KR20210090628A - 콜라겐 펩티드 제제의 재조합 생산 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제의 제조 방법, 이들 방법에 의해 생산된 콜라겐 펩티드 제제, 콜라겐 펩티드 제제를 함유하는 제품 및 상기 제제 및 제품의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제의 제조 방법, 이들 방법에 의해 생산된 콜라겐 펩티드 제제, 콜라겐 펩티드 제제를 함유하는 제품 및 상기 제제 및 제품의 용도에 관한 것이다.
콜라겐은 동물, 예를 들어 포유동물, 조류 및 어류에서 발견되는 세포 외 구조 단백질이다. 이것은 일반적으로 결합 조직에 존재하고, 특히 세포 외 기질의 일부로 발견된다. 힘줄, 인대, 연골 및 뼈에 특히 콜라겐이 풍부하다. 그러나 콜라겐은 식물과 단세포 유기체에서는 발견되지 않는다.
콜라겐은 구조적뿐 아니라 기능적으로 상이한 유형으로 발생하며 무엇보다도 구조, 기능 및 기원이 다르다. 콜라겐을 구성하는 폴리펩티드 사슬은 더 큰 전구체 분자의 형태로 소포체의 리보솜상의 세포에서 개별적으로 합성되며, 방대한 반복 (Gly-X-Y)n 서열을 가지며, 여기서 X와 Y는 임의의 아미노산일 수 있지만 보통 프롤린 및 4-하이드록시프롤린이다.
이러한 전구체 폴리펩티드 사슬은 하이드록시프롤린 및 하이드록시라이신 잔기를 형성하면서 소포체에 있는 폴리펩티드 사슬의 프롤린 및 라이신 잔기에서 번역 후 하이드록실화된다. 하이드록실화는 세포에서 형성되는 오른손 삼중 나선의 이웃한 콜라겐 폴리펩티드 사슬을 안정화시키는 역할을 하며, 각각 3 개의 전구체 폴리펩티드 사슬로 구성된다 (프로콜라겐).
이렇게 형성된 프로콜라겐은 세포 내에서 글리코실화되고, 세포에 의해 글리코실화된 삼중 나선 형태 (트로포콜라겐)로 분비되고, 이어서 말단 잔기의 펩티다제 매개 절단에 의해 콜라겐이 형성된다. 섬유소 형성 과정에서 이것은 축적되어 콜라겐 섬유를 형성한 다음 공유 가교 결합되어 콜라겐 섬유를 형성한다.
콜라겐은 종종 젤라틴으로 알려진 변성된 형태 또는 가수분해물의 형태로 사용된다.
젤라틴과 콜라겐이 가수분해 과정, 특히 효소적 가수분해를 거치면, 사용된는 콜라겐의 유형과 기원 및 효소 조건에 따라 다양한 조성 및 적용 프로파일을 갖는 콜라겐 가수분해물이 생성될 수 있다. 이들 콜라겐 가수분해물은 분자량이 특정 크기 범위에 분포된 펩티드의 혼합물을 나타낸다. 무엇보다도 뼈, 관절 또는 결합 조직에 관련된 통증의 예방 및/또는 치료를 위해 이러한 콜라겐 가수분해물을 예를 들어 식품 보충제 또는 미용 보조제로 사용하는 것이 오랫동안 알려져 왔다.
요컨대, WO 2012/065782는 피부 세포에 의한 세포 외 기질 단백질의 생합성을 자극하는 데 사용되며 특히 미용 목적에 적합한 돼지 껍질 젤라틴에서 수득한 콜라겐 가수분해물을 기술한다.
WO 2012/117012는 골다공증의 예방 및/또는 치료를 위해 프리바이오틱과 함께 사용될 수 있는, 소에서 분리한 효소적으로 가수분해된 평균 분자량 1500 내지 8000 Da의 콜라겐을 개시한다.
동물성 물질에서 수득한 콜라겐 가수분해물의 사용은 많은 응용과 소비자 그룹에 장점이 있지만, 이러한 방식으로 수득한 콜라겐 가수분해물의 사용은 특정 소비자 그룹 및 적용 프로파일의 관점에서 덜 바람직할 수도 있다. 특정 소비자 그룹은 건강에 유해한 미생물 또는 물질, 예를 들어, 공정 보조제를 포함한 오염 또는 원치 않는 면역 반응이 우려되거나 종교적 또는 윤리적 이유로 인해 동물성 물질에서 수득한 원료에 대해 근본적으로 비판적이거나 이에 반대한다. 또한 동물성 물질에서 수득한 콜라겐 가수분해물을 얻기 위해 사용되는 제조 공정에는 종종 복잡하고 값비싼 개발, 정제 및 추가 가공 단계가 포함된다. 마지막으로, 그 기원 및 조성과 관련하여 표준화되고 정확하고 신뢰성있게 정의된 콜라겐 가수분해물을 제공하는 것이 특정 적용에 유용할 수 있으며, 콜라겐 가수분해물은 유리하게는 또한 산업적 규모로 저렴하게 생산될 수 있어야 한다.
이러한 배경에서, 재조합 유전자 공학을 사용하여 젤라틴 및 콜라겐뿐만 아니라 이의 가수분해물을 생산하는 방법이 개발된 것은 놀라운 일이 아니다.
요컨대, WO 2006/052451 A2는 인간 프롤릴 하이드록실라제를 또한 발현하는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주에서의 재조합 III 형 콜라겐의 생산을 개시한다.
WO 2005/012356 A2는 인간 콜라겐 I 형 및 개별 50 kDa, 65 kDa 및 100 kDa 콜라겐 펩티드 종으로부터 젤라틴의 생산을 개시하고 있으며, 각각은 완전 하이드록실화, 부분 및 비-하이드록실화 형태이다.
WO 01/34646 A2 또한 비-하이드록실화, 부분 또는 완전 하이드록실화 형태로 존재할 수 있는, 재조합 생산 경로로부터 생성되는 정의된 분자량을 각각 갖는 개별 재조합 젤라틴 종의 생산을 개시한다.
그러나, 천연 공급원으로부터 수득한 콜라겐 또는 콜라겐 가수분해물의 것과 동일하거나 적어도 유사한 구조적 및 기능적 특성을 특징으로 하는 재조합 콜라겐 또는 그의 가수분해물의 생산은 문제가 있다. 이의 부분적인 이유는 콜라겐의 자연적인 형성이 글리코실화 및 하이드록실화와 같은 번역 후 합성 단계를 또한 포함하는 다수의 세포 내 및 세포 외 영향 인자를 특징으로 하는 비교적 복잡한 생리학적 과정이기 때문이다. 이러한 번역 후 합성 단계, 특히 프롤린과 라이신의 하이드록실화의 특정 배치 및 정도는 궁극적으로 회합하여 피브릴과 섬유를 형성하는 안정한 트로포콜라겐의 제공을 보장한다. 따라서 Wang et al. (Engineering Biology, 2017 (1), 18-23)으로부터, 콜라겐의 현재 재조합 생산은 천연 콜라겐 형성으로 일어나기 때문에 특히 번역 후 합성 단계가 누락되거나 일탈됨으로써 낮은 수율, 고비용이 특징인 것으로 알려져 있다. 정확하게 이러한 번역 후 변형은 콜라겐의 자연적인 구조와 기능 및 콜라겐 또는 콜라겐 가수분해물을 사용하는 응용에 필수적이라는 것도 알려져 있다.
따라서, 현재까지 천연 콜라겐 또는 그로부터 수득한 콜라겐 가수분해물과 동일한 구조, 특히 번역 후 변형의 품질 및 양, 특히 하이드록실화 및 글리코실화 정도 및 하이드록실화 및 글리코실화 위치를 갖는 재조합적으로 생산된 콜라겐 또는 콜라겐 가수분해물은 알려져 있지 않다.
다른 이유 중에서도, 상술된 상황, 특히 출발 물질 및 생산 방법의 차이로 인해, 통상적으로 생산된 콜라겐 또는 콜라겐 가수분해물로부터 특이적으로 유도된 특성 잠재력을 갖고 있는 재조합적으로 생산된 콜라겐 및 콜라겐 가수분해물의 공급은 용이치 않다. 특히 재조합 단백질의 산업적 생산에 그 자체로 적합한 원핵 생물에서, 재조합 콜라겐의 생산은 다른 이유 중에서도, 원칙적으로 번역 후 합성 단계 또한 재조합 기술을 사용하여 세포에 도입되어야 하고, 이것은 추가 대사 부하가 발생하여 원하는 콜라겐 펩티드의 발현과 생산을 어렵게 하거나 불가능하게 한다는 점에서 문제가 된다. 또한, 외래 단백질의 발현은 숙주 세포에 독성적일 수 있으며, 숙주 세포 내에서 또는 숙주 세포로부터 재조합적으로 생산된 단백질의 회수가 기술적으로 또는 경제적으로 불가능한 것으로 입증될 수 있으며, 수득된 발현 산물의 안정성이 너무 낮거나 기타 숙주 세포의 성장 및 생식 장애와 같은 영향이 발생할 수 있다.
따라서, 다양한 영역에서의 적용, 특히 치료 목적, 특히 인간 및 동물의 근육, 관절, 뼈 및 피부에 영향을 미치는 상태 또는 질환의 예방 또는 치료를 위해 재조합적으로 생산된 콜라겐 가수분해물을 제공하는 것이 여전히 많이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 앞서 언급한 단점을 극복한, 특히 표준화되고 신뢰할 수 있으며 정확하게 한정된 형태이면서 더 큰 산업적 및 비용 효율적인 규모로 재조합적으로 생산될 수 있으며, 특히 개선된 특성, 특히 동물성 물질에서 수득한 상응하는 콜라겐 가수분해물에 필적하는 효과를 나타내며, 특히 근육, 관절, 뼈 및 피부의 건강 유지와 관련하고 인간 및 동물의 근육, 관절, 뼈 및 피부에 영향을 미치는 질환의 예방 또는 치료에서 생물학적 효과를 나타내는 콜라겐 펩티드 제제 및 이와 같이 수득된 재조합 콜라겐 펩티드 제제의 생산 방법을 제공하는 기술적 문제에 기초한다.
본 발명은 독립 청구항의 교시, 특히 상세한 설명 및 종속 청구항의 바람직한 실시양태의 교시를 제공함으로써 기초가 되는 기술적 문제를 해결한다.
특히, 본 발명은 하기 방법 단계를 포함하는, 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 분자량이 8 내지 100 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 적어도 하나 포함하는 발현 시스템을 제공하는 단계,
b) 콜라겐 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 발현 시스템을 인큐베이션하는 단계,
c) 콜라겐 펩티드를 수득하는 단계,
d) 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제의 생산으로 이어지는 조건 하에서 콜라겐 펩티드를 가수분해하는 단계, 및
e) 콜라겐 펩티드 제제를 수득하는 단계.
콜라겐 펩티드 제제의 생산을 위해 본 발명에 따라 제공되는 방법은 특히, 재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제가 가수분해에 사용되는 재조합 특이적 콜라겐 펩티드 종 및 후속 방법 단계, 특히 가수분해 단계로부터 유리하게 생성되는 분자량 분포 및 구조, 특히 하이드록실화 프로파일을 갖는 적어도 하나, 바람직하게는 정확하게 한정되고, 재조합적으로 생산된 8 내지 100 kDa의 특정 크기의 콜라겐 펩티드로부터 가수분해에 의해 제공된다는 사실을 특징으로 하고, 그의 재조합 생산에도 불구하고, 직접, 그리고 추가 준비 단계없이 유리한 생물학적 활성을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 제공되는 콜라겐 펩티드 제제는 그의 재조합 생산 방법으로 인해, 특히 하이드록실화 및 글리코실화와 같은 번역 후 합성 단계에 의해 도입된 변형과 관련하여 천연 공급원으로부터 수득된 콜라겐 가수분해물과 그 구조에서 상당한 차이를 나타낸다. 놀랍게도, 원치 않는 오염없이 산업적 규모로도 다양한 발현 시스템에 제공될 수 있으며 동시에 특히 뼈, 연골, 피부, 머리카락 및 손발톱의 건강 유지 및 개선을 위한 적용 분야와 관련하여 유리한 생물학적 효과를 가질 수 있다.
본 발명에 따라 발견된 본원에 제공된 재조합 콜라겐 펩티드 제제의 생물학적 효과는 추가 처리 단계없이 가수분해로부터 직접 수득한 제제에 적용된다.
본 발명에 따라 발견된 생물학적 효과 및 본 발명의 재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제는 특히 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험을 사용하여, 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질 또는 이들 단백질을 암호화하는 mRNA의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험, 특히 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 시험관 내 시험을 사용하여 결정될 수 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 생산된 본 발명의 재조합 콜라겐 펩티드 함유 콜라겐 펩티드 제제는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명에 따라 생산된 본 발명의 재조합 콜라겐 펩티드 함유 콜라겐 펩티드 제제는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제와 동일한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명에 따라 생산된 본 발명의 재조합 콜라겐 펩티드 함유 콜라겐 펩티드 제제는 특히 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제보다 우수한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 세포 기반 또는 무세포 발현 시스템이다.
단계 a)에서 제공된 발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템은 바람직하게는 숙주 세포, 특히 원핵 또는 진핵 세포이다.
발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템은 바람직하게는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 구성된 군으로부터 선택된 숙주 세포이다.
발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템은 바람직하게는 박테리아 세포, 특히 대장균 (Escherichia coli) 또는 고초균 (Bacillus subtilis) 종의 박테리아 세포이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템은 특히 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 오가태아 안구스타 (Ogataea angusta) (한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha)) 종의 효모 세포이다.
발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템은 바람직하게는 진균 세포, 특히 아스퍼길루스 니거 (Aspergillus niger) 종이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템은 포유동물 세포, 특히 CHO 세포, HeLa 세포 또는 HEK293 세포이다.
발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템은 바람직하게는 곤충 세포, 특히 Sf-9, Sf-21 또는 Tn-5 세포이다.
발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템은 바람직하게는 식물 세포, 특히 옥수수 또는 담배 세포이다.
본 발명의 추가 바람직한 실시양태에서, 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 잔기 및 라이신 잔기를 하이드록실화할 수 있는 발현 시스템, 특히 세포 기반 발현 시스템이다. 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 바람직하게는 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 잔기 및 라이신 잔기를 하이드록실화할 수 있는 숙주 세포이다.
단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 바람직하게는 프롤릴 하이드록실라제 활성 및/또는 라이실 하이드록실라제 활성을 나타내는 세포 기반 발현 시스템이다. 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 바람직하게는 프롤릴 하이드록실라제 활성 및/또는 라이실 하이드록실라제 활성을 나타내는 발현 시스템, 특히 숙주 세포이다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 프롤릴 4-하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 세포 기반 발현 시스템이다. 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 특히 바람직하게는 프롤릴 4-하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 세포 기반 발현 시스템이므로, 방법 단계 e)에서는 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 수득된다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 라이실 하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 세포 기반 발현 시스템이다. 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 특히 바람직하게는 라이실 하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 세포 기반 발현 시스템이므로, 방법 단계 e)에서는 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 수득된다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 프롤릴-4-하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트 및 라이실 하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 세포 기반 발현 시스템이다. 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 특히 바람직하게는 프롤릴-4-하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트 및 라이실 하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 세포 기반 발현 시스템이므로, 방법 단계 e)에서는 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 수득된다.
따라서, 본 발명은 또한 다음 방법 단계를 포함하는, 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제, 특히 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제를 생산하는 방법을 포함한다:
a) 분자량이 8 내지 100 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하고 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 및 라이신 잔기를 하이드록실화할 수 있는 세포 기반 발현 시스템을 제공하는 단계,
b) 콜라겐 펩티드의 발현 및 하이드록실화를 허용하는 조건 하에서 발현 시스템을 인큐베이션하는 단계, 특히 세포 기반 발현 시스템을 배양하는 단계,
c) 콜라겐 펩티드, 특히 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드를 수득하는 단계,
d) 콜라겐 펩티드 제제, 특히 1 내지 7 kDa의 평균 분자량 및 0.1 내지 13.5 kDa 범위의 분자량을 갖는 콜라겐 펩티드, 특히 시험관 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 생산으로 이어지는 조건 하에서 콜라겐 펩티드, 특히 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드를 가수분해하는 단계, 및
e) 콜라겐 펩티드 제제, 특히 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제 (이하 콜라겐 펩티드 제제 A라고도 함)를 수득하는 단계.
전술한 방법을 이용함으로써, 사용된 세포 기반 발현 시스템에 따라 번역 후 변형의 특이젓 패턴, 특히 하이드록실화 및 글리코실화를 특징으로 하는, 특정 분자량 및 특정 평균 분자량을 갖는 생체 내 하이드록실화된 재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드를 갖는 콜라겐 제제를 유리하게 얻을 수 있다. 이러한 방식으로, 특히 직접적으로, 즉 콜라겐 펩티드 제제의 콜라겐 펩티드를 후속적으로 변형할 필요없이 생물학적 효과를 갖는 콜라겐 펩티드 제제를 수득하는 것이 유리하게 가능하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 A는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 A는 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제와 동일한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 A는 특히 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제보다 우수한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 및 라이신 잔기의 하이드록실화를 일으킬 수 없는 발현 시스템이며, 특히 단계 a)에서 제공된 발현 시스템은 프롤릴 하이드록실라제 활성 및 라이실 하이드록실라제 활성을 나타내지 않는다.
따라서, 본 발명은 다음 방법 단계를 포함하는, 재조합 콜라겐 펩티드 함유 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제를 생산하는 방법을 포함한다:
a) 분자량이 8 내지 100 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하고 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 및 라이신 잔기를 하이드록실화할 수 없는 발현 시스템을 제공하는 단계,
b) 콜라겐 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 발현 시스템을 인큐베이션하는 단계,
c) 콜라겐 펩티드, 특히 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드를 수득하는 단계,
d) 콜라겐 펩티드, 특히 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드를 1 내지 7 kDa의 평균 분자량 및 0.1 내지 13.5 kDa 범위의 분자량을 갖는 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제의 생산으로 이어지는 조건 하에서 가수분해하는 단계, 및
e) 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 (이하 콜라겐 펩티드 제제 B라고도 함)를 수득하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 B는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 생물학적 활성을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 B는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제와 동일한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 B는 특히 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제보다 우수한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 방법 단계 c)에서 수득된 콜라겐 펩티드는 방법 단계 d)를 수행하기 전에 방법 단계 x1)에서 하이드록실화되고, 즉 가수분해 전에, 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 제조 방법 단계 e)에서 얻어진다.
따라서, 본 발명은 다음 방법 단계를 포함하는, 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제, 특히 생체 외에서 사전 용해적으로 (pre-lysally) 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제를 제조하는 방법을 추가로 포함한다:
a) 분자량이 8 내지 100 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하고 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 및 라이신 잔기를 하이드록실화할 수 없는 발현 시스템을 제공하는 단계,
b) 콜라겐 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 발현 시스템을 인큐베이션하는 단계,
c) 콜라겐 펩티드를 수득하는 단계,
x1) 단계 c)에서 수득한 콜라겐 펩티드를 생체 외 하이드록실화하는 단계,
d) 콜라겐 펩티드, 특히 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드를, 1 내지 7 kDa의 평균 분자량 및 0.1 내지 13.5 kDa 범위의 분자량을 갖는 콜라겐 펩티드, 특히 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제의 생산으로 이어지는 조건 하에서 가수분해하는 단계, 및
e) 콜라겐 펩티드 제제, 특히 사전 용해적으로 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제 (이하 콜라겐 펩티드 제제 C라고도 함)를 수득하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 사전 용해적으로 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 C는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 사전 용해적으로 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 C는 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제와 동일한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명에 따라 생산된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 사전 용해적으로 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 C는 특히 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제보다 우수한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 방법 단계 c)에서 수득된 콜라겐 펩티드는 방법 단계 d)의 수행 후 방법 단계 x2)에서 하이드록실화되고, 용해 후, 즉 가수분해 후, 방법 단계 e)에서 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 수득된다.
따라서, 본 발명은 다음 방법 단계를 포함하는, 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제, 특히 사후 용해적으로 (post-lysally) 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제를 제조하는 방법을 추가로 포함한다:
a) 분자량이 8 내지 100 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하고 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 및 라이신 잔기를 하이드록실화할 수 없는 발현 시스템을 제공하는 단계,
b) 콜라겐 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 발현 시스템을 인큐베이션하는 단계,
c) 콜라겐 펩티드를 수득하는 단계,
d) 콜라겐 펩티드를, 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제의 생산으로 이어지는 조건 하에서 가수분해하는 단계,
x2) 단계 d)에서 수득된 콜라겐 펩티드 제제의 콜라겐 펩티드를 생체 외 하이드록실화하는 단계,
e) 콜라겐 펩티드 제제, 특히 사후 용해적으로 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제 (이하 콜라겐 펩티드 제제 D라고도 함)를 수득하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 생성된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 사후 용해적으로 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 D는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명에 따라 생성된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 사후 용해적으로 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 D는 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제와 동일한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명에 따라 생성된 재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 사후 용해적으로 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 D는 특히 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제보다 우수한 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 발현 카세트의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되며, 즉, 사용되지 않거나 바람직하게 사용되지 않는 뉴클레오티드 서열 내 코돈은 바람직하게는 암호화된 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않고 제공된 발현 시스템, 특히 제공된 세포 기반 발현 시스템, 특히 제공된 숙주 세포의 번역 시스템에 의해 사용되는 것으로 대체된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 척추동물, 특히 포유동물, 예를 들어 인간 또는 비인간 포유동물, 예를 들어 말, 당나귀, 캥거루, 양, 설치류, 돼지 또는 소, 조류, 예를 들어 닭, 물고기, 양서류, 파충류 또는 무척추동물, 예를 들어, 해파리 유래 콜라겐 펩티드이다.
뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 바람직하게는 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, XXVII 형, 바람직하게는 I, II 또는 III 형, 바람직하게는 I 형, 바람직하게는 II 형, 바람직하게는 III 형의 콜라겐에서의 아미노산 서열을 가진다.
뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 I, II 또는 III 형 콜라겐 펩티드가 바람직하고, 바람직하게는 I 형 또는 II 형, 특히 바람직하게는 I 형이다.
뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 바람직하게는 척추동물, 특히 어류, 양서류, 파충류, 조류 및 포유동물, 특히 I, II 또는 III 형, 바람직하게는 I 형, 바람직하게는 II 형, 바람직하게는 III 형의 인간, 소, 돼지, 말 또는 조류 콜라겐의 콜라겐에서 발생하는 아미노산 서열을 포함한다.
뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 특히 바람직하게는 인간 콜라겐, 특히 인간 I 형 콜라겐, 바람직하게는 인간 I 형 콜라겐의 α1 사슬에서 발생하는 아미노산 서열을 포함한다.
뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 특히 바람직하게는 비인간 콜라겐, 특히 비인간 I 형 콜라겐, 바람직하게는 비인간 I 형 콜라겐의 α1 사슬에서 발생하는 아미노산 서열, 특히 소, 돼지, 말 또는 조류 콜라겐에서 발생하는 아미노산 서열을 포함한다.
뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 바람직하게는 자연 발생 콜라겐 펩티드이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 자연 발생 콜라겐 펩티드가 아니다. 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 바람직하게는 유전적으로 변형된 콜라겐 펩티드이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 유전적으로 변형된 콜라겐 펩티드이며, 여기서 자연 발생 콜라겐 펩티드의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산, 바람직하게는 적어도 하나의 비필수 아미노산, 특히 자연 발생 콜라겐 펩티드의 아미노산 서열의 Ala, Asn, Asp, Glu, Ser은 적어도 하나의 매우 특이적인 아미노산, 특히 적어도 하나의 필수 아미노산, 특히 Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, 특히 바람직하게는 Trp로 대체된다.
본 발명에 따르면, 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 유전적으로 변형된 콜라겐 펩티드이며, 여기서 적어도 하나의 아미노산, 바람직하게는 적어도 하나의 필수 아미노산, 특히 Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, 특히 바람직하게는 Trp가 자연 발생 콜라겐 펩티드의 아미노산 서열에 첨가된다. 이 경우, 본 발명에 따라 적어도 하나의 아미노산, 바람직하게는 적어도 하나의 필수 아미노산, 특히 Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, 특히 바람직하게는 Trp가 N-말단, C-말단 및/또는 자연 발생 콜라겐 펩티드의 아미노산 서열 내에 첨가된 것이 제공될 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 8 내지 95 kDa, 바람직하게는 8 내지 90 kDa, 바람직하게는 8 내지 85 kDa, 바람직하게는 8 내지 80 kDa, 바람직하게는 9 내지 95 kDa, 바람직하게는 9 내지 90 kDa, 바람직하게는 9 내지 85 kDa, 바람직하게는 9 내지 80 kDa, 바람직하게는 10 내지 95 kDa, 바람직하게는 10 내지 90 kDa, 바람직하게는 10 내지 85 kDa, 바람직하게는 10 내지 80 kDa범위의 분자량을 갖는 콜라겐 펩티드를 암호화한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 가수분해는 효소 또는 산-촉매화 가수분해, 바람직하게는 효소 가수분해, 바람직하게는 산-촉매화 가수분해이다. 단계 c)에서 수득된 콜라겐 펩티드의 가수분해는 특히 바람직하게는 적어도 하나의 박테리아 또는 미생물 프로테아제, 특히 적어도 하나의 박테리아 및/또는 미생물 세린, 시스테인, 아스파테이트 및/또는 메탈로프로테아제, 바람직하게는 적어도 하나의 박테리아 및/또는 미생물 엔도프로테아제, 바람직하게는 적어도 하나의 박테리아 및/또는 미생물 엑소프로테아제의 첨가에 의해 수행된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 펩티드는 평균 분자량이 1 내지 3 kDa이고 분자량이 0.1 내지 10 kDa, 바람직하게는 0.18 내지 10 kDa, 바람직하게는 0.2 내지 10 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제를 생성하는 조건하에 단계 d)에서 가수분해된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 펩티드는 평균 분자량이 1 내지 5 kDa이고 분자량이 0.1 내지 12 kDa, 바람직하게는 0.18 내지 12 kDa, 바람직하게는 0.2 내지 12 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제를 생성하는 조건 하에서 단계 d)에서 가수분해된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 언급된 방법 중 하나를 사용하여 생산된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa, 바람직하게는 0.18 내지 13.5, 바람직하게는 0.2 내지 13.5 범위인 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 언급된 방법 중 하나로 생산된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa의 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 비-하이드록실화, 부분 하이드록실화 또는 완전 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제, 바람직하게는 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제, 바람직하게는 부분 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제, 바람직하게는 완전 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제이다.
본 발명에 따른 전술한 방법 중 하나로 생산된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 갖는 콜라겐 펩티드 제제는 바람직하게는 콜라겐 펩티드의 프롤릴 잔기, 바람직하게는 라이실 잔기, 특히 바람직하게는 프롤릴 및 라이실 잔기의 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 3%, 바람직하게는 적어도 4%, 바람직하게는 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 35%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 45%, 바람직하게는 적어도 50%가 하이드록실화되고, 바람직하게는 생체 내 하이드록실화되고, 바람직하게는 생체 외 하이드록실화되며, 특히 생체 외에서 사전 용해적으로 하이드록실화되거나 생체 외에서 사후 용해적으로 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제이다.
본 발명에 따른 전술한 방법 중 하나를 사용하여 제조된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 특히 바람직하게는 콜라겐 펩티드의 프롤릴 잔기, 바람직하게는 라이실 잔기, 특히 바람직하게는 프롤릴 및 라이실 잔기의 최대 95%, 바람직하게는 최대 90%, 바람직하게는 최대 85%, 바람직하게는 최대 80%, 바람직하게는 최대 75%, 바람직하게는 최대 70%, 바람직하게는 최대 65%, 바람직하게는 최대 60%, 바람직하게는 최대 55%, 바람직하게는 최대 50%, 바람직하게는 최대 45%, 바람직하게는 최대 40%, 바람직하게는 최대 35%, 바람직하게는 최대 30%, 바람직하게는 최대 25%, 바람직하게는 최대 20%, 바람직하게는 최대 15%, 바람직하게는 최대 10%, 바람직하게는 최대 5%가 하이드록실화되고, 바람직하게는 생체 내 하이드록실화되고, 바람직하게는 생체 외 하이드록실화되며, 특히 생체 외에서 사전 용해적으로 하이드록실화되거나 생체 외에서 사후 용해적으로 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 언급된 방법 중 하나로 생산된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 콜라겐 펩티드의 프롤릴 잔기, 바람직하게는 라이실 잔기, 특히 바람직하게는 프롤릴 및 라이실 잔기 콜라겐 펩티드의 1 내지 75%, 바람직하게는 5 내지 70%, 바람직하게는 5 내지 65%, 바람직하게는 10 내지 60%, 바람직하게는 15 내지 55%, 바람직하게는 20 내지 50%, 바람직하게는 25 내지 50%, 바람직하게는 30 내지 50%, 바람직하게는 35 내지 50%, 바람직하게는 40 내지 50%가 하이드록실화되고, 바람직하게는 생체 외 하이드록실화되며, 특히 생체 외에서 사전 용해적으로 하이드록실화되거나 생체 외에서 사후 용해적으로 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법 중 하나로 생산된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 콜라겐 펩티드가 글리코실화된 콜라겐 펩티드 제제이다. 콜라겐 펩티드는 바람직하게는 생체 내에서 글리코실화되고, 바람직하게는 생체 외에서 글리코실화된다. 하이드록실 잔기의 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 3%, 바람직하게는 적어도 4%, 바람직하게는 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 6%, 바람직하게는 적어도 7%, 바람직하게는 적어도 8%, 바람직하게는 적어도 9%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%가 글리코실화되고, 바람직하게는 생체 내에서 글리코실화되고, 바람직하게는 생체 외에서 글리코실화된다.
본 발명의 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법 중 하나를 사용하여 생성된 콜라겐 펩티드 제제는 콜라겐 펩티드가 글리코실화되지 않은 콜라겐 펩티드 제제이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 A이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 B이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 C 또는 D이다.
콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 바람직하게는 용해 전, 즉, 가수분해 전, 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 C이다.
본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 콜라겐 펩티드 제제, 특히 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제는 용해 후, 즉 가수분해 후, 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제, 즉 콜라겐 펩티드 제제 D이다.
본 발명은 또한 특히, 숙주 세포에서 분자량이 8 내지 100 kDa인 재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드의 가수분해에 의해 생산된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 하이드록실화 또는 비-하이드록실화 콜라겐 제제에 관한 것으로, 콜라겐 펩티드 제제는 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함한다.
효과에 기여하는 콜라겐 펩티드 제제의 특징적인 펩티드의 존재는 특히 질량 분광법, 바람직하게는 ESI (전자 분무 이온화) 또는 MALDI 질량 분광법에 의해 결정될 수 있으며, 특징적인 펩티드는 질량 스펙트럼에서 피크로 나타난다. MALDI 질량 분광법에 의해 결정된 분자량 분포에서, 특징적인 펩티드는 주변 환경에 비해 적어도 두 배의 강도, 더 바람직하게는 적어도 네 배의 강도를 나타낸다.
본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제, 특히 콜라겐 펩티드 제제 A, 콜라겐 펩티드 제제 B, 콜라겐 펩티드 제제 C 및 콜라겐 펩티드 제제 D는 또한 1,500 내지 3,500 Da의 크기를 갖는 특징적인 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제, 특히 콜라겐 펩티드 제제 A, 콜라겐 펩티드 제제 B, 콜라겐 펩티드 제제 C 및 콜라겐 펩티드 제제 D는 크기가 <500 Da인 콜라겐 펩티드를 최대 5.5%, 바람직하게는 최대 5%, 바람직하게는 최대 4.5%, 바람직하게는 최대 4%, 바람직하게는 최대 3.5% 포함한다.
이 실시양태에 따르면, 500 Da 미만의 크기를 갖는 펩티드의 특히 낮은 백분율은 유리하게는 선행 기술에 공지된 제제에 비해 콜라겐 펩티드 제제의 맛을 개선하고, 특히 콜라겐 펩티드 제제의 쓴맛 감소를 나타낸다.
본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 콜라겐 펩티드, 특히 콜라겐 펩티드 제제 A, 콜라겐 펩티드 제제 B, 콜라겐 펩티드 제제 C 및 콜라겐 펩티드 제제 D의 바람직하게는 35 내지 60%, 바람직하게는 35 내지 55%, 바람직하게는 35 내지 50%, 바람직하게는 36 내지 48%, 바람직하게는 36 내지 46%, 바람직하게는 37 내지 45%, 바람직하게는 38 내지 44%가 1500 Da 내지 3500 Da 범위의 크기를 갖는다.
본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제, 특히 콜라겐 펩티드 제제 A, 콜라겐 펩티드 제제 B, 콜라겐 펩티드 제제 C 및 콜라겐 펩티드 제제 D는 바람직하게는 7500 Da 내지 13500 Da 범위의 크기를 갖는 콜라겐 펩티드를 최대 2.8%, 바람직하게는 최대 2.75%, 바람직하게는 최대 2.7%, 바람직하게는 최대 2.65%, 바람직하게는 최대 2.6%, 바람직하게는 최대 2.55%, 바람직하게는 최대 2.5%, 바람직하게는 최대 2.45%, 바람직하게는 최대 2.4%, 바람직하게는 최대 2.35%, 바람직하게는 최대 2.3% 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제, 특히 콜라겐 펩티드 제제 A, 콜라겐 펩티드 제제 B, 콜라겐 펩티드 제제 C 및 콜라겐 펩티드 제제 D의 콜라겐 펩티드의 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 93.5%, 바람직하게는 적어도 94%, 바람직하게는 적어도 94.5%, 바람직하게는 적어도 95%는 500 Da 내지 7500 Da 범위의 크기를 갖는다.
본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제, 특히 콜라겐 펩티드 제제 A, 콜라겐 펩티드 제제 B, 콜라겐 펩티드 제제 C 및 콜라겐 펩티드 제제 D의 바람직하게는 적어도 94.5%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 95.5%, 바람직하게는 적어도 95.6%, 바람직하게는 적어도 95.7%, 바람직하게는 적어도 95.6%, 바람직하게는 적어도 95.7%, 바람직하게는 적어도 95.8%, 바람직하게는 적어도 95.9%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 96.1%, 바람직하게는 적어도 96.2%, 바람직하게는 적어도 96.3%, 바람직하게는 적어도 96.4%, 바람직하게는 적어도 96.5%는 500 Da 내지 13500 Da 범위의 크기를 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라, 콜라겐 펩티드 제제는 국부적으로, 특히 국소적으로 또는 전신적으로, 특히 장으로, 바람직하게는 경구로 투여된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 콜라겐 펩티드 제제는 식품 보충제의 형태로 투여된다. 본 발명에 따른 식품 보충제는 특히 유리하게는 용액, 현탁액 또는 겔 형태, 예를 들어 앰플, 과립 또는 분말 형태이다. 본 콜라겐 펩티드 제제는 용해도가 우수하기 때문에 탁함을 일으키지 않고 다양한 음료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따라 제공되는 식품 보충제는 콜라겐 펩티드 제제 외에 추가적인 단백질 또는 단백질 가수분해물을 함유하지 않는다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 식품 보충제는 콜라겐 펩티드 제제 외에 추가적인 생리학적 활성 성분, 특히 단백질 또는 단백질 가수분해물을 함유하지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제 및 적어도 하나의 첨가제를 포함하는 제품에 관한 것이다.
본 발명의 대상은 또한 본 발명에 따른 콜라겐 제제 및 하나 이상의 추가 성분, 특히 적어도 하나의 식품 허용 첨가제를 포함하는 식품 보충제이다.
하나의 실시양태에서, 콜라겐 펩티드 제제는 식품 또는 고급 식품, 예를 들어 초콜릿 바, 단백질 바, 시리얼 바, 우유, 유제품, 예를 들어 요구르트, 유청 또는 쿼크 및 우유 대용품, 예를 들어 두유, 라이스 밀크, 아몬드 밀크 및 코코넛 밀크 (소위 기능성 식품)에 첨가될 수 있다.
따라서 본 발명의 대상은 또한 본 발명에 따른 콜라겐 제제를 포함하는 식품 또는 고급 식품이다.
본 발명에 따르면, 콜라겐 펩티드 제제는 약학적 조성물의 형태로 투여되는 것이 추가로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 특히 유리하게는, 예를 들어 정제, 로젠지, 츄어블정, 캡슐, 바이트 캡슐, 코팅 정제, 로젠지, 주스, 겔 또는 연고의 형태로 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
추가 실시양태에서, 콜라겐 펩티드 제제가 화장품 조성물의 형태로 투여되는 것이 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 특히 유리하게는, 예를 들어 로션, 연고, 크림, 겔, 분말, 주사기 또는 스프레이의 형태로 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제 및 적어도 하나의 피부-적합성 첨가제를 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에 따른 콜라겐 펩티드 제제가 제품, 특히 식품 보충제, 식품 또는 고급 식품, 약학적 조성물 또는 화장품 조성물의 유일한 생리학적 활성 성분으로 사용되지 않는 경우, 이는 일반적인 건강, 특히 지구력 기능에 긍정적인 영향을 미치는 하나 이상의 다른 성분과 결합될 수 있다. 이러한 성분은 바람직하게는 비타민 C, B, D, E 및 K 시리즈의 비타민, 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산, 공액 리놀렌산, 카페인 및 그 유도체, 구아라나 추출물, 녹차 추출물, 에피갈로카테킨 갈레이트, 크레아틴, L-카르니틴, α-리포산, N-아세틸시스테인, NADH, D-리보스, 마그네슘 아스파테이트, 항산화제, 예컨대 안토시아닌, 카로티노이드, 플라보노이드, 레스베라트롤, 글루타티온 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD), 칸나비디노이드, 예컨대 칸나비디올 (CBD), 강장제, 예컨대 홍경천 (Rhodiola rosea), 파낙스 인삼 (Panax ginseng), 위타니아 솜니페라 (Withania somnifera), 표고 버섯, 영지 (Ganoderma lucidum), 마카 (Lepidium meyenii), 철, 마그네슘, 칼슘, 아연, 셀레늄 및 인과 같은 미네랄, 기타 단백질, 가수분해물 및 펩티드, 예컨대 콩, 밀 및 유청 단백질로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 펩티드 제제는 1 일 1 내지 40 g, 바람직하게는 1 일 1 내지 30 g, 바람직하게는 1 일 1 내지 20 g, 바람직하게는 1 일 1 내지 15 g, 바람직하게는 1 일 2.5 내지 30 g, 바람직하게는 1 일 2.5 내지 20 g, 바람직하게는 1 일 2.5 내지 15 g, 바람직하게는 1 일 2.5 내지 10 g, 바람직하게는 1 일 4 내지 15 g, 바람직하게는 1 일 4 내지 12 g, 더욱 바람직하게는 1 일 5 내지 25 g, 바람직하게는 1 일 5 내지 15 g, 더욱 바람직하게는 1 일 10 내지 25 g, 바람직하게는 1 일 12 내지 22 g, 특히 1 일 12.5 내지 20 g, 특히 바람직하게는 1 일 6 내지 15 g, 특히 1 일 2.5 내지 7.5 g, 바람직하게는 1 일 2.5 내지 5 g의 양으로 투여된다.
본 발명은 또한 뼈 건강 유지 및 개선, 골다공증 예방 및/또는 치료, 근감소증 예방 및/또는 치료, 퇴행성 근육량 손실 예방 및/또는 치료, 근력 향상, 지방 감소 촉진 및 체중 감소를 위한 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한 골 질환, 특히 골다공증의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 하나의 실시양태에서, 본 발명은 근감소증의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 퇴행성 근육량 손실의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 연골 질환, 특히 관절염 또는 관절염의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 근력 향상 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 감소된 미토콘드리아 활성을 특징으로 하는 병리학적 병태를 예방 및/또는 치료하는 방법, 특히 지구력 감소가 특징인 병적 상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 지방 분해를 자극하는 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 체중을 감소시키는 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 퇴행성 관절 질환, 특히 골관절염, 류마티스 관절염, 류마티스 질환, 척추염 및/또는 섬유근통의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 힘줄 또는 인대의 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 피부 질환, 특히 심상성 건선, 여드름, 아토피성 피부염, 만성 가려움증 및/또는 주사의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 창상, 특히 만성 창상, 급성 창상 및/또는 화상을 치료하는 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 퇴행성 신경 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치매의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 알츠하이머 병의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 지적 능력 저하를 특징으로 하는 병리학적 상태의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 혈액-뇌 장벽, 특히 뇌막의 구조 및/또는 기능의 오작동과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 장 질환, 특히 만성 염증성 장 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 심혈관계 질환, 특히 혈관, 특히 혈관벽의 구조 및/또는 기능의 예방 및/또는 치료, 특히 고혈압 및/또는 순환계 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치아 유지 장치의 질병 예방 및/또는 치료 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 뼈 건강 유지 및 개선, 골다공증 예방, 근감소증 예방 및/또는 치료, 퇴행성 근육량 손실 예방, 근력 향상, 지방 감소 촉진, 체중 감소 및/또는 퇴행성 관절 질환의 예방을 위한 비치료적 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한 피부의 시각적 및 구조적 개선, 특히 주름 감소, 피부 탄력 개선, 피부 톤 개선, 피부의 수분 함량 증가, 셀룰라이트 감소 및/또는 튼살 감소, 특히 튼살 감소를 위한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 비치료적 용도에 관한 것이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 손발톱의 성장을 촉진하고/거나 손발톱 부서짐을 감소시키기 위한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 비치료적 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한 모발의 시각적 및 구조적 개선, 특히 모발의 질 개선, 끝부분 갈라짐 감소 및/또는 탈모 감소/지연을 위한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 비치료적 용도에 관한 것이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 미토콘드리아의 수 및/또는 미토콘드리아 활성을 증가시키기 위한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 비치료적 용도에 관한 것이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 지구력 기능을 개선하기 위한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 비치료적 용도에 관한 것이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 지적 능력을 개선하기 위한 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 비치료적 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제는 본 발명에 따라 제공된 적용 중 하나에 사용하기 위해 단독으로, 즉 추가 물질없이 사용된다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제는 본 발명에 따라 제공되는 적용에서 생물학적 활성을 나타내는 단독 제제로 사용된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제는 본 발명에 따라 제공된 적용에서 적어도 하나의 추가 제제, 특히 추가 생물학적 활성제와 함께 사용된다.
본 발명은 또한 치료 목적을 위해 충분한 양의 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제가 임의로 첨가제와 함께 인간 또는 동물 신체에 투여되는, 상기 언급된 징후, 특히 상기 언급된 치료상 징후를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 또는 동물 신체에 본 발명에 따른 적어도 하나의 콜라겐 펩티드 제제가 투여되는, 근력 향상, 근육량 증가, 지방 감소 촉진, 체중 감소, 뼈 건강 유지 및/또는 개선, 피부 건강 유지 및/또는 개선, 장 건강 유지 및/또는 개선, 혈관 구조 유지 및/또는 개선, 심혈관계 건강 유지 및/또는 개선, 잇몸 유지 및/또는 개선, 인간 또는 동물 신체의 손발톱 및 모발 건강 유지 및/또는 개선, 미토콘드리아 수 및/또는 미토콘드리아 활성의 유지 및/또는 증가, 지구력 기능 유지 및/또는 개선, 또는 지적 능력 유지 및/또는 개선을 위한 비치료적 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 필름, 호일 및 코팅을 제조하는 방법에 적용되는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에 관한 것이다. 코팅은 예를 들어 페인트 및 바니시, 특히 특수 광학적 효과가 있는 페인트 및 바니시, 또는 자정 표면을 생성하기 위한 코팅일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명과 관련하여 용어 "콜라겐"은 특히 예를 들어 WO 01/34646에 정의된 바와 같이 당 업계에서 통상적인 방식으로 이해된다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "콜라겐"은 콜라겐 유형 I 내지 XXVII과 관련된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 용어 "콜라겐"은 일련의 글리신-프롤린, 글리신-4-하이드록시프롤린 또는 글리신-X-4-하이드록시프롤린, 바람직하게는 반복 모티프 (Gly-XY)n (여기서 X 및 Y는 임의의 아미노산일 수 있다), 바람직하게는 프롤린 및 4-하이드록시프롤린을 포함하는 펩티드를 의미하는 것으로 이해된다. 용어 "콜라겐"은 특히 바람직하게는 반복 모티프 (Gly-Pro-Y)n 및/또는 (Gly-X-Hyp)m을 갖는 펩티드를 의미하는 것으로 이해되며, 여기서 X 및 Y는 임의의 아미노산일 수 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "젤라틴"은 바람직하게는 당 업계에서 통상적인 방식, 특히 예를 들어 WO 01/34646에 정의된 바와 같이 이해된다.
본 발명과 관련하여, 용어 "콜라겐 펩티드"는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 콜라겐에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 의미하는 것으로 이해된다. "콜라겐 펩티드"는 바람직하게는 또한 천연 발생 콜라겐 펩티드의 아미노산 서열을 변형하여 수득한 유전적으로 변형된 콜라겐 펩티드를 의미하는 것으로 이해되며, 여기서 본 발명에 따른 방법의 단계 e)에서 수득한 "콜라겐 펩티드"로부터 얻어진 콜라겐 펩티드 제제는 바람직하게는 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험의 적어도 하나, 특히 실시예 3 내지 7, 특히 실시예 3 내지 5에 제시된 조골세포, 섬유아세포 및 연골세포에서 세포 외 기질 단백질의 합성을 자극하기 위한 시험관 내 시험 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 바람직하게는 모두에서 생물학적 활성, 바람직하게는 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비-재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제와 동일한 생물학적 활성, 특히 바람직하게는 천연 공급원에서 단리된 콜라겐 펩티드 제제, 특히 비-재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드 제제보다 더 나은 생물학적 효과를 나타낸다.
본 발명과 관련하여, 용어 "재조합 DNA"는 유전 공학 방법에 의해 시험관 내에서 생성된 인공적으로 생성되거나 조작된 DNA 분자를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 DNA는 기원이 다른 유기체의 성분으로 구성된다.
본 발명과 관련하여, "재조합 또는 재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드"는 재조합 DNA에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명과 관련하여, 용어 "발현 카세트"는 세그먼트에서 암호화된 정보를 RNA, 특히 mRNA로 전사하는 데 관여하는 DNA 세그먼트를 의미하는 것으로 이해되며, 적어도 하나의 프로모터 및 하나의 단백질-암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 일반적으로 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 단백질-암호화 뉴클레오티드 서열 및 임의로 종결자를 가진다
본 발명과 관련하여, "뉴클레오티드 서열"은 핵산, 특히 핵산 가닥, 특히 DNA 또는 RNA 가닥의 뉴클레오티드의 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 그러므로 "뉴클레오티드 서열"은 정보 단위로서 뿐만 아니라 이 정보를 물리적으로 나타내는 DNA 또는 RNA 가닥으로 이해하여야 한다.
본 발명과 관련하여, "발현 시스템"은 표적화되고 제어된 단백질 생합성이 일어날 수 있는 시스템을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따르면, 용어 "발현 시스템"은 단백질 생합성에 필요한 성분이 세포 내에 존재하지 않는, 즉, 단백질 합성이 세포 외부에서 일어나는 무세포 발현 시스템과 단백질 생합성이 살아 있는 세포 내에서 일어나는 세포 기반 발현 시스템을 모두 포함한다. 본 발명과 관련하여, 무세포 발현 시스템은 바람직하게는 단백질 생합성, 특히 번역 및 전사 시스템에 필요한 성분을 함유하는, 대장균, 곤충 세포, 밀 배아, 담배 세포 또는 포유동물 세포, 특히 CHO 세포 또는 토끼 유래 망상 적혈구로부터의 용해물 또는 추출물이다.
본 발명과 관련하여, "숙주 세포"는 외래 DNA, 특히 재조합 DNA에서 암호화된 펩티드 또는 단백질을 발현할 수 있는 살아 있는 세포를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명과 관련하여, 용어 "사전 용해" 및 "사후 용해"는 가수분해 전 또는 후, 특히 효소 또는 산-촉매화 가수분해 전 또는 후의 시점을 나타낸다.
본 발명과 관련하여, 용어 "인큐베이션"은 세포 기반 발현 시스템, 특히 숙주 세포의 배양 및 무세포 발현 시스템에 대한 특정 조건의 작용을 모두 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따르면, 방법 단계 c)에 따른 "콜라겐 펩티드 수득" 및 방법 단계 e)에 따른 "콜라겐 펩티드 수득"이라는 용어는 다중 성분을 함유하는 조성물로부터 콜라겐 펩티드 또는 콜라겐 펩티드 제제를 단리하기 위한 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 원심분리 방법, 특히 차등 원심분리 및/또는 밀도 구배 원심분리, 크로마토그래피 방법, 특히 겔 여과, 이온 교환, 친화성 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피, 전기 영동 방법, 여과 방법 및/또는 추출 방법을 의미하는 것으로 이해되며, 여기서 다중 성분을 함유하는 조성물로부터 관련 성분의 농축 및 정제는 바람직하게는 다중 단리 방법의 순차적 적용을 통해 달성될 수 있다.
본 발명에 따르면, "콜라겐 펩티드의 발현을 허용하는 조건"은 콜라겐 펩티드의 발현을 활성화시키거나 강화하는 조건, 예컨대 특히 온도, 압력, 시간, 빛 및 유도제 및/또는 억제제의 존재 또는 부재를 의미하는 것으로 이해된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 펩티드의 발현은 특히 고압, 바람직하게는 고압 공기 하에서 높은 세포 밀도 발효의 상황에서 일어난다. 콜라겐 펩티드의 발현을 가능하게 하는 특정 조건은 당업자에게 공지되어 있으며 사용된 발현 시스템 및 사용되는 발현 카세트, 특히 그 안에 함유된 프로모터에 따라 달라진다. 콜라겐 펩티드의 발현은 발현 카세트의 구조에 따라 구성적 또는 유도성 발현일 수 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "콜라겐 펩티드 제제의 생산으로 이어지는 조건 하에서 콜라겐 펩티드를 가수분해하는 것"은 분자량이 8 내지 100 kDa인 재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드로부터 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 수득할 수 있는 조건, 특히 가수분해 유형, 가능하게는 가수분해에 사용된 적어도 하나의 효소의 유형 및 양, pH 값, 가수분해 시간 및 가수분해 온도를 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 분자량이 8 내지 100 kDa인 재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드로부터 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 수득하기 위한 적합한 조건이 실시예 1에 명시되어 있다.
본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제에서 콜라겐 펩티드의 분자량 분포와 관련하여 인용된 백분율은 관련 콜라겐 펩티드 제제에 포함된 모든 콜라겐 펩티드에 대한 중량%에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, "포함하는" 및 "포함한"이라는 용어는 이들 용어에 의해 명시적으로 커버되는 요소 외에도 명시적으로 언급되지 않은 추가 요소가 부가될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명과 관련하여, 이들 용어는 또한 명시적으로 언급된 요소만이 포함되고 추가 요소가 존재하지 않음을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 특정 실시양태에서, 용어 "포함하는" 및 "포함한"의미는 용어 "이루어진"과 동의어이다. 추가로, 용어 "포함하는" 및 "포함한"은 또한 명시적으로 명명된 요소 외에 언급되지 않은 다른 요소를 포함하지만 기능적으로 및 정성적으로 부차적인 구성을 포함한다. 이 실시양태에서, 용어 "포함하는" 및 "포함한"은 용어 "본질적으로 구성되는"과 동의어이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "및/또는"은 용어 "및/또는"에 의해 연결된 그룹의 모든 구성원이 서로에 대한 대안으로서 뿐만 아니라 또한 서로에 대해 임의의 조합으로 누적적으로 개시됨을 의미하는 것으로 이해된다. 표현 "A, B 및/또는 C"는 a) A 또는 B 또는 C, 또는 b) (A 및 B), 또는 c) (A 및 C), 또는 d) (B 및 C), 또는 e) (A 및 B 및 C)를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
추가의 바람직한 실시양태가 종속항으로부터 발생한다.
본 발명이 도면, 표 및 관련 예시적인 실시양태를 참조하여 일반적인 발명 개념을 제한하지 않고 아래에서 설명된다.
도 1은 정의된 분자량 범위에서의 비교 제품 1 및 2의 개별 콜라겐 펩티드 및 실시예 1.3, 1.4 및 1.5에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 백분율을 보여준다.
도 2A는 비교 제품 1의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 2B는 비교 제품 2의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 3A는 실시예 1.3에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 3B는 실시예 1.4에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 4는 실시예 1.5에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 5는 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 100 kDa 콜라겐 펩티드 존재 (대조군 2), 평균 분자량이 1.8 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 1), 평균 분자량이 2.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 2) 또는 평균 분자량이 3.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 3)에서 일차 인간 섬유아세포의 콜라겐 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 100 kDa 콜라겐 펩티드 존재 (대조군 2), 평균 분자량이 1.8 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 1), 평균 분자량이 2.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 2) 또는 평균 분자량이 3.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 3)에서 일차 인간 섬유아세포의 엘라스틴 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 100 kDa 콜라겐 펩티드 존재 (대조군 2), 평균 분자량이 1.8 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 1), 평균 분자량이 2.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 2) 또는 평균 분자량이 3.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 3)에서 일차 인간 섬유아세포의 프로테오글리칸 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 8은 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 평균 분자량이 7 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 4), 평균 분자량이 5.6 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 5) 또는 평균 분자량이 1.3 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 6)에서 일차 인간 섬유아세포의 콜라겐 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 평균 분자량이 7 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 4), 평균 분자량이 5.6 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 5) 또는 평균 분자량이 1.3 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 6)에서 일차 인간 섬유아세포의 엘라스틴 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 평균 분자량이 7 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 4), 평균 분자량이 5.6 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 5) 또는 평균 분자량이 1.3 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 6)에서 일차 인간 섬유아세포의 프로테오글리칸 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 2A는 비교 제품 1의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 2B는 비교 제품 2의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 3A는 실시예 1.3에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 3B는 실시예 1.4에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 4는 실시예 1.5에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 1% 강도 용액의 크로마토그램을 보여준다. 분자량은 대수 눈금으로 가로 좌표에 표시된다.
도 5는 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 100 kDa 콜라겐 펩티드 존재 (대조군 2), 평균 분자량이 1.8 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 1), 평균 분자량이 2.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 2) 또는 평균 분자량이 3.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 3)에서 일차 인간 섬유아세포의 콜라겐 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 100 kDa 콜라겐 펩티드 존재 (대조군 2), 평균 분자량이 1.8 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 1), 평균 분자량이 2.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 2) 또는 평균 분자량이 3.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 3)에서 일차 인간 섬유아세포의 엘라스틴 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 100 kDa 콜라겐 펩티드 존재 (대조군 2), 평균 분자량이 1.8 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 1), 평균 분자량이 2.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 2) 또는 평균 분자량이 3.4 kDa인 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 3)에서 일차 인간 섬유아세포의 프로테오글리칸 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 8은 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 평균 분자량이 7 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 4), 평균 분자량이 5.6 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 5) 또는 평균 분자량이 1.3 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 6)에서 일차 인간 섬유아세포의 콜라겐 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 평균 분자량이 7 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 4), 평균 분자량이 5.6 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 5) 또는 평균 분자량이 1.3 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 6)에서 일차 인간 섬유아세포의 엘라스틴 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 콜라겐 펩티드 부재 (대조군 1), 0.5 mg/ml의 평균 분자량이 7 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 4), 평균 분자량이 5.6 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 5) 또는 평균 분자량이 1.3 kDa인 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제 존재 (샘플 6)에서 일차 인간 섬유아세포의 프로테오글리칸 합성 자극에 대한 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
실시예
실시예 1 - 콜라겐 펩티드 생산:
1.1
중성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 45 kDa 크기의 소 기원 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
0.789% 콜라겐 용액을 먼저 저온 유지 장치의 50 ml 병에서 50 ℃로 가열하였다. 그 다음에 200 ppm CaCl2x2H2O (콜라겐의 건조 물질 (TS) 기준)를 온도 조절된 콜라겐 용액에 첨가하고 10% NaOH 용액으로 용액의 pH 값을 6.2로 조정하였다. 다음 단계에서, 콜라겐 용액에 0.8% Sumizyme BNP-L (콜라겐의 TS 기준)을 첨가하였다.
180 분의 가수분해 시간 후 콜라겐 펩티드의 평균 분자량은 5.04 kDa로 측정되었다.
1.2
알카리성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 45 kDa 크기의 소 기원 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
0.792% 콜라겐 용액을 먼저 저온 유지 장치의 50 ml 병에서 63 ℃로 가열하였다. 그 다음에 200 ppm CaCl2x2H2O (콜라겐의 TS 기준)를 온도 조절된 콜라겐 용액에 첨가하고 10% NaOH 용액으로 용액의 pH 값을 7.75로 조정하였다. 다음 단계에서, 콜라겐 용액에 0.3% Alcalase 2.4L (콜라겐의 TS 기준)을 첨가하였다.
180 분의 가수분해 시간 후 콜라겐 펩티드의 평균 분자량은 3.01 kDa로 측정되었다.
1.3
알카리성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 25 kDa 크기의 인간 기원의 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
2.85% 콜라겐 용액을 먼저 저온 유지 장치의 50 ml 병에서 63 ℃로 가열하였다. 그 다음에 200 ppm CaCl2x2H2O (콜라겐의 TS 기준)를 온도 조절된 콜라겐 용액에 첨가하고 10% NaOH 용액으로 용액의 pH 값을 7.6으로 조정하였다. 다음 단계에서, 콜라겐 용액에 0.3% Alcalase 2.4L (콜라겐의 TS 기준)을 첨가하였다.
45 분의 가수분해 시간 후 콜라겐 펩티드의 평균 분자량은 1.8 kDa였다.
1.4
알카리성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 100 kDa 크기의 인간 기원의 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
먼저 50 ml 병에 있는 2.85% 콜라겐 용액을 저온 유지 장치에서 63 ℃로 가열하였다. 그 다음에 200 ppm CaCl2x2H2O (콜라겐의 TS 기준)를 온도 조절된 콜라겐 용액에 첨가하고 10% NaOH 용액으로 용액의 pH 값을 7.6으로 조정하였다. 그 후 0.4% Alcalase 2.4L (콜라겐의 TS 기준)을 콜라겐 용액에 첨가하였다.
45 분의 가수분해 시간 후, 용액은 2.4 kDa의 평균 분자량을 갖는 콜라겐 펩티드를 포함했다. 생성된 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제를 실시예 6에서 샘플 2로 사용하였다.
1.5
알카리성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 100 kDa 크기의 인간 기원의 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
1.5% 콜라겐 용액을 저온 유지 장치의 50 ml 병에서 63 ℃로 가열하였다. 그 다음에 200 ppm CaCl2x2H2O (콜라겐의 TS 기준)를 온도 조절된 콜라겐 용액에 첨가하고 10% NaOH 용액으로 용액의 pH 값을 7.6으로 조정하였다. 마지막으로 콜라겐 용액에 0.3% Alcalase 2.4L (콜라겐의 TS 기준)을 첨가하였다.
60 분의 가수분해 시간 후 콜라겐 펩티드의 평균 분자량은 1.8 kDa였다. 생성된 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제를 실시예 6에서 샘플 1로 사용하였다.
1.6
알카리성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 25 kDa 크기의 인간 기원의 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
2.85% 콜라겐 용액을 먼저 저온 유지 장치의 50 ml 병에서 63 ℃로 가열하였다. 그 다음에 200 ppm CaCl2x2H2O (콜라겐의 TS 기준)를 온도 조절된 콜라겐 용액에 첨가하고 10% NaOH 용액으로 용액의 pH 값을 7.6으로 조정하였다. 다음 단계에서, 콜라겐 용액에 0.1% Alcalase 2.4L (콜라겐의 TS 기준)을 첨가하였다.
60 분의 가수분해 시간 후 콜라겐 펩티드의 평균 분자량은 3.4 kDa였다. 생성된 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제를 실시예 6에서 샘플 3으로 사용하였다.
1.7 알카리성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 45 kDa 크기의 소 기원의 하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
5.53% 콜라겐 용액을 먼저 저온 유지 장치의 250 ml 유리 병에서 55 ℃로 가열하였다. 그 다음에 200 ppm CaCl2x2H2O (콜라겐의 TS 기준)를 온도 조절된 콜라겐 용액에 첨가하고 2% NaOH 용액으로 용액의 pH 값을 7.59로 조정하였다. 다음 단계에서, 콜라겐 용액에 0.2% Alcalase 2.4L (콜라겐의 TS 기준)을 첨가하였다.
150 분의 가수분해 시간 후 콜라겐 펩티드의 평균 분자량은 7 kDa로 측정되었다. 생성된 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제를 실시예 7에서 샘플 4로 사용하였다.
1.8
알카리성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 45 kDa 크기의 소 기원의 하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
5.00% 콜라겐 용액을 먼저 저온 유지 장치의 100 ml 유리 병에서 55 ℃로 가열하였다. 그 다음에 200 ppm CaCl2x2H2O (콜라겐의 TS 기준)를 온도 조절된 콜라겐 용액에 첨가하고 2% NaOH 용액으로 용액의 pH 값을 7.60으로 조정하였다. 이어서 콜라겐 용액에 0.25% NZ37071 (콜라겐의 TS 기준)을 첨가하였다.
240 분의 가수분해 시간 후 콜라겐 펩티드의 평균 분자량은 5.6 kDa였다. 생성된 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제를 실시예 7에서 샘플 5로 사용하였다.
1.9
알카리성 프로테아제를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 재조합적으로 생산된 45 kDa 크기의 소 기원의 하이드록실화 콜라겐 펩티드의 가수분해
실시예 1.7에 따라 수득된 콜라겐 펩티드 가수분해물로부터 출발하여, 가수분해물의 고 분자량 성분을 5000 Da의 크기 배제 막이 있는 농축기 (예를 들어, Vivaspin 20)로 제거하였다.
이렇게 수득한 콜라겐 펩티드의 평균 분자량은 1.3 kDa로 확인되었다. 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제를 실시예 7에서 샘플 6으로 사용하였다.
1.10
콜라겐 펩티드 가수분해물의 겔 크로마토그래피 분석
실시예 1.3 내지 1.5에서 수득한 콜라겐 펩티드 가수분해물 및 평균 분자량 2.3kDa 및 1.7kDa의 두 가지 시판 비교 제품의 분자량 분포를 겔 크로마토그래피 (독일에 소재하는 Knauer)로 측정하였다. WinGPC 소프트웨어 (독일 마인츠에 소재하는 PSS GmbH 사 제품)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 겔 크로마토그래피에 다음 파라미터가 사용되었다:
고정상: TSK 2000 SW XL (TOSOH Bioscience GmbH)
이동상: 0.4 mol/l 인산이수소나트륨, pH 5.3
유속: 0.5 ml/분
교정 표준: 정의된 콜라겐 1 형 단편 (FILK)
검출: 214 nm에서 UV 검출 (Knauer)
샘플 농도: 1%
다양한 콜라겐 펩티드 가수분해물에 대해, 표 1 및 도 1에 나타낸 개별 콜라겐 펩티드의 백분율이 정의된 분자량 범위에서 얻어졌다.
| 비교 제품 1 2.3 kDa |
비교 제품 2 1.7 kDa |
실시예 1.3 | 실시예 1.4 | 실시예 1.5 | |
| 개별 펩티드의 분자량 범위 (Da) |
백분율 wt.-% |
백분율 wt.-% |
백분율 wt.-% |
백분율 wt.-% |
백분율 wt.-% |
| < 500 | 5.81 | 13.09 | 2.72 | 2.47 | 3.26 |
| 1500 - 500 | 43.63 | 50.84 | 45.78 | 37.69 | 47.84 |
| 3500 - 1500 | 31.87 | 25.52 | 43.67 | 40.82 | 39.29 |
| 7500 - 3500 | 15.63 | 8.93 | 7.64 | 16.74 | 9.23 |
| 13500 - 7500 | 2.88 | 1.41 | 0.19 | 2.28 | 0.38 |
| > 13500 | 0.2 | 0.21 | 0 | 0 | 0 |
각각의 비교 제품 및 실시예 1.3 내지 1.5에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 1% 용액의 크로마토그램이 도 2 내지 4에 도시되어 있다. 더 좁은 분자량 분포, 고 분자량 펩티드 결여 및 본 발명에 따른 가수분해의 구현으로, 500 Da 미만 펩티드의 백분율이 현저하게 감소될 수 있으며 평균 분자량이 2 kDa 미만인 생성물을 달성할 수 있다. 동시에, 1500 내지 3500 Da 사이의 바람직한 크기 범위에 있는 펩티드 수가 상당히 증가한다. 1500 Da 초과 펩티드는 당업자에 의해 맛이 중립적인 것으로 분류되는데, 콜라겐 펩티드 제품의 쓴맛에 상당히 기여하는 것은 정확하게는 500 Da 미만의 저분자량 펩티드이다.
이러한 펩티드의 형성을 방지하는 것이 소비자에 의해 "중립적인" 맛으로 분류되는 감각적이고 관능적으로 우수한 콜라겐 펩티드를 생산하는 데 추가적인 이점이다. 이것은 3 내지 7 kDa 범위의 더 높은 평균 분자량을 갖는 제품에도 동일하게 적용된다.
상기 언급된 실시양태로부터, 본 발명에 따른 방법 및 이에 따른 가수분해를 위한 출발 물질로서 균일한 재조합 콜라겐 단편의 사용은 선택된 가수분해 조건에 따라 좁은 분자량 분포 내에서 보통 4 내지 6 사이에서 특징적인 피크를 갖는 바람직한 개별 펩티드의 형성을 가능하게 하는 것으로 추론될 수 있다 (도 3A, 도 3B, 도 4).
이러한 개별 펩티드의 형성은 출발 단편의 선택뿐 아니라 가수분해 조건을 통해 구체적으로 제어될 수 있는데, 이것은 비균질성으로 인해 동물 출발 물질을 사용하는 경우에는 거의 불가능하다.
실시예 2 - 콜라겐 단편의 생체 외 하이드록실화:
생체 외에서 콜라겐 단편의 번역 후 변형 (프롤린 잔기의 하이드록실화)을 위해, 보조 인자 α-케토글루타레이트, 철 (II) 이온 및 O2의 존재하에 특정 4-OH 프롤릴 하이드록실라제 (P4H)를 사용하고 비특이적 하이드록실라제의 사용을 또한 구상할 수 있다. 이를 위해, 총 1 mL 부피의 효소 용액과 14 mM α-케토글루타레이트, 0.5 mM 황산철(II) 및 50 mM MES 완충액 중 1.5 mM L-아스코르브산 (pH 6.5)의 존재하에 8 mM 콜라겐 단편을 서머믹서 (thermomixer)에서 37 ℃에서 14 내지 18 시간 동안 진탕시키면서 (300 RPM) 인큐베이션하였다. 대안적으로, 인큐베이션은 또한 전술한 조건 하에서 인큐베이터에서 수행될 수 있다.
실시예 3 - 조골세포 활성 (특히 뼈 건강):
뼈 건강 유지 및 뼈 질환의 예방 및 치료 측면에서 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 생물학적 효과를 분석하기 위해, 기질 구조 및 광물화에 역할을 하는 기질 단백질 및 효소의 합성에 대한 그의 자극 효과를 시험관 내에서 조골세포를 통해 검사하였다. 이는 실시간 PCR 및 반정량적 평가 (콜라겐 가수분해물이 없는 대조군 기준)를 통해 해당 mRNA의 발현을 결정하여 수행하였다.
이를 위해, 뼈 물질을 7 mg/ml 히알루로니다제 유형 I 및 III-S 및 5 mg/ml 프로나제가 보충된 행크스 용액에서 37 ℃에서 1 시간 동안 격렬한 교반하에 인큐베이션하여 무릎 관절에서 인간 조골세포를 먼저 단리하였다. 그 다음에 16 mg/ml 콜라게나제 유형 CLS IV가 보충된 행크스 용액에서 37 ℃에서 3-5 시간 동안 소화를 계속하였다. 수득된 일차 조골세포를 10% 송아지 태아 혈청, 20 U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 50 μg/ml 파트리신, 0.05 mg/ml 아스코르브산 및 0.15 mg/ml 글루타민이 보충된 Ham's F12 배지에서 효소적 소화 후 배양하였다. 대안적으로, 생물학적 효과를 조사하기 위해 일차 조골세포 (Article No. C-12760; 2019)를 독일 하이델베르크에 소재하는 PromoCell GmbH에서 입수할 수도 있다. 이어 세포를 10% 송아지 태아 혈청, 20 U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 50 μg/ml 파트리신 및 0.15 mg/ml 글루타민이 보충된 Ham's F12 배지에서 인큐베이션한다.
생물학적 효과를 조사하기 위해, 단리된 인간 조골세포의 단층 세포 배양물을 각 콜라겐 펩티드 제제 0.5 mg/ml가 보충된 배지에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군은 각 경우에 제제없이 배지에서 인큐베이션된다. 그 다음에 각 mRNA 발현을 결정하였다.
실시예 4 - 섬유아세포 활성 (특히 피부 건강):
실시예 4.1 - mRNA 합성 자극:
콜라겐 (I 형)과 프로테오글리칸류 비글리칸 및 베르시칸의 합성 자극을 인간 진피 섬유아세포 (피부 세포)에서 시험관 내에서 조사하였다. 이를 위해, 세포를 0.5 mg/ml의 저분자량 또는 본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제와 함께 24 시간 동안 인큐베이션한 다음, 콜라겐 RNA, 비글리칸 RNA 및 베르시칸 RNA의 발현을 실시간 PCR 및 반정량적 (제제없는 대조군 기준)으로 측정하였다.
실시예 4.2 - 결합 조직 단백질의 합성 자극:
본 발명에 따른 콜라겐 펩티드 제제를 통한 결합 조직의 단백질 합성 자극을 결정하기 위해, 효소적 소화 후 일차 인간 진피 섬유아세포를 먼저 10% FCS, 20 U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 50 μg/ml 파트리신, 0.05 mg/ml 아스코르브산 및 0.15 mg/ml 글루타민을 포함하는 HAM의 F12 배지에서 인큐베이션하였다. 80%의 합류점에 도달한 후, 각 배양 배지를 콜라겐 펩티드가 없는 배지 (대조군) 또는 시험할 콜라겐 펩티드 제제 0.5 mg/ml로 교체하고, 일차 인간 섬유아세포를 각 배지에서 적어도 14 일, 바람직하게는 14 내지 21 일, 특히 14 일의 기간 동안 인큐베이션하였다. 결합 조직의 상이한 단백질 발현을 적합한 분석법으로 결정하고 평가할 수 있다 (예를 들어, 실시예 6 및 7 참조).
실시예 5 - 연골세포 활성 (특히 연골 건강):
세포 배양을 위해, 돼지 또는 인간 연골세포를 공지 방식으로 연골 조직으로부터 단리하고 약 350,000 세포/cm2의 밀도로 배양 플레이트에 파종하였다. 10% 송아지 태아 혈청, 10 μg/ml 젠타마이신 및 5 μg/ml 암포테리신 B가 포함된 Ham's F12 배지를 배양 배지로 사용하였다. 10 μg/ml 젠타마이신의 대안으로 10 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신을 사용할 수도 있다. 배양은 산소가 감소된 대기 (5% O2, 5% CO2 및 90% N2)에서 37 ℃에서 수행되었다.
콜라겐 생합성 결정:
연골세포 (기본적으로 II 형)에 의해 합성된 콜라겐의 정량화를 콜라겐에 도입되는 14C-프롤린으로 방사성 표지하여 수행하였다.
14C-프롤린을 먼저 배양 배지에 첨가하고 연골세포를 결정 시점까지 이 조건에서 배양하였다. 검출 중에 도입된 14C-프롤린과 도입되지 않은 14C-프롤린을 구별할 수 있도록 하기 위해, 동위원소 함유 배양 배지를 3 일 동안 순수한 배양 배지로 교체하였다. 그 다음에 배양 배지를 버리고 부착 세포층을 증류수와 혼합하여 삼투 스트레스를 통해 세포막을 파괴하고 세포질의 결합되지 않은 14C-프롤린을 방출시켰다. 합성된 세포 외 기질이 있는 세포 파편을 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 펠릿을 신선한 증류수에 재현탁하고 자일렌 섬광 칵테일을 첨가하였다. 합성된 콜라겐의 양을 베타 카운터로 14C-프롤린을 검출하여 정량할 수 있다.
대안적으로, 정량화는 제조업체 지침 (실시예 6 및 7 참조)에 따라 Sircol Collagen Assay Kit (Article No. 054S5000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Germany 또는 Biocolor Ltd., UK)를 사용하여 수행할 수 있다.
프로테오글리칸 생합성 결정:
연골세포에 의해 합성된 프로테오글리칸을 프로테오글리칸 성분인 글리코사미노글리칸 (GAG)을 알시안 블루 염색하고 광도 측정하여 정량하였다.
세포 배양 시 GAG 함량을 결정하기 위해, 먼저 배양 배지를 버리고 부착 세포층을 PBS 완충액 (pH 7)으로 헹구었다. 그 다음에 세포를 PBS 중 10% 포름알데히드 용액에 4 ℃에서 2 시간 동안 고정하였다. 포름알데히드를 제거한 후, 알시안 블루 염색 시약 (3% 아세트산 중 5% 알시안 블루)을 세포밭에 적용하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 알시안 블루는 버리고 PBS로 3-4 회 조심스럽게 헹구어 씻어냈다. 산성 구아니딘 용액 (8 mol/l)을 첨가하여 GAG 복합체를 세포층에서 방출시켰다. 글리코사미노글리칸의 양을 620 nm의 파장에서 광도 측정하여 정량할 수 있다.
대안적으로, 정량화는 제조업체 지침에 따라 블리스칸 글리코사미노글리칸 분석 키트 (Article No. 054B3000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Germany 또는 Biocolor Ltd., UK)를 사용하여 수행할 수 있다 (실시예 6 및 7 참조).
실시예 6 - 본 발명에 따른 비-하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제를 통한 일차 인간 섬유아세포에서 콜라겐, 엘라스틴 및 프로테오글리칸의 합성 자극:
콜라겐, 엘라스틴 및 프로테오글리칸의 합성 자극을 결정하기 위해, 실시예 4.2에 따른 일차 인간 진피 섬유아세포를 콜라겐 펩티드 없이 (대조군 1), 그리고 0.5 mg/ml의 100 kDa 콜라겐 펩티드 (대조군 2), 평균 분자량 1.8 kDa의 콜라겐 펩티드 제제 (샘플 1), 평균 분자량 2.4 kDa의 콜라겐 펩티드 제제 (샘플 2) 및 평균 분자량 3.4 kDa의 콜라겐 펩티드 제제 (샘플 3) 중 하나의 존재 하의 배지에서 적어도 14 일, 바람직하게는 14 일 내지 21 일, 특히 14 일 동안 인큐베이션하였다.
실시예 6.1 - 콜라겐의 합성 자극 측정
일차 인간 진피 섬유아세포에 의한 콜라겐의 합성 결정을 제조업체 지침에 따라 Sircol 콜라겐 분석 키트 (Article No. 054S5000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Germany 또는 Biocolor Ltd., UK)를 사용하여 수행하였다. 실험 결과를 표 2 및 도 5에 나타내었다.
| 대조군 1 | 대조군 2 (분자량 = 100 kDa) |
샘플 1 (평균 분자량 = 1.8 kDa) |
샘플 2 (평균 분자량 = 2.4 kDa) |
샘플 3 (평균 분자량 = 3.4 kDa) |
|
| 평균 (OD450) | 1 | 1.01 | 1.2 | 1.24 | 1.21 |
| 표준 편차 | 0 | 0.01 | 0.07 | 0.1 | 0.06 |
실시예 6.2 - 엘라스틴의 합성 자극 결정
일차 인간 진피 섬유아세포를 통한 엘라스틴의 합성 결정을 제조업체 지침에 따라 파스틴 엘라스틴 분석법 (Article No. 054F2000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Germany 또는 Biocolor Ltd., UK)을 사용하여 수행하였다. 실험 결과를 표 3 및 도 6에 나타내었다.
| 대조군 1 | 대조군 2 (분자량 = 100 kDa) |
샘플 1 (평균 분자량 = 1.8 kDa) |
샘플 2 (평균 분자량 = 2.4 kDa) |
샘플 3 (평균 분자량 = 3.4 kDa) |
|
| 평균 (OD450) | 1 | 0.96 | 1.28 | 1.25 | 1.38 |
| 표준 편차 | 0 | 0.22 | 0.13 | 0.02 | 0.3 |
실시예 6.3 - 글리코사미노글리칸의 합성 자극 결정
일차 인간 진피 섬유아세포를 통한 글리코사미노글리칸 합성의 결정을 제조업체 지침에 따라 블리스칸 글리코사미노글리칸 분석법 (Article No. 054B3000, 2019, tebu-bio, Offenbach 또는 Biocolor Ltd., UK)을 사용하여 수행하였다. 실험 결과를 표 4 및 도 7에 나타내었다.
| 대조군 1 | 대조군 2 (분자량 = 100 kDa) |
샘플 1 (평균 분자량 = 1.8 kDa) |
샘플 2 (평균 분자량 = 2.4 kDa) |
샘플 3 (평균 분자량 = 3.4 kDa) |
|
| 평균 (OD450) | 1 | 1 | 1.28 | 1.26 | 1.2 |
| 표준 편차 | 0 | 0.09 | 0.08 | 0.08 | 0.06 |
실시예 7 - 본 발명에 따른 하이드록실화 콜라겐 펩티드 제제를 통한 일차 인간 섬유아세포에서 콜라겐, 엘라스틴 및 프로테오글리칸의 합성 자극:
콜라겐, 엘라스틴 및 프로테오글리칸의 합성 자극을 결정하기 위해, 실시예 4.2에 따른 일차 인간 진피 섬유아세포를 콜라겐 펩티드 없이 (대조군 1), 그리고 0.5 mg/ml의 평균 분자량 7.0 kDa의 콜라겐 펩티드 제제 (샘플 4), 평균 분자량 5.6 kDa의 콜라겐 펩티드 제제 (샘플 5) 및 평균 분자량 1.3 kDa의 콜라겐 펩티드 제제 (샘플 6)의 존재 하의 배지에서 적어도 14 일, 바람직하게는 14 일 내지 21 일, 특히 14 일 동안 인큐베이션하였다.
실시예 7.1 - 콜라겐의 합성 자극 결정
일차 인간 진피 섬유아세포를 통한 콜라겐 합성의 결정을 제조업체 지침에 따라 Sircol 콜라겐 합성 키트 (Article No. Article No. 054S5000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Germany 또는 Biocolor Ltd., UK)를 사용하여 수행하였다. 실험 결과를 표 5 및 도 8에 나타내었다. 비처리 대조군 (대조군 1)에 대해 확인된 평균값을 표준으로서 1로 표준화하였다.
| 대조군 1 | 샘플 4 (평균 분자량 = 7.0 kDa) |
샘플 5 (평균 분자량 = 5.6 kDa) |
샘플 6 (평균 분자량 = 1.3 kDa) |
|
| 평균 | 1 | 1.35 | 1.36 | 1.39 |
| 표준 편차 | 0 | 0.16 | 0.1 | 0.09 |
실시예 7.2 - 엘라스틴의 합성 자극 결정
일차 인간 진피 섬유아세포에 의한 엘라스틴 합성의 결정을 제조업체 지침에 따라 파스틴 엘라스틴 분석법 (Article No. 054F2000, 2019, tebu-bio, Offenbach, Germany 또는 Biocolor Ltd., UK)를 사용하여 수행하였다. 실험 결과를 표 6 및 도 9에 나타내었다. 비처리 대조군 (대조군 1)에 대해 확인된 평균값을 표준으로서 1로 표준화하였다.
| 대조군 1 | 샘플 4 (평균 분자량 = 7.0 kDa) |
샘플 5 (평균 분자량 = 5.6 kDa) |
샘플 6 (평균 분자량 = 1.3 kDa) |
|
| 평균 | 1 | 1.32 | 1.33 | 1.31 |
| 표준 편차 | 0 | 0.11 | 0.07 | 0.04 |
실시예 7.3 - 글리코사미노글리칸의 합성 자극 결정
일차 인간 진피 섬유아세포를 통한 글리코사미노글리칸 합성의 결정을 제조업체 지침에 따라 블리스칸 글리코사미노글리칸 분석 (Article No. 054B3000, 2019, tebu-bio, Offenbach 또는 Biocolor Ltd., UK)을 사용하여 수행하였다. 실험 결과를 표 7 및 도 10에 나타내었다. 비처리 대조군 (대조군 1)에 대해 확인된 평균값을 표준으로서 1로 표준화하였다.
| 대조군 1 | 샘플 4 (평균 분자량 = 7.0 kDa) |
샘플 5 (평균 분자량 = 5.6 kDa) |
샘플 6 (평균 분자량 = 1.3 kDa) |
|
| 평균 | 1 | 1.37 | 1.41 | 1.40 |
| 표준 편차 | 0 | 0.15 | 0.11 | 0.12 |
Claims (20)
- a) 분자량 8 내지 100 kDa 범위의 콜라겐 펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 적어도 하나 포함하는 발현 시스템을 제공하는 단계,
b) 상기 발현 시스템을 콜라겐 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계,
c) 콜라겐 펩티드를 수득하는 단계,
d) 상기 콜라겐 펩티드를, 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제의 생성으로 이어지는 조건 하에서 가수분해하는 단계, 및
e) 콜라겐 펩티드 제제를 수득하는 단계를 포함하는,
재조합 콜라겐 펩티드를 함유하는 콜라겐 펩티드 제제의 제조 방법. - 제1항에 있어서, 발현 시스템은 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 숙주 세포인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 콜라겐 펩티드는 척추동물, 특히 포유동물, 조류, 어류, 양서류, 파충류 또는 무척추동물의 콜라겐 펩티드인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시스템은 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 잔기 및 라이신 잔기를 하이드록실화할 수 있는 숙주 세포인 방법.
- 제4항에 있어서, 숙주 세포는 프롤릴 4-하이드록실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하고, 방법 단계 e)에서 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 수득되는 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 숙주 세포는 라이실 하이드록실라제 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하고, 방법 단계 e)에서 생체 내 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 수득되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시스템은 발현된 콜라겐 펩티드의 프롤린 잔기, 라이신 잔기 또는 프롤린 및 라이신 잔기의 하이드록실화를 유발할 수 없는 방법.
- 제7항에 있어서, 방법 단계 c)에서 수득된 콜라겐 펩티드는 방법 단계 d)를 수행하기 전에 방법 단계 x1)에서 하이드록실화되고, 방법 단계 e)에서 사전 용해적으로 (pre-lysally) 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 수득되는 방법.
- 제7항에 있어서, 방법 단계 d)에서 생성된 콜라겐 펩티드 제제는 방법 단계 d)를 수행한 후 방법 단계 x2)에서 하이드록실화되고, 방법 단계 e)에서 사후 용해적으로 (post-lysally) 생체 외 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제가 수득되는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 가수분해는 효소적 또는 산 촉매화된 가수분해인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 생산될 수 있는 콜라겐 펩티드 제제.
- 숙주 세포에서 분자량 8 내지 100 kDa 범위의 재조합적으로 생산된 콜라겐 펩티드를 가수분해하여 생산된, 평균 분자량이 1 내지 7 kDa이고 분자량이 0.1 내지 13.5 kDa 범위인 콜라겐 펩티드를 포함하는 콜라겐 펩티드 제제.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 비하이드록실화, 부분 하이드록실화 또는 완전 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 외에서 사전 용해적으로 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제 또는 생체 외에서 사후 용해적으로 하이드록실화된 콜라겐 펩티드 제제인 콜라겐 펩티드 제제.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈 건강의 유지 및 개선, 골다공증의 예방 및/또는 치료, 근감소증의 예방 및/또는 치료, 퇴행성 근육량 손실의 예방 및/또는 치료, 근력 향상, 미토콘드리아 활성 감소를 특징으로 하는 병리학적 상태의 예방 및/또는 치료, 특히 지구력 감소를 특징으로 하는 병리학적 상태의 예방 및/또는 치료, 체지방 감소 촉진, 체중 감소 및/또는 퇴행성 관절 질환의 예방 및/또는 치료, 연골 질환의 예방 및/또는 치료, 힘줄 및 인대 질환의 예방 및/또는 치료, 피부 질환의 예방 및/또는 치료, 창상 치료, 퇴행성 신경 질환의 예방 및/또는 치료, 치매의 예방 및/또는 치료, 알츠하이머 병의 예방 및/또는 치료, 정신 기능 저하를 특징으로 하는 병리학적 상태의 예방 및/또는 치료, 혈액-뇌 장벽의 기능 장애와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료, 장 질환의 예방 및/또는 치료, 심혈관계 질환의 예방 및/또는 치료 및/또는 치아 지지 장치의 질병의 예방 또는 치료를 위한 방법에 적용되는 콜라겐 펩티드 제제.
- 피부의 시각적 및 구조적 개선, 손발톱의 성장 촉진 및/또는 손발톱의 부서짐 감소, 모발의 시각적 및 구조적 개선, 미토콘드리아 수 및/또는 미토콘드리아 활성 증가, 지구력 기능의 향상 및/또는 지적 능력의 향상을 위한, 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 콜라겐 펩티드 제제의 비치료적 용도.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 콜라겐 펩티드 제제 및 적어도 하나의 첨가제를 포함하는 제품.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 콜라겐 펩티드 제제 및 적어도 하나의 식품 허용 첨가제를 포함하는 식품 보충제.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 콜라겐 펩티드 제제 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 콜라겐 펩티드 제제 및 적어도 하나의 피부-적합성 첨가제를 포함하는 화장품.
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