KR20210089366A

KR20210089366A - 인체 체온 기반 유전자 증폭법에 의한 인삼뿌리썩음병원균의 검출용 프라이머 세트, 이를 포함한 증폭용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법

Info

Publication number: KR20210089366A
Application number: KR1020200002436A
Authority: KR
Inventors: 최호윤; 박미경; 이동환
Original assignee: 크로마흐 주식회사
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2021-07-16

Abstract

본 발명은 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머트 세트를 이용하면, 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 감염 여부를 고가의 장비 없이 높은 민감도 및 특이도로 빠르게 식별할 수 있어, 인삼뿌리썩음병 진단을 용이하게 할 수 있다.

Description

인체 체온 기반 유전자 증폭법에 의한 인삼뿌리썩음병원균의 검출용 프라이머 세트, 이를 포함한 증폭용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법 {The Primer set for detection of Cylindrocarpon destructans in ginseng by Human Body Temperature Amplification, the composition for amplification comprising it and the method of detection using thereof}

본 발명은 인체 체온 기반 유전자 증폭법에 의한 인삼뿌리썩음병원균의 검출용 프라이머 세트, 이를 포함한 증폭용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

인삼(Panax ginseng)은 다년생의 반음지성 숙근초(宿根草)로 오가피과에 속하며 생육적온은 20 ℃ 전후로 주로 북반구의 극동지방에 자생하거나 재배되며 우리나라의 주산지는 경기 북부지역과 풍산 및 금산 지방이다. 인삼의 주 약리성분은 사포닌으로서 자양강장, 면역증강, 피로회복, 중추신경계 조절, 항스트레스, 항당뇨, 항종양 활성 등의 우수한 효능이 밝혀짐에 따라 그 소비가 증가추세에 있다.

이러한 인삼은 다년생 식물체로 4~6년 동안 동일한 토양에서 장기간 재배해야 하고, 인삼을 수확한 후에는 다른 작물을 재배하지 않고 1~2년간 경작 예정지를 관리한 후 다시 인삼을 경작하는 연작 방식으로 재배된다. 이러한 경작 방식으로 인하여 각종 병해에 의한 피해가 매우 크며, 연작 장해가 발생될 가능성이 매우 높은 실정이다.

즉, 인삼은 한번 심은 땅에 10년 이상 재배가 어려운 대표적인 연작 장해 식물로 인삼을 재배하는 초작지의 경우 평균 15~30% 정도 뿌리가 썩는 증상이 나타난다. 인삼에서 연작장해를 일으키는 병해 중 대표적인 것이 뿌리썩음병인데, 뿌리썩음병의 주요 병원균으로는 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)를 들 수 있다.

인삼뿌리썩음병의 초기 증상은 잎가장자리가 붉게 변하거나 잎이 안쪽으로 오므라드는 증상을 보이다가 고사하며, 이와 같은 증상을 나타내는 뿌리는 끝 또는 중간 부분에 적갈색 또는 흑갈색 병반을 형성하며, 적갈색으로 변색되어 부패한다. 또한 인삼뿌리썩음병은 묘삼에서부터 6년생까지 모든 연생에서 발생하며 고년생으로 갈수록 발생이 많아지는 등, 국내 인삼 재배 농가에서 가장 큰 문제로 손꼽히고 있다.

현재까지 개발된 인삼뿌리썩음병원균 진단 키트는 진단 시간이 4~5일 정도 소요되며, 선택 배지를 사용하여 자체 배양이 진행되므로 배양 중 증가되는 인삼뿌리썩음병원균의 증가분을 정확히 계산하기 어려운 문제점을 가진다. 이에 따라, 인삼뿌리썩음병원균의 감염 및 감염 수준을 정확하게 진단할 수 없는 큰 문제점이 존재한다. 또한, 분자 진단으로 주로 사용되는 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase chain reaction)은 숙련된 전문가와 고가의 실험장비가 필요하며, 신속한 진단이 불가능하다는 문제점을 내포하고 있다.

이에 따라, 보다 빠르고 정확하게 인삼뿌리썩음병원균의 존재 여부를 검출하기 위한 프라이머 세트 등의 개발이 필요한 실정이며, 또한 고가의 실험장비 없이 무전력으로 유전자 증폭이 가능한 기술 및 이를 이용한 검출 방법에 대한 연구 개발 역시 필요한 실정이다.

등록특허공보 제10-0518776호 등록특허공보 제10-1959737호

본 발명자들은 위와 같은 선행기술들의 문제점을 해결하고자, 종 특이적으로 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)의 감염을 높은 민감도로 빠르게 식별할 수 있는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 인삼뿌리썩음병원균 감염의 진단 방법을 개발하였다.

이에 따라, 본 발명은 보다 빠르고 정확하게 고가의 장비 없이 검출이 가능한 체온 기반 유전자 증폭법에 의한 인삼뿌리썩음병원균의 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2 로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans) 검출용 프라이머 세트를 포함하는 혼합액으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및

(c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균 포함 여부를 식별하는 단계;를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 인삼뿌리썩음병원균의 검출방법은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계;를 포함한다.

상기 시료는 통상적으로 인삼뿌리썩음병원균의 포함 여부의 식별이 필요한 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 바람직하게는 인삼(Panax ginseng) 시료일 수 있다.

시료로부터 DNA를 수득하는 것은 통상의 알려진 DNA 수득 방법을 이용할 수 있다. 출발물질이 gDNA인 경우 gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 출발물질이 mRNA인 경우에는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수도 있다. 예를 들어, 상기 DNA 분리는 통상적으로 시료에서 제노믹 DNA(Genomic DNA, gDNA)를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 퀴아젠(Qiagen)사의 DNeasy mini kit 등의 상업적으로 판매되는 DNA 분리 키트 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 인삼(Panax ginseng) 시료일 수 있다.

본 발명의 인삼뿌리썩음병원균의 검출방법은 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2 로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans) 검출용 프라이머 세트를 포함하는 혼합액으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;를 포함한다.

진핵생물에서 ITS(internal transcribed spacer)는 28S LSU (제2 유전자), 5.8S(제 3유전자), 18S SSU (제1 유전자) ribosomal RNAs에 coding된다. non-coding region의 염기서열은 coding된 유전자들을 분리하여 2가지의 ITS를 가진다. 즉, ITS-1은 18S 유전자 (small subunit rDNA)와 5.8S 유전자 사이에서 위치하고 ITS-2는 5.8 유전자와 28S 유전자 (large subunit rDNA) 사이에 위치하고 있다.

본 발명의 "프라이머"는 복제하려는 핵산가닥에 상보적인 단일가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 진단하고자 하는 병원균(예컨대, 인삼뿌리썩음병원균)의 핵산 가닥에 상보적으로 결합할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 뜻하며, 병원균의 DNA 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있다.

상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야한다. 상기 프라이머의 길이는 25 ~ 45 뉴클레오티드, 바람직하게 30 내지 40 뉴클레오티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에서는 바람직하게 중합효소 연쇄 반응에 사용되는 프라이머는 30염기(base pair) 이상으로 구성되는 것이 바람직하다. 상기 프라이머의 서열은 병원균의 DNA 주형가닥과 부분적으로 상보적일 수 있으나, 보다 정확한 검출 결과를 위하여 병원균의 DNA 주형가닥과 완벽하게 상보적인 것이 바람직하다고 할 수 있다. 이 때, Primer F는 Primer Foward를 뜻하며, 복사하고자 하는 DNA 주형 가닥의 5' 말단부터 전사시킬 수 있고, Primer R은 Primer Reverse를 뜻하며, 복사하고자 하는 DNA 주형 가닥의 3' 말단부터 전사시킬 수 있다.

본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다. 본 명세서에서 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다.

본 발명의 "실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)”은 목표 DNA분자의 증폭과 양의 측정을 동시 실시하는 방법으로, DNA샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위하여, 실시간 중합효소연쇄반응은 검출과 양의 측정을 할 수 있는 방법이다. 계량은 절대적인 복제 수 또는 상대적인 양을 셀 수 있다.

본 발명에서, 체온 기반 유전자 증폭법(HBTA, Human Body Temperature Amplification)은 이중가닥 DNA(ds-DNA)를 해리시키고, 동시에 DNA Polynerase와 특정 primer를 사용하여, 원하는 DNA를 인간 체온 범위(예컨대, 35~38℃)에서 증폭시키는 기술이다. 즉, 본 발명에 따른 검출용 프라이머 세트는 등온 반응 조건으로 35~38℃의 인체 체온 범위에서 증폭 반응을 수행함으로써, 빠른 시간 내에 정확하고 고가의 장비 없이 간편하게 병원균을 검출할 수 있는 장점을 가진다.

상기 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트는 인삼뿌리썩음병원균 gDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로, 바람직하게는 시료 DNA에 포함된 ITS-1 및 ITS-2의 일부 DNA 서열을 증폭할 수 있는 염기서열을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

이러한 서열번호 1, 2 각각을 아래와 같이 기재하였다.

서열번호 1: TCCGTAGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCG

서열번호 2: CGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAG

본 발명에서는 ITS(Internal transcribed spacer)-1 및 ITS(Internal transcribed spacer)-2 유전자 부위의 일부를 증폭 대상으로 선정하였다. 바람직하게 상기 증폭되는 DNA 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

즉, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머는 시료 DNA에 포함된 ITS(Internal transcribed spacer)-1 및 ITS(Internal transcribed spacer)-2 유전자부위의 일부를 증폭하는 것일 수 있다. 바람직하게 상기 증폭되는 DNA 서열은 서열번호 3의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, PCR을 수행하는 단계는 인체 체온 기반 유전자 증폭법(Human Body Temperature Amplification)이 사용되는 것일 수 있다.

체온 기반 유전자 증폭법(Human Body Temperature Amplification)은 원하는 DNA를 체온(예컨대, 35~38℃)에서 증폭을 수행함으로써, 고가의 장비 없이도 빠르고 정확하게 병원균의 유무를 확인할 수 있다. 특히, 35~38℃의 온도에서 반응을 수행하여, 병원균의 유무를 확인할 수 있기 때문에, 진단시간을 대폭 줄이면서 정확한 검출을 수행할 수 있게 한다.

즉, 본 발명에 따른 방법은 체온에서 수행되는 증폭을 이용하는 체온증폭법이며, 체온에서 유전자를 증폭하기 때문에 고가의 전문장비 없이 손쉽게 유전자 증폭을 가능하게 한다.

본 발명의 인삼뿌리썩음병원균의 검출방법은 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균 포함 여부를 식별하는 단계;를 포함한다.

상기 증폭된 PCR 산물의 식별은 DNA 칩. 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, PCR 산물 분석은 PCR 산물의 크기 분석을 포함하는 단편 분석(fragment analysis)를 수행하는 것 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 산물 분석은 PCR 산물의 크기 분석을 포함하는 단편 분석(fragment analysis)를 수행하는 것 일 수 있다. 상기 PCR 산물의 크기 분석은 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 크기를 분석하여 수행하는 분석방법을 의미하는 것으로, 바람직하게는 PCR 산물의 크기가 약 210 내지 230염기쌍(베이스페어; base pair; bp), 구체적으로 218 bp일 경우, 시료는 인삼뿌리썩음병원균을 포함하는 것으로 식별할 수 있다.

상기 PCR 수행을 통해 증폭된 PCR 산물은 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방산선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.

증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다.

또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, PCR 산물을 분석하는 것은 PCR 산물의 발색 (바람직하게, 형광) 변화를 확인하여, 인삼뿌리썩음병원균의 포함 여부를 확인하는 것일 수 있다. 즉, 상기 PCR 수행을 통해 증폭된 PCR 산물은 검출 가능하도록 형광 시약을 통해 염색될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 체온 기반 유전자 증폭법(Human Body Temperature Amplification)이 사용되어 35~40℃와 같은 온도 조건에서 반응을 수행하고 바로 형광 분석을 수행할 수 있기 때문에, 검출 반응을 하나의 반응 튜브에서 빠르게 수행할 수 있다.

상기 발색 변화를 확인하기 위한 발광물질은 당해분야에서 일반적으로 사용되는 것을 적용할 수 있으나, 바람직하게는 SybrGreen 또는 Evagreen을 사용하는 것이 가능하다. 상기 SybrGreen 또는 Evagreen은 DNA 이중가닥에 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 하기 위하여 첨가한 것이다. 특히, 상기 SybrGreen 또는 Evagreen은 DNA 이중 가닥에 삽입되어 자외선 조사시 형광을 발현하는 물질이다. 이에 따라, 본 발명의 일실시예에서, SYBR Green I 염색시약을 사용하여 병원균의 유무를 확인하였다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트를 포함한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 인삼뿌리썩음병원균에 함유된 ITS(Internal transcribed spacer)-1 및 ITS(Internal transcribed spacer)-2 유전자 부위의 일부를 증폭시키는, 서열번호 1 및 2를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 인삼뿌리썩음병원균이 가지는 ITS(Internal transcribed spacer)-1 및 ITS(Internal transcribed spacer)-2 유전자 부위의 일부를 증폭시키는 것일 수 있다.

상기 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환되더라도, 목적하는 ITS(Internal transcribed spacer)-1 및 ITS(Internal transcribed spacer)-2 유전자 부위의 일부를 증폭 시킬 수 있다면, 해당 서열도 본 발명의 범위 내로 포함될 수 있다. 즉, 상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 ITS(Internal transcribed spacer)-1 및 ITS(Internal transcribed spacer)-2 유전자 부위의 일부는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트 및 증폭용 시약을 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증폭용 시약은 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 증폭용 조성물은 반응버퍼, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 염색시약 및 증류수를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 염색시약은 SybrGreen 또는 Evagreen일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 시료마쇄용 튜브 용기; 플라스틱 균질기; 및 체온증폭반응용 PCR 튜브 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료마쇄용 튜브 용기는 멸균증류수를 포함할 수 있다.

본 발명에서 “시료마쇄용 튜브 용기”라는 용어는 마쇄 시 식물체 시료를 담을 수 있는 용기를 의미하며, 여기에 멸균증류수가 포함될 수 있다.

본 발명에서 “플라스틱 균질기”는 식물체 시료를 마쇄하는 도구를 의미한다.

본 발명에서, 상기 등온 증폭 반응을 위한 PCR 튜브는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트; 등온증폭 반응용 DNA 중합효소; DNA에 결합하여 형광을 나타내는 염색시약; dNTPs; 반응버퍼 및 증류수를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다.

또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 인체 체온 기반 유전자 증폭법에 의한 인삼뿌리썩음병원균을 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법을 제공함으로써, 기존의 인삼뿌리썩음병원균의 검출 방법보다 저비용 및 고효율적로 인삼뿌리썩음병원균을 보다 빠르고 정확하게 검출할 수 있다.

특히, 본 발명의 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법은 고가의 장비와 전문가의 도움 없이 육안으로 인삼뿌리썩음병원균의 존재 여부를 빠르게 판별할 수 있는 장점을 가진다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 양성대조군 및 음성대조군에 대해 재조합효소-중합효소 증폭 반응을 수행한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. (양성대조군 : 빨간색, 음성대조군 : 파란색)
도 2는 양성대조군 및 음성대조군의 멜팅 커브(melting curve)를 나타낸 것이다. (양성대조군 : 빨간색, 음성대조군 : 파란색, 가로축: 온도 ℃, 세로축 : RFU)
도 3은 양성대조군 및 음성대조군의 멜팅 커브(melting curve)를 나타낸 것이다. (양성대조군 : 빨간색, 음성대조군 : 파란색, 가로축: 온도 ℃, 세로축 : -d(RFU)/dt)
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 37℃의 항온수조에서 증폭반응을 수행한 양성대조군 튜브와 음성대조군 튜브의 발색 반응 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시를 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고, 기술된 실시예에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 하기에 설명되는 본 발명의 실시예는 당업자에게 본 발명의 사상을 충분하게 전달하기 위한 것임에 유의하여야 한다.

실시예 1. 인삼뿌리썩음병원균( Cylindrocarpon destructans ) 검출용 프라이머 세트의 제조

인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 ITS(Internal Transcribed Spacer)-1 및 2 유전자 부위의 서열을 수집하였다.

구체적으로, 미국 국립생물공학정보센터 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 데이터베이스에 등록된 Cylindrocarpon destructans ITS1, 2 유전자부위의 염기서열을 기초로 하여, 프라이머 서열 디자인을 수행하였다.

본 발명에 따른 PCR 수행을 위한 프라이머 서열 세트는 체온 기반 유전자 증폭법(HBTA, Human Body Temperature Amplification)에 적합하도록 디자인되었다. 체온 기반 유전자 증폭법(HBTA, Human Body Temperature Amplification)은 이중가닥 DNA(ds-DNA)를 해리시키고, 동시에 DNA Polynerase와 특정 primer를 사용하여, 원하는 DNA를 온도의 증감이 없는 등온(예컨대, 35~40℃)에서 증폭시키는 기술이다.

이러한, 체온 기반 유전자 증폭법에 적절히 적용될 수 있도록 일반 PCR에서 사용되는 프라이머 길이보다 긴 약 30~35 mer로 각각의 forward 및 reverse 프라이머 서열을 디자인하였고, 이들의 길이를 일부 다르게 설정하였다. 안정적인 증폭을 위해 3‘말단에 최대한 G, C, T를 이용할 수 있도록 하였으며, 5’말단 쪽에 3mer 정도에는 G가 없고 C, T가 주로있는 서열로 제작하였다. 또한, GC content가 50 내지 70 % 범위 내로 설정되도록 조정하였다.

위 내용을 고려하여 설정된 ITS-1 및 2 유전자 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	프라이머	염기서열	크기
서열번호 1	F_HBTA_CD	TCCGTAGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCG	33mer
서열번호 2	R_HBTA_CD	CGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAG	31mer

상기 표 1에 기재된 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트는 Cylindrocarpon destructans ITS1, 2 유전자부위의 염기서열 중 218 bp의 서열을 증폭하도록 설정되었다.

위와 같이 설정된 본 발명에 따른 프라이머 세트는 체온 기반 유전자 증폭법을 이용할 수 있어, 35~40℃의 등온에서 빠른 증폭 반응 수행 및 검출이 가능하다는 점에 장점을 지닌다.

실시예 2. 체온 기반 유전자 증폭법(HBTA)을 통한 인삼뿌리썩음병원균의 확인

서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.

구체적으로, PCR을 수행하기 위하여 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 게놈 DNA를 추출하였으며, 반응의 주형으로 사용하였다.

하기 표 2에 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 위한 PCR 조성물의 용량을 기재하였다.

내용물	용량
F_HBTA_CD (서열번호 1)	2.4
R_HBTA_CD (서열번호 2)	2.4
Rehydration buffer	29.5
10xSYBR green	5
증류수	7.2
MgAC	2.5
최종 용량	49.0㎕

상기 표 1에 기재된 내용물 중 MgAC를 제외하고 나머지를 vortex를 이용하여 완전히 혼합하고, HBTA용 중합효소에 조성물을 분주하였다. 이 때, 양성대조군 튜브에는 상기 추출한 DNA를 1㎕ 첨가하고 MgAC를 넣은 후, 최종 반응 조성물이 용량 50㎕가 되도록 하였다. 음성대조군 튜브에는 추출한 DNA를 첨가하지 않는 대신 증류수를 1㎕ 더 첨가하고, MgAC를 넣은 후, 최종 반응 조성물이 용량 50㎕가 되도록 하였다. 그 후, vortex를 이용하여 완전히 혼합시키고, 37℃로 설정된 PCR 기계에서 20분 동안 PCR 반응을 수행하였다.

상기 표 2에 기재된 내용물 중 SYBR Green 염색시료는 DNA-binding fluorescent dye로, 이중가닥의 DNA(Double strand-DNA, ds-DNA)와 결합할 수 있으며, 청색광을 흡수하여 녹색광을 방출한다. 상기 SYBR Green 염색시료를 사용함으로써, PCR 반응을 통해 추출된 DNA가 증폭되었는지 확인할 수 있다. 이러한, SYBR green은 형광 발광과 양성/음성 유무를 확인할 수 있는 단일 peak을 확인하는데 적합하다.

상기 표 2에 기재된 내용물 중 Rehydration Buffer는 수분을 공급해주는 완충용액이다.

상기 표 2에 기재된 내용물 중 MgAC(Magnesium Acetate)는 효소가 활성을 가지기 위해 필요한 마그네슘 이온을 공급해주기 위한 성분이다. 마그네슘 이온은 효소의 보조 인자(Co-factor)로서, PCR 반응을 위한 반응물 내 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid) 등의 킬레이터가 포함되거나 dNTP의 농도가 높은 경우, 마그네슘 이온의 농도를 높여서 사용할 수 있다. 마그네슘 이온은 PCR 반응을 위한 내용물에 MgAC, MgCl_2, MgSO₄ 등의 형태로 첨가될 수 있으며, 과량의 마그네슘 이온은 비정상적인 효소 활성을 발생시킬 수 있다.

상기 실험 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.

도 1은 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 양성대조군 및 음성대조군을 재조합효소-중합효소 증폭 반응을 수행한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

상기 도 1의 그래프에서 가로축은 DNA template의 증폭 횟수(Cycle)를 나타내고, 세로축은 RFU(Relative fluorescence units)를 뜻한다. 또한, 상기 도 1의 그래프에서 빨간색 선은 양성대조군을 뜻하고, 파란색 선은 음성대조군을 뜻한다.

도 1을 살펴보면, 양성대조군의 경우, 20cycle 이후에 RFU(Relative fluorescence units) 값이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 반면, 음성대조군의 경우, 30~40cycle 이후에도 RFU 값은 거의 증가하지 않는 것을 확인할 수 있다. 이로부터 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트는 추출된 인삼뿌리썩음병원균의 DNA를 증폭시키는 것이 가능한 것을 확인할 수 있다.

도 2 및 도 3은 양성대조군 및 음성대조군의 멜팅 커브(melting curve)를 나타낸 것이다.

멜팅 커브(melting curve)는 증폭시키고자 하는 타겟 프로덕트(target product)와 다른 경쟁적 프로덕트(competitor product)의 T_m값이 서로 다른 점을 이용하여, 타겟 프로덕트 이외의 비특이적 증폭 여부를 확인하기 위해 사용된다. PCR 반응 종료 후, sample template를 약 55℃ 정도로 설정하고, 온도를 0.5℃씩 증가시키면서 형광 신호의 크기를 측정한다. 특정 온도가 되면, 형광 신호의 크기가 급 감소하는 지점이 발생하게 되는데, 이 지점을 피크(peak)라고 하며, PCR 반응의 산물이 이중가닥에서 단일가닥으로 해리되는 순간을 뜻한다.

이 때, T_m값은 이중가닥 DNA가 단일가닥 DNA로 해리되는 온도 변화에 있어서, 이중가닥 DNA와 단일가닥 DNA의 비율이 1:1인 경우의 온도를 T_m이라고 한다. T_m 값은 DNA의 길이, 염기 조성에 따라 다르게 나타나며, T_m 값이 높을수록 primer와 대상 DNA 간의 결합 정도를 의미한다.

상기 도 2의 그래프에서 가로축은 온도(temperature)를 나타내고, 세로축은RFU 값을 나타낸다. 또한, 상기 도 2의 그래프에서 빨간색 선은 양성대조군을 뜻하고, 파란색 선은 음성대조군을 뜻한다.

상기 도 3의 그래프에서 가로축은 온도(temperature)를 나타내고, 세로축은-d(RFU)/dT 값을 나타낸다. 또한, 상기 도 3의 그래프에서 빨간색 선은 양성대조군을 뜻하고, 파란색 선은 음성대조군을 뜻한다.

도 3를 살펴보면, 양성대조군의 경우, 대략 79~80 ℃에서 피크(peak)를 형성하는 것을 확인할 수 있으나, 음성대조군의 경우, 뚜렷한 피크(peak)를 형성하지 않는 것을 확인할 수 있다. 이로부터, 양성대조군 튜브에 첨가한 병원균의 DNA는 대략 79℃~80℃에서 ds-DNA(double strand)가 ss-DNA(single strand)로 해리되는 것을 확인할 수 있으며, 비특이적 증폭 반응에 의한 불순물 없이, 인삼뿌리썩음병원균의 DNA가 순도 높은 상태로 증폭된 것을 알 수 있다.

상기 결과들로부터, 본 발명에 따른 프라이머 세트가 비특이적 증폭 반응에 의한 불순물 없이, 인삼뿌리썩음병원균의 DNA를 순도 높게 증폭하고 검출할 수 있는 것을 알 수 있다.

따라서, 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여, 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 DNA를 증폭시키는 것이 가능한 것을 유의적으로 확인할 수 있었고, 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 진단에 적합한 것을 확인하였다.

실시예 3. 항온수조에서의 체온 기반 유전자 증폭법(HBTA)을 통한 인삼뿌리썩음병원균의 확인

서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 체온 기반 유전자 증폭법(HBTA)을 수행하였다. 이 때, PCR을 수행하기 위하여, 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 게놈 DNA를 추출하였으며, 이를 반응의 주형으로 사용하였다.

하기 표 3은 항온수조에서의 증폭반응을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 HBTA용 프라이머와 증폭 반응을 위한 PCR 조성물의 용량을 기재한 것이다.

내용물	용량
F_HBTA_CD (서열번호 1)	2.4
R_HBTA_CD (서열번호 2)	2.4
Rehydration buffer	29.5
증류수	12.2
MgAC	2.5
최종 용량	49.0㎕

상기 표 3에 기재된 내용물 중 MgAC를 제외하고 나머지를 vortex를 이용하여 완전히 혼합하고, HBTA용 중합효소에 조성물을 분주하였다. 이 때, 양성대조군 튜브에는 추출한 DNA를 1㎕ 첨가하였다. 그리고, MgAC를 넣은 후, 최종 반응 조성물이 용량 50㎕가 되도록 하였다. 음성대조군 튜브에는 추출한 DNA를 첨가하지 않는 대신 증류수를 1㎕ 더 첨가하고 MgAC를 넣은 후 최종 반응 조성물이 용량 50㎕가 되도록 하였다. 그리고, vortex를 이용하여 완전히 혼합시키고, 37℃의 항온수조(water bath)에서 증폭 반응을 수행하였다. 이 때, 증폭 반응은 항온수조에서 20~30분 동안 방치하여 수행되는 것이 바람직하며, 20분 동안 항온수조에서 방치된 상태로 증폭되는 것이 보다 바람직하다고 할 수 있다. 그 후, 양성대조군 튜브 및 음성대조군 튜브 각각에 10000X SYBR Green I Nucleic acid gel strain을 첨가하고 발색 반응을 확인하였다. 이 때, 10000X SYBR Green I 염색시약은 반응 조성물 50㎕ 당 1㎕를 첨가시키는 것이 가장 바람직하다고 할 수 있다.

37℃의 항온수조에서 증폭반응을 수행한 양성대조군 튜브와 음성대조군 튜브의 발색 반응 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 양성대조군 튜브 및 음성대조군 튜브를 자외선광(Ultra Violet) 조건에서 촬영한 결과, 양성대조군 튜브가 음성대조군 튜브보다 강하게 형광 발색되는 것을 육안으로 확인할 수 있다.

또한, 양성대조군 튜브 및 음성대조군 튜브를 청색광(Blue light) 조건에서 촬영한 결과, 양성대조군 튜브의 형광 발색이 음성대조군 튜브의 형광발색보다 매우 강하게 발색되는 것을 육안으로 확인할 수 있다.

이로부터 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 인삼뿌리썩음병원균의 DNA는 첨가되는 염색시료에 의해 형광색으로 발색될 수 있음을 육안으로 확인할 수 있다.

따라서, 형광색의 발색이 대조군과 대비하여 육안으로 뚜렷히 관찰되면 인삼뿌리썩음병원균이 감염된 것으로 판단할 수 있으며, 그렇지 않은 경우 인삼뿌리썩음병원균에 감염되지 않은 것으로 판단할 수 있다. 위 결과들로부터 상기 프라이머 세트가 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 진단에 적합하다는 것을 확인하였다.

이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Chromach.co.,Ltd. <120> The Primer set for detection of Cylindrocarpon destructans in ginseng by Human Body Temperature Amplification, the composition for amplification comprising it and the method of detection using thereof <130> Chromach_2 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_HBTA_CD <400> 1 tccgtaggtg aaccagcgga gggatcatta ccg 33 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_HBTA_CD <400> 2 cgctgcgttc ttcatcgatg ccagagccaa g 31 <210> 3 <211> 457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS sequence <400> 3 ccgagtttac aactcccaaa cccctgtgaa cataccattt gttgcctcgg cggtgcctgc 60 ttcggcagcc cgccagagga cccaaaccct tgattttata cagtatcttc tgagtaaatg 120 attaaataaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc 180 agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg 240 cacattgcgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgttc gagcgtcatt tcaaccctca 300 agcccccggg cttggtgttg gagatcggcg tgccccccgg ggcgcgccgg ctcccaaata 360 tagtggcggt ctcgctgtag cttcctctgc ctagtagcac acctcgcact ggaaaacagc 420 gtggccacgc cgttaaaccc cccacttctg aaaggtt 457

Claims

(a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2 로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans) 검출용 프라이머 세트를 포함하는 혼합액으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균 포함 여부를 식별하는 단계;를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 인삼(Panax ginseng)시료인, 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 PCR 산물은 ITS(Internal transcribed spacer)-1 및 ITS(Internal transcribed spacer)-2 유전자 부위의 일부인, 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 중합효소연쇄반응은 체온 기반 유전자 증폭법(Human Body Temperature Amplification)을 통해 수행되는 것인, 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 검출방법.
제4항에 있어서, 상기 체온 기반 유전자 증폭법(Human Body Temperature Amplification)은 등온에서 수행되는 것인, 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 PCR 산물의 분석은 DNA 칩. 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인, 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)의 검출방법.
서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 조성물.
제7항의 인삼뿌리썩음병원균 검출용 조성물 및 증폭용 시약을 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 키트.
제8항에 있어서, 반응버퍼, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 염색시약 및 증류수를 더 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 키트.