KR20210065065A - 단백질 발현용 mRNA 구조체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 영역, (b) 5'말단에 β-globin UTR 영역, 및 (c) 3'말단에 BGH, BGH-IRES, 또는 IRES-BGH가 삽입된 영역을 포함하는, mRNA 또는 mRNA 구조체(mRNA construct) 에 관한 것으로, 본 발명의 mRNA 또는 mRNA 구조체는 키메라 항원 수용체 또는 키메라항원수용체 단백질 (Chimeric antigen receptor protein, CAR protein) 의 세포 내 발현 또는 발현 안정성 향상과 세포 내 지속성 향상, 상기 키메라항원수용체의 체내 안전성을 높이고 암세포의 살상능을 증가시켜, 항암용 약학 조성물과 고형암을 표적하는 항암면역요법에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 목적 단백질의 기능을 유지하고 안정적이고 높은 효율로 발현을 유도할 수 있는 mRNA 구조체에 관한 것으로서, 본 발명의 mRNA 구조체는 목적 단백질(또는 펩타이드)를 암호화하는 영역의 upstream에 5'-β-globin UTR 영역을 포함하고 그 downstream에 BGH, BGH-IRES, 또는 IRES-BGH 영역을 포함한다.
수십 년 동안 암을 치료하는 방법들은 꾸준히 변화하고 발전해왔다. 1800년대에서부터 1900년대까지는 외과적인 수술 (Surgery), 화학요법 (Chemotherapy), 그리고 방사선 요법 (Radiation therapy)과 같은 방법들이 주로 이뤄졌지만, 이들에 대한 한계점들이 드러나기 시작하여, 최근 면역세포 요법으로 체내의 면역세포를 꺼내서, 강화시키거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 넣어주는 세포치료 방식이 개발되고 있다. 이의 대표적인 예로는 종양 침윤 림프구 (Tumor Infiltrating Lymphocytes, TIL), 키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor, CAR), T세포 수용체 (T-Cell Receptor, TCR) 기술 등이 있으며, 특히 유전자 재조합 변형을 이용한 인공 수용체인 CAR (키메라항원수용체)를 이용한 연구 및 임상이 이루어지고 있다. 하지만, 상기 유전공학 변형을 이용한 세포치료 방식 또는 유전자 요법은 게놈 내의 무작위 위치에서의 유전자의 혼입으로 인해서 바람직하지 않은 면역 반응 및 안전성 문제를 비롯한 다수의 도전을 갖는다. 이와 관련하여, DNA를 이용한 형질전환 CAR-NK 세포 (키메라 항원 수용체 자연살해세포 (Natural killer cell))는 CAR 유전자가 genome에 통합되거나 돌연변이가 발생하여 안전성이 담보되지 않는다는 문제점이 존재한다. 이를 해결하기 위해 일시적(transient) 형질전환된 CAR-NK 세포를 이용하고자 하는 시도가 있으나, mRNA를 이용한 일시적 형질전환의 경우 mRNA의 불안정성과 낮은 형질주입율 및 목적 단백질 발현율이 허들로 작용하여 성과를 나타낸 연구가 없었다.
상기의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 세포 내에서 게놈의 돌연변이 없이 목적 단백질(또는 펩티드)의 발현이 가능하도록 형질전환에 이용할 수 있는 mRNA 구조체 제공을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성 또는 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 영역, (b) 상기 목적 단백질 암호화 영역의 upstream에 5'-β-globin UTR 영역, 및 (c) 상기 목적 단백질 암호화 영역의 downstream에 BGH, BGH-IRES, 또는 IRES-BGH 영역을 포함하는 mRNA 구조체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, mRNA 구조체는 일시적 형질전환용일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (a) 목적 단백질은 키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor, CAR)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체는 특정 타겟과 특이적으로 결합할 수 있는 엑토도메인(Ectodomain), 세포막을 관통하는 막관통 도메인(transmembrane (TM) domain), 및 세포 내 신호전이를 유도하는 엔도도메인(Endodomain)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 엑토도메인은 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain)가 링커(linker)를 통해 연결된 항체 단편 (ScFv) 일 수 있고, 상기 엔도도메인은 CD28일 수 있으며, DAP10 및/또는 CD3z를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 키메라 항원 수용체의 엑토도메인과 TM 도메인은 spacer로 연결될 수 있으며, 상기 spacer는 Myc-Hinge일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 mRNA 구조체는 5' 말단에 Cap을 포함할 수 있으며, 3' 말단에 poly (A) tail을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 mRNA 구조체의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 일시적(transient) 형질전환체 제조방법을 제공한다:
(1) 상기 mRNA 구조체 또는 상기 재조합 벡터를 준비하는 단계; 및
(2) 상기 mRNA 구조체 또는 상기 재조합 벡터를 세포 내로 주입하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (2) 단계는 전기천공법을 이용하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 Nepa21 시스템을 이용하는 것일 수 있다. 상기 Nepa21 시스템을 이용한 전기천공법은 110 내지 200V 조건에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 110 내지 140V, 더욱 바람직하게는 110V 조건에서 수행될 수 있다.
상기 제조방법에서 세포는 식물세포 또는 동물세포일 수 있으나 바람직하게는 동물세포일 수 있으며, 동물세포 중에서 자연살해세포(Natural Killer cell: NK cell)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 mRNA 구조체 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 형질전환된 세포는 일시적 형질전환된 세포일 수 있다. 상기 형질전환된 세포는 상기 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있으며, 염색체 내에 DNA 삽입 없이 목적 단백질(또는 펩티드)를 발현한다. 상기 목적단백질(또는 펩티드)은 3일 동안 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 NK세포는 primary NK cell 또는 NK 세포주이며, 상기 CAR-NK는 Nepa21 시스템을 통해 형질전환 (Transfection) 될 수 있다. 또한 상기 형질전환은 110 내지 200V 조건에서 수행될 수 있다.
한편, 상기 제조방법에서 세포가 NK cell이고 세포 내 주입하고자 하는 mRNA 구조체 또는 재조합 백터가 암호화하는 목적 단백질이 키메라 항원 수용체인 경우, 본 발명의 형질전환 세포 제조방법은 키메라 항원 수용체 자연살해세포 (Chimeric antigen receptor natural killer cell, CAR-NK) 제조방법으로 이용될 수 있고, 이때 mRNA 구조체 또는 상기 재조합 벡터의 세포 내 주입은 110 내지 200 V (바람직하게는 NK세포주는 110V, Primary NK 세포는 200V) 조건에서 Nepa21 시스템을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 CAR-NK 세포 제조방법에 의해 제조된 CAR-NK 세포를 제공할 수 있으며, 제조된 CAR-NK 세포는 염색체 내 DNA 삽입없이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현함으로써 체내 안전성이 높다.
또한, 본 발명은 상기 CAR-NK 세포를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 암은 고형암일 수 있고, 상기 고형암은 유방암 및/또는 폐암일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 CAR-NK 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항암제 제조를 위한 상기 CAR-NK 세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 mRNA 구조체는 안정적이고, 세포내에 주입되어 그 기능을 온전하게 발휘하는 목적 단백질을 장시간 발현할 수 있는바 형질전환 기술, 특히 일시적 형질전환 기술의 활발한 이용에 기여할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 형질전환 CAR-NK는 암세포 살상능이 우수하고, NK 세포의 게놈에 유전자 삽입 없이 CAR를 발현하여 체내 안전성이 보장되는 바 항암용 약학 조성물과 고형암을 표적하는 항암면역요법에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 CAR mRNA의 구조 및 CAR의 도메인 및 모티프 (motif) 구성을 나타낸 것이다.
도 2는 형질전환(Transfection) 최적화에 대한 결과를 나타낸 것으로, Nepa21 시스템을 이용한 NK92 세포에 대한 형질전환 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 형질전환(Transfection) 최적화에 대한 결과를 나타낸 것으로, Nepa21 시스템을 이용한 primary NK 세포에 대한 transfection 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Transient CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에서 시간별 CAR 발현 확인에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Transient CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에 대한 시간별 암세포 살상능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 DAP10를 포함하는 키메라항원수용체의 발현율 및 암세포 살상능에 대한 확인 실험을 위한 벡터 구축 또는 CAR를 구성하는 도메인 및 모티프를 나타낸 것이고,
도 7은 상기 도6과 관련하여, FACS를 이용하여 CAR mRNA 형질전환시 DAP10 유무에 따른 CAR 발현율 확인을 나타낸 것이다.
도 8은 CAR 구조에서 co-activator 2개 (CD28, DAP10)를 갖는 3세대 CAR와 co-activator 1개 (DAP10)를 갖는 2세대 CAR 형태에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 CAR 구조에서 co-activator DAP10과 4-1BB에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 CAR 구조에서 co-activator DAP10과 2B4에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 5'-β-globin UTR, 3'-BGH, EMCV-IRES 구조의 유무, EMCV-IRES의 정/역방향 또는 5'/3' 위치를 상이하게 설계한 mRNA 구조체의 모식도이고, 도 11b는 mRNA 구조체 제조과정을 도식화한 도면이다.
도 12는 세포 내로 주입된 mRNA 구조체 1 내지 7의 시간 경과에 따른 감소비율을 비교한 도면이다.
도 13은 mRNA 구조체 1 내지 7이 주입된 transient NK92 세포의 CAR 단백질 발현 수준을 비교확인한 도면이다.
도 14는 mRNA 구조체 1 내지 7이 주입된 transient NK92 세포의 폐암 세포주 및 유방암세포주에서의 독성을 비교확인한 도면이다.
도 15a는 3' 말단에 BGH와 IRES의 순서를 달리한 mRNA의 염기서열과 대응하는 또는 이에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 벡터에서 획득된 전사체를 전기영동을 통해 확인한 도면이다.
도 15b는 3' 말단에 BGH와 IRES의 순서를 달리한 mRNA 구조체의 세포 내 목적 단백질 발현 효율과 목적 단백질의 성능을 확인한 도면이다.
도 2는 형질전환(Transfection) 최적화에 대한 결과를 나타낸 것으로, Nepa21 시스템을 이용한 NK92 세포에 대한 형질전환 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 형질전환(Transfection) 최적화에 대한 결과를 나타낸 것으로, Nepa21 시스템을 이용한 primary NK 세포에 대한 transfection 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Transient CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에서 시간별 CAR 발현 확인에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Transient CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에 대한 시간별 암세포 살상능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 DAP10를 포함하는 키메라항원수용체의 발현율 및 암세포 살상능에 대한 확인 실험을 위한 벡터 구축 또는 CAR를 구성하는 도메인 및 모티프를 나타낸 것이고,
도 7은 상기 도6과 관련하여, FACS를 이용하여 CAR mRNA 형질전환시 DAP10 유무에 따른 CAR 발현율 확인을 나타낸 것이다.
도 8은 CAR 구조에서 co-activator 2개 (CD28, DAP10)를 갖는 3세대 CAR와 co-activator 1개 (DAP10)를 갖는 2세대 CAR 형태에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 CAR 구조에서 co-activator DAP10과 4-1BB에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 CAR 구조에서 co-activator DAP10과 2B4에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 5'-β-globin UTR, 3'-BGH, EMCV-IRES 구조의 유무, EMCV-IRES의 정/역방향 또는 5'/3' 위치를 상이하게 설계한 mRNA 구조체의 모식도이고, 도 11b는 mRNA 구조체 제조과정을 도식화한 도면이다.
도 12는 세포 내로 주입된 mRNA 구조체 1 내지 7의 시간 경과에 따른 감소비율을 비교한 도면이다.
도 13은 mRNA 구조체 1 내지 7이 주입된 transient NK92 세포의 CAR 단백질 발현 수준을 비교확인한 도면이다.
도 14는 mRNA 구조체 1 내지 7이 주입된 transient NK92 세포의 폐암 세포주 및 유방암세포주에서의 독성을 비교확인한 도면이다.
도 15a는 3' 말단에 BGH와 IRES의 순서를 달리한 mRNA의 염기서열과 대응하는 또는 이에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 벡터에서 획득된 전사체를 전기영동을 통해 확인한 도면이다.
도 15b는 3' 말단에 BGH와 IRES의 순서를 달리한 mRNA 구조체의 세포 내 목적 단백질 발현 효율과 목적 단백질의 성능을 확인한 도면이다.
본 발명자들은 일시적 형질전환을 통해 그 치료적 효능 향상과 안전성이 확보된 CAR-NK 세포 제조를 위해 예의연구하여, 구조적으로 안정하고 세포 내로 주입되어 온전한 기능을 갖는 목적 단백질의 발현을 장시간 활발하게 유도할 수 있는 mRNA 구조체를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (a) 목적 단백질(또는 펩티드)를 암호화하는 영역, (b) 상기 목적 단백질 암호화 영역의 upstream에 5'-β-globin UTR 영역, 및 (c) 상기 목적 단백질 암호화 영역의 downstream에 BGH, BGH-IRES, 또는 IRES-BGH 영역을 포함하는 mRNA 구조체를 제공한다.
본 발명에서 용어 "IRES(Internal Ribosome Entry Site)"는 내부 리보솜 진입 부위 또는 리보솜 결합 부위로서 mRNA 상에서 고리(loop) 구조를 형성하여 Cap과 독립적인 메커니즘으로 번역(translation)의 개시를 유도함이 알려져 있다. 이를 이용하여 2개 이상의 유전자 사이에 IRES를 위치시켜 하나의 벡터로 제조하는 경우 한 개 mRNA 상에서 2개의 유전자를 각각 동시에 발현시킬 수 있다. 이에, 유전자 재조합 기술에서 타겟 유전자의 발현 유도를 위하여 IRES 영역을 삽입하는 것은 널리 이용되고 있다. 그러나, 본 발명자들은 IRES의 고리구조가 mRNA의 3' UTR에 위치하는 경우 mRNA가 구조적으로 안정하고 고효율로 목적 단백질을 발현할 수 있음을 확인하였다. 특히, 3' UTR에 IRES-BGH 순서로 포함된 RNA가 BGH-IRES 순서로 포함된 RNA보다 구조적 단일성, 안정성 및 단백질 발현 효율이 높음을 확인하였다.
본 발명자들은 mRNA 구조체 연구에 있어서 IRES는 encephalomyocarditis virus (EMCV)의 IRES 영역을 이용하였다.
한편, mRNA의 안정성 및 단백질 발현효율 상승을 위해서는 IRES 영역의 위치와 그 순서가 중요하다. 본 발명자들은 5' UTR에 IRES 영역이 포함되는 경우 3' UTR에 IRES 영역이 포함되는 경우보다 mRNA 안정성 및 단백질 발현 효율이 낮음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 IRES가 3' UTR에 위치하더라도 역방향으로 놓여있는 경우 정방향으로 놓인 경우보다 mRNA 안정성 및 단백질 발현 효율이 낮음을 확인하였다. 이로부터 단순히 IRES의 고리 구조만이 아니라 그 고리 구조가 자리잡은 위치(3'UTR)와 뒤에 오는 BGH 영역 등이 유기적으로 결합하여 mRNA 안정성 및 번역 효율 상승에 기여함을 알 수 있다.
본 발명에서 "BGH"란 소 성장인자 (bovine growth hormone; bGH)로서 소 성장인자의 폴리아데닐 신호를 의미한다. BGH 영역은 5'-β-globin UTR 영역과 함께 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 본 발명자들은 mRNA 구조체에 있어서 5'-β-globin UTR 영역이 존재할 때 mRNA의 안정성을 약 36% 향상시키고 BGH 영역이 3' UTR에 위치할 때 mRNA 안정성을 약 20% 향상시킴을 실험적으로 확인하였다.
본 발명의 mRNA 구조체는 숙주 세포의 염색체에 유전자 삽입 없이 일정 시간 동안에만 목적 단백질을 발현하도록 하는 형질전환, 바람직하게는 일시적 형질전환에 이용하기 위한 것으로서, mRNA가 구조적으로 안정하여 오랜 시간 단백질을 고 효율로 발현시키는 것도 중요하지만, 목적 단백질의 본래의 기능을 온전히 나타내는 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있어야 하는 것이 궁극적으로 형질전환의 목적 달성을 위한 필수 조건이다.
이에, 본 발명자들은 상술한 mRNA 구조체가 발현하는 목적 단백질을 키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor, CAR)로 하여, NK 세포에 형질주입하여 transient CAR-NK 세포를 제작하고 상기 transient CAR-NK 세포의 암세포 살상능을 확인하였다. 그 결과, mRNA 구조체의 단백질 발현율과 그 mRNA 구조체가 주입된 NK 세포의 암세포 살상능은 서로 비례관계로 본 발명의 mRNA 구조체가 목적 단백질의 고유 기능에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
본 발명에서 용어 "UTR(untranslated region)"은 비해석부위, 비해독 부분라고도 하며, mRNA 사슬 중 단백질 유전자의 주형이 되지 않는 부분, 즉 번역되지 않는 부분을 의미하고, mRNA의 비해독 부분을 이르는 단어로 일반적으로 코딩 영역의 upstream을 5'UTR로 downstream을 3'UTR로 지칭한다.
일반적으로 상기 UTR에서, 5 UTR(5 비해석부위), 3 UTR(3 비해석부위)이 존재하는데, 상기 5 UTR은 5' 말단 부분이고, 3 UTR은 3' 말단 부분을 지칭한다. 진핵세포의 메신저 RNA (mRNA)에서, 3 UTR이 중요한 조절 요소로 알려져 있고, 상기 3' UTR은 원핵생물에서 mRNA의 안정성에 기여하는 전사 터미네이터를 의미한다. 또한, mRNA에서의 비번역 영역(untranslated region) (UTR)은 mRNA 안정성 및 mRNA 번역 둘 다를 조절하는데 중추적인 역할을 하는 것으로 보고되었다.
5' UTR 모티프 예컨대 상류 개방형 해독틀(upstream open reading frame) (uORF) 또는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site) (IRES)가 유전자 조절, 특히 번역 개시에 관여한다는 것은 공지되어 있으나, 3' UTR에 위치한 IRES의 기능은 알려져 있지 않았다.
UTR은 RNA 결합 단백질과의 그의 상호 작용을 통해 mRNA 안정화 및 세포내 국소화 뿐만 아니라, 번역 개시, 신장 (elongation), 및 종결에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. UTR 내에 특정 모티프에 따라, 이는 mRNA 회전율(turnover)을 높이거나 낮출 수 있다
상기와 같이 상기 자연살해세포를 이용한 키메라 항원 수용체 (CAR-NK)의 mRNA 구조체 안정성과 목적 단백질 발현을 높이기 위해 5' 말단에 β-globin 유전자의 upstream 서열과 3' 말단에 상기 bovine growth hormone (BGH) 서열과 poly-A sequence 와 같은 UTR을 첨가함으로써, 발명을 완성하였다.
한편, 본 발명의 mRNA 구조체에서 목적 단백질이 CAR인 경우 NK 세포에 주입되어 높은 암세포 살상능을 나타내었는바, 본 발명의 mRNA 구조체는 CAR-NK 세포 제조를 위해 이용될 수 있다. 본 발명에서 목적 단백질이 CAR인 mRNA 구조체는 별도로 "CAR mRNA"라고 한다. 본 발명에서 CAR mRNA는 mRNA로부터의 단백질 발현율을 향상시키는 기능적 영역을 의미하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로 리보솜을 유도하는 영역, mRNA의 번역개시 또는 번역촉진과 관련된 영역, mRNA의 핵 외로의 수송과 관련된 영역, 소포체 막에 대한 결합과 관련된 도메인, 소포체 보유 신호(ER 보유 신호) 서열을 함유하는 도메인, 또는 소포체 신호 서열을 함유하는 영역 모두 포함될 수 있다.
본 발명은 상기 mRNA와 대응되는 또는 이와 상보적인 DNA 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 발현벡터로, 상기 발현 벡터 (expression vector)는 세포 내에서 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 상기 발현벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코드하는 유전자 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 원하는 유전자의 5 측 및 3 측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제 가능 단위 등을 적절하게 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 코딩 서열과 프로모터를 반드시 포함하는 하나 이상의 전사 조절 부위들이 작동 가능하게 연결된 집합체(발현체, expression cassette), 또는 상기의 집합체를 포함하는 벡터를 의미한다. 상기 목적 단백질은 단백질 분비 메커니즘을 활용하여 생산하고 하는 목적이 되는 단백질 또는 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모드 단백질을 의미한다. 본 발명에서는 키메라항원수용체 (CAR), 상기 CAR 단백질, 상기 CAR의 ScFv, Antibody 등을 의미하기도 한다.
또한 본 발명은 키메라항원수용체 (CAR) mRNA를 포함하는 NK세포를 제공하고, 상기 NK 세포는 키메라항원수용체 자연살해세포 (chimeric antigen receptor Natural killer cell, CAR-NK)로, 상기 CAR mRNA 또는 상기 재조합 백터를 Nepa21 시스템을 통해 형질전환한 세포일 수 있다.
한편, 형질주입(트렌스펙션; transfection) 또는 형질도입(트렌스덕션; transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질주입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 해당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질주입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 형질주입과 형질도입은 혼용될 수 있으나, 양자 큰 의미로 숙주세포에 외래 유전자 전달의 형질전환(transformation)으로 해석됨이 바람직하고, 형질주입 또는 형질도입에 의해 외래 유전자가 도입된 세포는 형질전환체라고 한다.
한편, 형질주입은 주입된 외래 유전자가 숙주세포의 염색체 DNA안에 삽입 또는 독립적으로 복제 가능한 형태인 경우 안정적 형질주입(stable transfection)으로 구분하고 그렇지 않은 경우 일시적 형질주입(transient transfection)으로 구분할 수 있다.
본 발명은 숙주 세포의 염색체 내 DNA 삽입 또는 돌연변이에 대한 위험이 없고 수일 내로 체내에서 소멸되어 유전적 변이에 대한 체내 안전성이 높은 형질주입에 제공되는 mRNA 구조체이며, 특히 일시적 형질주입에 제공될 수 있다
본 발명에서는 NEPA21 Super Electroporator (Nepagene, 일본)를 사용하여 전기천공법으로, 형질전환 또는 트랜스펙션시켰다. 또한 본 발명은 일시적(transient) 트랜스펙션(transfection) 방법, 또는 일시적 형질전환방법을 사용하였다. 상기 일시적 발현은 신속한 포유동물 단백질 생산을 위한 선택 시스템으로 급속히 되고 있다. 일시적 형질감염의 유연성은 당면한 단백질에 대한 개념으로부터 신속한 시현을 가능케 하고, 많은 상이한 단백질이 동시에, 또는 연속으로 생산될 수 있다. 이와 관련하여, Rodrigo Vazquez-Lombardi et al (Transient expression of human antibodies in mammalian cells, Nat Protoc. 2018 Jan;13(1) 99-117)에 의하면, transient mammalian expression systems 은 합리적인 비용으로 재조합 항체를 100mg/liter 이상 생산가 능하다고 보고되기도 하였다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 또는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 객체에 투여되는 방식으로 사용되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 주사용 앰플을 통해 사용될 수 있다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 이렇게 제조된 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 세포와 함께 혼합물의 형태로 투여될 수 있다. 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예1> CAR mRNA 구조
본 발명에서 사용된 키메라항원수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)는 타겟을 인지하는 엑토도메인(Ectodomain), 세포 내 신호전이(cell signaling)를 유도하는 엔도도메인(Endodomain), 엑토도메인의 연결 및 유연성을 부여하는 스페이서(Myc-Hinge), 세포막을 투과하는 Transmembrane (TM) domain으로 구성된다. 엑토도메인은 중쇄와 경쇄가 링커를 통해 연결된 ScFv로 구성되고, 엔도도메인은 co-activator로 CD28과 DAP10을 채택했고, cytotoxic signaling을 담당하는 CD3z로 구성한 3세대 CAR 구조로, 도 1과 같다.
<실시예2> 형질전환 (Transfection) 최적화
형질전환 최적화 조건을 확립하기 위해 1 X 106세포 당 2μg GFP-mRNA를 이용해 110V에서 200V로 전압을 변화시키면서 Nepa21 시스템을 이용해 형질전환(transfection)을 수행해 GFP의 발현을 살펴본 결과, 전압 증가와 함께 세포 생존율이 감소하였다(도 2). NK92 세포주(NK 세포주, 자연살해세포 세포주)에서 110V, 125V, 140V에서 GFP가 90% 이상 발현됐고, CAR-mRNA의 transfection 효율 평가에서 110V 조건에서 최상의 세포생존율과 발현율을 보였다. NK92 1 X 106 세포 당 사용하는 mRNA 양을 2 μg에서 5μg으로 높인 결과 발현율이 증가했고, transfection 후 3일까지 CAR의 발현이 관찰되었다. 이를 바탕으로 Scale-up을 시도하였고, 1 X 107 세포 당 20μg mRNA를 transfection시 발현율이 좋았고, 지속기간은 1 X 106 세포와 동일하게 transfection 후 3일 동안 유지되는 것을 확인하였다.
제대혈로부터 CD3 세포들을 depletion한 monocytes에 hydrocortisone과 cytokines (IL15, IL21)을 7일 이상 처리해 성숙시킨 primary NK 1 X 106 세포 당 5μg GFP-mRNA를 Nepa21 시스템으로 tranfection한 결과, 190V, 200V 조건에서 transfection 효율이 높게 나타났다 (도 3). 상기와 같이 CAR-mRNA의 transfection 효율 평가에서 200V 조건에서 최상의 효율을 보였다.
<실시예3> 일시적 (Transient) CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에서 시간별 CAR 발현 확인
상기 Nepa21 시스템을 이용해 CEACAM6을 인지하는 anti-CEACAM6 scFv, 항원에 대한 항체에 cotinine을 태그하고 이를 인지할 수 있는 anti-cotinine scFv를 가진 CAR mRNA들을 NK92에 transfection한 후 시간경과에 따른 CAR 발현 양상과 일시적(transient) CAR-NK 세포의 cytotoxicity를 살펴보았다. NK92 세포에서 CEACAM6, cotinine에 대한 scFv 서열에 따른 CAR 발현율을 살펴본 결과, anti-CEACAM6-CAR의 경우 mRNA 주입 후 48시간까지 90% 이상의 높은 발현율을 유지했고 4일까지 발현이 지속되었으며, anti-continine-CAR의 경우 mRNA 주입 후 16시간까지 70% 이상의 발현율을 보이고 2일까지 발현이 지속되었다. 그리고 EGFR에 대한 conjugate 분자를 이용해 Cotinine-CAR-NK 세포의 암세포 용해 활성을 측정한 결과, CAR mRNA를 transfection한 후 단백질 발현이 높을 때 cytotoxicity가 높고, 이후 발현율 감소와 함께 암세포 살상능(cytotoxicity)이 감소되는 것을 확인하였다(도 4, 도 5).
<실시예4> DAP10를 포함하는 키메라항원 수용체의 발현율 및 암세포 살상능 (cytotoxicity) 향상 확인
시그널링(Signaling)을 담당하는 엔도도메인(Endodomain)을 구성하는 각 구조의 기능 및 작용을 평가하기 위해 엑토도메인(Ectodomain)이 없는 △Ecto-TM-10z와 항-EGFR 활성을 갖는 애피바디(Affibody)를 Ectodomain으로 갖는 ZEGFR-CAR를 구성하였다. ZEGFR-CAR는 pSK 벡터를 바탕으로 CD28의 TM motif와 ITAM motif를 갖는 ZEGFR-TM, 여기에 DAP10이 추가된 ZEGFR-TM-10 또는 CD3z가 추가된 ZEGFR-TM-z, DAP10과 CD3z를 모두 갖춘 ZEGFR-TM-10z 벡터들을 구축하였다(도 6). 이를 바탕으로 CAR mRNA를 합성하였고, NK92세포에서 FACS를 이용해서 CAR의 발현을 측정하였다(도 7). DAP10, CD3z를 모두 갖춘 ZEGFR-TM-10z의 경우, CAR 발현율은 ZEGFR-TM-10과 유사하였다. CD28, DAP10과 같이 2개의 co-activation motif를 가진 3세대 CAR 구조와 DAP10 1개만 가진 2세대 CAR 구조를 비교한 결과, CAR의 발현율 및 발현감소 속도는 유사했고, cytotoxicity는 CAR mRNA의 transfection 후 8시간 뒤에는 유사했으며, 25시간 뒤에는 2세대 CAR구조가 더 높은 cytotoxicity를 보였다 (도 8). 또한 co-activation domain 2개로 구성된 3세대 CAR에서 DAP10 motif 대신에 4-1BB motif를 사용한 경우, DAP10 motif를 사용한 ZEGFR-10z가 4-1BB motif를 갖는 ZEGFR-BBz보다 CAR 발현율 및 지속성이 더 좋았고, 폐암세포주 A549와 유방암세포주 AU565에 대한 cytotoxicity도 비슷하거나 ZEGFR-10z가 더 높게 나타나는 것을 확인하였고(도 9), 다음으로 DAP10 motif 대신에 2B4 motif를 사용한 경우, DAP10 motif를 사용한 ZEGFR-10z가 2B4 motif를 갖는 ZEGFR-2B4z보다 CAR 발현율 및 지속성이 더 좋았고, CAR mRNA transfection 후 8시간과 25시간이 지난 시점에 각각 수행한 유방암세포주인 AU565 세포에 대한 cytotoxicity도 ZEGFR-10z가 더 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 10).
<실시예5> mRNA의 구조적 안정성 및 목적 단백질의 발현 향상을 위한 UTR 확인
5-1. mRNA 구조체 설계 및 제작
mRNA의 구조적 안정성과 목적 단백질의 발현을 높이기 위해 5' UTR과 3' UTR을 다양하게 변형한 mRNA 구조체 1~7을 설계하고(도 11a), T7 promotoer 영역을 포함하고 각 mRNA 구조체를 코딩하는 벡터로부터 전사체를 획득하여 mRNA 구조체 1~7을 제작하였다(도 11b). 하기 표 1 및 도 11a는 설계된 mRNA 구조체이고 실험에 이용된 mRNA 구조체는 5'-Cap과 3'-Poly-A tail을 포함한다. mRNA 구조체가 포함하는 각 영역에 상보적인 DNA 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
구조체 No. | 명명 | mRNA Size | Rank |
1 | ZE-BBz | 1286 bp | 1 |
2 | ZE-BBz-BGH | 1519 bp | 3 |
3 | 5U-ZE-BBz | 1345 bp | 2 |
4 | 5U-ZE-BBz-BGH | 1578 bp | 4 |
5 | 5U-ZE-BBz-IRES-BGH | 2164 bp | 5 |
6 | 5U-ZE-BBz-reIRES-BGH | 2164 bp | 5 |
7 | 5U-IRES-ZE-BBz-BGH | 2164 bp | 5 |
서열번호 | 유전자 | 서열 |
1 | β-globin UTR |
ACATTTGCTTCTGACATAGTTGTGTTGACTCACAACCCCAGAAACAGACATCC |
2 | BGH | GCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA |
3 | EMCV-IRES | TCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGTTGATAATTTG |
5-2. mRNA stability 평가
1 x 107개의 NK92 세포에 20μg 의 상기 mRNA 구조체 1 내지 7를 상기 실시예 2에서 확인한 최적화 조건하에 형질전환을 유도하고, 시간 경과에 따라 NK92 세포 내로 주입된 mRNA level 을 확인하였다.
5'-β-globin UTR, 3'-BGH, EMCV-IRES 구조의 유무, EMCV-IRES의 정/역방향 또는 5'/3' 위치에 따른 CAR mRNA stability 평가를 위하여, 세포 내로 주입된 mRNA의 시간 경과에 따른 감소비율을 확인하였다 (도 12(A)).
그 결과, 형질전환 초기인 형질주입 후 4시간째에 평가한 mRNA 구조체 존재양을 기준 (1)로 했을 때, 5U-ZE-BBz은 ZE-BBz보다 36.9%, 5U-ZE-BBz-BGH는 ZE-BBz-BGH보다 35.9% 향상된 mRNA stability를 나타냈고, ZE-BBz-BGH가 ZE-BBz보다 20.2%, 5U-ZE-BBz-BGH가 5U-ZE-BBz보다 19.1% 향상된 mRNA stability를 나타내었으며, 5'-β-globin과 3'-BGH를 모두 포함하는 U-ZE-BBz-BGH는 ZE-BBz보다 56.1% 향상된 mRNA stability를 나타내었는바, 5'-β-globin과 3'-BGH의 존재가 mRNA의 안정성을 상승시킴을 알 수 있었다(도 12(B) 및 도 12(C)).
5-3. translational stability 평가
이어서, 5'-β-globin UTR, 3'-BGH, EMCV-IRES 구조의 유무, EMCV-IRES의 정/역방향 또는 5'/3' 위치에 따른 CAR mRNA의 translational stability 평가를 위하여, 형질전환 유도 4, 8, 18, 24시간 경과 후 CAR protein의 발현 감소 정도를 확인하였다(도 13).
그 결과, CAR 단백질 발현이 최고점에 이르는 형질전환 유도 후 8시간에서의 CAR 단백질 발현율을 기준 (1)로 했을 때, ZE-BBz-BGH가 ZE-BBz보다 28.4%, 5U-ZE-BBz-BGH가 5U-ZE-BBz보다 24.3% 향상된 단백질 발현율을 나타내고, 5U-ZE-BBz-IRES-BGH은 5U-ZE-BBz-BGH보다 33.3% 향상된 단백질 발현율을 나타내었는바, 3'-BGH와 3'-EMCV-IRES가 단백질 발현율 상승에 기여함을 알 수 있었다.
한편, 3'-EMCV-IRES의 존재가 단백질의 발현을 상승시키는것과 대조적으로 EMCV-IRES를 역방향으로 삽입해 translation을 위한 looping 구조형태를 변형한 경우와 5'에 EMCV-IRES를 위치시킨 경우 단백질 발현율이 급격히 감소하였다.
5-4. cytolytic activity 평가
이어서 transient NK92 세포에서 functional CAR protein expression level 을 확인하기 위하여 폐암세포주 A549와 유방암세포주 AU565에 상기 NK92 세포를 처리하여 cytolytic activity를 평가하였다(도 14a 및 도 14b).
그 결과, transient NK92 세포에서 CAR 단백질의 발현 정도에 상응하는 cytolytic activity가 확인되었으며, 일련의 반응인 IFNγ, TNFα secretion도 그에 상응하게 증가됨을 확인하였다. CAR 단백질 발현 정도와 cytolytic activity는 5U-ZE-BBz-BGH와 5U-ZE-BBz-IRES-BGH에 높게 나타났으며, 특히 5U-ZE-BBz-IRES-BGH에서 가장 높았다.
5-5. IRES-BGH와 BGH-IRES의 비교
3' UTR에 위치하는 IRES와 BGH 순서의 영향을 확인하고자 하였다.
먼저, 하기 표 3과 같이 mRNA를 설계하고 도 12에 도식화된 방법에 의해 mRNA를 제조한 후 전기영동을 수행한 결과, 3'UTR에 BGH-IRES 순서의 mRNA는 in vitro transcription 과정에서 mRNA에 IRES 미포함 또는 포함으로 분리된 전사체가 생성되었으나, IRES-BGH의 경우 3' UTR에 IRES가 위치하는 단일의 mRNA가 생성됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, IRES의 복잡한 2차 구조 때문에 IRES가 BGH 뒤에 오는 경우 IRES가 mRNA와 분리되는 경우가 발생함을 알 수 있다(도 15a).
구조체 No. | 명명 |
1 | UTR-COT-MH-10Z-IRES-BGH-PolyA |
2 | UTR-COT-MH-10Z-BGH-IRES-PolyA |
또한, 상기 제조된 mRNA 구조체를 이용하여 상술한 실시예 2의 방법으로 NK92 세포에 형질주입하여 CAR 단백질의 발현 수준과 암세포 살상능을 확인한 결과, IRES-BGH 순서의 mRNA가 CAR 단백질을 높은 효율로 발현시키며 암세포 살상능이 BGH-IRES 순서의 mRNA보다 높음을 확인하였다(도 15b).
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<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'-UTR (B-globin)
<400> 1
acatttgctt ctgacatagt tgtgttgact cacaacccca gaaacagaca tcc 53
<210> 2
<211> 215
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'-UTR (BGH)
<400> 2
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180
gaggattggg aagacaatag caggcatgct gggga 215
<210> 3
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'-UTR (EMCV-IRES)
<400> 3
tccccctctc cctccccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg 60
gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc 120
ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa 180
aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag 240
acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg 300
cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg 360
ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa 420
caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg 480
gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 540
ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacgt tgataatttg 580
Claims (13)
- (a) 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 영역, (b) 상기 목적 단백질 암호화 영역의 upstream에 5'-β-globin UTR 영역, 및 (c) 상기 목적 단백질 암호화 영역의 downstream에 BGH, BGH-IRES, 또는 IRES-BGH 영역을 포함하는, mRNA 구조체.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 목적 단백질 또는 펩티드는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)인, mRNA 구조체. - 제2항에 있어서,
상기 키메라 항원 수용체는 특정 타겟과 특이적으로 결합할 수 있는 엑토도메인(Ectodomain), 세포막을 관통하는 막관통 도메인(transmembrane domain), 및 세포 내 신호전이를 유도하는 엔도도메인(Endodomain)을 포함하는 것인, mRNA 구조체. - 제3항에 있어서,
상기 엑토도메인은 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain)가 링커(linker)를 통해 연결된 항체 단편 (ScFv)이고,
상기 엔도도메인은 CD28인, mRNA 구조체. - 제4항에 있어서,
상기 엔도도메인은 DAP10 및/또는 CD3z을 추가로 포함하는 것인, mRNA 구조체. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 mRNA 구조체의 염기서열과 대응하는 또는 이와 상보적인 DNA 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
- (1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 mRNA 구조체를 준비하는 단계; 및
(2) 상기 mRNA 구조체를 숙주세포 내로 주입하는 단계;를 포함하는 형질전환체 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 (2) 단계는 110 내지 140V 조건의 Nepa21 전기천공법에 의해 수행되는 것인, 형질전환체 제조방법. - (a) 제2항의 mRNA 구조체를 준비하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 구조체를 자연살해세포(NK cell) 내로 주입하는 단계;를 포함하는, CAR-NK 세포 제조방법. - 제9항에 있어서,
상기 (b) 단계의 NK cell은 primary NK 세포이고,
mRNA 구조체의 NK 세포 내로의 주입은 190 내지 200 V 조건의 Nepa21 전기천공법에 의해 수행되는 것인, CAR-NK 세포 제조방법. - 제9항 또는 제10항의 방법에 의해 제조된 CAR-NK 세포로서,
상기 세포는 3일 동안 CAR 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는, CAR-NK 세포. - 제11항의 CAR-NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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