KR20210055276A

KR20210055276A - 식물에 대한 폴리시스트론 발현 시스템

Info

Publication number: KR20210055276A
Application number: KR1020190141538A
Authority: KR
Inventors: 정제형; 이제훈; 원효준; 이선미; 김형석; 서문형
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2021-05-17
Also published as: KR102281973B1

Abstract

본 명세서에는 식물에 적용 가능한 폴리시스트론 발현 시스템이 개시된다. 본 명세서에 따른 폴리시스트론 발현 시스템은 여러 개의 유전자들을 식물 genome의 한 곳에 인터그레이션시키는 것이 가능하며, 여러 개의 유전자들의 발현량을 일정 수준 이상 유지하고 한번에 조절하는 것이 가능하며, 전체적인 식물 엔지니어링 과정을 보다 효율적으로 수행하고 시간을 단축시키는 이점이 있다.

Description

식물에 대한 폴리시스트론 발현 시스템{Polycistronic Expression System for Plants}

본 명세서에는 식물에 적용 가능한 폴리시스트론 발현 시스템이 개시된다.

종래 식물 엔지니어링에서는 여러 개의 유전자들을 형질전환시킬 때 개별 벡터들을 사용하여 여러 개를 한번에 또는 각각을 여러 번에 걸쳐 주입하여 형질전환된 식물체를 제조하였다.

따라서, 각각의 벡터들이 genome의 어느 부위에 인터그레이션되는지에 따라 발현량에 많은 차이를 보였고, 이 때문에 원하는 만큼의 형질 (즉, 여러 개의 유전자들의 발현을 통하여 나타날 수 있는 식물형질)을 보이는 개체를 선별하는 과정에 많은 시간과 돈이 소요되는 기술적 한계가 있었다.

Baltes, N. J., J. Gil-Humanes, T. Cermak, P. A. Atkins and D. F. Voytas. 2014. DNA Replicons for Plant Genome Engineering. The Plant Cell 26: 151-163. Liu, Z., O. Chen, J. B. J. Wall, M. Zheng, Y. Zhou, L. Wang, H. Ruth Vaseghi, L. Qian and J. Liu. 2017. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Scientific Reports 7: 2193. Stavolone L et al (2003) Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV) promoter: a new strong constitutive promoter for heterologous gene expression in a wide variety of crops. Plant Mol Biol 53:703-713. Nagaya S, Kawamura K, Shinmyo A, Kato K (2010) The HSP terminator of Arabidopsis thaliana increases gene expression in plant cells. Plant Cell Physiol 51:328-332.

일 측면에서, 본 명세서는 식물 엔지니어링에 적용 가능한 폴리시스트론 유전자 발현 시스템 (Polycistronic gene expression system)을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 서열번호 2 내지 5 중 하나의 시퀀스로 구성되고, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터 제조에 사용되는 것인, 폴리시스트론 발현 벡터 제조용 백본 벡터를 제공한다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 바이너리 벡터 (binary vector)에 제2 제한효소 인식 부위를 삽입시킨 것을 백본 벡터로 사용하고, 상기 백본 벡터의 제2 제한효소에 의한 절단 부위에 2개의 오버행 시퀀스가 위치하고, 상기 2개의 오버행 시퀀스는 각각 정방향 가닥과 역방향 가닥에 위치하고, 상기 제2 제한효소에 의한 절단 부위에 하기 (1) 프로모터; (2) 1 이상의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스; (3) 2 이상의 목적 유전자 모듈; 및 (4) 터미네이터 요소들이 삽입된 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터를 제공한다.

(1) 제2 제한효소에 의해 절단되고, 절단 후 백본 벡터에 위치한 오버행 시퀀스 및 목적 유전자 모듈에 위치한 오버행 시퀀스와 각각 상보적인 2개의 오버행 시퀀스를 포함하는, 프로모터;

(2) 목적 유전자 모듈 사이에 위치하며, 제2 제한효소에 의해 절단되고, 절단 후 목적 유전자 모듈에 위치한 오버행 시퀀스 및 또 다른 목적 유전자 모듈에 위치한 오버행 시퀀스와 각각 상보적인 2개의 오버행 시퀀스를 포함하는, 1 이상의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스;

(3) 프로모터와 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 사이, 또는 2개의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 사이, 또는 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스와 터미네이터 사이에 위치하며, 제2 제한효소에 의해 절단되고, 절단 후 프로모터에 위치한 오버행 시퀀스, 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스에 위치한 오버행 시퀀스, 및 터미네이터에 위치한 오버행 시퀀스 중 2개의 오버행 시퀀스와 각각 상보적인 2개의 오버행 시퀀스; 상기 상보적인 2개의 오버행 시퀀스와 각각 연결된 2개의 목적 유전자 특이적 시퀀스; 및 목적 유전자를 포함하는, 2 이상의 목적 유전자 모듈; 및

(4) 제2 제한효소에 의해 절단되고, 절단 후 백본 벡터에 위치한 오버행 시퀀스 및 목적 유전자 모듈에 위치한 오버행 시퀀스와 각각 상보적인 2개의 오버행 시퀀스를 포함하는, 터미네이터.

예시적인 일 구현예에서, 상기 프로모터에서 2개의 오버행 시퀀스는, 각각 백본 벡터의 역방향 가닥에 위치한 오버행 시퀀스 및 제1 목적 유전자 모듈의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스에서 2개의 오버행 시퀀스는, 각각 제1 목적 유전자 모듈의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 제2 목적 유전자 모듈의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 목적 유전자 모듈에서 2개의 오버행 시퀀스는, i) 각각 프로모터의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이거나, ii) 각각 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이거나, iii) 각각 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 터미네이터의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 터미네이터에서 2개의 오버행 시퀀스는, 각각 백본 벡터의 정방향 가닥에 위치한 오버행 시퀀스 및 목적 유전자 모듈의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 바이너리 벡터는 pLSLR 벡터인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 백본 벡터는 서열번호 2 내지 5 중 하나의 시퀀스를 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 제2 제한효소는 BasI인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 모든 오버행 시퀀스는 4개의 염기를 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 백본 벡터에 위치한 2개의 오버행 시퀀스는 역방향 가닥에 5'-ATAG-3' 및 정방향 가닥에 5'-TAAG-3'인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 폴리시스트론 발현용 벡터에 삽입된 요소들은, 프로모터 - 제1 목적 유전자 모듈 - 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 - 제2 목적 유전자 모듈 - 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 - 제3 목적 유전자 모듈 - 터미네이터 순서로 삽입된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 프로모터는 정방향의 5' 말단에 5'-CTAT-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-GGTT-3' 오버행 시퀀스를 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 제1 목적 유전자 모듈은 정방향의 5' 말단에 5'-AACC-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-CCTC-3' 오버행 시퀀스를 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스는 정방향의 5' 말단에 5'-GAGG-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-AGGG-3' 오버행 시퀀스를 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 제2 목적 유전자 모듈은 정방향의 5' 말단에 5'-CCCT-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-TAGC-3' 오버행 시퀀스를 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스는 정방향의 5' 말단에 5'-GCTA-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-GGGT-3' 오버행 시퀀스를 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 제3 목적 유전자 모듈은 정방향의 5' 말단에 5'-ACCC-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-ATAT-3' 오버행 시퀀스를 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 터미네이터는 정방향의 5' 말단에 5'-ATAT-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-CTTA-3' 오버행 시퀀스를 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 및 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스는, 오버행 시퀀스를 제외하고 각각 서열번호 22 및 23의 시퀀스를 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 프로모터와 터미네이터는, 오버행 시퀀스를 제외하고 각각 서열번호 24 및 25의 시퀀스를 갖는 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 서열번호 2 내지 5 중 하나를 갖는 백본 벡터; 서열번호 6의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터; 서열번호 7의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터; 서열번호 8의 프로모터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터; 서열번호 9의 터미네이터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터; 제1 목적 유전자 모듈; 제2 목적 유전자 모듈; 및 제3 목적 유전자 모듈로부터 제조되고, 상기 제1 목적 유전자 모듈은, 서열번호 10 및 11의 시퀀스, 상기 서열번호 10 및 11의 시퀀스 각각의 3' 말단에 연결된 제1 목적 유전자 특이적 시퀀스, 및 제1 목적 유전자를 포함하고, 상기 제2 목적 유전자 모듈은, 서열번호 12 및 13의 시퀀스, 상기 서열번호 12 및 13의 시퀀스 각각의 3' 말단에 연결된 제2 목적 유전자 특이적 시퀀스, 및 제2 목적 유전자를 포함하고, 상기 제3 목적 유전자 모듈은, 서열번호 14 및 15의 시퀀스, 상기 서열번호 14 및 15의 시퀀스 각각의 3' 말단에 연결된 제3 목적 유전자 특이적 시퀀스, 및 제3 목적 유전자를 포함하는 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터를 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 클로닝 벡터는 pLUG-Prime, pCR2.1, 및 pGEM-T로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터의 제조방법으로, 바이너리 벡터 (binary vector)에 제2 제한효소 인식 부위를 삽입시켜 백본 벡터를 제조하는 단계; 제2 제한효소 인식 부위를 갖는 프로모터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터를 제조하는 단계; 제2 제한효소 인식 부위를 갖는 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터를 제조하는 단계; 제2 제한효소 인식 부위를 갖는 목적 유전자 모듈을 제조하는 단계; 제2 제한효소 인식 부위를 갖는 터미네이터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터를 제조하는 단계; 상기 백본 벡터, 프로모터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터, 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터, 목적 유전자 모듈, 터미네이터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터를 혼합한 다음, 제2 제한효소와 라이게이즈 첨가하여 효소 절단 및 라이게이션 공정을 동시에 실시하는 단계를 포함하는, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터의 제조방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 식물 엔지니어링에 적용 가능한 폴리시스트론 유전자 발현 시스템 (Polycistronic gene expression system)을 제공하는 효과가 있다. 상기 폴리시스트론 유전자 발현 시스템은 여러 개의 유전자들을 식물 genome의 한 곳에 인터그레이션시키는 것이 가능하며, 여러 개의 유전자들의 발현량을 일정 수준 이상 유지하고 한번에 조절하는 것이 가능하며, 전체적인 식물 엔지니어링 과정을 보다 효율적으로 수행하고 시간을 단축시키는 이점이 있다.

도 1은 골든 게이트 클로닝과 양립하는 바이너리 백터의 도식을 나타낸 것이다. 블루 박스의 시퀀스는 BasI 매개 골든 게이트 클로닝 부위를 나타내며, 블랙 컬러의 뉴클레오타이드 시퀀스는 BasI 효소 절단 후 벡터에 남은 오버행 (overhang)을 나타낸다.
도 2는 골든 게이트 클로닝과 양립하는 자가 복제형 바이너리 백터의 도식을 나타낸 것이다. 블루 박스의 시퀀스는 BasI 매개 골든 게이트 클로닝 부위를 나타내며, 블랙 컬러의 뉴클레오타이드 시퀀스는 BasI 효소 절단 후 벡터에 남은 오버행 (overhang)을 나타낸다.
도 3은 골든 게이트 클로닝 매개 모듈 어셈블리 과정을 도식화한 것을 나타낸다.
도 4는 생성된 2A 펩타이드 매개 폴리시스트론 유전자 발현 벡터의 도식을 나타낸 것이다.
도 5는 pGO-DV1-nptII를 이용하여 식물 세포에서 폴리시스트론 유전자 발현을 실행한 결과를 나타낸다.
도 6은 pGO-DV2-nptII를 이용하여 식물 세포에서 폴리시스트론 유전자 발현을 실행한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적 유전자 모듈은 2개의 오버행 시퀀스; 상기 2개의 오버행 시퀀스와 각각 연결된 2개의 목적 유전자 특이적 시퀀스; 및 목적 유전자를 포함한다.

본 명세서에서 '목적 유전자'는 식물에서 발현시키고자 하는 유전자를 의미한다.

본 명세서에서 '목적 유전자 특이적 시퀀스'는 목적 유전자와 혼성화될 수 있도록 목적 유전자 일부와 상보적인 단편을 갖는 시퀀스를 의미한다. 상기 목적 유전자 특이적 시퀀스는 정방향 가닥에 1개, 역방향 가닥에 1개 위치하며, 목적 유전자의 정방향 및 역방향 3' 말단 부위에 각각 상보적인 단편을 갖는다.

본 명세서에서 '2개의 오버행 시퀀스'는 각각 정방향 가닥과 역방향 가닥에 위치한 것을 의미한다.

본 명세서에서 '제1', '제2' 등은 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해 사용된 것을 의미한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 목적 유전자 모듈에서 2개의 오버행 시퀀스는, i) 목적 유전자 모듈이 프로모터와 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 사이에 위치하는 경우, 각각 프로모터의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이거나, ii) 목적 유전자 모듈이 2개의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 사이에 위치하는 경우, 각각 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이거나, iii) 목적 유전자 모듈이 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스와 터미네이터 사이에 위치하는 경우, 각각 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 터미네이터의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적인 것일 수 있다.

pCAMBIA와 같은 일반적인 바이너리 벡터를 이용하여 백본 벡터의 제작이 가능하며, 예시적인 일 구현예에서, 상기 바이너리 벡터는 pLSLR 벡터인 것일 수 있다. pLSLR 벡터를 사용함으로써 자가 복제형 바이너리 벡터 제조가 가능하며, 이에 따라 목적 유전자 발현량을 증가시키는 효과가 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 백본 벡터는 제2 제한효소 인식 부위를 포함하는 서열번호 1의 시퀀스를 삽입시킨 것일 수 있다.

서열번호 22 (정방향)

5'-GCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGG-3'

서열번호 23 (정방향)

5'-CTAATTTTTCTCTTCTTAAGCAAGCTGGAGATGTTGAAGAAAATCCTGG-3'

서열번호 24 (정방향)

5'-CTGGCAGACAAAGTGGCAGACATACTGTCCCACAAATGAAGATGGAATCTGTAAAAGAAAACGCGTGAAATAATGCGTCTGACAAAGGTTAGGTCGGCTGCCTTTAATCAATACCAAAGTGGTCCCTACCACGATGGAAAAACTGTGCAGTCGGTTTGGCTTTTTCTGACGAACAAATAAGATTCGTGGCCGACAGGTGGGGGTCCACCATGTGAAGGCATCTTCAGACTCCAATAATGGAGCAATGACGTAAGGGCTTACGAAATAAGTAAGGGTAGTTTGGGAAATGTCCACTCACCCGTCAGTCTATAAATACTTAGCCCCTCCCTCATTGTTAAGGGAGCAAAATCTCAGAGAGATAGTCCTAGAGAGAGAAAGAGAGCAAGTAGCCTAGAAGTAG-3'

서열번호 25 (정방향)

5'-GAAGATGAAGATGAAATATTTGGTGTGTCAAATAAAAAGCTTGTGTGCTTAAGTTTGTGTTTTTTTCTTGGCTTGTTGTGTTATGAATTTGTGGCTTTTTCTAATATTAAATGAATGTAAGATCTCATTATAATGAATAAACAAATGTTTCTATAATCCATTGTGAATGTTTTGTTGGATCTCTTCTGCAGCATATAACTACTGTATGTGCTATGGTATGGACTATGGAATATGATTAAAGA-3'

본 명세서에 따른 폴리시스트론 발현용 벡터는 프로모터, 2A 펩타이드, 목적 유전자 및 터미네이터 각각의 요소들을 모듈화하여 백본 벡터에 삽입시킴으로써 하나의 프로모터에 의해 여러 개의 유전자들을 발현시키는 효과가 있다. 목적 유전자 사이에는 2A 펩타이드 (18~22aa 길이, self-cleaving peptide)가 있어 번역이 일어난 뒤 분리되어 폴리시스트론 유전자 발현이 가능하다.

상기 백본 벡터, 클로닝 벡터 및 목적 유전자 모듈은 이중 가닥을 갖는다.

예시적인 일 구현예에서, 제2 제한효소 인식 부위는 BasI 제한 효소에 의해 인식되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 모듈 준비

(1) 바이너리 벡터

플라스미드의 저장, 보급 비영리 기관인 Addgene으로부터 pLSLR 벡터를 분양받아 사용하였다 (Baltes et al., 2014).

pLSLR 벡터에서 선별마커 유전자의 고발현을 위해 35s 프로모터를 35s HSP 인트론 프로모터로 교체한 pLSLR_35sHSP 벡터를 제작하였다. 이후, pLSLR_35sHSP 벡터를 SalI과 PmeI으로 절단한 후 BasI 매개 골든 게이트 클로닝 부위를 삽입한 바이너리 벡터 pGO-DV1을 제작하였다. 이후, pGO-DV1에서 선별마커인 히그로마이신 저항성 유전자 (hpt)를 네오마이신 저항성 유전자 (nptII)로 교체한 pGO-DV1-nptII를 제작하였다 (도 1 참조). 상기 BasI 매개 골든 게이트 클로닝 부위는 서열번호 1 (정방향 5'-CTATNGAGACCGAGGTCTCNTAAG-3')의 시퀀스를 포함한다. 본 실험예에서는 상기 서열번호 1의 N 염기 자리에 G 염기를 사용하였다.

또한, pLSLR_35sHSP 벡터를 PmlI과 XhoI으로 절단한 후 업스트림 LIR과 SIR 사이에 BasI 매개 골든 게이트 클로닝 부위를 삽입한 자가 복제형 바이너리 벡터 pGO-DV2을 제작하였다. 이후, pGO-DV2에서 선별마커인 히그로마이신 저항성 유전자 (hpt)를 네오마이신 저항성 유전자 (nptII)로 교체한 pGO-DV2-nptII를 제작하였다 (도 2 참조). 상기 BasI 매개 골든 게이트 클로닝 부위는 서열번호 1 (정방향 5'-CTATNGAGACCGAGGTCTCNTAAG-3')의 시퀀스를 포함한다. 본 실험예에서는 상기 서열번호 1의 N 염기 자리에 G 염기를 사용하였다.

하기 표 1은 제작된 벡터 pGO-DV1, pGO-DV1-nptII, pGO-DV2, 및 pGO-DV2-nptII의 전체 뉴클레오타이드 시퀀스 (각각 서열번호 2 내지 5, 정방향)를 나타낸 것이다. 밑줄친 음영 박스의 시퀀스는 삽입 부위, 즉 BsaI 매개 골든 게이트 클로닝 부위를 나타낸다. 마찬가지로, 본 실험예에서 서열번호 2 내지 5의 N 염기 자리는 G 염기를 적용한 것이다.

(2) T2A 모듈 벡터 및 P2A 모듈 벡터

T2A 및 P2A의 뉴클레오타이드 시퀀스는 Liu et al. (2017)로부터 검색되었다. 상기 시퀀스는 Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/)를 이용하여 니코티아나 타바쿰에 최적화된 코돈이다. 5' 및 3' 말단에 BasI 효소 자리를 포함하는 T2A 및 P2A 모듈을 합성한 다음, pLUG-Prime 벡터에 클로닝하였다.

하기 표 2는 골든 게이트 클로닝과 양립하는 T2A 및 P2A 모듈의 뉴클레오타이드 시퀀스 (각각 서열번호 6 및 7, 정방향)를 나타낸다. 밑줄친 음영 박스의 시퀀스는 BasI 효소 자리를 나타낸다. 본 실험예에서는 서열번호 6 및 7의 N 염기 자리에 G 염기를 사용하였다. 효소 절단 후 남는 오버행 시퀀스는 T2A 및 P2A 뉴클레오타이드 시퀀스에 원래 포함된 것으로서, 이에 따라 본 명세서에 개시된 기술은 제1 목적 유전자, T2A, 제2 목적 유전자, P2A, 제3 목적 유전자를 하나의 ORF로 발현시켜 정확한 폴리시스트론 발현을 가능하게 하는 효과를 제공한다.

T2A module

5'-GGTCTCNGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTNGAGACC-3'

P2A module

5'-GGTCTCNGCTACTAATTTTTCTCTTCTTAAGCAAGCTGGAGATGTTGAAGAAAATCCTGGACCCNGAGACC-3'

(3) 프로모터 모듈 벡터 및 터미네이터 모듈 벡터

CmYLCV 프로모터의 뉴클레오타이드 시퀀스는 Stavolone et al. (2003)으로부터 검색되었다. 각 5' 및 3' 말단에 BasI 효소 자리와 오버행 시퀀스를 결정하는 삽입 부위를 포함하는 프로모터 모듈을 합성한 다음, pLUG-Prime 벡터에 클로닝하였다.

AtHSP 3'UTR의 뉴클레오타이드 시퀀스는 Nagaya et al. (2010)으로부터 검색되어 터미네이터로 사용하였다. 각 5' 및 3' 말단에 BasI 효소 자리와 오버행 시퀀스를 결정하는 삽입 부위를 포함하는 터미네이터 모듈을 합성한 다음, pLUG-Prime 벡터에 클로닝하였다.

하기 표 3은 골든 게이트 클로닝과 양립하는 CmYLCV 프로모터 및 AtHSP 3'UTR 터미네이터 모듈의 뉴클레오타이드 시퀀스 (각각 서열번호 8 및 9, 정방향)를 나타낸다. 본 실험예에서는 서열번호 8 및 9의 N 염기 자리에 G 염기를 사용하였다. 밑줄친 음영 박스의 시퀀스는 BasI 효소 자리를 나타내며, 밑줄친 기울임체의 시퀀스는 BasI 효소 절단 후 오버행을 결정하는 삽입 부위를 나타낸다.

CmYLCV promoter module

5'-GGTCTCN CTAT CTGGCAGACAAAGTGGCAGACATACTGTCCCACAAATGAAGATGGAATCTGTAAAAGAAAACGCGTGAAATAATGCGTCTGACAAAGGTTAGGTCGGCTGCCTTTAATCAATACCAAAGTGGTCCCTACCACGATGGAAAAACTGTGCAGTCGGTTTGGCTTTTTCTGACGAACAAATAAGATTCGTGGCCGACAGGTGGGGGTCCACCATGTGAAGGCATCTTCAGACTCCAATAATGGAGCAATGACGTAAGGGCTTACGAAATAAGTAAGGGTAGTTTGGGAAATGTCCACTCACCCGTCAGTCTATAAATACTTAGCCCCTCCCTCATTGTTAAGGGAGCAAAATCTCAGAGAGATAGTCCTAGAGAGAGAAAGAGAGCAAGTAGCCTAGAAGTAG AACC NGAGACC-3'

AtHSP _ 3'UTR terminator module

5'-GGTCTCN ATAT GAAGATGAAGATGAAATATTTGGTGTGTCAAATAAAAAGCTTGTGTGCTTAAGTTTGTGTTTTTTTCTTGGCTTGTTGTGTTATGAATTTGTGGCTTTTTCTAATATTAAATGAATGTAAGATCTCATTATAATGAATAAACAAATGTTTCTATAATCCATTGTGAATGTTTTGTTGGATCTCTTCTGCAGCATATAACTACTGTATGTGCTATGGTATGGACTATGGAATATGATTAAAGA TAAG NGAGACC-3'

(4) 유전자 모듈

본 실험예에서는 식물 내 2A 펩타이드 매개 폴리시스트론 발현을 확인하기 위해 형광 단백질을 코딩하는 세 개의 유전자 (mCherry, eYFP, 및 eGFP)를 사용하였다. 또한, 폴리시스트론 벡터 시스템에서 상이한 위치에 있는 각각의 유전자들의 발현을 확인하기 위해, 상기 세 개의 유전자가 벡터 내 1^st, 2^nd, 3^rd 유전자 위치로 삽입될 수 있도록 유전자 모듈을 제조하였다. 골든 게이트 클로닝 시스템에서 동시적 효소 절단 및 라이게이션 공정을 수행하기 위해, a) BasI 효소 자리, b) 오버행 시퀀스를 결정하는 삽입 부위, 및 c) 목적 유전자 특이적 시퀀스 (즉, 목적 유전자의 정방향 및 역방향 3' 말단 부위와 각각 상보적인 단편을 갖는 시퀀스)를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 목적 유전자가 함유된 유전자 모듈을 증폭시켰다. 상기 오버행 시퀀스를 통해 유전자를 벡터 내 정확한 위치에 오게 할 수 있었다. 상기 사용된 프라이머는 BasI 효소 자리와 오버행 시퀀스를 결정하는 삽입 부위를 포함하는 서열번호 10 내지 15의 시퀀스와, 상기 서열번호 10 내지 15의 시퀀스 3' 말단에 발현시키고자 하는 목적 유전자에 특이적인 시퀀스를 결합하여 사용하였다 (표 4 참조). 본 실험예에서는 서열번호 10, 12 및 14의 N 염기 자리에 G 염기를 사용하였다. 또한, 서열번호 11, 13 및 15의 N 염기 자리에 C 염기를 사용하였다.

서열번호 10 (정방향 5'-GGTCTCNAACC-3')

서열번호 11 (역방향 5'-GGTCTCNCCTC-3')

서열번호 12 (정방향 5'-GGTCTCNCCCT-3')

서열번호 13 (역방향 5'-GGTCTCNTAGC-3')

서열번호 14 (정방향 5'-GGTCTCNACCC-3')

서열번호 15 (역방향 5'-GGTCTCNATAT-3')

하기 표 4는 골든 게이트 클로닝과 양립하는 유전자 모듈을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머를 나타낸다. 상기 서열번호 10 내지 15와 마찬가지로, 서열번호 16, 18 및 20에서 N 염기 자리는 G 염기이고, 서열번호 17, 19 및 21에서 N 염기 자리에 C 염기이다. 밑줄친 음영 박스의 시퀀스는 BasI 효소 자리를 나타내며, 밑줄친 기울임체의 시퀀스는 오버행 시퀀스를 결정하는 삽입 부위를 나타낸다. 한편, 밑줄친 기울임체 이후 볼드체로 기재된 시퀀스는 발현시키고자 하는 형광 단백질 유전자 특이적 시퀀스를 나타낸다.

프라이머	시퀀스 (5'→3')	백터 내 증폭 유전자 모듈 삽입 부위
FP1st-Forward (서열번호 16)	ACGGTCTCN AACC ATGGTGAGCAAGGGCGAG	프로모터와 T2A 사이 (1^st gene)
FP1st-Reverse (서열번호 17)	TGGGTCTCN CCTC CTTGTACAGCTCGTCCAT	프로모터와 T2A 사이 (1^st gene)
FP2nd-Forward (서열번호 18)	ACGGTCTCN CCCT GTGAGCAAGGGCGAGGAG	T2A와 P2A 사이 (2^nd gene)
FP2nd-Reverse (서열번호 19)	TGGGTCTCN TAGC CTTGTACAGCTCGTCCAT	T2A와 P2A 사이 (2^nd gene)
FP3rd-Forward (서열번호 20)	ACGGTCTCN ACCC GTGAGCAAGGGCGAGGAG	P2A와 터미네이터 사이 (3^rd gene)
FP3rd-Reverse (서열번호 21)	TGGGTCTCN ATAT TTACTTGTACAGCTCGTCCAT	P2A와 터미네이터 사이 (3^rd gene)

실험예 2. 벡터 제작

목적 벡터로의 모듈 어셈블리를 하기와 같이 수행하였다. 150 ng의 각 모듈 (YLCV 프로모터, T2A, P2A, AtHSP 터미네이터, 및 형광 단백질 유전자) 및 150 ng의 목적 벡터 (pGO-DV1-nptII 또는 pGO-DV2-nptII)를 0.2 ml 튜브에 첨가하였다. 열 순환기에서 동시적 효소 절단 및 라이게이션 공정을 BsaI 효소 및 T4 DNA 라이게이즈를 사용하여 수행하였다 (작동 사이클: 10x (37 ℃/5분 + 16 ℃/10분) + 50 ℃/5분 + 80 ℃/5분). 인큐베이션 후, DH5α 수용성 세포 (competent cells)를 라이게이션된 제작물로 형질전환시켰고, 정확하게 어셈블리된 제작물을 증폭, 선택, 및 정제하였다. 최종적으로, 총 6개의 폴리시스트론 발현 벡터가 제작되었다 (도 3 및 4 참조).

그 결과, 7개의 모듈 (1개의 프로모터, 1개의 터미네이터, 3개의 유전자, 및 2개의 2A 시그널)이 골든 게이트 클로닝 접근법에 의해 바이너리 벡터로 잘 어셈블리되었고, 상기 모듈 어셈블리는 E.coli 형질전환 및 정제 공정을 포함하여 단지 3일 소요되었다. 효소 절단이 각 성분에 대해 개별적으로 수행되어야 하는 종래의 벡터 제작 공정에서는, 하나의 성분을 벡터에 첨가하는데 3일이 걸리므로 7개의 성분을 첨가하는데 21일이 걸릴 것이다. 따라서, 본 명세서에 따른 폴리시스트론 발현 벡터는 식물 엔지니어링 과정을 보다 효율적으로 수행하고 시간을 단축시키는 이점을 제공하는 것을 확인하였다.

또한, 본 명세서에 따른 골든 게이트 클로닝 매개 모듈 어셈블리는 100%에 매우 근접한 효율 (정확하게 어셈블리된 제작물을 보유하는 클론의 수 / 선택된 E.coli 클론의 수) x 100)을 나타내었다. 어셈블리가 정확하게 수행되지 못한 제작물을 보유하는 클론은 항생제 선택압 하에서 생존할 수 없었을 것이다.

실험예 3. 담배 잎에서 형광 단백질의 발현 및 이미징

전기천공법 (electroporation)으로 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404)를 상기 생성된 제작물로 형질전환시켰다. 전기 수용성 세포 (electrocompetent cells) 제조를 위해, 스트렙토마이신 (20 μg/ml)이 보충된 LB (Luria-Bertani) 배지에서 250 rpm 교반을 가하여 28 ℃에서 2일 동안 아그로박테리움을 배양하였다. 박테리아 세포 배양물의 1/25 부피의 새로운 LB 배지를 접종하였고 OD₆₀₀ 값이 0.4에 도달할 때까지 250 rpm 교반을 가하여 28 ℃에서 배양하였다. 얼음 상에서 20분간 냉각시킨 후, 세포를 4 ℃에서 10분간 4,000 rpm으로 원심분리하여 수확하였고 차가운 물로 3번 세척하였다. 펠릿을 차가운 10% 글리세롤에 재현탁, 분취 및 -80 ℃에 저장시켰다.

상기 제작물을 보유하는 아그로박테리움은 스트렙토마이신 (20 μg/ml) 및 카나마이신 (50 μg/ml)이 보충된 LB 배지에서 2일 동안 배양하였다. 박테리아 세포를 수확하였고 재현탁 용액 (10 mM MgCl₂, 10 mM MES-KOH pH 5.6, 100 μM 아세토시린곤)에서 OD₆₀₀ 0.4로 조정하였다. 상온에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 박테리아 현탁액을 바늘 없는 주사기를 사용하여 4주 내지 5주령 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 잎에 스며들게 하였고 생장 챔버에서 5일 동안 인큐베이션하였다. ZEN 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 LSM5 Zeiss 공초점 레이저 주사 현미경으로 담배 잎에서 형광 단백질 발현을 관찰하였다 (Carl Zeiss, Jena, Germany). 여기/방출 스펙트럼은 eGFP의 경우 488 nm/493-598 nm, eYFP의 경우 514 nm/517-588 nm, mCherry의 경우 594 nm/599-650 nm였다.

그 결과, 골든 게이트 클로닝 및 2A 시그널 펩타이드 매개 폴리시스트론 발현 시스템은 식물 세포에서 성공적으로 폴리시스트론 발현을 유도하였다. 유전자 위치와 무관하게 두 벡터 내 3개의 형광 단백질이 식물 세포, 즉 담배 잎 세포에서 발현되었다 (도 5 및 6 참조).

단백질 발현 수준과 직접적으로 연관된 형광 강도는 자가 복제가 가능한 벡터 pGO-DV2-nptII가 pGO-DV1-nptII 벡터에 2.3배 ~ 4.6배 더 높은 것으로 나타났다. 이는 자가 복제가 가능한 벡터 pGO-DV2-nptII의 사용이 폴리시스트론 발현 수준을 더욱 향상시킬 수 있음을 나타낸다.

이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Polycistronic Expression System for Plants <130> 19P270/IND <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insertional site <400> 1 ctatngagac cgaggtctcn taag 24 <210> 2 <211> 9187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGO-DV1 vector <400> 2 caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt 60 gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc 120 gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc 180 gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct 240 ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc 300 gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga 360 ggtttccgca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc 420 ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg 480 ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg 540 aaagcagaaa 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agatcatcct gatcgacaag accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc 4560 gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg 4620 ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag 4680 atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc 4740 gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc 4800 ctggagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg 4860 cgctgacagc cgaaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata 4920 gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat 4980 ccccatccta ggggacgcgt ggatcctcta gaggccgctt ggtatctgca ttacaatgaa 5040 atgagcaaag actatgtgag taacactggt caacactagg gagaaggcat cgagcaagat 5100 acgtatgtaa agagaagcaa tatagtgtca gttggtagat actagatacc atcaggaggt 5160 aaggagagca acaaaaagga aactctttat ttttaaattt tgttacaaca aacaagcaga 5220 tcaatgcatc aaaatactgt cagtacttat ttcttcagac aacaatattt aaaacaagtg 5280 catctgatct tgacttatgg tcacaataaa ggagcagaga taaacatcaa aatttcgtca 5340 tttatattta ttccttcagg cgttaacaat ttaacagcac acaaacaaaa acagaatagg 5400 aatatctaat tttggcaaat aataagctct gcagacgaac aaattattat agtatcgcct 5460 ataatatgaa tccctatact attgacccat gtagtatgaa gcctgtgcct aaattaacag 5520 caaacttctg aatccaagtg ccctataaca ccaacatgtg cttaaataaa taccgctaag 5580 caccaaatta cacatttctc gtattgctgt gtaggttcta tcttcgtttc gtactaccat 5640 gtccctatat tttgctgcta caaaggacgg caagtaatca gcacaggcag aacacgattt 5700 cagagtgtaa ttctagatcc agctaaacca ctctcagcaa tcaccacaca agagagcatt 5760 cagagaaacg tggcagtaac aaaggcagag ggcggagtga gcgcgtaccg aagacggtag 5820 atctgctaga gtcagcttgt cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag 5880 aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat 5940 cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 6000 tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttca acgatggcct 6060 ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg agccaccttc cttttccact atcttcacaa 6120 taaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tccggatatt accctttgtt 6180 gaaaagtctc aatcggacca tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt 6240 cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag 6300 aggcatcttc aacgatggcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt 6360 ccttttccac tatcttcaca ataaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt 6420 ttccggatat taccctttgt tgaaaagtct caatcggacc tgcagaagct caccggtgcg 6480 gtccgcgtaa ctataacggt cctaaggtag cgaaagcttg tcgactatcg gacgagctca 6540 aagtttaacg cgttagcaga aggcatgttg ttgtgactcc gaggggttgc ctcaaactct 6600 atcttataac cggcgtggag gcatggaggc aggggtattt tggtcatttt aatagatagt 6660 ggaaaatgac gtggaattta cttaaagacg aagtctttgc gacaaggggg ggcccacgcc 6720 gaatttaata ttaccggcgt ggccccccct tatcgcgagt gctttagcac gagcggtcca 6780 gatttaaagt agaaaatttc ccgcccacta gggttaaagg tgttcacact ataaaagcat 6840 atacgatgtg atggtatttg atggagcgta tattgtatca ggtatttccg ttggatacga 6900 attattcgta cgaccctcgg cgcgccgaga acttccagag ctttgggtac gtcacctatn 6960 gagaccgagg tctcntaagt cgagcgcgta gtcctcggta atatcgcaga acaaaagtac 7020 ctgatatcga gtgtacttca agtcagtggg aaatcaataa aatgattatt ttatgaatat 7080 atttcattgt gcaagtagat agaaattaca tatgttacat aacacacgaa ataaacaaaa 7140 aaagacaatc caaaaacaaa caccccaaaa aaaataatca ctttagataa actcgtatga 7200 ggagaggcac gttcagtgac tcgacgattc ccgagcaaaa aaagtctccc cgtcacacat 7260 gtagtgggtg acgcaattat ctttaaagta atccttctgt tgacttgtca ttgataacat 7320 ccagtcttcg tcaggattgc aaagaattat agaagggatc ccacctttta ttttcttctt 7380 ttttccatat ttagggttga cagtgaaatc agactggcaa cctattaatt gcttccacaa 7440 tgggacgaac ttgaagggga tgtcgtcgat gatattatag gtggcgtgtt catcgtagtt 7500 ggtgaaatcg atggtaccgt tccaatagtt gtgtcgtccg agacttctag cccaggtggt 7560 ctttccggta cgagttggtc cgcagatgta gaggctgggg tgtcggattc cattccttcc 7620 attgtccttg ttaaatcggc catccattca aggtcagatt gagcttgttg gtatgagaca 7680 ggatgtatgt aagtataagc gtctatgctt acatggtata gatgggtttc cctccaggag 7740 tgtagatctt cgtggcagcg aagatctgat tctgtgaagg gcgacacata cggttcaggt 7800 tgtggaggga ataatttgtt ggctgaatat tccagccatt gaagctttgt tgcccattca 7860 tgagggaatt cttccttgat catgtcaaga tattcctcct tagacgttgc agtctggata 7920 atagttctcc atcgtgcgtc agatttgcga ggagaaacct tatgatctcg gaaatctcct 7980 ctggttttaa tatctccgtc ctttgatatg taatcaagga cttgtttaga gtttctagct 8040 ggctggatat tagggtgatt tccttcaaaa tcgaaaaaag aaggatccct aatacaaggt 8100 tttttatcaa gctggagaag agcatgatag tgggtagtgc catcttgatg aagctcagaa 8160 gcaacaccaa ggaagaaaat aagaaaaggt gtgagtttct cccagagaaa ctggaataaa 8220 tcatctcttt gagatgagca cttgggatag gtaaggaaaa catatttaga ttggagtctg 8280 aagttcttac tagcagaagg catgttgttg tgactccgag gggttgcctc aaactctatc 8340 ttataaccgg cgtggaggca tggaggcagg ggtattttgg tcattttaat agatagtgga 8400 aaatgacgtg gaatttactt aaagacgaag tctttgcgac aagggggggc ccacgccgaa 8460 tttaatatta ccggcgtggc ccccccttat cgcgagtgct ttagcacgag cggtccagat 8520 ttaaagtaga aaatttcccg cccactaggg ttaaaggtgt tcacactata aaagcatata 8580 cgatgtgatg gtatttgatg gagcgtatat tgtatcaggt atttccgttg gatacgaatt 8640 attcgtacga ccctcatagt ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa 8700 cctaagagaa aagagcgttt attagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta 8760 tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact 8820 ttgatccaac ccctccgctg ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct 8880 tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt 8940 tcctggcgtt ttcttgtcgc gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac 9000 cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc 9060 agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc 9120 aagctgtttt ccgagaagat caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg 9180 cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc 9240 agcacccgcg acctactgga cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt 9300 agcctggcag agccgtgggc cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg 9360 ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc 9420 gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag 9480 atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca 9540 ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg 9600 cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc 9660 ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc 9720 aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg 9780 tgttcgagcc gcccgcgcac ggctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt 9840 ctgatgccaa gctggcggcc tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc 9900 gtctaaaaag gtgatgtgta tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata 9960 tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact 10020 taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca 10080 actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg 10140 ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga 10200 ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc 10260 ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc 10320 aagcccttac gacatatggg ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga 10380 ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg 10440 catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg 10500 tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc 10560 agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa 10620 actcatttga gttaatgagg taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc 10680 ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca 10740 gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac 10800 gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca 10860 gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat 10920 ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg 10980 cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc 11040 caagcccgag gaatcggcgt gacggtcg 11068 <210> 6 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A module nucleotide sequence <400> 6 ggtctcngag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc 60 tngagacc 68 <210> 7 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A module nucleotide sequence <400> 7 ggtctcngct actaattttt ctcttcttaa gcaagctgga gatgttgaag aaaatcctgg 60 acccngagac c 71 <210> 8 <211> 422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmYLCV module nucleotide sequence <400> 8 ggtctcncta tctggcagac aaagtggcag acatactgtc ccacaaatga agatggaatc 60 tgtaaaagaa aacgcgtgaa ataatgcgtc tgacaaaggt taggtcggct gcctttaatc 120 aataccaaag tggtccctac cacgatggaa aaactgtgca gtcggtttgg ctttttctga 180 cgaacaaata agattcgtgg ccgacaggtg ggggtccacc atgtgaaggc atcttcagac 240 tccaataatg gagcaatgac gtaagggctt acgaaataag taagggtagt ttgggaaatg 300 tccactcacc cgtcagtcta taaatactta gcccctccct cattgttaag ggagcaaaat 360 ctcagagaga tagtcctaga gagagaaaga gagcaagtag cctagaagta gaaccngaga 420 cc 422 <210> 9 <211> 264 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtHSP 3 prime UTR module nucleotide sequence <400> 9 ggtctcnata tgaagatgaa gatgaaatat ttggtgtgtc aaataaaaag cttgtgtgct 60 taagtttgtg tttttttctt ggcttgttgt gttatgaatt tgtggctttt tctaatatta 120 aatgaatgta agatctcatt ataatgaata aacaaatgtt tctataatcc attgtgaatg 180 ttttgttgga tctcttctgc agcatataac tactgtatgt gctatggtat ggactatgga 240 atatgattaa agataagnga gacc 264 <210> 10 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st Forward nucleotide sequence containing BasI enzyme site and overhang site <400> 10 ggtctcnaac c 11 <210> 11 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st Reverse nucleotide sequence containing BasI enzyme site and overhang site <400> 11 ggtctcncct c 11 <210> 12 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd Forward nucleotide sequence containing BasI enzyme site and overhang site <400> 12 ggtctcnccc t 11 <210> 13 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd Reverse nucleotide sequence containing BasI enzyme site and overhang site <400> 13 ggtctcntag c 11 <210> 14 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3rd Forward nucleotide sequence containing BasI enzyme site and overhang site <400> 14 ggtctcnacc c 11 <210> 15 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3rd Reverse nucleotide sequence containing BasI enzyme site and overhang site <400> 15 ggtctcnata t 11 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st Forward primer <400> 16 acggtctcna accatggtga gcaagggcga g 31 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st Reverse primer <400> 17 tgggtctcnc ctccttgtac agctcgtcca t 31 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd Forward primer <400> 18 acggtctcnc cctgtgagca agggcgagga g 31 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd Reverse primer <400> 19 tgggtctcnt agccttgtac agctcgtcca t 31 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3rd Forward primer <400> 20 acggtctcna cccgtgagca agggcgagga g 31 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3rd Reverse primer <400> 21 tgggtctcna tatttacttg tacagctcgt ccat 34 <210> 22 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A site <400> 22 gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccgg 46 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A site <400> 23 ctaatttttc tcttcttaag caagctggag atgttgaaga aaatcctgg 49 <210> 24 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter site <400> 24 ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60 acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120 ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180 gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240 agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300 gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360 agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag 400 <210> 25 <211> 242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator site <400> 25 gaagatgaag atgaaatatt tggtgtgtca aataaaaagc ttgtgtgctt aagtttgtgt 60 ttttttcttg gcttgttgtg ttatgaattt gtggcttttt ctaatattaa atgaatgtaa 120 gatctcatta taatgaataa acaaatgttt ctataatcca ttgtgaatgt tttgttggat 180 ctcttctgca gcatataact actgtatgtg ctatggtatg gactatggaa tatgattaaa 240 ga 242

Claims

서열번호 2 내지 5 중 하나의 시퀀스로 구성되고,
식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터 제조에 사용되는 것인, 폴리시스트론 발현 벡터 제조용 백본 벡터.
바이너리 벡터 (binary vector)에 제2 제한효소 인식 부위를 삽입시킨 것을 백본 벡터로 사용하고,
상기 백본 벡터의 제2 제한효소에 의한 절단 부위에 2개의 오버행 시퀀스가 위치하고,
상기 2개의 오버행 시퀀스는 각각 정방향 가닥과 역방향 가닥에 위치하고,
상기 제2 제한효소에 의한 절단 부위에 하기 (1) 프로모터; (2) 1 이상의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스; (3) 2 이상의 목적 유전자 모듈; 및 (4) 터미네이터 요소들이 삽입된 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
(1) 제2 제한효소에 의해 절단되고, 절단 후 백본 벡터에 위치한 오버행 시퀀스 및 목적 유전자 모듈에 위치한 오버행 시퀀스와 각각 상보적인 2개의 오버행 시퀀스를 포함하는, 프로모터;
(2) 목적 유전자 모듈 사이에 위치하며, 제2 제한효소에 의해 절단되고, 절단 후 목적 유전자 모듈에 위치한 오버행 시퀀스 및 또 다른 목적 유전자 모듈에 위치한 오버행 시퀀스와 각각 상보적인 2개의 오버행 시퀀스를 포함하는, 1 이상의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스;
(3) 프로모터와 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 사이, 또는 2개의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 사이, 또는 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스와 터미네이터 사이에 위치하며, 제2 제한효소에 의해 절단되고, 절단 후 프로모터에 위치한 오버행 시퀀스, 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스에 위치한 오버행 시퀀스, 및 터미네이터에 위치한 오버행 시퀀스 중 2개의 오버행 시퀀스와 각각 상보적인 2개의 오버행 시퀀스; 상기 상보적인 2개의 오버행 시퀀스와 각각 연결된 2개의 목적 유전자 특이적 시퀀스; 및 목적 유전자를 포함하는, 2 이상의 목적 유전자 모듈; 및
(4) 제2 제한효소에 의해 절단되고, 절단 후 백본 벡터에 위치한 오버행 시퀀스 및 목적 유전자 모듈에 위치한 오버행 시퀀스와 각각 상보적인 2개의 오버행 시퀀스를 포함하는, 터미네이터.
제 2항에 있어서,
상기 프로모터에서 2개의 오버행 시퀀스는, 각각 백본 벡터의 역방향 가닥에 위치한 오버행 시퀀스 및 제1 목적 유전자 모듈의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이고,
상기 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스에서 2개의 오버행 시퀀스는, 각각 제1 목적 유전자 모듈의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 제2 목적 유전자 모듈의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이고,
상기 목적 유전자 모듈에서 2개의 오버행 시퀀스는, i) 각각 프로모터의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이거나, ii) 각각 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이거나, iii) 각각 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스 및 터미네이터의 정방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적이고,
상기 터미네이터에서 2개의 오버행 시퀀스는, 각각 백본 벡터의 정방향 가닥에 위치한 오버행 시퀀스 및 목적 유전자 모듈의 역방향 5' 말단에 위치한 오버행 시퀀스와 상보적인 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 2항에 있어서,
상기 바이너리 벡터는 pLSLR 벡터인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 4항에 있어서,
상기 백본 벡터는 서열번호 2 내지 5 중 하나의 시퀀스를 갖는 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 2항에 있어서,
상기 제2 제한효소는 BasI인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 6항에 있어서,
상기 모든 오버행 시퀀스는 4개의 염기를 포함하는 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 6항에 있어서,
상기 백본 벡터에 위치한 2개의 오버행 시퀀스는 역방향 가닥에 5'-ATAG-3' 및 정방향 가닥에 5'-TAAG-3'인 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 6항에 있어서,
상기 폴리시스트론 발현용 벡터에 삽입된 요소들은, 프로모터 - 제1 목적 유전자 모듈 - 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 - 제2 목적 유전자 모듈 - 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 - 제3 목적 유전자 모듈 - 터미네이터 순서로 삽입된 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 9항에 있어서,
상기 프로모터는 정방향의 5' 말단에 5'-CTAT-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-GGTT-3' 오버행 시퀀스를 포함하고,
상기 제1 목적 유전자 모듈은 정방향의 5' 말단에 5'-AACC-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-CCTC-3' 오버행 시퀀스를 포함하고,
상기 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스는 정방향의 5' 말단에 5'-GAGG-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-AGGG-3' 오버행 시퀀스를 포함하고,
상기 제2 목적 유전자 모듈은 정방향의 5' 말단에 5'-CCCT-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-TAGC-3' 오버행 시퀀스를 포함하고,
상기 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스는 정방향의 5' 말단에 5'-GCTA-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-GGGT-3' 오버행 시퀀스를 포함하고,
상기 제3 목적 유전자 모듈은 정방향의 5' 말단에 5'-ACCC-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-ATAT-3' 오버행 시퀀스를 포함하고,
상기 터미네이터는 정방향의 5' 말단에 5'-ATAT-3' 및 역방향의 5' 말단에 5'-CTTA-3' 오버행 시퀀스를 포함하는 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 6항에 있어서,
상기 제1 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스 및 제2 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스는, 오버행 시퀀스를 제외하고 각각 서열번호 22 및 23의 시퀀스를 갖는 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 6항에 있어서,
상기 프로모터와 터미네이터는, 오버행 시퀀스를 제외하고 각각 서열번호 24 및 25의 시퀀스를 갖는 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
서열번호 2 내지 5 중 하나를 갖는 백본 벡터;
서열번호 6의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터;
서열번호 7의 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터;
서열번호 8의 프로모터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터;
서열번호 9의 터미네이터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터;
제1 목적 유전자 모듈;
제2 목적 유전자 모듈; 및
제3 목적 유전자 모듈로부터 제조되고,
상기 제1 목적 유전자 모듈은, 서열번호 10 및 11의 시퀀스, 상기 서열번호 10 및 11의 시퀀스 각각의 3' 말단에 연결된 제1 목적 유전자 특이적 시퀀스, 및 제1 목적 유전자를 포함하고,
상기 제2 목적 유전자 모듈은, 서열번호 12 및 13의 시퀀스, 상기 서열번호 12 및 13의 시퀀스 각각의 3' 말단에 연결된 제2 목적 유전자 특이적 시퀀스, 및 제2 목적 유전자를 포함하고,
상기 제3 목적 유전자 모듈은, 서열번호 14 및 15의 시퀀스, 상기 서열번호 14 및 15의 시퀀스 각각의 3' 말단에 연결된 제3 목적 유전자 특이적 시퀀스, 및 제3 목적 유전자를 포함하는 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 13항에 있어서,
상기 클로닝 벡터는 pLUG-Prime, pCR2.1, 및 pGEM-T로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것인, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터.
제 2항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터로 형질전환된 식물체.
제 2항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터의 제조방법으로,
바이너리 벡터 (binary vector)에 제2 제한효소 인식 부위를 삽입시켜 백본 벡터를 제조하는 단계;
제2 제한효소 인식 부위를 갖는 프로모터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터를 제조하는 단계;
제2 제한효소 인식 부위를 갖는 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터를 제조하는 단계;
제2 제한효소 인식 부위를 갖는 목적 유전자 모듈을 제조하는 단계;
제2 제한효소 인식 부위를 갖는 터미네이터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터를 제조하는 단계;
상기 백본 벡터, 프로모터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터, 2A 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터, 목적 유전자 모듈, 터미네이터 시퀀스가 삽입된 클로닝 벡터를 혼합한 다음, 제2 제한효소와 라이게이즈 첨가하여 효소 절단 및 라이게이션 공정을 동시에 실시하는 단계를 포함하는, 식물에 대한 폴리시스트론 발현용 벡터의 제조방법.