 선택 과정에서 직접 사용하였다.

실시예 6. HSA -결합 V _H 의 단리를 위한 선택 전략

라이브러리 파지 스톡의 제조 및 파지 디스플레이 선택은 공개된 방법에 따라 수행하였다 (Antibody Engineering, Edited by Benny Lo, chapter 8, p161-176, 2004). 대부분의 경우에, 패닝 접근법 (panning approach)과 조합된 파지 디스플레이를 사용하여 결합 V_H 도메인을 단리하였다. 그러나 가용성 선택, 스트레스 (예: 열) 하에 수행된 선택 및 경쟁적 선택을 포함한, 다양한 상이한 선택 방법이 당 분야에 잘 개시되어 있고, 여기서 과잉의 항원 또는 항원-반응성 V_H 도메인을 경쟁으로 부가하여 고친화성 V_H 도메인의 회수를 촉진하거나 또는 특정 에피토프로부터 선택을 왜곡하였다. HSA 면역화된 마우스 유래의 라이브러리의 경우, 패닝 선택 또는 HSA에 대한 가용성 선택의 1 라운드를 수행하였다.

실시예 7. 표적 결합에 대한 분석법

다양한 선택으로부터의 VH를, HSA에 대한 VH 결합을 확인하기 위해 하기 하나 이상의 분석법으로 스크리닝하였다.

a) 조 박테리아 주변세포질 제제와 ELISA 결합

라이브러리를 선택한 후에, HSA 특이적 V_H 항체를 박테리아 숙주에 의해 발현된 V_H 도메인의 조 추출물을 사용하여 ELISA로 확인하였다. 소-규모의 박테리아 주변세포질 추출물을 딥 웰 플레이트 (deep well plates)에서 성장시킨, 1ml의 배양물로부터 제조하였다. 스타터 배양물 (Starter cultures)을 사용하여, 0.1% (w/v)의 글루코스+ 100ug/ml의 암피실린이 보충된 2XTY 배양액 (Melford, M2130)을 함유하는 96-웰 딥 웰 플레이트 (Fisher, cat# MPA-600-030X)에 37℃에서 접종하고 250rpm으로 진탕하였다. OD600이 0.6-1을 달성한 경우, IPTG (최종 농도 1mM) 및 암피실린이 보충된 100ul의 2XTY를 부가하여 V_H 생성을 유도하고, 배양물을 250rpm으로 진탕하면서 30℃에서 밤새 성장시켰다. 대장균을 3200rpm으로 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상등액을 버렸다. 세포 펠릿을 150ul의 빙냉한 추출 버퍼 (20% (w/v) 수크로스, 1mM EDTA 및 50mM Tris-HCl pH8.0)에 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시켰다. 세포를 얼음에서 30분 동안 인큐베이션한 다음에, 4℃에서 4500rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 폴리프로필렌 플레이트로 옮기고, 1 x PBST 차단 용액에서 인큐베이션한 후에 ELISA에서 직접 사용하였다.

HSA는 탄산나트륨 버퍼 (pH9.6) 중에 1ug/ml로 50ul 부피를 부가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 maxisorb 플레이트 (Nunc 443404)에 고정하였다. 코팅 후에, 상기 항원 용액을 흡인하고, 상기 플레이트는 0.05% Tween 20 (sigma P1379)이 보충된 PBS (PBS 정제로부터 제조, Oxoid cat no. BR0014G)를 사용하여 세척하고, 그 다음에 Tween이 부가되지 않은 PBS로 세척하였다. 비-특이적 단백질 상호작용을 차단하기 위해, PBST를 웰에 부가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 주변세포질 추출물의 1 x PBST (최종 농도)에서의 희석액을 폴리프로필렌 튜브 또는 플레이트에서 제조하고, 차단된 ELISA 플레이트로 옮기기 전에 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하고, 여기서 적어도 1시간의 추가 인큐베이션이 수행되었다. 결합되지 않은 단백질을 PBS/Tween에 이어 PBS로 반복 세척을 사용하여 세척 제거하였다. 그 다음에 PBST에서 1:1000으로 희석하여 제조된, HRP-접합된 항-His Ab (Miltenyi Biotec, 130-092-785)의 용액을 각 웰에 부가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 추가 인큐베이션을 수행하였다. 결합되지 않은 검출 항체는 PBS/Tween 및 PBS를 사용한 반복 세척에 의해 제거하였다. 그 다음에 ELISA는 TMB 기질 (Sigma cat. no. T0440)을 사용하여 현상시키고, 0.5M H₂SO₄ 용액 (Sigma cat. no. 320501)을 부가하여 10-30분 후에 반응을 정지시켰다. 흡광도는 450nm에서 판독하여 결정하였다.

b) 정제된 VH 도메인과 ELISA 결합

정제된 V_H는 주변세포질 추출물의 니켈-아가로스 친화도 크로마토그래피 정제를 위해 V_H C-말단 6xHIS 태그를 사용하여 수득하였다. 각 V_H의 스타터 배양물을 2% (w/v)의 글루코스 및 100μg/ml의 암피실린이 보충된 2XTY 배지 (2XTY 배양액 (Melford cat. no. M2103))에서 30℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 밤새 성장시켰다. 그 다음에 이러한 밤새 성장시킨 배양물을 사용하여 50ml-200ml의 2XTY 배지에 접종하고, 37℃에서 250rpm으로 진탕하면서 약 6-8시간 동안 (OD₆₀₀ = 0.6-1.0이 될 때까지) 인큐베이션하였다. 배양물을 3200rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 100μg/ml의 암피실린/1mM의 IPTG를 함유하는 신선한 2XTY 배양액에 재현탁하였다. 진탕 플라스크를 30℃ 및 250rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. 배양물을 다시 3200rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 버렸다. 세포 펠릿을 빙냉한 추출 버퍼 (20% (w/v) 수크로스, 1mM EDTA, 50mM Tris-HCl pH 8.0 또는 50mM MOPS) 중에 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시킨 다음에, 1:5의 희석된 빙냉한 추출 버퍼로 추가로 희석하였다. 세포를 얼음에서 30분 동안 인큐베이션한 다음에, 4℃에서 4500rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 10mM 이미다졸 (Sigma cat. no. I2399) 및 사전-평형화된 니켈 아가로스 비드 (Qiagen, Ni-NTA 50% soln, cat. no. 30210)를 함유하는 튜브로 옮겼다. V_H 결합은 부드럽게 진탕하면서 4℃에서 2시간 동안 진행되도록 하였다. 상기 비드를 polyprep 컬럼 (BioRad cat. no. 731-1550)으로 옮기고, 상등액을 중력 흐름에 의해 버렸다. 컬럼을 PBS/0.05% Tween®으로 3회 세척한 다음에, 5ml의 PBS/20mM 이미다졸로 3회 세척하였다. PBS/250mM 이미다졸을 사용하여 컬럼으로부터 V_H를 용출시켰다. NAP-5 컬럼 (GE Healthcare, 17-0853-01)에서 버퍼 교환 및 PBS로 용출하여 정제된 V_H 제제로부터 이미다졸을 제거하였다. 정제된 V_H의 수율을 분광광도법으로 추정하였고, 순도는 SDS PAGE를 사용하여 평가하였다.

대안으로서, V_H는 pJExpress 벡터를 사용하여 W3110 대장균의 상등액으로부터 정제하였다. 이러한 절차를 위해, 최대 1L의 배양물을 TB 배지에서 250rpm으로 진탕하면서 37℃에서 성장시킨 후에 1mM IPTG로 밤새 유도하였다. 수득된 상등액을 수확하고, Ni-세파로스 엑셀 수지 (Ni-Sepharose excel resin) (GE Healthcare Cat# 17-3712-03)에 이어 AKTA Pure 시스템에서 HiLoad 26/600 Superdrex 75 pg 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 V_H를 정제하였다.

대안으로서, V_H는 AKTA Pure 시스템에서 HiLoad 26/600 Superdrex 75 pg 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 이어 Capture Select C-태그 XL 친화도 매트릭스 (Thermo Fisher Cat# 2943072010)를 사용하여 상등액으로부터 정제하였다. 정제된 V_H의 수율을 분광광도법으로 추정하였고, 순도는 SDS PAGE를 사용하여 평가하였다.

그 다음에, 정제된 VH를 PBST에서 알려진 농도로 ELISA로 적정하고, HSA 및 CSA (시노몰구스 혈청 알부민 (cynomolgus serum albumin), Equitech-Bio Inc, Cat: CMSA62) 모두에 대한 결합을 테스트하고, 상기 모두는 탄산나트륨 버퍼 (pH9.6)에서 1ug/ml로 코팅한 것을 제외하고는, 상기에 기재된 바와 같이 ELISA를 수행하였다. 정제된 V_H는 HSA 및 CSA에 결합하는 것으로 밝혀졌다.

c) 결합 키네틱스

인간, 시노 (cyno) 및 마우스 혈청 알부민에 대한 결합 연구는 ForteBio OCTET RED384 기기를 사용하여 수행하였다. 혈청 알부민 (HSA, CSA, MSA)을 아민 시약 커플링 키트 (amine reagent coupling kit) (2세대, ForteBio)를 사용하여 아민 커플링에 의해 AR2G 바이오센서에 커플링하였다. 간단히 말해서, AR2G 바이오센서를 물에 재수화시킨 다음에, EDC/sNHS 시약을 사용하여 10분에 걸쳐 활성화하였다. 상기 활성화된 바이오센서를, 10분에 걸쳐 1M 에탄올아민 pH 8.5를 사용하여 유리 활성 부위를 퀀칭하기 전에, 10mM 아세트산나트륨 pH 5.0에서 10ug/ml로 희석된 혈청 알부민 (HSA, CSA, MSA)을 함유하는 웰에 10분 동안 침지시켰다. 그 다음에 표면을 안정화하기 위해 10mM 글리신 pH 2.5에 침지시켰다. 그 다음에 상기 HSA 및 CSA가 로딩된 바이오센서를 120초 동안 1x 분석 버퍼 (PBS/Tween-20 0.05%)에 침지시켜서 기준선 (baseline)을 수립한 다음에, 미리 결정된 농도로 Humabody® V_H를 함유하는 웰에 침지시켰다 (7 포인트의 2배 희석 계열, 혈청 알부민에 대한 결합이 120초에 걸쳐 발생하도록 하는 실험의 경우 최대 농도는 50nM (HSA의 경우) 또는 1500nM (MSA, CSA)임).　그 다음에 상기 바이오센서를 분석 버퍼를 함유하는 웰로 옮겨서, 상기 Humabody® V_H가 300초에 걸쳐 혈청 알부민으로부터 해리되도록 하였다.　결합 상호작용의 키네틱스 및 친화도는 1:1의 결합 모델을 사용하여 모델링하였고, ForteBio 분석 소프트웨어 버전 8.1 이상을 사용하여 계산하였다.　비정상적이거나 또는 적합하지 않은 곡선은 상기 분석으로부터 제외하였다.

실시예 8 - V _H 단일 도메인 항체가 우수한 안정성을 나타냄.

정제된 V_H를 크기 배제 크로마토그래피로 처리하였다. 간단히 말해서, 정제된 V_H를 4℃ 또는 40℃에서 0-14일 동안 PBS 버퍼 중에 2mg/ml로 저장한 다음에, Waters ACQUITY BEH 125Å SEC 컬럼에서 분리와 함께 PDA 검출기 (280nm에서 검출)를 포함하는 Waters H-Class Bio UPLC를 사용하여 다양한 시점에서 분석하였다. 샘플을 10μl 부피로 주입하고, 200 mM NaCl, 100 mM 인산나트륨, pH 7.4 + 5% 프로판-1-올을 함유하는 이동상에서 0.4ml/분의 유속으로 수행하였다. 데이터를 6분 동안 수집하고, 저장 후에 샘플 중에 단량체 단백질의 퍼센트를 계산하였다.

4℃에서 14일 동안 인큐베이션한 후에, 유의한 변화는 보이지 않았다. 40℃에서 인큐베이션한 후에 단량체 퍼센트가 약간 떨어진 것으로 관찰되었다. 결과는 (Humabody® 1 (서열번호: 1)에 대한 결과를 하기에 제시하였다.

표 3: V_H 단일 도메인 항체 (Humabody® 1 (서열번호: 1)의 안정성. 이는 0, 1, 3, 7 및 14일 후에 존재하는 단량체의 퍼센트를 나타낸다.

실시예 9 이중 유전자이식 인간화 FcRn / HSA 마우스에서 반감기가 연장된 분자의 단일 정맥내 투여의 약동학 분석

genOway®의 인간 신생아 Fc 수용체 / 인간 알부민 마우스 모델을 사용하여 실험을 수행하였다. 이러한 이중 인간화 신생아 Fc 수용체 (FcRn)/알부민 마우스 모델은 자가 수용체-리간드 상호작용을 유지하고, 인간의 생리학적 약물 청소를 모방하므로, 알부민-연결된 소분자 및 기존 약물 약동학을 측정 및 최적화하고, 순환하는 생물학적 제제 및 바이오시밀러 약물의 반감기를 연구 및 예측하는 독특하고 신뢰할 수 있는 수단을 나타낸다 (Viuff D, Antunes F, Evans L, Cameron J, Dyrnesli H, Thue Ravn B, Stougaard M, Thiam K, Andersen B, Kjærulff S, Howard KA. 2016. Generation of a double transgenic humanized neonatal Fc receptor (FcRn)/albumin mouse to study the pharmacokinetics of albumin-linked drugs. J Control Release).

상기 hFcRn/HSA 인간화 마우스는 WT 마우스보다 더 예측 가능한 "인간-유사 (human-like)" 약동학적 결과를 제공한다. 이러한 모델은 HSA-결합 약물의 약동학, 분포 및 독성의 인 비보 평가하는데 적합하다.

약동학을 테스트하기 위해 Humabody® 1 (서열번호: 1)을 포함하는 삼중특이적 분자 (서열번호: 17)를 이들 실험에 사용하였다. 상기 3가 구조체는 상기 구조체의 C-말단 단부에 위치하는 HSA 결합 서열번호: 1과 함께, CD137 및 전립선 특이적 막 항원 (prostate specific membrane antigen: PSMA) 각각에 결합하는 2개의 VH 도메인을 포함한다 (여기서 3개의 VH는 G4S 링커에 의해 연결됨).

간단히 말해서, 수컷 genOway® 인간 HSA/FcRn Tg 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 2mg/kg의 단일 정맥내 주사 (n = 3)로 투여하였다. 혈액 샘플은 복재 정맥 (saphenous vein)을 통해, 약물 투여 전 및 약물 투여 후 0.083시간, 1시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 수집하였다. 투여 후 168시간에, 모든 동물을 안락사시키고, 혈액을 수집하였다. 혈장을 분리하고, 분석이 수행될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 혈장 샘플은 비오틴화 인간 PSMA를 캡쳐 (capture)로 사용하고 인간 CD137Dylight650을 검출 (detection)로 사용하여, Gyrolab 면역분석 플랫폼에서 분석하였다. 혈장 중 농도를 수득하기 위해 Gyros를 사용하여 데이터를 분석하였다. 데이터의 약동학적 분석은 엑셀의 추가 기능인 PK Solver 2.0을 사용하여 수행하였다.

연구 결과로부터 상기 분자를 인간 HSA/FcRn Tg 마우스에서 2mg/kg으로 정맥내 투여하는 경우 상기 분자의 반감기는 18.13 ± 0.412시간 (n = 3)인 것을 보여주었다. 서열번호: 1을 갖지 않는 대조군은 빠르게 청소되었고, 1시간 후에 혈장 중에서 검출 가능하지 않았다.

표 4: pK 파라미터에 대한 요약표.

실시예 10 - Humabody ® 1에 대한 결합 부위의 결정

상기 ForteBio OCTET RED384 기기는 Humabody® 1 V_H 및 HSA 도메인 I, II 및 III 간의 상호작용을 연구하는데 사용하였다. HSA 도메인은 Albumin Bioscience로부터 구입하였다. 간단히 말해서, AR2G 바이오센서를 물에 재수화시킨 다음에 EDC/sNHS 시약을 사용하여 10분에 걸쳐서 활성화시켰다. 상기 활성화된 바이오센서를, 10분에 걸쳐서 1M 에탄올아민 pH 8.5를 사용하여 유리 활성 부위를 퀀칭하기 전에, 10mM 아세트산나트륨 pH 5.0 중에 50 ug/ml로 희석시킨 HSA 도메인을 함유하는 웰로 5분 동안 침지시켰다. 그 다음에 이들을 10mM 글리신 pH 2.5로 침지시켜서 표면을 안정화하였다. 그 다음에 도메인 HSA가 로딩된 바이오센서를 1x 분석 버퍼 (PBS/Tween-20 0.05%)에 120초 동안 침지시켜서 기준선을 설정한 다음에, 300 nM의 미리 결정된 농도의 Humabody® 1 V_H를 함유하는 웰에 침지시켜서 HSA에 대한 결합이 120초에 걸쳐 발생하도록 하였다. 그 다음에 상기 바이오센서를 분석 버퍼를 함유하는 웰로 옮겨서 Humabody® 1 V_H가 300초에 걸쳐 HSA 도메인으로부터 해리되도록하였다.

Humabody® 1은 HSA의 도메인 III에 결합하지만, 도메인 I 및 II에는 결합하지 않는다.

표 5: Humabody ® 1 (서열번호: 1) 및 대조군에 대한 HSA 도메인에의 결합

상기 실험에 하기 서열이 사용되었다:

SEQUENCE LISTING <110> Crescendo Biologics Limited <120> Single domain antibodies that bind human serum albumin <130> P35198WO1 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His His Tyr Ala 20 25 30 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 35 40 45 Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly Ala Pro Thr Phe Glu His Trp 100 105 110 Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 His Tyr Ala Met His 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly Ala Pro Thr Phe Glu His 1 5 10 <210> 5 <211> 609 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Gly Leu Lys Cys 210 215 220 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 275 280 285 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410 415 Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Cys Leu Ser Val Phe 465 470 475 480 Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Gly Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605 Leu <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C terminal sequence VH <400> 6 Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> His-tag <400> 7 His His His His His His 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 10 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 12 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 13 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 14 Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 15 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 16 <211> 750 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 16 ggctttgtga gcggatacaa ttataatatg tggaattgtg agcgctcaca attccacaac 60 ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac ttttaggagg taaaacatat gaagaaaacg 120 gcaatcgcaa tcgcagtcgc tctggcgggt ttcgcaactg tagcgcaagc cgaggtgcaa 180 ctggtcgagt ctggtggtgg tttggtgcaa cctggtagaa gcttgcgttt gagttgtgcc 240 gcttccggct tcactttcca tcattatgct atgcactggg ttcgtcaagc tcccggaaaa 300 ggtttggagt gggtttccgg aatttcctgg aatggcaata agattacgta cgctgattca 360 gtgaaaggaa ggtttacaat cagtagagat aatgctaaaa actcattgta tctacaaatg 420 aacagcctaa gagcagaaga taccgctctg tactactgtg ttagagatag ctcgttattc 480 attgtaggtg caccaacttt tgaacattgg ggtcggggta ctcttgtgac tgtctcatcc 540 gcggccgcac accaccatca tcaccactaa ctcgagcgcc taatgaaagc ttccccaagg 600 gcgacacccc ctaattagcc cgggcgaaag gcccagtctt tcgactgagc ctttcgtttt 660 atttgatgcc tggcagttcc ctactctcgc atggggagtc cccacactac catcggcgct 720 acggcgtttc acttctgagt tcggcatgga 750 <210> 17 <211> 453 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Ala Trp Gly Leu Arg Leu Gly Glu Ser Ser Ser Tyr 100 105 110 Asp Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Trp Met Asn 180 185 190 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile 195 200 205 Asn Gln Asp Gly Ser Glu Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg 210 215 220 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met 225 230 235 240 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 245 250 255 Gly Glu Gly Tyr Gly Val Asp His Tyr Gly Leu Asp Val Ser Gly Gln 260 265 270 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 325 330 335 Phe Thr Phe His His Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 340 345 350 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile 355 360 365 Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 370 375 380 Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 385 390 395 400 Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly 405 410 415 Ala Pro Thr Phe Glu His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 420 425 430 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser 450 <210> 18 <211> 1359 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 18 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt ggctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggcatat atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagatccg 300 gcctggggat tacgtttggg ggagtcatcg tcctatgatt ttgatatctg gggccaaggg 360 acaatggtca ccgtctcctc aggtggtggc ggttcaggcg gaggtggctc tggaggtgga 420 ggttcaggag gtggtggttc tggcggcggt ggatcgggtg gaggtggtag tgaggtgcag 480 ttagttgaga gcggaggtgg tttagttcag ccggggggct cgcttcgcct gtcgtgcgcc 540 gcctcgggat tcacattatc aaactactgg atgaattggg tccgccaggc tccgggcaaa 600 ggtcttgagt gggtggcgaa cattaatcag gacgggagcg agcgttatta cgttgattcg 660 gtaaaaggac gtttcactat cagtcgtgac aacgctaaaa attccttgta cttacagatg 720 aactcacttc gtgctgagga caccgcagtg tactactgtg ctcgcggtgg tgaaggatac 780 ggcgtcgatc actacggcct tgatgtatca ggacagggga ctacagttac cgtctcttcc 840 ggcggaggtg gctctggagg aggcggatcg gggggtggag gaagtggcgg cggtggtagt 900 ggaggaggtg gttctggagg cggtggctct gaagtacaac tggttgaatc gggtggtgga 960 ttggtccaac ctggaagatc attgaggctt tcttgtgcag cttccggatt cacctttcat 1020 cactatgcta tgcactgggt gagacaagcc cctggtaagg gcttggaatg ggtgtccgga 1080 atctcctgga atggtaacaa aataacatat gcagattccg ttaagggtag atttactatt 1140 agccgtgata atgcaaaaaa cagtttatac ttgcagatga attccttgag ggctgaggat 1200 acagctcttt actattgtgt gcgtgactca tcgttgttca ttgtcggagc cccaactttc 1260 gaacattggg gtagaggtac cctagttacg gttagctcag gcggaggtgg ctctggagga 1320 ggcggatcgg ggggtggagg aagtggcggc ggtggtagt 1359 <210> 19 <211> 123 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe His His Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly Ala Pro Thr Phe Asp His 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe His His Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly Ala Pro Thr Phe Asp His 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (24)

1. 서열번호: 1 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는, 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HSA)에 결합하는 면역글로불린 인간 단일 가변 중쇄 도메인.
2. 청구항 1에 있어서,
   a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 2와 1 또는 2개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
   b) 서열번호: 3 또는 서열번호: 3과 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
   c) 서열번호: 4 또는 서열번호: 4와 1, 2, 3 또는 4개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3
   을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인.
3. 청구항 1에 있어서, 서열번호: 19 또는 20, 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 상이한 표적에 결합하는 적어도 제2 모이어티를 포함하는 단백질 또는 구조체.
5. 청구항 4에 있어서, 치료용 모이어티 (therapeutic moiety)를 포함하는 단백질 또는 구조체.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 치료용 모이어티는 항체 또는 이의 단편인 단백질 또는 구조체.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 단편은 scFv, Fv, 중쇄 또는 단일 도메인 항체, 예컨대 단일 가변 중쇄 도메인인 단백질 또는 구조체.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 단일 도메인 항체는 단일 가변 중쇄 도메인 항체인 단백질 또는 구조체.
9. 청구항 4 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 상기 치료용 모이어티에 펩티드 링커를 사용하여 연결된 단백질 또는 구조체.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 15인 단백질 또는 구조체.
11. 청구항 4 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기 단백질의 N 또는 C 말단 단부에 위치하는 단백질 또는 구조체.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기 단백질의 C 말단 단부에 위치하고, 1 내지 50개의 아미노산의 C 말단 연장을 포함하는 단백질 또는 구조체.
13. 단백질의 반감기를 연장하는 방법으로서, 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인에 상기 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
14. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인이 융합 단백질에서 치료용 모이어티에 연결되는 경우 상기 치료용 모이어티의 반감기를 연장하는데 있어서, 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인의 용도.
15. 청구항 1 또는 2에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 청구항 4 내지 12 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 구조체를 포함하는 약학적 조성물.
16. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열.
17. 청구항 16에 있어서, 서열번호: 16을 포함하는 핵산 서열.
18. 청구항 16 또는 17에 있어서, 상기 핵산 서열이 링커를 사용하여 제2 핵산 서열에 연결된 핵산 서열.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 제2 핵산은 치료용 모이어티를 코딩하는 핵산 서열.
20. 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 링커는 핵산 링커인 핵산 서열.
21. 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
22. 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열 또는 청구항 21의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
23. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 청구항 4 내지 12 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 구조체, 또는 청구항 15에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트.
24. 인간 혈청 알부민의 아미노산 잔기 383-569에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인 항체.