CN113412278A - 结合人血清白蛋白的单结构域抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结合人血清白蛋白的单V_H结构域抗体。

Description

结合人血清白蛋白的单结构域抗体

背景技术

蛋白质和多肽的药代动力学受吸收、生物分布、代谢和消除的参数的控制。清除蛋白质和肽的最常见途径包括肝细胞对较大蛋白质的内吞和膜转运介导的清除，以及肾脏对较小蛋白质和肽的肾小球滤过作用。

许多具有可用于治疗和/或诊断目的活性的药物因为在施用后迅速从体内清除而具有有限的价值。例如，许多具有治疗有用活性的多肽被通过肾脏从循环中迅速清除。

因此，必须施用大剂量以获得期望的治疗效果。需要具有改善的药代动力学性质的改善的治疗剂和诊断剂。

因此，已经采用了不同的策略来改善较小蛋白质和肽的药代动力学，包括增加蛋白质或肽的尺寸和流体动力学半径，增加靶蛋白质或肽的负电荷，或通过与白蛋白结合来增加肽或蛋白质的血清蛋白结合水平。在慢性病中这可能很重要。通过靶向内源白蛋白的半衰期延长部分实现了暴露的延长。这包括使生物活性蛋白质或肽与人血清白蛋白(HSA)融合，与人免疫球蛋白(Ig)G的恒定片段(Fc)结构域融合或与非结构化多肽(例如XTEN)融合(Stroh“Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategyto Make Biobetters BioDrugs”.2015；29(4):215–239中的综述)。

不同的应用需要不同的半衰期，并且仍然需要提供定制的半衰期延长分子。本发明旨在解决该需求。

发明内容

本发明涉及结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域，特别是人免疫球蛋白单可变重链结构域，例如特别是从表达未重排人V、D、J基因片段的转基因小鼠获得或可获得的人免疫球蛋白单可变重链结构域。

一方面，本发明涉及结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域，其包含SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性/同源性的序列，或由SEQ IDNO.1或与SEQ ID NO.1具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性/同源性的序列组成。本发明还涉及结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域，其为SEQ ID NO.1的变体并且与SEQ IDNO.1相比具有氨基酸替换，例如1至20个氨基酸替换。本发明涉及结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域，其包含SEQ ID NO.19或20或与SEQ ID NO.19或20具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性/同源性的序列，或由SEQ ID NO.19或20或与SEQ ID NO.19或20具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性/同源性的序列组成。

另一方面，本发明还涉及用于延长蛋白质的半衰期的方法，其包括使所述蛋白质与如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域连接。

本发明还涉及如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域在延长治疗部分的半衰期中的用途，当本文所述的免疫球蛋白单可变结构域在融合蛋白中与所述治疗部分连接时，实现所述延长。

本发明涉及融合蛋白，其包含结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有至少75％、80％、90％或95％序列同一性/同源性的序列，或由SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有至少75％、80％、90％或95％序列同一性/同源性的序列组成，所述免疫球蛋白单可变结构域例如通过肽接头与结合另一靶标的另一部分连接。

另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域或如本文所述的蛋白质或构建体。

本发明还涉及编码如本文所述的氨基酸序列的核酸序列。

本发明进一步涉及包含如本文所述的核酸序列的载体。

本发明还涉及包含如本文所述的如本文所述的核酸序列或如本文所述的载体的宿主细胞。

本发明还涉及试剂盒，其包含如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域或如本文所述的蛋白质或构建体或如本文所述的药物组合物。

具体实施方式

现在将进一步描述本发明的实施方案。在以下段落中，描述了不同的实施方案。如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合，除非有相反的明确指示。

通常，与本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交的技术结合使用的术语和是本领域公知的和常用的。除非另外指出，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法以及如本说明书通篇引用和讨论的多种上位和更下位的参考文献中所述来进行。参见例如Greenand Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)；Therapeutic MonoclonalAntibodies:From Bench to Clinic,Zhiqiang An(Editor),Wiley,(2009)；and AntibodyEngineering,2nd Ed.,Vols 1and 2,Ontermann and Dubel,eds.,Springer-Verlag,Heidelberg(2010)。

酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书如本领域通常完成的或如本文所述进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术结合使用的术语是本领域公知的和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂、递送和患者治疗。

本发明涉及与人血清白蛋白(HSA)结合的氨基酸序列和包含这样的氨基酸序列的结合分子，例如蛋白质。特别地，本发明涉及具有如本文所述的氨基酸的单结构域抗体、免疫球蛋白单可变结构域，特别是人免疫球蛋白单可变重链结构域(V_H)抗体，其可用于如本文所述的治疗方法和用途以及用在药物制剂中。

本文所述的单结构域抗体特异性结合野生型人血清白蛋白(UniPro登录号Q56G89)。野生型人血清白蛋白的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.5)。

人血清白蛋白(HSA，2BXN)约占血浆蛋白质的60％。HSA由长度为585个氨基酸的单链组成，其包含三个同源结构域(I、II和III)。结构域I由残基5-197组成，结构域II包含残基198-382，并且结构域III由残基383-569形成。每个结构域包含称为A和B的两个亚结构域(IA：残基5-107；IIA：残基108-197；IIA：残基198-296；IIB：残基297-382；IIIA：残基383-494；IIIB：残基495-569)。

本发明的“结合”或“能够结合”目的抗原(例如人血清白蛋白)的单结构域抗体(sdAb)、免疫球蛋白单可变结构域或蛋白质是以足够的亲和力结合抗原的那些，使得单结构域抗体可用作靶向表达如本文所述的抗原人血清白蛋白的细胞或组织的治疗剂。

本文所述的单结构域抗体、免疫球蛋白单可变结构域或蛋白质与人血清白蛋白特异性结合。换句话说，与人血清白蛋白抗原的结合可测量地不同于非特异性相互作用。如实施例所示，本发明的单结构域抗体不与小鼠人血清白蛋白交叉反应。优选地，如实施例中所示，本发明的单结构域抗体与人血清白蛋白结合并且还与猴血清白蛋白结合。

如本文所用，术语“抗体”广泛地指任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分，其包含两条重(H)链和两条轻(L)链的四条多肽链或它们的保留了Ig分子的基本表位结合特征的任何功能性片段、突变体、变体或衍生物。

在全长抗体中，每条重链包含重链可变区或结构域(本文缩写为HCVR)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链包含轻链可变区或结构域(在本文中简称为LCVR)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域C_L。

重链和轻链可变区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的区，称为框架区(FR)。每条重链和轻链可变区包含三个CDR和四个FR，其从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，重链和轻链的每个可变区中都有三个CDR，分别称为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组(CDR set)”是指出现在能够结合抗原的单个可变区中的三个CDR的组。这些CDR的确切边界可以根据本领域已知的不同系统来不同地定义。

Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性，并且是最常用的(Kabat等人,(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)。相反，Chothia涉及结构环的位置(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当提及可变结构域中的残基(大致为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统。另一种系统是ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案。在Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.,29,185-203(2005)中描述了IMGT编号方案。

本文使用Kabat描述的系统。术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文可互换使用。这些术语在本领域中是公认的，是指对抗体或抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基比更可变(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统。

术语“抗原结合位点”是指包含与抗原特异性结合的区域的抗体或抗体片段的部分。抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合位点通常包含在抗体或抗体片段的缔合的V_H和V_L内。

抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab')2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、可变重(V_H)、可变轻(V_L)链结构域等。全长抗体的功能片段保留了完整抗体的靶标特异性。因此，重组功能性抗体片段，例如Fab(抗体片段)、scFv(单链可变链片段)和单结构域抗体(dAb)已被用于开发作为对基于mAb的治疗的替代的治疗。

scFv片段(～25kDa)由两个可变结构域V_H和V_L组成。天然地，V_H和V_L结构域通过疏水相互作用非共价缔合并且趋于解离。然而，可以通过将结构域与亲水性柔性接头连接以产生单链Fv(scFv)来设计稳定片段。

最小抗原结合片段是单可变片段，即可变重链(V_H)或可变轻链(V_L)结构域。V_H和V_L结构域分别能够与抗原结合。靶标结合不需要分别与轻链/重链伴侣结合，或者不需要实际上存在完整抗体的其他部分。尺寸减小到一个单结构域(对应于V_H或V_L结构域)的抗体的抗原结合实体通常被称为“单结构域抗体”或“免疫球蛋白单可变结构域”。因此，单结构域抗体(～12至15kDa)具有V_H或V_L结构域，即其不具有完整抗体的其他部分。已经描述了源自骆驼科动物的天然缺乏轻链的仅重链抗体的单结构域抗体以及具有人重链结构域的单结构域抗体。还已经从例如从免疫小鼠的脾脏的基因组DNA中扩增并在大肠杆菌中表达的鼠V_H基因文库中鉴定了抗原结合单V_H结构域(Ward等人,1989,Nature 341:544-546)。Ward等人将分离的单V_H结构域“dAb”称为“结构域抗体”。术语“dAb”通常是指特异性结合抗原的单免疫球蛋白可变结构域(V_H、V_HH或V_L)多肽。为了用于治疗，人单结构域抗体优于骆驼科动物来源的V_HH，主要是因为当施用于患者时，其不太可能引起免疫反应。

术语“单结构域抗体(sdAb)、单可变结构域、单可变结构域抗体或免疫球蛋白单可变结构域(ISV)”在本领域中是公知的，并且描述了与靶抗原结合的抗体的单可变片段。这些术语在本文中可互换使用。术语“单重链结构域抗体、单可变重链结构域、单可变重链结构域、免疫球蛋白单重链可变结构域(ISV)、免疫球蛋白单重链可变结构域、人V_H单结构域”在本文中可互换使用并描述了完整抗体的单重链可变片段，其在不存在轻链或其他抗体片段的情况下保留了与抗原的结合特异性，并且以分离形式而不是作为全长抗体的一部分来使用。单可变重链结构域抗体不包含全长抗体的任何其他链或结构域；其没有任何轻链或恒定结构域。因此，其能够在不存在轻链的情况下与抗原结合。

一方面，本发明涉及结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，特别是免疫球蛋白单重链可变结构域。如下所述，实施方案涉及结合HSA抗原的单可变重链结构域抗体/免疫球蛋白单可变重链结构域。因此，单可变重链结构域抗体能够在不存在轻链的情况下结合HSA。人单可变重链结构域抗体(“V_H单结构域抗体/单V_H结构域抗体”)是特别优选的。这样的结合分子在本文中也被称为

是Crescendo Biologies有限公司的注册商标。

因此，在一些实施方案中，分离的结合剂/分子包含至少一个单结构域抗体或由至少一个单结构域抗体组成，其中所述结构域是人免疫球蛋白可变重链结构域；其没有V_L结构域或其他抗体片段，并与靶抗原结合。

术语“分离的”是指从其天然环境分离的部分。例如，术语“分离的”是指基本上不含其他单结构域抗体、抗体或抗体片段的单结构域抗体。此外，分离的单结构域抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

每个V_H结构域抗体包含三个CDR和四个FR，其从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此，在本发明的一个实施方案中，结构域是具有下式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR2-CDR3-CDR3-FR4的人可变重链(V)结构域。

可以对本发明的单结构域抗体进行C或N末端V_H框架序列的修饰，以改善其特性。例如，V_H结构域可以包含C-或N-末端延伸。可以将C末端延伸添加至以残基VTVSS(SEQ IDNO.6)终止的V_H结构域的C末端。

在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体包含1至50个残基，例如1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-20、1-30或1-40个额外氨基酸的C末端延伸。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体包含人C_H1结构域的额外氨基酸，因此C末端延伸到C_H1结构域中。

另外的C或N端残基可以是例如用于将本发明的单结构域抗体缀合至另一部分的肽接头，或有助于检测分子的标签。这样的标签在本领域中是公知的，并且包括例如接头His标签，例如六-His(hexa-His)(HHHHHH，SEQ ID NO.7)或myc标签。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”通常是指在比对序列之后并且在一些实施方案中如果必要在引入缺口以实现最大百分比同源性之后并且在不考虑将任何保守替换作为序列同一性的一部分的情况下，序列中与同其进行比较的参考多肽中的残基相同的氨基酸残基的百分比。因此，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两个序列之间的百分比同一性。N-末端或C末端的延伸、标签或插入均不得解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是公知的。可以使用公知的数学算法确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。

如本文所述的单结构域抗体的可变结构域是完全人的或基本上完全人的。如本文所用，术语V_H结构域抗体表示单人可变重链结构域抗体(与V_HH相反，其表示骆驼科重链结构域)。如本文所用，人V_H结构域包括完全人或基本上完全人V_H结构域。如本文所用，术语人V_H结构域还包括从表达完全人免疫球蛋白重链基因座的转基因小鼠产生的仅重链抗体分离的V_H结构域，特别是响应于用目的抗原(即HSA)免疫后，例如如WO2016/062990和以下实施例中所述。在一个实施方案中，人V_H结构域还可以包括衍生自或基于人V_H结构域氨基酸或由人V_H核酸序列产生的V_H结构域。因此，术语人V_H结构域包括衍生自人免疫球蛋白序列或由人免疫球蛋白序列编码的可变重链区，并且例如从表达完全人未重排V、D、J基因片段的转基因小鼠产生的仅重链抗体获得。在一些实施方案中，基本上人V_H结构域或衍生自或基于人V_H结构域的V_H结构域可包含未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过例如随机或位点-特异性诱变体外引入或通过体内体细胞突变引入的突变)。因此，术语“人V_H结构域”还包括基本上人V_H结构域，其中一个或多个氨基酸残基已被修饰，例如，去除序列负债(sequence liabilities)。例如，对于基本上人V_H结构域，与种系人序列相比，V_H结构域可包含至多10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或至多20个氨基酸修饰。

然而，如本文所用，术语“人V_H结构域”或“基本上人V_H结构域”不旨在包括其中来源于另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。在一个实施方案中，如本文所用，术语“人V_H结构域”也不旨在包括骆驼源化(camelized)的V_H结构域，即已经被如下特异性修饰的人V_H结构域，例如通过常规诱变方法体外修饰以选择V_H结构域序列中的预定位置，并且在预定位置引入一个或多个点突变以将一个或多个预定残基改变为可在骆驼科动物V_HH结构域中发现的特定残基。

本发明的分子是有利的，因为其是完全人的并且因此不是免疫原性的。其不需要人源化。

HSA具有三个结构域，即结构域I、结构域II和结构域III。结构域III参与血清白蛋白与FcRn的结合。令人惊讶地，发明人已经显示了包含SEQ ID NO.1或由SEQ ID NO.1组成的在本文中称为

1的单可变重链结构域抗体与HSA的结构域III结合。不希望受到理论的束缚，相信与结构域III的相互作用可有益于调节半衰期。这种相互作用可能对HSA和FcRn相互作用产生影响，导致一些激动剂分子可能需要的较短半衰期。

因此，在第一方面，本发明涉及结合HSA的结构域III(即HSA的氨基酸残基383-569)的免疫球蛋白单可变重链结构域。在一个实施方案中，其不结合结构域I和II。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有至少75％、80％、85％、90％或95％同源性的序列，或由SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有至少75％、80％、85％、90％或95％同源性的序列组成。

SEQ ID NO.1如下所示：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRSCAASGFTFHHYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNGNKITYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCVRDSSLFIVGAPTFEHWGRGTLVTVSS

(SEQ ID NO.1，在本文中也称为

1)。

CDR1、CDR2和CDR3的序列在上面分别以粗体显示。

1的CDR具有以下序列：

CDR1：HYAMH(SEQ ID NO.2)

CDR2：GISWNGNKITYADSVKG(SEQ ID NO.3)

CDR3：DSSLFIVGAPTFEH(SEQ ID NO.4)

序列同源性/同一性可以为至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，例如至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域包含

a)具有SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有1、2、3、4或5个差异的氨基酸序列的CDR1，

b)具有SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个差异的氨基酸序列的CDR2，和/或

c)具有SEQ ID NO.4或与SEQ ID NO.4具有1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13或14个差异的氨基酸序列的CDR3。

氨基酸序列中的差异可以是氨基酸的缺失、替换或添加。在一个实施方案中，差异是氨基酸替换。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域具有本文定义的其中一种CDR，例如CDR1、CDR2或CDR3。在一个实施方案中，CDR分别选自SEQ ID NO.2、3或4。在另一个实施方案中，CDR是变体并且具有如上所定义的替换。在另一个实施方案中，两个CDR序列中的一个如SEQ ID NO.2、3或4所定义，并且其余CDR是相应CDR序列2、3或4(适用时)的变体。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变重链结构域是SEQ ID NO.1的变体，其具有一个或多个氨基酸替换，例如20个，例如1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个替换，一个或多个缺失，一个或多个插入或其他修饰，并且其保留了单结构域抗体的生物学功能，即与HAS结合。因此，变体V_H单结构域抗体可以被序列改造。修饰可以包括编码单结构域抗体或多肽的一个或多个密码子的一种或多种替换、缺失或插入，其导致与天然序列V_H单结构域抗体或多肽相比氨基酸序列的变化。氨基酸替换可以是将一个氨基酸替换为具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸的结果，例如将亮氨酸替换为丝氨酸，即保守氨基酸替换。插入或缺失可以任选地在约1至25个氨基酸的范围内，例如1至5、1至10、1至15、1至20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。可以通过系统地在序列中进行氨基酸的插入、缺失或替换并测试所得变体的由全长或成熟天然序列所表现出的活性来确定允许的变化。

本文所述的V_H单结构域抗体的变体与非变体分子具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性/同一性。在一个实施方案中，修饰是保守序列修饰。如本文所用，术语“保守序列修饰”旨在指不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的sdAb中。保守氨基酸替换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的单结构域抗体的CDR区域内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的抗体的保留功能(即，HSA结合)。

因此，通常可以进行这些氨基酸变化而不改变多肽的生物学活性、功能或其他所需性质，例如其对抗原的亲和力或特异性。通常，多肽非必需区域中的单个氨基酸替换基本上不会改变生物学活性。此外，结构或功能上相似的氨基酸的替换不太可能破坏多肽的生物活性。下表1中显示了包含本文所述的多肽和肽的氨基酸残基的缩写，以及这些氨基酸残基的保守替换。

表1.氨基酸残基和保守氨基酸替换的实例

在一些实施方案中，本发明提供了V_H单结构域抗体，其是V_H单结构域抗体的变体，与SEQ ID NO.1相比，其包含一个或多个序列修饰，并且与未修饰的单结构域抗体相比，其在一种或多种性质例如结合亲和力、特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性上有改善。

技术人员将知道，存在着鉴定、获得和优化本文所述的抗原结合分子的不同方法，包括体外和体内表达文库。在实施例中将对此进行进一步描述。可以使用本领域已知的优化技术，例如展示(display)(例如，核糖体和/或噬菌体展示)和/或诱变(例如，易错诱变)。因此，本发明还包括本文所述的单结构域抗体的序列优化的变体。

在一个实施方案中，可以进行修饰以降低单结构域抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基回复为相应的人种系序列。更具体地，经历了体细胞突变的单结构域抗体可以含有与单结构域抗体所源自的种系序列不同的框架残基。可以通过将单结构域抗体框架序列与单结构域抗体所源自的种系序列进行比较来鉴定这样的残基。在一个实施方案中，所有框架序列均为种系序列。

为了使框架区序列中的一个或多个氨基酸残基返回其种系构型，可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变(backmutated)”至种系序列。

框架修饰的另一种类型涉及使框架区内或甚至一个或多个CDR区域内的一个或多个残基突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。

在另一个实施方案中，对糖基化进行修饰。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以，例如，增加抗体对抗原的亲和力。这样的碳水化合物修饰可通过，例如，改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸替换，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。

在一个实施方案中，一个或多个替换在CDR1、2或3区域中。例如，在CDR1、2或3中可存在1、2、3、4、5或更多个氨基酸替换。在另一个实施方案中，可存在1或2个氨基酸缺失。在一个实施方案中，一个或多个替换在框架区中。例如，在框架区中可以存在1至10个或更多个氨基酸替换。

在一个实施方案中，变体包含一个或多个参考SEQ ID NO.1的以下替换或其组合：

E111→D；

R115→Q；

S100→H或V；

V97→A；

K98→R；

13Q→H或K；

16R→G；

19R→K；

23A→T；

24A→V；

H30→N或D；

H31→E或D；

G55→S；

G56→N；

K57→S、T、V或R；

T59→A、D或G；

K65R；

A89→V或P，和/或

I104→L。

在一个实施方案中，变体包含1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个上文所列的修饰。因此，特别地设想了修饰的组合。在一个实施方案中，变体具有修饰E111→D和R115→Q。在一个实施方案中，变体具有SEQ ID NO.19或20或与SEQ IDNO.19或20具有至少80％、90％或90％序列同一性并保留SEQ ID NO.19或20所示的CDR序列的序列。因此，本发明还涉及包含SEQ ID NO.1、19或20或其变体的单V_H结构域抗体，或由SEQ ID NO.1、19或20或其变体组成的单V_H结构域抗体。

还涵盖了本文所述的sdAb的片段，例如保留与HAS结合的SEQ ID NO.1、19或20的片段，例如包含一个或多个CDR序列或由一个或多个CDR序列组成的肽。

如上所述，本发明提供的氨基酸序列是可以与人血清白蛋白结合的蛋白质，并且可以特别是特异性(如本文所述)与人血清白蛋白结合的蛋白质。因此，其可用作与人血清白蛋白结合的结合单位或结合结构域，例如赋予治疗化合物、部分或实体的半衰期(如本文所定义)的延长。

所使用的术语“半衰期”通常可以指在体内将氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度降低50％所需的时间，例如由于序列或化合物的降解和/或通过天然机制对序列或化合物的清除或隔离。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以通过本身已知的任何方式来确定，例如通过药代动力学分析。合适的技术对于本领域技术人员将是清楚的。可以使用诸如tl/2-α、tl/2-β和曲线下面积(AUC)的参数来表示半衰期。可以从缀合物或融合物的血清浓度随时间的曲线确定半衰期(tα和tβ)和AUC。因此，如本文所用，术语“半衰期”特别是指tl/2-β或终末半衰期(其中tl/2-α和/或AUC或两者均可不考虑在内)。

例如，在第一阶段(α阶段)中，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合物)主要在患者体内分布，并且有一些消除。第二阶段(β阶段)是末期阶段，此时药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合物)已经分布，并且随着药物组合物从患者体内清除，血清浓度降低。tα半衰期是第一阶段的半衰期，并且tβ半衰期是第二阶段的半衰期。

本发明的结合HSA的免疫球蛋白可变结构域：

·在人中的半衰期(表示为t1/2)为1至72小时，例如2、4、6、8或10小时，例如10或更多，例如10、11、12、14、14、15、16、17、18、19、20，例如约18，例如至多20小时或12、24、36或48小时，和/或

·在与治疗部分连接后，使所得的融合蛋白在人中的血清半衰期为1至72小时，例如10或更多，例如2、4、6、8或10小时，例如10、11、12、14、14、15、16、17、18、19、20，例如约18或至多20小时或12、24、36或48小时。

在一个实施方案中，本发明的结合HSA的免疫球蛋白可变重链结构域使分子(例如另一单可变重链结构域抗体)在人源化小鼠模型中的半衰期延长约18小时。例如，本发明的结合HAS的免疫球蛋白可变重链结构域使分子(例如另一单可变重链结构域抗体)在

HSA/FcRn人源化小鼠模型中的半衰期延长约18小时，如实施例中所述，其中通过静脉内(i.v.)施用提供结合HSA的免疫球蛋白可变重链结构域。

如实施例8所示，本发明的结合HSA的免疫球蛋白可变结构域还具有优异的储存稳定性。例如，本发明的结合HSA的免疫球蛋白可变结构域在4°下保持稳定14天。如实施例所示，其特别适合于延长V_H单结构域抗体的半衰期。

因此，本发明还涉及结合分子，其包含：包含SEQ ID NO.1或由SEQ ID NO.1组成的免疫球蛋白单可变结构域，以及与另一靶标结合的第二部分，例如包含结合HSA的免疫球蛋白可变结构域和另一部分或由结合HSA的免疫球蛋白可变结构域和另一部分组成的融合蛋白。在一个实施方案中，该部分是治疗性部分。结合分子可以是多肽、蛋白质或构建体。

在一个实施方案中，治疗部分是结合分子，例如选自抗体或抗体片段(例如，Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段(scFv)或单结构域抗体，例如V_H或V_HH结构域)或抗体模拟蛋白。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体可与包含C_H2和C_H3结构域中的一者或两者以及任选地铰链区的抗体Fc区或其片段连接。在一个实施方案中，至少第二部分是单结构域抗体，例如单V_H结构域抗体。

在一个实施方案中，包含如本文所述的与HSA结合的免疫球蛋白单可变结构域和第二部分的蛋白质或多肽是融合蛋白。在一个实施方案中，包含如本文所述的与HSA结合的免疫球蛋白单可变结构域和第二部分的蛋白质或多肽是药物缀合物。

如本文所用，“缀合物”是指包含与药物结合/缀合的如本文所述的结合血清白蛋白的单V_H结构域抗体的组合物。

这样的缀合物包括“药物缀合物”和“非共价药物缀合物”，“药物缀合物”包含与药物共价结合的血清白蛋白结合的抗体的抗原结合片段，“非共价药物缀合物”包含与药物非共价结合的血清白蛋白结合的抗体的抗原结合片段。

如本文所用，“药物缀合物”是指包含与药物共价结合的血清白蛋白结合的抗体的抗原结合片段的组合物。药物可以直接地或通过合适的接头部分间接地与抗原结合片段共价结合。药物可以在任何合适的位置，例如氨基末端、羧基末端或通过合适的氨基酸侧链与抗原结合片段结合。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域通过肽接头或连接两个部分的其他合适的接头与第二部分连接。

术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸的肽。肽接头包含1至50个，例如1至20个氨基酸。肽接头是本领域已知的，并且本文描述了非限制性实例。合适的非免疫原性接头肽是，例如包含G和/或S残基的接头(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为1至10之间的数字，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，肽例如选自GGGGS(SEQID NO:8)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:9)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:10)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQID NO:11)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:12)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:13)、GGSGSG(SEQ ID NO:14)和GGSG(SEQ ID NO:15)。

结合剂可以是多特异性的，例如双特异性的。在一个实施方案中，结合分子包含如本文所述的与HSA结合的第一V_H单结构域抗体(V_H(A))和与另一种抗原结合的第二V_H单结构域抗体(V_H(B))，并且因此具有下式：V_H(A)-L-V_H(B)。V_H(A)与V_H(B)缀合，即与V_H(B)连接，例如通过肽接头。L表示接头。

每个V_H包含CDR和FR区。因此，结合分子可以具有下式：FR1(A)-CDR1(A)-FR2(A)-CDR2(A)-FR3(A)-CDR3(A)-FR4(A)-L-FR1(B)-CDR1(B)-FR2(B)-CDR2(B)-FR3(B)-CDR3(B)-FR4(B)。

单V_H结构域A和B的顺序没有特别限制，使得在本发明的多肽内，单可变结构域A可以位于N端，并且单可变结构域B可以位于C端，反之亦然。

在一个实施方案中，结合分子是双特异性的。因此，一方面，本发明涉及一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的本文所述的单结构域抗体，所述第二功能部分与所述单结构域抗体具有不同的结合特异性。

在一个实施方案中，结合分子(例如蛋白质或构建体)是多特异性的，并且包含另外的即第三、第四、第五等部分。

在多特异性蛋白质的一个实施方案中，HSA结合V_H结构域位于蛋白质的C末端。

第二或另外的治疗部分可以选自与例如肿瘤抗原或免疫肿瘤靶标结合的部分，但是本领域技术人员知道本发明不限于此。

本发明还涉及如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域在延长治疗部分的半衰期中的用途，当根据权利要求中任一项的所述免疫球蛋白单可变结构域在融合蛋白中与所述治疗部分连接时，实现所述延长。

本发明还涉及如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域在延长治疗部分的半衰期中的用途，当根据权利要求中任一项的所述免疫球蛋白单可变结构域在融合蛋白中与所述治疗部分连接时，实现所述延长。例如，如本文所述，其可用于延长包含与CD137结合的sdAb和与PSMA结合的sdAb的蛋白质的半衰期。如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域，例如分子可以是V_H(A)-V_H(B)-V_H(C)、V_H(B)-V_H(A)-V_H(C)、V_H(C)-V_H(A)-VH(B)或V_H(C)-V_H(B)-V_H(A)的形式，其中A是与CD137结合的sdAb，B是与PSMA结合的sdAb，并且C是本文所述的免疫球蛋白单可变结构域(例如SEQ ID NO.1)。例如，分子包含SEQ ID NO.17或由SEQ ID NO.1组成。

因此，在本发明的融合蛋白中，治疗部分可以例如与肿瘤学靶标，例如免疫肿瘤学靶标结合。

在一个实施方案中，单可变重链结构域抗体获自或可获自表达包含未重排人V、D和J区的转基因的转基因啮齿动物，特别是产生人仅重链抗体的啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物不产生功能性内源轻链和重链。

通常，除非本文另外指出，否则本文提及的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、蛋白质和其他化合物和构建体将旨在用于预防或治疗人(和/或还任选地在温血动物并且特别是哺乳动物)中的疾病或紊乱。因此，通常，本文所述的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、蛋白质和其他化合物和构建体优选使得其可用作(生物)药物或其他药学或治疗活性化合物和/或药物产品或组合物，和/或可以合适地作为(生物)药物或其他药学或治疗活性化合物和/或药物产品或组合物的一部分。

因此，本发明还涉及药物组合物或制剂，其包含如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域多肽、蛋白质或构建体，例如包含如本文所述的HSA-结合单结构域的结合分子或融合蛋白。药物组合物可任选地包含药学上可接受的载体。免疫球蛋白单可变结构域多肽、蛋白质或构建体或药物组合物可以通过任何方便的途径施用，包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼、鼻内、肺、皮内、玻璃体内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、脑内、透皮、透粘膜、通过吸入或局部，特别是耳、鼻、眼、或皮肤或通过吸入。

肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。优选地，肠胃外施用所述组合物。

药学上可接受的载体或载剂(vehicle)可以是颗粒状的，使得该组合物为例如片剂或粉末形式。术语“载体”是指与本发明的药物抗体缀合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。这样的药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用于动物时，本发明的单结构域抗体或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当静脉内施用本发明的药物抗体缀合物时，水是优选的载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。

本发明的药物组合物可以是液体的形式，例如溶液、乳液或悬浮液。液体可用于通过注射、输注(例如，IV输注)或皮下递送。当旨在口服施用时，该组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文认为是固体或液体的形式中。

作为用于口服施用的固体组合物，可以将所述组合物配制成粉末、颗粒剂、压制片剂、丸剂、胶囊剂、咀嚼剂、圆片等形式。这样的固体组合物通常包含一种或多种惰性稀释剂。此外，可以存在以下一种或多种：粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，例如藻酸、藻酸钠、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂；和着色剂。当组合物为胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除上述类型的材料外，其还可以包含液体载体，例如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。

组合物可以是液体的形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。液体可用于口服施用或通过注射递送。当旨在口服施用时，组合物可包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于通过注射施用的组合物中，还可以包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

组合物可以采取一种或多种剂量单位的形式。在特定的实施方案中，可能期望将组合物局部施用于需要治疗的区域，或者通过静脉内注射或输注。

本发明进一步扩展到用于治疗疾病(例如癌症)的方法，其包括施用本文所述的药物组合物或制剂或包含本文所述的HSA-结合单结构域的结合分子或融合蛋白。还设想了本文所述的药物组合物或制剂或包含本文所述的HSA-结合单结构域的结合分子或融合蛋白，其用于治疗疾病；例如用于治疗癌症。还设想了本文所述的药物组合物或制剂或包含本文所述的HSA-结合单结构域的结合分子或融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在治疗特定紊乱或病症中有效/活性的治疗剂的量将取决于紊乱或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，可任选地采用体外或体内测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或紊乱的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。应考虑诸如年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病严重性等因素。

通常，该量为按组合物的重量计至少约0.01％的本发明的单结构域抗体。当旨在口服施用时，该量可以在按组合物的重量计约0.1％至约80％的范围内变化。优选的口服组合物可以包含按组合物的重量计约4％至约50％的本发明的单结构域抗体。

制备本发明的优选组合物，使得肠胃外剂量单位包含按重量计约0.01％至约2％的本发明的单结构域抗体。

对于注射施用，该组合物可以占约通常受试者体重的约0.1mg/kg至约250mg/kg，优选动物体重的约0.1mg/kg至约20mg/kg，并且更优选动物体重的约1mg/kg至约10mg/kg。在一个实施方案中，组合物以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg、或约3mg/kg的剂量施用。给药方案可以从例如每周一次到每2、3或4周一次变化。

如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指抑制或缓解疾病或紊乱。例如，治疗可以包括推迟与疾病或紊乱有关的症状的发展，和/或降低与所述疾病一起或预期将与所述疾病一起发展的此类症状的严重性。这些术语包括改善现有症状，预防其他症状以及改善或预防此类症状的背后原因。因此，该术语表示对进行治疗的至少一些哺乳动物(例如人类患者)给予有益的结果。许多药物治疗对进行治疗的一些(但并非全部)患者有效。

术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅作为实例，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物、鼠、牛、马、犬、绵羊或猫科动物。

本发明的分子或药物组合物可以作为单独的活性成分或与一种或多种其他治疗剂组合施用。治疗剂是可用于治疗疾病的化合物或分子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料和放射性同位素。

本发明还涉及用于延长蛋白质的半衰期的方法，其包括将所述蛋白质与如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域连接。

本发明还涉及编码本文所述的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸是SEQ ID NO.16或与SEQ ID NO.16具有至少75％、80％或90％序列同源性的核酸。在一个实施方案中，所述核酸序列通过接头连接至第二核酸序列。在一个实施方案中，所述第二核酸编码治疗部分。在一个实施方案中，所述接头是核酸接头。示例性核酸如下所示。然而，技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，可以设想其他序列。

本发明还涉及包含如本文所述核酸序列的载体。

本发明还涉及包含如本文所述核酸序列或如本文所述载体的宿主细胞。

本发明还涉及试剂盒，其包含如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域或药物组合物，如本文所述的蛋白质或构建体或如本文所述的药物组合物以及任选的使用说明书。

本文所述的单结构域抗体可获自转基因哺乳动物，例如啮齿动物，其在用HSA抗原刺激后表达仅重链抗体。转基因啮齿动物(例如小鼠)优选具有降低的表达内源抗体基因的能力。因此，在一个实施方案中，啮齿动物具有降低的表达内源轻链和/或重链抗体基因的能力。因此，啮齿动物可包含修饰以破坏内源κ和λ轻链和/或重链抗体基因的表达，从而不产生功能性轻链和/或重链，例如如下文进一步解释的。

还公开了一种用于产生能够结合HSA的人仅重链抗体的方法，所述方法包括

a)用HSA抗原免疫转基因啮齿动物，例如小鼠，其中所述啮齿动物表达包含未重排人重链V基因的核酸构建体，并且不能产生功能性内源轻链或重链，

b)分离人仅重链抗体。

进一步的步骤可以包括从所述仅重链抗体分离V_H结构域，例如通过从所述啮齿动物(例如小鼠)产生包含V_H结构域序列的序列文库以及从所述文库分离包含V_H结构域序列的序列。

还公开了一种用于产生能够结合人HSA的单V_H结构域抗体的方法，所述方法包括

a)用HSA抗原免疫转基因啮齿动物，例如小鼠，其中所述啮齿动物表达包含未重排人重链V基因的核酸构建体，并且不能产生功能性内源轻链或重链，

b)从所述啮齿动物(例如小鼠)产生包含V_H结构域序列的序列文库，以及

c)从所述文库分离包含V_H结构域序列的序列。

进一步的步骤可以包括鉴定与HSA结合的单V_H结构域抗体或仅重链抗体，例如通过使用如实施例中所示的功能测定。

用于使用体外表达文库制备或产生本文所述的多肽、核酸、宿主细胞、产物和组合物的方法，可包括以下步骤：

a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的集、集合或文库；以及

b)筛选所述集、集合或文库的可以与HSA结合/对HSA具有亲和力的氨基酸序列，以及

c)分离可以与HSA结合或对HSA具有亲和力的氨基酸序列。

在上述方法中，可以在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(例如酵母)上展示氨基酸序列的集、集合或文库，以便于筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的集、集合或文库)的合适方法、技术和宿主生物对于本领域技术人员将是清楚的(参见例如PhageDisplay of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press；第一版(1996年10月28日)Brian K.Kay,Jill Winter,John McCafferty)。通过分离表达抗原特异性仅重链抗体的细胞或组织，从来源于分离的细胞或组织的mRNA克隆编码VH结构的序列，以及使用文库展示编码的蛋白质，来产生文库，例如噬菌体文库。可以在细菌、真菌或其他表达系统中表达VH结构域。

另一方面还涉及分离的V_H单结构域抗体或分离的仅重链抗体，其包含与HSA结合的V_H结构域，其包含人V_H种系序列的氨基酸产物或衍生自人V_H种系序列的氨基酸产物。仅重链抗体可以是完全人的或包含小鼠序列。

在本文的各个方面和实施方案中，术语啮齿动物可以涉及小鼠或大鼠。在一个实施方案中，所述啮齿动物是小鼠。小鼠可以包含非功能性内源λ轻链基因座。因此，小鼠不能产生功能性内源λ轻链。在一个实施方案中，λ轻链基因座部分或全部缺失，或通过插入、倒置、重组事件、基因编辑或基因沉默而失去功能。例如，至少恒定区基因C1、C2和C3可以缺失或通过如上所述的插入或其他修饰而失去功能。在一个实施方案中，基因座在功能上是沉默的，因此小鼠不产生功能性λ轻链。

此外，小鼠可以包含非功能性内源κ轻链基因座。因此，小鼠不能产生功能性内源κ轻链。在一个实施方案中，κ轻链基因座部分或全部缺失，或通过插入、倒置、重组事件、基因编辑或基因沉默而失去功能。在一个实施方案中，该基因座在功能上是沉默的，因此小鼠不产生功能性κ轻链。

具有功能沉默的内源λ和κL-链基因座的小鼠可以例如如WO 2003/000737中公开的产生，其通过引用整体并入本文。

此外，小鼠可以包含非功能性内源重链基因座，例如如WO 2004/076618(通过引用整体并入本文)中所述。因此，小鼠不能产生功能性的内源重链。在一个实施方案中，重链基因座部分或全部缺失，或通过插入、倒置、重组事件、基因编辑或基因沉默而失去功能。在一个实施方案中，基因座在功能上是沉默的，因此小鼠不产生功能性重链。

在一个实施方案中，小鼠包含非功能性内源重链基因座、非功能性内源λ轻链基因座和非功能性内源κ轻链基因座。因此，小鼠不产生任何功能性内源轻链或重链。因此，该小鼠是三重敲除(TKO)小鼠。

转基因小鼠可以包含用于表达异源、优选人重链基因座的载体，例如酵母人工染色体(YAC)。YAC是可用于在酵母中克隆非常大的DNA插入片段的载体。除了包含类似于天然酵母染色体的行为所必需的所有三个顺式作用结构元件(自主复制序列(ARS)、着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))以外，其接受大DNA插入片段的能力还使其能够达到染色体样稳定性和在酵母细胞中传播保真度所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用在本领域中是公知的(例如，Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.Yeast Artificial Chromosomes,Encyclopediaof Life Sciences,2002Macmillan Publishers Ltd,Nature Publishing Group)。

例如，YAC可包含与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调节区组合的过多的未重排人VH、D和J基因。人VH、D和J基因是人VH、D和J基因座，并且它们是完全人的未重排基因。YAC可以如WO2016/062990中所述。

本领域已知的替代方法可用于缺失或失活内源小鼠或大鼠免疫球蛋白基因，并引入与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调节区组合的人V、D和J基因。

可以根据如实施例中所示的标准技术来产生转基因小鼠。用于产生转基因小鼠的两种最典型途径是通过将遗传物质原核显微注射到新鲜受精的卵母细胞中，或通过将稳定转染的胚胎干细胞引入桑椹胚或胚泡期胚胎中。无论如何引入遗传材料，被操纵的胚胎都转移到假孕雌性接受者体内，在那里继续妊娠并生出候选的转基因幼崽。

这些广泛方法之间的主要区别在于，在用于产生转基因动物之前可以对ES克隆进行广泛筛选。相比之下，原核显微注射依赖于遗传物质在引入后整合到宿主基因组中，并且一般来说，只有在幼崽出生后才能确定转基因的成功整合。

有许多本领域已知的方法来辅助并确定是否成功地整合了转基因。转基因动物可以通过多种方式产生，包括将构建体随机整合到基因组中、位点特异性整合或同源重组。有多种工具和技术可用于驱动和选择转基因整合以及随后的修饰，包括使用药物抗性标记(阳性选择)、重组酶、重组介导的盒交换、阴性选择技术和核酸酶来改善重组效率。这些方法中的大多数通常用于ES细胞的修饰。然而，一些技术可能具有增强通过原核注射介导的转基因的效用。

可以使用进一步的改进以在所需背景内更有效地产生转基因品系。如上所述，在优选的实施方案中，使内源小鼠免疫球蛋白表达沉默以允许仅将引入的转基因用于表达可用于药物发现的仅重链库。如上所述，可以使用遗传操纵的小鼠，例如使所有内源免疫球蛋白基因座(小鼠重链、小鼠κ链和小鼠λ链)沉默的TKO小鼠。可以通过常规或通过包括IVF步骤的育种来实现将任何引入的转基因转移到该TKO背景中，以有效地缩放该过程。然而，也可以在转基因程序中包括TKO背景。例如，对于显微注射，卵母细胞可以源自TKO供体。类似地，可将来自TKO胚胎的ES细胞用于转基因。

引入转基因以表达免疫球蛋白基因座的三重敲除小鼠在本文中称为TKO/Tg。

在一个实施方案中，小鼠如WO2016/062990中所述。本发明还涉及表达人重链基因座并已用HSA抗原免疫的啮齿动物，优选小鼠。本发明还涉及表达包含与人HSA结合的人VH结构域的仅重链抗体的如上所述的啮齿动物，优选小鼠。优选地，所述啮齿动物不能产生功能性内源κ和λ轻链和/或重链。人重链基因座位于可以如上所述的转基因上。

本发明还涉及包含人V_H结构域的抗人HSA单V_H结构域抗体或抗人HSA仅重链抗体，其获自或可获自用人HSA抗原免疫并表达人重链基因座的啮齿动物，优选小鼠。优选地，所述啮齿动物不能产生功能性内源κ和λ轻链和/或重链。人重链基因座位于可以如上所述的转基因上。

除非本文另外定义，否则与本申请结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。尽管前述公开提供了对涵盖在本发明的范围内的主题的一般描述，包括制造和使用本发明的方法及其最佳模式，但是提供了以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实践本发明。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应理解为对本发明的限制，本发明的范围应从所附权利要求及其所附于本发明的等同物中理解。鉴于本发明，本发明的各种另外的方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。

本说明书中提及的所有文件均通过引用全文并入本文，包括对基因登录号的引用、科学出版物和对专利出版物的引用。

本文所用的“和/或”应被视为具有或不具有彼此的两个指定特征或组件中的每一个的特定公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一种情况的具体公开，就如同它们在本文中分别列出一样。除非上下文另外指示，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且等同地适用于所描述的所有方面和实施方案。

在以下非限制性实施例中进一步说明本发明。

实施例

实施例1.Tg/TKO小鼠的构建

如先前所述(WO2004/076618和WO2003/000737,Ren等人.Genomics,84,686,2004；Zou等人,J.Immunol.,170,1354,2003)产生了小鼠，所述小鼠携带在内源重链和轻链抗体表达沉默(三重敲除或TKO)的背景内的种系构型的重链抗体转基因基因座。简单地说，如WO2016/062990中所述，在用包含与缺少CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调节区组合的过多的人V_H、D和J基因的酵母人工染色体(YAC)对新鲜受精的卵母细胞进行原核显微注射后产生了转基因小鼠。酵母人工染色体(YAC)是可用于在酵母中克隆非常大的DNA插入片段的载体。除了包含类似于天然酵母染色体行为所必需的所有三个顺式作用结构元件(例如天然酵母自主复制序列(ARS)、着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))以外，其接受大DNA插入片段的能力还使其能够达到染色体样稳定性和在酵母细胞中的传播保真度所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用是本领域公知的(例如Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.Yeast Artificial Chromosomes,ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES2002Macmillan Publishers Ltd,Nature Publishing Group/www.els.net)。

实施例2.免疫抗原

免疫使用重组纯化的蛋白质。重组人HSA蛋白购自Sigma(目录号A9731)。

实施例3.免疫方案

三只8至12周龄的Crescendo小鼠分别接受在完全弗氏佐剂中乳化并皮下递送的10μg HAS的初次免疫，并且在初次免疫后，以每周间隔也是皮下施用在不完全弗氏佐剂中乳化的10μg HAS的三次加强。HAS的最后剂量在无佐剂的情况下在磷酸盐缓冲盐水中覆膜内施用。初次免疫后28天，杀死小鼠，将肱和腹股沟淋巴结和脾脏收集到RNAiater(Qiagen目录号76104)中。收集血清并储存以用于测试反应。

实施例4.血清ELISA

将Nunc Maxisorp板在4℃下用在PBS溶液中的5μg/ml的HSA包被过夜。然后将板用补充有0.05％吐温20的PBS洗涤，然后用不添加吐温的PBS洗涤，并在室温下用在PBS中的3％脱脂奶粉(Marvel)的溶液封闭至少一小时。在聚丙烯试管或板中制备在3％Marvel/PBS中的血清稀释液，并在室温下孵育至少一小时，然后转移至封闭的ELISA板中，再进行至少一小时的孵育。在PBS/吐温和PBS中洗涤后，然后添加以1:10000稀释度在PBS/3％Marvel中制备的生物素缀合的山羊抗小鼠IgG，Fcγ亚类1特异性抗体(Jackson 1 15-065-205)的溶液并将板在室温下孵育至少一小时，然后用PBS/吐温和PBS洗涤。将在3％Marvel/PBS中以1:1000稀释的中性抗生物素蛋白-HRP溶液(Pierce 31030)添加到ELISA板中，并孵育至少30分钟。进一步洗涤后，使用TMB底物(Sigma目录号T0440)进行ELISA，并在10分钟后通过添加0.5M H₂SO₄溶液终止反应。通过在450nm下读数确定吸光度。在所有小鼠中均观察到阳性反应。

实施例5.从免疫小鼠产生文库

a.处理组织、RNA提取和cDNA制备

从每只免疫动物中将脾脏、腹股沟和肱淋巴结收集到RNAIater中。对于每只动物，分别处理了1/3的脾脏和4个淋巴结。首先，将组织均质化；然后将组织转移到裂解基质D珠管(MP Bio目录号116913100)中后，添加600ul含β-巯基乙醇的RLT缓冲液(来自QiagenRNeasy试剂盒目录号74104)，然后在MP Bio Fastprep均质器(目录号116004500)中使用6m/s 40秒的周期进行均质化。将装有均质组织的试管转移至冰中，并通过在以10g微量离心5分钟，沉淀出碎片。取出400ul上清液并用于RT-PCR。

首先，按照制造商的方案，使用Qiagen RNeasy试剂盒目录号74104提取RNA。然后使用Superscript III RT-PCR高保真试剂盒(Invitrogen目录号12574-035)将每个RNA样品用于制备cDNA。对于每个脾脏和LN RNA样品，进行5次RT-PCR反应，每次反应使用与V_H家族引物组合的VH_J/F(长)引物。对于每只小鼠，使用标准方案从脾脏和淋巴结的混合物中扩增V_H产物。

b.克隆到噬菌粒载体中

在这些研究中使用了噬菌粒载体pUCG3。如所指出的，可以使用本领域广泛使用的常规方法(例如用NcoI和XhoI的限制性内切酶消化、连接和转化)将V_H克隆到pUCG3中。在这里，如下所述，使用了替代的基于PCR的方法来构建V_H噬菌粒文库：

纯化的V_H RT-PCR产物用作利用载体pUCG3的大引物，以提供用于转化和文库创建的噬菌粒产物。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分析。

将V_H/噬菌粒PCR产物通过起源动物(animal-of-origin)汇集，并使用FermentasPCR纯化试剂盒(目录号K0702)根据制造商的说明进行纯化。使用Bio-Rad GenePulserXcell通过电穿孔将洗脱的DNA用于转化TG1大肠杆菌(Lucigen，目录号60502-2)。将电穿孔的细胞汇集。将转化物的10倍稀释系列铺板在含2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xTY琼脂培养皿中。这些培养皿上产生的菌落用于估计文库大小。将其余转化物铺板在补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的大幅面2xTY琼脂生物测定皿中。将所有琼脂板在30℃下孵育过夜。通过将10ml的2xTY肉汤添加到大幅面生物测定皿中来收获文库。轻轻刮擦细菌菌落并记录OD600。将等分试样在添加等体积的50％(v/v)甘油溶液后在-80℃下保存在冷冻管中，或直接用于噬菌体选择过程。

实施例6.用于分离HSA-结合的V_H的选择策略

根据公开的方法(Antibody Engineering,Benny Lo编辑,第8章,第161-176页,2004)进行文库噬菌体储备液的制备和噬菌体展示选择。在大多数情况下，与淘选方法结合的噬菌体展示可用于分离结合V_H结构域。然而，在本领域中充分描述了多种不同的选择方法，包括可溶性选择，在胁迫(例如，热)下进行的选择，以及竞争性选择，其中添加过量的抗原或抗原反应性V_H结构域作为竞争，以促进高亲和力V_H结构域的恢复或使选择偏离特定表位。对于来自HSA免疫小鼠的文库，在HSA上进行了一轮淘选或可溶性选择。

实施例7.靶结合的测定

在以下一种或多种测定中筛选了来自不同选择的VH，以鉴定VH与HSA的结合。

a)以粗制细菌周质制备物结合ELISA

选择文库后，使用细菌宿主表达的V_H结构域的粗提物通过ELISA鉴定HSA特异性V_H抗体。从在深孔板中生长的1ml培养物中制备小规模细菌周质提取物。起子培养物用于在37℃以250rpm的摇动下接种含有2XTY肉汤(Melford，M2130)并补充有0.1％(w/v)葡萄糖+100ug/ml氨苄青霉素的96孔深孔板(Fisher,cat#MPA-600-030X)。当OD600达到0.6-1时，通过添加补充有IPTG(终浓度1mM)和氨苄青霉素的100ul 2XTY来诱导V_H产生，并且使培养物在30℃下以250rpm摇动生长过夜。通过以3200rpm离心10分钟来沉淀大肠杆菌，并弃去上清液。通过轻轻移液将细胞沉淀重悬于150ul冰冷的提取缓冲液(20％(w/v)蔗糖、1mM EDTA和50mM Tris-HCl pH8.0)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃下以4500rpm离心15分钟。将上清液转移到聚丙烯板上，并在1x PBST封闭液中孵育后直接用于ELISA。

通过添加pH9.6的碳酸钠缓冲液中1ug/ml的50ul体积并在4℃孵育过夜，将HSA固定在maxisorb板(Nunc 443404)上。包被后，抽吸抗原溶液，并将板用补充有0.05％吐温20(sigma P1379)的PBS(由Oxoid目录号BR0014G的PBS片剂制备)洗涤，然后用不添加吐温的PBS洗涤。为了阻断非特异性蛋白质相互作用，将PBST加入孔中，并将板在室温下孵育至少一小时。在聚丙烯试管或板中制备周质提取物在1x PBST中的稀释液(终浓度)，并在室温下孵育至少一小时，然后转移至封闭的ELISA板中，再进行至少一小时的孵育。然后，先后用PBS/吐温和PBS重复洗涤来洗去未结合的蛋白质。然后将在PBST中以1:1000的稀释度制备的HRP缀合的抗His Ab(Miltenyi Biotec,130-092-785)溶液添加至每个孔中，并在室温下进一步孵育至少一小时。通过使用PBS/吐温和PBS重复洗涤来去除未结合的检测抗体。然后使用TMB底物(Sigma目录号T0440)进行ELISA，并在10-30分钟后通过添加0.5M H₂SO₄溶液(Sigma目录号320501)终止反应。通过在450nm下读数确定吸光度。

b)以纯化的V结构域结合ELISA

通过使用V_H C末端6xHIS标签对周质提取物进行镍-琼脂糖亲和色谱纯化，得到纯化的V_H。使每种V_H的起子培养物在补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2XTY培养基(2XTY肉汤(Melford目录号M2103)中在30℃下以250rpm摇动生长过夜。然后将该过夜培养物用于接种50ml-200ml 2XTY培养基，并在37℃下以250rpm摇动孵育约6-8小时(直到OD₆₀₀＝0.6-1.0)。将培养物以3200rpm离心10分钟，并将细胞沉淀重悬于含有100μg/ml氨苄青霉素/1mM IPTG的新鲜2XTY肉汤中。将摇瓶在30℃和250rpm下孵育过夜。将培养物再次以3200rpm离心10分钟，并弃去上清液。通过轻轻移液将细胞沉淀重悬于冰冷的提取缓冲液(20％(w/v)蔗糖、1mM EDTA、50mM Tris-HCl pH 8.0或50mM MOPS)中，然后用1:5稀释的冰冷的提取缓冲液进一步稀释。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃下以4500rpm离心15分钟。将上清液转移至装有10mM咪唑(Sigma目录号I2399)和预先平衡的镍琼脂糖珠(Qiagen,Ni-NTA 50％溶液,目录号30210)的管中。在轻轻摇动下，于4℃使V_H结合进行2小时。将珠转移到polyprep柱(BioRad目录号731-1550)上，并通过重力流弃去上清液。柱用PBS/0.05％

洗涤3次，然后用5ml PBS/20mM咪唑洗涤3次。用PBS/250mM咪唑从柱上洗脱V_H。通过与NAP-5柱(GE Healthcare，17-0853-01)进行缓冲液交换并用PBS洗脱，从纯化的V_H制备物中除去咪唑。用分光光度法估算纯化的V_H的收率，并使用SDS PAGE评估纯度。

或者，从具有pJExpress载体的W3110大肠杆菌的上清液中纯化V_H。对于该程序，将至多1L培养物在TB培养基中于37℃以250rpm摇动生长过夜，然后用1mM IPTG诱导过夜。收获所得的上清液，并使用Ni-Sepharose excel树脂(GE Healthcare目录号17-3712-03)进行V_H纯化，随后在AKTA Pure系统上使用HiLoad 26/600Superdrex 75pg柱进行尺寸排阻色谱。

或者，使用Capture Select C-tag XL亲和基质(Thermo Fisher目录号2943072010)从上清液中纯化出V_H，然后使用AKTA Pure系统上的HiLoad 26/600Superdrex75pg柱进行尺寸排阻色谱。用分光光度法估算纯化的V_H的收率，并使用SDS PAGE评估纯度。

然后如上所述进行ELISA，不同之处在于将纯化的VH在PBST中以已知浓度滴定到ELISA中，并测试与HSA和CSA二者的结合(食蟹猴血清白蛋白，Equitech-Bio股份有限公司，目录：CMSA62)，两者在pH 9.6的碳酸钠缓冲液中以1ug/ml包被。发现纯化的VH与HSA和CSA结合。

c)结合动力学

使用FortéBio OCTET RED384仪器进行与人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白的结合研究。使用胺试剂偶联试剂盒(第2代，FortéBio)通过胺偶联将血清白蛋白(HAS、CSA、MSA)偶联至AR2G生物传感器。简单来说，将AR2G生物传感器在水中再水化，然后使用EDC/sNHS试剂活化10分钟。将活化的生物传感器浸入含有稀释的血清白蛋白(HAS、CSA、MSA)的孔中10分钟，所述血清白蛋白(HAS、CSA、MSA)在10mM乙酸钠(pH 5.0)中稀释至10ug/ml，然后使用1M乙醇胺pH 8.5对游离的活性位点淬灭10分钟。然后将其浸入10mM甘氨酸pH 2.5中以稳定表面。然后将负载有HSA和CSA的生物传感器浸入1x测定缓冲液(PBS/吐温-20 0.05％)中120秒钟以建立基线，然后浸入含有预定浓度的

V_H的孔中(7个点的2倍稀释系列，最高浓度为50nM(对于HSA)或1500nM(MSA、CSA)用于实验，以允许与血清白蛋白的结合进行120秒。然后将生物传感器转移到含有测定缓冲液的孔中，以允许

V_H从血清白蛋白解离300秒。使用1:1结合模型对结合相互作用的动力学和亲和力进行建模，并使用FortéBio Analysis Software 8.1或更高版本进行计算。

从分析中排除了异常或拟合不良的曲线。

表2a：

V_H对血清白蛋白的计算的动力学常数和K_D的平均值

表2b：

V_H对血清白蛋白的计算的动力学常数和K_D的平均值

实施例8-V_H单结构域抗体表现出良好的稳定性

对纯化的V_H进行尺寸排阻色谱法。简单来说，将纯化的V_H以PBS缓冲液中2mg/ml的浓度在4℃或40℃下储存0-14天，然后使用包含PDA检测器的Waters H-Class Bio UPLC在不同的时间点进行分析(在280nm检测)，并在Waters ACQUITY BEH

SEC柱上进行分离。样品以10ml的体积注入，并以0.4ml/min的流速在含有200mM NaCl、100mM磷酸钠pH 7.4+5％丙-1-醇的流动相中运行。收集6分钟的数据，并计算储存后样品中的单体蛋白的百分比。

在4℃孵育14天后，未见明显变化。在40℃下孵育后，观察到单体百分比略有下降。显示了以下结果(

1(SEQ ID NO.1))。

表3：V_H单结构域抗体(

1(SEQ ID NO.1))的稳定性。显示了在0、1、3、7和14天后存在的单体的百分比。

实施例9在双转基因人源化FcRn/HSA小鼠中半衰期延长分子的单次静脉内剂量的药代动力学分析

使用

的人新生儿Fc受体/人白蛋白小鼠模型进行实验。这种双重人源化的新生儿Fc受体(FcRn)/白蛋白小鼠模型维持了自体受体-配体的相互作用并模拟了人体中的生理药物清除，因此代表了一种独特且可靠的工具来测量和优化与白蛋白相关的小分子和常规药物的药代动力学以及研究和预测循环生物制品和生物仿制药的半衰期(ViuffD,Antunes F,Evans L,Cameron J,Dyrnesli H,Thue Ravn B,Stougaard M,Thiam K,Andersen B,

S,Howard KA.2016.Generation of a double transgenichumanized neonatal Fc receptor(FcRn)/albumin mouse to study thepharmacokinetics of albumin-linked drugs.J Control Release)。

与WT小鼠相比，hFcRn/HSA人源化小鼠提供了更可预测的“类人”药代动力学结果。该模型非常适合于体内评估HSA结合药物的药代动力学、分布和毒性。

在这些实验中使用了包括

1(SEQ ID NO.1)的三特异性分子(SEQ IDNO.17)来测试药代动力学。该三价构建体包含以HSA结合的SEQ ID NO.1分别与CD137和前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合的两个VH结构域，所述HSA结合的SEQ ID NO.1位于构建体C末端(其中三个VH通过G4S接头连接)。

简单来说，通过尾静脉以2mg/kg向雄性

人HSA/FcRn Tg小鼠单次静脉注射给药(n＝3)。在给药前以及通过隐静脉的药物施用后的0.083h、1h、8h、24h、48h、72h和96h收集血液样品。给药后168小时，对所有动物实施安乐死并收集血液。分离血浆并储存在-80℃直到进行测定。在Gyrolab免疫测定平台上分析血浆样品，使用生物素化的人PSMA作为捕获物，并使用人CD137Dylight650作为检测物。使用Gyros分析数据以获得血浆中的浓度。数据的药代动力学分析是使用PK Solver 2.0(Excel附加软件)完成的。

研究结果表明，当在人HSA/FcRn Tg小鼠中以2mg/kg静脉内给药时，分子的半衰期为18.13±0.412小时(n＝3)。不具有SEQ ID NO.1的对照被迅速清除，并且1小时后在血浆中无法检测到。

表4：pK参数汇总表

表4：pK参数汇总表实施例

1的结合位点的确定

使用FortéBio OCTET RED384仪器研究

1V_H与HAS结构域I、II和III之间的相互作用。HAS结构域购自Albumin Bioscience。简单来说，将AR2G生物传感器在水中再水化，然后使用EDC/sNHS试剂活化10分钟。将活化的生物传感器浸入含有在10mM乙酸钠pH 5.0中稀释至50ug/ml的HAS结构域的孔中5分钟，然后使用1M乙醇胺pH 8.5将游离的活性位点淬灭10分钟。然后将其浸入10mM甘氨酸pH2.5中以稳定表面。然后将负载有HSA的域生物传感器浸入1x测定缓冲液(PBS/吐温-20 0.05％)中120秒钟，以建立基线，然后浸入含有预定浓度为300nM的

1V_H的孔中，从而允许与HSA的结合120秒。然后将生物传感器转移到含有测定缓冲液的孔中，以使

1V_H与HAS结构域解离300秒。

1结合HSA的结构域III，但不结合结构域I和II。

表5.

1(SEQ ID NO.1)和对照与HAS结构域的结合

以上实验中使用的序列

SEQ ID NO.17

蛋白质

编码SEQ ID No.18的蛋白质的核酸

SEQ ID NO.19

SEQ ID NO.20

序列表

<110> 克雷森多生物制剂有限公司

<120> 结合人血清白蛋白的单结构域抗体

<130> P35198WO1

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His His Tyr Ala

20 25 30

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

35 40 45

Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly Ala Pro Thr Phe Glu His Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

His Tyr Ala Met His

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly Ala Pro Thr Phe Glu His

1 5 10

<210> 5

<211> 609

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Gly Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Gly Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Cys Leu Ser Val Phe

465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Gly Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Leu

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> C 末端序列 VH

<400> 6

Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> His-标签

<400> 7

His His His His His His

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 10

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 12

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 13

Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 14

Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 15

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 16

<211> 750

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

ggctttgtga gcggatacaa ttataatatg tggaattgtg agcgctcaca attccacaac 60

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac ttttaggagg taaaacatat gaagaaaacg 120

gcaatcgcaa tcgcagtcgc tctggcgggt ttcgcaactg tagcgcaagc cgaggtgcaa 180

ctggtcgagt ctggtggtgg tttggtgcaa cctggtagaa gcttgcgttt gagttgtgcc 240

gcttccggct tcactttcca tcattatgct atgcactggg ttcgtcaagc tcccggaaaa 300

ggtttggagt gggtttccgg aatttcctgg aatggcaata agattacgta cgctgattca 360

gtgaaaggaa ggtttacaat cagtagagat aatgctaaaa actcattgta tctacaaatg 420

aacagcctaa gagcagaaga taccgctctg tactactgtg ttagagatag ctcgttattc 480

attgtaggtg caccaacttt tgaacattgg ggtcggggta ctcttgtgac tgtctcatcc 540

gcggccgcac accaccatca tcaccactaa ctcgagcgcc taatgaaagc ttccccaagg 600

gcgacacccc ctaattagcc cgggcgaaag gcccagtctt tcgactgagc ctttcgtttt 660

atttgatgcc tggcagttcc ctactctcgc atggggagtc cccacactac catcggcgct 720

acggcgtttc acttctgagt tcggcatgga 750

<210> 17

<211> 453

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Pro Ala Trp Gly Leu Arg Leu Gly Glu Ser Ser Ser Tyr

100 105 110

Asp Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

145 150 155 160

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

165 170 175

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Trp Met Asn

180 185 190

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile

195 200 205

Asn Gln Asp Gly Ser Glu Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg

210 215 220

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met

225 230 235 240

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly

245 250 255

Gly Glu Gly Tyr Gly Val Asp His Tyr Gly Leu Asp Val Ser Gly Gln

260 265 270

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

305 310 315 320

Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

325 330 335

Phe Thr Phe His His Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

340 345 350

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile

355 360 365

Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

370 375 380

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

385 390 395 400

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly

405 410 415

Ala Pro Thr Phe Glu His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

420 425 430

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser

450

<210> 18

<211> 1359

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt ggctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtggcatat atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagatccg 300

gcctggggat tacgtttggg ggagtcatcg tcctatgatt ttgatatctg gggccaaggg 360

acaatggtca ccgtctcctc aggtggtggc ggttcaggcg gaggtggctc tggaggtgga 420

ggttcaggag gtggtggttc tggcggcggt ggatcgggtg gaggtggtag tgaggtgcag 480

ttagttgaga gcggaggtgg tttagttcag ccggggggct cgcttcgcct gtcgtgcgcc 540

gcctcgggat tcacattatc aaactactgg atgaattggg tccgccaggc tccgggcaaa 600

ggtcttgagt gggtggcgaa cattaatcag gacgggagcg agcgttatta cgttgattcg 660

gtaaaaggac gtttcactat cagtcgtgac aacgctaaaa attccttgta cttacagatg 720

aactcacttc gtgctgagga caccgcagtg tactactgtg ctcgcggtgg tgaaggatac 780

ggcgtcgatc actacggcct tgatgtatca ggacagggga ctacagttac cgtctcttcc 840

ggcggaggtg gctctggagg aggcggatcg gggggtggag gaagtggcgg cggtggtagt 900

ggaggaggtg gttctggagg cggtggctct gaagtacaac tggttgaatc gggtggtgga 960

ttggtccaac ctggaagatc attgaggctt tcttgtgcag cttccggatt cacctttcat 1020

cactatgcta tgcactgggt gagacaagcc cctggtaagg gcttggaatg ggtgtccgga 1080

atctcctgga atggtaacaa aataacatat gcagattccg ttaagggtag atttactatt 1140

agccgtgata atgcaaaaaa cagtttatac ttgcagatga attccttgag ggctgaggat 1200

acagctcttt actattgtgt gcgtgactca tcgttgttca ttgtcggagc cccaactttc 1260

gaacattggg gtagaggtac cctagttacg gttagctcag gcggaggtgg ctctggagga 1320

ggcggatcgg ggggtggagg aagtggcggc ggtggtagt 1359

<210> 19

<211> 123

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe His His Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly Ala Pro Thr Phe Asp His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 123

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe His His Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Asp Ser Ser Leu Phe Ile Val Gly Ala Pro Thr Phe Asp His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims (24)

1.一种结合人血清白蛋白(HSA)的免疫球蛋白人单可变重链结构域，其包含SEQ IDNO.1或与SEQ ID NO.1具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性的序列，或由SEQ IDNO.1或与SEQ ID NO.1具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性的序列组成。

2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白单可变结构域，其包含

a)具有SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有1或2个差异的氨基酸序列的CDR1，

b)具有SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有1、2、3、4、5、6个差异的氨基酸序列的CDR2，以及

c)具有SEQ ID NO.4或与SEQ ID NO.4具有1、2、3或4个差异的氨基酸序列的CDR3。

3.根据权利要求1所述的免疫球蛋白单可变结构域，其具有SEQ ID NO.19或20或与SEQID NO.19或20具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性的序列。

4.一种蛋白质或构建体，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域和结合不同靶标的至少第二部分。

5.根据权利要求4所述的蛋白质或构建体，其包含治疗部分。

6.根据权利要求5所述的蛋白质或构建体，其中所述治疗部分是抗体或其片段。

7.根据权利要求6所述的蛋白质或构建体，其中所述片段是scFv、Fv、重链或单结构域抗体，例如单可变重链结构域。

8.根据权利要求7所述的蛋白质或构建体，其中所述单结构域抗体是单可变重链结构域抗体。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的蛋白质或构建体，其中所述免疫球蛋白单可变结构域通过肽接头与所述治疗部分连接。

10.根据权利要求9所述的蛋白质或构建体，其中所述肽接头是(G4S)n，其中n为1至15。

11.根据权利要求4至10中任一项所述的蛋白质或构建体，其中所述免疫球蛋白单可变结构域位于所述蛋白质的N或C末端。

12.根据权利要求11所述的蛋白质或构建体，其中所述免疫球蛋白单可变结构域位于所述蛋白质的C末端，并且包含1至50个氨基酸的C末端延伸。

13.一种用于延长蛋白质的半衰期的方法，其包括将所述蛋白质与根据权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域连接。

14.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域在延长治疗部分的半衰期中的用途，当根据权利要求中任一项的所述免疫球蛋白单可变结构域在融合蛋白中与所述治疗部分连接时，实现所述延长。

15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求4至12中任一项所述的蛋白质或构建体。

16.一种核酸序列，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的氨基酸序列。

17.根据权利要求16所述的核酸序列，其包含SEQ ID NO.16。

18.权利要求16或17所述的核酸序列，其中所述核酸序列通过接头与第二核酸序列连接。

19.权利要求18所述的核酸序列，其中所述第二核酸编码治疗部分。

20.权利要求18或19所述的核酸序列，其中所述接头是核酸接头。

21.一种载体，其包含根据权利要求16至20中任一项所述的核酸序列。

22.一种宿主细胞，其包含根据权利要求16至20中任一项所述的核酸序列或权利要求21所述的载体。

23.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求4至12中任一项所述的蛋白质或构建体或根据权利要求15所述的药物组合物。

24.一种结合人血清白蛋白的氨基酸残基383-569的免疫球蛋白单可变重链结构域抗体。