KR20210083183A

KR20210083183A - 전기전도도를 기초로 한 씨앗발아 프로파일 표시기를 위한 방법과 장치

Info

Publication number: KR20210083183A
Application number: KR1020200178245A
Authority: KR
Inventors: 론 거터맨
Original assignee: 씨-큐어 파머수티칼 리미티드
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2021-07-06
Also published as: JP2021101691A; PL3690440T3; CA3102534A1; JP6833085B1; EP3690440A1; BR102020026046A2; EP3690440B1

Abstract

본 발명은 전도도에 기초한 발아 프로파일 표시기를 위한 방법과 장치에 관한 것으로: 상기 표적 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하고, 상기 표적 발아 단계는 상기 표적 프로파일이 해당하는 씨앗 발아 과정의 진행 지점과 관련되는 단계; 각각의 과정 발아 단계에 대한 상기 씨앗-발아 과정 동안의 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 과정-프로파일 상관관계를 이용하고, 여기서 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하고, 상기 각각의 과정 발아 단계는 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일이 해당하는 상기 발아 과정의 진행 지점과 관련되는 단계; 상기 표적 프로파일의 상기 적어도 하나의 특정 식별 특성을 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일내 대응 특징과 비교하는 단계; API 양을 최대화하기 위해, 상기 비교 단계에 기초하여 상기 각각의 과정 발아 단계의 최적 상태를 선택하여 상기 표적 발아 단계로 지정하는 단계; 및 온도-의존적 발아중지 조건을 확인하기 위해, 주어진 온도 범위내에서 침지수내 상기 식물 씨앗에 대한 전기전도도 범위와 상기 최적 상태를 교차-상관시키는 단계를 포함한다.

Description

전기전도도를 기초로 한 씨앗발아 프로파일 표시기를 위한 방법과 장치 {Methods and devices for a seed germination profile indicator based on electrical conductivity}

본 발명은 전기전도도를 기초로 한 씨앗발아 프로파일 표시기를 위한 방법과 장치에 관한 것이다.

실험실에서의 발아란 AOSA(Association of Official Seed Analysts)에 의해 "문제의 씨앗 종류에 대해 유리한 조건하에 정상적으로 식물을 생산할 수 있는 능력을 나타내는 필수 구조의 씨앗 배아로부터의 출현 및 발달"로 정의된다.

씨앗 발아 과정은 환경의 영향을 크게 받는다. 이런 영향은 발아 단계가 기근(식물의 배아 뿌리)의 출현에 기여하는 진행속도와 발아를 넘어 싹이 튼 식물 성장 둘다에서 발현된다. 다양한 발아 단계를 식별하는 것은 농업 기술 과정, 광범위한 생화학 과정, 파생 과정 및 제약 산업과 관련된 과정에서 매우 중요한 목표이다.

발아 과정에서 씨앗은 발아에 수반되는 생화학적 과정의 변화를 반영하는 물질을 방출하며, 이런 변화는 발아의 첫 번째 단계에서 영양 공급원을 제공하는 데 중점을 두고, 이런 물질은 후속 변화가 발생함에 따라 일시적으로 발생한다. 이런 발아 변형 과정에서, 이런 씨앗이 스며드는 물(이하, 침지수라고 함)의 부피의 특성도 특징적인 변화를 겪는다. 특히, 이런 침지수의 전기전도도는 씨앗 발달과 생존력 측면에 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.

Conrad의 미국 특허 제 5,659,623 호는 특히 침지수 전도도를 측정하는 전도도 테스트를 이용해 대량의 씨앗의 품질을 평가하는 방법을 소개한다. 세포막 구조가 열악하고 누수성인 저활력 씨앗과 상관관계가 있었다. 이렇게 세포막 구조가 좋지 않은 씨앗은 물을 흡수할 때 아미노산과 유기산과 같은 전해질을 잃어, 침지수의 전도도가 증가한다. 이런 테스트의 다른 예는 "전기전도도 활력 테스트: 생리 학적 기초 및 사용", Matthews and Powell, Seed Testing International, No. 131, pp. 32-35, 2006 년 4 월 및 "씨앗-매개 병원균 및 콩 씨앗의 전기전도도,”Wain-Tassi et al., Sci. Agric., v. 69, n. 1, pp. 19-25, 2012 년 1월/2월"와 같은 과학 문헌에서 찾을 수 있다. .

DT56a(Femarelle®)는 자궁 내막과 유방 조직의 생식 조직에 영향을 미치지 않고 호르몬 혈액 프로필을 변경하지 않고 갱년기 증상 완화 및 폐경 후 뼈 예방에 새로운 SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator) 역할을 하는 것으로 밝혀진 콩 식물에서 추출한 독점적인 비-호르몬 API(Active Pharmaceutical Ingredient)이다.

SC012(Brizo®)는 전립선의 양성 비대(BPH-Benign Prostate Hyperplasia)와 관련된 과민성 하부 요로 증상으로 고통받는 남성에게 도움을 주는 것으로 밝혀진 콩 식물에서 추출한 독점 API이다. SC012는 전립선 내부의 안드로겐과 에스트로겐 수용체만을 선택적으로 표적으로 삼아 전립선 크기를 줄여 남성을 발기부전과 같은 불필요한 위험에 노출시키지 않고 사용 첫 달부터 요도의 압력을 완화한다.

DT65a 및 SC012의 생산 과정은 침지수내 콩의 온도-조절 통으로 시작된다. 씨앗 발아 과정에서 이 물질은 생화학적 변화를 거쳐 활성 발아 단계와 식물의 발달을 위한 생물학적 영양을 제공한다. DT65a 및 SC012 재료에 존재하는 성분들은 발아 과정의 특정 단계에서 발견되는 물질을 기반으로 한다. 예를 들어, 콩의 전체 발아 과정은 온도에 따라 몇 시간 동안 발생하는 반면, 원하는 성분이 발생하는 전술한 단계는 일시적이며 몇 분에서 30 분까지만 지속된다.

문제는 모든 발아 배치에 대해 씨앗 내의 성분을 분석하기 위해 씨앗(즉, 콩과 식물)을 샘플링할 필요없이 다양한 온도와 시간 조건에서 원하는 성분이 고농도로 발견되는 단계를 식별하는 것이다.

전기전도도에 기초한 씨앗 발아 프로파일 표시기를 위한 방법과 장치를 구현할 필요가 있다. 이런 방법과 장치는 특히 전술한 여러 한계를 극복할 수 있다.

본 발명의 목적은 전기전도도에 기초한 씨앗 발아 프로파일 표시기를 위한 방법과 장치를 제공하는 데 있다.

본 발명의 실시 예는 발아 과정 동안 일시적인 성분의 화학적 프로파일을 침지수의 전기전도도와 상관시킴으로써 비침습적 방식으로 대량의 씨앗의 발아 단계를 식별할 수 있게 한다. 이 과정은 온도를 제어할 수 있을 뿐만아니라 제어되지 않은 온도 환경에서 산업용 담금 통의 계절적 주변 온도 변화를 고려하여 보정으로 조정할 수 있다. 발아 과정에서 거의 실시간으로 이런 정보를 사용할 수 있으므로 원하는 성분을 최대 농도로 "수확"하기 위해 생화학적 변화를 중지할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따르면, 전기전도도를 기반으로한 씨앗 발아 프로파일 표시기의 컴퓨터-구현 방법에 있어서: (a) 식물 씨앗에서 유래한 활성 제약 성분(API; active pharmaceutical ingredient)의 표적 프로파일과 표적 발아 단계의 표적-프로파일 상관관계를 활용하며, 여기서 상기 표적 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하고, 상기 표적 발아 단계는 상기 표적 프로파일이 해당하는 씨앗 발아 과정의 진행 지점과 관련되는 단계; (b) 각각의 과정 발아 단계에 대한 상기 씨앗-발아 과정 동안의 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 과정-프로파일 상관관계를 이용하고, 여기서 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하고, 상기 각각의 과정 발아 단계는 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일이 해당하는 상기 발아 과정의 진행 지점과 관련되는 단계; (c) 상기 표적 프로파일의 상기 적어도 하나의 특정 식별 특성을 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일내 대응 특징과 비교하는 단계; (d) API 양을 최대화하기 위해, 상기 비교 단계에 기초하여 상기 각각의 과정 발아 단계의 최적 상태를 선택하여 상기 표적 발아 단계로 지정하는 단계; 및 (e) 온도-의존적 발아중지 조건을 확인하기 위해, 주어진 온도 범위내에서 침지수내 상기 식물 씨앗에 대한 전기전도도 범위와 상기 최적 상태를 교차-상관시키는 단계를 포함한다.

한편, 표적-프로파일 상관관계를 이용하는 상기 단계는 분석 기술을 이용해 상기 표적 프로파일을 제공함으로써 수행되고, 상기 과정-프로파일 상관관계를 이용하는 상기 단계는 분석 기술을 이용해 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일을 제공함으로써 수행될 수 있다.

이런 분석 기술이 고압 액체 크로마토그래피(HPLC; High-Pressure Liquid Chromatography)일 수 있다.

또, 적어도 하나의 필수 화학 성분이 API의 유도체나 전구체일 수 있다.

또, 식물 씨앗이 콩일 수 있다.

본 발명은 전기전도도에 기초한 씨앗 발아 프로파일 표시기용 장치에 관한 것으로, 이 장치는 (a) 계산 연산을 수행하기 위한 CPU; (b) 데이터를 저장하기위한 메모리 모듈; (c) 전기전도도 데이터를 검색하기위한 전기전도도 모듈; (d) 온도 데이터를 검색하기위한 온도센서 모듈; (e) 발아 프로파일 모듈; (f) 비교기 모듈; 및 (g) 전도도 상호-상관 모듈;을 포함하고, 발아 프로파일 모듈은, (i) 식물 씨앗에서 유래한 활성 제약 성분(API)의 표적 프로파일과 표적 발아 단계의 표적 프로파일 상관관계를 활용하며, 여기서 상기 표적 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하고, 상기 표적 발아 단계는 상기 표적 프로파일이 해당하는 씨앗 발아 과정의 진행 지점과 관련되고; (ii) 각각의 과정 발아 단계에 대한 상기 씨앗 발아 과정 동안 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 과정-프로파일 상관관계를 이용하며, 여기서 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 상기 각각의 과정 발아 단계 동안 상기 식물 씨앗으로부터 추출된 씨앗 재료와 관련되고, 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하며, 상기 각각의 과정 발아 단계는 적어도 하나의 발아-과정 프로파일이 해당되는 상기 발아 진행의 진행 지점과 관련되고; 비교기 모듈은, (i) 상기 표적 프로파일의 상기 적어도 하나의 특정 식별 특성을 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 대응하는 특징과 비교하며; (ii) API 양을 최대화하기 위해 상기 비교에 기초하여 상기 각각의 과정 발아 단계의 최적 상태를 선택해 표적 발아 단계로 지정하고; 전도도 상호-상관 모듈은 온도 의존적 발아 중지 조건을 확인하기 위해 주어진 온도 범위내에서 침지수내 식물 씨앗에 대한 전기전도도 범위와 최적 상태를 상호-상관시키도록 구성된다.

또, 표적-프로파일 상관관계를 이용하는 단계가 분석 기술을 이용해 상기 표적 프로파일을 획득함으로써 수행되고, 상기 과정-프로파일 상관관계를 이용하는 단계는 분석 기술을 이용해 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일을 획득함으로써 수행될 수 있다.

또, 이런 분석 기술이 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)일 수 있다.

EH, 식물 씨앗이 콩일 수 있다.

본 발명은 또한 전기전도도에 기초한 씨앗 발아 프로파일 표시기에 대해, 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체에 구현된 컴퓨터-판독 코드를 갖는 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체에 관한 것이고, 이런 컴퓨터-판독 코드는, (a) 식물 씨앗에서 유래한 활성 제약 성분(API)의 표적 프로파일과 표적 발아 단계의 표적-프로파일 상관관계를 활용하기위한 프로그램 코드로서, 상기 표적 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 특성을 포함하고, 상기 표적 발아 단계는 상기 표적 프로파일이 해당하는 씨앗 발아 과정의 진행 지점과 관련되는 프로그램 코드; (b) 각각의 과정 발아 단계에 대한 상기 씨앗 발아 과정 동안 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 과정-프로파일 상관관계를 활용하기위한 프로그램 코드로서, 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 상기 각각의 과정 발아 단계 동안의 식물 씨앗으로부터 추출된 씨앗 물질과 관련되고, 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하며, 상기 각각의 과정 발아 단계는 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일이 해당되는 상기 발아 진행의 진행 지점과 관련되는 프로그램 코드; (c) 상기 표적 프로파일의 상기 적어도 하나의 특정 식별 특성을 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 대응하는 특징과 비교하기위한 프로그램 코드; (d) API 수량을 최대화하기 위해, 상기 비교에 기초해, 상기 각각의 과정 발아 단계의 최적 상태를 선택해 상기 표적 발아 단계로 지정하기 위한 프로그램 코드; 및 (e) 온도-의존적 발아 중지 조건을 식별하기 위해 주어진 온도 범위 내에서 침지수내 식물 씨앗에 대한 전기전도도 범위와 상기 최적 상태를 교차-상관시키는 프로그램 코드를 포함한다.

한편, 표적-프로파일 상관관계를 활용하기 위한 프로그램 코드가 분석 기술을 이용해 상기 표적 프로파일로부터 구한 데이터를 사용해 실행되고, 과정-프로파일 상관관계를 이용하기 위한 상기 프로그램 코드는 분석 기술을 이용해 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일로부터 구한 데이터를 사용해 수행될 수 있다.

식물 씨앗은 콩일 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 주어진 발아 단계에서 콩에서 추출된 씨앗 물질의 크로마토그래피 분리를 보여주는 DT56a 샘플의 HPLC 지문 크로마토그램;
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 주어진 발아 단계에서 콩에서 추출된 씨앗 물질의 크로마토그래피 분리를 보여주는 SC012 샘플의 HPLC 지문 크로마토그램;
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 전기전도도에 기초한 종자 발아 프로파일 표시기에 대한 주요 과정 단계의 순서도.

본 발명은 전기전도도에 기초한 씨앗 발아 프로파일 표시기를 위한 방법과 장치에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이런 방법과 및 장치를 제공하기 위한 원리와 동작은 첨부된 설명과 도면을 참조하면 더 잘 이해할 수 있다.

콩의 발아 과정은 발아와 관련된 생화학적 과정을 시작하는 씨앗이 수분을 흡수하는 것으로 시작해, 유전물질과 식물 영양소의 보존 과정에서 발아 과정으로의 전환을 시작한다. 씨앗(또는 콩)의 껍질로 물이 흡수되면서 진행되는 배꼽(즉, 씨앗이 콩깍지에 붙어있는 지점인 콩 씨앗의 "눈")을 통해 초기 물 침투가 일어나면서, 껍질이 유연한 소재로 변한다. 이런 유연성은 껍질을 통한 양방향 확산을 가능하게하여, 씨앗의 성분이 침지수로 방출되도록 하는 특징이 된다.

침지수로 방출된 물질의 일부는 침지수의 전도도를 직접적으로 변화시키는 미네랄이고, 다른 방출된 물질은 침지수의 전도도에 간접적으로 영향을 미친다. 일반적으로 발아 성분과 침지수내 물질의 양과 질 사이에 직접적인 상관관계를 설정할 수 있다.

온도가 조절되는 발아통 내부에서, 5분 간격으로 침지수의 전도도를 체크해 씨앗 발아 단계에 해당하는 전도도 수준을 결정한다. 이런 기능을 통해 사용자는 활성 DT56a와 SC012 재료를 얻기 위해 씨앗 재료에서 원하는 성분으로의 필요한 전이가 발생한 발아 단계를 확인할 수 있다. 원하는 발아 단계가 확인되면 최종 제품 API 형태로 추출된 씨앗 물질의 샘플에 대해 고압 액체 크로마토그래피(HPLC; High-Pressure Liquid Chromatography)를 수행했다. 전도도 모니터링 중 어느 시점에서든, 주어진 발아 단계에 존재하는 일시적인 생화학적 성분을 분리하기 위해 발아 과정을 종료할 수 있다.

이런 지표 기술은 HPLC 사용에만 국한되지 않고, 오히려 API에 존재하는 화학 성분의 "서명"이나 "지문" 프로파일을 얻기위한 분석 기술을 사용해 상호-상관 전도도 테스트 지표를 개발하기 위한 기초 역할을 하는 표적 프로파일을 얻을 수 있다.

전형적인 발아통에는 수백 킬로그램의 씨앗이 들어갈 수 있다. 이런 용량의 분석을 요구하는 것은 비실용적이지만, 씨앗의 통 샘플을 사용하면 측정에 허용할 수없는 불일치와 오류가 생길 수 있다. 따라서, 여기에 설명된 것과 같은 발아통의 전체 내용물을 고려하는 비침습 발아 프로파일 표시기는 이런 문제를 완화하여, 신뢰성, 정확성, 효율성, 실시간에 가까운 처리, 품질관리 및 품질보증을 제공한다.

이런 테스트 지표를 가능하게하기 위해서는 발아 과정에서 추출된 씨앗 재료의 생화학적 조성을 주요 성분별로 분석해야한다. 침지수 전도도 값을 지표로 사용해 발아를 중지하는 정확한 시간을 식별하면 전도도를 분석 프로파일에서 추출한 샘플 재료와 연관시켜 원하는 생화학 성분을 평가하고 최적화할 수 있다. 이런 화학적 프로파일에는 샘플링시 발아 단계의 구성 요소가 포함되어 있으므로 테스트를 통해 발아 단계에서 변형의 직접적 산물인 재료를 정확히 파악할 수 있다.

HPLC는 아미노산과 같은 화학 성분을 높은 정확도로 일상적으로 분석할 수 있도록 발전했다. 크로마토그래피 컬럼에서 아미노산 분석물을 분리하기 위한 이동상 구배 용출 용량은 잘 알려져 있다.

전도도 테스트 지표에 대한 상관관계를 기반으로하는 원하는 특성 프로파일의 참조 자료로 콩 추출물인 DT56a와 SC012 샘플을 사용했다. 초기 샘플 준비로, 샘플을 20-메쉬 체를 통과하도록 분쇄(즉, 0.5mm 미만의 분말)하고, 샘플 승인을 위해 품질관리 시스템을 사용해 체크했으며, 건실 온도(예 : 일반적으로 18~24℃, 최저 0.5%의 상대습도 설정 또는 -37℃의 실내 이슬점 설정)로 저장했다. DT56a와 SC012는 첨가제, 착색제, 향료, 향료 및/또는 방부제와 같은 추가 물질을 함유하지 않는다.

HPLC-UV 분석을 이용해, 발아 프로파일의 기초를 형성하는 샘플내 DT56a와 SC012 바이오마커를 별도로 결정했다. DT56a와 SC012 샘플에 대한 모든 분석은 별도로 독립적으로 했다. 시료 처리에는 UV-Vis 검출기(254nm)를 갖춘 HPLC 장치 (Dionex HPLC 1100 시리즈)에 주입된 메탄올 용액(이중 증류수 DDW내 HPLC 구배-등급 메탄올)을 사용해 HPLC 컬럼으로 바이오마커가 추출되었다.

다음을 통해 역상 HPLC 컬럼을 사용해 크로마토그래피 분리를 했다: 선형 ㅅ수성 메탄올 구배 용출, PTFE 시린지 필터(직경 13mm, 기공크기 0.45㎛), HPLC 컬럼(LiChroCART^® 4.6-250mm ID, Purospher^® STAR RP-18 엔드캡(5μm)) 및 프리-컬럼 (LiChroCART 4-4 HPLC 가드 컬럼, RP-18e (5μm)).

샘플 준비에는 정확한 측정치의 샘플들이 들어있는 시험관에 메탄올을 첨가하는 것이 포함되었다. 메탄올 용액을 회전기에서 실온으로 24시간 동안 교반하였다. 약 15분 방치 후 시험관의 상부 용액이 투명하고 입자상 물질이 없어질 때까지 샘플 시험관의 상부 용액을 1.5-ml Eppendorf 피펫을 사용해 추출하고 Eppendorf 시험관으로 옮긴 후, 1분간 2400rpm의 소용돌이 원심분리기에 넣었다. 원심분리된 샘플에서 1-ml 보정 주사기를 사용해 상부 상을 추출했다. 추출된 용액은 PTFE 주사기 필터로 여과되었다. 이어서, 여과된 샘플을 HPLC 바이알에 수집하고 HPLC 오토샘플러에 넣었으며, 분석을 위해 주입했다.

HPLC 분석은 다음 주입 매개 변수를 사용해 25℃의 컬럼 온도에서 수행되었다: 샘플 부피 20㎕, 샘플 온도 25℃, 분할-루프 주입법, 10% 메탄올 수용액의 용리액 A, 및 100% 메탄올의 용리액 B. 표 1은 HPLC 용리액 보정 데이터를 보여준다.

시간 (min.)	% A	% B
0.00	100.0	0.0
20.00	43.0	57.0
26.00	0.0	100.0
30.00	100.0	0.0
35.00	100.0	0.0

표 1. 용리액 A(10% 메탄올 수용액)와 용리액 B(100% 메탄올)에 대한 HPLC 용리액 보정 데이터

도 1은 바람직한 활성 물질의 존재를 확인하기 위해 주어진 발아 단계에서 콩에서 추출된 씨앗 물질의 크로마토그래피 분리를 보여주는 일례의 DT56a 샘플의 HPLC 지문 크로마토그램이다. 피크 잔류 시간이 크로마토그램에 표시되었는데, mAU 강도(즉, 밀리-흡광도 단위)에 따라 4개의 주요 피크를 피크 1~4 (즉, DT56a 샘플의 바이오마커)로 확인했다.

피크값들은 (도 1~2에 모두 있는) 최종산물 API 성분들을 나타내지만, 주어진 발아 단계에 존재하는 화학 성분들은 처리 후의 최종산물과 같거나 아닐 수 있다. 그러나, 표적 프로파일에 대한 상관관계 데이터를 개발할 때 관련성이 있다고 보는 확인된 피크값들이 최종산물 성분들(예: 최종산물 성분들의 전구체나 유도체)에 도달하는데 책임이 있다고 설정할 필요가 있다. 따라서, 원하는 발아 단계에서 발아가 중단된 후에도 다양한 발아후 처리로인해 성분 프로파일에 변화가 발생할 수 있다. 이미 이런 발아후 처리를 거친 샘플을 사용하면 이런 처리과정중의 변화로인한 모든 성분 프로파일 변화가 충분히 고려된다.

표 2는 주어진 발아 단계에서 콩에서 추출한 DT56a 샘플의 주요 확인된 피크값(P1~P4)의 프로파일 데이터를 보여주며, 피크 높이와 곡선밑 피크 면적(AUC)이 표시되어 있다. 상대 높이와 면적은 각각 P2 대 P1 및 P3 대 P4, RH 및 RA의 비율에 대한 백분율로 표시된다.

잔류시간 (minutes)	피크 명	높이 (mAU)	상대높이 (%)	면적 (mAU x min, AUC)	상대면적 (%)
19.16	1	171.076	----	34.398	----
16.83	2	94.115	55.01 (RH1=P2/P1)	16.828	48.92 (RA1=P2/P1)
24.24	3	210.001	----	38.443	----
25.91	4	339.582	61.84 (RH2=P3/P4)	56.683	67.82 (RA2=P3/P4)

표 2. 주어진 발아단계에서 콩에서 추출한 DT56a 샘플의 주요 확인된 피크값(P1~P4)의 HPLC 프로파일 데이터

표 2(와 아래 표 3)의 프로파일 데이터는 테스트 지표의 전도도에 대한 상호 상관관계를 설정하기위한 기준으로 RA를 사용하지만, 화학적 프로파일을 얻기 위해 사용된 분석법에 따라 상관관계의 품질개선을 위해 다른 프로파일 데이터가 더 적절하게 결정될 수도 있다. 따라서, AUC는 표 2에서와 같이 RA를 계산하지 않고 간단하게 사용될 수 있다. 마찬가지로, 피크값들 사이의 다른 비율이 사용될 수도 있다. 이런 테스트 지표를 개발하는 데 관심이있는 사용자는 이미 (1) 관련/의도된 치료효과를 갖는 API를 확인했으며 (2) API와 관련된 표적 프로파일을 이 표적 프로파일을 원하는 발아 단계 동안 API(또는 이의 유도체 및/또는 전구체)를 함유한 관심 씨앗의 침지수 전도도에 연계하기 위한 시작점으로 추가로 완전히 확인했다고 가정한다.

실제로, 표 2의 RA와 관련하여 생산 과정의 지속 여부(즉, 발아를 계속할 것인지 중단할 것인지 여부)는 씨앗 추출물에 보존된 원하는 물질의 양과 발아 과정의 추가 진행으로인해 발생한 원하는 물질의 양 사이의 비율에 따라 좌우된다. RA 분석은 두 산물 피크(P1, P3)를 이 산물에서 파생된 2개의 중간 피크(P2, P4)와 비교하여 이런 비율을 최적화하는데 사용된다.

위에서 언급했듯이, 표적 프로파일로부터의 상관관계에 대한 기초를 결정할 때 표적 프로파일의 특징(즉, 관심 과정에서의 화학적 성분들과 그 역할)을 완전히 이해한다고 가정한다. 따라서, 원하는 산물을 생성하는 데 사용된 씨앗의 반응물이 완전히 소모되면 발아 단계를 중지해야한다. P1 내지 P4는 발아 시작부터 최종 API까지 발견된 가장 안정적인 피크였으며, (도 1과 표 2의) DT56a와 (도 2와 표 3의) SC012 모두에 대해 쥐의 전임상 모델과 관련하여 원하는 효능 프로파일을 확인할 신뢰할 수 있는 마커 역할을 했다.

일련의 HPLC 결과를 누적 분석한 결과, DT56a의 최종 산물이 45.52~79.25 %의 RA1과 55.23~73.3 %의 RA2를 나타냈음을 확인했다.

도 2는 본 발명의 실시예에 따른 원하는 활성 물질의 존재를 확인하기 위해 주어진 발아 단계에서 콩에서 추출된 씨앗 물질의 크로마토그래피 분리를 묘사하는 예시적인 실시예에 대한 SC012 샘플의 HPLC 지문 크로마토그램이다. 피크 잔류 시간들이 크로마토그램에 표시되어, mAU 강도에 따라 4 개의 주요 피크값들을 피크 1~4(즉, SC012 샘플의 바이오마커)로 보여준다.

표 3은 주어진 발아 단계에서 콩에서 추출한 SC012 샘플의 주요 확인된 피크 (P1-P4)의 프로파일 데이터를 보여준다. 상대 높이와 면적은 각각 P2 대 P1 및 P3 대 P4, RH 및 RA의 비율에 대한 백분율로 표시된다.

잔류시간 (minutes)	피크 명	높이 (mAU)	상대높이 (%)	면적 (mAU x min, AUC)	상대면적 (%)
19.51	1	232.631	----	54.072	----
17.19	2	144.994	62.33 (P2/P1)	28.104	51.97 (P2/P1)
24.48	3	129.681	----	21.018	----
26.05	4	201.762	64.27 (P3/P4)	36.694	57.28 (P3/P4)

표 3. 주어진 발아단계에서 콩에서 추출한 SC012 샘플의 주요 확인된 피크값들(P1~P4)의 HPLC 프로파일 데이터

HPLC 결과의 누적 분석으로, SC012에 대한 최종 산물이 50.65~56.22 %위의 RA1 및 56.2~68.67 %의 RA2를 보여줌을 확인했다.

다양한 온도 범위에서 씨앗 발아통의 침지수에 대해 전기전도도 측정을 했다. 표 4는 발아중지값 범위를 침지수 온도의 함수로 식별하는데 사용된 여러 온도 범위에서의 전도도 범위(밀리지멘 단위)를 보여준다. 발아가 시작될 때 씨앗와 처음 접촉했을 때 침지수의 기준 전도도는 0.72~0.9 mS였다.

원하는 발아중지값 범위를 결정하기 위해 전술한 피크-비율 백분율을 기반으로 전도도 범위를 원하는 화학적 프로파일과 교차상관했다. 이어서, 이 범위를 표 4에 표시된 데이터의 온도-의존성을 얻기위한 기초로 사용했다. 테스트 표시기의 이런 "온도 보정"을 통해 정확한 온도 제어로 원하는 발아 단계가 일어나는 속도를 조절(예; 원하는 발화단계의 "오버슈팅" 방지)함은 물론, 제어되지 않는 온도 환경에서 산업용 침지수 통의 계절적 주변 온도 변화도 조절할 수 있다. 이런 기술은 대량의 씨앗의 발아 단계를 실시간에 가깝게, 비침습적안 전도도 기반 결정할 수 있도록한다.

온도 (°C)	전도도 (mS)
18-19	3.08-3.32
20-21	3.33-3.45
22-23	3.46-3.59
24-25	3.60-3.87
26-27	3.88-4.19
28-30	4.19-4.51

표 4. 발아중지 조건 결정을 위해 "온도보정"을 이용하기 위한 각종 온도범위에서의 씨앗 발아통의 침지수의 전기전도도 측정값

표 4는 발아 "중지"조건을 제공한다. 예를 들어, (대표적인 소정의 표적 프로파일을 갖는) 원하는 재료를 얻기위한 시간 창이 너무 짧다고 판단되면 작업자는 발아통의 침지수의 온도를 낮추어 발아 과정 종료를 더 잘 제어할 수 있다. 작업자는 침지수에 대해 원하는 온도를 선택하여, 테스트 표시기 장치가 표 4에 따라 중지 전도도 범위를 적절하게 조정하도록한다. 실제로 중지 전도도 범위에 도달하면 (침지수와 함께) 씨앗이 발아통에서 갈려, 발아 과정을 급히 중지시킨다.

도 3은 본 발명의 실시 예에 따른 전기전도도에 기초한 씨앗 발아 프로파일 표시기에 대한 주요 과정 단계의 단순화된 순서도이다. 전술한 것처럼, 원하는 재료와 관련/의도된 사용에 관한 정보를 처움부터 알고있다고 가정한다. 이 과정은 식물 씨앗에서 비롯된 표적 프로파일의 표적-프로파일의 표적 발아 단계에 대한 상관관계로 시작한다(2 단계). 표적 프로파일에는 API의 화학 성분의 특정 식별 특성이 포함된다. 표적 발아 단계는 표적 프로파일이 해당하는 씨앗-발아 과정에서의 지점과 관련된다.

이어서, 해당 과정 발아 단계에 대한 씨앗-발아 과정 동안의 발아-과정 프로파일의 과정-프로파일 상관관계를 이용한다(4 단계). 각 발아-과정 프로파일은 해당 과정 발아 단계 동안 식물 씨앗에서 추출된 씨앗 재료와 관련된다. 다음, 표적 프로파일의 특정 식별 특성을 발아-과정 프로파일의 해당 특징들과 비교한다(6단계). 다음, API의 양을 최대화하기 위해 과정 발아 단계의 최적 상태를 선택해 표적 발아 단계로 지정한다(8단계). 다음, 최적의 상태는 온도에 따른 발아중지 조건을 확인하기 위해 주어진 온도 범위 내에서 침지수내 식물 씨앗의 전기전도도 범위와 최적의 상태를 교차-상관시킨다(10단계).

한편, 분석기법을 이용해 표적 프로파일을 제공하여 표적-프로파일 상관관계를 이용하는 2단계를 실시하고(12단계), 분석 기법을 사용해 발아-과정 프로파일을 제공하여 과정-프로파일 상관관계를 이용하는 4 단계를 실시하기도한다(14단계).

다양한 콩과 식물을 시험하고 씨앗 식물의 전체 범위에 대해 더 광범위하게 이런 기술을 활용하는 일반적인 적용 가능성을 쉽게 이해할 수 있다. 씨앗 발아 과정은 다수의 씨앗에 걸쳐 예측 가능한 균일성을 보여준다. 일반적으로 씨앗은 보호 외피로 둘러싸인 배아 식물로서, 전술한 것처럼 침재수에서 동일한 유형의 성숙 과정을 겪는다. 이런 기술을 다른 씨앗에 적용하는 것은 비침습적 방식의 대량의 발아 과정 동안 일시적인 성분들의 화학적 프로파일을 연관시키기 위해 전기전도도를 기반으로 전술한 바와 같은 발아 프로파일 표시기를 사용하는 사소한 측면이다.

Claims

전기전도도를 기반으로한 씨앗 발아 프로파일 표시기의 컴퓨터-구현 방법에 있어서:
(a) 식물 씨앗에서 유래한 활성 제약 성분(API; active pharmaceutical ingredient)의 표적 프로파일과 표적 발아 단계의 표적-프로파일 상관관계를 활용하며, 여기서 상기 표적 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하고, 상기 표적 발아 단계는 상기 표적 프로파일이 해당하는 씨앗 발아 과정의 진행 지점과 관련되는 단계;
(b) 각각의 과정 발아 단계에 대한 상기 씨앗-발아 과정 동안의 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 과정-프로파일 상관관계를 이용하고, 여기서 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하고, 상기 각각의 과정 발아 단계는 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일이 해당하는 상기 발아 과정의 진행 지점과 관련되는 단계;
(c) 상기 표적 프로파일의 상기 적어도 하나의 특정 식별 특성을 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일내 대응 특징과 비교하는 단계;
(d) API 양을 최대화하기 위해, 상기 비교 단계에 기초하여 상기 각각의 과정 발아 단계의 최적 상태를 선택하여 상기 표적 발아 단계로 지정하는 단계; 및
(e) 온도-의존적 발아중지 조건을 확인하기 위해, 주어진 온도 범위내에서 침지수내 상기 식물 씨앗에 대한 전기전도도 범위와 상기 최적 상태를 교차-상관시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에있어서, 상기 표적-프로파일 상관관계를 이용하는 상기 단계는 분석 기술을 이용해 상기 표적 프로파일을 제공함으로써 수행되고, 상기 과정-프로파일 상관관계를 이용하는 상기 단계는 분석 기술을 이용해 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일을 제공함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에있어서, 상기 분석 기술이 고압 액체 크로마토그래피(HPLC; High-Pressure Liquid Chromatography)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에있어서, 상기 적어도 하나의 필수 화학 성분이 상기 API의 유도체나 전구체인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에있어서, 상기 식물 씨앗이 콩인 것을 특징으로 하는 방법.
전기전도도에 기초한 씨앗 발아 프로파일 표시기용 장치에 있어서:
(a) 계산 연산을 수행하기 위한 CPU;
(b) 데이터를 저장하기위한 메모리 모듈;
(c) 전기전도도 데이터를 검색하기위한 전기전도도 모듈;
(d) 온도 데이터를 검색하기위한 온도센서 모듈;
(e) 발아 프로파일 모듈;
(f) 비교기 모듈; 및
(g) 전도도 상호-상관 모듈;을 포함하고,
상기 발아 프로파일 모듈은,
(i) 식물 씨앗에서 유래한 활성 제약 성분(API)의 표적 프로파일과 표적 발아 단계의 표적 프로파일 상관관계를 활용하며, 여기서 상기 표적 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하고, 상기 표적 발아 단계는 상기 표적 프로파일이 해당하는 씨앗 발아 과정의 진행 지점과 관련되고;
(ii) 각각의 과정 발아 단계에 대한 상기 씨앗 발아 과정 동안 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 과정-프로파일 상관관계를 이용하며, 여기서 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 상기 각각의 과정 발아 단계 동안 상기 식물 씨앗으로부터 추출된 씨앗 재료와 관련되고, 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하며, 상기 각각의 과정 발아 단계는 적어도 하나의 발아-과정 프로파일이 해당되는 상기 발아 진행의 진행 지점과 관련되고;
상기 비교기 모듈은,
(i) 상기 표적 프로파일의 상기 적어도 하나의 특정 식별 특성을 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 대응하는 특징과 비교하며;
(ii) API 양을 최대화하기 위해 상기 비교에 기초하여 상기 각각의 과정 발아 단계의 최적 상태를 선택해 표적 발아 단계로 지정하고;
상기 전도도 상호-상관 모듈은 온도 의존적 발아 중지 조건을 확인하기 위해 주어진 온도 범위내에서 침지수내 식물 씨앗에 대한 전기전도도 범위와 최적 상태를 상호-상관시키도록 구성된 것을 특징으로 하는 장치.
제6항에있어서, 상기 표적-프로파일 상관관계를 이용하는 상기 단계가 분석 기술을 이용해 상기 표적 프로파일을 획득함으로써 수행되고, 상기 과정-프로파일 상관관계를 이용하는 단계는 분석 기술을 이용해 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일을 획득함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 장치.
제7항에있어서, 상기 분석 기술이 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)인 것을 특징으로 하는 장치.
제6항에있어서, 상기 적어도 하나의 필수 화학 성분이 API의 유도체나 전구체인 것을 특징으로 하는 장치.
제6항에있어서, 상기 식물 씨앗이 콩인 것을 특징으로 하는 장치.
전기전도도에 기초한 씨앗 발아 프로파일 표시기에 대해, 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체에 구현된 컴퓨터-판독 코드를 갖는 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체에 있어서:
컴퓨터-판독 코드가 아래 프로그램 코드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체.
(a) 식물 씨앗에서 유래한 활성 제약 성분(API)의 표적 프로파일과 표적 발아 단계의 표적-프로파일 상관관계를 활용하기위한 프로그램 코드로서, 상기 표적 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 특성을 포함하고, 상기 표적 발아 단계는 상기 표적 프로파일이 해당하는 씨앗 발아 과정의 진행 지점과 관련되는 프로그램 코드;
(b) 각각의 과정 발아 단계에 대한 상기 씨앗 발아 과정 동안 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 과정-프로파일 상관관계를 활용하기위한 프로그램 코드로서, 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 상기 각각의 과정 발아 단계 동안의 식물 씨앗으로부터 추출된 씨앗 물질과 관련되고, 각각의 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일은 적어도 하나의 필수 화학 성분의 적어도 하나의 특정 식별 특성을 포함하며, 상기 각각의 과정 발아 단계는 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일이 해당되는 상기 발아 진행의 진행 지점과 관련되는 프로그램 코드;
(c) 상기 표적 프로파일의 상기 적어도 하나의 특정 식별 특성을 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일의 대응하는 특징과 비교하기위한 프로그램 코드;
(d) API 수량을 최대화하기 위해, 상기 비교에 기초해, 상기 각각의 과정 발아 단계의 최적 상태를 선택해 상기 표적 발아 단계로 지정하기 위한 프로그램 코드; 및
(e) 온도-의존적 발아 중지 조건을 식별하기 위해 주어진 온도 범위 내에서 침지수내 식물 씨앗에 대한 전기전도도 범위와 상기 최적 상태를 교차-상관시키는 프로그램 코드.
제11항에있어서, 상기 표적-프로파일 상관관계를 활용하기 위한 상기 프로그램 코드가 분석 기술을 이용해 상기 표적 프로파일로부터 구한 데이터를 사용해 실행되고, 상기 과정-프로파일 상관관계를 이용하기 위한 상기 프로그램 코드는 분석 기술을 이용해 상기 적어도 하나의 발아-과정 프로파일로부터 구한 데이터를 사용해 수행되는 것을 특징으로 하는 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체.
제12항에있어서, 상기 분석 기술이 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)인 것을 특징으로 하는 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체.
제11항에있어서, 상기 적어도 하나의 필수 화학 성분이 API의 유도체나 전구체인 것을 특징으로 하는 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체.
제11항에있어서, 상기 식물 씨앗이 콩인 것을 특징으로 하는 비일시적 컴퓨터-판독 저장매체.