KR20220159909A - 단백질 발현용 mRNA 제조방법 및 이에 의해 제조된 mRNA의 용도 - Google Patents
단백질 발현용 mRNA 제조방법 및 이에 의해 제조된 mRNA의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 poly (A) tailing 단계를 포함하지 않고 20 nt 내지 500 nt 길이의 3'- poly (A) tail을 갖는 mRNA 제조방법 등에 관한 것으로서, 본 발명의 제조방법으로 제작된 mRNA 구조체는 안정적이고, 세포내에 주입되어 그 기능을 온전하게 발휘하는 목적 단백질을 장시간 발현할 수 있는바 일시적(transient) 형질전환 기술의 활발한 이용에 기여할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 일시적 형질전환 CAR-NK는 암세포 살상능이 우수하고, NK 세포의 게놈에 유전자 삽입 없이 CAR를 발현하여 체내 안전성이 보장되는 바 항암용 약학 조성물과 고형암을 표적하는 항암면역요법에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 단백질 발현을 위한 형질전환용 mRNA에 대하여, 숙주 세포 내에서 mRNA의 안정성과 단백질로의 번역을 향상시키는 기술에 관한 것이다.
mRNA는 단백질 정보를 암호화하는 DNA의 번역과 세포질의 리보솜에 의한 단백질 생산과정 사이를 연결하는 중간 매개체이다. 치료제 목적을 위한 최적의 시험관 내 전사 mRNA 제조는 T7, T3 또는 Sp6 파지(phage) RNA 중합 효소(polymerase)를 사용하여 선형 DNA 주형(linear DNA template)으로부터 생산된다. 이렇게 만들어진 RNA는 목적 단백질(protein of interest)을 암호화하고 있는 개방형 판독틀(open reading frame; ORF), 비번역구간, 5'-Cap과 다중 아데노신 꼬리 서열(poly (A) tail)을 갖고 있어야 한다. 제작된 mRNA는 완전히 성숙한 자연적인 mRNA 분자와 유사하며 진핵세포의 세포질에 자연적으로 존재하는 것과 동일하여 숙주세포의 선천성 면역계(innate immune system) 작동을 피할 수 있다.
폴리(A) 테일(poly(A) tail)은 mRNA 번역 및 안정성에 중요한 조절 역할을 수행하는바, DNA 주형에서 RNA 전사체를 제작한 후 다중 아데노신 중합효소(poly (A) polymerase)를 사용하여 mRNA의 3' 말단에 아데노신 서열을 연장하는 tailing 작업이 필수적이다. 한편, Poly (A) tail의 길이는 mRNA의 안정성과 단백질 발현 효율에 영향을 미치고, 세포의 종류와 발현하고자 하는 단백질에 따라 최적의 폴리(A) 테일의 길이가 다를 수 있다.
한편, 최근 암 치료를 위한 면역세포 요법으로 체내의 면역세포를 꺼내서 강화시키거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 넣어주는 세포치료 방식이 개발되고 있다. 이의 대표적인 예로는 종양 침윤 림프구(Tumor Infiltrating Lymphocytes, TIL), 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR), T세포 수용체(T-Cell Receptor; TCR) 기술 등이 있으며, 특히 유전자 재조합 변형을 이용한 인공 수용체인 CAR를 이용한 연구 및 임상이 이루어지고 있다. 하지만, 상기 유전공학 변형을 이용한 세포치료 방식 또는 유전자 요법은 게놈 내의 무작위 위치에서의 유전자의 혼입으로 인해서 바람직하지 않은 면역 반응 및 안전성 문제를 비롯한 다수의 도전을 갖는다. 이와 관련하여, DNA를 이용한 형질전환 CAR-NK 세포(Chimeric Antigen Receptor - Natural killer cell)는 CAR 유전자가 게놈에 통합되거나 돌연변이가 발생하여 안전성이 담보되지 않는다는 문제점이 존재한다. 이를 해결하기 위해 mRNA를 이용한 일시적(transient) 형질전환된 CAR-NK 세포를 이용하고자 하는 시도가 있으나, 일시적 형질전환의 경우 mRNA의 불안정성과 낮은 형질주입율 및 목적 단백질 발현율이 장애로 작용하여 성과를 나타낸 연구가 없었다. 이에, 자연살해세포의 세포질에서 분해되지 않고 안정적으로 CAR를 발현할 수 있는 mRNA 구조체의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 숙주세포의 세포질에서 반감기가 길고 목적 단백질의 발현율이 높은 mRNA 구조체 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 mRNA 구조체로 형질전환된 일시적 형질전환체 및 상기 형질전환체를 암의 치료 용도에 제공하는 것이다.
그러나 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열; 및 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA의 하류에 연결된 20nt 내지 500nt의 길이를 갖는 폴리(A) 염기서열;을 포함하는 mRNA 구조체를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 mRNA 구조체의 염기서열과 대응하거나 또는 이와 상보적인 DNA 염기서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트, 및 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 벡터를 주형으로, 시험관내 전사(in vitro transcription)를 수행하는 단계;를 포함하는 안정성이 향상된 mRNA의 제조 방법을 제공한다.
상기 시험관내 전사 이후에, 시험관내에서 폴리(A) 테일링을 수행하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 mRNA 구조체가 숙주세포 내로 도입된 형질전환체 및 이를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항암제 제조를 위한 상기 형질전환체의 용도를 제공한다.
본 발명의 mRNA 구조체는 안정적이고, 세포 내에 주입되어 그 기능을 온전하게 발휘하는 목적 단백질을 장시간 발현할 수 있는바 일시적(transient) 형질전환 기술의 활발한 이용에 기여할 것으로 기대된다. 예컨대, 목적 단백질로 키메릭 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)를 선택하고 본 발명의 mRNA 구조체에 적용하여 제조된 일시적 형질전환 CAR-NK 세포는 CAR를 안정적으로 오랫동안 발현하면서 암세포에 대한 우수한 세포독성을 나타낼 뿐만 아니라, 자연살해 세포의 게놈에 유전자 삽입 없이 CAR를 발현하여 체내 안전성이 보장되기까지 하므로, 항암용 약학 조성물과 고형암을 표적하는 항암면역요법에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 CAR mRNA의 구조 및 CAR의 도메인 및 모티프(motif) 구성을 나타낸 것이다.
도 2는 형질전환(Transfection) 최적화에 대한 결과를 나타낸 것으로, Nepa21 시스템을 이용한 NK92 세포에 대한 형질전환 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 형질전환(Transfection) 최적화에 대한 결과를 나타낸 것으로, Nepa21 시스템을 이용한 primary NK 세포에 대한 transfection 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Transient CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에서 시간별 CAR 발현 확인에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Transient CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에 대한 시간별 암세포 살상능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 DAP10를 포함하는 키메라항원수용체의 발현율 및 암세포 살상능에 대한 확인 실험을 위한 벡터 구축 또는 CAR를 구성하는 도메인 및 모티프를 나타낸 것이고,
도 7은 상기 도6과 관련하여, FACS를 이용하여 CAR mRNA 형질전환 시 DAP10 유무에 따른 CAR 발현율 확인을 나타낸 것이다.
도 8은 CAR 구조에서 co-activator 2개(CD28, DAP10)를 갖는 3세대 CAR와 co-activator 1개(DAP10)를 갖는 2세대 CAR 형태에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 CAR 구조에서 co-activator DAP10과 4-1BB에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 CAR 구조에서 co-activator DAP10과 2B4에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 5'-β-globin UTR, 3'-BGH, EMCV-IRES 구조의 유무, EMCV-IRES의 정/역방향 또는 5'/3' 위치를 상이하게 설계한 mRNA 구조체의 모식도이고, 도 11b는 mRNA 구조체 제조과정을 도식화한 도면이다.
도 12는 세포 내로 주입된 mRNA 구조체 1 내지 7의 시간 경과에 따른 감소비율을 비교한 도면이다.
도 13은 mRNA 구조체 1 내지 7이 주입된 transient NK92 세포의 CAR 단백질 발현 수준을 비교 확인한 도면이다.
도 14는 mRNA 구조체 1 내지 7이 주입된 transient NK92 세포의 폐암 세포주 및 유방암세포주에서의 독성을 비교 확인한 도면이다.
도 15a는 3' 말단에 BGH와 IRES의 순서를 달리한 mRNA의 염기서열과 대응하는 또는 이에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 벡터에서 획득된 전사체를 전기영동을 통해 확인한 도면이다.
도 15b는 3' 말단에 BGH와 IRES의 순서를 달리한 mRNA 구조체의 세포 내 목적 단백질 발현 효율과 목적 단백질의 성능을 확인한 도면이다.
도 16a 및 도 16b는 3' 말단에 poly(A) 서열의 유무에 따른 mRNA 구조체의 세포 내 목적 단백질 발현 효율과 목적 단백질의 성능을 확인한 도면이다.
도 2는 형질전환(Transfection) 최적화에 대한 결과를 나타낸 것으로, Nepa21 시스템을 이용한 NK92 세포에 대한 형질전환 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 형질전환(Transfection) 최적화에 대한 결과를 나타낸 것으로, Nepa21 시스템을 이용한 primary NK 세포에 대한 transfection 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Transient CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에서 시간별 CAR 발현 확인에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Transient CAR NK92 세포와 Stable CAR NK92 세포에 대한 시간별 암세포 살상능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 DAP10를 포함하는 키메라항원수용체의 발현율 및 암세포 살상능에 대한 확인 실험을 위한 벡터 구축 또는 CAR를 구성하는 도메인 및 모티프를 나타낸 것이고,
도 7은 상기 도6과 관련하여, FACS를 이용하여 CAR mRNA 형질전환 시 DAP10 유무에 따른 CAR 발현율 확인을 나타낸 것이다.
도 8은 CAR 구조에서 co-activator 2개(CD28, DAP10)를 갖는 3세대 CAR와 co-activator 1개(DAP10)를 갖는 2세대 CAR 형태에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 CAR 구조에서 co-activator DAP10과 4-1BB에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 CAR 구조에서 co-activator DAP10과 2B4에 따른 CAR 발현율과 cytotoxicity 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 5'-β-globin UTR, 3'-BGH, EMCV-IRES 구조의 유무, EMCV-IRES의 정/역방향 또는 5'/3' 위치를 상이하게 설계한 mRNA 구조체의 모식도이고, 도 11b는 mRNA 구조체 제조과정을 도식화한 도면이다.
도 12는 세포 내로 주입된 mRNA 구조체 1 내지 7의 시간 경과에 따른 감소비율을 비교한 도면이다.
도 13은 mRNA 구조체 1 내지 7이 주입된 transient NK92 세포의 CAR 단백질 발현 수준을 비교 확인한 도면이다.
도 14는 mRNA 구조체 1 내지 7이 주입된 transient NK92 세포의 폐암 세포주 및 유방암세포주에서의 독성을 비교 확인한 도면이다.
도 15a는 3' 말단에 BGH와 IRES의 순서를 달리한 mRNA의 염기서열과 대응하는 또는 이에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 벡터에서 획득된 전사체를 전기영동을 통해 확인한 도면이다.
도 15b는 3' 말단에 BGH와 IRES의 순서를 달리한 mRNA 구조체의 세포 내 목적 단백질 발현 효율과 목적 단백질의 성능을 확인한 도면이다.
도 16a 및 도 16b는 3' 말단에 poly(A) 서열의 유무에 따른 mRNA 구조체의 세포 내 목적 단백질 발현 효율과 목적 단백질의 성능을 확인한 도면이다.
이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 구조적으로 안정하고 세포 내로 주입되어 온전한 기능을 갖는 목적 단백질의 발현을 장시간 활발하게 유도할 수 있는 mRNA 구조체를 제공한다.
본 발명의 상기 mRNA 구조체는 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열과 폴리(A) 염기서열을 포함한다.
상기 목적 단백질 또는 펩티드는 재조합 형질전환체에서 생산하고자 하는 목적이 되는 단백질 또는 펩티드로서, 형질전환체 자체의 전사 또는 번역 체계를 이용하여 발현이 가능한 모든 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 예컨대, 상기 목적 단백질 또는 펩티드는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 리셉터 및 리셉터의 단편, 항원 및 항원의 단편 또는 유사체, 항체 및 항체 단편, 단선 항체, 구조 단백질, 독소 단백질 등이나, 이들의 일부 또는 이들의 일부 또는 전부가 융합된 단백질 등일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 목적 단백질 또는 펩티드로 키메릭 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)를 이용하였다.
상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열은 RNA 서열일 수 있고, 특히 mRNA 서열일 수 있다.
상기 폴리(A) 염기서열은 복수 개의 아데노신 일인산(adenosine monophosphate)이 인산이에스테르(phosphodiester) 결합을 통해 연결된 염기서열을 의미한다. 상기 폴리(A) 염기서열은 20 nt 내지 500 nt 길이, 예컨대 30 nt 내지 450 nt, 50 nt 내지 400 nt, 100 nt 내지 350 nt, 또는 150 nt 내지 310 nt 길이일 수 있다.
상기 폴리(A) 염기서열은 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 하류(downstream)에 배치될 수 있다. 상기 하류는 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 3'-말단의 다음 부분을 의미한다. 따라서 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 3'-말단의 다음에, 상기 폴리(A) 염기서열이 배치될 수 있다. 이때, 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 3'-말단의 다음에 곧바로 상기 폴리(A) 염기서열이 연결될 수도 있고, 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 3'-말단과 상기 폴리(A) 염기서열의 사이에 임의의 염기서열이 개재될 수도 있다.
상기와 같이 폴리(A) 염기서열이 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 하류(downstream)에 배치되어 구성되는 mRNA 구조체의 경우, 세포 내로 도입된 이후에 사기 세포의 세포질 내에서도 구조적으로 높은 안정성을 나타낼 뿐만 아니라, 온전한 기능을 갖는 목적 단백질 또는 펩티드의 발현을 장시간 활발하게 유도할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 mRNA 구조체는 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 상류(upstream)에 5'-β-globin UTR(untranslated region) 영역을 더 포함할 수 있다. 상기 상류는 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 5'-말단의 앞 부분을 의미한다. 따라서, 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 5'-말단의 앞에, 상기 5'-β-globin UTR 영역이 배치될 수 있다. 이때, 상기 5'-β-globin UTR 영역의 다음에 곧바로 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 5'-말단이 연결될 수도 있고, 상기 5'-β-globin UTR 영역과 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 5'-말단 사이에 임의의 염기서열이 개재될 수도 있다. 한편, 상기 5'-β-globin UTR 영역은 β-globin을 암호화하는 유전자의 상류(upstream), 즉 β-globin을 암호화하는 유전자의 염기서열의 5'-말단의 앞 부분에 존재하는 비해독 부분을 의미한다. 특히, 상기 5'-β-globin UTR 영역은 서열번호 1의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 mRNA 구조체는 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열과 상기 폴리(A) 염기서열 사이에 BGH를 더 포함할 수 있다. 따라서, 상기 BGH는 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 3'-말단과 상기 폴리(A) 염기서열의 5'-말단의 사이에 배치될 수 있고, 마찬가지로 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 3'-말단과 상기 BGH의 사이, 그리고 상기 BGH와 상기 폴리(A) 염기서열의 3'-말단의 사이에는 임의의 염기서열이 개재될 수도 있다. 한편, 상기 BGH는 소 성장인자(bovine growth hormone; bGH)의 폴리아데닐화 신호를 의미한다. 특히, 상기 BGH는 서열번호 2의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
나아가, 상기 본 발명의 mRNA 구조체는 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열과 상기 폴리(A) 염기서열 사이에 IRES를 더 포함할 수 있다. 따라서, 상기 IRES는 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 3'-말단과 상기 폴리(A) 염기서열의 5'-말단의 사이에 배치될 수 있고, 마찬가지로 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 3'-말단과 상기 IRES의 사이, 그리고 상기 IRES와 상기 폴리(A) 염기서열의 3'-말단의 사이에는 임의의 염기서열이 개재될 수도 있다. 특히, 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열과 상기 폴리(A) 염기서열 사이에 BGH와 IRES가 모두 포함되는 경우, 상기 IRES는 i) 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열과 상기 BGH 사이 및 ii) 상기 BGH와 상기 폴리(A) 염기서열 사이 중 적어도 하나에 포함될 수 있다. 한편, 상기 IRES는 내부 리보솜 진입 부위 또는 리보솜 결합 부위로서 mRNA 상에서 고리(loop) 구조를 형성하여 mRNA의 번역(translation)의 개시하는 부분이다. 특히, 상기 IRES는 encephalomyocarditis virus(EMCV)의 IRES 영역일 수 있고, 구체적으로 서열번호 3의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
상기와 같이 구성되는 본 발명의 mRNA 구조체는 세포에 형질전환되기 위한 것일 수 있다. 상기 형질전환은 외래의 염기서열을 세포로 도입시키는 것을 의미하고, 형질전환에 의해 외래 유전자가 도입된 세포는 형질전환체라고 한다. 한편, 상기와 같이 세포 내로 도입된 외래의 염기서열이 세포의 염색체 내로 삽입되거나 또는 독립적으로 복제 가능한 형태로 존재하는 경우, 이를 안정적 형질전환 또는 영구적 형질전환이라고 하고, 그렇지 않은 경우를 일시적(transient) 형질전환이라고 한다. 특히, 본 발명의 상기 mRNA 구조체는 mRNA 그 자체로 세포 내에 형질전환되는 것일 수 있고, 이러한 경우 상기 mRNA 그 자체는 세포 내에서 독립적으로 복제 가능한 형태가 아니고, 시간이 경과함에 따라 세포 내에서 분해되어 소멸된다. 본 발명의 상기 mRNA 구조체는 일시적인 형질전환을 위한 것일 수 있고, 형질전환된 세포의 세포질 내에서 최대한 안정적으로 오랫동안 유지됨으로써 상기 목적 단백질 또는 펩티드의 발현을 지속시킬 수 있도록 하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 목적 단백질인 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 mRNA의 하류에 40nt, 150nt 및 310nt 길이의 폴리(A) 염기서열이 연결된 mRNA 구조체를 설계하였고, 이를 mRNA 상태로 숙주세포인 NK92 세포 및 primary NK 세포에 직접 형질전환시켜 제작한 일시적 CAR-NK 세포에서 상기 mRNA 구조체로부터의 단백질 발현율과 상기 단백질에 의한 활성(암세포에 대한 세포독성)이 눈에 띄게 향상 및 지속됨을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 상기 mRNA 구조체의 염기서열에 대응되거나 또는 이와 상보적인 DNA 염기서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트, 및 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 mRNA 구조체의 염기서열에 대응되는 DNA 염기서열은 상기 mRNA 구조체의 염기서열에서 우라실(uracil, U)이 티민(thymine, T)으로만 바뀌었을 뿐, 나머지 염기서열은 모두 동일한 DNA 염기서열을 의미한다. 또한, 상기 mRNA 구조체와 상보적인 DNA 염기서열은 상기 mRNA 구조체의 염기서열에 대응되는 DNA 염기서열에 대한 안티센스 염기서열을 갖는 DNA 서열을 의미한다.
본 발명의 상기 mRNA 구조체의 염기서열에 대응되거나 또는 이와 상보적인 DNA 염기서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트는 보관 또는 활용을 위해 벡터에 포함된 형태로 이용될 수 있다.
예컨대, 일 구현예에서 상기 벡터는 그 자체로 세포 내로 형질전환될 있다. 이러한 경우 상기 유전자 컨스트럭트는 안정적 또는 영구적으로 형질전환되고, 형질전환체의 전사 및 번역 체계를 이용하여 상기 벡터로부터 목적 단백질 또는 펩티드를 전사 및 번역하여 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 발현시킬 수 있다.
한편, 다른 구현예에서 상기 벡터를 주형으로 시험관내 전사(in vitro transcription)를 통해 mRNA를 제조하고, 이를 세포 내로 형질전환할 수 있다. 이러한 경우 상기 mRNA는 일시적으로 형질전환되고 형질전환체의 번역 체계를 이용하여 목적 단백질 또는 펩티드를 번역하여 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 발현시킬 수 있다. 상기 벡터를 주형으로 시험관내 전사되어 얻어지는 mRNA의 경우 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 하류에 폴리(A) 염기서열이 포함되어 있기 때문에, 세포 내로 도입되더라도 세포의 세포질에서 매우 안정적으로 존재하면서 오랫동안 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 벡터를 주형으로, 시험관내 전사(in vitro transcription)를 수행하는 단계를 포함하는 안정성이 향상된 mRNA의 제조 방법을 제공한다.
상기 시험관내 전사는 RNA 중합효소와 그 보조인자, 기질 NTP와 주형 DNA를 이용하여 시험관 내에서 RNA를 합성하는 과정을 의미하는 것으로서, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자들은 적절한 방법으로 상기 과정을 수행할 수 있다.
특히, 본 발명의 mRNA 제조 방법의 경우, 상기 벡터에 포함된 유전자 컨스트럭트 내에 폴리(A) 염기서열에 대응되거나 또는 이에 상보적인 염기서열이 포함되어 있기 때문에, 상기와 같은 시험관내 전사만을 수행하면 되고, 시험관내 전사 이후에 별도로 또는 추가적으로 시험관내에서 폴리(A) 테일링을 수행하지 않을 수 있다.
일반적으로 시험관내 전사를 통해 mRNA을 얻는 경우, 얻어진 mRNA를 대상으로 폴리(A) 중합효소(poly(A) polymerase) 등을 이용하여 mRNA를 폴리아데닐화(polyadenylation)하는 추가적인 폴리(A) 테일링 과정을 수행하여야 한다. 그런데 이와 같이 폴리(A) 중합효소를 이용하여 폴리(A) 테일링을 수행하는 경우, mRNA의 하류에 연결되는 폴리(A)의 길이를 일정하게 조절할 수 없고, 심지어 몇 개 길이의 폴리(A)가 연결되는지도 정확하게 알 수 없는 문제가 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 mRNA 구조체 내에 폴리(A) 염기서열이 포함되면, 폴리(A) 테일링을 수행할 필요 없이 단순히 시험관내 전사 과정만으로도 단일한 길이를 갖는 안정적인 mRNA를 생산할 수 있게 되는 효과가 있는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 상기 mRNA 구조체에서 상기 목적 단백질 또는 펩티드가 키메릭 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)인 mRNA 구조체가 세포 내로 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 세포는 면역세포일 수 있고, 상기 면역세포는 면역을 유도하여 목적하는 치료 효과를 유발할 수 있는 세포라면 제한 없이 이용될 수 있으며, 말초혈액, 제대혈, 골수, 종양침윤 림프구, 림프절조직 또는 흉선 조직으로부터 획득될 수 있고, 태반세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 조혈줄기세포로부터 분화시켜 획득할 수 있다. 또한, 상기 면역세포는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 그의 유전자삽입 종뿐만 아니라 확립세포주로부터 획득할 수 있다.
면역세포 획득방법은 임의의 당업계에 알려진 수단을 사용할 수 있고, 자가, 동종 또는 이종으로부터 획득할 수 있다. "자가"는 이후에 개체에게 재도입될 동일한 개체로부터 파생된 모든 세포를 의미하고, "동종"은 세포가 도입되는 개체와 동일한 종의 다른 동물로부터 유래된 모든 세포를 의미하는 것이며, "이종"은 다른 종의 동물에서 유래된 세포를 의미한다.
특히, 상기 면역세포는 자연살해 세포(Natural Killer cell, NK cell), T 세포, 자연살해 T 세포(natural killer T cell, NKT cell), 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell; CIK), 마크로파지, 수지상세포 등에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 세포 표면에 발현하는 면역세포는 CAR-NK 세포(Chimeric Antigen Receptor Natural Killer Cell), CAR-T 세포(Chimeric Antigen Receptor T Cell), CAR-NKT 세포(Chimeric Antigen Receptor Natural killer T Cell), CAR-대식세포(Chimeric Antigen Receptor Macrophage) 등일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 면역세포는 통상적인 키메릭 항원 수용체의 표적 세포에 대한 반응 개시(on)/중지(off)를 조절할 수 있으므로, 후속 세포 요법, 치료 세포의 활성이 증가 또는 감소될 필요가 있는 상황에서 매우 유익할 수 있는 안전성 스위치를 포함한다. 예를 들어, 키메릭 항원 수용체를 발현하는 면역세포가 환자에게 제공되는 경우, 어떤 상황에서는 부작용, 예를 들어 탈표적(off-target) 독성이 있을 수 있다. 또는 예를 들어, 치료 세포가 종양 세포의 수 또는 종양 크기를 감소시키는 작용을 할 수 있고, 더 이상 필요하지 않을 수 있다. 이러한 상황에서는 치료세포가 더 이상 활성화되지 않도록 조절할 수 있다. 특히, 자연살해 세포에 키메릭 항원 수용체가 도입된 상기 CAR-NK 세포는, 기존의 T 세포를 기반으로 한 CAR-T 치료제를 이용하였을 때의 암 면역치료가 가지고 있는 지속적인 독성에 의한 문제점, 자가면역 질환의 위험, 이종세포 이식에 대한 이식편대숙주질환(GVHD)의 문제점, 비표적 독성 문제 등을 반응 개시(on)/중지(off)의 스위치를 통해 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 암 세포를 표적할 수 있도록 하여 범용의 치료제로 활용가능한 장점이 있다.
따라서 본 발명의 상기 형질전환체는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있고, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "암"은 "종양"은 동일한 의미로 사용되며, 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 의미한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 특히, 상기 백혈병 또는 림프종 등과 같은 혈액암일 수 있고, 구체적으로 흉선 암종(thymic carcinoma), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 광범위큰세포림프종(diffuse large cell lymphoma), 소림프구성세포 림프종(small lymphocytic lymphoma), T-세포 종양(T-cell neoplasma), 말초 T-세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), T-세포 급성림프구성백혈병(T-cell acute lymphobalstic lymphoma), 만성림프성백혈병(chronic lymphoblastic lymphoma) 등에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물은, 치료 대상인 개체의 종양 세포의 수에 비해 상기 면역세포의 수가 1배 내지 10배, 2배 내지 10배, 또는 5배 내지 8배로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 암의 치료에는 화학요법 및 방사선 요법을 병행하는 것이 일반적이다. 화학요법에 이용되는 항암제는 증식이 활발한 세포의 세포사멸을 유도하고 항암제의 치료 효과를 높이기 위한 방사선 조사는 이러한 세포사멸을 증가시킨다. 이때 항암제 및 방사선에 의해 세포사멸이 유도되는 세포는 암세포에 한정되는 것이 아니며, 면역치료를 위해 개체에 투여된 면역세포치료제에도 영향을 미칠 수 있다.
화학요법은 CHOP(cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone), EPOCH(etoposide, vincristine, doxorubicin, cyclophosphamide, prednisone) 또는 임의의 다른 여러약물 요법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 "세포치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용 가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 것이며, 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 개체에 투여를 위한 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 형질전환체의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 형질전환체의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 형질전환체의 항암제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여방법에 특별히 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 상술한 형질전환체 이외에 공지된 항암제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예 1]
목적 단백질의 설계
본 발명의 mRNA 구조체에 적용되어 세포 내에서 일시적으로 발현시킬 목적 단백질로 도 1과 같이 구성된 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR)를 설계하였다. 구체적으로, 상기 키메릭 항원 수용체는 표적을 인지하는 엑토도메인(ectodomain), 상기 엑토도메인의 연결 및 유연성을 부여하는 스페이서(spacer)(Myc-Hinge), 세포막을 투과하는 TM 도메인(transmembrane domain) 및 세포 내 신호전달(cell signaling)을 유도하는 엔도도메인(endodomain)이 순차적으로 연결되어 구성된다. 본 발명에서는 상기 엑토도메인으로 CEACAM6를 항원으로 인지하는 항-CEACAM6 항체의 ScFv, 코티닌(cotinine)을 항원으로 인지하는 항-cotinine 항체의 ScFv 또는 EGFR을 항원으로 인지하는 항-EGFR 애피바디(affibody)를 이용하는 한편, 엔도도메인으로 세포독성 신호전달(cytotoxic signaling)을 담당하는 CD3ξ와 함께, CD28과 DAP10을 공-활성자(co-activator)로 채택하여, 항-CEACAM6 scFv를 가지는 키메릭 항원 수용체(항-CEACAM6-CAR), 항-cotinine scFv를 가지는 키메릭 항원 수용체(항-cotinine-CAR) 및 항-EGFR의 애피바디를 가지는 키메릭 항원 수용체(ZEGFR-CAR)를 각각 설계하였다. 그리고 이를 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열을 pBluescript SK(-) 벡터(Addgene사)와 렌티-바이러스 벡터(Clontech사, 632155)에 각각 삽입하였다.
[실시예 2]
자연살해 세포로의 일시적 형질전환(transient transfection)을 위한 최적 조건 확립
mRNA 구조체를 자연살해 세포로 일시적 형질전환시킬 수 있는 최적의 조건을 확립하기 위해, Nepa21 시스템을 이용하여 전압을 110V에서 200V로 변화시키면서, GFP의 mRNA를 세포 1X106개당 2μg의 양으로 NK92 세포에 형질전환한 다음, NK92 세포에서 GFP의 발현을 살펴보았다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 전압이 상승함에 따라 NK92 세포의 생존률은 점점 감소하였으나, 150V 이하의 전압에서는 생존한 NK92 세포들의 90% 이상에서 GFP가 발현되는 것으로 확인되었고, 110V 조건에서 최상의 세포생존율과 GFP 발현율을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, NK92 세포 1X106개당 처리한 mRNA 양을 2μg에서 5μg으로 높여 110V의 전압으로 형질전환시킨 결과, 발현율이 증가되었고, 형질전환 후 3일이 경과할 때까지 GFP의 발현이 관찰되었다. 이를 바탕으로, NK92 세포 1X107개당 20μg의 mRNA를 110V의 전압으로 형질전환시켜 스케일-업(scale-up)을 해 보았고, 이 경우에도 발현율과 발현 지속성이 우수하게 유지되는 것으로 확인되었다.
또한, 제대혈에서
CD3+ 세포들을
제거(deplete)하여 얻어진 단핵구(monocytes)에 히드로코르티손(hydrocortisone)과 IL15, IL21 등과 같은 사이토카인(cytokines)을 7일 이상 처리하여 성숙시킨 primary NK 세포를 대상으로, 상기 NK92 세포에서와 동일하게 전압을 변화시키면서 GFP의 mRNA를 세포 1X106개당 5μg의 양으로 형질전환한 다음, primary NK 세포에서 GFP의 발현을 살펴보았다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 190V 및 200V 조건에서 형질전환 효율이 높게 나타났고, 200V 조건에서 최상의 효율을 보였다(도 3).
[실시예 3]
자연살해 세포에서 목적 단백질의 일시적(Transient) 발현과 영구적 발현의 비교
상기 실시예 1에서 설계한 목적 단백질 중 항-CEACAM6-CAR와 항-cotinine-CAR를 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열이 삽입된 각각의 pBluescript SK(-)벡터로부터, 시험관내 전사(in vitro transcription) 및 폴리(A) 테일링(poly(A) tailing)을 통해 항-CEACAM6-CAR와 항-cotinine-CAR의 mRNA를 각각 수득하였다.
상기와 같이 수득된 항-CEACAM6-CAR와 항-cotinine-CAR의 mRNA들을 상기 실시예 2에서 이용된 Nepa 21 시스템을 이용하여 110V 전압으로 NK92 세포에 형질전환시켜 일시적(transient) CAR-NK 세포를 제작하였다.먼저, 상기와 같이 제작된 일시적 CAR-NK 세포를 대상으로, 유세포분석을 통해 시간의 경과에 따른 CAR의 발현 양상(발현율 및 발현 지속성)을 확인한 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 항-CEACAM6-CAR의 경우 mRNA 주입 후 48시간까지 90% 이상의 높은 발현율을 유지했고 그 발현이 4일 동안 지속되었고, 항-cotinine-CAR의 경우 mRNA 주입 후 16시간까지 70% 이상의 발현율을 보였다.
또한, 유방암 세포주인 AU565에 대하여, 상기와 같이 제작된 일시적 CAR-NK 세포들의 세포독성(cytotoxicity)(또는 세포살상능, 세포용해 활성)을 칼세인 AM 분석법으로 확인하였다. 구체적으로, AU565 세포에 칼세인-AM(life technologies; C1430)을 5ug/ml의 농도로 처리하여 반응시킨 후(37℃, 5% CO2, 암소에서 1시간), 칼세인으로 염색된 AU565 세포에 상기 일시적 CAR-NK 세포를 각각 10:1, 5:1, 1:1의 비율(자연살해 세포 : 암 세포)로 처리하여 200ul의 RPMI1640(10% FBS)에서 5.5시간, 13시간, 25시간, 50시간 및 82시간 동안 반응시킨 다음(37℃, 5% CO2) 상등액 100ul를 취하여 상등액 내에 존재하는 칼세인의 양을 확인하여, 각 조건에 따른 세포독성을 아래와 같은 방법으로 계산하였다. 이때, 항-cotinine-CAR를 발현하는 일시적 CAR-NK 세포는 EGFR에 대한 항체에 코티닌(cotinine)이 태깅된 접합체(conjugate)와 함께 상기 AU565 세포에 처리하였다.
세포독성(%) = (조건에 따른 칼세인 release value-spontaneous value) / (maximum value-spontaneous value) x 100
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 항-cotinine-CAR의 mRNA를 형질전환한 후 상기 CAR들의 단백질 발현이 높을 때 암세포에 대한 세포독성 또한 높고, 이후 상기 CAR들의 단백질 발현이 감소함과 함께 세포독성 또한 감소되는 것으로 확인되었다.
한편, 상기 실시예 1에서 설계한 두 목적 단백질인 항-CEACAM6-CAR와 항-cotinine-CAR를 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열이 삽입된 각각의 렌티-바이러스 벡터를 바이러스 패키징 벡터(viral packaging vector; PMDLg/RRE, RSV/REV, VSVG)와 함께 HEK293T 세포에 형질전환시키고, 그로부터 항-CEACAM6-CAR와 항-cotinine-CAR를 발현하는 렌티바이러스를 얻었다. 상기 렌티바이러스를 초고속원심분리기를 이용하여 농축시키고, 농축된 상기 렌티바이러스를 HEK293T 세포에 감염시킨 뒤, CD5-CAR의 Myc 에피토프 양을 유동세포계수법(Flow cytometry)으로 확인하여 감염 단위(Infection Unit)을 계산하였다. 감염다중도(Multiplicity of infection; MOI)가 30이 되도록 자연살해 세포 수 및 렌티바이러스의 양을 계산하고, 항-CEACAM6-CAR와 항-cotinine-CAR를 발현하는 렌티바이러스를 각각 NK92 세포에 spinoculation 방법(360g, 90min, RT)으로 감염시켜, 영구적(stable) CAR-NK 세포를 제작하였다.
상기와 같이 제작된 영구적 CAR-NK 세포에 대하여, 상기 일시적 CAR-NK 세포에서와 동일한 방법으로, 시간의 경과에 따른 CAR의 발현 양상(발현율 및 발현 지속성)과 세포독성을 확인하였다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 항-CEACAM6-CAR의 경우 일시적 CAR-NK 세포와 마찬가지로 48시간까지 90% 이상의 높은 발현율을 유지했고 그 발현이 4일 동안 지속되었고, 항-cotinine-CAR의 경우 40%에 미치지 못하는 발현율이 2일 동안 지속되는 것으로 확인되었다. 또한, 세포독성은, 도 5에 도시된 바와 같이, 일시적 CAR-NK 세포와 마찬가지로 CAR들의 단백질 발현과 동일한 양상을 나타내는 것으로 확인되었다.
[실시예 4]
공-활성자(co-activator)를 포함하는 키메릭 항원 수용체의 발현율 및 암세포에 대한 세포독성(cytotoxicity) 확인
상기 실시예 1에서 설계한 키메릭 항원 수용체의 엔도도메인을 구성하는 각 부분의 기능 및 mRNA의 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해, 도 6에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR를 기준으로, 엑토도메인이 없는 변형 ZEGFR-CAR인 ΔEcto-TM-10z와, 엔도도메인의 일부 구성들이 제거된 3종의 변형 ZEGFR-CAR들(ZEGFR-TM, ZEGFR-TM-10 및 ZEGFR-TM-z)를 설계하고, 이들을 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열을 렌티-바이러스 벡터(Clontech사, 632155)에 삽입하였다.
상기 ZEGFR-CAR와 상기 4종의 변형 ZEFGR-CAR들을 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열이 포함된 렌티-바이러스 벡터로부터, 시험관내 전사(in vitro transcription) 및 폴리(A) 테일링을 통해, 상기 5종의 CAR들의 mRNA를 수득하였다. 그리고, 상기 mRNA들을 상기 실시예 2에서 이용된 Nepa 21 시스템을 이용하여 110V 전압으로 NK92 세포에 형질전환시켜 일시적(transient) CAR-NK 세포를 제작하였다. 상기와 같이 제작된 5종의 일시적 CAR-NK 세포를 대상으로, 상기 실시예 3에서와 동일한 방법으로 CAR의 발현 및 상기 일시적 CAR-NK 세포의 세포독성을 측정하였다.
그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, DAP10을 갖지 않은 ZEGFR-TM 및 ZEGFR-TM-z에 비해, DAP10을 갖는 ZEGFR-TM-10와 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR(ZEGFR-TM-10z)의 경우에 CAR의 발현율이 향상되고(도 7의 (A)), 상기 CAR 단백질에 의한 NK 세포의 세포자살(apoptosis) 비율도 감소되는 것으로 확인되었다(도 7의 (D)). 아울러, DAP10과 CD3ξ를 모두 갖는 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR(ZEGFR-TM-10z)의 경우, NK92 세포에서 CD107a의 발현을 향상시킬 뿐만 아니라(도 7의 (B)), 실제로 유방암 세포주 AU565에 대한 일시적 CAR-NK 세포의 세포독성 역시 훨씬 향상시키는 것으로 확인되었다(도 7의 (C)).
또한, 상기 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR를 기준으로, CD28의 ITAM motif가 제거된 변형 ZEGFR-CAR(ZEGFR-MH-TM-10z-B)를 각각 설계하였고, 상술한 바와 같은 방법으로 수득한 상기 변형 ZEGFR-CAR의 mRNA를 상술한 바와 같은 방법으로 NK92 세포에 형질전환시켜 일시적 CAR-NK 세포를 제작하였으며, 상술한 바와 같은 방법으로 CAR의 발현 및 상기 일시적 CAR-NK 세포의 세포독성을 측정하였다.
그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, CD28의 ITAM motif가 제거된 변형 ZEGFR-CAR(ZEGFR-MH-TM-10z-B)의 경우에, 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR(도 8에서는 'ZEGFR-MH-TM-28-10z-B'로 표시됨)에 비해 CAR의 발현율이 저하될 뿐만 아니라, 유방암 세포주 AU565에 대한 일시적 CAR-NK 세포의 세포독성 역시 CD28의 ITAM motif를 포함하는 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR에 미치지 못하는 것으로 확인되었다.
마지막으로, 상기 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR를 기준으로, DAP10 motif 대신 4-1BB motif 또는 2B4 motif를 갖는 변형 ZEGFR-CAR들(각각 'ZEGFR-MH-BBz' 및 'ZEGFR-MH-2B4z'라고 함)을 각각 설계하였고, 상술한 바와 같은 방법으로 수득한 상기
변형 ZEGFR-CAR들의 mRNA를 상술한 바와 같은 방법으로 NK92 세포에 형질전환시켜 일시적 CAR-NK 세포를 제작하였으며, 상술한 바와 같은 방법으로 CAR의 발현 및 상기 일시적 CAR-NK 세포의 세포독성을 측정하였다.
그 결과, 도 9 및 도 10에 도시된 바와 같이, 4-1BB motif나 2B4 motif를 가지는 변형 ZEGFR-CAR들의 경우에, DAP10 motif를 가지는 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR에 비해 CAR의 발현율이 저하될 뿐만 아니라, 유방암 세포주 AU565에 대한 일시적 CAR-NK 세포의 세포독성 역시 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR에 미치지 못하는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과로부터, 엔도도메인으로 CD3ξ와 함께, CD28과 DAP10을 모두 가지는 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR가 CAR의 발현율이나 일시적 CAR-NK 세포의 세포독성 측면 모두에서 가장 효과가 우수한 것임을 알 수 있다.
[실시예 5]
mRNA의 구조적 안정성 및 목적 단백질의 발현 향상을 위한 구성 확인
[5-1]
목적 단백질에 대한 mRNA 구조체 설계 및 제작
목적 단백질에 대한 mRNA의 구조적 안정성과 그 단백질의 발현에 5'-UTR 및 3'-UTR이 어떠한 역할을 하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR를 대상으로 5'-UTR과 3'-UTR을 다양하게 변형하여 하기 표 1에 기재된 바와 같은 mRNA 구조체 1~7을 설계하였다. 도 11a는 하기 표 1에 기재된 7종의 mRNA 구조체를 합성하기 위한 주형 벡터에서 T7 프로모터 다음에 배열된 구조체의 모식도이고, 하기 표 2는 ZEGFR-CAR의 5'-UTR 및 3'-UTR에 도입한 구성의 DNA 서열을 나타낸 것이다.
구조체 No. | 명명 | mRNA Size |
1 | CAR(실시예 1에서 설계한 ZEGFR-CAR) | 1286 bp |
2 | CAR-BGH | 1519 bp |
3 | 5U-CAR | 1345 bp |
4 | 5U-CAR-BGH | 1578 bp |
5 | 5U-CAR-IRES-BGH | 2164 bp |
6 | 5U-CAR-reIRES-BGH | 2164 bp |
7 | 5U-IRES-CAR-BGH | 2164 bp |
e | 유전자 | 염기서열 |
1 | 5U(β-globin UTR) | ACATTTGCTTCTGACATAGTTGTGTTGACTCACAACCCCAGAAACAGACATCC |
2 | BGH | GCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA |
3 | EMCV-IRES | TCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGTTGATAATTTG |
상기와 같이 설계된 7종의 mRNA 구조체를 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열들을 pBluescript SK(-) 벡터(Addgene사)에 삽입하였고, 도 11b에 도시된 바와 같은 시험관내 전사(in vitro transcription) 및 폴리(A) 테일링을 통해 mRNA 구조체 1~7을 제작하였다.
상기와 같이 얻어지는 7종의 mRNA에는 도 11b에 도시된 바와 같이, 5'-Cap과 3'-Poly(A) tail이 결합되어 있다.
[5-2]
mRNA 구조체의 구조적 안정성(structural stability) 평가
상기 실시예 [5-1]에서 수득한 7종의 mRNA들을, 상기 실시예 2에서 이용된 Nepa 21 시스템을 이용하여 110V 전압으로 NK92 세포에 형질전환시켜 일시적(transient) CAR-NK 세포를 제작하였다. 상기와 같이 제작된 일시적 CAR-NK 세포를 대상으로, 시간의 경과에 따라 NK92 세포 내로 주입되어 세포질에 잔존하는 mRNA의 양을 RT-PCR로 확인하였다.
먼저, 상기와 같이 mRNA를 NK92 세포 내로 주입한 후 4시간이 경과한 시점에서 mRNA의 잔존량은, 도 12의 (A)에서 확인되는 바와 같이, CAR > 5U-CAR > CAR-BGH > 5U-CAR-BGH > 5U-CAR-IRES-BGH 순으로, NK92 세포 내에 잔존하는 mRNA의 양이 많음을 알 수 있다(도 12의 (A) 및 표 1).다음으로, mRNA를 NK92 세포 내로 주입한 후 4시간이 경과한 시점에서의 mRNA의 잔존량을 1로 두고 8시간 경과한 시점에서의 mRNA의 잔존량을 평가한 결과, 도 12의 (B) 및 (C)에 도시된 바와 같이, mRNA 구조체의 5'-UTR 부분에 5'-β-globin이 존재함으로써 5U-CAR는 CAR보다 36.9%, 5U-CAR-BGH는 CAR-BGH보다 35.9% 향상된 안정성을 나타내는 것으로 확인되었고, mRNA 구조체의 3'-UTR 부분에 3'-BGH가 존재함으로써 CAR-BGH가 CAR보다 20.2%, 5U-CAR-BGH가 5U-CAR보다 19.1% 향상된 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, mRNA 구조체의 5'-UTR 부분과 3'-UTR 부분에 5'-β-globin과 3'-BGH를 모두 포함하는 5U-CAR-BGH는 CAR보다 56.1% 향상된 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과로부터 mRAN 구조체의 5'-UTR 부분과 3'-UTR 부분에 각각 존재하는 5'-β-globin과 3'-BGH가 mRNA의 구조적 안정성을 상승시킴을 알 수 있다.
[5-3]
번역 안정성(translational stability) 평가
나아가, 상기 실시예 [5-2]에서 제작한 7종의 제작된 일시적 CAR-NK 세포를 대상으로, mRNA를 NK92 세포 내로 주입한 후 8시간이 경과한 시점에서 발현된 CAR 단백질의 발현량을 기준(1)으로 시간의 경과에 따른 mRNA 구조체의 번역 안정성(translational stability)을 평가하였다.
그 결과, mRNA를 NK92 세포 내로 주입한 후 18시간이 경과한 시점에서의 단백질 발현량의 경우, 도 13에 도시된 바와 같이, mRNA 구조체의 3'-UTR 부분에 3'-BGH가 존재함으로써 CAR-BGH가 CAR보다 28.4% 향상된 단백질 발현율을, mRNA 구조체의 5'-UTR 부분에 5'-β-globin이 존재함으로써 5U-CAR-BGH가 5U-CAR보다 24.3% 향상된 단백질 발현율을 나타내었고, mRNA 구조체의 3'-UTR 부분에 EMCV-IRES가 추가적으로 존재함으로써 5U-CAR-BGH보다 5U-CAR-IRES-BGH가 33.3% 향상된 단백질 발현율을 나타내는 것으로 확인되었다. 한편, EMCV-IRES를 역방향으로 삽입해 번역을 위한 루프 구조의 형태를 변형한 경우와 5'-UTR 부분에 EMCV-IRES를 배치한 경우에는 단백질 발현율이 급격히 감소하는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과를 종합적으로 고려해 볼 때, mRNA 구조체의 3'-UTR 부분에 정방향으로 존재하는 EMCV-IRES가 mRNA의 번역 안정성에 크게 기여하는 것으로 판단된다.
[5-4]
세포용해 활성(cytolytic activity) 평가
이어서, 상기 실시예 [5-2]에서 제작한 7종의 일시적(transient) CAR-NK 세포를, mRNA를 NK92 세포 내로 주입한 후 18시간이 경과한 시점에, 상기 실시예 3에서와 같은 방법으로 상기 일시적 CAR-NK 세포를 유방암 세포주 AU565와 폐암 세포주 A549에 각각 처리하여, 암세포에 대한 세포독성을 평가하였다.
그 결과, 도 14에 도시된 바와 같이, 유방암 세포주 AU565와 폐암 세포주 A549 모두에 대하여, 상기 실시예 5-3에서 확인된 단백질 발현율에 상응하는 수준 및 양상으로, 상기 일시적(transient) CAR-NK 세포의 세포독성이 확인되었고, 세포용해 과정에서 일어나는 일련의 반응인 IFNγ와 TNFα의 분비 역시 상기 실시예 5-3에서 확인된 단백질 발현율에 상응하는 수준과 양상으로 나타나는 것으로 확인되었다.
[5-5]
IRES-BGH와 BGH-IRES의 비교
한편, mRNA 구조체의 3'-UTR에 위치하는 IRES와 BGH 순서가 mRNA의 구조적 안정성, 번역 안정성 및 세포독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 설계한 항-cotinine-CAR를 대상으로 5'-UTR과 3'-UTR을 하기 표 3에 기재된 바와 같이 설계하고, 상기 실시예 [5-1]에서와 동일한 방법으로 mRNA를 수득한 다음, 이를 전기영동하였다. 상기와 같이 수득된 mRNA에는, 상기 실시예 [5-1]에서 수득된 mRNA와 마찬가지로 5'-Cap과 3'-Poly(A) tail이 결합되어 있다.
그 결과, 도 15a에 도시된 바와 같이, 복잡한 2차 구조를 형성하는 IRES가 BGH의 뒤에 위치하는 'UTR-CAR-BGH-IRES' 구조체의 경우에는 시험관내 전사 과정에서 mRNA 합성시 IRES가 포함된 전사체와 IRES가 제거된 전사체의 두 개의 밴드(band)가 확인된 반면, IRES가 BGH의 앞에 위치하는 'UTR-CAR-IRES-BGH' 구조체의 경우에는 IRES가 포함된 전사체의 단일 밴드만이 확인되었다.
또한, 상기와 같이 수득한 mRNA를 상기 실시예 [5-2] 내지 [5-4]에서와 동일한 방법으로 NK92 세포에 형질전환시켜 mRNA 구조체의 구조적 안정성, 번역 안정성 및 세포독성을 평가하였다.
그 결과, 도 15b에 도시된 바와 같이, 'UTR-CAR-BGH-IRES' 구조체보다, 'UTR-CAR-IRES-BGH' 구조체가 더욱 높은 단백질 발현 수준과 더욱 높은 세포독 성을 나타내는 것으로 확인되었다.
[실시예 6]
Poly (A) tail이 목적 단백질의 발현에 미치는 영향 확인
먼저, 상기 실시예 [5-1]에서 설계한 5번 구조체(5U-CAR-IRES-BGH)를 기준으로, 하기 표 4에 기재된 바와 같이, 3'-UTR에 각각 40bp, 150bp 또는 310bp의 poly(A) 서열이 추가된 mRNA 구조체(하기 표 4의 2, 3 및 4번 구조체)를 설계하고, 이들을 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열을 pBluescript SK(-) 벡터(Addgene사)에 각각 삽입하였다. 상기와 같이 제조된 각각의 pBluescript SK(-)벡터로부터, 폴리(A) 테일링 없이, 시험관내 전사만을 통해 각각의 하기 표 4의 2, 3 및 4번의 구조를 갖는 mRNA를 수득하였다.
한편, 상기 실시예 [5-1]에서 설계한 5번 구조체를 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열이 삽입된 pBluescript SK(-)벡터로부터, 폴리(A) 테일링 없이, 시험관내 전사만을 통해 각각의 하기 표 4의 1번의 구조를 갖는 mRNA를, 그리고 시험관내 전사와 폴리(A) 테일링을 모두 거쳐 하기 표 4의 5번의 구조를 갖는 mRNA를 각각 수득하였다.
mRNA 구조체 | 구조 |
1. 5U-CAR-IRES-BGH | |
2. 5U-CAR-IRES-BGH-PA40 | |
3. 5U-CAR-IRES-BGH-PA150 | |
4. 5U-CAR-IRES-BGH-PA310 | |
5. 5U-CAR-IRES-BGH-PolyA |
결국, 상기 표 4에서 2, 3 및 4번 구조체는 구조체 자체에 폴리(A) 테일이 존재하도록 설계되어 시험관내 전사 이후에 폴리(A) 테일링을 별도로 진행하지 않고, 표 4의 5번 구조체는 구조체 자체에 폴리(A) 테일이 존재하지 않지만 시험관내 전사 이후에 추가적으로 폴리(A) 테일링을 진행하여 폴리(A) 테일을 붙인 것이다.
상기와 같이 설계 및 수득된 5종의 mRN를 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 최적의 조건 하에 NK92 세포 및 primary NK 세포에 형질전환하여 일시적(transient) CAR-NK 세포를 제작하였고, 상기 실시예 [5-3] 및 실시예 [5-4]에서와 동일한 방법으로 CAR의 단백질 발현 수준과 암세포에 대한 세포독성을 확인하였다.
먼저, 1번 구조체와 5번 구조체를 비교한 결과, 도 16a 및 도 16b에서 확인되는 바와 같이, 폴리(A) 테일이 포함된 5번 구조체에 비해, 폴리(A) 테일이 없는 1번 구조체의 경우에 mRNA 구조체의 3'-UTR에 안정성을 높여주는 BGH와 번역 안정성을 높여주는 IRES가 존재함에도 불구하고, CAR의 단백질 발현이나 유방암 세포주 AU565에 대한 세포독성이 현저히 낮은 것으로 확인되었다(도 16a, 도 16b).
반면, 구조체 자체에 폴리(A) 테일을 갖는 2번 내지 4번 구조체의 경우, NK92 세포에서, 2번 구조체는 폴리(A) 테일이 포함되지 않은 1번 구조체보다 단백질 발현이나 유방암 세포주 AU65에 대한 세포독성이 높았으나, 3번 및 4번 구조체 3 및 4에 비해서는 단백질 발현이나 유방암 세포주 AU565에 대한 세포독성이 낮은 것으로 확인되었다. 그리고 3번 및 4번 구조체 3 및 4는 단백질을 안정적으로 발현하고, 그 발현율에 상응하는 수준이나 양상의 세포독성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 16a). 한편, primary NK 세포에서는, 5번 구조체가 가장 높은 수준의 단백질 발현을 나타내었으나 유방암 세포주 AU565에 대한 세포독성은 오히려 150bp의 아데노신(A)을 포함하는 3번 구조체에서 가장 높은 것으로 확인되었다(도 16b).
상기와 같은 결과로부터, 효소 활성 및 반응시간 의존적으로 mRNA 구조체에 추가적으로 합성되는 폴리(A) 테일에 비해, mRNA 구조체 내에 폴리(A) 테일 자체가 포함되도록 설계되는 경우에, 이를 암호화하는 유전자 컨스트럭트의 염기서열이 포함된 주형 재조합 벡터로부터 별도의 폴리(A) 테일링 과정 없이 시험관내 전사만을 통해 폴리(A) 테일이 포함된 mRNA 구조체가 생성될 수 있으므로, mRNA 구조체 생산시 단일 크기의 mRNA 구조체 생산이 가능할 뿐만 아니라, mRNA 구조체 합성 공정 자체가 감소하고, mRNA 구조체의 품질 관리도 용이해지는 장점이 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
<120> Method for preparing mRNA constructs for protein expression and
the use of mRNA constructs prepared by the same
<130> 2022-DPA-4760
<150> KR 10-2021-0066744
<151> 2021-05-25
<160> 3
<170> KopatentIn 3.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-globin UTR
<400> 1
acatttgctt ctgacatagt tgtgttgact cacaacccca gaaacagaca tcc 53
<210> 2
<211> 215
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BGH
<400> 2
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180
gaggattggg aagacaatag caggcatgct gggga 215
<210> 3
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EMCV-IRES
<400> 3
tccccctctc cctccccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg 60
gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc 120
ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa 180
aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag 240
acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg 300
cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg 360
ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa 420
caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg 480
gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 540
ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacgt tgataatttg 580
Claims (17)
- 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열; 및 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 하류(downstream)에 연결된 20nt 내지 500nt의 길이를 갖는 폴리(A) 염기서열;을 포함하는 mRNA 구조체.
- 청구항 1에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열의 상류(upstream)에 5'-β-globin UTR 영역을 더 포함하는 것인 mRNA 구조체. - 청구항 2에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열과 상기 폴리(A) 염기서열 사이에 BGH를 더 포함하는 것인 mRNA 구조체. - 청구항 3에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열과 상기 폴리(A) 염기서열 사이에 IRES를 더 포함하는 것인 mRNA 구조체. - 청구항 4에 있어서,
상기 IRES는 i) 상기 목적 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 염기서열과 상기 BGH 사이 및 ii) 상기 BGH와 상기 폴리(A) 염기서열 사이 중 적어도 하나에 포함되는 것인 mRNA 구조체. - 청구항 1에 있어서,
상기 폴리(A) 염기서열은 100nt 내지 350nt의 길이를 갖는 것인 mRNA 구조체. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 mRNA 구조체는 세포에 형질전환되기 위한 것인 mRNA 구조체. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩티드는 키메릭 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)인 것인 mRNA 구조체. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 mRNA 구조체의 염기서열과 대응하거나 또는 이와 상보적인 DNA 염기서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트.
- 청구항 9의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터.
- 청구항 10의 벡터를 주형으로, 시험관내 전사(in vitro transcription)를 수행하는 단계;를 포함하는 안정성이 향상된 mRNA의 제조 방법.
- 청구항 11에 있어서,
상기 시험관내 전사 이후에, 시험관내에서 폴리(A) 테일링을 수행하지 않는 것인 안정성이 향상된 mRNA의 제조 방법. - 청구항 8의 mRNA 구조체가 숙주세포 내로 도입된 형질전환체.
- 청구항 13에 있어서,
상기 숙주세포는 면역세포인 것인 형질전환체. - 청구항 13의 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 조성물.
- 청구항 15에 있어서,
상기 세포치료제는 항암제인 것인 세포치료제 조성물. - 청구항 16에 있어서,
상기 암은 고형암인 것인 세포치료제 조성물.
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