KR20210090274A

KR20210090274A - 혈소판 풍부 혈장과 자가 유래된 트롬빈을 결합하여 얻을 수 있는 상처 치료용 젤

Info

Publication number: KR20210090274A
Application number: KR1020217020460A
Authority: KR
Inventors: 자넷 해드필드
Original assignee: 바이오테라피 서비시스 리미티드
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2021-07-19
Also published as: US11944667B2; IL283679A; CN113423420A; CY1124553T1; EP3749336A1; CA3122204C; JP2022516229A; EP3749336B1; AU2019394837A1; AU2019394837B2; CA3122204A1; GB2579630A; WO2020115503A1; DK3749336T3; ES2885802T3; GB201819987D0; JP7094593B2; KR20220035283A; SG11202105821VA; NZ776716A

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상처 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다; i) 전혈 샘플을 혈소판 풍부 혈장(PRP) 샘플, 혈소판 부족 혈장(PPP) 샘플 및 적혈구 샘플을 포함하는 다수의 샘플로 분류하는 단계에 있어서, 상기 PRP 샘플은 1-10%의 헤마토크리트 레벨을 갖고, ii) 자가 트롬빈을 생성하기 위해 PPP 및/또는 PRP 내에 존재하는 자가 프로트롬빈의 절단을 촉진하여 PPP 및/또는 PRP 샘플의 일부를 처리하는 단계, 및 iii) 상처 치료 조성물을 생성하기 위해, PRP 샘플을 PPP 샘플의 일부 및 단계 (ii)에서 생성된 트롬빈의 일부와 조합하는 단계를 포함하고, 여기서 단계 ii)는 15℃ 미만에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, PRP는 2 또는 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는다. 방법에 의해 생성된 상처 치료 조성물은 또한 만성 및 급성 상처 치료에 사용하기 위한 조성물로서 제공된다.

Description

혈소판 풍부 혈장과 자가 유래된 트롬빈을 결합하여 얻을 수 있는 상처 치료용 젤

본 발명은 상처 치료 조성물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 치료는 혈소판 풍부 혈장을 포함한다.

상처는 보통 신체의 신체적 상해로 인해 발생되며 전염병이나 기저 질환으로 인해 발생될 수도 있다. 상처는 일반적으로 만성 또는 급성으로 분류된다. 만성 상처는 상처 치유의 정상적인 단계를 거치지 않으며, 보통 예컨대, 당뇨병과 같은 상태와 관련이 있다. 급성 상처는 일반적으로 갑자기 가해지고(inflicted), 상처 치유의 정상 단계를 통해 예측 가능하고 예상되는 속도로 치유된다.

상처를 빠르고 효율적으로 치료해야 하는 필요성은 의료 행위에서 매우 중요하다. 예를 들어, 치유되지 않는 만성 상처는 당뇨병 환자의 사망률(mortality)과 이환율(morbidity)의 중요한 근원이며, 종종 상처가 치료될 수 없는 경우 팔다리(limb)를 절단해야(amputated) 하는 경우가 많다. 당뇨병 발병률(incidence)이 증가함에 따라 만성 상처에 대한 효과적인 치료법을 개발할 필요성이 증가하고 있다. 현재 영국에서는 매년 220만 건의 만성 상처가 연간 51-53 억 파운드의 비용으로 치료된다.

본 발명은 상처 치료 조성물을 함유하는 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 제조 방법에 관한 것이다. 이 조성물은 특히 만성 또는 급성 상처에 국소 적용에 적합하다.

상처 치료 조성물은 전혈 샘플로부터 생성되며, 혈액의 다양한 성분의 상처 치유 특성을 활용하고 향상시킨다. 전혈은 혈장에 현탁된 적혈구(erythrocytes), 백혈구(leukocytes) 및 트롬보사이트(thrombocytes)(혈소판)의 세가지 주요 유형의 세포를 포함한다. 적혈구는 적혈 세포(red blood cells)로서, 헤모글로빈을 함유하고 신체 주위에 산소를 운반한다. 백혈구는 타고난(innate) 및 적응성(adaptive) 면역 반응을 통해 감염과 싸우는 것에(combating) 관여하는 백혈 세포(white blood cells)이며 보통 혈소판으로 알려진 트롬보사이트는 손상 부위에서 출혈을 멈추는 지혈(haemostasis)/응고(clotting)에 기여한다.

혈소판은 혈소판 플러그(platelet plug)를 형성하여 출혈을 멈추게 함으로써 상처 치유 과정을 돕는다. 손상 부위가 감지되면 혈소판이 그 부위에 부착되기 시작하고, 예컨대 트롬빈과 같은 작용제에 의해 과립 물질을 방출하도록 활성화된다. 일단 과립 활성화가 일어나면 이것은 새로운 조직의 형성을 자극하고 상처 치유의 염증 단계를 시작하는 성장 인자의 방출을 자극한다.

PRP 기반 상처 치료는 현재 당업계에 알려져 있다. 그러나, 놀랍게도 본 발명자들은, PRP는 만성 또는 급성 상처의 치료에 특히 적합한 다양한 헤마토크리트 레벨로 생성될 수 있다는 것을 발견했다. 보다 구체적으로, 대략 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP는, 전혈 샘플로부터 실질적으로 모든 백혈구를 보유하고 특히 급성 상처 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 약 2%의 헤마토크리트 레벨로 생성된 PRP는, 실질적으로 백혈구가 없으며 만성 상처 치료에 특히 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 본 방법은 고농도의 혈소판으로 PRP를 생성할 수 있으며, 기준(baseline)의 4-6배의 혈소판 레벨(즉, 환자의 혈액 내에서 발견되는 혈소판의 농도)이 상처 치료의 사용에 가장 적합하다는 사실이 밝혀졌다. 전혈로부터 PRP 분획을 제조하기 위해 고안된 상업적 분리 시스템은 Degen et al (2016) The musculoskeletal Journal of Hospital for Special Surgery (HSSJ) vol 13 : 75-80에 의해 비교되었고, 본원에 참조로 포함된다.

본원에 기재된 발명은 자가 유래된 트롬빈을 가진 PRP와 조합함으로써 상처 치료용 젤을 생성하는 방법을 제공한다. 이 방법에서 PRP와 트롬빈은 모두 동일한 전혈 샘플로부터 유래되고, 자체로 그 젤은 완전 자가 상처 치료 조성물이다. 다른 유사한 상처 관리 젤이 생성되었다; 그러나, 이들은 면역 반응과 같은 합병증(complications)과 예컨대, 광우병(bovine spongiform encephalopathy)과 같은 감염의 전파를 초래할 수 있는 소의 트롬빈(bovine thrombin)을 사용한다. 또한, 소의 트롬빈은 영국과 같은 국가에서 사용하도록 승인되지 않았다. PRP를 자가 트롬빈과 결합함으로써 혈소판이 활성화되어 결과적으로 성장 인자, 사이토카인, 및 케모카인을 방출할 뿐만 아니라, 혈장 내에서 피브리노겐을 활성화시켜 피브린 매트릭스 스캐폴드를 형성한다. 성장 인자는 상처 치유 과정을 자극하는데 도움이 되며 피브린 세포 외 기질의 생성은 젤 일관성을 가져온다.

본 발명자들은 놀랍게도 저온에서 자가 트롬빈의 생성은 생성되는 상처 치료 젤의 농도(consistency)를 상당히 개선시킨다는 것을 발견했다. 생성된 젤은 거의 고체 농도를 가지고 있어 적어도 10분 동안 모양을 유지할 수 있고, 상처 적용시 48시간 이상 온전하게 유지되고 인사이트(insite)된다. 이것은 이 자가 스캐폴드에 조직을 통합하기 위한 매트릭스를 효과적으로 제공한다.

젤 농도를 더욱 안정화시키기 위해 아스코르브산(비타민 C)이 조성물에 포함될 수 있다. 아스코르브산은 또한 자유 라디칼 소거, 조직 보호, 콜라겐 합성 활성화(enabling)와 같은 추가적 이점을 제공하고, 아스코르브산은 항염증제(anti-inflammatory)이다.

본 방법은 자가 상처 치료 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 치료될 상처의 유형에 따라 조성물이 높은 비율의 백혈구를 포함할 수 있거나 실질적으로 백혈구가 없을 수 있다. 이와 같이 이 방법을 사용하면 치료될 상처의 유형에 잘 맞도록(tailored) 백혈구 레벨이 조정될 수 있으며 결과적으로 더 빠르고 효과적인 상처 치료 조성물을 얻을 수 있다. 이 조성물은 당뇨병 환자의 만성 상처 치료에 사용되어왔으며, 치료 과정 동안 n15 환자들의 파일럿 코호트(pilot cohort)에서 상처 부피의 평균 감소는 > 75%였다. 상처 봉합(closure)이 달성되는데 걸린 평균 시간은 상처 치료 조성물을 대략 5회 처리한 경우 17.9일이었다. 이 치료는 놀랍도록 개선된 상처 치료법을 제공한다.

본 명세서에서 명백하게 이전에 출판된 문서의 목록이나 논의는 그 문서가 최신 기술의 일부이거나 보통의 일반적인 지식이라는 것으로 인정되는 것으로 간주되어서는 안된다.

놀랍게도, 헤마토크리트 레벨이 1-10%인 PRP 샘플을 생성함으로써, 사용된 헤마토크리트 레벨에 따라 급성 또는 만성 상처에서 특히 효과적인 상처 치료 조성물이 생성될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 특히, 대략 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플은 급성 상처 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 상기 PRP는 높은 비율의 백혈구를 포함한다. 반면, 헤마토크리트 레벨이 대략 2%인 PRP 샘플은 만성 상처 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 상기 PRP는 실질적으로 백혈구가 없다. 또한, 본 발명자들은 헤마토크리트 레벨이 다양한 상처 치료 조성물이 상처의 치료 동안 순차적으로 사용될 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 만성 상처를 치료할 때 급성기(acute phase)를 유도하기 위해 괴사조직이 제거(debrided)될 수 있고, 우선 이 상처는 헤마토크리트 레벨이 8%인 조성물로 치료된다. 후속 상처 치료 시 헤마토크리트 레벨이 2%인 조성물이 사용된다. 이러한 치료의 조합은 상처 봉합 및 신속한 상처 치유를 달성하는데 특히 효과적인 것으로 나타났다. 시험에서 평균 5회 치료와 17.9일에 걸쳐 75%의 상처 부피 감소가 달성되었다. 특정 백분율의 헤마토크리트를 갖는 상처 치료 조성물에 대한 본원에서의 언급은, 자가 트롬빈 및 아스코르브산과 같은 부형제의 도입 전에 적절한 헤마토크리트 백분율로 생성된 PRP 제제로부터 생성된 조성물에 대한 언급이며, 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 상처 치료 조성물의 최종 헤마토크리트 백분율을 반드시 나타내지 않을 수 있다.

본 발명의 상처 치료 조성물을 형성하기 위해 PRP 샘플은 자가 트롬빈과 조합된다(따라서 트롬빈은 PRP와 동일한 공급원으로부터 유래된다). 이것은 특히 상처에 국소 적용하기에 적합한 젤 농도를 갖는 조성물을 생성한다. 본 발명자들은 놀랍게도 자가 트롬빈이 생성되는 온도는 최종 상처 조성물의 농도에 영향을 미칠 수 있음을 발견했다. 자가 트롬빈은 프로트롬빈을 트롬빈으로 절단함으로써 생성된다. 이 과정이 15℃ 미만의 온도에서 수행될 때 트롬빈과 PRP의 조합으로부터 얻어진 결과물 젤(resultant gel)은 유익한 특성을 갖는다. 예를 들어, 젤은 몰드(mould)로부터 제거되었을 때 대략 10분 동안 그 모양을 유지할 수 있는 거의 고체 농도를 가지며, 48시간 초과동안 그 위치 그대로(in situ) 온전하게 유지되어 해면상(cavernous) 치명적인(catastrophic) 상처를 효과적으로 채우고, 성장 인자와 세포 단백질의 장기 작용 방출을 위한 효과적인 매트릭스를 제공하는 것으로 나타났다. 이에 비해, 이전의 상처 관리 젤은 단지 최대 대략 60초 동안만 그 모양을 유지한다. 이론에 얽매이지 않고, 더욱 단단한 농도는 젤이 용해되기 전에 더 오랜 시간 동안 상처 내에서 유지될 수 있게 하여 장기간에 걸쳐 성장 인자를 방출할 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 특성은 본원에 제공된 실시예에서 알 수 있는 바와 같이 개선된 상처 치유로 이어진다.

또한, 젤의 더욱 단단한 농도는 상당한 조직 부피가 손실된 상처 치료에 특히 유익한 것으로 밝혀졌다. 이러한 경우, 젤은 그 모양을 유지할 수 있기 때문에 상처 주변 내에서 조직 재생을 일으킬 수 있는 스캐폴드를 제공한다.

따라서, 본 발명의 일 측면은 상처 치료 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은; i) 전혈 샘플을, 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma; PRP) 샘플, 혈소판 부족 혈장(platelet poor plasma; PPP) 샘플 및 적혈구 샘플을 포함하는 다수의 샘플로 분류하는 단계로서, 상기 PRP 샘플은 1-10%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 단계, ii) 자가 트롬빈을 생성하기 위해 PPP 및/또는 PRP 내에 존재하는 자가 프로트롬빈의 절단을 촉진하여 PPP 및/또는 PRP 샘플의 일부를 처리하는 단계, 및 iii) 상처 치료 조성물을 생성하기 위해 PRP 샘플을 PPP 샘플의 일부 및 단계 (ii)에서 생성된 트롬빈의 일부와 조합하는 단계를 포함하고, 여기서 단계 ii)는 15℃미만의 온도에서 수행된다.

일 구현예에서, 제1 측면의 단계 iii)은 또한 15℃ 미만의 온도에서 수행될 수 있는 것으로 예상된다(envisaged).

본 발명의 제2 측면은, 제1 측면의 방법에 의해 얻을 수 있는 상처 치료 조성물을 포함한다.

본 발명의 추가 측면은, 본 발명의 제1 측면에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 상처 치료 조성물을 투여함으로써 대상체에서 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 약물에(in medicine) 사용하기 위한, 더욱 특히는 상처 치료에 사용하기 위한 제2 측면에 따른 상처 치료 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 보다 명확하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 지금부터 첨부된 도면을 참조하여 실시예가 설명될 것이다.

도 1은 상처의 치료 중 취한 단계를 예시하는 순서도(flow chart)를 보여준다.
도 2는 급성으로 분류된 상처의 치료를 위해 취한 단계를 예시하는 순서도를 보여준다.
도 3은 만성으로 분류된 상처 치료를 위해 취한 단계를 예시하는 순서도를 보여준다.
도 4는 실시예 1에 요약된 프로토콜을 사용하여 상처 치료 조성물을 사용하여 치료된 환자 상처의 예시를 보여준다.
도 5는 실시예 1에 요약된 프로토콜을 사용하여 치료된 당뇨병 환자의 발 뒤꿈치에 있는 상처를 보여준다.
도 6은 Arthrex® Angel® 시스템을 사용하여 본 발명의 방법에 따라 전혈을 분류한 결과의 실례를 제공한다. 이것은 각 분획에서 일반적으로 발견되는 세포 유형과 PP로부터서 PRP를 통해 적혈구 부분까지 변화하는 헤마토크리트 레벨을 보여준다. 2% 및 7%의 헤마토크리트 레벨에 대해 대략적인 혈소판 레벨이 제공된다.
도 7은 실시예에서 사용된 Arthrex® Angel® 시스템의 PRP 산출의 실례를 보여준다. Arthrex® Angel® 시스템 PRP 산출과 전혈의 차이를 평가하기 위해, Arthrex® Angel® 시스템 PRP는 2%, 5%, 7%, 10% 및 15%의 헤마토크리트 설정에서 건강한 기증자 6명의 정맥혈(venous blood)로부터 준비되었다. 혈소판, 백혈구(WBC) 및 호중구(NE)의 농도(concentration)는 표준 완전 혈구 수(CBC)로 측정되었다.

본 발명의 제1 측면에 있어서,

i) 전혈 샘플을, 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma; PRP) 샘플, 혈소판 부족 혈장(platelet poor plasma; PPP) 샘플 및 적혈구 샘플을 포함하는 다수의 샘플로 분류하는 단계로서, 상기 PRP 샘플은 1-10% 레벨의 헤마토크리트를 갖는 단계,

ii) PPP 및/또는 PRP 내에 존재하는 자가 프로트롬빈의 절단을 촉진하여 자가 트롬빈을 생성하기 위해 PPP 및/또는 PRP 샘플의 일부를 처리하는 단계, 및

iii) 상처 치료 조성물을 생성하기 위해, 상기 PRP 샘플을 상기 PPP 샘플의 일부 및 단계 (ii)에서 생성된 트롬빈의 일부와 합하는 단계

를 포함하는, 상처 치료 조성물의 제조 방법에 있어서,

단계 ii)는 15 ℃ 미만의 온도에서 수행되는 것인, 방법이 제공된다.

본원에 사용된 용어 "전혈"은 당업계 중 하나이며 혈장, 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하는 조성물을 의미한다. 따라서, 전혈은 모든 천연 성분들을 함유하는 개인으로부터 채취된 신선한 혈액 샘플일 수 있다. 전혈 샘플은 또한 샘플의 응고를 방지하기 위해 시트레이트 또는 기타 적합한 완충액을 포함할 수 있다. 완충액은 약리학적으로 허용될 것으로 예상된다.

용어 "혈소판 풍부 혈장(PRP)"은 혈소판의 높은 비율 또는 농도(즉, 전혈보다 더 높은)를 함유하는 혈장을 의미한다; 또한 적혈구가 실질적으로 없다. PRP는 전혈 샘플을 분류(예를 들어 원심 분리에 의해)하여 제조되며 전혈 샘플에서 발견되는 농도보다 더 높은 농도의 혈소판을 함유한다. 본 발명의 제1 측면에 따르면, PRP는, 리터당 600 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 800 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 1000 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 1200 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 1400 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 1600 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 1800 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 2000 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 2200 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 2400 x 10⁹ 초과의 혈소판을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 제1 측면에 따르면, PRP는, 리터당 600 내지 2400 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 800 내지 2200 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 1000 내지 2000 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 1200 내지 1800 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 1400 내지 1600 x 10⁹ 혈소판, 또는 이들의 임의의 조합을 함유할 수 있다. "혈소판 부족 혈장(PPP)"은 전혈 샘플을 분류함으로써 생성되며 낮은 비율의 혈소판을 함유하는, 예를 들어, 리터당 1 x 10⁹ 미만의 혈소판, 또는 리터당 1 x 10⁸ 미만의 혈소판, 또는 리터당 1 x 10⁷ 미만의 혈소판을 의미한다.

이하에서 더 자세히 설명되는 바와 같이, PRP에서 최적의 혈소판 레벨은 단계 i)에서 PRP를 생성하기 위한 전혈의 분류로부터 직접 얻을 수 있거나, 단계 i) 후 PPP로 PRP를 희석한 후에 얻을 수 있다. 따라서, PRP에서 최적의 혈소판 농도는 자가 트롬빈(선택적 아스코르브산 포함)을 첨가하기 전에 얻어진다. Arthrex® Angel® 시스템의 산출의 실례는 도 7에서 제공된다.

본원에서 사용된 용어 "자가 트롬빈"은 PRP가 유래된 것과 동일한 전혈 샘플로부터 유래된 트롬빈을 의미한다.

본 발명의 제1 측면에 따라 생성된 상처 치료 조성물은 리터당 200 내지 2400 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 400 내지 2400 x 10⁹ 혈소판, 리터당 600 내지 2400 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 800 내지 2200 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 1000 내지 2000 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 1200 내지 1800 x 10⁹ 혈소판, 또는 리터당 1400 내지 1600 x 10⁹ 혈소판을 포함할 수 있다.

본 발명의 제1 측면의 특정 구현예에서, 방법은 트롬빈의 첨가와 동시에, 전에, 또는 후에 아스코르브산(비타민 C)을 상처 치료 조성물에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 아스코르브산은 0.5mM 내지 5mM, 바람직하게는 2mM 내지 4mM, 가장 바람직하게는 2.5mM 내지 3mM의 농도로 첨가된다. 본 발명의 제1 측면의 바람직한 구현예에서 아스코르브산(비타민 C)은 PRP 샘플에 첨가된다.

프로트롬빈의 트롬빈으로의 절단을 용이하게 하는데 적합하고 본 발명에서 사용하기에 적합한 당업계에 공지된 많은 방법이 있다. 본 발명의 제1 측면의 특정 구현예에서, 방법의 단계 ii)는 PPP 샘플 및/또는 PRP 샘플의 일부를 염화칼슘 및/또는 에탄올을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 에탄올에 염화칼슘을 포함하는 용액은 프로트롬빈의 트롬빈으로의 절단을 용이하게 하는데 특히 적합하다. 용액은 대략 5 내지 20% w/v 염화칼슘, 또는 대략 8 내지 15% w/v 염화칼슘을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 용액은 10% w/v 염화칼슘을 함유한다. 염화칼슘은 에탄올을 포함하는 용액에 존재할 수 있으며, 상기 용액은 대략 10 내지 30% v/v 에탄올, 또는 약 10 내지 20% v/v 에탄올을 함유할 수 있으며, 바람직하게 용액은 약 17% v/v 에탄올을 함유할 수 있다. 자가 트롬빈을 생성하기 위해 PPP 및/또는 PRP에 존재하는 자가 프로트롬빈의 절단을 용이하게 하기 위해 PPP 및/또는 PRP 샘플의 일부를 처리하는데 적합한 상업적으로 이용 가능한 키트가 있고, 이러한 키트의 비 제한적인 예로는 Biotherapy Services ActivAT 키트 및 Arthrex Thrombinator가 있다.

본 발명의 제1 측면에서 단계 ii)는 15℃ 미만의 온도에서 수행된다. 특히, 단계 ii)는 2℃ 내지 15℃, 4℃ 내지 15℃, 6℃ 내지 15℃, 8℃ 내지 15℃, 10℃ 내지 15℃ 또는 12℃ 내지 15℃의 온도에서 수행될 수 있다. 이 구현예에서 PPP 및/또는 PRP 샘플의 일부와 프로트롬빈 절단 반응에 필요한 용액은 15℃ 미만으로 냉각된다. 일반적으로, 이것은 얼음에 반응하기 전과 반응 중에 용액을 저장함으로써 달성될 수 있다. 이것은 더 낮은 온도에서 일어나는 절단 반응을 일으킨다. 트롬빈이 PRP와 결합되면, 혈소판이 활성화되어 젤이 형성된다. 더 높은 온도는 반응 속도를 증가시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 더 낮은 온도에서 절단 반응 수행이 더 단단하고 효과적인 젤을 만드는 트롬빈 샘플을 생성한다는 사실은 매우 놀랍다. 의심의 여지를 없애기 위해, 제1 측면의 단계 i)는 일반적으로 실온에서 수행될 것으로 예상된다. 전혈 샘플을 분류하는 적절한 방법은 당업계에 알려져 있다. 본 발명의 특별한 특징은 전혈 샘플을 분류하기 위해 원심 분리가 사용된다는 것이다. 분류 단계 동안 원심 분리는 두 단계로 수행될 수 있다. 초기 원심 분리 단계를 사용하여 적혈구를 다른 구성 요소와 분리한 다음, 두 번째 원심 분리 단계를 수행하여 혈소판을 분별하고 PRP를 형성할 수 있다. 초기 원심 분리 단계는 3,000 내지 4,500rpm에서, 바람직하게는 3,200 내지 4,000rpm에서, 더욱 바람직하게는 3,700rpm에서 수행될 수 있다. 두 번째 원심 분리 단계는 2,000 내지 3,500 rpm에서, 바람직하게는 2,500 내지 3,000 rpm에서, 더욱 바람직하게는 2,700 rpm에서 수행될 수 있다. 이러한 원심 분리 단계는 바람직하게는 Arthrex® Angel® 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.

분류 과정 동안 PRP 샘플은 고농도의 백혈구를 함유하는 PRP와 저농도의 백혈구를 함유하는 생성 PRP(producing PRP)를 하위 분류(sub-fractionate)할 것이다. 따라서, 다양한 레벨의 백혈구를 함유하는 PRP가 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "헤마토크리트 레벨"은 전혈 샘플로부터 분류된 PRP에 존재하는 백혈구의 대략적인 양을 의미한다.

다양한 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플을 생성하기 위해 PPP 샘플, PRP 샘플 및 적혈구 샘플을 구별할 수 있는 센서가 사용될 수 있다. 센서는 또한 백혈구가 많은 PRP 샘플과 백혈구가 적은 샘플을 구분할 수 있다. 적합한 센서에는 LED 센서가 포함된다. 또한 Magellan® 자가 혈소판 분리기, Biomet GPS® 혈소판 농축 시스템 및 Arthrex® Angel® 시스템을 포함하여 특정 헤마토크리트 레벨로 PRP를 생성하는데 적합한 상업적으로 이용 가능한 시스템이 많이 있다.

다양한 헤마토크리트 레벨을 갖는 다른 PRP 샘플을 생성함으로써, PRP에 존재하는 백혈구의 양을 변경할 수 있다. 높은 비율의 백혈구를 포함하는 PRP를 형성하려면, 전혈 샘플의 전체 백혈구의 80% 초과가 PRP에 존재할 것이고, 상기 PRP는 더 높은 헤마토크리트 레벨로, 예를 들어 5 내지 10% 헤마토크리트 레벨, 바람직하게는 7 내지 9% 헤마토크리트 레벨로 생성되어야 한다. 백혈구가 실질적으로 없는 PRP를 형성하려면, 전혈 샘플의 총 백혈구의 10% 미만이 PRP에 존재할 것이고, 상기 PRP는 낮은 헤마토크리트 레벨, 예를 들어, 1 내지 5% 헤마토크리트 레벨, 바람직하게는 1 내지 3% 헤마토크리트 레벨로 생성되어야 한다.

2%의 헤마토크리트 레벨로 생성된 PRP 샘플은 실질적으로 백혈구가 없을 것이고, 보다 구체적으로는 전혈 샘플의 전체 백혈구의 10% 미만이 PRP 샘플에 존재할 것이고, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 2% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만이다. 2%의 헤마토크리트 레벨로 생성된 PRP는 실질적으로 백혈구가 없을 것이고, 예를 들어 PRP는 리터당 12 x 10⁸ 미만의 백혈구, 또는 리터당 6 x 10⁸ 미만의 백혈구, 또는 리터당 3 x 10⁸ 미만의 백혈구, 또는 리터당 12 x 10⁷ 미만의 백혈구, 또는 리터당 6 x 10⁷ 미만의 백혈구, 또는 리터당 3 x 10⁷ 미만의 백혈구를 함유할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서 PRP 샘플은 대략 2%의 헤마토크리트 레벨을 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에서 PRP 샘플은 대략 1, 1.5, 2.5, 3, 3.5, 4 또는 4.5%의 헤마토크리트 레벨을 가질 수 있다.

대조적으로, 대략 8%의 헤마토크리트 레벨로 생성된 PRP는 전혈 샘플에서 존재하는 대부분의 백혈구를 포함하고, 보다 구체적으로 전혈 샘플로에서 전체 백혈구의 80% 초과가 PRP에 존재할 것이고, 바람직하게는 90% 초과, 더욱 바람직하게는 95% 초과가 PRP에 존재할 것이다. 8%의 헤마토크리트 레벨로 생성된 PRP는 전혈 샘플에서 존재하는 대부분의 백혈구를 포함하고, 예를 들어, 리터당 1 x 10⁹ 초과의 백혈구, 또는 리터당 3 x 10⁹초과의 백혈구, 또는 리터당 5 x 10⁹ 초과의 백혈구, 또는 리터당 10 x 10⁹ 초과의 백혈구를 포함할 수 있다. 바람직하게는 8%의 헤마토크리트 레벨로 생성된 PRP는 리터당 대략 1 x 10⁹ 내지 15 x 10⁹ 백혈구를 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 대략 3 x 10⁹ 내지 12 x 10⁹를 포함할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 특정 구현예에서 본 발명의 PRP 샘플은 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에서 PRP 샘플은 대략 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8.5, 9 또는 9.5%의 헤마토크리트 레벨을 가질 수 있다.

통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, "헤마토크리트" 레벨은 샘플 내 적혈구 농도의 직접적인 시각적 측정이다. 이것은 혈액 샘플 내의 백혈구 또는 혈소판의 레벨을 직접 측정하는 것은 아니지만, 인간 혈액 분획의 맥락에서 샘플 내의 백혈구 및/또는 혈소판 레벨과 직접적으로 관련이 있다. 이것은 본원에 기재된 바와 같이 Arthrex Angel System을 사용하여 분류된 전혈 내에서 헤마토크리트의 구배(gradient)를 보여주는 도 6에 설명되어 있다. 당업계에서 헤마토크리트 레벨은 보통 분류 후 혈액 성분의 반복 가능한 측정을 가능하게 하는 편리한 측정법으로 사용된다. 이것은 원하는 조성물의 혈액 분획들의 수집을 자동화할 수 있는 수단을 의미한다. 따라서, 당업계에서, 헤마토크리트 측정은 원하는 레벨의 혈소판을 갖는 농축된 혈소판 샘플의 자동화된 수집을 허용한다. 헤마토크리트 레벨은 헤마토크리트의 레벨이 명확하게 구별되고 반복 가능하고 예측 가능하므로 수동 및 컴퓨터에 의해 PRP 분획들의 수집을 가능하게 한다. 혈소판 레벨을 직접 측정하는 보다 침습적인(invasive) 수단은, 환자의 상처에 빠르게 적용될 수 있는 상처 치료 조성물을 신속하게 생성하기 위한 방법인 본 발명의 맥락에서 적절하지 않을 것이다. 헤마토크리트 측정은 혈액 샘플과의 임의의 직접적인 접촉이나 임의의 요소들의 추가가 필요하지 않은데, 실시예에서 사용된 장치에 의해 수행되는 것처럼 광학 측정(광 흡수 차이 감지)으로 간단히 수행될 수 있기 때문이다. 따라서, 헤마토크리트는 혈소판 레벨의 대리(surrogate) 마커이고 그 의미 및 목적은 당업자에 의해 쉽게 인식될 것이다.

본 발명자들은 PRP 샘플 내에 존재하는 최적 레벨의 혈소판이 있음을 추가로 발견했다. 가장 효과적인 PRP 혈소판 농도는 기준 혈소판 레벨의 4 내지 6 배 사이인 것으로 밝혀졌으며, 기준 혈소판 레벨은 전혈 샘플에서 발견된 것이다. 따라서 PRP 샘플에 기준 혈소판 레벨의 4 내지 6배 초과하여 포함된다면, PPP 샘플을 사용하여 PRP 샘플이 희석될 수 있다. 이것은 자가 트롬빈 및 아스코르브산과 같은 부형제를 포함하기 전에 PRP 샘플이 기준 혈소판 레벨의 4배 및 6배를 포함하도록 보장할 것이다.

따라서, 상기의 관점에서 이해되는 바와 같이, 본 발명의 방법의 단계 iii)에서 PPP 샘플의 일부를 PRP 샘플과 결합하는 주요 목적은, 활성화된 트롬빈과 결합하기 전에, 최적의 혈소판 레벨을 갖는 PRP 샘플을 달성하는 것이다. 따라서, PPP는 추가 처리 전에 PRP(농축된 PRP)를 희석하는 데 사용될 수 있다. 트롬빈과 결합하기 전 PRP 내의 최적 혈소판 레벨은 환자와 치료될 상처에 따라 다르다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 개체들은, 예를 들어 자연적 기질(disposition) 또는 질병으로 인해 더 높은 레벨의 혈소판을 나타낸다. 반대로, 일부 개체들은, 예를 들어 자연적인 기질 또는 질병으로 인해 혈소판 레벨이 낮아진다. 따라서, 본 발명의 방법 및 방법에 의해 제조된 상처 치료 조성물은 환자의 혈액 내 혈소판의 자연 레벨에 따라 환자에 맞게 조정될 수 있으며, 이는 발명의 방법의 첫 번째 단계에서 생성된 농축된 PRP의 부피에 영향을 준다. 상기에서 설명된 바와 같이, 트롬빈(및 선택적으로 아스코르브산)의 첨가 전 PRP 내의 혈소판 레벨은 개별 환자에서의 기준 혈소판 레벨의 대략 4 내지 6 배가 되는 것이 바람직하다. 일부 예에서, 본 발명의 방법의 단계 i)에서 생성된 PRP는 지속적인 처리에 대하여 허용되는 혈소판 레벨을 갖을 것이지만(예를 들어 환자가 낮은 혈소판 레벨을 갖는 경우), 대부분의 경우 단계 i)에서 생성된 PRP는 원하는 혈소판 레벨보다 높을 것이다. 이 경우 PPP를 사용하여 PRP는 원하는 혈소판 레벨로 희석될 수 있다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 방법에 의해 생성된 PRP 내의 혈소판 농도는, 예를 들어 Arthrex® Angel® 시스템을 사용한 방법에서 생성되는 농축된 PRP의 부피와 무관하다. 오히려, 부피는 처리 전 전혈 샘플 내의 혈소판 양을 나타낸다. 따라서 PRP는 거의 고정된 혈소판 농도에서 생성되지만 PRP의 부피는 다양하다. Arthrex® Angel® 시스템에 의해 생성된 PRP의 혈소판의 농도는 리터당 3600 x 10⁹ 혈소판의 영역 내이다. 예를 들어, 혈액에 리터당 100 x 10⁹의 혈소판을 갖는 환자는 대략 1 ml의 농축된 PRP를 생성할 수 있고, 그 다음 PPP의 추가에 의해 6 ml로 다시 희석되어 대략 리터당 600 x 10⁹의 혈소판을 갖는 희석된 PRP 용액을 생성할 것이다(6x 기준). 혈액 내에 리터당 대략 400 x 10⁹의 혈소판을 갖는 환자는 대략 4 ml의 농축된 PRP를 생성할 것이고 그 다음 이것을 다시 6 ml로 희석하여 리터당 대략 2400 x 10⁹의 혈소판을 갖는 희석된 PRP 용액을 생성할 것이다(6x 기준). 따라서, 자가 트롬빈을 첨가하기 전에 PRP 일부 내의 혈소판 농도는 일반적으로 전혈의 기준 혈소판 레벨의 4 내지 6배, 바람직하게는 6 배이다.

트롬빈을 첨가하기 전 PRP 내에서 혈소판의 최적 레벨은 리터당 대략 600 x 10⁹ 내지 1400 x 10⁹ 혈소판으로 예상된다. 바람직하게는 리터당 대략 600 x 10⁹ 내지 1200 x 10⁹ 혈소판, 리터당 대략 600 x 10⁹ 내지 1000 x 10⁹ 혈소판, 리터당 대략 600 x 10⁹ 내지 800 x 10⁹ 혈소판, 리터당 대략 800 x 10⁹ 내지 1400 x 10⁹ 혈소판, 대략 리터당 800 x 10⁹ 내지 1200 x 10⁹ 혈소판 또는 리터당 대략 800 x 10⁹ 내지 1000 x 10⁹ 혈소판. 따라서, 본 발명의 방법은 트롬빈(및 선택적으로 아스코르브산)을 첨가하기 전에, 단계 iii)에서 최적 레벨의 혈소판을 PRP 샘플에 제공하는 것을 포함한다.

2% 및 7% 헤마토크리트 설정에서 전혈과 비교된 Arthrex® Angel® 시스템 PRP의 혈소판 밀도는, 다른 상용 기계와 비교하여 상기에서 언급된 Degen et al (2017)의 표 2에 제공된다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 상처 치료 조성물은 리터당 200 내지 2,600 x 10⁹ 혈소판, 바람직하게는 리터당 600 내지 2,400 x 10⁹ 혈소판, 더욱 바람직하게는 리터당 1,000 내지 2,000 x 10⁹ 혈소판의 혈소판 레벨을 포함한다.

본 발명의 제1 측면에 따라 생성된 상처 치료 조성물은 0.5 내지 10%, 또는 1 내지 8%의 최종 헤마토크리트 레벨을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따라 생성된 상처 치료 조성물은 0.5 내지 5%, 0.5 내지 4%, 0.5 내지 3% 또는 0.5 내지 2%의 최종 헤마토크리트 레벨을 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따라 생성된 상처 치료 조성물은 4 내지 10%, 4 내지 9%, 4 내지 8%, 4 내지 7%, 또는 4 내지 6%의 최종 헤마토크리트 레벨을 포함한다.

본 발명에 따르면 자가 생성된 트롬빈은 PRP와 결합된다. 트롬빈은 PRP 샘플 내에서 혈소판을 활성화시키는 작용제 역할을 하여 성장 인자를 방출한다. 따라서 이러한 성장 인자는 본 발명의 상처 치료 조성물 내에 존재할 수 있으며, 존재하는 성장 인자의 비제한적인 예에는, 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF-AB), 형질 전환 성장 인자 베타 1(transforming growth factor beta 1, TGF-B1), 인슐린-성장 인자(insulin-like growth factors, IGF-1 IGF2), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 유래 혈관 신생 인자(platelet-derived angiogenesis factor, PDAF), 혈소판 유래 표피 성장 인자(platelet-derived epidermal growth factor, PDEGF), 혈소판 인자 4(platelet factor 4, PF-4), 산성 섬유아세포 성장 인자(acidic fibroblast growth factor, FGF-A), 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, FGF-B), 형질 전환 성장 인자 α(transforming growth factor α, TGF-A), β 트롬보글로불린 관련 단백질(β thromboglobulin-related proteins, BTG), 트롬보스폰딘(thrombospondin, TSP), 피브로넥틴(fibronectin), 폰 윌린 브란트 인자(von Willinbrand's factor, vWF), 피브로펩티드 A(fibropeptide A), 피브리노겐, 알부민, 플라스미노겐 활성제 억제제 1(plasminogen activator inhibitor 1, PAI-1), 오스테오넥틴(osteonectin), 활성화시 조절되는 정상 T 세포 발현 및 추정 분비(regulated upon activation normal T cell expressed and presumably secreted, RANTES), gro-α, 비트로넥틴(vitronectin), 피브린 D-이량체(fibrin D-dimer), 인자 V(factor V), 항 트롬빈 III(antithrombin III), 면역 글로불린-G(IgG), 면역 글로불린-M(IgM), 면역 글로불린-A(IgA), a2-마크로글로불린(a2-macroglobulin), 안지오게닌(angiogenin), Fg-D, 엘라스타아제(elastase), 각질 세포 성장 인자(keratinocyte growth factor, KGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF) 및 인터루킨-1(interleukin-1, IL -1) 및 이들의 조합을 포함한다. 이러한 성장 인자들은 시너지 효과를 발휘하여 상처 치유 촉진을 돕는다.

본 발명의 제2 측면은, 본 발명의 제1 측면에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 상처 치료 조성물을 포함한다.

본 발명의 제2 측면의 특별한 특징은 혈소판 풍부 혈장(PRP), 트롬빈 및 아스코르브산을 포함하는 상처 치료 조성물이며, 상기 조성물은 리터당 200 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 400 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 600 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 800 x 10⁹ 초과의 혈소판, 또는 리터당 1,000 x 10⁹ 초과의 혈소판을 포함한다.

본 발명의 제2 측면에 따른 조성물의 일 구현예에서 PRP 및 트롬빈은 단일 개체로부터 얻어진 전혈 샘플로부터 생성된다.

본 발명의 상처 치료 조성물은 상처 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 구현예에서 본 발명의 상처 치료 조성물은 급성 또는 만성 상처의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다.

본 발명자들은, 예를 들어 1 내지 5%의 낮은 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플로부터 생성된 본 발명에 따른 상처 치료 조성물은 만성 상처 치료에 효과적이라는 것을 발견하였다. 보다 구체적으로 대략 2%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP로부터 생성된 상처 조성물은 놀랍게도 만성 상처 치료에 사용하기에 특히 효과적이다. 따라서, 본 발명의 상처 치료 조성물의 이러한 구현예는 1 내지 5%, 바람직하게는 2%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플로부터 생성될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 1 내지 5%, 바람직하게는 2%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플로부터 형성된 상처 치료 조성물은 이를 필요로 하는 환자에서 만성 상처를 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "만성 상처"는 상처 치유의 정상 단계를 통해 진행되지 않고 종종 치유의 염증 단계에 남아있는 상처를 의미한다. 발생할 수 있고, 본 발명의 조성물로부터 이익을 얻을 수 있고, 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 만성 상처의 비제한적인 예는, 당뇨병성 족부 궤양(diabetic foot ulcers), 정맥성 하지 궤양(venous leg ulcers) 및 욕창(pressure ulcers)을 포함한다.

또한 더 높은 헤마토크리트 레벨, 예를 들어 5 내지 10%를 갖는 PRP 샘플로부터 생성된 본 발명에 따른 상처 치료 조성물은 급성 상처 치료에 효과적이다. 보다 구체적으로 대략 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP로부터 생성된 상처 조성물은 특히 급성 상처 치료에 사용하기에 효과적이다. 이와 같이, 본 발명에 따른 상처 치료 조성물의 구현예는 5 내지 10%, 바람직하게는 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플로부터 생성될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 5 내지 10%, 바람직하게는 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플로부터 형성된 상처 치료 조성물은 이를 필요로 하는 환자에서 급성 상처를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "급성 상처"는 시간이 지남에 따라가 아니라, 갑자기 발생하는 상해 또는 손상을 지칭하는데 사용된다. 만성 상처는 변연절제술(debridement)과 같은 과정을 거쳐 급성 상처로 유도될 수 있는데, 여기서 죽은 조직이나 손상된 조직이 상처로부터 제거되어 건강한 조직을 나타낸다. 이것은 상처를 혈액에 노출시켜 자연 치유를 자극한다. 이러한 과정은 만성 상처 치료 동안 보통 사용되며 숙련자는 적절한 방법을 알고 있을 것이다.

본 발명의 상처 치료 조성물은 바람직하게는 일단 생성되면 젤 농도로 고형화 된다. 따라서, 몰드는 치료될 상처에 젤의 모양을 맞추기 위해 사용되거나 치료될 상처와 임상의의 선호도에 따라 특정 크기 또는 모양으로 절단될 수 있다. 본 발명의 상처 치료 조성물은 이전의 조성물보다 더 안정된 구조를 갖기 때문에, 젤을 절단하거나 성형하여 특정 상처에 맞추는 것이 더 쉽다.

본 발명의 일 구현예는 본 발명의 상처 치료 조성물을 적용하여 상처를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 치료의 과정에 걸쳐 상처 치료 조성물의 다중 적용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상처는 더 높은 헤마토크리트 레벨 예를 들어 5 내지 10%를 갖는 PRP 샘플로부터 생성된 상처 치료 조성물의 적용이 뒤따르는 변연절제술을 겪을 수 있다. 이 상처는 더 낮은 헤마토크리트 레벨 예를 들어 1 내지 5%를 갖는 PRP 샘플로부터 생성된 상처 치료 조성물을 적용함으로써 후속 치료를 받을 수 있다. 본 발명의 추가적 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 상처 치료 조성물을 투여함으로써 대상체에서 상처를 치료하는 방법이다. 따라서, 본 발명에 따른 대상체에서 상처를 치료하는 방법은

i) 치료될 대상체로부터 전혈 샘플을 채취하는 단계,

ii) 전혈 샘플을 혈소판 풍부 혈장(PRP) 샘플, 혈소판 부족 혈장(PPP) 샘플 및 적혈구 샘플을 포함하는 다수의 샘플로 분류하는 단계로서, 상기 PRP 샘플은 1-10%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 단계,

iii) 자가 트롬빈을 생성하기 위해 PPP 및/또는 PRP 내에 존재하는 자가프로트롬빈의 절단을 촉진하여 PPP 및/또는 PRP 샘플의 일부를 처리하는 단계,

iv) 상처 치료 조성물을 생성하기 위해 PRP 샘플을 PPP 샘플의 일부 및 단계 (iii)에서 생성된 트롬빈의 일부와 조합하는 단계로서, 상기 상처 치료 조성물은 리터당 600 x 10⁹ 초과의 혈소판 레벨을 포함하는 것인 단계, 및

v) 상기 상처 치료 조성물을 치료할 대상체의 상처에 적용하는 단계로서, 단계 iii)은 15℃미만의 온도에서 수행되는 것인 단계

를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상처 치료 방법은, 예를 들어 8%의 높은 헤마토크리트 PRP 샘플로부터 생성된 본 발명의 상처 치료 조성물로, 처음에 만성 상처를 제거하여 깨끗한 상처 베드를 노출시키는 것, 이를 급성 상처로 효과적으로 전환시키는 것, 또는 처음에 급성 상처를 치료하는 것을 포함할 수 있다. 그리고, 다음의 치료 단계에서, 상처 치유의 초기 급성기가 종료되고 상처가 만성으로 간주될 때, 본 발명의 방법은 예를 들어, 2%의 더 낮은 헤마토크리드 레벨을 갖는 PRP 조성물로부터 생성된 본 발명의 상처 치료 조성물을 적용하는 것을 포함할 수 있다. 이 두 번째 단계의 다수의 적용은 상처의 만족스러운 치유가 이루어질 때까지 적절하게 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가 구현예는 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플로부터 생성된 본 발명에 따른 상처 치료 조성물을 투여함으로써 대상체의 급성 상처를 치료하는 방법이다. 따라서, 본 발명의 추가 구현예는 2%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP 샘플로부터 생성된 본 발명에 따른 상처 치료 조성물을 투여함으로써 대상체의 만성 상처를 치료하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 측면은 상처 치료용 약제의 제조에 있어서 상처 치료 조성물을 사용하는 것이며, 상기 상처 치료 조성물은 다음 방법에 의해 얻을 수있다;

i) 전혈 샘플을 혈소판 풍부 혈장(PRP) 샘플, 혈소판 부족 혈장(PPP) 샘플 및 적혈구 샘플을 포함하는 다수의 샘플로 분류하는 단계로서, 상기 PRP 샘플은 1-10%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 단계;

ii) 자가 트롬빈을 생성하기 위해 PPP 및/또는 PRP 내에 존재하는 자가 프로트롬빈의 절단을 촉진하여 PPP 및/또는 PRP 샘플의 일부를 처리하는 단계; 및

iii) 상처 치료 조성물을 생성하기 위해 PRP 샘플을 PPP 샘플의 일부 및 단계 (ii)에서 생성된 트롬빈의 일부와 조합하는 단계; 및

상기 단계 ii)는 15℃ 미만의 온도에서 수행된다.

본 발명은 또한 약물에 사용하기 위한, 특히 본원에 제시된 바와 같은 만성 또는 급성 상처 치료에 사용하기 위한 제2 측면에 따른 상처 치료 조성물을 제공한다.

본 발명의 이전 측면과 관련하여 기재된 모든 구현예는 적절한 경우 본 발명의 선행하는 측면에 동일하게 적용되도록 의도된다.

다음 실시예들은 본 발명을 설명한다;

실시예 1

다음 실시예는 예를 들어 당뇨병 환자의 상처를 치료할 때 취한 단계를 설명한다.

단계 1

헤마토크리트 레벨이 8%인 PRP가 첫 번째 치료에 사용하기 위해 생성된다. 상처는 괴사 조직(necrotic tissue)을 외과적으로 변연절제하여 '외과적으로 새로운' 신선한 급성 상처 베이스를 노출한다. 상처 치료 조성물은 다음의 제형에 따라 제조된다. 이 제형은 부피 측정(volumetrically)을 조정하도록 설계되었으며 부피가 두배로 증가하여 >7000mm³ 초과의 상처를 치료한다.

i. 52 mL의 전혈에서 처리된 5 mls PRP. PRP는 전혈 샘플 내에서 발견되는 5-6x 혈소판 농도를 함유한다.

ii. 0.75 mL 아스코르브산 500 mg/5 ml USP 추가

iii. 2 mL 자가 트롬빈을 추가하여 PRP/아스코르브산 액을 젤로 활성화

첫 번째 치료는 농축된 혈소판과 많은 '복용량(dose)'의 백혈구를 함유한다. 이 단계는 과자극(hyperstimulation) 치료라고 지칭될 수 있다. 젤과 상처를 덮기 위해 옵사이트(Opsite)와 같은 반 폐쇄 드레싱이 사용될 수 있다.

단계 2

두 번째 치료는 48시간 후에 수행된다. 두 번째 치료 및 후속 치료에는 2%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 PRP가 사용된다. 후속 치료는 매주/7 일마다 실시된다. 2% 헤마토크리트 레벨을 사용하여 >98% 백혈구를 PRP에서 제거되고 다음의 제형에 따라 상처 치료 조성물이 생성된다.

i. 52 mL의 전혈에서 처리된 5 mL PRP. PRP는 전혈 샘플 내에서 발견되는 5-6x 혈소판 농도를 함유한다.

ii. 0.75 mL 아스코르브산 500 mgs/5ml USP 추가

iii. 2 mL 자가 트롬빈을 추가하여 PRP/아스코르브산 액을 젤로 활성화한다.

상처가 주당 >30%의 상처 봉합 개선을 나타내지 않는 경우, 8%의 헤마토크리트 레벨의 급성 제형을 사용하여 상처가 치료되어야 한다.

이 접근법은 임상 설정에서 만성 상처의 반복적이고 강력한 치료를 가능하게 한다.

실시예 2

임상 설정에서 15명의 환자의 18개의 상처가 치료되었다. 5명은 노출된 뼈/힘줄(tendon)/연골(cartilage)과 함께 광범위한 조직 손실을 보였고; 3명은 신기능대치요법(renal replacement therapy)을 받고; 4명은 말초신경병증(peripheral neuropathy)이 심했고, 4 명은 깊은 골수염(osteomyelitis)을 가졌고, 1명은 섭식 장애와 관련된 심각한 영양 결핍이 있었다. 치료 시작(commencement) 시 평균 상처 부피: 8203.3 mm³(범위 141.3-41257.2 mm³). 상처는 실시예 1에 설명된 방법론을 사용하여 치료되었다. PRP 치료 완료 시 평균 상처 부피: 2783.2 mm³(범위 0.5-28809 mm³). 치료 완료 시 평균 상처 부피 감소: 75%. PRP 치료 시작 후 상처 치유가 >90%인 총 일수: 17.9 일(범위 6-40 일). 치료 후 외과적 개입은 주요 절단(amputation)을 받은 1명의 환자에게 필요했다; 나머지는 추가 개입 없이 퇴원했다.

도 4는 이 연구에서 치료된 환자 상처의 예시를 보여주며, 표 1은 치료 과정에서 상처 부피의 감소와 <90% 상처 치유에 걸린 일수를 자세히 보여준다.

표 1

실시예 3

당뇨병 환자는 상처의 외과적 변역절제술과 발뒤꿈치 부분의 골수염 제거를 받았다. 이어서 이 상처는 본 발명의 상처 치료 조성물로 치료되었다. 14일에 걸쳐 세번의 치료가 시행되었다.

14일 동안 곡선 부피 감소는 -36581.2 mm³(-90.7%)였다. 부피 변화는 -417.3 mm³(-30.8%)로, 상처는 상처를 닫기 위해 조직을 과립화하고 재생함에 따라 부피가 증가하는 것을 보여준다. 상처 영역의 감소는 -1051.1 mm²(-25.8%)였습다. 치료 과정에서 상처 치유의 이미지는 도 5에 나타난다.

상처 치료 조성물은 본 발명에 따라 생성되었다. 이하의 표는 15℃ 미만의 온도에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하는 것은 상처 케어 치료의 주요 특성 중 일부에 미치는 영향을 보여준다.

혈소판, 호중구 및 백혈구 농도는 시작 레벨의 요인으로 표현된다.

Claims

상처 치료 조성물의 제조 방법에 있어서, 상기 방법은;
i) 전혈 샘플을, 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma; PRP) 샘플, 혈소판 부족 혈장(platelet poor plasma; PPP) 샘플 및 적혈구 샘플을 포함하는 다수의 샘플로 분류하는 단계로서, 상기 PRP 샘플은 1-10% 레벨의 헤마토크리트를 갖는 단계,
ii) PPP 및/또는 PRP 내에 존재하는 자가 프로트롬빈의 절단을 촉진하여 자가 트롬빈을 생성하기 위해 PPP 및/또는 PRP 샘플의 일부를 처리하는 단계, 및
iii) 상처 치료 조성물을 생성하기 위해, 상기 PRP 샘플을 상기 PPP 샘플의 일부 및 단계 (ii)에서 생성된 트롬빈의 일부와 합하는 단계
를 포함하고, 상기 단계 ii)는 15 ℃ 미만의 온도에서 수행되는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
단계 iii)은 15 ℃ 미만의 온도에서 수행되는 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 트롬빈의 첨가와 동시에, 전에, 또는 후에 아스코르브산을 상기 상처 치료 조성물에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 PRP 샘플은 8%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 PRP 샘플은 2%의 헤마토크리트 레벨을 갖는 것인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 상처 치료 조성물은 600 내지 2,400 x 10⁹ 혈소판/L의 혈소판 레벨을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 상처 치료 조성물.
제7항에 있어서,
상처, 선택적으로 만성 또는 급성 상처의 치료에 사용하기 위한, 상처 치료 조성물.
제4항의 방법에 의해 얻을 수 있는, 상처 치료 조성물.
제9항에 있어서,
급성 상처의 치료에 사용하기 위한, 상처 치료 조성물.
제5항의 방법에 의해 얻을 수 있는, 상처 치료 조성물.
제11항에 있어서,
만성 상처의 치료에 사용하기 위한, 상처 치료 조성물.
제11항에 있어서,
제9항에 기재된 상처 치료 조성물로 이전에 치료된 적이 있는 상처를 치료하는데 사용하기 위한, 상처 치료 조성물.
상처를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은, 제9항에 기재된 상처 치료 조성물을 상처에 적용하는 것과, 제11항에 기재된 상처 치료 조성물을 상처에 1회 이상 적용하는 것을 포함하는, 상처를 치료하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 제11항에 기재된 상처 치료 조성물이 매주 적용되는 것인, 방법.