CN115844024A - 重组人源化胶原蛋白在制备可食用抗衰补水美白产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人源化胶原蛋白在制备可食用抗衰补水美白产品中的应用，所述的重组人源化胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生，含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。本发明首次将重组人源化胶原蛋白应用于可食用抗衰补水美白产品中，直接食用重组人源化胶原蛋白具有延缓衰老的功效，且其抗衰效果明显优于市售的动物来源胶原蛋白，无动物来源的腥味，同时其服用剂量仅是动物来源胶原蛋白肽的二十分之一。

Description

重组人源化胶原蛋白在制备可食用抗衰补水美白产品中的 应用

技术领域

本发明涉及一种重组人源化胶原蛋白在制备可食用抗衰补水美白产品中的应用，属于食品加工领域。

背景技术

皮肤衰老是一个复杂过程，受到内部因素(自然生理过程)以及外部因素(如光照、粉尘)的影响。随着人年龄的增长、生活方式的改变、外界环境的刺激，皮肤会逐渐老化。内源性老化表现为皮肤松弛、皱纹、缺乏弹性等；外源性老化常表现为色素斑形成、皮肤粗糙干燥、皮肤变黄等。

自由基学说是认可度最高的皮肤衰老学说，其指出人体内活性氧(ROS)的累积是导致衰老的一个重要原因。ROS主要包括自由基，阳离子和过氧化物。人体内的自由基处于动态平衡，氧化应激(oxidative stress)衰老学说认为活性氧均能破坏皮肤内部的动态平衡(即破坏活性氧产生和清除间的平衡)，进而引起细胞成分的损伤、细胞的结构和功能的破坏。皮肤含有大量皮脂，容易受活性氧、过氧化脂质等的影响，在不断与氧气接触，紫外线的照射下，引发自由基与皮肤的生物分子反应，造成皮肤过氧化的损伤和衰老。另外，紫外线等外源性因素会干扰皮肤成纤维细胞(FBs)内的基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)的表达，导致皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的降解，从而导致皱纹产生和皮肤弹性减小。

服用膳食补充剂，选用一些抗氧化的活性物质，如胶原蛋白或其肽等产品，已经成为人们保护皮肤、抗衰的方式。胶原蛋白是动物体内不同结缔组织中的主要结构蛋白，广泛地分布人体骨骼，肌腱，关节软骨以及皮肤中。胶原蛋白是皮肤细胞外基质重要组成部分，约占皮肤干重的80％，作为支撑基质，维持皮肤弹性与紧致。婴幼儿皮肤中，I型胶原蛋白占70-75％，III型胶原蛋白含量占18-21％。成年人皮肤，其中I型胶原蛋白占85％左右，III型胶原蛋白占15％。随着年龄的增加，胶原蛋白以每年1.5％速度减少，皮肤皱纹增加。已有大量研究表明摄入胶原蛋白可增加皮肤弹性，保持皮肤水分，抚平细纹，延缓皮肤衰老。以胶原蛋白为主要原料的护肤美容，延缓衰老的保健食品等产品日益受到消费者的关注。

目前，市面上口服美容的胶原产品大都是动物来源，如由猪、牛、鸡以及鱼类的皮和鳞片提取、酶解得到的，其工艺比较复杂，且动物来源的胶原蛋白存在潜在的重金属、兽药残留的风险，且对于海鲜类食物过敏的人群，服用后可能会出现过敏反应。专利CN109527587A将胶原蛋白肽粉与其他提取物等9种成份组成组合物，但其组成复杂且并未提及胶原蛋白的来源，组合依据及抗衰的功效验证。重组人源化胶原蛋白是基于人体皮肤Ⅲ型胶原蛋白的原始基因序列，优化选择其中水溶性强、生物活性高的部分进行密码子优化和拼接重组，得到全新的重组人源Ⅲ型胶原蛋白序列，由毕氏酵母基因工程菌构建和工业化表达。因此，重组人源化胶原蛋白没有携带病毒等污染的危险，进入人体产生的免疫反应会大大降低，而且水溶性极好，可加工性强，拓展了其应用范围。专利CN 113397998 A已经成功将其应用到护肤品中，表现了良好的抗衰老功效，但目前还没有重组人源化胶原蛋白应用到食品行业中的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人源化胶原蛋白在制备可食用抗衰补水美白产品中的应用。

本发明中，所述的重组人源化胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生，已在中国专利ZL 201110327865.5中充分公开。所述的重组人源化胶原蛋白含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。并在2021年，经GRAS专家组鉴定，公认为，使用毕赤酵母生产的该重组人源化胶原蛋白可以作为食品配料使用，且是安全的(GRAS)。

本发明中，所述的可食用抗衰补水美白产品为常见的可食用抗衰补水美白保健品或食品。

具体地，可食用抗衰补水美白保健品的剂型包括但不限于口服液、胶囊和片剂等。可食用抗衰补水美白食品的剂型包括但不限于饮料、糖果等。

更进一步地，可食用抗衰补水美白保健品的类型包括但不限于口服液、软胶囊、硬胶囊、咀嚼片和口含片等。可食用抗衰补水美白食品的类型包括但不限于固体饮料、果味饮料、直饮粉、泡腾粉、微泡粉、压片糖果、软糖或夹心凝胶糖果等。

具体地，本发明提供一种抗衰补水美白的胶原蛋白组合物，按重量百分比计由重组人源化胶原蛋白50～92.6％、透明质酸钠0.56～40％和橄榄果粉0.9～10％组成。

在本发明具体实施方式之一中，所述的抗衰补水美白的胶原蛋白组合物，按重量百分比计由重组人源化胶原蛋白50％、透明质酸钠40％和橄榄果粉10％组成。

本发明还提供含有上述组合物的直饮粉，按重量百分比计由上述胶原蛋白组合物13.4％，蔓越莓果汁粉5％，抗性糊精12％，赤藓糖醇69.6％组成。

在本发明具体实施方式之二中，所述的抗衰补水美白的胶原蛋白组合物，按重量百分比计由重组人源化胶原蛋白78.26％、透明质酸钠17.39％和橄榄果粉4.35％组成。

本发明还提供含有上述组合物的咀嚼片，按重量百分比计由上述胶原蛋白组合物34.5％、葡萄口味香精0.5％、异麦芽酮糖醇64％和硬脂酸镁1％组成。

在本发明具体实施方式之三中，所述的抗衰补水美白的胶原蛋白组合物按重量百分比计由重组人源化胶原蛋白96.15％、透明质酸钠2.88％和橄榄果粉0.96％组成。

本发明还提供含有上述组合物的咀嚼片，按重量百分比计由上述胶原蛋白组合物52％、山梨糖醇44.6％、白桃口味香精0.6％、重瓣红玫瑰花果粉1.5％、葡萄糖基甜菊糖苷0.3％和硬脂酸镁1％组成。

上述胶原蛋白组合物，利用重组人源化胶原蛋白的抗衰特性，与透明质酸钠、橄榄果粉组合，具有协同增效，超强抗氧化及补水作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明首次将重组人源化胶原蛋白应用于可食用抗衰补水美白产品中，发现重组人源化胶原蛋白作为食品或保健品直接食用，具有延缓衰老的功效；其作用方式主要是通过增加皮肤水分、减少脂褐素的生成、促进皮肤中成纤维细胞生长、刺激皮肤中胶原蛋白以及透明质酸的生成实现的；其作用机理为通过抗氧化以及抑制基质金属蛋白酶MMPS的蛋白表达，上调TIMP-1蛋白的表达，增加纤维原COLIA2蛋白的表达，从而增加蛋白的合成。

(2)本发明意外发现重组人源化胶原蛋白的抗衰效果明显优于市售的动物胶原蛋白，无动物来源的腥味，且其服用剂量可以仅为动物来源胶原蛋白肽的二十分之一。

附图说明

图1为各组的总胶原蛋白含量的变化图。

图2为各组的水份含量的变化图。

图3为各组的脂褐素含量的变化图。

图4为各组的透明质酸含量的变化图。

图5为各组的皱纹条数的变化图。

图6为各组的MDA含量的变化图。

图7为各组的SOD含量的变化图。

图8为各组的MMP-1蛋白表达量的变化图。

图9为各组的TIMP-1蛋白表达量的变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述。

实施例1

1、取昆明SPF小鼠60只，随机分成5组，每组12只，分别为对照组，衰老模型组，RHC(重组人源化胶原蛋白)低剂量组LRHC，按50mg/kg体重灌胃；RHC(重组人源化胶原蛋白)高剂量组HRHC，按1000mg/kg体重灌胃，以及市售胶原蛋白肽组(动物来源)，按1000mg/kg体重灌胃。

对照组小鼠每日于颈背处皮下注射0.85％生理盐水；模型组小鼠每日于颈背处皮下注射300mg/kg的D-半乳糖，其余各组每日皮下注射300mg/kg的D-半乳糖造模后，经口灌胃给药相应胶原蛋白干预物；实验累计共6周，定期称量小鼠体重，根据体重计算给药体积(0.1m1/10g)。

2、表征

(1)皮肤皱纹、含水量检测：试验结束后，小鼠背部皮肤脱毛(2*2cm)，采用皮肤测试分析仪检测皮肤皱纹、含水量变化。结果分别如图5、图2所示。

(2)皮肤组织中透明质酸、总胶原蛋白、脂褐素的含量检测：

使用1％巴比妥钠(3.5μl/g)麻醉各组小鼠，运用小鼠眼球摘除取血法将全血放置2mL EP管中，4℃冰箱内静置2h后，在低温冷冻离心机以3500r/min离心15min，取上清液分装并放置于-80℃冰箱内保存。

剪取2*2cm背部皮肤，剪去皮下组织，用预冷生理盐水冲洗干净，剪成2块，一块放置于固定液中，另一部分放于封口袋中于-80℃冰箱中冻存。

准确称取皮肤组织重量，按照重量(g)：体积1：9的比例，取组织块用预冷的生理盐水进行漂洗，滤纸擦干，称重，放入组织匀浆器中，然后加入9倍体积的预冷生理盐水，冰水浴条件下进行充分研磨，将研磨好的匀浆放入离心机离心，取上清液。

采用ELISA Kit分别检查皮肤组织中透明质酸、总胶原蛋白、脂褐素的含量。结果分别如图4、图1、图3所示。

(3)SOD活性检测：氮蓝四唑(NBT)光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。结果如图7所示。

(4)MDA生成量检测：用丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(微量法)检测。结果如图6所示。

(5)MMP-1、TIMP-1含量检测：Trozol法提取皮肤组织RNA，采用5×PrimeScript RTMaster Mix进行RT成cDNA，SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行qPCR，分别测定MMP-1、TIMP-1、。结果分别如图8和图9所示。

采用R 4.1.3软件，对数据进行统计分析，并使用TukeyHSD方法，进行组内统计学差别检验，p＝0.05。

3、实验结果及分析

图1-图4，可以看出来，相对于对照组，由D-半乳糖诱导的衰老组，其皮肤中胶原蛋白含量、水份含量、透明质酸的含量，都显著性地降低(p<0.05)，而表征由于衰老引起的生化指标——脂褐素的含量显著地增加，说明衰老模型组构建成功。相对于衰老组，服用胶原蛋白组，可以显著地增加皮肤水份和胶原蛋白的含量，增幅分别达17.5％，20％，且可以增加透明质酸的含量，低剂量组增幅达3％；会减少脂褐素的生成，降低幅度达39％(p<0.05)，且RHC有比较明显的剂量效应，且低剂量RHC改善效果与高剂量的市售产品效果，无统计学差异，而高剂量的RHC效果优于市售产品。

图5为皱纹条数的变化，相对于对照组，由D-半乳糖诱导的衰老组，其皮肤皱纹条数显著性地增加，说明衰老模型组构建成功。相对于衰老组，服用胶原蛋白组，可以显著地降低皱纹条数，降低幅度约达29.3％，且RHC有比较明显的剂量效应，且低剂量RHC改善效果与高剂量的市售产品效果，无统计学差异，而高剂量的RHC条数显著低于市售胶原组，说明RHC抗衰效果优于市售产品。

图6-9，显示抗氧化指标以及蛋白表达指标的变化，超氧化物歧化酶SOD含量的变化，相对于对照组，由D-半乳糖诱导的衰老组，其皮肤中SOD含量显著性降低，而衡量氧化损伤的重要指标，脂质过氧化产物MDA显著地增加(p<0.05)，说明衰老会引起氧化应激。相对于衰老组，服用胶原蛋白组，可以显著地降低氧化应激指标，且RHC有比较明显的剂量效应，且低剂量RHC改善效果与高剂量的市售产品效果，无统计学差异，而高剂量的RHC条数显著低于市售胶原组，说明RHC抗衰效果优于市售产品。

基质金属蛋白酶MMP家族中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9被视为修复损伤和减缓细胞凋亡中正常组织重构的重要因子，其表达过高，会引起胶原纤维，弹性纤维的破环；TIMP-1是基质金属蛋白酶的组织抑制剂，TIMPs家族抑制MMPs家族功能，两者共同维护细胞外基质稳态；衰老会引起细胞外基质失调，MMP-1表达上调，TIMP-1表达被下调、抑制，引起胶原纤维断裂，导致皱纹的出现。而服用胶原蛋白，可以改变紊乱，降低MMP-1蛋白的表达，激活TIMP-1蛋白表达，从而抑制胶原纤维的破环，另外刺激合成胶原COLA2基因的表达，增加胶原蛋白的含量。

实施例2

1.本实施例提供一种以胶原蛋白组合物为功效成分的抗衰美白补水的直饮粉。

(1)以重量占比计，重组人源化胶原蛋白组合物包括：重组人源化胶原蛋白50％，透明质酸钠40％，橄榄果粉10％。

(2)以重量占比计，直饮粉成品配方包括：重组人源化胶原蛋白组合物13.4％，蔓越莓果汁粉5％，抗性糊精12％，赤藓糖醇69.6％。

(3)直饮粉的制备方法如下：

(3.1)预混：根据配方比例称取重组人源化胶原蛋白25g，透明质酸钠20g，橄榄果粉5g，混合均匀，得重组胶原蛋白组合物。

(3.2)混合：称取重组人源化胶原蛋白组合物30g，蔓越莓果汁粉11.2g，抗性糊精26.9，赤藓糖醇157.1g，过20目筛，防止团块，混合均匀。

(3.3)灌装：将步骤2所得物料进行包装，1.5g/条，得成品，一天一次。

实施例3

1.本实施例提供一种以胶原蛋白组合物为功效成分的抗衰美白补水的咀嚼片。

(1)以重量占比计，重组人源化胶原蛋白组合物包括：重组人源化胶原蛋白78.26％，透明质酸钠17.39％，橄榄果粉4.35％。

(2)以重量占比计，咀嚼片成品配方包括：重组人源化胶原蛋白组合物34.5％，葡萄口味香精0.5％，异麦芽酮糖醇64％，硬脂酸镁1％。

(3)咀嚼片的制备方法如下：

(3.1)预混：根据配方比例称取重组人源化胶原蛋白54g，透明质酸钠12g，橄榄果粉3g，等量递增分散，混合均匀。得预混料A。

(3.2)混合：把预混料A和葡萄口味香精1g，异麦芽酮糖醇128g，等量递增分散，混合均匀。得预混料B。

(3.3)上述预混料B中加入硬脂酸镁2g，混合均匀。硬脂酸镁分散在颗粒表面起到润滑效果，总混时间应控制在3分钟以内，否则影响物料得可压性。

(3.4)压片：选择适合压片机模具，片重1g，一日一片。

实施例4

1.本实施例提供一种以胶原蛋白组合物为功效成分的抗衰美白补水的咀嚼片。

(1)以重量占比计，重组人源化胶原蛋白组合物包括：重组人源化胶原蛋白96.15％，透明质酸钠2.88％，橄榄果粉0.96％。

(2)以重量占比计，咀嚼片成品配方包括：重组人源化胶原蛋白组合物52％，山梨糖醇44.6％，白桃口味香精0.6％，重瓣红玫瑰花果粉1.5％，葡萄糖基甜菊糖苷0.3％，硬脂酸镁1％。

(3)咀嚼片的制备方法如下：

(3.1)预混：称取重组人源化胶原蛋白200g，透明质酸钠6g，橄榄果粉2g，等量递增分散，混合均匀。得预混料A。

(3.2)混合：把预混料A和白桃口味香精2.4g，重瓣红玫瑰花果粉6g，葡萄糖基甜菊糖苷1.2g，山梨糖醇178.4g，等量递增分散，混合均匀。得预混料B。

(3.3)上述预混料B中加入硬脂酸镁4g，混合均匀。硬脂酸镁分散在颗粒表面起到润滑效果，总混时间应控制在3分钟以内，否则影响物料得可压性。

(3.4)压片：选择适合压片机模具，片重1g，一日一片。

实施例4中重组人源化胶原蛋白含量最高，以实施例4样品为例检测片剂质量。

2.片剂性能检测

(1)硬度

过小的硬度对片剂的生产，运输和储存带来不变，因此对硬度的检测保证片剂的质量。检测方法如下：孟山都硬度计法——将药片立于两个压板之间，沿直径方向慢慢加压，刚刚破碎时的压力即为该片的硬度。取10颗片剂测量其硬度分别为99.96N，99.86N，90.89N，110.52N，86.34N，75.75N，104.47N，112.89N，116.52N，122.11N，去掉一个最小值和最大值的平均硬度为102.68N。一般认为能承受29.4-39.2的压力即认为合格。

(2)脆碎度

检测方法：取样品若干片使其总重大于6.5g，除去片剂表面脱落的粉末，精密称重，置于脆碎度测试仪的圆筒中，转动100次。除去脱落粉末，精密称重。未出现断裂，龟裂或粉碎片，且其减失重量不超过1％时，符合规定。

检测：称取样品若干，称量11.4866g，置于脆碎度测试仪的圆筒中，转动100次，去脱落粉末，精密称重11.4709，重量损失0.15％，合格。

Claims (10)

1.重组人源化胶原蛋白在制备可食用抗衰补水美白产品中的应用，其特征在于，所述的重组人源化胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生，含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的可食用抗衰补水美白产品为可食用抗衰补水美白保健品或食品。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的可食用抗衰补水美白保健品的剂型为口服液、胶囊或片剂；可食用抗衰补水美白食品的剂型为饮料或糖果。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的可食用抗衰补水美白保健品的类型为口服液、软胶囊、硬胶囊、咀嚼片或口含片；可食用抗衰补水美白食品的类型为固体饮料、果味饮料、直饮粉、泡腾粉、微泡粉、压片糖果、软糖或夹心凝胶糖果。

5.抗衰补水美白的胶原蛋白组合物，其特征在于，按重量百分比计由重组人源化胶原蛋白50～92.6％、透明质酸钠0.56～40％和橄榄果粉0.9～10％组成。

6.含权利要求5所述的抗衰补水美白的胶原蛋白组合物的直饮粉，其特征在于，按重量百分比计由权利要求5所述的胶原蛋白组合物13.4％，蔓越莓果汁粉5％，抗性糊精12％，赤藓糖醇69.6％组成。

7.根据权利要求5所述的胶原蛋白组合物，其特征在于，按重量百分比计由重组人源化胶原蛋白78.26％、透明质酸钠17.39％和橄榄果粉4.35％组成。

8.含权利要求7所述的抗衰补水美白的胶原蛋白组合物的咀嚼片，其特征在于，按重量百分比计由权利要求7所述的胶原蛋白组合物34.5％、葡萄口味香精0.5％、异麦芽酮糖醇64％和硬脂酸镁1％组成。

9.根据权利要求5所述的胶原蛋白组合物，其特征在于，按重量百分比计由重组人源化胶原蛋白96.15％、透明质酸钠2.88％和橄榄果粉0.96％组成。

10.含有权利要求9所述的胶原蛋白组合物的咀嚼片，其特征在于，按重量百分比计由权利要求9所述的胶原蛋白组合物52％、山梨糖醇44.6％、白桃口味香精0.6％、重瓣红玫瑰花果粉1.5％、葡萄糖基甜菊糖苷0.3％和硬脂酸镁1％组成。

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