CN115089619A - 植物乳杆菌zdy2013在具有缓解非酒精性脂肪肝功能的制剂中的应用 - Google Patents

植物乳杆菌zdy2013在具有缓解非酒精性脂肪肝功能的制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了植物乳杆菌ZDY2013在具有缓解非酒精性脂肪肝功能的制剂中的应用,其中含有的植物乳杆菌ZDY2013,其生物保藏编号为CCTCC M2014170。所述植物乳杆菌ZDY2013可用于制备具有缓解非酒精性脂肪肝功能的药物或保健品或食品,其可以通过调节肝脏脂质合成,减少NAFLD小鼠肝脏中的脂肪堆积,缓解肝功能障碍和肝脏病理损伤以及胰岛素抵抗,还可以缓解NAFLD小鼠的肝脏炎症和氧化应激及其结肠炎症。

Description

植物乳杆菌ZDY2013在具有缓解非酒精性脂肪肝功能的制剂 中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及植物乳杆菌ZDY2013在具有缓解非酒精性脂肪肝功能的制剂中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指肝细胞出现弥漫性脂肪浸润和脂肪堆积等病理特征,但无过量饮酒史和其它损伤因素(如药物,病毒感染或内分泌条件)所致的慢性肝脏疾病。非酒精性脂肪性肝病在全球范围内的患病率为20%-35%,且逐年增加,已成为慢性肝病的主要病因。目前“多重打击学说”最符合NAFLD的发病本质。“多重打击学说”是指由遗传、环境因素、神经内分泌失调、氧化应激、炎性反应、肠道菌群失调等多种因素的相互作用以及不同器官和组织之间的相互关联,共同导致了NAFLD的发生和发展。在“多重打击”学说中“肠道菌群失调”是NAFLD发生、发展不可或缺的部分,它与肝脏炎症反应、脂质沉积、氧化应激、胰岛素抵抗、胆汁酸及胆碱代谢等密切相关。
联合国粮食与农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为“活的微生物,当给予足够的剂量时会给宿主的健康带来好处”。益生菌功能很多,常见功能包括:(1)调节宿主肠道菌群,从而达到预防和缓解肠道健康的功能;(2)调节机体免疫反应,导致IL-6和TNF-α的减少,提高NK细胞的活性等;(3)促进大分子物质的消化与吸收,如蛋白质和乳糖等;(4)降低胆固醇等。目前有许多种不同的微生物被当作益生菌,常见的有乳杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Biffdobacterium)和酵母菌(Saccharomyces)等。
我们前期研究发现植物乳杆菌ZDY2013具有强耐酸性和耐胆盐能力,具有更好的生长能力,能够更好的通过胃到达肠道定植,发挥其改善肠道菌群失调,减轻炎症和氧化应激。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌ZDY2013在具有缓解非酒精性脂肪肝功能的制剂中的应用。
本发明的第一个方面,是提供了一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的药物或保健品或食品。
该药物或保健品或食品活性成分主要包括植物乳杆菌((Lactobacillusplantarum)ZDY2013,其保藏号为CCTCC M2014170。
本发明的第二个方面,是提供了上述植物乳杆菌((Lactobacillus plantarum)ZDY2013的应用。
所述植物乳杆菌((Lactobacillus plantarum)ZDY2013或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝的药物或保健品或食品中的应用。
所述的植物乳杆菌((Lactobacillus plantarum)ZDY2013或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝的药物或保健品或食品中的应用。
所述的植物乳杆菌((Lactobacillus plantarum)ZDY2013或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗肝脏脂质堆积、肝脏炎症和胰岛素抵抗的药物或保健品或食品中的应用。
所述的植物乳杆菌((Lactobacillus plantarum)ZDY2013或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗肠道损伤的药物或保健品或食品中的应用。
在其中一些实施例中,所述制剂为药物或保健品或食品或者菌剂。
在其中一个实施例中,所述食品为乳制品、蔬菜制品、饮料制品和其他发酵类制品,例如饮料、酸奶或果冻。
所述保健品为液体状保健品、颗粒状保健品、粉末状保健品、胶囊保健品或片状保健品;或所述药物为溶液剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂或片剂。
本发明的第三个方面,是提供了一种益生菌菌剂,其包括活性成分以及药学上或者食品上可接受的辅料,所述活性成分包括植物乳杆菌((Lactobacillus plantarum)ZDY2013或其代谢产物、或其提取液。
在其中一个实施例中,所述益生菌菌剂由植物乳杆菌ZDY2013制备而成,并以新鲜活菌菌体形式存在。
本发明所述的植物乳杆菌ZDY2013,2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,简称CCTCC M,地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,邮编:430072),保藏编号为CCTCC M2014170。
本发明的有益效果是:
经过动物实验证明,本发明植物乳杆菌ZDY2013能有效缓解非酒精性脂肪肝,包括高脂饮食诱导的肝脏脂质堆积、肝脏炎症和胰岛素抵抗和肠道损伤,所述植物乳杆菌((Lactobacillus plantarum)ZDY2013具有非常好的潜在药用价值。
附图说明
图1是实施例1中采用动物实验建模说明植物乳杆菌ZDY2013减少了NAFLD小鼠肝脏中的脂肪堆积;其中a为小鼠体重变化,b为血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-c的含量,c为肝脏中的TC、TG、HDL-C、LDL-c的含量。
图2是实施例2中所述动物实验结果说明植物乳杆菌ZDY2013缓解了NAFLD小鼠的肝功能障碍、肝损伤和氧化应激;其中a为小鼠肝脏H&E染色,b为小鼠肝脏油红O染色,c为血清中AST、ALT的含量,d为肝脏中AST、ALT的含量,e为肝脏CAT的含量,f为肝脏GSH的含量,g为肝脏SOD的含量,h为肝脏MDA的含量。
图3是实施例3中所述动物实验结果说明植物乳杆菌ZDY2013缓解了NAFLD小鼠的胰岛素抵抗;其中a为血清中胰岛素的含量,b为血清中葡萄糖的含量,c为胰岛素抵抗指数,d为胰岛素敏感指数。
图4是实施例4中所述动物实验结果说明植物乳杆菌ZDY2013缓解了小鼠的肝脏炎症及其结肠炎症。其中a为小鼠结肠组织中炎症相关基因的mRNA表达水平,b为小鼠肝脏组织中炎症相关基因的mRNA表达水平。
图5是实施例5中所述动物实验结果说明植物乳杆菌ZDY2013调节了NAFLD小鼠中的脂质合成基因,减少肝脏脂肪堆积。图5为小鼠肝脏组织中脂质合成相关基因的mRNA表达水平。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细说明。
本发明提供了一种植物乳杆菌ZDY2013在具有缓解非酒精性脂肪肝功能的制剂中的应用。
以下实施例中所述的植物乳杆菌ZDY2013,2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M2014170。
实施例1植物乳杆菌ZDY2013减少了NAFLD小鼠肝脏中的脂肪堆积。
将-80℃冻存的植物乳杆菌ZDY2013冻干粉用接种环挑取,于无菌MRS固体平板上划线活化,37℃厌氧培养24h复苏,经2次传代活化后转接无菌MRS液体培养基,过夜培养。将活化2代后的植物乳杆菌ZDY2013按2%接种于无菌MRS液态培养基中,37℃厌氧培养24h后进行活菌计数。将培养液以8000rpm离心3min后弃去上清液,根据活菌计数结果,用无菌1×PBS缓冲液将菌体制成1×109cfu/ml的菌液,每天制备一次菌液。
正常日粮预饲一周后,将24只5周龄的雄性C57BL/6n小鼠平均分为三组,每组8只,ND组喂食正常日粮及饮水,其余组均喂食NAFLD模型饲料。ND组和MD组小鼠灌胃无菌1×PBS,LD组小鼠灌胃植物乳杆菌ZDY2013菌液(1×109cfu/mL)0.1mL,连续灌胃12周。
采样前饥饿处理12h,对小鼠进行眼球采血。收集小鼠肝脏,检测小鼠肝重、肝脏指数和Lee′s指数,使用生化检测试剂盒检测小鼠血清和肝脏中的TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)、HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)和LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)。
表1小鼠肝脏指数和Lee′s指数
Figure BDA0003750449380000051
*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;*is compared with MD.
实施例1结果如表1和图1所示,MD组的肝脏重量、肝脏指数和Lee’s系数明显高于ND组。用植物乳杆菌ZDY2013干预可显著降低NAFLD小鼠肝脏指数,在对小鼠体重的分析中,与MD组相比,ZDY2013处理组的小鼠体重显著改善(图1a)。TC、TG、HDL-C和LDL-C是反映血脂和肝脂状况的重要指标,水平越高显示血脂和肝脂越高,脂肪长期沉积将诱发脂肪肝。与MD组相比,LD组的血清和肝脏TC、TG和LDL-C水平都显著降低(图1b)。然而,所有组的肝脏HDL-C水平均无显著差异。综上所述,说明植物乳杆菌ZDY 2013干预减少了NAFLD小鼠的体重和血脂及肝脂的增加。
实施例2:植物乳杆菌ZDY2013缓解了NAFLD小鼠的肝功能障碍、肝损伤和氧化应激。
动物实验建模同实施例1。采样前饥饿处理12h,对小鼠进行眼球采血。收集小鼠肝脏,采用HE染色和油红O染色检测小鼠肝脏的病理情况,使用生化检测试剂盒检测小鼠血清和肝脏中的AST和ALT,使用生化试剂盒检测小鼠肝脏中SOD、MDA、CAT和GSH的含量。
实施例2结果如图2所示,通过H&E染色,MD组出现中度的大泡性脂肪变性,而LD组的脂肪变性等级显著低于MD组。与ND组小鼠相比,MD组小鼠通过油红O染色在肝组织中显示出显著的肝脂滴积聚(图2b)。相比之下,在给予植物乳杆菌ZDY201312周后,LD组小鼠的肝脂滴数量和大小显著减少。天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平是脂肪肝患者炎症和肝细胞损伤的指标。在肝功能测试中,MD组的AST和ALT水平显著高于ND组,而植物乳杆菌ZDY2013干预组的AST和ALT水平接近ND组(图2c,d)。与ND组相比,MD组的MDA和GSH水平显著升高,SOD和CAT水平显著降低;而植物乳杆菌ZDY2013干预组的SOD、MDA、CAT和GSH水平接近ND组(图2e-h)。综上所述,说明植物乳杆菌ZDY2013干预缓解了NAFLD小鼠的肝功能障碍、肝损伤和氧化应激。
实施例3:植物乳杆菌ZDY2013缓解了NAFLD小鼠的胰岛素抵抗。
动物实验建模同实施例1。收集小鼠肝脏和血液等物。使用试剂盒检测小鼠血清中的葡萄糖和胰岛素,计算HOMA-IR(胰岛素抵抗指数)和ISI(胰岛素敏感指数)。
我们发现MD组的血糖(3b)和胰岛素水平(3a)、HOMA-IR(3c)和ISI(3d)明显高于ND组,而LD组的血糖和胰岛素水平、HOMA-IR和ISI显著降低,说明植物乳杆菌ZDY2013干预缓解了NAFLD小鼠的胰岛素抵抗,增加胰岛素的敏感性(图3)。
实施例4:植物乳杆菌ZDY2013缓解了小鼠的结肠炎症及其肝脏炎症。
动物实验建模同实施例1。处理12周后,收集小鼠肝脏、结肠和血液等物。采用实时荧光定量PCR检测小鼠肠道紧密连接蛋白(zonula occludin-1、claudin-3和occludin)和炎症因子以及肝脏炎症因子mRNA表达水平,采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中细菌内毒素LPS和NF-κB、IκB-α和IKKβ的含量。
从结果图4中可看出,与ND组相比,MD组的小鼠肠道中NF-κB和TLR4和炎症因子TNF-α、IL-6和IFN-γ的表达水平显著升高,IκB-α表达水平显著降低(4a);肝脏中NF-κB和TLR4和炎症因子TNF-α、IL-6和IFN-γ的表达水平显著升高,IκB-α表达水平显著降低(4b)。然而,经过植物乳杆菌ZDY2013干预后,这些情况都有所缓解。
综上所述,长期高脂高果糖高胆固醇饮食会导致小鼠肠道炎症和肝脏炎症,而经过植物乳杆菌ZDY2013干预后肠道和肝脏的炎症反应有所缓解。
实施例5:植物乳杆菌ZDY2013调节NAFLD小鼠中的脂质合成基因,减少肝脏脂肪堆积。
动物实验建模同实施例1。处理12周后,收集小鼠肝脏和结肠等物。采用实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏脂肪合成相关基因FAS、ACC和SREBP-c等及脂肪代谢相关基因PPAR-γ和CPT-1α等mRNA表达水平。
实施例5结果如图5所示,与ND组相比,MD组肝脏中这些基因的表达水平发生了明显变化(P<0.001,图5)。相反,在灌胃植物乳杆菌ZDY201312周后,观察到LD组的脂代谢相关基因表达水平改变,包括PPAR-γ和CPT-1αmRNA表达增加,FAS、ACC、C/EBP-α和SREBP-1c表达显著降低。这些结果表明,植物乳杆菌ZDY2013对NAFLD的治疗作用与脂肪合成相关基因表达的下调有关。综上所述,植物乳杆菌ZDY2013可通过调节NAFLD小鼠中的脂质合成基因,减少肝脏的脂质合成,进而减少肝脏脂肪堆积。
以上仅为本发明的具体实施例,并不以此限定本发明的保护范围;在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进,均属本发明的保护范围。

Claims (8)

1.植物乳杆菌ZDY2013或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝的药物或保健品或食品中的应用,所述植物乳杆菌ZDY2013的保藏号为CCTCC M 2014170。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌ZDY2013或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝的药物或保健品或食品中的应用,其特征在于,所述非酒精性脂肪肝是高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌ZDY2013或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝的药物或保健品或食品中的应用,其特征在于,所述药物或保健品或食品包括制备预防和治疗肝脏脂质堆积、肝脏炎症和胰岛素抵抗的药物或保健品或食品。
4.根据权利要求2所述的植物乳杆菌ZDY2013或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝的药物或保健品或食品中的应用,其特征在于,所述药物或保健品或食品还包括制备预防和治疗肠道损伤的药物或保健品或食品。
5.根据权利要1-4任一项所述应用,其特征在于,所述食品为饮料、酸奶或果冻。
6.一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的药物或保健品或食品,其特征在于,其包括活性成分以及药学上或者食品上可接受的辅料,所述活性成分包括植物乳杆菌ZDY2013或其代谢产物、或其提取液,所述植物乳杆菌ZDY2013的保藏号为CCTCC M 2014170。
7.根据权利要求6所述的药物或保健品或食品,其特征在于,所述药物或保健品或食品为益生菌菌剂。
8.根据权利要求6所述的药物或保健品或食品,其特征在于,所述药物或保健品或食品为生物制剂。
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