KR20210052324A

KR20210052324A - 한국 전통 청국장에서 분리된 초고순도 트랜스형 메나퀴논-7 고생산능을 가지는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210052324A
Application number: KR1020200141938A
Authority: KR
Inventors: 한정준; 주숙자; 정천오; 나성숙; 김의중
Original assignee: 주식회사 지에프퍼멘텍
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2021-05-10
Also published as: KR102354881B1

Abstract

본 발명은 trans 형태 메나퀴논-7을 고농도로 생산하면서, 메나퀴논-6을 거의 생산하지 않는 신규한 바실러스 서브틸러스 나토균 및 이을 이용한 메나퀴논-7의 제조방법에 관한 것이다. 상기 균주를 이용하여 심혈관계 질환 및 골다공증 치료제를 비롯한 각종 성인병 질환에도 효과적인 건강기능 식품 및 의약 조성물을 제조할 수 있다.

Description

한국 전통 청국장에서 분리된 초고순도 트랜스형 메나퀴논-7 고생산능을 가지는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도{Novel Bacillus subtilis natto Isolated from Korean Traditional Soy Bean Paste with High Productivity for High Purity Trans Type Menaquinone-7 and the Use Thereof}

본 발명은 메나퀴논-7 고생산능을 가지는 신규 균주에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 trans 형태 메나퀴논-7을 고농도로 생산하면서, 메나퀴논-6을 거의 생산하지 않는 신규한 바실러스 서브틸러스 나토균 및 이을 이용한 메나퀴논-7의 제조방법에 관한 것이다.

비타민 K2의 작용기작은 γ-glutamyl carboxylase의 보조인자(cofactor)로 작용하여 Gla-protein(비타민 K-dependent carboxylation/γ-carboxyglutamic domain을 가지고 있는 단백질의 총칭)의 글루탐산(Glu)을 γ-carboxyglutamic acid (Gla)로 카르복실화시키는 기작을 활성화시킨다. 이러한 비타민 K2 의존형 Gla-protein의 카르복실화는 해당 단백질 기능에 필수요소로 작용할 뿐만 아니라 비타민 K 리사이클 경로에서 비타민 K2의 epoxide 대사체 (KO)가 비타민 K2로 재전환되는데 작용하여 카르복실화에 재사용이 될 수 있도록 한다.

비타민 K2의 주요 효능으로는 칼슘을 혈액 내로부터 흡수하여 뼈로 이동시키므로 골다공증을 예방하여 뼈의 강도를 증가시키는 기능을 한다. 또한 비타민 K2 는 뼈 내부의 미네랄 농도(bone-mineral density)를 유지시키는데 중요한 작용을 한다. 골다공증 및 만성 신장 질환 환자의 경우 혈관 내 칼슘 침착이 나타나는데 비타민 K2는 혈관 내 칼슘 침착 저해 단백질인 MGP (matrix Gla protein) 의 기능 저하에 의해 나타나는 결과로서, 비타민 K2 처방에 의해 혈관 내 칼슘 침착을 방지 할 수 있다. 최근에는 당뇨, 치매, 파킨스 질환에도 그 효능 연구가 활발히 이루어지고 있다.

비타민 K2는 메나퀴논-4 (MK-4)의 형태로 2000년대 초반에 효능이 밝혀지면서 세상에 많이 알려지기 시작했고 2005년에 화학합성 유래 MK-4가 골다공증 치료제로서 등록되어 의약품으로 사용되어 왔다. 하지만 반감기가 짧아 효능이 약하여 시장에서 크게 관심을 끌지 못하다가 Bacillus subtilis 또는 B.licheniformis 에 의해 메나퀴논-7 형태의 비타민 K2의 생산이 되는 것이 보고되고 MK-4 대비 강력한 효능이 알려짐에 따라 비타민 K2 시장의 주가 되었고 시장에 수요가 높아지고 있다.

메나퀴논-7(MK-7)타입의 비타민 K2는 trans form만이 활성을 나타내며 화학합성의 경우 cis form이 다량 생성된다. 이에 불순물로 판단될 수 있는 cis form이 거의 없는 순순한 trans 형태의 MK-7의 생산이 매우 중요하다. 미국 약전 (USP)에는 발효 시 소량 생성되는 MK-6의 함량에 대해서도 매우 엄격한 기준인 2% 이하로 규격화하고 있다. 따라서, 순순한 trans 형태의 MK-7를 생산할 수 있는 방법을 개발하는 것이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 MK-6 함량이 2% 이하여서 추가적인 정제가 필요없으면서도, 활성 성분인 trans 형태 이성질체가 99% 이상인 고순도 MK-7을 높은 효율로 생산할 수 있는 균주를 찾아내고자 노력한 결과, 한국 전통 청국장에서 신규한 바실러스 서브틸리스 나토(Bacillus substilis natto) 균주를 분리하고, 상기 균주가 종래의 균주에 비해 MK-7의 생산능력이 현저히 높으며 trans 형태의 함량이 99% 이상이며 MK-6 함량이 2% 이하로 효율적으로 MK-7을 생산할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 trans 형태의 메나퀴논-7을 고순도로 생산하는 신규 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 신규균주를 배양하여 trans 형태의 메나퀴논-7을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메나퀴논 생성능을 가지고, 생성되는 메나퀴논 중 메나키논-6을 2%이하로 생성하고, 메나퀴논-7 생성량 중 트랜스형 메나퀴논-7의 함량이 99%이상인 것을 특징으로 하는 신규 균주 바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152(KCTC18795P)를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152(KCTC18795P)를 배양하여 비타민 K2를 생성시키는 단계; 및 b) 상기 생성된 비타민 K2를 수득하는 단계를 포함하는 비타민 K2의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152 균주는 종래의 균주에 비해 MK-7의 생산능력이 현저히 높으며 활성을 나타내는 trans함량이 99% 이상이며 MK-6 함량이 2% 이하로 효율적으로 MK-7을 생산할 수 있어 생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있다. 또한, 상기 균주를 이용하여 심혈관계 질환 및 골다공증 치료제를 비롯한 각종 성인병 질환에도 효과적인 건강기능 식품 및 의약 조성물을 제조할 수 있다.

도 1은 Bacillus subtilis natto GFMK-152의 Vitamin K2 MK-7 배양 특성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 GFMK-152 균주 유래 MK-7의 이소머 순도를 확인한 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 시판매 중인 MK-7 제품의 이소머 순도를 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 trans 형태 메나퀴논-7을 고농도로 생산하면서, 메나퀴논-6을 거의 생산하지 않는 신규한 균주를 개발하고자, 한국 전통 청국장에서 205종의 바실러스 서브틸리스를 분리하고, 이들 균주 중 메나퀴논-7을 고농도로 생산하면서, 메나퀴논-6를 거의 생산하지 않는 신규 바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152 균주를 선별하였다.

상기 선별된 GFMK-152 균주는 비타민 K2 성분 중 MK-6성분이 MK-7함량 대비 2% 이하로 현저히 낮고, 생산된 메나퀴논-7 중 트랜스 형태(trans form)를 99.9%의 메나퀴논-7을 생산하고, 시스형태(cis form)를 0.001%로 만 생산하는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 메나퀴논 생성능을 가지고, 생성되는 메나퀴논 중 메나키논-6을 2%이하로 생성하고, 메나퀴논-7 생성량 중 트랜스형 메나퀴논-7의 함량이 99%이상인 것을 특징으로 하는 신규 균주 바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152에 관한 것이다.

본 발명에 따른 GFMK-152 균주는 96시간 발효 시 260.2mg/L로 시간당 2.71 mg/L의 높은 비타민 MK-7 생산성을 확인할 수 있었으며 trans 함량은 99.9%. MK-7 대비 MK-6 함량은 1.3% 수준으로 매우 고순도의 all trans MK-7을 생산할 수 있는 균주이다(도 1).

다른 관점에서, 본 발명은 (a) 바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152를 배양하여 비타민 K2를 생성시키는 단계; 및 b) 상기 생성된 비타민 K2를 수득하는 단계를 포함하는 비타민 K2의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서는 GFMK-152 균주를 효모 추출물, 글리세린(glycerine), 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 및 대두분말을 포함하는 배지에서 배양하여, 비타민 K2를 생산하였다.

본 발명에 있어서, 상기 비타민 K2는 메나퀴논-4, 메나퀴논-6, 메나퀴논-7 등일 수 있으며, 바람직하게는 메나퀴논-7인 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 예는오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 비타민 K2 생산 균주의 선별

국내산 청국장으로부터 분리한 균주 205종으로부터 비타민 K2 생산성을 보유한 균주들을 확보하여 그중 1차적으로 생산성이 높은 균주를 선별하고자 하였다. 사용한 배지 조성은 다음과 같다: Glycerol 100 g/L, Soy bean meal 50 g/L, Yeast extract 50 g/L, K₂HPO₄ 0.6 g/L. 500mL flask에 배지 (50mL)를 넣고, 96시간, 37도, 150 rpm으로 진탕 배양하여 비타민 K2 생산성을 시험하였다. 그 결과, Bacillus subtilis natto GFMK-152 균주가 96시간에 312.3mg/L, 시간(hr) 당 2.6mg/L의 높은 비타민 K2 생산성을 보였다(표 1).

비타민 K₂생산균주의 생산량

균 주 명	번호	비타민 K₂ 생산량 (mg/L)
Bacillus subtilis natto	KCTC14231	30.7
Bacillus licheniformis	KCTC1659	17.6
Bacillus subtilis natto	GFMK-112	105.8
*Bacillus subtilis natto*	GFMK-152	251.3
Bacillus subtilis natto	GFMK-183	83.5
Bacillus subtilis natto	GFMK-204	65.5

한국등록특허 10-1884659에서는 야생형의 바실러스 서브틸리스 균주를 이용하여 최적의 복합 배지 조건에서 80시간 발효한 경우 11.4mg/L 수준의 메나퀴논-7을 생성하고, 자외선과 아지드화나트륨으로 돌연변이한 변이균주가 같은 배양 조건에서 80시간 발효한 경우 107.0mg/L 수준의 메나퀴논-7 생산성을 생성한다고 보고하고 있다. Berenjian 등도 나토(natto)에서 분리한 바실러스 서블틸리스 나토(Bacillus subtillis natto) 균주를 발효 조건 최적화를 통하여 5% 효모 추출물, 5% 글리세린(glycerine), 18.9% 대두 펩톤, 0.06% 제2인산칼륨(K2HPO4) 배지에서 120시간 배양하여 226 ㎎/ℓ의 메나퀴논-7(menaquinone-7, MK-7; 비타민 K2)을 얻었으며, 생산성(productivity)은 시간(hr)당 1.8 ㎎/L 이였다.따라서, Bacillus subtilis natto GFMK-112, GFMK-152 두 균주를 선별하여 이후 실험을 수행하였다.

실시예 2: 비타민 K ₂ 선발 균주 배양

비타민 k2 생산능이 우수한 Bacillus subtilis natto GFMK-112, GFMK-152 두 균주에 대해 Glycerol 100 g/L, Soy bean meal 50 g/L, Yeast extract 50 g/L, K₂HPO₄ 0.6 g/L를 배지로 하여 5L 배양기를 이용하여 발효하여 비타민 K₂ 생산 및 isomer 순도 및 MK-6 함유량에 대해 조사하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, GFMK-152번 균주가 96시간 발효 시 260.2mg/L로 시간당 2.71 mg/L의 높은 비타민 MK-7 생산성을 확인할 수 있었으며 trans 함량은 99.9%. MK-7 대비 MK-6 함량은 1.3% 수준으로 매우 고순도의 all trans MK-7을 생산할 수 있는 균주임을 확인하였다.

실시예 3: 비타민 k2 추출 및 순도, 함량분석

실시예 2의 배양액에 주정을 투입하여 주정함량 95%가 되도록 하여 40℃에서 1시간 교반 추출한 후 여과하여 감압 농축 건조하여 물과 주정을 제거한 후, MCT를 이용 비타민 K2를 추출하여 용해되지 않은 부분을 상분리 및 여과한 후 순도 및 함량 분석을 위해 HPLC 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 분석결과 MK-7 trans 형태는 RT 약 17.6분, cis 형태는 19.9분에서 검출되었다. 피크 면적 %를 기준으로 한 순도 분석 결과 MK-7의 trans 형태는 99.9%, cis 형태는 0.001%으로 all trans type의 MK-7을 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 표준품 및 시료의 순도 및 함량 비교 분석

USP 기준 menaquinone-7 분석법을 이용하여 순도 및 함량분석을 실시하였다. 시료는 MK-7 (USP) 표준품과 GFMK-152 균주 유래 Mk-7 그리고 시장에서 판매 중인 MK-7시료를 이용하여 분석하였다.

㉮ 표준품

MK-7 12.5 mg을 25 mL volumetric flask에 넣고 먼저 tetrahydrofuran (THF) 0.5 mL을 넣고 플라스크 부피만큼 무수 에탄올을 첨가하여 희석한다. 이 용액 5 mL을 다시 25 mL volumetric flask에 넣고 플라스크 부피만큼 무수 에탄올로 희석하고 필터 후 시료로 분석하였다 (최종 0.1 mg/mL).

㉯ 검체

검체 0.4g을 25 mL volumetric flask에 넣고 먼저 2 mL THF를 첨가한 후 flask 부피만큼 무수 에탄올을 첨가하여 희석한다. 필터 후 시료로 하였다. 위의 전처리 방식으로 시료를 조제하여 분석하였고, USP에서 제시된 최적 파장인 268 nm에서 피크의 면적 값을 확인하여 순도실험을 실시하였다.

그 결과, 검체의 경우, 도 2에서 나타난 바와 같이, 99.9%의 trans형 MK-7와 0.001% cis 형태를 가지고 있었으나, 시판매되는 USP 표준품 MK-7의 경우,도 3에 나타난 바와 같이, isomeric puriy를 동일 분석법으로 살펴본 결과 trans type이외의 cis type 및 알 수 없는 불순물 함유량이 매우 높았다.

실시예 5:바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152 균주 동정

GFMK-152 균주의 동정을 위하여, 해당 균주의 16S rRNA와 aprN 염기서열을 확인하였다. 16S rRNA과 aprN 염기서열을 증폭하기 위하여 순수 분리된 균주로부터 게놈 DNA를 분리(genomic DNA extraction kit: RBC사)하였고, 분리된 게놈 DNA를 주형으로 일반 세균용 프라이머(universal PCR primer)인 서열번호 4의 27F와 서열번호 5의 1492R로 PCR을 이용하여 16S rRNA 염기서열(서열번호 1)을 확보하였고, 게놈 서열에서 aprN의 ORF(Open Reading Frame) 양쪽 바깥에 결합하는 서열번호 6와 서열번호 7의 프라이머를 이용하여 aprN 염기서열(서열번호 2)을 확보하였다. 상기 실험을 통하여 얻은 16S rRNA 염기서열과 aprN ORF를 가지는 염기서열을 이용하여 NCBI(The National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Blast search 프로그램과 상기 나토 게놈 프로젝트(http://natto-genome.org)에 등록된 나토 균주의 게놈 정보로 상동성을 비교하였다.

16S rRNA 염기서열의 상동성과 aprN 염기서열과 아미노산 서열(382개의 전체 아미노산과 298번 위치의 발린(valine)) 분석 결과 GFMK-152 균주는 바실러스 서브틸리스 나토 임을 확인하였다.

[수탁기관]

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC18795P

수탁일자 : 20191127

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업게의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의항 정의된다고 할 것이다.

<110> GF Fermentech <120> Novel Bacillus subtilis natto Isolated from Korean Traditional Soy Bean Paste with High Productivity for High Purity Trans Type Menaquinone-7 and the Use Thereof <130> P20-B297 <150> KR 2019-0136271 <151> 2019-10-30 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA <400> 1 ccaccttcgg cggctggctc ctaaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct 60 cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc 120 cgcgattact agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag 180 aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc ggtttcgctg ccctttgttc tgtccattgt 240 agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct 300 ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa 360 gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat 420 gcaccacctg tcactctgcc ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt cagaggatgt 480 caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg 540 cgggcccccg 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Gly Gly Thr Tyr 305 310 315 320 Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 325 330 335 Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val 340 345 350 Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr 355 360 365 Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln 370 375 380 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agagtttgat catggctcag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggataccttg ttacgactt 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gacatttcag cataatgaac at 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggaacatcag gatgctgaca 20

Claims

메나퀴논 생성능을 가지고, 생성되는 메나퀴논 중 메나키논-6을 2%이하로 생성하고, 메나퀴논-7 생성량 중 트랜스형 메나퀴논-7의 함량이 99%이상인 것을 특징으로 하는 신규 균주 바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152(KCTC18795P).
다음 단계를 포함하는 비타민 K2의 제조방법:
(a) 바실러스 서브틸리스 나토 GFMK-152(KCTC18795P)를 배양하여 비타민 K2를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 비타민 K2를 수득하는 단계.
제2항에 있어서, 비타민 K2는 메나퀴논-7인 것을 특징으로 하는 방법.