KR20210042334A - 상기도감염, 스트레스, 불안, 기억력 및 인지기능장애, 및 노화를 위한 프로바이오틱 균주 - Google Patents

상기도감염, 스트레스, 불안, 기억력 및 인지기능장애, 및 노화를 위한 프로바이오틱 균주 Download PDF

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KR20210042334A
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lactobacillus plantarum
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aging
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KR1020217006268A
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박용하
리옹민지
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클리니컬 뉴트리션 인터내셔널 (엠) 에스디엔 비에이치디
프로울리오 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 본 발명의 첫 번째 양상과 연관이 있고, 상기 첫 번째 양상은 중국 미생물자원은행에 수탁번호 CGMCC 15535로 기탁되었고, 전체 게놈 서열은 유전자 은행에 수탁번호 CP031318로 기탁된 락토바실러스 플란타룸의 균주에 관한 것이다. 상기 균주는 상부 호흡기 감염, 스트레스, 불안, 기억력,인지기능장애, 알츠하이머병, 고지혈증, 장 균형 및 노화에 특히 유용하다.

Description

상기도감염, 스트레스, 불안, 기억력 및 인지기능장애, 및 노화를 위한 프로바이오틱 균주
본 출원은 2018년 9월 3일에 출원된 말레이시아 특허출원 PI 2018703091의 이익을 주장하고, 상기 말레이시아 특허 출원의 내용들은 본 명세서에 전체적으로 참조로서 통합되어지며, 상기 말레이시아 특허 출원은 본 명세서에서 "말레이시아 우선권 출원"으로 지칭한다.
본 발명은 의학, 미생물학 및 영양학, 그리고 특히 프로바이오틱 박테리아 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7에 관한 것이다. 상기 락토바실러스 플란타룸 DR7은 건강, 특히 상기도 감염, 스트레스, 불안, 기억력, 인지기능장애 및 노화지연의 예방 및 치료를 위한 다수의 생체기능성들을 갖는다.
과학 논문 "Lactobacillus plantarum DR7 reduces cholesterol via phosphorylation of AMPK that down-regulated the mRNA expression of HMG-CoA reductase(30.04.2018)"는 2018년 4월 30일에 공개되었다. 상기 논문의 저자들은 본 특허 출원의 발명자들과 동일하고 말레이시아 우선권 출원 이전에 공개되었으며 1년의 우선권기간내에 이루어졌다. 본 논문의 내용은 말레이시아 우선권 출원에 통합되었고(따라서 그 내용은 말레이시아 우선권 출원일에 공개되지 아니하였다), 또한 본 출원에 포함된다. 본 논문의 저자들은 말레이시아 우선권 출원의 발명자들이고, 본 출원 및 말레이시아 우선권 출원의 출원인들에게 모든 권리를 양도하였다. 환원하면, 본 출원인들의 상기 공개는 소위 "발명자에 의한 원천 공개"로 간주되어질 수 있다(즉, 공개의 주제는 발명가, 하나 또는 그 이상의 공동발명가, 또는 발명가 또는 공동발명가로부터 직접 또는 간접적으로 주제를 획득한 사람으로부터 기인되어야 한다). 본 명세서는 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7을 최초로 기술하는 것으로, 단지 콜레스테롤 대사(cholesterol metabolism)에서의 그 기본적인 기계적 역할(mechanistic role)을 기술하는 것이다. 상기 관점에서, 박테리아 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7 그 자체뿐만 아니라 이의 모든 의학적 사용들은 적어도 1년의 우선권기간을 향유하는 국가들에서 특허 가능한 주제이다.
논문 "Lactobacillus plantarum DR7 alleviated stress and anxiety while improving memory and cognition in stressed adults via the serotonin and dopamine pathways(18.03.2019)"는 2019년 3월 18일에 공개되었고, 상기 공개일은 말레이시아 우선권 출원의 우선일 이후이다. 본 논문의 내용은 말레이시아 우선권 출원에 통합되었고(따라서 그 내용은 우선권 출원일에 공개되지 아니하였다), 또한 본 출원에 포함된다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸 DR7 균주의 기억력과 인지능력 향상 및 스트레스와 불안의 경감 효과는 말레이시아 우선권 출원일에 알려지거나 공개되지 아니하였다.
논문 "Lactobacillus plantarum DR7 improved upper respiratory tract infections via enhancing immune and inflammatory parameters: A randomised, double-blind, placebo-controlled study(03.04.2019.)"는 2019년 4월 3일에 공개되었고, 이는 말레이시아 우선권 출원에 의한 우선일 이후이다. 본 논문의 내용은 말레이시아 우선권 출원에 통합되었고(따라서 그 내용은 우선권 출원일에 공개되지 아니하였다), 또한 본 출원에 포함된다. 따라서, 상기도 감염 개선 및 면역과 염증 매개변수들의 향상에 대한 락토바실러스 플란타룸 DR7의 효능은 말레이시아 우선권 출원일에 알려지거나 공개되지 아니하였다.
상술한 내용은 본 명세서에 전체적으로 참조에 의하여 통합된다.
프로바이오틱스는 '적정한 양으로 섭취시 숙주에 건강한 효과를 부여하는 살아있는 미생물'로 규정된다(PAO/WHO, 2006). 락토바실러스는 장내 환경조절부터 대사장애(metabolic disorders)의 경감 및 면역반응(immune responses) 조절에 이르기까지의 건강상의 이점들을 발휘한다.
건기 동안에는, 더 높은 수준의 공기 부유 오염물질들이 기도(airways)에서 염증 과정(inflammation processes)을 유발하고, 이는 점막 투과성(mucosal permeability)을 증가시키며, 그 결과 병원성 미생물(pathogenic microorganisms)에 의한 감염에 취약하게 된다. 우기 동안에는, 높은 습도가 곰팡이 와 곰팡이균의 성장 그리고 바이러스들의 발현을 도와 감기, 알레르기 상태, 그리고 호흡기 감염의 발현을 증가시킨다. 상기도 감염(URTI)은 상부 호흡기(upper respiratory system)에 영향을 미치는 일반적인 감기(cold), 후두염(laryngitis), 부비동염(sinusitis) 그리고 인두염 (pharyngitis)을 포함한 감염들을 아우르는 일반적인 용어이다. 이러한 감염들은 국제 사회에 영향을 미치는 가장 흔한 건강 문제들 중 하나이다. 미국에서는 성인의 경우 매년 2-3회의 상기도 감염이 발생하고, 어린이의 경우 연간 최대 5건의 상기도 감염이 나타나고 있다. 그러나 성인의 20% 이상이 4주마다 상기도 감염을 경험하고 있다.
알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 전세계적으로 가장 널리 퍼진 치매로서 전세계 4천 7백만명의 사람들이 영향을 받고 있으며 이는 2018년 기준으로 전체 비용 6천4백억 달러를 지출시키고 있다. 전세계 60세 이상의 인구의 12% (대략 8억명)에게, 알츠하이머 병은 치료법이나 예방 요법(cure or preventative therapy)이 아직 알려지지 않는 감염병 수준으로 근접해 가고 있다. 이 질병의 특징은 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ)로 알려진 아밀로이드생성 펩티드 (amyloidogenic peptides)의 위치로 기인된 아밀로이드 신경반(amyloid plaques)의 존재이다. Aβ 펩티드의 많은 생성은 불용성 원섬유(insoluble fibrils)에 축적되고, 얽히는 경향이 있다.
스트레스는 위협적인 일에 대한 신체의 비특이적 반응이며 이는 불안, 불편함, 정서적 긴장 및 적응의 어려움을 야기한다. 불안은 스트레스에 대한 최초의 심리적 반응(psychological reaction)이며 지속된 불안(prolonged anxiety)은 종종 우울증(depression)을 포함한 정신 질환(mental illnesses) 등을 유발한다. 전세계적으로 3억만명 이상이 우울증의 영향을 받고 있으며, 매년 거의 80만명이 자살로 인하여 목숨을 잃고 있다. 장뇌축(gut-brain axis)을 따라 장과 뇌 사이의 신호반응(signalling responses)의 양방향 흐름(bidirectional flow)으로 보아 장내 미생물(gut microbiota)이 뇌 건강과 연관성이 있다.
노화(Ageing)는 연령별 사망률의 증가를 야기하는 생리적 기능의 감퇴와 관련된 연령 의존적 다인성 과정이다. 노화는 피할 수 없지만, 현재의 노화에 대한 연구들은 기대수명이 증가하는 가운데 삶의 질을 향상 시키는 것을 목표로 하고 있다.
노화 과정(Ageing processes)은 세포 수준부터 감각, 운동, 기억 그리고 고위인지기능에 영향을 미치는 능력저하를 포함하는 기능 수준에 이르기까지 다방면에서 뇌에 영향을 미친다. 심각한 인지 저하는 알츠하이머 병과 기억력 감퇴와 같은 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)과 관련이 있다. 한편, 노화는 심혈관 질환(cardiovascular diseases, CVD)의 위험을 증가시키는 고지혈증(hyperlipidaemia)과 같은 대사 질환(metabolic diseases)과도 관련이 있다. 세계보건기구(WHO)는 전세계적으로 심혈관 질환이 전체 사망의 31%를 차지한다고 추정하며, 심혈관계 합병증을 이환율과 사망률(morbidity and mortality)의 주요 원인으로 간주되어지고 있다. 그러므로 고지혈증이 있는 노령인구에 도움을 줄수 있도록 자연 및 식이 전략을 모색해야 한다. 노화는 신체적 능력에도 영향을 미치며, 우리는 내구성 능력의 양상에서 측정을 할 수 있다. 유기체는 노화중에 세포 및 분자 변화를 경험할 수 도 있으며, 나이는 개개인의 전반적인 능력등을 변화시킨다. 예를 들어, 근력운동을 수행 할수 있는 능력은 나이가 들어가면서 악화된다. 이러한 현상은 복잡한 움직임을 관장하는 제어 메커니즘(control mechanisms)의 고장 때문일 수도 있다. 더욱이, 세포호흡(cellular respiration)을 통해 생성된 세포손상 반응성 분자(cell-damageing reactive molecules)들의 축적 또한 노화로 이어질 수 있다. 이러한 분자들은 반응하여 단백질 및 다른 세포 분자들을 산화시킬 수 있다. 노화는 또한 알츠하이머 병과 같은 다양한 뇌 퇴행성 질환(brain degenerative disorders) 발현에 주요 원인이 된다.
텔로미어 길이(Telomere length)는 종종 노화와 연령 관련 이환율의 생체 지표로 간주되어진다. 텔로미어들은 각 세포 분열에 따라 감소하는 진핵세포의 염색체(eukaryotic chromosomes) 끝쪽에 있는 핵 단백질 복합체(nucleoprotein complex)이다. 텔로미어 길이는 임계길이에 도달할때 까지 세포분열(cell division)과 함께 단축되며 세포 노화(cell senescence)를 시작한다.
연령주의(Ageism)는 초기 성인기에 비해 신체가 제 기능을 할 수 없을 때 신체적 및 정신적 기능등을 악화시키고 전반적인 건강에 영향을 미친다. 예를 들어, 특정 호르몬을 생성하는 땀샘(glands)이 최적의 수준(optimum levels)으로 기능하지 못할 때 호르몬 수치(hormone levels)는 떨어지고 생화학적 과정(biochemical processes)을 수행하는 장기의 능력(organs' ability)에 영향을 미친다. 보다 구체적인 예로서, 여성은 폐경기(menopause) 동안 성 호르몬(sex hormones) 수치의 급격한 저하로 인해 자궁(uterus)과 난소(ovaries)가 수축되고 배란(ovulation)이 멈추게 되며 이 때 생식능력을 잃게 된다. 게다가, 고령인구는 근육손실과 칼슘손실(muscle loss and calcium loss)로 인하여 청력 상실(hearing loss), 시력장애(vision difficulties), 수면장애(sleep disturbance), 자제력(continence) 그리고 신체 체형 및 크기의 변화로부터 고통받는다. 주름(wrinkles), 검버섯(age spots) 및 피부건조와 같은 피부 안색(skin complexion)의 악화는 노화 및 호르몬 변화로 인해 발생할 수 있다.
살아있는 유기체(living organism)의 생화학적 과정(Biochemical processes) 및 신체 대사(body metabolism)는 연령요소(age factor)에 상당한 영향을 받는다. 생화학적 과정 및 대사는 아데노신 모노 포스페이트 활성화 단백질 키나아제 adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)에 의해 조절될 수 있다. AMPK는 동화와 이화 경로(anabolic and catabolic pathways)를 조절하는 세포내 에너지 센서이며, 특히 세포 에너지 항상성(cellular energy homeostasis)의 주조절자의 역할을 수행한다. 특히, AMPK가 낮은 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)을 감지하게 되면 신호경로가 활성화되며, AMPK는 지방산 산화 및 자식작용(fatty acid oxidation and autophagy)과 같은 다양한 세포 활동들에 대하여 더 많은 ATP를 생산하도록 이화경로를 촉진시킨다. 반면, 이러한 과정에 직접적으로 관련된 다수의 효소의 직접적인 인산화(phosphorylation)와 전사인자, 공활성화제, 그리고 공동억제자의 인산화를 통한 대사의 전사 조절을 통해 포도당 생성(gluconeogenesis), 지질 및 단백질 합성(lipid and protein synthesis)과 같은 ATP를 소모하는 생합성 과정을 부정적으로 조절한다. 그러므로 AMPK는 ATP 수치를 조절하여 신체기능이 최적의 단계로 유지될 수 있도록 하며 신체의 대사 및 노화를 제어하는 생물학적 스위치이다. 최근에는, 인산화를 통한 AMPK의 활성화는 대식세포(macrophages)의 활성화를 통해 인플루엔자 바이러스 감염(reducing influenza viral infections) 감소에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 바이러스 공격시 면역 조절 기능의 중요성을 나타내고 있다.
고지혈증(Hyperlipidemia)은 분리된 콜레스테롤(cholesterol)의 상승, 분리된 TG의 상승 및 두 개 모두의 상승으로 크게 분류되어질 수 있다. 혈중 콜레스테롤 및 중성지방(triglycerides) 수치 증가를 나타내는 고지혈증은 심혈관계 질환(cardiovascular diseases) 발병의 위험 요소중 하나이다. 고지혈증은 또한 다른 기관의 항산화 상태(antioxidant status)와 지질 단백질(lipoprotein) 수치에 영향을 미치는 것을 나타냈으며, 이는 차례로 대사 장애를 심화시키고 심혈관계 질환 뿐 아니라 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 위험을 증가시킨다. 프로바이오틱스(Probiotics)는 동물 연구에서 혈중 지질 프로파일(blood lipid profile)을 개선시키는 것으로 나타?다.
장내 미생물의 불균형(Dysbiosis of the gut microbiota)은 질병, 식이요법 그리고 노화로 인해 발생할 수 있다. 노화와 고지방 식단(high-fat diet) 모두는 장내 미생물의 구성을 변화 시키는 주요 요인중 하나로 인식되어 왔다. 장내 미생물은 장을 따라 모든 틈새(all niches)에 서식하는 매우 대사적으로 활동적인 미생물 군집(metabolically active community)이며, 현재 숙주 항상성(host homeostasis)의 중요한 조절자로서 인식되고 있다. 장내 미생물 균형을 변경하면 장내 대사 환경의 변화가 유도되어 결국 우리 자신의 대사에 영향을 미칠 수 있다는 가설이 제기되었다. 최근의 연구에서는 장내 미생물과 대사산물 사이에 숙주 에너지 대사(host energy metabolism), 대사 질환, 면역 그리고 뼈 건강등의 연관성에 대한 늘어나는 인식을 나타내고 있다.
따라서, 프로바이오틱 박테리아는 위에서 언급된 상태들을 완화시키는 해결책을 제공할 필요가 있다.
본 발명에서 해결 되어야 할 과제는 상술한 상태들의 개선에 유용한 신규 조성물 및 치료법을 안전하고 효과적 방식으로 제공하기 위한 것이다.
과제의 해결 수단은 락토바실러스 플란타룸 DR7로도 언급되는 수탁번호 CGMCC 15535로 기탁된 프로바이오틱 박테리아 균주의 제공을 기반으로 한다. 본 발명자들은 상기 균주가 특히 후술할 상이한 상태들과 질병들의 개선에 있어서 유용한 생체 기능성과 연관을 가진다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 첫번째 양상은 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물에 관한 것으로, 여기서 균주는 중국 미생물자원은행(CGMCC)에 수탁번호 CGMCC 15535로 기탁되었고, 전체 게놈 서열은 유전자은행(GenBank)에 수탁번호 CP031318로 기탁되었으며, 여기서 상기 대사산물은 2-히드록시이소카프로산(2-hydroxyisocapric acid)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic acid)을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 치료 또는 의약품으로 사용하기 위한 락토바실러스 플란타룸 DR7 또은 이의 대사산물과 연관이 있다. 이러한 양상은 락토바실러스 플란타룸 DR7 또은 이의 대사산물의 유효량을 필요에 따라 투여함으로써 프로바이오틱 치료의 방법으로 선택적으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 '프로바이오틱'의 용어는 적정량을 투여했을때, 숙주(host)에게 건강상의 이점을 부여하는 살아있는 미생물을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양상은 항염증(anti-inflammatory) 및 면역조절 보호(immune modulatory protection)에 작용하여 상기도 감염의 치료 및 예방에 사용하기 위한 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 예를 들어, 세로토닌과 토파민의 경로(serotonin and dopamine pathway)를 향상시켜 스트레스, 불안, 기억력, 인지 기능장애의 치료및 예방에 사용하기 위한 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)의 치료및 예방에 사용하기 위한 균주락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상으로, 본 발명은 노화에 맞서 에너지 대사(energy metabolisms) 향상과 텔로미어 단축(telomere shortening)의 예방을 통한 노화 지연에 사용하기 위한 균주락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 중성지방(triglycerides) 수치, 염증(inflammation), 지질 축적(accumulation of lipids)의 증가를 방지함으로써 고지혈증(hyperlipidaemia) 및 간 지질 축적(hepatic lipid accumulation)의 치료 및 예방에 사용하기 위한 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 심혈관계 질환의 치료와 예방, 및 콜레스테롤 감소에 사용하기 위한 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 장내 세균 집단(gut bacterial populations)과 대사산물 농도(metabolites concentrations)의 불균형에 대한 장 조절(gut modulation)을 위한 프로바이틱으로서의 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물의 사용에 관한 것이다.
락토바실러스 플란타룸 DR7은 상술한 의학적 활용 및 모든 장점들을 가지고 있다는 점을 주목해야 하는 반면, 다른 경우에, 각각의 의학적 활용마다 균주를 사용하여야 한다.
본 발명의 또 다른 양상은 균주 락토바실러스 플란타룸 DR7을 구성하는 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 균주는 동결 건조(freeze-dried)되고 조성물에서 104 -1012 cfu/g의 양을 가지며 또한 균주의 대사산물을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기에서 상기 대사산물은 2-히드록시이소카프로산(2-hydroxyisocapric acid)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic acid)을 포함한다.
위에서 언급된 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물의 모든 의학적 용도는 식품보조제(food supplement), 의약품(medicament), 유아용 분유( infant formula), 식용 제품(edible product) 또는 위에서 언급된 증상들의 치료 및 예방을 위한 식료품(food product)을 생산하기 위해 균주 또는 이의 대사산물을 사용하는 것으로 선택적으로 제공될 수 있다. 또한, 이는 상기 언급된 증상들의 치료 및 예방을 위한 방법으로도 나타나며, 본 발명의 균주 또는 이의 대사산물의 유효량을 필요로 하는 실험대상에 투여하는 것을 포함한다. 실험대상은 주로 포유 동물(mammal)이고 특히, 인간(human)이다.
본 명세서에서 사용되는 균주를 언급할 때, 용어 "유효량(effective amount)"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 조성물 내 균주가 긍정적인 방향으로 치료할 상태를 수정하기에 충분히 많은 양이지만 그러나 심각한 부작용(적절한 위험/이익 비율)을 회피하기에 충분히 낮은 양을 의미한다.
본 발명의 청구항에서 사용되는 용어들 및 양상들은 본 명에서에서 넓고 일반적인 의미로 이해될 것이다. 본 명세서에서, 락토바실러스 플란타룸 DR7 균주는 "DR7"으로 간략히 언급될 것이다.
본 발명의 이해를 용이하기 위한 목적으로, 후술할 명세서와의 관계를 고려할 때 본 발명, 구조와 작용 및 많은 이점들이 쉽게 이해될 수 있도록 본 발명의 양상으로부터의 구체적인 실시예들 및 첨부 도면들이 도시된다.
도 1은 12주 간의 프로바이오틱 락토바실러스 플란타룸 균주 DR7(회색) 또는 위약(흑색)의 투여기간 중 0주차와 비교하여 (a) 청년층(30세 미만; n=59), (b) 성인층(30~59세; n=52), 그리고 (c) 모든 피험자(n=111), (여기서, *p<0.05 and **p<0.10)에서 상기도 감염 일수 및 발생 횟수의 변화를 도표로 나타내고 있다.
도 2는 12주 간의 프로바이오틱락토바실러스 플란타룸 균주 DR7(회색) 또는 위약(흑색) 투여기간 동안의 (a) 청년층(30세 미만; n=59), (b) 성인층(30~59세; n=52), 그리고 (c) 모든 피험자(n=111)에서 혈장 사이토 카인(pg/mL; 인터루킨-1
Figure pct00001
, -4, -10, 종양괴사인자 (TNF)-α, 인터페론 (IFN)-γ) 수치의 변화를 나타내고 있다.
도 3은 12주 간의 프로바이오틱락토바실러스 플란타룸 균주 DR7(회색) 또는 위약(흑색) 투여기간 동안의 (a), (d) 청년층(30세 미만; n=59), (b), (e) 성인층(30~59세; n=52), 그리고 (c), (f) 모든 피실험자(n=111)에서 철환원항산화능(FRAP), 혈장내 티오바르비투르산, 적혈구막, 용혈물의 수치 변화를 나타내고 있다.
도 4는 12주 간의 프로바이오틱락토바실러스 플란타룸 DR7(회색) 또는 위약(흑색) 투여기간 동안의 (a), (d) 청년층(30세 미만; n=59), (b), (e) 성인층(30~59세; n=52), 그리고 (c), (f) 모든 피실험자(n=111)에서 T-세포(CD4, CDS, CD44, CD117)와 NK-세포(CD34, CD56, CD94, NKp46, NKp30)에 대한 혈장 유전자의 상대적인 유전자 발현의 변화를 나타내고 있다.
도 5는 12주 동안의 (A) 인두의, (B) 일반적인 독감 증상에 대한 비강증상, (C) 혈장 IFN-γ, (D) IL-10, (E) 혈장 티오바르비투르산에 대한 IL-4, (F) CD117에 대한 유전자의 혈장 발현 (G) 모든 피실험자들의 CD44에 대한 CD8의 변화를 나타내는 스피어만(Speraman) 상관분석 도표이다(total n=109; Lactobacillus plantarum DR7, n=56; placebo, n =53).
도 6은 12주 간의 투약 후 쥐들의 (A) 모리스 수중 미로 실험(Morris water maze), (B) 오픈 필드 실험(Open field test), (C) T-미로 실험(Open field test)을 통한 행동 평가. Young(정상식단), Young HFD(고지방 식단을 섭취한 어린쥐), Old(600mg/kg/day의 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Old HFD(고지방 식단과 락토바실러스 플란타룸 DR7을 함께 D-갈락토오스 섭취로 노화 유도된 쥐), Old HFD DR7 (락토바실러스 플란타룸 DR7을 log10 CPU/day 투여하고 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Old HFD Statin(로바스타틴 2mg/kg/day를 투여하고 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다. 다른날의 동일한 치료 그룹의 평균이 크게 다르다(P<0.05).
도 7은 0주차와 비교하여 청년층(30세 미만), 성인층(30세 이상), 그리고 모든 피험자들에게서 (A) PSS-10, (B) 스트레스, (C) 불안, (D) 우울증, (E) DASS-42의 전체점의 점수 변화에 대한 12주간의 락토바실러스 플란타룸 DR7(회색 막대) 또는 위약(흰색 막대) 투여의 효과. DASS-42에 대한 반복측정 분산분석; 청년층의 스트레스: W: P=0.130; T: P=0.016, TXW: P=0.628; 모든피실험자들의 스트레스: W: P=0.003; T: P=0.036, TXW: P=0.593; 청년층의 불안: W: P=0.040; T: P=0.0016, TXW: P=0.291; 성인층의 불안: W : P=0.127; T: P=0.045, TXW: P=0.433; 모든 피실험자들의 불안: W : P=0.007; T: P=0.002, TXW : P=0.170; 청년층의 전체점: W: P=0.061; T : P=0.044, TXW: P=0.484; 모든 피실험자들의 전체점: W: P=0.005; T: P=0.028, TXW : P=0.448. P의 수치는 개별시간지점에 치료그룹 간의 차이를 나타냄. 반복측정 분산분석은 W: 주차의 효과; T: DR7과 위약 치료 그룹의 효과; TXW: 주차와 치료사이의 효과의 통계적 유의성을 제공함. 결과는 평균; 오차 막대 (SEM); n=l 11 (DR7 n=56, placebo n=55)으로서 표현되었다.
도 8a 및 8b는 12주차에 스트레스 받는 성인층을 대상으로 컴퓨터화된 CBB(CogState Brief Battery) 실험을 통한 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 위약 투여에 따른 인지 및 기억 변수 평가(n=111; DR7 n=56, placebo n=55)이다.
도 9는 12주 간의 투여후 (A) 감마-아미노뷰티르산 알파 서브유닛(Gamma- aminobutyric acid alpha subu, GABA A2), (B) 티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase, TH), (C) 도파민 베타 수산화효소(Dopamine beta-hydroxylase, DBH), (D) 인돌아민 이수산화효소(Indoleamine dioxygenase, IDO), (E) 트립토판 수산화 효소 1(Tryptophan Hydroxylase 1, TPH1)의 상대적인 해마 신경전달물질의 유전자 발현, (F) TPH의 작용을 통한 세로토닌 또는 IDO의 작용을 통한 키누레닌으로 트립토판 대사의 해마경로. Young(정상식단), Young HFD(고지방 식단을 섭취한 어린쥐), Old(600mg/kg/day의 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Old HFD(고지방 식단과 락토바실러스 플란타룸 DR7을 함께 D-갈락토오스 섭취로 노화 유도된 쥐), Old HFD DR7(락토바실러스 플란타룸 DR7을 log10 CPU/day 투여하고 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Old HFD Statin(로바스타틴 2mg/kg/day를 투여하고 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 10은 12주 간 락토바실러스 플란타룸 DR7 투여가 (A) 청년층(30세 미만), (B) 일반 성인층(30세 이상), (C) 모든 피실험자들에게 도파민 수산화 효소(DBH), 티로신 수산화효소(TH), 트립토판 수산화 효소-1(TPH1), 트립토판 수산화 효소-2(TPH2), 5-하이드록시트립타민 수용체-6(5-HT6), 인돌아민 2,3-이수산화효소(IDO), 트립토판 2,3-이수산화효소(TDO), 글루탐산 탈수소효소(GAD65), 감마 아미노부티르산 A-수용체 α-5(GABRA5), 뇌유래신경 성장인자(BDNF), cAMP 반응 요소 결합에 대한 혈액 mRNA관련 유전자 발현에 미치는 영향. P의 수치는 개별시간지점에서 치료그룹 간의 차이를 나타냄. 결과는 평균; 오차막대(SEM); n=111 (DR7=56, placebo=55)으로서 표현되었다.
도 11a 및 11b는 (A)-(F)의 현미경 이미지(microscopic images)를 나타내고 있다. (A) 250배의 배율로 촬영된 야생형 노랑 초파리(Oregon-R)과 Glass multimer reporter-GAL4(GMR-Gal4)의 교배를 통해 생산된 GMR-OreR의 눈, (B) 350배의 배율로 촬영된 잘 형성된 육각형 낱눈(hexagonal ommatidia)과 곧은 강모(straight bristles). 250배의 배율로 촬영된 Glass multimer reporter-GAL4 (GMR-GAL4)와 UAS-Aβ42의 교배를 통한 야생형 인간 Aβ42(wild-type human Aβ42)의 전형적 발현(exemplified expression)에 의해 생성된 이식 유전자를 가진 노랑 초파리 Aβ42 (GMR-Aβ42)의(C) 구멍을 가진 거친 눈의 형태(rough eye phenotype), (D) 육각구조를 잃어버린 낱눈(Ommatidia)의 변형 그리고 부서진 강모 (broken bristle), 여기서 pan-retinal GMR-GAL4 driver은 눈의 퇴화를 일으키기도 한다. Glass multimer reporter-GAL4 (GMR-GAL4)과 UAS-Aβ42의 교배를 통해 생성된 이식 유전자를 가진 노랑 초파리 Aβ42 (GMR-Aβ42)의 (E) 250배의 배율로 잘 형성된 눈 모양, (F) 350배의 배율의 육각 구조를 지닌 낱눈(hexagonal ommatidia)과 적게 손상된 강모(less damaged bristles), 여기서 GMR-Aβ42은 락토바실러스 플란타룸 균주 DR7(Lactobacillus plantarum strain DR7)에 100 μL 1 x 10 11 CFU/mL의 용량으로 희석되었다. (G) 각 눈의 표현형 점수를 산출하는 Flynotyper라는 소프트웨어를 이용하여 초파리 눈의 형태학적 결함의 정량화.
도 12는 12주 간의 치료 후 쥐들의 해마 (hippocampus)에서 (A) 인터루킨-1-β (IL-1b), (B) 인터페론- γ (IFN- γ), (C) 종양괴사인자-α (TNF- α)의 해마 사이토카인 (Hippocampal cytokines) 수치. Young (정상식단), Young HFD (고지방 식단을 섭취한 어린쥐), Old (600mg/kg/day의 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Old HFD (고지방 식단과 락토바실러스 플란타룸 DR7을 함께 D-갈락토오스 섭취로 노화 유도된 쥐), Old HFD DR7 (락토바실러스 플란타룸 DR7을 log10 CPU/day 투여하고 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Old HFD Statin (로바스타틴 2mg/kg/day를 투여하고 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 13은 12주 후의 치료후 (A) 종양 단백질 53 (Tumor protein 53, P53) (B) 종양 단백질 19 (Tumor protein 19, P19) (C) 거대 B세포 림프종 (B-cell lymphoma-extra-large, BCL-XL), (D) BCL2 연관 X (BCL2 Associated X, BAX), (E) 카스파제 9 (Caspese 9, CAS-9) 의 상대적인 해마의 세포사멸 유전자 발현. (F) P53과 P19경로의 도식적인 개요. (G) BAX, BCL-XL, CAS-9의 상호작용 경로를 통한 세포사멸 활성인자. Young (정상식단), Young HFD (고지방 식단을 섭취한 어린쥐), Old (600mg/kg/day의 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Old HFD (고지방 식단과 락토바실러스 플란타룸 DR7을 함께 D-갈락토오스 섭취로 노화 유도된 쥐), Old HFD DR7 (락토바실러스 플란타룸 DR7을 log10 CPU/day 투여하고 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Old HFD Statin (로바스타틴 2mg/kg/day를 투여하고 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 14는 위약대조군(짙은회색 막대) 과 비교하여 12주동안의 락토바실러스 플란타룸 DR7(옅은 회색막대) 투여후 (A) 청년층(30세 미만), (B) 일반 성인층 (30세 이상), (C) 모든 피실험자들의 코르티솔(Cortisol)과 사이토카인(Cytokines) [인터페론-γ(IPN-γ); 종양괴사인자-α(TNF-α); 인터루킨-1β(IL-1β); 인터루킨-10(IL-10); 인터루킨-4(IL-4)] 의 혈장내 수치 변화. 전체 혈액검사를 통해 얻은 전체 백혈구 수를 사용하여 사이토카인의 농도를 표준화함. 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=111(DR7=56, placebo=55) 으로서 표현되었다.
도 15는 (A) DBEM, MRS 배지의 지질 분획, 락토바실러스 플란타룸 DR7 무세포 상층액의 지질 분획, MRS 배지 (a blank MRS broth) 의 단백질 분획, 락토바실러스 플란타룸 DR7 무세포 상층액의 단백질 분획, MRS배지의 다당류 분획, 락토바실러스 플란타룸 DR7 무세포 상층액의 다당류 분획에서 5' AMPK의 인산화도표. (B) MRS 배지, 상업용 AMPK 활성제, 5-아미노이미다졸-4-카복사마이드 리보뉴클레오타이드 (AICAR), 락토바실러스 플란타룸 DR7 무세포 상층액, 상업용 AMPK 억제제와 화합물 C가 첨가된 락토바실러스 플란타룸 DR7 무세포 상층액, 화합물 C만 첨가된 락토바실러스 플란타룸 DR7 무세포 상층액, 로바스타틴만 첨가된 락토바실러스 플란타룸 DR7 무세포 상층액을 이용한 AMPK의 상대적 인산화에 대한 도표이다.
도 16은 (a) MRS 배지, (b) 락토바실러스 플란타룸 DR7 무세포 상층액의 색층렬(chromatogram)을 나타내고 있으며, 여기서 2-하이드록시이소카프로산(2-hydroxyiso-caproic acid)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic-acid)의 최대 강도 (intensity peaks)는 HICA 및 PLA로 각각 표시되었다.
도 17은 12주 간의 치료 후 수집된 쥐의 혈액에서 측정된 텔로미어 길이 (T/S비율). Y (어린쥐 대조군), O (D-갈락토오스 노화 유도를 통한 노화 대조군), O+S (로바스타틴 2mg/kg/day 투여하면서, D-갈락토스 섭취로 노화유도), O+DR7(락토바실러스 플란타룸 DR7 10 log CPU/day 투여하면서, D-갈락토스 섭취로 노화유도). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 18은 12주 간의 투여후 쥐들의 운동부하검사. Young (대조군), Aged (D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Aged-statin (로바스타틴 2mg/kg/day 투여하면서, D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐), Aged-DR7 (락토바실러스 플란타룸 DR7 10 log CPU/day 투여하면서, D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 19a, 19b 및 19c는 (A) 37℃에서 24시간동안 발효했을 때, 0.3% (w/v) 황소담즙 (ox-bile)과 60 μg/mL의 콜레스테롤을 함유한 MRS 배지내 락토바실리 (lactobacilli) (1% v/v 접종원)의 다른 균주에 의한 콜레스테롤 동화능 (assimilation of cholesterol). 락도바실리(5% v/v) 의 다른 균주로부터의 무세포 상층액 (CFS)의 존재하에 37℃에서 24시간 배양했을때 (B) 장내세포(intestinal cells, HT-29)의 콜레스테롤 동화능, (C) 간세포(hepatic cells, HepG2)의 콜레스테롤 동화능. 사용된 무혈청 DMEM은 1mM의 콜레스테롤(cholesterol) 과 0.03% 황소담즙을 함유하고 있다. Blank MRS: 무혈청 DMEM;30242 에서 50%의 최종농도(v/v)로 살균된 MRS 배지. 락토바실러스 플란타룸 DR7의 무세포 상층액의 다양한 농도 존재하에 5% 이산화탄소 (CO2) 농도로 37℃ 에서 24시간 배양했을때 (D) 간세포 (hepatic cell, HepG2)에서 콜레스테롤의 세포내 축적(intracellular accumulation), (E) 간세포 (hepatic cell, HepG2)에서 HMG-CoA 환원효소(HMG-CoA reductase, HMGCR)의 mRNA 유전자 발현. Non-treated: H2pG가 무혈청 DMEM에서 어떠한 처리도 없이 배양됨. blank MRS: H2pG가 무혈청 DMEM에서50%의 최종 농도 (v/v)로 살균된 MRS 배지에서 배양됨. (F) 5%의 이산화탄소(CO2)에서 37℃에서 3시간동안 다양한 처리의 존재하에 간세포내의 HMG-CoA 환원효소(HMG-CoA reductase, HMGCR)의 mRNA 유전자 발현. AICAR(AMPK활성화제)와 화합물C(AMPK 억제제)는 각각 양성 그리고 음성 대조군으로 사용되었다. Non-treated: H2pG가 무혈청 DMEM에서 어떠한 처리도 없이 배양됨. blank MRS: H2pG가 무혈청 DMEM에서 30%의 최종 농도 (v/v)로 살균된 MRS 배지에서 배양됨. CFS-DR7: H2pG가 무혈청 DMEM에서 30%의 최종 농도 (v/v)로 락토바실러스 플란타룸 DR7의 CFS에서 배양됨. (G) 5%의 이산화탄소 (CO2)에서 37℃에서 3시간동안 다양한 처리와 함께 배양했을때 간세포의 AMPK의 상대적 유전자 발현 (relative gene expression). AICAR (AMPK활성화제)와 화합물C (AMPK 억제제)는 각각 양성 그리고 음성 대조군으로 사용되었다. Non-treated: H2pG가 무혈청 DMEM에서 어떠한 처리도 없이 배양됨. blank MRS: H2pG가 무혈청 DMEM에서 30%의 최종 농도 (v/v)로 살균된 MRS 배지에서 배양됨. CFS-DR7: H2pG가 무혈청 DMEM에서 30%의 최종 농도(v/v)로 락토바실러스 플란타룸 DR7의 CFS에서 배양됨. (H) 5%의 이산화탄소 (CO2)에서 37℃에서 3시간동안 다양한 처리와 함께 배양했을때 간세포의 AMPK의 상대적 인산화(relative phosphorylation). AICAR(AMPK활성화제)와 화합물C(AMPK 억제제)는 각각 양성 그리고 음성 대조군으로 사용되었다. Non-treated: H2pG가 무혈청 DMEM에서 어떠한 처리도 없이 배양됨. blank MRS: H2pG가 무혈청 DMEM에서 30%의 최종 농도(v/v)로 살균된 MRS 배지에서 배양됨. CFS-DR7: H2pG가 무혈청 DMEM에서 30%의 최종 농도 (v/v)로 락토바실러스 플란타룸 DR7의 CFS에서 배양됨. 결과는 평균; 오차막 (SEM); n=3 으로서 표현되었다. 일원배치 분산분석(oneway ANOVA)과 함께 Duncan의 사후검정 비교 (Duncan's post hoc comparisons)를 이용하여 통계분석(statistical analysis)을 수행하였다. 다른 글자들로 표기된 평균값들은 상당히 다르다 (p<0.05). (I) 12주 간의 투여후 D-갈락토오스의 600mg/kg/day 섭취가 유도된 노화된 쥐들의 혈청 중성지방 (Serum triglyceride, TG). ND (정상식단), HFD (고지방식단), HFD-statin (2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 고지방 식단), HFD-DR7 (1010 CFU/day의락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 고지방 식단). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 20은 12주 간의 투여후 D-갈락토오스의 600mg/kg/day 섭취가 유도된 노화된 쥐들의 간내 (A) SCD1, (B) IL-6, (C) ABCG5, (D) ABCG8의 상대적 유전자 발현. ND (정상식단), HFD (고지방식단), HFD-statin (2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 고지방 식단), HFD-DR7 (1010 CFU/day의락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 고지방 식단). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 21은 12주 간의 투여후 D-갈락토오스의 600mg/kg/day 섭취가 유도된 노화된 쥐들의 간내 (A) SR-B1, (B) LDL-R, (C) ABCA1, (D) ApoA1의 상대적 유전자 발현. ND (정상식단), HFD (고지방식단), HFD-statin (2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 고지방 식단), HFD-DR7 (1010 CFU/day의락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 고지방 식단). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 22는 12주 간의 투여후 D-갈락토오스의 600mg/kg/day 섭취가 유도된 노화된 쥐들의 간내 (A) AMPKα1, (B) AMPKα2의 상대적 유전자 발현. ND (정상식단), HFD (고지방식단), HFD-statin (2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 고지방 식단), HFD-DR7 (1010 CFU/day의락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 고지방 식단). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 23은 12주 간의 투여후 D-갈락토오스의 600mg/kg/day 섭취가 유도된 노화된 쥐들의 간 내부의 항염증성 사이토카인 IL-4수치 (liver anti-inflammatory cytokine IL-4 level). ND (정상식단), HFD (고지방식단), HFD-statin (2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 고지방 식단), HFD-DR7 (1010 CFU/day의락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 고지방 식단). 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서표현 되었다.
도 24는 12주 간의 투여후 D-갈락토오스의 600mg/kg/day 섭취가 유도된 노화된 쥐들의 간부위의 H&E 염색 (hematoxylin and eosin (H&E) staining). (a) ND (정상식단), (b) HFD (고지방식단), (c) HFD-statin (2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 고지방 식단), (d) HFD-DR7 (1010 CFU/day의락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 고지방 식단)이다.
도 25는 세개의 주요 파일론(three major phyla)의 상대 풍부도(relative abundance); 12주간의 투여후 쥐 배설물 (rats fecal)에서 A) 방선균 (actinobacteria), B) 의간균 (Bacteroidetes), C) 후벽균 (firmicutes), D) 의간균에 대한 후벽균의 비율 (ratio of firmicutes over Bacteroidetes). Young-ND: 정상식단 섭취 어린쥐, young-RFD: 고지방식단 섭취 노화쥐, aged­ ND: 정상식단에 D-갈락토오스 섭취 유도된 노화쥐, aged-HFD: 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취 유도된 노화쥐, aged-HFD-statin: 2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 함께 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취 유도된 노화쥐, aged-HFD-DR7: 1010 CPU/day의 락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 함께 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취 유도된 노화쥐. 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 26은 배설물 아세테이트(fecal acetate)의 절대농도(absolute concentration) 분석. Young-ND: 정상식단 섭취 어린쥐, young-RFD: 고지방식단 섭취 노화쥐, aged­ND: 정상식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD: 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD-statin: 2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 함께 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD-DR7: 1010 CPU/day의 락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 함께 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐. 결과는 평균; 오차막대 (SEM); n=6 으로서 표현되었다.
도 27은 12주 간의 투여후 쥐 배설물 샘플에서 상위 70개의 수용성 대사산물 (water-soluble metabolites)의 분석. 히트맵은 -2와 2 사이의 상대적인 값으로 정규화 되었다. 빨간색은 높은 농도 (higher concentration)를 나타내고, 파란색은 낮은 농도 (lower concentration)를 나타낸다. Young-ND: 정상식단 섭취 어린쥐, young-RFD: 고지방식단 섭취 노화쥐, aged­ND: 정상식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD: 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD-statin: 2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 함께 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD-DR7: 1010 CPU/day의 락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 함께 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐이다.
도 28은 12주 간의 투여후 쥐 배설물에서 수용성 대사산물(water-soluble metabolites) 의 희박부분최소제곱판별분석(sparse partial least squares discriminant analysis, sPLS-DA) 도표. Young-ND: 정상식단 섭취 어린쥐, aged­ND: 정상식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD: 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD-statin: 2mg/kg/day의 로바스타틴 투여와 함께 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐, aged-HFD-DR7: 1010 CPU/day의 락토바실러스 플란타룸 DR7 투여와 함께 고지방식단에 D-갈락토오스 섭취로 노화가 유도된 쥐. 600mg/kg/day의 D-갈락토오스는 피하주사 (subcutaneous injection)를 통해 투여되었다. 정상식단(ND): 표준 식단(standard chow diet), 고지방식단(HFD): 25% 지방을 함유한 표준 식사식단이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
락토바실러스 플란타룸 DR7은 페낭의 신선한 우유로부터 추출되었고, 말레이시아의 Clinical Nutrition Intl (M) Sdn. Bhd.사의 제공으로 얻게 되었다. 이 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 확인되었으며, 중국 북경시 서북천로 1번지, 중국 과학학술원 미생물 연구소에 위치한 중국 미생물자원은행(CGMCC)에 기탁되어 있다. 기탁된 균주(deposited strain)는 수탁번호 CGMCC 15535를 부여받았고, 2018년 4월 2일에 기탁되었다. 또한, 동일한 신청인인 Clinical Nutrition Intl (M) Sdn. Bhd.사와 Lii Run Sdn. Bhd.사에 의해 기탁되어졌다. 기탁된 균주는 독자 생존 가능하고 (viable), 기탁과 관련된 모든 기능들은 유지된다.
종들의 식별은 16S rRNA 유전자 염기서열분석(gene sequencing)을 통해 확인되었다.
16S rRNA에 대한 정보는 다음과 같고 염기서열은 SEQ ID NO: 1이다:
콘티그(Contig) 25 (1,1475)
콘티그 길이: 1475 bases
평균길이 / 염기서열(Average Length/Sequence): 875 bases
전체 염기서열 길이(Total Sequence Length): 1751 bases
상위가닥(Top Strand) : 1개 염기서열
하위가닥(Bottom Strand) : 1개 염기서열
전체계 : 2개 염기서열
전체 게놈 서열은 수탁번호 CP031318로 유전자은행(GenBank)에 2018년 9월 26일에 기탁되었다(개정내역액세스: CP031318.1 GI: 1480141094 2018년 9월 26일 오전 7:25).
기탁된 균주를 초기 재료로 사용함으로써, 당업자는 본 명세서에서 기술된 본 발명의 균주의 관련 특징 및 이점을 유지하거나 향상시키는 추가 변이체 또는 이의 돌연변이를 돌연변이 유발 또는 재분리 기술을 통해 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 밝혀진 균주의 변형에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "변형(variant)" 또는 "돌연변이(mutant)"라는 용어는 기탁된 균주로 부터 획득된 자연발생적 또는 특별히 개발된 균주를 지칭하며 주로 돌연변이(mutation)에 의해 기탁된 균주의 기능을 유지시킨다. 이러한 기능들은 실시예 부분(EXAMPLES section)에 기재된 방법들 사용하여 당업자에 의해 평가될 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에서 고려되는 "변이" 균주의 16S rRNA 유전자 또는 전체 게놈 염기서열은 16S rRNA 염기서열 SEQ ID NO: 1 또는 본 명세서에서 밝혀진 균주의 CP031318 게놈 염기서열과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 염기서열 동일성(sequence identity)을 공유한다.
하나의 특정 구체예에서, 돌연변이는 재조합 DNA기술(recombinant DNA technology)을 사용하여 획득된다. 다른 실시예에서는, 돌연변이는 무작위 돌연변이 유발(random mutagenesis)에 의하여 획득된다. 그러므로, 본 발명의 다른 양상은 DR7 균주(DR7 strain)의 돌연변이를 획득하는 방법과 관련이 있으며, 여기서 획득방법은 기탁된 균주를 초기 재료(starting material)로 사용하거나 돌연변이 유발을 적용하는 것을 포함하며, 획득된 변이체 또는 돌연변이(variant or mutant)는 기탁된 균주의 생물학적 기능을 유지시키거나 향상시킨다.
특정 구체예에서, 균주는 인공배지(artificial medium)에서 발효되고 발효처리 후 후처리(post-treatment)에 보내져서 박테리아 세포를 수득하고 생성된 박테리아세포는 액체배지(liquid medium) 또는 고체배지(solid form) 내에 있다. 특히, 후처리는 액상배지(liquid medium)에서 건조(drying), 동결(freezing), 동결건조(freeze-drying), 유동층 건조(fluid bed-drying), 분무건조(spray-drying) 및 냉동 (refrigerating)으로 구성된 군(group)으로 부터 선택되고, 더 바람직하게는 동결건조(freeze-drying)가 선택된다.
상기 균주는 적절한 인공배지(artificial medium)내에서 적절한 조건하에 박테리아 배양(또는 발효)를 통해 생산되었다. 미생물에 대한 "인공배지(artificial medium)"라는 표현은 자연물질(natural substances)을 포함하는 배지(medium) 그리고 선택적으로는 혈청(serums)의 일부기능을 발현하는 폴리비닐알코오올 중합체 (polymer polyvinyl alcohol)와 같은 합성화합물질(synthetic chemicals)을 의미한다. 일반적으로 적절한 인공배지는 박테리아 성장에 필요로 되는 탄소원 (예: 포도당), 질소원 (예: 아미노산 및 단백질), 물, 염등을 포함하는 요소들을 내포하고 있는 영양배지(nutrient broths)를 의미한다. 성장배지(growth media)는 액체형태이거나 또는 고채배지를 얻기 위해 종종 한천(agar)또는 다른 겔화제(gelling agent)를 혼합하기도 한다. 균주는 단독으로(alone) 배양하여 순수배양(pure culture)을 형성하거나 또는 다양한 종류의 박테리아를 따로 배양한 다음 원하는 비율(desired proportions)로 조합하여 다른미생물과 함께 혼합 배양되기도 한다. 배양후, 최종 제형(the final formulation)에 따라 정제된 박테리아(purified bacteria)로 사용되거나 또는 선택적으로, 적절한 후처리후에 박테리아 배양(bacterial culture) 또는 세포 현탁액(cell suspension)으로 사용 될수 있다. 본 상세한 설명에서, 용어 "바이오매스(biomass)"는 배양(또는 배양에 대한 동의어로서 발효)를 통해 수득된 박테리아 균주 배양(bacterial strain culture)을 의미한다.
용어 "후처리(post-treatment)"는 본 발명의 내용에서 저장가능한 박테리아 세포(storable bacterial cells)를 수득하는 목적으로 바이오매스에 수행되는 임의의 처리(any processing)를 의미한다. 후처리의 목적은 바이오매스에서 세포의 대사활성(metabolic activity)을 감소시켜 세포손상반응 속도(rate of cellular deleterious reactions)를 늦추는 것이다. 후처리의 결과로서, 박테리아 세포는 고체 및 액체 형태를 포함한다. 고체형태의 경우, 저장된 박테리아 세포는 분말 또는 과립(powder or granules)일 수 있다. 어떤 경우든, 박테리아 세포(bacterial cells)를 포함하는 고체 및 액체 형태의 경우 자연에 존재하지 않고, 인공적인 후처리 과정의 결과이기 때문에 자연발생적이지 않다. 특정 실시예에서는, 후처리 과정은 하나 또는 그 이상의 후처리제(post-treatment agent)의 사용을 요구하기도 한다. 본 발명의 내용에서, "후처리제(post-treatment agent)"라는 표현은 본 명세서에 기재된 후처리과정을 수행하는데 사용된 화합물(compound)을 지칭한다. 후처리제 중에는 탈수제(dehydrating agents), 정균작용제(bacteriostatic agents), 동결 방지제(cryoprotective agents), 불활성 충전제(또는 동결보호제라고 알려진), 담체물질(또는 심물질이라고 알려진) 등이 제약없이 단독 또는 조합된 것을 포함한다.
박테리아 세포의 대사 활성(metabolic activity)을 감소시키는 두가지 접근법이 있는데, 상기 두가지 접근법은 후처리(post-treatment)를 사용하는 것이다. 첫 번째 접근법은 모든 화학반응의 속도(rate of all chemical reactions)를 줄이는 것이며, 이는 냉장고, 기계식 냉동고, 그리고 액체질소 냉동고를 사용하여 냉장 및 냉동(refrigerating or freezing)을 통해 온도를 낮춤으로서 달성 될 수 있다. 선택적으로는, 박테리아 세포의 성장을 억제하는 물질 즉, 정균작용제(약칭: Bastatic)를 추가하여 모든 화학반응의 속도를 감소시킬 수도 있다.
후처리를 사용하는 두 번째 접근법은 동결건조기(lyophilizer)를 사용하여 물의 승화(sublimation of water) 과정을 통해 바이오메스로부터 물을 제거하는 것이다. 바이오메스로 부터 물을 제거하는 적절한 기술들로는 건조(drying), 동결건조(freeze-drying), 분무건조(spray­ drying) 또는 유동층건조(fluid bed-drying)가 있다. 고체형태를 만드는 후처리 과정은 건조, 동결, 동결건조, 유동층건조 또는 분무건조가 있을 수 있다.
감압하에서 승화(sublimation)를 통해 동결괸 박테리아 현탁액에서 물을 제거하는 것은 후처리에서 특히 동결건조(freeze-drying)이다. 이과정은 세 단계(three steps)로 이루어진다. 첫번? 단계에서는 제품을 사전동결(pre-freezing)하여 동결구조(frozen structure)를 형성하고, 두번? 단계에서는 1차 건조(primary drying)를 통해 대부분의 물을 제거하고, 마지막 단계에서 2차 건조(secondary drying)를 통해 결합수(bound water)를 제거한다. 동결건조된 세균(lyophilized bacterial cultures)의 배양의 제조및 분리를 위한 산업공정의 객관적이고 예측되는 가변성(variability)으로 인하여, 동결보호제(lyoprotectant)로 알려진 일정량의 불활성 충전제(inert filler)를 일반적으로 포함시킨다. 그 역할은 제품에서 살아있는 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria)의 함량을 표준화 시키는 것이다. 상업적으로 이용가능한 동결건조 배양물(lyophilized cultures)에서 다음과 같은 불활성 충전제(inert filler)가 사용된다: 수크로스(sucrose), 사카로스(saccharose), 유당(lactose), 트레할로스(trehalose), 포도당(glucose), 엿당(maltose), 말토덱스트린(maltodextrin), 옥수수전분(corn starch), 이눌린(inulin) 및 다른 약제학적으로 허용되는 비흡습 충전제(non­ hygroscopic fillers). 선택적으로, 아스코르브산(ascorbic acid)과 같은 다른 안정화제(stabilizing agents) 또는 동결방지제(freeze-protecting agents)도 동결건조 (freeze­drying)를 위해 쓰이는 점성 페이스트(viscous paste)를 형성하는데 사용된다. 어떠한 경우에서든, 이렇게 획득된 재료는 분말(powder)을 포함하여 적절한 크기로 분쇄 될 수 있다.
락토바실러스 플란타룸 DR7의 의학적 활용
락토바실러스 플란타룸 DR7은 프로바이오틱스로 특히 유용하다는 장점이 있다. 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria)는 적은 독성(lack of toxicity), 생존도(viability), 접착력(adhesion) 그리고 유익한 효능(beneficial effects)과 관련된 여러 요구사항들을 충족시켜야 한다. 각각의 박테리아 균주의 특성은 고유하고 동일한 종의 다른 균주로 추정될 수 없다.
실시예 부분의 실험을 통하여, 락토바실러스 플란타룸 DR7 균주는 건강에 유익한 다음과 같은 효능과 활용을 갖는다는 점을 타당하게 본 명세서에서 입증되었다:
1. 락토바실러스 플란타룸 DR7 균주는 무작위대조, 이중맹검, 위약 대조 연구 (실시예 1 참조) 등에서 보여졌듯이, 면역 및 염증 매개변수(immune and inflammatory parameters)를 강화함으로써 상기도 감염(upper respiratory tract infections)을 개선하였다. 이 연구의 목적은 상기도 감염(URTI)에 대한 락토바실러스 플란타룸 DR7 균주의 효과를 분석하고 면역조절특성(immunomodulatory properties)에 내재되어 있는 가능한 매커니즘을 규명하는 것이다. 12주 동안 9 log cfu/day의 DR7 균주(DR7 strain)를 109명의 성인이 참여한 무작위대조, 이중맹검, 위약 대조 연구를 수행하며 투여 되었다. DR7의 투여는 위약 투여와 비교하여 각각 12주와 4주후 비강 증상(nasal symptoms)의 지속기간(duration)과 상기도감염의 발생 빈도(frequency)를 감소시켰다. DR7의 투여는 중년층(30~60세)의 혈장 전염증성 사이토카인 (IFN-γ, TNF-α)을 억제하는 반면, 청년층 (30세 미만)의 항염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokines)을 증가시키고, 동시에 위약투여와 비교하여 혈장당 산화 및 산화스트레스 수준(plasma per-oxidation and oxidative stress levels)을 감소시켰다. DR7을 투여 받은 청년층은 위약투여와 비교하여 혈장 CD44 와 CD117의 발현이 각각 4.5배와 2.22배 더 높았다. 한편, 중년층은 혈장 CD4 및 CDS의 발현이 위약대조와 비교하여 각각 11.26배와 1.8배 더 낮아져 T세포의 활성화(T-cell activation)가 더 적음을 나타낸다. 대조적으로, DR7을 투여받은 청년 및 중장년층 사람들은 위약을 투여받은 사람들에 비해 비휴식세포(nonrusting cells)와 성숙한 자연살해세포 (NK cells)의 발생을 개선하였다. 따라서, DR7은 염증매개변수(inflammatory parameters)를 개선하고 면역조절특성(immune-modulatory properties)을 강화하여 상기도감염(URTI)의 증상을 경감시킨다.
따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 양상은 항염증(anti-inflammatory) 및 면역조절 보호(immune modulatory protection)를 통한 상기도 감염의 치료및 예방에 사용하기 위한 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물에 관한 것이다.
2. 락토바실러스 플란타룸 DR7 균주는 무작위대조, 이중맹검, 위약 대조 연구(실시예 2 참조) 등에서 보여졌듯이, 성인들의 스트레스와 불안(stress and anxiety)을 완화시켜준다. PSS-10 설문지를 사용하여 일반적인 스트레스 수준(moderate stress levels)을 기반으로 스트레스를 받는 성인 111명을 모집하였다. 12주간 1Xl09 cfu/day양의 DR7 섭취는 DASS-42 설문지에 의해 평가된 위약대조군과 비교시 스트레스를 받는 성인들의 스트레스와 불안증세, 그리고 전체 심리점수(total psychological scores)가 빠르게는 8주차부터 감소되었다. 위약대조군과 비교하여 DR7 피실험자들의 혈장 코티솔 수치(plasma cortisol level)가 감소하였고, 이는 인터페론-γ(interferon-γ)및 전환성장인자-α(transforming growth factor-α)와 같은 혈정전염증성 사이토카인(plasma pro­inflammatory cytokines)을 감소시키고, 인터페론-10(interferon-10)과 같은 혈장 항염증성 사이토카인(plasma anti-inflammatory cytokines) 을 증가시켰다. DR7은 위약대조군과 청년층(30세미만)과 비교하여 일반성인층 (30세이상)의 기본적인 주의력(basic attention), 정서적 인지(emotional cognition), 연관학습(associate learning)등과 같은 인지 및 기억능력(cognitive and memory functions)을 향상시켰다. 혈장 도파민 하이드록실라제(plasma dopamine β-hydroxylase, DBH), 티로신 하이드록실라제(tyrosine hydroxylase, TH), 인돌아민2,3-디옥시게나아제(indoleamine 2,3-dioxygenase), 그리고 트립토판 수산화효쇼-2(tryptophan hydroxylase-2) 와 5-히드록시트립타민 수용체-6(5-hydroxytryptamine receptor-6)의 높은 발현을 동반한 트립토판 2,3-디옥시게나아제(tryptophan 2,3-dioxygenase)의 낮은 발현이 관찰되었듯이 DR7의 투여는 세로토닌 경로(serotonin pathway)를 개선한 반면, 12주간의 위약대조군과 비교시 TH와 BDH의 안정화된 발현을 통해 도파민 경로가 안정화된 것이 관찰되었다. 결과는 DR7이 PAO/WHO의 권장사항에 따라 프로바이오틱 균주(probiotic strain)의 요구사항을 충족하고 스트레스 받는 성인(stressed adults)의 심리적 기능(psychological functions), 인지건강(cognitive health) 및 기억력(meomry)을 개선시키는데 자연스러운 전략으로 적용될 수 있음을 나타낸다.
따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 양상은 스트레스, 불안, 기억 및 인지기능 장애의 예방 및 치료에 사용하기 위한 락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 이의 대사산물에 관한 것이다.
3. 락토바실러스 플란타룸 DR7은 세포자멸(apoptosis), 해마염증(hippocampal inflammation), 그리고 알츠하이머 병(Alzheimer's Disease)에 대한 신경전달물질인 세로토닌(neurotransmitter serotonin)과 도파민 경로(dopamine pathways)를 향상시켜 뇌건강을 개선한다(실시예 3 참조). 쥐를 대상으로 한 연구는, DR7을 투여한 aged-HFD 쥐를 대상으로한 행동평가(behavioural assessments) 중에 불안감(anxiety)이 감소하고 기억력(memory)이 개선됨을 나타내었다. 세 가지의 전 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 해마 농도(hippocampal concentrations)는 노화중에 증가했지만 스타틴(statin)과 DR7 모두 투여함과 동시에 감소하였다. 해마신경전달물질(hippocampal neurotransmitters)과 세포자멸(apoptosis) 유전자의 발현은 DR7을 투여한 aged-HFD 쥐들의 IDO와 P53의 감소된 발현과 TPH1의 증가된 발현을 동반하였고, 이는 세로토닌(serotonin)과 산화적 노화(oxidative senescence)의 경로를 따라 DR7의 잠재적 효능을 나타낸다. 따라서, 이것은 락토바실러스 플란타룸 DR7이 노화중에 인지기능(cognitive functions)을 향상시키는 식이전략(dietary strategy)의 전망을 나타내고 있다.
4. 락토바실러스 플란타룸 DR7 균주는 노랑 초파리(Drosophila melanogaster) 알츠하이머(Alzheimer's disease, AD) 모델의 병태생리(pathophysiology)를 개선하고 눈의 신경변성(neurodegeneration)을 완화시킨다 (실시예 3참조). 노랑 초파리(Drosophila melanogaster) AD 모델에 DR7 투여를 통해 DR7 균주의 잠재적인 알츠하이머 병의 역전(AD-reversal) 효능을 나타내었다. 프로바이오틱 균주의 투여는 알츠하이머가 유도된 초파리의 거친 눈표현형(the rough eye phenotype, REP)을 구제할 수 있었고, 락토바실러스 플란타룸 DR7 균주를 투여하자 보다 두드러진 결과가 관찰되었다.
따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 양상은 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)의 예방 및 치료에 사용하기 위한 락토바실러스 플란타룸 DR7 및 이의 대사산물에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병이고, 여기서 락토바실러스 플란타룸 DR7은 알츠하이머 병(Alzheimer's Disease), 해마염증(hippocampal inflammation), 그리고 세포자멸(apoptosis)에 대한 신경전달물질인 세로토닌(neurotrans-mitter serotonin)과 도파민 경로(dopamine pathways)를 개선시킨다.
5. 락토바실러스 플란타룸 DR7은 텔로미어 단축을 방지하고 노화에 대한 에너지대사를 향상시킨다(실시예 5 참조). 수컷 Sprague-Dawley 쥐에게 고지방 식단 (54% kcal 지방)을 제공하고, 12주 동안 매일 D-갈락토오스(D-galactose)를 주사하여 노화를 유도하였다. DR7균주가 텔로미어 길이, 혈장지질 과산화(plasma lipid peroxidation), 간 내 AMPK 발현(hepatic AMPK expression) 및 근육성능(muscle performance)과 같은 연령관련장애(age-related impairment)에 미치는 영향을 평가하였다. 스타틴(statin)과 락토바실러스 플란타룸 DR7(LP-DR7)의 투여는 텔로미어 단축을 현저히 감소시키고 AMPK subunit-α2의 발현을 증가시켰다. AMPK subunit-α2은 대조군과 비교하여 LP-DR7 투여한 쥐에서는 상승한 반면, 스타틴(statin)은 이러한 효과를 나타내지 않았다.근육성능 테스트(Muscle performance test)에서 DR7의 투여는 대조군과 비교하여 달리기 거리(running distance), 지속시간(duration), 속도(speed), 일(work), 파워(power)등이 증가한 반면, 스타틴(statin)은 이러한 효과를 발휘하지 않았다.
따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 양상은 노화에 맞서 에너지 대사 향상과 텔로미어 단축의 예방을 통해 노화 징후(ageing signs)를 늦추어주는 락토바실러스 플란타룸 DR7 혹은 이의 대사 산물에 관한 것이다. 노화 징후는 예를 들어 이동성과 움직임의 장애(impairment in mobility and movements)를 야기하는 낮은 에너지 대사(reduced energy metabolisms) 또는 면역력 장애(impairment of immunity)를 야기하는 혈장 산화(oxidation of plasma)등이 있다.
6. 락토바실러스 플란타룸 DR7은 HMG-CoA 환원효소(HMG-CoA reductase)의 mRNA 발현(mRNA expression)을 하향 조절하는 AMPK의 인산화(phosphorylation of AMPK)를 통해 콜레스테롤(cholesterol) 수치를 감소시켜, 증가된 크리글리세라이드 수치(increased triglycerides level), 증가된 염증(inflammation) 그리고 증가된 지질 축적(accumulation of lipids)에 맞서 간지질(liver lipid)과 에너지대사(energy metabolisms)에 영향을 미친다(실시예 6 참조). 락토바실러스 플란타룸 DR7의 무세포상층액(Cell free supernatant, CFS)은 다른 락토바실리(lactobacilli)에 비해 HepG2에서 HMG-CoA 환원효소(HMGCR)의 감소된 mRNA 발현 감소와 함께, HepG2 and HT-29세포 모두에서 더 좋은 콜레스테롤 동화능력과 콜레스테롤 축적 감소(reduction in cholesterol accumulation) 능력을 나타내었다. HMGCR 발현의 감소는 AMPK 억제제(AMPK inhibitor)의 존재하에 감소되었으며, 이는 HepG2에서 AMPK의 mRNA 발현 대신에 AMPK의 인산화를 통한 AMPK 경로(AMPK pathway)를 통해 락토바실러스 플란타룸 DR7은 그 효과를 발휘하였음을 시사하고 있다. 전체적으로, 락토바실러스 플란타룸 DR7은 HMGCR 발현의 감소를 야기하는 AMPK의 인산화를 통해, AMPK 경로를 따라 콜레스테롤 저하 특성을 발휘할 수 있었다는 것을 나타내고 있다.
따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 양상은 심혈관계 질환(cardiovascular diseases)의 예방 및 치료 그리고 콜레스테롤 감소에 사용되기 위한 락토바실러스 플란타룸 DR7 혹은 이의 대사 산물에 관한 것이다.
7. 락토바실러스 플란타룸 DR7은 노화 쥐의 NAFLD를 완화시키고 지질 대사(lipid metabolism)를 개선시킨다(실시예 6 참고). 이 연구에서는 다양한 락토바실러스(Lacto­ bacillus)의 균주가 노화쥐에서 AMPK 활성화를 통해 고지혈증(hyperlipidemia)과 간 지방증 (liver steatosis)을 완화시키는지 테스트하였다. 수컷 Sprague-Dawley 쥐는 고지방 식단(HFD)를 섭취하면서 노화를 유도하기 위해 D-갈락토오스(D-galactose)를 12주 동안 매일 투여하였다. 투약은 다음과 같다.: i) 정상식단(normal diet), ii) 고지방식단(HFD), iii) 고지방식단과 로바스타틴 2 mg/kg/day 투여(HFD-statin), iv) 고지방 식단과 DR7 10 log CPU/day 투여(HFD­ Lactobacillus plantarum DR7). DR7의 투여는 HFD 대조군과 비교하여 12주 후에 혈청 중성비장 수치(triglycerides level)를 감소 시켰다. DR7의 투여로부터 두드러진 효과들이 관찰 되었고, 여기서 간 유전자 발현(hepatic gene expressions)부터 간 조직학(liver histology)에 이르기까지 대조군과 비교하여 긍정적힌 효능도 관찰 되었다; 간지질 합성 및 산화 유전자 SCD1의 하향조절, ABCG5 및 ABCG8의 간 배설 유전자의 상향조절, 간 지방증의 정도 감소, 간 에너지 대사 유전자 AMPKα1 and AMPKα2의 상향조절. 종합해보면, 이 연구는 DR7균주가 에너지및 지질 대사의 활성화를 통하여 지질 프로파일(lipid profiles)을 향상시켰고, 이는 심혈관계 질환 및 간 질환(cardiovascular and liver diseases)의 완화에 있어서 전도 유망한 자연적인 중재(intervention)임을 나타내고 있다.
따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 양상은 중성지방 수치, 염증, 지질 축적의 증가를방지하여 고지혈증(hyperlipidaemia) 및 간 지질 축적(hepatic lipid accumulation)의 치료및 예방에 사용되기 위한 락토바실러스 플란타룸 DR7 혹은 이의 대사 산물에 관한 것이다. 특정 구체 예에서는, 본 발명의 균주는 비알코올 성 지방간 질환(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 예방 및 치료에도 사용된다.
8. 락토바실러스 플란타룸 DR7은 장내 세균 집단(gut bacterial populations)과 대사산물 농도(metabolites concentrations)의 불균형에 대한 장 조절(gut modulation)에 영향을 미친다(이하 실기예7 참조). 수컷 Sprague-Dawley 쥐는 고지방 식단(HFD)를 섭취하면서 노화를 유도하기 위해 D-갈락토오스(D-galactose)를 12주 동안 매일 투여하였다. 배설물 미생물 프로파일(fecal microbiota profile), 단쇄지방산(short-chain fatty acids), 수용성 화합물(water­soluble compounds)에 대한 락토바실러스 플란타룸 DR7의 투여효과를 분석하였다. 배설물 수용성 대사산물(fecal water-soluble metabolites) 분석 결과, 락토바실러스 플란타룸 DR7의 투여는 트립토판(tryptophan), 류신(leucine), 티로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 메티오닌 (methionine), 발린(valine) 및 라이신(lysine)과 같은 아미노산 대사(amino acids metabolism)와 관련된 화합물에서 높은 배설물 함량을 나타내었다.
따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 양상은 장내 세균 집단(gut bacterial populations)과 대사산물 농도(metabolites concentrations)의 불균형에 대한 장 조절(gut modulation), 즉 다시 말하면, 장내세균 불균형(dysbiosis)의 개선을 위해 사용될 락토바실러스 플란타룸 DR7 혹은 이의 대사 산물에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 대사산물인 2-하이드록시이소카프산(2-hydroxyisocapric acid, HICA)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic, PLA)의 생성을 통해 여러 매커니즘중에서 건강상의 이점(health benefits)을 발휘한다.
본 발명의 균주는 대사산물인 2-하이드록시이소카프산(2-hydroxyisocapric acid, HICA)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic, PLA)의 생성을 통해 여러 매커니즘중에서 건강상의 이점(health benefits)을 발휘한다.
이러한 대사산물(metabolite)은 텔로미어 단축을 저하시켜 노화징후를 늦출수 있다. 더욱이, 대사산물은 AMPK 인산화를 통하여 AMPK 경로 활성화를 유도한다. 따라서, 대사산물은 일반적으로 노화인자(ageing factor) 관련된 지질대사(lipid metabolism)를 간접적으로 조절한다. 한편으로는, 상기도 감염에 대한 항염증(anti-inflammatory) 및 면역 조절 보호(immune modulatory protection)를 제공함으로써 노화징후의 속도를 낮출 수 있다. 대사산물을 섭취쉬 피험자들의 노화징후를 늦출수 있다. 대사산물의 사용은 특히 심혈관계 질환, 높은 콜레스테롤 수치 그리고 진행성 신경기능 장애(progressive neuronal dysfunction)와 같은 연령 관련 질환(age-related diseases)으로 고통받는 대상자들에게는 매우 적합하다. 특히, 대사산물의 지질분획(lipid fraction)은 위에서 언급된 연령관련 질환을 치료하기에 적합하다.
조 대사산물(crude metabolite)0은 섭취가능하며, 또한 하나이상의 첨가제(excipient)와 혼합하여 건강식품(health food) 또는 음료(beverage)로 만들 수 도 있다. 이러한 과정은 대사산물의 영양가(nutritional value)를 유지시키기 위해 적절한 방식으로 수행되어야 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 노화징후의 감속은 HICA 및 PLA 포함하는 대사산물을 사용하여 AMPK의 인산화를 통한 AMPK 경로 활성화를 통해 달성된다. 특히, AMPK는 동화와 이화 경로 세포 에너지 수준을 조절하는 세포내 에너지 센서이다. 또한 AMPK는3-하이드록시 3-메틸글루타길 조효소 A 환원효소(HMGCR)와 같은 대사효소(metabolic enzyme)의 상위 키나아제(upstream kinase)이기도 하다. AMPK가 활성화 되면, AMPK는 광범위한 하위 표적(downstream targets)을 인산화하여 ATP 생산 경로(ATP-producing pathways)가 증가하고 ATP 활용 경로(ATP-utilizing pathways)는 감소한다. 더 자세하게는, AMPK는 콜레스테롤(cholesterol)과 이소프레노이드(isoprenoid)를 생성을 담당하는 HMGCR의 유전자 발현을 감소시킨다. 이것은 대사산물이 콜레스테롤 저감 특성(cholesterol-lowering properties)을 나타내며, 피험자 섭취시 콜레스테롤 저감 및 지질 수치를 낮추는데 유용함을 나타내었다.
더욱이, 대식세포 활성화(macrophage activation)를 통해 인플루엔자 바이러스 감염 (influenza viral infections)을 줄이는 AMPK 인산화를 활성화하여 노화징후를 늦출 수 있다. 특히, 대식세포(macrophages)는 인터페론-γ(interferon-gamma)와 같은 사이토카인과 지질다당류(lipopolysaccharide와 같은 박테리아 내독소(bacterial endotoxins)의 의해 활성화 되며, 여기서 활성화는 대식세포를 변화시켜 침입하는 박테리아(invading bacteria)나 감염된 세포(infected cells)를 괴멸시킨다. 더 정확하게는, 활성화된 대식세포는 프로테아제(proteases), 호중구 화학주성인자(neutrophil chemotactic factors), 활성산소종 (reactive oxygen species), 사이토카인(cytokines), 에이코사노이드(eicosanoids) 그리고 성장인자(growth factors)등과 같은 독성 화학물질(toxic chemicals)과 단백질(proteins)을 방출하여 침입하는 박테리아(invading bacteria)나 감염된 세포(infected cells)를 괴멸시킨다. 따라서, 본 발명의 대사산물은 대상체(subject)가 섭취시 상기도 감염에 대한 면역 조절 보호를 행사할 수 있다.
전술한 설명에 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 개시된 대사산물은 지잘대사(lipid metabolism)를 촉진하는데 사용될 수 있다. 특히, 대사산물은 스테아로일-CoA 불포화 효소1(SCD1)을 하향 조절하고, 간내 ATP-결합 카세트 서브 패밀리 G 멤버 5(ABCG5)과 ATP-결합 카세트 서브 패밀리 G 멤버 8(ABCG8)을 상향조절하여 체내 혈청 중성지방(serum triglyceride)의 수치를 감소시킨다. SCD1의 하향 조절은 단일 불포화 지방산의 합성을 감소시키고 그리고 혈장 중성지방을 감소 시킨다. 따라서, SCD1의 활성화를 낮춤으로써 체내 중성지방 생성(triglyceride production)을 제한 할 수 있다. 반면에, ABCG5와ABCG8의 상향조절은 선택적으로 구동되는 담즙 중성 스테롤 분비(biliary neutral sterol secretion)를 통해 스테롤 균형을 유지한다. 이와 같이, 대사산물의 사용은 지방과 연관된 건강 상태의 위험을 줄일 수 있으며 이러한 위험은 노화요인과도 연관이 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, HICA와 PLA를 포함한 대사산물은 텔로미어 단축(telomere shortening)을 방지하여 노화징후를 늦추는 효과를 제공한다. 하나의 실시예에서는, 대사산물과 고지방을 포함한 식단을 섭취한 노화 동물은 고지방 식단만을 섭취한 노화쥐들에 비해 더 높은 텔로미어/단일 복제 유전자 비율(telomere/single-copy-gene ratio)을 나타내었다. 특히, 미토콘드리아 산화(mitochondrial oxidation)로 부터 생산된 활성산소종(reactive oxygen species)은 텔로미어를 단축시키는 요인들 중 하나이다. HICA와 PLA를 포함한 대사산물은 미토콘드리아 산화와 연관이 있을 수도 있고, 그러면 활성산소종의 생산을 감소 시킨다. 게다가, 대사산물의 사용은 뇌에서 아밀로이드 베타 펩타이드(amyloid beta peptides)의 축적을 감소시킨다. 아밀로이드 베타 펩타이드는 치매(dementia), 진행성 신경장애(progressive neuronal dysfunction), 시냅스 기능 장애(synaptic function impairment), 그리고 알츠하이머병(Alzheimer's disease)에 기여하는 중요한 아미노산(amino acids)이다. 이처럼, 대사산물의 사용은 뇌에서 아밀로이드 플라크(amyloid plaques) 형성을 방지한다.
제품 형태
본 발명의 양상은 본 발명의 균주를 포함하는 조성물(composition)에 관한 것이며, 여기서 균주는 동결건조(freeze-dried)되고 조성물의 양은 104 ~ 1012 cfu/ g 이다.
본 발명의 다른 양상은 균주의 대사산물을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 대사산물은 2-히드록시이소카프로산(2-hydroxyisocapric acid)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic acid)으로 구성된다.
박테리아 세포(bacterial cells)의 유효량은 당업자에 의해 결정되며, 이는 달성하고자하는 특정 목표, 치료받는 환자의 연령 및 신체상태, 기저질환의 중증도 그리고 최종적인 제형에 따라 달라진다. 경구투여(administered orally)시, 본 발명의 균주는 현행법에 따라 107 에서 1012 cfu, 바람직하게는 109 에서 1011 cfu의 일일 유효 투여량(effective daily dose)을 제공하는 양으로 조성물내에 존재한다. 집락형성단위("cfu")라는 표현은 한천배지(agar plates)위의 미생물 검사(microbiological counts)에 의해 밝혀진 박테리아 세포의 수로 정의된다. 본 발명의 조성물의 형태로 균주가 사용될때, 균주는 바람직하게는 1:1의 농도비(concentration ratio)를 가진다.
본 발명의 균주의 일반적인 사용은 생존 세포(viable cells)의 형태이다. 그러나, 이는 사멸된 배양물(killed cultures) 또는 세포 용해물(예: 변경된 pH, 초음파, 방사선, 온도 또는 압력, 박테리아를 사멸하거나 용해하는 다른 방법에 대한 노출에 의해 획득됨)과 같은 비생존 세포(non-viable cells) 또는 유익한 인자(beneficial factors)를 포함하는 조성물 (compositions)로 확장될 수 있으며, 이 조성물은 2-히드록시이소카프로산(2-hydroxyiso-capric acid)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic acid)을 포함하는 이의 대사산물과 같은 본 발명의 균주에 의해 생산된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 조성물은 식품 보조제(food supplement), 의약품 (medicament), 유아용 분유(infant formula), 식용 제품(edible product) 및 식품(food product)으로 이루어진 군으로부터 선택된 형태이다.
특정 구체예에서, 조성물은 경구투여(oral administration)용 정제(tablets), 캡슐 (capsules), 알약(pills)의 형태이다.
본 발명의 조성물은 조성물을 형성하는 박테리아 세포의 생존력(viability)에 부정적인 영향을 미치치 않는 적합한 형태(suitable form)로 제조 될 수 있다. 첨가제(excipients) 및 가장 적합한 제조방식의 선택은 조성물의 특정 목적을 고려하여, 제약 및 식품 기술 (pharmaceutical and food technology)분야의 당업자에게 달려있다.
본 발명에 따른 조성물은 박테리아 세포가 유일한 활성제(active agents)이거나, 하나 이상의 다른 활성제와 혼합되거나, 약학적으로 허용되는 첨가제(excipients) 또는 식품의 경우 적절한 첨가제(additives)나 성분(ingredients)에 혼합되는 형태로 제조 될 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서, 조성물은 추가적으로 하나 이상의 추가적인 활성제(active agents)를 포함한다. 바람직하게는, 추가 활성제는 본 발명의 조성물울 형성하는 박테리아 세포(bacterial cells)에 길항하지(antagonistic)않는 다른 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria)이다. 제형에 따라, 박테리아 세포는 정제된 박테리아(purified bacteria)로서, 박테리아 배양물(bacterial culture)로서 또는 박테리아 배양물의 일부로서, 후처리된 박테리아 배양물로서, 그리고 단독 또는 적절한 담체(carriers)와 성분(ingredients)과 함께 첨가 될 수 있다. 프로바이오틱(Prebiotics)도 첨가될 수 있다.
상기 조성물은 의약품(pharmaceutical product)의 형태일 수도 있다. "의약품(pharmaceutical product)"이라는 용어는이 경우 박테리아 세포와 함께 약학적으로 허용되는 첨가제와 같은 활성 성분(active ingredient)을 포함하는 조성물을 포함한 광범위한 의미로서 본 명세서에서 이해된다. 본 명세서에서 사용된 "약학적으로 허용되는(pharmaceutically acceptable)" 이라는 용어는 정상적인 의학적 판단범위내 피험자(예: 인간)의 조직과 접촉하여 과도한 독성(toxicity), 자극(irritation), 알레르기 반응(allergic response), 또는 다른 문제나 합병증(complication)없이 합리적인 이익/위험 비율에 상응하여 사용하기에 적학합 화합물(compounds), 물질(materials), 조성물(compositions) 및 투여형태(dosage forms) 에 관한것 이다. 각 담체(carrier), 첨가제(excipient) 등은 제형의 다른 성분들과 호환된다는 의미에서 "허용되어야" 한다. 적절한 담체, 첨가제등은 표준제약 텍스트(standard pharmaceutical texts)에서 찾을 수 있다
의약품(pharmaceutical product)은 제품승인 경로(product approval route)및 국가에 따라 다른 형태 또는 이름 으로 채택될 수도 있다. 예를 들어, 의약(medicament)은 특정 의약품이다. 본 설명에 있어서, 의료용 식품(medical food)은 또다른 특정 의약품으로 간주된다. 일부 국가에서는 "의료용 식품(medical food)" 또는 특수한 의학적 목적을 위한 음식(food for special medical purposes)"이라는 용어가 특수하게 제조된 음식 또는 일반적인 식단(normal diet)으로는 충족될 수 없는 고유한 영양 요구(distinctive nutritional needs)를 가진 질병의 식단 관리(dietary management)를 위한 음식을 지칭한다. 이는 미국에서는 미국 식품 의약국 (Food and Drug Administration)의 1988년 희귀의약품법 개정안(Orphan Drug Act Amendments) 그리고 유럽에서는 Commission Directive 1999/21/EC과 같은 법으로 규정되어 있다. 의료 식품(Medical foods)은 광범위한 범주의 식품 보조제(food supplements)와 건강을 주장하는 전통식품(traditional foods)과는 다르다. 따라서, 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 의료식품(medical food)이다.
종종, 본 명세서에서 밝혀진 프로바이오틱 박테리아 조성물은 식품 보조제(food supplements)로 간주된다. 식이 보충제(dietary supplement) 또는 영양 보충제(nutritional supplement)로도 알려진 식품 보조제는 또 다른 특정 의약품(pharmaceutical product)으로 간주된다. 이것은 식단을 보충하기 위한 용도로 준비되 것이며, 정상적인 식단에서 섭취가 되지 않거나 충분한 양으로 섭취되지 않을 수 있는 영양소(nutrients) 또는 유익한 성분(beneficial ingredients)을 제공하기 위한 것이다. 대부분 식품 보조제는 식품으로 간주되지만 때로는 약물(drugs), 천연건강제품(natural health products) 또는 건강기능식품 (nutraceutical products)으로 간주된다. 본 발명의 의미에서, 식품 보조제는 건강기능식품을 포함한다. 식품 보조제는 일반적으로 처방전 없이(without prescription) 카운터에서 판매된다. 식품 보조제가 알약(pill) 또는 캡슐(capsule) 형태를 채택하는 경우, 의약품에 사용되는 동일한 첨가제(excipients)를 포함한다. 그러나 식품 보조제는 일부 영양소로 강화된 식품형태(예: 유아용 조제분유)를 채택할 수도 있다. 따라서, 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 식품 보조제(food supplement)이다.
본 발명에 따른 조성물은 그대로 투여되거나 또는 적절한 식용 액체 또는 고체와 혼합되어 투여되거나 또는 정제(tablets), 알약(pills), 캡슐(capsules), 로젠지(lozenges), 과립(granules), 분말(powders), 현탁액(suspensions), 사쳇(sachets), 시럽(syrups)의 형태 또는 단위용량(unit dose)의 형태로 동결 건조(freeze-dried)될 수 있다. 또한 투여전 함께 제공된 별도의 액체 용기(separate liquid container)에 혼합되어지는 동결 건조된 조성물의 단일용량(monodoses)의 형태일 수도 있다.
본 발명의 조성물은 유아의 경우 우유제품과 같은 다양한 식용식품 및 식품에 포함될 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 "식용식품(edible product)"이라는 용어는 광범위한 의미에서 어떠한 형태로든, 동물에 의해 섭취될 수 있는 임의의 형태의 제품을 포함한다(예를 들어, 제품은 감각기관에 의해 받아들여 질수 있는 제품). "식품(food product)"이라는 용어는 체내에 양양지원(nutritional support)을 공급하는 식용제품으로 이해된다. 특히, 흥미로운 식품은 식품보조제(food supplements)와 유아용 조제분유(infant formulas)이다. 식품은 바람직하게는, 귀리가루죽(oatmeal gruel), 젖산발효식품(lactic acid fermented foods), 저항성 전분(resistant starch), 식이섬유(dietary fibers), 탄수화물(carbohydrates), 단백질(proteins) 그리고 당화단백질(glycosylated proteins)과 같은 담체물질(carrier material)을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 박테리아 세포는 유아용 제조분유를 구성하기 위해 곡물(cereals) 또는 분유(powdered milk)와 같은 다른성분과 균질화(homogenized) 된다.
본 발명의 또 다른 양상은 동결방지제(cryoprotectant); 본 발명의 균주를 포함하는 동결건조된 바이오메스(freeze-dried biomass); 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 고체 조성물(solid composition)에 관한 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 특히 에멀젼(emulsion), 겔(gel), 페이스트(paste), 과립, 분말 및 검(gum)으로 부터 선택된다. 본 발명의 추가적인 양상은 이전 양상에서 정의된 조성물의 유효량을 포함하는 구강관리 제품(oral care product), 제약 조성물(pharmaceutical composition), 식용제품, 식이 보충제, 미용 조성물(cosmetic composition)을 제공한다. 특정 실시예에서, 구강관리제품은 츄잉껌(chewing gum), 치약(tooth paste), 구강 스프레이(mouth spray), 로젠지, 구강 붕해정(oral dispersible tablet)이다. 특정 구체예에서, 제약 조성물, 식용제품 또는 식이 보충제는 로젠지 또는 구강 붕해정이다.
본 발명의 조성물의 실시예는 하기의 실시예 8에 나타나 있다.
상세한 설명 및 청구항에서 "구성하다"라는 단어와 그 변형은 다른 기술적 특징, 첨가, 구성요소, 단계를 배제하려는 의도가 아니다. 본 발명의 추가목적, 이점 및 특징들은 상세한 설명을 검토할 때 당업자에게 명백해지고, 본 발명의 구체화를 통해 학습될 수도 있다. 더욱이, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 및 바람직한 실시예의 모든 가능한 조합을 포함한다. 다음의 실시예 및 도면들은 본 발명을 제한하려는 의도없이, 예시 목적으로 본 명세서에서 제공된다.
발명의 모드(Mode for Invention)
실시예
재료 및 방법
박테리아 균주 및 배양
락토바실러스 플란타룸 DR7은 페낭의 신선한 우유로부터 추출되었고, 말레이시아 쿠알라룸프에 위치한 Clinical Nutrition Intl (M) Sdn. Bhd.사의 도움으로 획득되었다. 모든 배양(All stocks cultures)은 20% 글리세롤 (-20℃)에서 보존되었고, 멸균된 MRS배지(Hi-Media,인도 뭄바이)에서 10% (v/v) 접종원(inoculums)을 사용하여 연속적으로 세번 활성화되었고, 사용되기 전에는 24시간동안 37℃에서 배양 되었다(incubated). 배양물(cultures)은 4℃에서 5분동안 12,000 x g로 원심분리되었고, 펠릿(pellets)은 산성도 7.5 (pH 7.5)의 PBS에 1 x 1011 CFU/mL의 최종농도로 재현탁되었다.
DR7 대사산물로 부터 추출된 지질 분획의 특성
발효배지(fermentation medium) 내 DR7 대사산물은 사용된 배지(spent broth)의 세포 펠렛(cell pellet)을 분리하여 수집되었다. 사용된 배지는 지질(lipid), 단백질(protein) 그리고 다당류 분획(polysaccharide fractions)으로 분리되었다. 지질 분획은 지방산 메틸에스테르(fatty acid methyl ester, FAME) 분석을 위해 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS)을 사용하여 응축(condensed), 가수분해(hydrolysed) 그리고 메틸에스테르화(methyl esterified)되었다. 약 100μL의 샘플추출물(sample extract)을 2% H2S04 과 메탄올(methanol)을 포함하는 500μL의 용매 혼합물(solvent mixture)을 2mL 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 혼합한 다음 2시간 동안 80℃에서 교반하였다. 이어서, 500μL의 0.9% 염화나트륨 (NaCl)과 500μL의 헥산(hexane)을 샘플 추출물이 포함된 튜브에 첨가하고 16,000 x g에서 3분동안 원심분리 하였다. 헥산층(hexane layer)은 FAME 정량화(FAME quantification)를 위해 자동시료주입기(auto-sampler)로 피펫팅되었다. FAME를 식별하기 위해, 1μL의 헥산층은 5977 MSD 질량분석기(Agilent Technologies Australia Pty Ltd; GC/MS)를 갖춘 Agilent 5977A 가스크로마토그래피 시스템에 주입하였다. 분리에는 BPX-70 컬럼(BPX-70 column)이 사용되었다.
체외 실험
콜레스테롤 동화
락토바실리에(by lactobacilli) 의한 콜레스테롤 동화(assimilation of cholesterol)는 이전에 설명된대로 결정되었다(Liang and Shah, 2005). 상층액(supernatant)에 남아있는 콜레스테롤은 제조사의 메뉴얼을 따라 Amplex Red 콜레스테롤 분석키트(lnvitrogen, 미국)를 사용하여 정량화되었다.
세포 배양
HepG2(인간 간종 세포주)과 HT-29(인간 결장직장 세포주)는 전술한 바와 같이 DMEM(Gibco, 미국)에서 배양되었다(Lew et al., 2013). 12-웰 플레이트(웰당 1X l0 5 세포)에 접종된 HepG2과 HT-29세포(HepG2 and HT29 cells)들은 1mM의 콜레스테롤과 0.03% 황소담즙(ox-bile)을 함유한 무혈청 DMEM(serum free DMEM)에서 24시간 동안 37℃에서 5%의 CO2와 함께 배양하였다. 그 다음 세포를 7.4의 산성도를 가진 차가운 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 사용하여 2회 세척 하였다. 지질은 3:2로 희석된 2mL의 헥산과 이소프로판올(isopropanol)을 사용하여 30분동안 추출하였다. 추출물(extracts)을 유리관(glass tube)에 모아 질소가스하에 증발시켰다. 세포에 흡수되고 유지된 콜레스테롤의 양은 제조사의 메뉴얼에 따라 Amplex Red 콜레스테롤 분석키트를 사용하여 추출 및 정량화 되었다. 세포내 단백질(intracellular protein)은 2mL의 NaOH (0.1 N)를 사용하여 4℃에서 16시간 동안 지속적으로 흔들어 12-웰 플레이트내 세포에서 추출되었다. 단백질 농도는 Bradford의 방법을 사용하여 측정되었다. 세포 내 콜레스테롤 축적은 세포 내 단백질 함량에 따라 표현되었다.
유전자 발현
전체 RNA는 TRISURE 시약 (Bioline, 영국)을 사용하여 분리되었고, 제조사의 메뉴얼에 따라 random hexamer primer과 함께 RevertAid RT Kit(Thermo Scientific, 미국)을 사용하여 역전사(reverse transcription)를 통해 전체 RNA를 cDNA로 전환하였다. 간단히, 1μg의 전체 RNA를 역전사하고 반응 혼합물(reaction mixture)을 2℃에서 5분 동안 배양후 이어서 4℃에서 60분동안 배양을 통해 증폭시켰다. 혼합물을 7℃에서 5분 동안 배양하여 반응을 종결시켰다. cDNA는 뉴클라아제가 없는 물(nuclease-free water)을 사용하여 10배 희석하고, qPCR에서 주형(template)으로 되거나, 사용할때 까지 -8℃에서 보관되었다. HMG-CoA 환원효소(HMG-CoA reductase)와 AMPK의 mRNA 수치는 Agilent AriaMx Realtime PCR System (Agilent Technologies, 미국)을 사용하여 실시간 PCR 분석(real-time PCR analysis)을 통해 측정되었다. 2mL의 PCR 반응은 10μL의 2xSensiFAST SYBR 믹스(Bioline, 영국), 0.8μL의 10μM 정방향 및 역방향 프라이머(forward and reverse primers), 그리고1μL의 cDNA로 구성된다. 프라이머 염기서열(primer sequences)은 표 1과 같고, 제조업체가 제안한 증폭조건을 사용하였다. 18S rRNA 유전자(18S rRNA gene)는 데이터 정규화(normalization of data)를 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)로 사용되었다. mRNA 발현은 대조군(control)에 대한 백분율 변화(percentage change)로 표현되었다.
실시간 PCR 분석에 사용된 프라이머 서열
표적유전자 프라이머 서열(5' - 3') NCBI 등록번호
SCD-1 F: CAC TGG TGC CCT GGT.ACT GCT (SEQ ID NO: 2)
R: GGA TGT TCT CCC GAG ATT GM (SEQ ID NO: 3)		 NM 139192.2
ABGG5 F TGT GAC CCT GGC ATC TAT (SEQ ID NO: 4)
R: ATC ATT GGA CCA GTT CAG T (SEQ ID NO: 5)		 NM 053754.2
ABCGB F: GAT GCT GGC TAT CAT AGG GAG C (SEQ ID NO: 6)
R: TCTCTG CCTGTGATAACG TCGA (SEQ ID NO: 7)		 NM 130414.2
Telomere F: ACACTMGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAG TGT (SEQ ID NO: 8)
R
TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA
ACA (SEQ ID NO: 9)
AMPK활성화 측정을 위한 세포기반 ELISA
AMPK의 활성화(activity of AMPK)은 제조업체의 메뉴얼에 따라 세포기반 ELISA (RayBio cell-based protein phosphorylation ELISA kit, RayBiotech, 미국)를 사용하여 측정되었다. 간략하게는, HepG2 세포(웰당 l xl0 4 세포)를 96-웰 플레이트(96-well plates)에 접종하고 무혈청 DMEM(serum free DMEM)에서 5%의 이산화탄소와 함께 3℃에서 24시간 배양하였다. 200μL의 PBS로 두번 세척한 후, 100 mL의 고정액(fixative solution)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 20분동안 흔들어 주었다. 그다음, 플레이트를 200μL의 TBST를 사용하여 3번 세척한 후, 실온에서 20분동안 200μL의 퀀칭 버퍼(quenching buffer)와 배양한 다음, 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 3℃에서 1시간동안 첨가하였다. 다음으로는 플레이트를 200μL의 TBST를 사용하여 3번 세척하고, 50μL의 rabbit anti-phosphorylated AMPK­ αl/2 (Santa Cruz Biotechnology; Thr172, 블로킹 욕액과 1:1,000으로 희석)을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 흔들면서 배양하였다. 세척후, 50μL의 HRP-conjugated mouse antirabbit IgG (블로킹 욕액과 1:1,0000으로 희석; Santa Cruz Biotechnology, 미국)을 첨가하고 상온에서 1.5시간 동안 배양하였다. 3회 세척후, 50μL의 TMB substrate (3,3,5,5-테트라메틸벤즈이딘)을 각 웰에 첨가하고 30분동안 어두운 상온에서 흔들면서 배양 하였다. 마지막으로, 50μL의 정지액(H2SO4, 2N)을 첨가하고 450 nm에서 광학밀도 (optical density)를 판독 하였다
동물 실험
투여 그룹
모든 동물 실험(All animal experiments)은 USM 동물 관리 및 사용위원회(USM/Animal Ethics Approval/2016/(724))의 승인을 얻어 진행되었다. 8주차의 수컷 Sprague Dawley 쥐들은 두가지 실험 모델을 기반으로 각 그룹으로 할당되었다; 1) 스타틴(statin)을 양성대조군(positive control)으로 사용하는 노화군, 2) 스타틴을 양성 대조군으로 사용하며 고지방 식단(high-fat diet, HPD)을 섭취한 노화군.
모델 (1)에서는, 쥐들은 12주동안 다음의 그룹(N = 6)중 하나에 할당되었다: (1) Young (대조군), (2) Aged (D-갈락토오스 유도 섭취를 통한 노화) (3) Aged-statin (D-갈락토오스 유도섭취를 통한 노화와 2 mg/kg/day의 로바스타틴을 투여) (4) Aged-DR7 (D-갈락토오스 유도섭취를 통한 노화와 락토바실러스 플란타룸 DR7을 20% (v/v) 자당 (sucrose)을 동결방지제 (cryoprotectant)로 사용하여 동결건조형태로 10 log CPU/day 투여).
모델 (2)에서는, 쥐들은 12주동안 다음의 그룹(N = 6)중 하나에 할당되었다: (1) Young (정상식단), Young HPD (고지방식단을 섭취한 어린쥐), Old (600mg/kg/day 의 D-갈락토오스를 통해 노화가 유도된 쥐), Old HPD (고지방식단과함께 D-갈락토오스를 통해 노화가 유도된 쥐 ), Old HPD DR7 (log 10 CPU/day의락토바실러스 플란타룸 DR7을 투여하면서 고지방식단과 함께 D-갈락토오스를 통해 노화가 유도된 쥐), Old HPD statin (2mg/kg/day의 로바스타틴을 투여하면서 고지방식단과 함께 D-갈락토오스를 통해 노화가 유도된 쥐). 표준 식단(Altromin, 독일)을 ND로 사용하고, 25%(w/w) 동물성지방이 첨가된 표준식단을 HPD로 사용하였다. 투여는 1g의 식품펠렛(food pellet)에 혼합되어 매일 공급되었다. 쥐들이 완전한 섭취를 보장하기 위해 투여중에는 개별 케이지로 이동 되었다. 12주의 투약기간이 끝난후, 이산화탄소(carbon dioxide)를 흡입을 통해 희생되기전 12시간 동안에는 금식을 하였다. 모든 조직들은 즉시 절제되었고, 식염수(saline)로 헹구어졌다. 조직들은 실시간 PCR을 통해 유전자 정량화(gene quantification)에 사용되었다.
텔로미어 길이 측정
최종 DNA 농도 범위가 0.073~17.65 ng/μL인 참조 DNA 샘플 (표준 DNA)을 사용하여 두개의 표준 곡선(텔로미어 및 알부민)을 생성하였다. 실험 DNA 샘플의 T/S 비율(T/S ratio)은 T(텔로미어 주형의 복제수에 대한 표준 실험 샘플과 일치하는 표준 DNA의 나노그램 수)를 S(알부민의 복제수에 대한 실험 샘플과 일치하는 표준 DNA의 나노그램 수)로 나눈 값이다. 평균적인 T/S 비율은 세포당 평균 텔로미어 길이(average telomere length)에 비례할 것으로 예상된다.
운동부하검사
운동부하검사(Treadmill exhaustion test)는 Castro and Kuang (2017)의 연구를 참조하여 수행되었다. 쥐들은 먼저 움직이지 않는 런닝챔버내에서 0°의 경사로 5분동안 적응한 다음, 0°의 경사로에서 10m/min의 속도로 5분동안 달렸다. 적응 2, 3일차에서는 쥐들은 10°의 오르막 경사를 10분 동안 달렸다. 러닝머신 플랫폼 뒤의 금속 전극에는 일시적이고 가벼운 전기자극(0.4 mA)을 사용하여 쥐들을 빨리 달리도록 자극 하였다. 실험 4일차에는, 벨트속도를 5분동안 10m/min의 속도로 설정하였고, 46m/min에 도달할 때까지 2분마다 2m/min의 속도를 증가시켰다. 쥐들은 체력이 지칠때까지(전기 자극에도 5초동안 움직이지 않음) 달리도록 허용되거나 또는 최대속도(maximal speed)에 도달 할때까지 달리도록 허용되었다. 쥐들이 지친 그 순간의 시간, 속도, 및 거리가 기록되었다. 일(Work)과 파워(power)는 아래 식을 통해 계산되었다: 일(J) =체중(kg) x 중력가속도(9.81m/s2) x 종방향속도(m/s x 경사도) x 시간(s). 파워 (w) = 일 (J) / 시간 (s).
모리스 수중 미로
모리스 수중미로(MWM) 실험은 직경 180cm, 높이 51cm의 무반사 실내 수영장에서 수행되었다. 수영장의 19-22℃의 수온을 가진 물로 채워졌고, 수영장은 4개의 구역(임의로 지정된 동, 서, 남, 북쪽 사분면)으로 나뉘어 졌고, 북쪽 사문면 중앙에는 원형 플랫폼(직경 20cm)이 수면 1.5cm 아래에 잠겼다(D'Hooge and De Deyn, 2001). 각 사분면(each quadrant)은 서로 다른 개체로 표시되었고, 쥐들에게 각 평가 시작전에 이 개채들을 보여주었다. 쥐들은 4 연속일 동안의 실제 평가 이전에 하루에 4번의 예비실험(각 사분면마다 1번씩 수행)을 통해 훈련하였다. 각각의 실제 평가는 4번의 예비실험과 유사한 구성을 가진다. 쥐들은 다른 시작위치에서 벽을 향한채 물에 부드럽게 배치되었고, 60초 이내에 플랫폼을 탈출하기 위해 자유롭게 수영할 수 있도록 허용되었다. 각 동물마다 플랫폼 탈출에 걸린 시간을 기록하였다.
오픈 필드 실험 (OFT)
오픈필드실험(OFT)은 이전의 연구를 수정하여 격자 표시(marked grids)가 있는 불투명한 직사각형 상자(32 cm (H) X 38 cm (W) X 52 cm (L))를 사용하여 수행하였다(Sprott and Eleftheriou, 1974). 각 동물들은 케이지에서 상자로 부드럽게 옮겨졌고, 연이은 3일 동안 매일 5분동안은 상자안을 자유롭게 탐색할 수 있도록 허용되었다. 중앙 및 외부 영역(central and outer zones)으로 진입한 수가 기록 되었다. 각 쥐들의 성과 (performance) 및 자취(trajectory)는 카메라(GoPro, California, 미국)를 사용하여 기록되었다.
T-미로
동물들은 T-미로 실험의 대상이며, T-미로는 3개의 암으로 구성되며, 이중 1개의 암은 벽이 없이 열린 암(open arm)이고, 2개는 벽으로 둘러쌓인 닫힌암(closed arm)이며 벽의 제원은 높이 40cm, 길이 50cm 그리고 폭 15cm 이다. 각각의 암은 지상으로부터 70cm 높이의 단단한 금속다리에 부착된다. 동물들은 실험의 시작점인 열린팔의 가장자리에 조심스럽게 위치된다. 특히, 실험은 두단계로 진행이 되면, 첫번째 단계에서는 닫힌 암에 음식을 올려놓고 동물들은 닫힌암중 하나에 들어갈 수있도록 60초동안 자유롭게 거닐도록 하였다. 들어간 직후에는, 판지(cardboard)를 사용하여 선택된 암을 떠나는 것을 방지하기 위해 동물들을 30초동안 방해하였다. 다음으로는, 동물들을 풀어주고, 두번째 단계의 실험을 진행하기 위해 시작점에 위치된다. 유사하게, 동물들은 닫힌암들중에 하나를 선택하고 들어가는데 60초가 주어졌다. 실험은 하루에 10번 반복되었고, 결과인 동물들의 정확한 입장한 횟수가 기록되었다.
ELISA 및 유전자 분석을 위한 해마 수집
쥐들이 희생되면, 모든 쥐들의 해마(hippocampus)를 즉시 절제하고 식염수로 헹구었다. 전체 RNA 분리(total RNA isolation)를 위한 조직 샘플(Tissue samples)은 RNAlater(Sigma, Missouri, 미국)에 보관되었으며, 조직 샘플은 실시간 PCR과 Multiplex ELISA의 추가 분석때 까지 -80℃에서 스냅 냉동(snap frozen)되고 보관되었다.
생화학적 분석
혈청 지질 프로파일(전체 콜레스테롤 (TC), 중성지방(TG), 저밀도 단백질 (LDL), 고밀도 지단백(HDL)), 간기능 프로파일(전체 단백질, 알부민, 글로불린, 일부민/글로불린 비율(AG ratio), 아스파르산 아미노전이효소(AST), 알라닌 아미노전이효소(ALT), 알칼리성 인산분해효소 (ALP), 전체 빌리루빈), 신장기능 프로파일(나트륨, 요소, 염화물, 칼류므 크레아티닌, 요산, 칼슘, 인산염) 대한 전혈(Whole blood)을 분석하였다. 수확된 조직(harvested tissue)은 실시간 PCR 및 ELISA 분석을 통해 유전자 발현 분석에 사용되었다.
간 조직학
샘플들은 자동조직처리기(Thermo Scientific TM Shandon Excelsior, 미국)를 사용하여 처리되었다. 그런 다음, 샘플을 파라핀 왁스(paraffin wax)에 고정하였고, cryotome를 사용하여 단면화하였다. 단면화된 샘플은 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)에 염색되어, 광학현미경(light microscope)으로 관찰 되었다.
배설물 샘플의 대사산물 검출
수용성 대사산물의 검출은 Tsugawa의 2011년 연구를 토대로 수행되었고, 여기서 샘플은 기체 크로마도크래피 질량분석기(GCMS) 분석전에 유도체화(derivatized) 되었다. 배설물 샘플에서 단쇄지방산(short-chain fatty acids)의 추출은 이전에 수행된 Nakajima의 2017년 연구를 토대로 수행되었다. 분석은 GCMS-TQ8030 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (Shimadzu, 일본)의 기체 크로마토그래피 텐덤 질량분석기 플랫폼을 사용하였다.
배설물 미생물군집 염기서열 및 분석
16S rRNA 유전자의 Vl-V2 (27F-338R)영역은 분리된 박테리아 DNA들을 사용하여 증폭되었다. PCR 산물(PCR products)은 이전에 진행된 Kato T의 2014년 연구를 바탕으로 제조 되었다. 16S rRNA의 시퀀싱(16S rRNA sequencing)은 제조사의 메뉴얼에따라 454 GS Junior를 사용하여 수행되었다. 결과적인 16S rRNA 판독은 QIIME 파이프라인 (QIIME pipeline)을 사용하여 분석되었다.
사람을 대상으로 한 임상연구
락토바실러스 플란타룸 DR7 및 위약 제품
DR7과 위약제품은 GN Pharmaceuticals Sdn. Bhd.(말레이시아, 슬랑호주)사에 의해 생산되었다. 제품에는 돼지 또는 소 성분(porcine or bovine ingredients)이 포함되어있지 않고, 그들은 GMP에 따라 제조 되었고, JAKIM(Department of Islamic Development Malaysia)으로 부터 할랄 인증을 받았다. 프로바이오틱 제품은 1 X 109 CPU/ sachet의 DR7과덱스트린(95%)을 첨가제(excipient)로 포함하고, 위약제품은 말토덱스트린(100%) 만 포함한다. 각 용량은 알루미늄 봉지(aluminum sachet)에 담은 담황색 분말(light yellow powder) 2 g 이고, 모든 제품은 맛이 동일하였다.
남성과 여성 참가자의 포함 기준(inclusion criteria)은 18세에서 60세 사이이며, 실험 기간동안 연구에 참여할 의지가 있어야 한다. 제외기준으로는 1형 당뇨병(type 1 diabetes), 중증 질환(severe illness)으로 인한 장기 투약(long-term medication), HIV/AIDS, 포도당 6-인산 탈수소효소 결핍증(glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency)등이 포함된다. Universiti Sains Malaysia의 임상연구에 대한 인간 피험자(human subjects)와 관련된 모든 절차는 JEPeM-USM Review Panel의 승인을 받았다. 연구전에 모든 피험자(all subjects)로부터 서면 동의를 획득하였다.
뇌연구를 위해, 피험자들은 코헨 스트레스자각 척도(Cohen's Perceived Stress Scale, PSS-10)에서 중간 정도의 스트레스 수준(a moderate stress level)을 가졌다(Cohen et al., 1983). 피험자들은 DASS-43 설문지(Lovibond and Lovibond, 1995)를 통해 스트레스, 불안 및 우을증을 기준점(0주차)에서 부터 4주간견(4주차, 8주차, 12주차)으로 평가하였다. 연구가 끝날때에는 (12주차), 모든 피험자의 기억력(memory)과 인지능력(cognitive functions)을 평가하기 위해 컴퓨터화된 CogState Brief Battery (CBB)를 사용하였다(Mielke et al., 2015).
상기도 감염(URTI)에 대한 연구에서, 피험자들은 2가지 종류의 설문지에 응답하였다: (i) 기본 인구통계 설문지 (0주차), (ii) 상기도감염의 발생을 기록하기 위해 4주마다 건강상태 설문지 (상기도감염 지속기간, 증상수, 질병 에피소드수). 모든 설문지는 영어, 중국어, 말레이어를 포함하는 3개의 언어로 검증되고 제공되었다(Lau et al., 2018a,b).
유전자 및 ELISA 분석을 위한 사람의 혈액 수집
혈액 샘플(Blood samples)은 스트레스 호르몬 코르티솔(cortisol), 인터루킨-1β, 4, 10(interleukin-l
Figure pct00002
,-4, and -10), 종양괴사인자 (TNF-α), 인터페론 (IFN-γ)의 농도를 ELISA통해 0주차와 연구가 끝날때인 12주차에 수집되었다. 도파민 β-수산화 효소 (dopamine hydroxylase, DBH), 티로신 수산화 효소(tyrosine hydroxylase, TH), 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(indoleamine 2,3-dioxygenase), 트립토판 2,3-디옥시게나아제-트립토판 수산화효쇼(tryptophan 2,3-dioxygenasetryptophan hydroxylase-2), 5-하이드록시트립토판 수용체6(5-hydroxytryptamine receptor-6)등과 같은 세로토닌과 도파민 경로(serotonin and dopamine pathway)와 연관된 유전자들은 실시간 PCR을 통해 분석되었다. 전혈 유전자 발현도는18S rRNA을 세포자멸(apoptosis)과 염증유전자에 대한 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)로 사용하여 수행되었다.
생화학 검사
적혈구(red blood cells, RBC) 샘플의 혈장막(Plasma membrane)과 용혈액 분획(hemolysate fractions)을 지질의 과산화(peroxidation) 및 항산화(antioxidant) 잠재력에 대하여 평가되었다. 지질의 과산화(peroxidation)와 황산화 잠재력은 적혈구 샘플의 혈장, 막, 용혈액에서 평가되었다. 적혈구 용혈액과 막은 이전에 기술된 바와 같이 획득되었다. 간략하게는, 전혈을 3500 X g 에서 20분동안 원심분리하여 혈장과 적혈구 펠렛(RBC pellet)을 분리하였다. 적혈구 펠렛을 등장성 Tris-HCl 완충액(isotonic Tris-HCl buffer)으로 세척하여 버피코트(buffy coat)를 제거하였고, 등장성 Tris-HCl 완충액에 재현탁한(resuspended) 다음 8000 X g 에서 4℃의 온도에서 20분동안 막이 무색(colorless)이 나타날때까지 여러번 원심분리 하였다. 마지막 무색 펠렛을 등장성 Tris-HCl 완충액으로 두번 헹구고 헤모글로빈이 없은(haemoglobin-free) 적혈구 막(RBC membrane)에서 수집하였다. 용혈액은 단계 전반에 걸쳐서 수집되고 모아졌다. 적혈구 샘플은 20 μL의 적혈구 펠렛(RBC pellets)을 기준으로 표준화 되었으며, 20 μL의 희석되지 않은 혈장(undiluted plasma)이 사용되었다. 지질 과산화는 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)생성을 측정함으로써 측정되었고, 항산화 잠재력은 FRAP(ferric­reducing/antioxidant power) 분석을 통해 측정되었다.
알츠하이머병에 관한 초파리 Drosophila melanogaster 연구
본 연구에서 사용된 모든 초파리 스톡(Stocks)은 Flybase(http://fybase.bio.indiana.edu)에 등록되어 있으며, 블루밍턴 초파리 스톡센터(Bloomington, 미국)에서 구입하였다: Oregon-R wild type (#5), Glass Multiple Reporter­ GAL4 (#1104) (Moses and Rubin, 1991), UAS-A 42 (#33769) (Sign and Mahoney, 2011). 모든 표적발현실험(targeted expression experiments)은 GMR­ Gal4를 사용하여 수행되었다. 야생형 대조군의 경우, Oregon-R을 GMR-GAL4와 교배하여 GMR-OreR을 생성한 반면, UAS-A 42을 GMR-GAL4과 교배하여 Aβ42을 발현하는 형질전환 초파리 계열의 GMR-Aβ42 (transgenic Drosophila line GMR-Aβ42)를 생성하였다. 스톡은 25℃에서 유지되었고, 교배는 29℃에서 유지되었다. 일반먹이(Normal feed)는 4% (w/v) 옥수수 전분(corn starch), 5% (w/v) 폴렌타(polenta), 10% (w/v) 흑설탕(brown sugar), 0.7% (w/v) 한천(agar), 5% (w/v) 열 사멸 효모(heat-killed yeast), 3% (w/v) 니파진(nipagin), 0.7% (w/v) 프로피온산 (propionic acid)등을 끓여서 일정하게 혼합하여 준비되고, 플라스틱 바이알(plastic vials)로 무균적으로 옮겨지기전에 냉각및 응고되어졌다. 모든 먹이는 니파진과 프롤피온산이 없는 상태에서 준비되었다. 100 μL의 락토바실러스 플란타룸 DR7을 1 x 1011 CFU/mL로 냉각된 먹이(cooled feed)에 응고(solidification)전에 첨가하고, 층류 후드(laminar flow hood)에 응고되도록 한다. DR7이 포함된 신선한 먹이(Fresh feed)는 응고후 2시간 이내에 지정된 초파리 계열에 공급되었다.
교배를 준비하기 위해, 동일한 부모계열의 5-10 마리의 처녀 초파리(Gal4 or UAS 계열)와 5-10 마리의 수컷 초파리(male Drosophila)를 플라스틱 바이알에 먹이와 함께 넣었다. 야생형 대조군 교배는 UAS-Aβ42 수컷과 교배한 Oregon-R 계통의 처녀암컷을 사용하여 수행되었고, GMR-Aβ42 교배에는 암컷 GMR-Aβ42와 교배한 처녀암컷 UAS-Aβ42를 사용하여 수행되었다. 대조군과 형질전환 GMR-Aβ42.nf 초파리 계열은 DR7이 포함되지 않은 정상먹이로 사육되었다 (표2). DR7을 투여한 그룹은 형질전환 GMR-Aβ42 초파리를 사용하였다. 부모 초파리(Parent Drosophila)는 교배후 4-5일 후에 제거되었다. F1 자손(Fl progenies)은 후속 분석(subsequent analyses)을 위해 각 그룹에서 교배후 10일후에 수집되었다.
초파리 계통과 투여 그룹 목록
초파리 계통 이름 공급된 프로바이오틱 균주 약어
OreR-GMR 공급안됨 야생형 대조군
GMR-Aβ42 공급안됨 GMR-Aβ42.nf
GMR-Aβ42 락토바실러스 플란타룸 DR7 GMR-Aβ42.DR7
각 그룹의 10마리의 자손(progenies)들은 0.1M 인산염 완충액(phosphate buffer)과 4% 포르알데히드(formaldehyde)를 함유한 4℃의 McDowell-Trump 고정액(McDowell-Trump fixative (Sigma-Aldrich))에서 밤새 고정되었다. 표본들은 인산염 완충액으로 세번 세척하고, 1% (w/v) 사산화오스뮴(osmium tetroxide (Sigma-Aldrich))에서 25℃에서 1시간 동안 고정되었다. 그 다음, 표본들은 증류소(distilled water)로 세척후, 50%, 75%, 95% 그리고 100% 의 에탄올(ethanol)에 차례로 각각 15분씩 탈수시켰다. 탈수된 표본들은 헥사메틸디실라잔 (hexamethyldisilazane, HDMS(Sigma))에 10분 동안 담그었다. 표본들은 데시케이터(desiccator)에서 밤새 공기 건조되었다. 건조 된 표본들(dried specimens)을 장착하고, 금으로 코팅하여 주사전자 현미경(SU8010; Hitachi Ltd., 일본)을 통해 관찰 할 수 있다. 초파리 눈(Drosophila eye)의 낱눈의 육각 구조(hexagonal arrangement of ommatidia)의 변형(modifications)을 기반으로 표현형 점수 (P-값)를 산출하는 이미지 J(Image J)를 통해 Flynotyper (https://flynotyper.sourceforge.net)라는 컴퓨터 기반의 방법을 사용하여 각 이미지로부터 눈 영역(Eye area)을 계산하였다(Yyer et al, 2018).
결과 및 결론
실시예 1: 락토바실러스 플란타룸 DR7이 상기도감염에 대한 항염증 및 면역조절 보호에 미치는 영향
사람을 대상으로한 임상시험의 결과
사람을 대상으로한 임상시험은 이중맹검, 무작위배정, 위약 대조 임상시험이었으며, 포함 및 제외 기준(inclusion and exclusion criteria을 확인 후 무작위 배정을 수행하였다. 실험 참여가 가능한 피험자들은 연구의 두 부분에 있어서 블록크기가 4인 나이(18-29, 30-39, 40-49, 50-60세)의 따라 계층화(stratified) 된후 컴퓨터로 생성된 블록 무작위표(blocked randomization list)에 따라 1:1의 비율로 무작위 배정 되어, 투약 코드와 함께 프로바이오틱 그룹(DR7)과 위약 그룹(말토 덱스트린)으로 할당 되었다. 무작위 배정은 피험자들과 접촉이 없는 통계학자에 의해 수행 되었다. 연구가 완료될때 까지, 연구팀의 어떤 구성원들도 무작위 배정 순서를 알 수 없었다.
표본의 크기는 하나의 예방군(one prevention arm)과 하나의 위약군(one placebo arm)을 포함하는 병행집단연구설계(parallel group study design)에 대하여 산출되었고 검정력 분석을 기반으로 한다. 이 연구에는 전체 피험자 124명이 필요했으며, 이 수는 각 그룹(DR7과 위약)의 62명과 추가적인 10% 의 탈락을 포함한다. 이 계산은 독립적인 대조군(independent control) 및 실험에 참여하는 피험자의 연속형 반응변수(continuous response variable)에 대한 필요성을 기반으로 하며, 대조군과 피험자의 비율(ratio of control to subject)을 1:1로 고정하였고, 확률(검정력)은 0.9이고, 0.05의 귀무가설(null hypothesis)의 이 시험과 연관된 제 1종 오류 확률(Type-I error probability)을 가진다. 이전의 데이터에 따르면 폐질환 및 증상(pulmonary diseases and symptoms)으로 인해 발생하는 질병의 지속기간을 줄이는데 프로바이오틱의 투여는 투약 그룹과 위약그룹의 차이를 1일로 감소시켰고, 각 그룹의 표준편차(standard deviation)로는 1.7일이 관찰되었다.
124명의 피험자중에서 13명의 피험자는 12주의 기간 중에 탈락하거나 또는 설문지응답 (answering questionnaires), 혈액샘플제공(providing blood samples)에 임하지 않았으며, 12주 간의 연구후에는 111명의 피험자만이 남게 되었다 (DR7: 56명, 위약:55명). 표3과 같이 청년층(30세 미만), 성인층(30~59세) 및 전체 모집단(overall populations)에 대하여 DR7 및 위약그룹의 피험자들의 일반혈액검사(full blood count)의 항목들과 대부분의 일반적인 특성에 있어서 유의미한 차이가 관찰되었고, 다만, 평균 적혈구 헤모글로빈(for mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)및 호염기구(basophils) 수치에서는 위약군의 피험자에서는 낮게 검출되었고, 호산구(eosinophils) 수치에서는 위약군에서 높게 나타났다.
락토바실러스 플란타룸 DR7 또는 위약을 사용한 12 주간의 이중맹검 시험에 무작위로 배정된 111명의 성인들의 일반적인 특성
기본 특성 나이<30세 P-value 나이>30세 P-value Total P-value
위약 DR7 위약 DR7 위약 DR7
표본 크기
(n)		 32 27 0.704 23 29 0.059 55 56 0.595
나이 24.9 ± 2.9 24.8 ± 2.8 41.7 ± 9.5 37.0 ± 6.0 31.1 ± 11.0 31.1 ± 7.8
헤모글로빈
(g/L)		 133.59 ±16.37 134.41 ±16.50 0.850 138.74 ±14.22 139.83 ±15.17 0.793 133.59 ±15.58 137.21 ±15.92 0.624
적혈구 수(Х
Figure pct00003
/L)		 4.93 ± 0.64 4.88 ± 0.59 0.758 5.03 ± 0.65 4.85 ± 0.49 0.264 4.97 ± 0.64 4.87 ± 0.53 0.345
적혈구 용적백분율 (L/L) 0.42 ± 0.04 0.41 ± 0.04 0.512 0.42 ± 0.04 0.42 ± 0.04 0.888 0.42 ± 0.04 0.41 ± 0.04 0.587
평균혈구용적(MCV; fL) 85.03 ± 7.59 84.11 ± 7.00 0.633 83.65 ± 7.99 85.69 ± 3.66 0.227 84.45 ± 7.72 84.93 ± 5.53 0.710
평균혈구혈색소
(MCH; pg)		 27.25 ± 2.48 27.74 ± 3.19 0.509 27.74 ± 3.00 28.83 ± 1.65 0.102 27.45 ± 2.69 28.30 ± 2.55 0.091
평균혈구혈색소
농도(MCHC; g/L)		 321.09 ±15.16 328.85 ±13.85 0.046* 332.17 ±15.07 336.38 ±9.63 0.227 325.73 ±15.96 322.75 ±12.34 0.011*
적혈구 분포폭(%) 13.81 ± 1.21 13.77 ± 1.46 0.927 13.68 ± 1.47 13.17 ± 0.93 0.130 13.75 ± 1.31 13.46 ± 1.24 0.229
백혈구 수
(Х
Figure pct00004
/L)		 7.38 ± 2.69 7.42 ± 1.71 0.946 7.16 ± 1.92 6.92 ± 1.92 0.661 7.29 ± 2.38 7.16 ± 1.82 0.757
중성구
(Х
Figure pct00005
/L)		 4.16 ± 2.11 4.34 ± 1.26 0.696 3.73 ± 1.46 3.80 ± 1.31 0.859 3.98 ± 1.86 4.06 ± 1.31 0.792
림프구(Х
Figure pct00006
/L)		 2.47 ± 0.83 2.24 ± 0.65 0.257 2.56 ± 0.8 2.25 ± 0.72 0.122 2.50 ± 0.76 2.24 ± 0.68 0.062
단핵구(Х
Figure pct00007
/L)		 0.53 ± 0.18 0.58 ± 0.16 0.297 0.59 ± 0.20 0.58 ± 0.23 0.899 0.56 ± 0.19 0.58 ± 0.20 0.512
호염구
(Х
Figure pct00008
/L)		 0.11 ± 0.11 0.16 ± 0.12 0.077 0.18 ± 0.17 0.28 ± 0.17 0.058 0.14 ± 0.14 0.22 ± 0.16 0.005*
호산구
(Х
Figure pct00009
/L)		 0.11 ± 0.25 0.07 ± 0.12 0.433 0.11 ± 0.12 0.03 ± 0.05 0.014* 0.10 ± 0.21 0.05 ± 0.09 0.079
혈소판(Х
Figure pct00010
/L)		 312.63 ±56.25 311.63 ±60.80 0.948 313.74 ±73.10 300.41 ±59.00 0.470 313.09 ±63.19 305.82 ±59.60 0.534
*p<0.05
DR7의 투여는 위약군과 비교하여 청년층에서 비강(nasal), 인두(pharyngeal), 일반 독감 증상(general flu symptoms)의 지속기간(duration)을 미미하게 감소시켰다 (p<0.10; 도 1A). DR7의 투여는 성인층에서 대조군과 비교하여 비강증상(p<0.05)의 지속기간을 상당히 감소시킨반면 상기도 감염(p<0.10)의 발생빈도(frequency of URTI)및 일반 독감증상의 지속기간은 미미하게 감소시켰다(도. lB). 모든 피험자들을 비교했을때, DR7은 비강증상 및 상기도 감염(p<0.05)의 발생빈도를 감소시킨 반면, 12주 동안 위약군과 비교시 인두증상 및 일반독감증상의 지속기간은 미미하게 감소시켰다(도 lC).
인터루킨-1
Figure pct00011
(interleukin-1β), TNF-α, IFN-γ과 같은 혈장 전염증성 사이토카인(Plasma pro-inflammatory cytokines)은 12주 동안 DR7 투여시 위약 투여와 비교하여 성인층(adults)에서 상당히 감소된 반면, DR7 투여는 위약투여과 비교하여 청년층(young adults)에서 오직 IFN-γ을 감소 시켰다(p <0.05; 도. 2A 와 2B). IL-4 와 IL-10과 같은 혈장 항염증성 사이토카인 (Plasma anti-inflammatory cytokines)은 12주 동안 DR7 투여시 위약 투여(p <0.05; 도. 2A 와 2B)와 비교하여 청년층에서 상당히 증가한 반면, 성인층에서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. 모든 피험자들을 비교했을때, 위약 투여와 비교시 DR7 투여는TNF-α, IFN-γ과 같은 혈장 전염증성 사이토카인을 감소 시키고, IL-4 와 IL-10과 같은 혈장 항염증성 사이토카인은 증가시켰다(p <0.05; 도 2C).
비록 DR7 투여가 위약과 비교하여 청년층의 혈장, 적혈구 막, 용혈액내 항산화 잠재력 (antioxidant potentials)에 영향을 미치지는 않지만(도. 3A), DR7 투여는 미미하게나마 성인층의 적혈구 막내 항산화 잠재력을 증가키셨고(p<0.10, 도. 3B), 모든 피험자들 대상으로는 12주 동안 위약 투여와 비교시 이 수치를 상당히 증가시켰다(p<0.05, 도 3C). DR7 투여는12주 동안 위약 투여와 비교시 청년층, 성인층 그리고 모든 피험자들의 혈장내 TBA에 의해 결정되는 MDA(malondialdehyde, MDA)의 농도를 현저히 감소시켰다 (p<0.05, 도. 3D, 3E, 3F). DR7 투여는 12주 동안 위약 투여어비교시, 청년층 및 모든 피험자들의 적혈구 막내의 TBA의 수치(levels of TBA)와 모든 피험자들의 적혈구 용혈액내의 TBA수치를 근소하게나마 감소시켰다(p<0.10, 도 3D, 3F).
DR7 투여는12주 동안 위약 투여와 비교시, 청년층의 CD44와CD117의 혈장 유전자 발현 (expressions of plasma genes)을 상향 조절(upregulated) 하였다(p <0.05, 도 4A). 이와 동시에 DR7 투여는12주 동안 위약 투여와 비교시 성인층의 성인층의 CD4와 CD8의 혈장 유전자 발현을 하향 조절하였다(p <0.05, 도 4B). 모든 피험자들과 비교시, 이러한 차이점들은 DR7과 위약 투여 피험자들사이의 유의미한 차이(insignificant differences)가 관찰되었을때, 이러한 차이점들은 사라졌다(도 4C). DR7 투약 그룹내 성인층의 혈장 CD44 와 CD117의 높은 발현과 혈장 CD4와 CD8의 낮은 발현은 위약 그룹과 비교하여 덜 활성화된 T-세포(T-cells)의 존재를 나타낸다. DR7 투여는12주 동안 위약 투여와 비교시 청년층의 NKp46 과 NKp30의 혈장유전자 발현을 하향 조절하였고, 성인층에서는 CD56, NKp46 과 NKp30의 혈장유전자 발현을 하향 조절하였고, 모든 피험자들에서는 CD56, CD94, NKp46 과 NKp30의 혈장유전자 발현을 하향 조절하였다 (p<0.05, 도 4D, 4E, 4F). 이것은 위약과 비교하여 비휴식 및 성숙한 NK-세포(non-resting and matured NK-cells)가 증가되었음을 나타낸다. 이러한 T-세포 NK-세포 유전자 발현은 DR7이 점막 상피 완전성(mucosal epithelial integrity)을 향상시켜, NK-세포의 선천 면역(innate immunity)의 1차 방어에 의해 충분히 약해진 항원(antigens)의 낮은 침투(lower infiltration)를 이끌어 내고 이로써 T-세포의 적응면역(adaptive immunity)은 덜 활성화된다.
도 5는피험자들의 임상 증상및 혈액 항목의 상관성을 나타내고 있다.
결론:
본 연구의 목적은 상기도 감염(URTI)에 대한 락토바실러스 플란타룸 DR7의 효과를 분석하고 면역조절 특성(immunomodulatory properties) 안에 내재된 가능한 메터니즘 (possible mechanisms)을 밝히는 것이다. 9 log cfu/day 양의 DR7 균주를 무작위배정, 이중맹검, 위약 대조 실험에 참가한 109명의 성인들에게 투여되었다. DR7의 투여는 위약투여와 비교하여 각각 4주 그리고 12주후에 상기도 감염의 발생빈도 및 비강 증상의 지속기간을 감소시켰다. DR7의 투여는 중년층(30-60세)에서 TNF-α, IFN-γ과 같은 혈장 전염증성 사이토카인을 억제하였고, 반면 청년층(30세미만)에서 IL-4 와 IL-10과 같은혈장 항염증성 사이토카인을 향상시키고, 위약투여와 비교하여 혈장 과산화(plasma peroxidation) 및 산화 스트레스 수치(oxidative stress levels)를 감소 시켰다. 위약 투여와 비교시, DR7을 투약받은 청년층에서는 혈장 CD44 와 CD117은 각각 4.5배, 2.22배 높은 발현을 나타내었다. 반면, DR7을 투약받은 중년층에서는 혈장 CD4 와 CD8은 각각 11.26배, 1.80배 낮은 발현을 나타내며 T-세포의 활성화(T-cell activation)가 적음을 나타내었다. 대조적으로는, DR7을 투여받은 모든 청년층과 중년층에서는 위약 투여와 비교시, 비휴식 및 성숙한 NK-세포(nonresting and matured NK-cells)가 증가되었음을 나타내었다. 따라서, DR7은 염증매개변수(inflammatory parameters)및 면역 조절 특성 개선을 통해 상기도 감염의 증상을 완화시킨다.
실시예 2: 스트레스, 불안, 기억력 그리고 인지 장애의 치료및 예방에 있어서 락토바실러스 플란타룸 DR7의 효과
동물실험 결과
고지방 식단 섭취와 함께 DR7과 스타틴을 투여한 그룹에서는 2일차 이후부터 미로내 머무르는 시간(latency time)이 감소한 반면, 대조군의 경우 4일차 이후부터 감소함을 나타내었다 (평균 차 -28.66%; 95% CI -45.89 to 11.48; P<0.05). 도. 6A와 같이 정상 식단 섭취를 한 어린쥐(평균차 -8.75; 95% CI -26.48 to 8.93) 및 노화쥐(평균차 -8.75; 95% CI -25.97 to 8.47) 그룹에서는 3일차 이후부터 머무르는 시간이 감소함을 나타내었다 (P<0.05). 이는 DR7을 투여한 쥐들이 더나은 기억력을 가지고 있고 숨겨진 플렛폼(hidden platform)을 찾는데 더 적은 시간을 사용하였음을 나타내고 있다.
오픈필드실험(open field test)를 통한 불안(anxiety)과 탐색(exploration)에 대하여 평가 한 결과, 거의 모든 그룹에서 3일간의 테스트 기간동안 외부지역(outer zone)으로 출입한 횟수에 변화가 없음을 나타내었고, 다만, 예외적으로 DR7 투약과 고지방 식단 섭취 및 D-갈락토오스섭취로 노화가 유도된 쥐(old HFD DR7) 그룹의 경우 2일차 이후부터 외부지역으로 출입횟수가 줄어들었음을 도. 6 B를 통해 나타났으며, 이는 불안함의 특성 (anxiety characteristic)이 줄어들었음을 나타낸다.
도 6C의 도표는 락토바실러스 플란타룸 균주 DR7을 투여한 동물들이 T-미로 실험(T-maze test)에서 정확한 출입횟수(number of correct entries)가 증가함을 나타내었으며, 이는 동물들의 기억력이 DR7을 투여후 향상됨을 나타내고있다.
사람을 대상으로 한 임상시험 결과
사람을 대상으로 한 임상시험 연구에서, DR7의 투여는 도.7에 나타난 바와 같이 DASS-42에 의한 평가 8주후에, 위약투여와 비교시 감소된 스트레스와 불안 수준(reduced stress and anxiety levels)을 나타내었다. 따라서, DR7은 불안과 스트레스 같은 덜 심각한 심리적 상태(psychological conditions)에 유익하다.
도 8에 나타난 바와 같이, 12주동안 위약투여와 비교하여, DR7의 투여는 정상 성인 집단(normal adult populations)의 기억력 및 인지 특성(cognitive traits)을 개선하였다.
결론:
PSS-10 설문지(PSS-10 questionnaire)를 사용하여 중간 정도의 스트레스 수준(moderate stress levels)을 기준으로 111명의 스트레스 받은 성인들을 모집하였다. 12주 동안 1X l09 cfu/day 양의 DR7 투여는 DASS-42 설문지(DASS-42 questionnaire)를 통한 평가에서, 위약군과 비교하여 스트레스와 불안 증상, 그리고 전체 심리점수(total psychological scores)가 빠르게는 8주차부터 감소함을 나타내었다. 혈장 코티솔 수치(Plasma cortisol level)는 위약군과 비교하여 DR7 피험자들 사이에서 감소하였고, 인터페론-γ 및 형질전환 성장인자-α(transforming growth factor-α)와 같은 혈장 전염증성 사이토카인 또한 감소를 동반하였고, 인터루킨10(interleukin 10)과 같은 혈장 항염증성 사이토카인은 증가하였다. DR7은 청년층의 위약투여군과 비교시, 성인층(30세 이상)의 기본적인 주의력, 정서적 인지 및 연관학습과 같은 인지 및 기억능력을 향상 시켰다. DR7의 투여는 혈장 도파민 베타 수산화효소(plasma dopamine β-hydroxylase, DBH) , 티로신 수산화효소 tyrosine hydroxylase(TH), 인돌아민2,3-디옥시게나아제(indoleamine 2,3-dioxygenase), 트립토판 2, 3-디옥시게나아제(tryptophan 2,3-dioxygenase)의 낮은 발현과 트립토판 수산화효소-2(tryptophan hydroxylase-2) 와 5-히드록시트립타민 수용체-6(5-hydroxytryptamine receptor-6)의 높은 발현에서 관찰되었듯이, 세로토닌 경로(serotonin pathway)를 향상시키는 반면, 12주간 위약투여와 비교시, TH와 DBH의 안정적인 발현(stabilised expressions)을 통해 관찰되었듯이 도파민 경로(dopamine pathway)를 안정화시켰다. 이러한 결과는 DR7이 FAO와 WHO의 권고사항에 따라 프로바이오틱 균주의 요구사항을 충족함을 나타내며, 스트레스를 받는 성인들의 정신적 기능 (psychological functions), 인지 건강(cognitive health) 그리고 기억력(memory)등을 향상시키는 자연스러운 전략으로 적용할 수 있다.
실시예 3: 알츠하이머병의 신경전달물질인 세로토닌 과 도파민 경로 향상, 고관절염증 및 세포사멸에 대한 락토바실러스 플란타룸 DR7의 효과
동물실험 결과
DR7의 투여는 GABA(도 9A), 도파민(도 9B) 또는 노르에피네프린(도 9C)의 신경전달물질 경로(neurotransmitter pathways)를 따라 어떠한 효과도 발휘하지 않았다. 그러나, DR7을 투여한 쥐들중 고지방식단및 D-갈락토오스 섭취를 통해 노화가 유도된 쥐들(aged HFD rats)은 대조군(평균차 -1.56; 95% CI -2.88 to - 0.24; P<0.05; 도. 9E, 9F)과 비교시, IDO의 발현이 감소하고, TPH1의 발현이 증가한 반면, 스타틴(statin)은 TPH1의 발현을 증가시켰다. 이는 DR7이 세로토닌 경로(serotonin pathway)를 통해 고지방 식단 및 D-갈락토오스 섭취를 통해 노화가 유도된 쥐들(aged HFD rats)에 불안 완화 효과(anxiety-alleviating effect)를 발휘할 수도 있다는 것을 보여주었다.
사람을 대상으로한 임상시험 결과
사람을 대상으로하는 임상연구에서는, DR7의 투여는 12주 동안 청년층의 위약 투여와 비교시, 노르에피네프린 생산에 중요한 도파민 베타 수산화효소(dopamine β-hydroxylase, DBH)와 트립토판 2, 3-디옥시게나아제(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO)의 낮은 발현을 통해 스트레스와 불안 수준을 낮춘반면, 인지능력을 향상시키는 세로토닌 경로와 연관된 트립토판 수산화효소-2(tryptophan hydroxylase-2, TPH2)와 5-히드록시트립타민 수용체-6(5-hydroxytryptamine receptor-6, 5-HT6)의 발현을 증가시켰다 (도. 10A). DR7이 12주간 위약 투여와 비교시 DBH, TH, IDO, TDO의 발현을 낮추고 TPH2의 발현을 증가시킨 것과 비슷한 경향이 정상적인 성인 집단에서도 관찰되었다(도 10B). 모든 피험자들에서, DR7의 투여는 12주동안 위약 투여와 비교시 DBH, TH, IDO 그리고 TDO의 발현을 낮추는 반면, TPH2 및 5-HT6의 발현을 증가시켰다(도 10C).
초파리 눈 모델 연구 결과
초파리 눈은 광 수용체(photoreceptors)와 보조세포(accessory cells)로 구성된 단순한 신경외배엽(neuroectoderm)이기 때문에 발달 신경 생물학자(developmental neuro-biologists)에게는 이상적인 조직(ideal tissue)이다. 각각의 눈은 낱눈(ommatidium) 이라고하는 800개의 육각형의 단위로 이루어져 있으며 벌집의 벌집모양 세포(honeycomb cells)와 유사한 결정 배열로 배열되어 있다. 낱눈은 전체적으로 오목하고(concave) 달걀 모양(egg-like shape)을 형성하기 위해 눈을 가로질러 종으로(in columns) 배열된다. 특한정 각도로 위치한 각 같눈의 교대정점(alternate vertice)에서 튀어나온 기계감각적 강모(mechanosensory bristles)는 두번? 감각장(second sensory field)을 제공한다. pan-retinal GMR-GAL4 driver를 사용하여 겹눈에서 인간의 αβ42(human αβ42)의 이소성 발현은 거친 눈표현형(rough eye phenotype, REP)을 특징으로하는 강력한 신경 퇴행성(neurodegenerative phenotype) 표현형을 초래하였다. 대조군 OreR-GMR와 비교시(도. 11A, 11B), GMR-A 42.nf 성인의 눈은 전체 눈이 유약된 외형(glazed appearance)을 보이게 하는 다중구멍(multiple holes)으로 묶인 결합된 개별 눈 단위를 보이며 심각하게 왜곡되었다(도. 11C, 11D). 낱눈사이의 강모(inter-ommatidial bristles)는 그 수가 감소한 반면, 눈에 있는 강모들은 임의의 각도(random angles)를 하고 있다.
DR7의 투여는 GMR-Aβ42의 눈의 왜곡을 다양한 각도에서 역전 시킬수 있었으며, 대조군과 거의 동일하였다. 낱눈은 결합된 개별 단위 또는 관찰 가능한 구멍이 없는 기존의 육각형 구조를 지님을 추정하였다. 추가적으로, 강모의 수(number of bristles)는 상당히 증가하였고, 강모의 각도(angles of the bristles) 또한 어느정도 수정되었다. 초파리 눈의 형태학적 결함(morphological defect)의 정량화는 Flynotyper 소프트웨어를 이용하였고, 이 소프트웨어는 각눈의 표현형 점수(P-값)를 산출해 낸다. 더 높은 P-값은 낱눈 배열(ommatidia arrangement)의 증가된 무실서(increased disorderliness) 또는 변경된 대칭(altered symmetry) 그리고 눈 표현형의 증가된 심각도(severity)를 나타낸다. SEM 이미지 (도. 11A-F)에 상응하여, GMR-Aβ42.nf의 P-값은 야생형 대조군(Wild type Control)보다 상당히 높았으며(p=0.0355), 이는 DR7의 투여를 받지 않는 초파리 눈에 대한 Aβ42의 부정적인 영향을 의미한다. DR7의 투여는눈의 P-값을 현저하게 감소시켰고, 이는 DR7이 초파리의 GMR-Aβ42로 유도된 신경퇴행(neurodegeneration)의 개선에 영향을 주었음을 시사한다.
동물실험 결과
고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취를 통해 노화가 유도된 쥐들에게 스타틴과 DR7 투여는 도. 12에 나타난 바와 같이, 세가지 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 해마 농도(hippocampal concentrations)를 모두 감소 시켰다(평균차5.62; 95% CI 1.78 to 6.11; P<0.05). 높은 수치의 혈장 TNF-a는 알츠하이머병을 가진 노화된 쥐에서 보고되었으며, 이는 치매(dementia)의 발병에 있어서 중요한 역할을 하며, IL-6 and TNF-a의 증가된 수치는 인지능력(cognitive performance) 저하의 잠재적 지표(potential markers)로 지목되었고, IFN-g 수치는 노화중(during ageing)에 증가함이 발견되었다.
사람에 대한 임상시험 결과
사람을 대상으로 한 임상연구에서, 노화 및 세포사멸 유전자(senescing and apoptotic genes) 조절을 통해 해마(hippocampus)에서 신경세포 사멸(neuronal apoptosis)을 감소 시켰다(도 13). BCL-XL, BAX 그리고 CAS9 유전자는 세포사멸(apoptosis)과 DNA 손상(DNA damages) 과정을 통제한다(도. 13G). old HFD 그룹은 old ND 그룹과 비교시, BCL-XL, BAX, CAS9 유전자의 높은 발현을 나타내었고, 이는 고지방 식단에 의해 유발된 세포사멸과 싸우고 통제할 필요가 있음을 나타내고있다. DR7과 스타틴 투여 직후에는 이 유전자들의 낮은 발현이 관찰되었고, 이는 DR7과 스타틴이 낮은 세포사멸과 낮은 산화 스트레스(oxidative stress) 조건에서 이 유전자들을 상향 조절할 필요성을 감소시킴을 시사한다.
DR7은 도 14에서 나타난 바와 같이, 12주 동안 청년층에서 항염증성 사이토카인을 증가시키고 전염증성 사이토카인은 감소시키는 반면, 일반 성인층에서는 전염증성 사이토카인만을 감소시켰다. 스트레스가 종종 염증반응(inflammatory responses)을 유발하기 때문에, DR7은 청년층의 감소된 염증 매개변수(inflammatory parameters)와 관련하여 스트레스 수준을 감소 시킬수 있는 반면, 정상적인 성인에서는 스트레스와 염증 매개변수 모두가 덜 감소한 것으로 관찰되었다.
결론:
쥐들을 대상으로 실시된 연구에 따르면, DR7의 투여는 행동평가(behavioural assessments) 에서 aged­HFD 그룹의 쥐들이 향상된 기억력(enhanced memory)과 불안감(anxiety) 감소를 나타내었다. 세가지 전 염증성 사이토카인의 해마농도는 노화중에 증가했지만 스타틴과 DR7의 모두 투여시 감소하였다. 해마의 신경전달물질 및 세포사멸 유전자의 발현은 IDO 및 P53의 발현을 감소시키고, DR7을 투여한 aged-HFD그룹의 쥐들에서는 TPH1의 발현을 증가시켰으며, 이는 DR7이 세로토닌과 산화적 노화(serotonin and oxidative senescence)의 경로를 따라 잠재적 효과(potential effects)가 있음을 나타낸다. 따라서, 이는 락토바실러스 플란타룸 DR7이 노화중에 인지기능을 향상시키는 유망한 식이전략(dietary strategy)임을 나타낸다.
이는 또한 노랑초파리 AD모델(Drosophila melanogaster AD model)에 DR7 섭취를 통해 DR7 균주의 잠재적 AD-반전 효과(AD-reversal effects)를 나타내었다. 프로바이오틱 균주(probiotic strains)의 투여는 AD-유도된 초파리에서 보여지는 거친 눈 표현형(rough eye phenotype, REP)을 치유 할 수 있으며, 락토바실러스 플란타룸 DR7 투여시에는 보다 두드러진 효과가 관찰되었다.
실시예 4: 락토바실러스 플란타룸 DR7은 대사산물 HICA 와 PLA의 생산을 통해 건강상의 이점을 발휘한다
AMPK는 많은 생물학적 경로(biological pathways)와 신진대사(metabolisms)를 제어하는 중요한 생물학적 스위치(biological switch)이므로, 다양한 건강상의 이점을 담당하는 DR7의 잠재적 대사산물(potential metabolites)을 식별하는 표적(target)으로 사용되었다. 본 연구는 DR7의 대사산물에 의한 AMPK 인산화(phosphorylation)의 활성화를 확인하기 위해 수행되었다. 본 연구에서 DMEM은 대조군으로 사용되었고, 락토바실러스 플란타룸 DR7의 대사산물의 지질 분획, 단백질 분획 및 다당류 분획과 비교하였다. 도 15A에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸 DR7 대사산물의 지질분획이 가장 높은 AMPK 인산화 활성을 나타낸것에 주목을 해야하며, 이는 지질 분획이 대사산물의 AMPK 인산화에 많은 책임이 있을 시사한다. 지질 분획은 추가적으로 정제(purification), 특성화 (characterization) 및 확인되었다. 도 15B에 나타난 바와 같이, crude DR7의 무세포 상층액은 상업용 AMPK 활성화제인 AICAR과 동등한 인산화 활성을 나타내었다. 한편, 락토바실러스 플란타룸 DR7의 대사산물의 유효성(effectiveness)은 상업용 AMPK 억제제인 화합물 C(Compound C) 와 화합물 C가 첨가된 무세포 상층액의 인산화 활성을 비교하여 확인 되었다. crude DR7의 무세포 상층액은 AMPK 인산화 활성을 AICAR과 유사한 수준으로 증가시키는 반면, 화합물 C의 첨가는 활성을 감소시킨다.
GC-MS 분석을 통해 측정된 락토바실러스 플란타룸 DR7 대사산물의 지질 분획은 블랭크 비발효 MRS 배지(blank unfermented MRS medium)와 비교하여 상이한 피크 프로파일(peak profiles)을 나타내고 있다(도 16). 크로마토그램 (b)에서 두개의 상당한 강도의 피크(peaks)는 HICA 와 PLA의 존재를 나타내고 있다. DR7 이 노화방지 효과(anti-ageing effects)를 보였기 때문에, HICA 와 PLA가 이러한 노화 방지 효과를 담당하는 대사산물일 가능성이 높다.
DR7이 이 두가지 대사산물을 생산할 수 있음을 증명하기 위해, 생산 경로를 평가하였다. 류신(Leucine)은 효소 HaDH(enzyme HaDH)의 작용을 통해 KICA로 부터 전환시, HICA 형성에 대한 전구체(precursor)이다. HaDH 유전자는 DR7의 전체 게놈 서열(whole genome sequence)에 존재함이 밝혀졌다(protein ID AYA79606.1). 페닐알라닌 (Phenylalanine)은 효소 HPT, LDH, AAT의 작용을 통해 PPA로 부터 전환시, PLA 형성에 대한 전구체이다. HPT(protein ID AYA81108.1), AAT (protein ID AYA79202.1), LDH(protein ID AYA79316.1)에 대한 유전자들은 DR7의 전체 게놈 서열에 존재함이 밝혀졌다. 이러한 유전자의 존재와 FAME 분석(FAME analysis)을 통한 HICA 와 PLA의 검출은 DR7이 HICA 와 PLA을 대사산물로서 생산할 수 있는 잠재력을 확인시켜 주었다.
실시예 5: 텔로미어 단축 방지 및 노화에 대한 에너지 대사 증진에 대한 락토바실러스 플란타룸 DR7의 효과
12주 간의 투여후 수집된 쥐들의 혈액으로 부터 측정된 텔로미어 길이(Telomere length)는 도 17에 나타난 바와 같다. D-갈락토오스(D-galactose)를 통해 노화가 유도된 쥐(aged rats)들은 어린 쥐들과 비교시 상당히 짧은 텔로미어 길이(P < 0.05)를 가짐을 나타내었다. 한편, DR7과 스타틴이 투약되지 않은그룹(non-treated aged group)은 aged-statin과 aged­ DR7 그룹과 비교하여 현저하게 짧은 텔로미어 길이(P < 0.05)를 가짐을 관찰되었다.
운동부하검사(Treadmill exhaustion test)는 12주간의 투약후 쥐들의 지구력(endurance capacity)을 평가하기 위해 실시되었다. 피로치가 최대 지구력(maximal endurance capacity)에 도달할까지의 달린시간 (Running time), 거리(distance), 최대속도(highest speed)등이 기록되었다. 도 18에 나타난 바와같이, aged 그룹(aged group)은 young 그룹(young group)과 비교시, 현저하게 낮은 지구력(거리, 달리기 지속 시간, 속도, 일, 파워; P < 0.05)을 나타내었다. 결과는 aged-DR7 그룹(aged-DR7 group)이 aged 그룹(aged group) 과 비교시, 일과 파워 측면에서는 상당히 높은 지구력(P < 0.05)을 가짐을 나타내었다. aged-DR7그룹(aged-DR7 group)의 달리기 지속 시간과 속도는 상당히 높았으며, 이는 aged 그룹(aged group)에 비해 더 높은 달리기 거리(P < 0.05)를 동반하였다.
결론:
수컷 Sprague-Dawley 쥐들에게 매일 고지방 식단(54% kcal 지방)을 섭취시키고, D-갈락토오스(D-galactose) 주입을 통해 12주 동안 노화(ageing)를 유도하였다. DR7 균주가 텔로미어 길이(telomere length), 혈장 지질 과산화(plasma lipid peroxidation), 간 AMPK 발현(hepatic AMPK expression) 및 근육성능(muscle performance)과 같은 연련 관련 장애(age-related impairment)에 미치는 영향을 평가하였다. 락토바실러스 플란타룸 DR7(LP-DR7)과 균주의 투여는 텔로미어 단축을 감소시키고, AMPK subunit-α2의 발현을 증가시켰다. AMPK subunit-α1은 대조군과 비교시, LP-DR7을 투여한 쥐들에서 상승하였고, 스타틴은 그러한 효과를 나타내지 않았다. 이와 유사하게, DR7의 투여는 달린거리, 지속시간, 속도, 힘 그리고 파워등의 증가를 통해 근육 성능을 향상시키는 반면, 스타틴은 이러한 효과를 나타내지 않았다. 본 연구는 노화 쥐 모델을 대상으로한 생체내 실험을 통해, DR7 균주가 연련관련장애의 완화에 있어서 잠재력이 있음을 나타내었다.
실시예 6: 락토바실러스 플란타룸 DR7이 증가하는 중성지방 수치, 염증 및 지질 축적에 대하여 간지질과 에너지 대사에 미치는 영향.
락토바실리 균주(Strains of lactobacilli)를 콜레시테롤 동화 특성(cholesterol assimilation properties)을 기준으로 스크리닝하면서 대조군과 비교하였다(도 19A; p<0.05). 락토바실러스 플란타룸 DR7은 콜레스테롤 미셀(cholesterol micelle)을 포함하는 배양배지(culture media)에서 전체 콜레스테롤(total cholesterol)을 더 많이 감소시킴을 나타내었고, 따라서 후속분석(subsequent analyses)을 위해 선택되었다. DR7의 CFS는 대조군과 비교하여 HT-29세포(p<0.05)에서 콜레스테롤 축적(cholesterol accumulation) 을 현저하게 감소시켰고 (도 19B, 19C), 또한 HepG2세포(약 19.7%; p<0.05)에서 콜레스테롤 축적을 감소시켰다. 락토바실러스 플란타룸 DR7의 CFS (CFS-DR7) 는 HT-29세포와 HepG2세포 모두에서 콜레스테롤 축적을 감소시키므로, 추가분석을 위해 선택되었다. 간은 콜레스테롤 항성성(cholesterol homeostasis)을 조절하는 주요 장기이기 때문에, CFS-DR7의 농도는 HepG2세포에서의 콜레스테롤 축적 및 HMGCR mRNA(콜레스테롤의 체내합성을 담당하는 속도제한 효소)의 발현에 대한 평가시 상이하였다. 테스트된 농도는 10%에서 50% (v/v)까지 다양했으며, 50% 이상의 농도에서는 세포 사멸때문에 그보다 더높은 농도는 시험에 불가능하였다 (데이터에 표시되지 않음). 1μM의 로바스타틴(Lovastatin)은 양성 대조군(positive control)으로 포함되었다. 모든 농도의 실험에서, HepG2 세포에서의 콜레스테롤 축적은 현저하게 줄어들었으며, 로바스타틴과 비교시 유사한 효과를 나타내었다(도 19D; p<0.05). 그러나, HMGCR mRNA의 유전자 발현 감소는 30% 이상의 CFS-DR7의 농도에서만 유의미 하였다(도. 19E; p<0.05). 따라서, 30% 농도의 CFS-DR7가 모든 후석 분석에서 사용되었다. CFS-DR7의 AMPK 억제제(음성대조군으로서 1μM의 화합물C) 와 AMPK 활성화제(양성대조군으로서 1mM의 AICAR) 존재하에 HMGCR mRNA의 유전자 발현에 대한 효과를 연이어서 평가하였다. 30% 농도의 CFS-DR7을 37℃에서 3시간 배양시 대조군과 비교하여 HMGCR mRNA(p<0.05)의 유전자 발현을 현저하게 감소시켰다. 이러한 감소는 양성대조군(1mM의 AICAR; p<0.05)과 비교시 통계적으로 훨씬 큰 반면, 1μM의 로바스타틴은 HMGCR의 mRNA(p<0.05) 발현에 무의미한 변화만를 나타내었다. 반면, 1μM의 화합물C는대조군과 비교시 HMGCR의 mRNA(p<0.05) 발현을 현저하게 증가시켰다. 1μM의 화합물C의 존재하에 HepG2 세포와 함께 CFS-DR7의 투여시 대조군 (p<0.05)과 비교하면 HMGCR의 mRNA(p<0.05) 발현이 상당히 높게 나타났으며, 이는 CFS-DR7의 줄어든 효과를 나타낸다. 우리는 AMPK의 증가된 발현을 통해 CFS-DR7가 HMGCR의 발현을 조절할수 있다는 가설을 세웠다. 그러나, CFS-DR7가 AMPK의 발현에 영향을 미치지 않았고 (도 19G), 이는 조절이 전사적 수준(transcriptional level)을 넘어 섰음을 나타낸다. 따라서, 우리는 AMPK의 인산화에 대한 CFS-DR7의 효과를 추가로 조사하였다. 일반적으로, AMPK의 인산화는 효소의 활성화(activation of the enzyme)를 이끌어 내는 반면, 탈인산화(dephosphorylation)는 효소를 비활성화한다. 현재의 데이터에 따르면, CFS-DR7은 AMPK의 인산화를 잘확립된 AMPK 활성화제(AICAR; 도. 18H)와 유사한 수준으로 현저하게 증가시킨 반면, AMPK 억제제(화합물C)는 이러한 효과를 감소시킨다. 또한 CFS-DR7은 AMPK의 인산화(p<0.05)를 1mM의 로바스타틴 보다 높은 수준으로 증가시킨다. 여기에서, 우리는 AMPK의 인산화와 연관된 경로를 표적으로하는 DR7의 CFS를 사용하여 콜레스테롤 대사의 변화(alteration of cholesterol metabolism)를 보고하였다.
DR7은 체외에서 지질 대사를 조절하는 큰 잠재력을 보여주었기 때문에, DR7을 사용하여 동물을 대상으로한 연구를 수행하였다. 도 19I에는 혈청 중성지방(Serum triglyceride, TG)의 수치가 도시되어 있다. 결과는 쥐들이 고지방 식단을 섭취시, 중성지방의 수치가 현저하게 증가하였다(P < 0.05). 오직 HFD-DR7 그룹의 경우 HFD 그룹과 비교시, 낮은 중성지방 수치(P < 0.05)를 나타내었다. TG는 비 알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 뿐만 아니라 CVD 및 당뇨병(diabetes)에 대한 강력한 지표(strong marker)로 인식된다.
SCD1(Strearoyl-CoA desaturase 1)은 단일 불포화 지방산(mono-unsaturated fatty acids, MUFA) 합성을 촉진시키는 효소이며, 간 지질 합성및 산화(hepatic lipid synthesis and oxidation)를 조절하는 중요 제어점(critical control point)이다. SCD1 효소는 HFD 그룹과 비교시, HFD-DR7 그룹에서 상당히 하양조절 되었다(P < 0.05). 따라서, 락토바실러스 플란타룸 DR7은 SCD1 유전자 발현의 하향 조절을 통해 TG를 감소시키는 효과(TG lowering effect)를 발휘할 수 있다. IL6의 유전자 발현은 ND 그룹과 비교시, HFD 그룹에서 현저하게 낮아졌고(P< 0.05), 락토바실러스 플란타룸 DR7의 투여는 IL6의 유전자 발현을 현저하게 상향조절하였다(P < 0.05; 도 20B). ABCG5과 ABCG8은 간으로 부터 스테롤 배설(sterol excretion)을 증가시키는 이종이량체(ABCG5/G8)로서 기능을 하는ABC 수송체(ABC transporters)의 절반 크기이다. 고지방 식단은 ABCG5과 ABCG8의 mRNA 발현을 크게 감소시킨 (P<0.05; 도 20C,D) 반면, 락토바실러스 플란타룸 DR7(P<0.05)의 투여는 ABCG5과 ABCG8의 mRNA 발현을 크게 향상시켰다.
SR-Bl 과 LDL-R의 발현은 ND 그룹과 비교시, HFD 그룹에서 현저하게 낮았다(P<0.05; 도. 21A, 21B). HFD-DR7 그룹은 SR-Bl 과 LDL-R(P<0.05)의 현저하게 높은 발현을 나타내었다. ND 그룹과 HFD 그룹 비교시, ABCAl의 mRNA 발현에 있어서 무의미한 변화를 나타내었다. HFD 그룹과 비교시 HFD-statin과 HFD-DR7 그룹에서 ABCAl의 높은 발현(P < 0.05)이 있음이 관찰되었다 (도 21C). statin과 HFD-DR7 그룹은 HFD 그룹과 비교시, Apo-A1의 수치를 증가시켰다 (도 21D).
AMPKαl 및 AMPKα2의 mRNA 발현은 ND 그룹과 비교시, HFD 그룹에서 현저하게 줄어들었다(도 22). HFD-DR7 그룹은 HFD 그룹과 비교시, AMPKαl 및 AMPKα2의 상당히 높은 발현을 나타내었다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸 DR7은 SCD1 유전자 발현을 하향조절 하여 AMPK를 활성화 시킬 수도 있다.
도 23은 ND 그룹과 비교하여, HFD 그룹에서 IL-4가 상당히 증가하였다는 것을 보여주었다. HFD 그룹과 비교할 때, HFD-statin 과 HFD-DR7은 더 낮은(P<0.05) IL-4 레벨을 가졌다.
ND 그룹과 비교하였을 때, HFD 그룹에서 더 높은 수준의 지질 축적과 덜 조직화된 구조가 관찰되었다(도 24 A, 24B). HFD-statin 과 HFD-DR7 그룹은 HFD 그룹과 비교시, 낮은 지질 축적을 나타내었다(도 24 C, 24D). HFD-DR7 그룹은 다른 그룹들과 비교하여 잘 조직된 구조(better-organized structure)를 나타내었다.
결론:
락토바실러스 플란타룸 DR7의 무세포 상층액(CFS)은 콜레스테롤을 동화시키는 능력이 더 높고, HepG2 및 HT-29의 콜레스테롤 축적을 감소시켰으며, HepG2에서 HMGCR의 mRNA 발현을 낮추었다. HMGCR 발현의 감소는 AMPK 억제제의 존재하에 감소되었으며, 이는 락토바실러스 플란타룸 DR7이 AMPK 경로를 통해 그 효과를 발휘하였고, 전형적으로는 HepG2의 AMPK의 mRNA 발현 대신에, AMPK의 인산화를 통해서이다. 락토바실러스 플란타룸 DR7은 AMPK 경로를 따라 콜레스테롤 저하특성 (cholesterol lowering properties)을 발휘할 수 있음을 나타내며, 구체적으로는 HMGCR의 발현을 낮추는 AMPK의 인산화를 통해서이다.
DR7은 노화된 쥐들에서 AMPK의 활성화를 통해 고지혈증(hyperlipidemia) 및 간 지방증(liver steatosis)을 완화하는 것에 대하여 테스트 되었다. 수컷 Sprague- Dawley 쥐들은 고지방 식단을 섭취하고 12주 동안 매일 D-갈락토오스를 주입하여 노화를 유도하였다. 다음과 같은 투약을 포함한다: i) normal diet, ii) HFD, iii) HFD-statin (lovastatin 2 mg/kg/day), iv) HFD­ Lactobacillus plantarum DR7 (10 log CPU/day). DR7의 투여는 HFD 대조군과 비교하여 12주후에 혈청 중성지방의 수치를 감소시켰다. DR7의 투여로 부터 두드러진 효과가 관찰되었고, 대조군과 비교하여, 간 유전자 발현에서 간 조직학에 이르기까지; 간 지질 합성 및 산화 유전자 SCD1의 하향조절; ABCG5 및 ABCG8의 간 스테롤 배설 유전자의 상향조절; 간 지방증의 정도 감소; 간 에너지 대사 유전자 AMPKαl과 AMPKα2의 상향조절등의 긍정적인 효과도 관찰되었다. 종합해보면, 이 연구는 DR7 균주가 지질 대사와 에너지의 활성화를 통해 지질 프로파일을 개선함을 나타내었으며, 이는 심혈관계 및 간 질환(cardiovascular and liver diseases) 완화를 위한 전도유망하고 자연적인 중재임을 시사한다.
실시예 7. 락토바실러스 플란타룸 DR7이 장내 세균 집단과 대사산물 농도의 불균형에 대한 장 조절에 미치는 영향
악티노박테리아(Actinobacteria)는 HFD 유무에 관계없이 노화시 감소되었다(P<0.05; 도. 25a). DR7의 투여는 고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취를 통해 노화가 유도된 쥐(P<0.05) 들에서 이러한 감소를 방지하였다. Bifidobacterium의 주요 속(genus)을 가진 악티노박테리아 는 종종 더 건장한 장내 미생물 프로파일과 관련이 있다. 따라서, DR7은 노화된 쥐들의 장내에서 이러한 특성을 향상시켰다. 박테로이데테스(Bacteroidetes)는 young-ND 그룹과 비교시, aged-ND 그룹에서 더 높은 (P < 0.05) 반면, 후벽균(Firmicutes)은 모든 투여 그룹에서 유의미한 차이가 없었다(도. 25b, 25c). D-갈락토오스 유도는 F/B 비율 (Firmicutes/ Bacteroidetes)을 크게 감소시킨(P < 0.05) 반면, DR7의 투여는고지방 식단과 D-갈락토오스 섭취를 통해 노화가 유도된 쥐들의 F/B 비율을 young-ND 그룹과 유사한 수치만큼 증가시켰다(도 25d).
고지방 식단을 섭취한 쥐들은 배설물 샘플에서 아세테이트(acetate) 농도를 현저히 감소시켰다. 스타틴과 락토바실러스 플란타룸 DR7을 투여한 그룹들은 배설물에서 상당히 높은 아세테이트 농도를 나타내었다(도 26). 아세테이트는 혈장(plasma) 및 간 지방산 함량(hepatic fatty acid content)을 줄이고 콜레스테롤을 낮추며 잠재막으로 인슐린 민감성(insulin sensitivity)을 개선하는 것으로 보고되었다. 또한 아세테이트는 병원성(pathogenic)을 억제하는 내강 pH(luminal pH)의 감소를 통해 장벽기능(gut barrier function)을 유지한다고 보고된 바 있다.
장내 미생물(gut microbiota)에서 유래한 대사산물(Metabolites)은 인간의 건강과 질병에 직접적인 역할을 할 수 있다. 일반적으로, 락토바실러스 플란타룸 DR7의 투여는 숙주 아미노산의 항상성(host amino acid homeostasis)과 건강에 중요한 트립토판(tryptophan), 류신(leucine), 티로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 메티오닌(methionine), 발린(valine) 및 라이신(lysine) (도. 27) 등과 같은 필수 아미노산(essential amino acids)의 배설물 함량(fecal content)을 높이는 것으로 관찰되었다. 도 28에 나타난 바와 같이, DR7의 투여는 장내 미생물 분포(gut microbiota distribution)에 변화(shift)를 일으켰다.
결론:
수컷 Sprague-Dawley 쥐들은 고지방 식단을 섭취하였고 12주간 D- 갈락토오스를 투여하여 노화를 유도하였다. 락토바실러스 플란타룸 DR7 투여가 배설물 미생물군 프로파일(fecal microbiota profile), 단쇄 지방산(short-chain fatty acids) 및 수용성 화합물(water-soluble compounds)에 미치는 영향을 분석하였다. 균주의 투여가 장내 미생물의 다양성(gut microbiota diversity)과 구성을 변화시키는 것으로 밝혀졌으며, 심지어 문 수준(phylum level)과 배설물 대사산물 프로파일(fecal metabolites profiles)에서도 변화시키는 것으로 나타났다. 배설물의 수용성 대사산물(water-soluble metabolites) 분석결과, 락토바실러스 플란타룸 DR7의 투여는 트립토판, 루신, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 발린 및 라이신과 같은 아미노산 대사산물과 연관된 화합물들(compounds)의 배설물 함량을 높인다는 것을 밝혀냈다.
실시예 8. 락토바실러스 플란타룸 DR7의 구성성분
성분 기능 양 (g) 퍼센트(%)
상기도감염: 0.5g의 캡슐
Lactobacillus plantarum DR7 Probiotic 0.02g 4.00%
Yeast Beta Glucan Active 0.25g 50.00%
Tapioca Starch Excipient 0.23g 46.00%
기억력: 0.5g의 캡슐
Lactobacillus plantarum DR7 Probiotic 0.02g 4.00%
포도 및 블루베리 추출물 Active 0.30g 60.00%
타피오카 전분 Excipient 0.18g 36.00%
알츠하이머: 0.50g의 캡슐
Lactobacillus plantarum DR7 Probiotic 0.02g 4.00%
사프란 추출물 Active 0.03g 6.00%
타피오카 전분 Excipient 0.45g 90.00%
노화방지: 2.0g 의 파우더 사쳇 (100 ml 물에 2.0g)
Lactobacillus plantarum DR7 Probiotic 0.02g 1.00%
Super Oxide Dismutase (SOD) Food 0.01g 0.50%
타피오카 전분 Excipient ·0.20g 10.00%
락 멜론 주스 파우더 Food 1.77g 88.50%
건강한 심장: 5.0g의 파우더 사쳇 (100 ml 물에 5.0g)
Lactobacillus plantarum DR7 Probiotic 0.02g 0.40"%
귀리베타 글루 Food -4.60g 92.00%
타피오카 전분 Excipient 0.20g 4.00%
레몬 주스 파우더 Food 0.18g 3.60%
장: 2.0g의 파우더 사쳇 (100 ml 물에 2.0g)
Lactobacillus plantarum DR7 Probiotic 0.02g 1.00%
이눌린 Probiotic 0.78g 39.00%
타피오카 전분 Excipient 0.20g 10.00%
사과 주스 파우더 Food 1.00g 50.00%
참고: 이 섹션에서 사용되는 재료 및 방법을 설명하는 위에서 언급한 논문들의 내용은 전체가 참조로 본 문서에 포함되었다.
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<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1475
<212> RNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
*tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag 60
tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata acacctggaa 120
acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagtttgaa agatggcttc 180
ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta acggctcacc 240
atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 300
cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg 360
agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt taaagaagaa 420
catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta 540
aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt 600
gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 720
acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccataccg 780
taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc ggggacatgg atacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg tgagactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag taagctaatc tcttaaagcc 1260
attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt taggaaccag ccgcctaagg 1440
tgggacagat gattagggga agtcgaacaa gagcc 1475
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer forward SCD-1
<400> 2
cactggtgcc ctggtactgc t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer reverse SCD-1
<400> 3
ggatgttctc ccgagattga a 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer forward ABCG5
<400> 4
tgtgaccctg gcatctat 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer reverse ABCG5
<400> 5
atcattggac cagttcagt 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer forward ABCG8
<400> 6
gatgctggct atcataggga gc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer reverse ABCG8
<400> 7
tctctgcctg tgataacgtc ga 22
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer forward telomere
<400> 8
acactaaggt ttgggtttgg gtttgggttt gggttagtgt 40
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer reverse telomere
<400> 9
tgttaggtat ccctatccct atccctatcc ctatccctaa ca 42
중국 미생물자원은행(CGMCC) CGMCC15535 20180402

Claims (14)

  1. 락토바실러스 플란타룸 균주는 중국미생물자원은행에 수탁번호 CGMCC 15535로 기탁되었고, 전체 게놈서열이 유전자 은행에 수탁번호 CP031318로 기탁되었으며, 대사산물은 2-히드록시이소카프로산(2-hydroxyisocapric acid)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 대사산물은 상기도 감염의 예방 및 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 대사산물은 기억력, 인지기능 장애, 스트레스 및 불안의 예방 및 치료를 위해 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 대사산물은 신경 퇴행성 질환의 예방 및 치료를 위해 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 병인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 대사산물은 노화 지연에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 대사산물은 고지혈증, 간 지질 축적 및 지질대사의 예방 및 치료를 위해 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 대사산물은 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 예방 및 치료를 위해 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 대사산물은 심혈관 질환의 예방 및 치료와, 콜레스테롤 감소에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 대사산물은 장내 세균집단과 대사산물 농도의 불균형에 대한 장 조절에 프로바이오틱으로서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 대사산물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 균주는 동결건조되고, 조성물에서 104 내지 1012 cfu/g의 양을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주를 포함하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 대사산물은 2-히드록시이소카프로산(2-hydroxyisocapric acid)과 3-페닐락트산(3-phenyllactic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주의 대사산물을 포함하는 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 조성물은 식품보조제, 의약, 유아용 조제분유, 식용제품, 및 식품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 정제, 캡슐 또는 알약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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