KR20210029221A - 항-응고 인자 XIa (FXIa) 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 생산 방법 - Google Patents

항-응고 인자 XIa (FXIa) 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본원에는 a) 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적을 동결시켜 펠릿을 형성하는 단계; b) 펠릿을 동결-건조시키는 단계를 포함하고; 여기서 단계 a)에서 액적은 온도-제어가능한 내벽 표면 및 용액의 동결 온도 미만의 내부 온도를 갖는 냉각탑 내로의 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적 형성에 의해 형성되고, 단계 b)에서 펠릿은 진공 챔버 내부에 수용된 회전 리셉터클에서 동결-건조되는, 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 생산 방법이 기재된다.

Description

항-응고 인자 XIa (FXIa) 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 생산 방법
본 발명은 a) 항-응고 인자 XIa (FXIa) 항체를 포함하는 용액의 액적을 동결시켜 펠릿을 형성하는 단계; 및 b) 펠릿을 동결-건조시키는 단계를 포함하는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 재구성 시간을 감소시키는 방법 및 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿에 관한 것이다.
1964년에 맥팔란 (Macfarlane) 및 다비 (Davie) & 라트노프 (Ratnoff) [Macfarlane RG. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier. Nature 1964; 202: 498-9.; Davie EW, Ratnoff OD. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science 1964; 145: 1310-2.]는 혈액 응고 과정에 대해 케스케이드 가설을 도입하였다. 그 이후로, 생체내 응고 기능에 대한 우리의 지식은 성장하였다. 지난 몇 년 동안, 응고를 시작하고 공통 경로로 수렴하여 궁극적으로 트롬빈 생성 및 피브린 침착으로 이어지는 소위 외인성 및 내인성 경로로 불리는 2개의 별개의 경로에 대한 이론이 수정되었다. 현재 모델에서는, 혈장 프로테아제 활성화된 인자 VII가 조직 인자 (TF)와 접촉하고 이에 의해 이와 복합체를 형성할 때 응고가 일어난다. 이 조직 인자-FVIIa 복합체는 지모겐 FX를 이의 활성 형태 FXa로 활성화시킬 수 있으며, 이는 그의 부분에서 프로트롬빈 (응고 인자 II)을 트롬빈 (IIa)으로 전환할 수 있다. 응고에서 핵심 역할을 하는 트롬빈은 차례로 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 촉매할 수 있다. 또한, 트롬빈은 혈소판에 의해 발현되는 특정 수용체를 활성화시켜 후자의 활성화를 유도한다. 피브린과 조합된 활성화된 혈소판은 응괴 형성에 필수적이므로 정상적인 지혈에서 근본적인 역할을 한다.
제2 증폭 경로는 응고 인자 XI (FXI)에 의해 형성된다. FXI는 응고 캐스케이드의 다른 구성원과 마찬가지로 혈장 세린 프로테아제 지모겐으로서 생체내 혈액 응고의 개시 단계와 증폭 단계를 연결하는데 핵심적인 역할을 한다는 것이 잘 확인되었다 [Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry 1991 ;30:10363-70; Gailani D, Broze Jr GJ . Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991 ;253:909-12; Kravtsov DV, Matafonov A, Tucker El, Sun MF, Walsh PN, Gruber A, et al. Factor XI contributes to thrombin generation in the absence of factor XI I . Blood 2009;1 14: 452-8.3-5]. 응고 인자 XI (FXI)는 간에서 합성되어 고분자량 키니노겐 (HMWK)과 복합된 디술파이드 결합-연결된 이량체로 혈장에서 순환한다. 이 이량체의 각각의 폴리펩티드 쇄는 약 80 kD이다. 지모겐 인자 XI는 혈액 응고의 접촉 단계를 통해 또는 혈소판 표면에서의 트롬빈-매개된 활성화를 통해 그의 활성 형태인 응고 인자 XIa (FXIa)로 전환된다. 인자 XI의 이러한 활성화 동안, 내부 펩티드 결합이 2개의 쇄 각각에서 절단되어 디술파이드 결합에 의해 함께 결합된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 세린 프로테아제인 활성화된 인자 XIa가 생성된다. 이 세린 프로테아제 FXIa는 응고 인자 IX를 IXa로 전환하고, 이후에 응고 인자 X를 활성화한다 (Xa). 이어서, Xa는 응고 인자 II/트롬빈 활성화를 매개할 수 있다.
FXI 결핍은 일반적으로 자연 출혈로 이어지지는 않지만, 지혈 문제로 인한 출혈 위험 증가와 관련이 있으며, 출혈의 심각성은 FXI의 혈장 수준과 관련이 없다. 인간에서 심각한 FXI 결핍은 혈전 질환으로부터 특정한 보호 효과를 갖는다. 그러나, 높은 수준의 FXI는 혈전 사건과 관련이 있었다. 따라서, FXI의 억제는 개선된 이익-위험 비율을 달성하기 위한 새로운 항혈전제의 개발에서 새로운 접근법으로 제안되었다.
WO 2013/167669는 활성화된 형태의 혈장 인자 XI인 FXIa에 선택적으로 결합하여 혈소판 응집 및 관련 혈전증을 억제할 수 있는 항체를 개시한다. 이들 항체는 지혈을 손상시키지 않는 것으로 밝혀졌다.
면역글로불린은 다른 많은 바이오약품과 마찬가지로 장기간에 걸쳐 용액에서 안정적이지 않다. 동결건조 (lyophilization)로도 공지된 동결-건조 (freeze-drying)는 얼음 결정을 수증기로 승화시켜, 즉 물을 고체상으로부터 기체상으로 직접 전이시켜 열- 및/또는 가수분해-민감성 물질을 건조시키는 공정이다.
통상적인 공정에서, 동결-건조는 일반적으로 (진공) 건조 챔버 내에 하나 이상의 트레이 또는 선반을 포함하는 표준 동결-건조 챔버에서 수행된다. 바이알은 동결-건조될 생성물로 충전되고 이들 트레이에 배열될 수 있다. 이러한 건조기는 전형적으로 온도 제어된 벽이 없으며 건조기 챔버에 놓인 바이알에 균일하지 않은 열 전달을 제공한다. 특히 가장자리에 위치된 바이알은 챔버 벽과 플레이트/선반 적치물 사이의 틈에서 복사 열 전달 및 가스 전도로 인해 플레이트 중앙에 위치된 바이알보다 에너지를 더 집중적으로 교환한다. 이러한 에너지 분포의 불균일성은 가장자리의 바이알과 중앙에 있는 바이알 사이의 동결 및 건조 동역학을 변화시키고 각각의 바이알의 활성 내용물 활성에 변화를 일으키고 생성물 수율 손실을 초래할 수 있다. 최종 생성물의 균일성을 보장하려면 실험실 및 생산 규모 모두에서 광범위한 개발 및 검증 작업을 수행해야 한다.
WO 2006/008006 A1은 바이알과 같은 최종 용기에 펠릿화된 바이오약품 생성물을 동결-건조, 저장, 검정 및 충전하는 것을 포함하는 멸균 제조 공정에 관한 것이다. 기재된 공정은 분무-동결 및 동결-건조를 조합하며, a) 생성물의 액적을 동결시켜 펠릿을 형성하는 단계이며, 여기서 액적은 생성물의 용액을 주파수-보조된 노즐을 통해 통과시켜 형성되고 펠릿은 상기 액적을 극저온 가스의 역류 유동을 통해 통과시킴으로써 액적으로부터 형성되는 것인 단계; b) 펠릿을 동결-건조시키는 단계; c) 동결-건조된 펠릿을 저장하고 균질화하는 단계; d) 동결-건조된 펠릿이 저장되고 균질화되는 동안 이를 검정하는 단계; 및 e) 동결-건조된 펠릿을 상기 용기에 적재하는 단계를 포함한다.
WO 2013/050156 A1은, 적어도 액적 생성 및 입자 형성을 위한 액체 액적의 동결 응결을 위한 분무 챔버, 및 입자를 동결-건조시키기 위한 벌크 동결-건조기 (동결-건조기는 입자를 수용하기 위한 회전 드럼을 포함함)를 포함하는, 폐쇄 조건 하에서 동결-건조된 입자의 생산을 위한 공정 라인을 기재한다. 또한, 분무 챔버로부터 동결-건조기로 생성물을 전달하기 위한 전달 섹션이 제공된다. 엔드-투-엔드 폐쇄 조건 하에서 입자를 생산하기 위해, 장치 및 전달 섹션 각각은 동결-건조 및/또는 격납될 생성물의 멸균성을 보존하는 작동을 위해 개별적으로 조정된다.
WO 2013/050161 A1은 폐쇄 조건 하에서 동결-건조된 입자의 생산을 위한 공정 라인을 개시하며, 공정 라인은 폐쇄 조건 하에서 동결-건조된 입자의 벌크 제품 생산을 위한 동결-건조기 (동결-건조기는 동결된 입자를 수용하기 위한 회전 드럼을 포함함), 및 회전 드럼을 수용하는 고정 진공 챔버를 포함하고, 여기서 폐쇄 조건 하에서 입자를 생성하기 위해 진공 챔버는 입자의 처리 동안 폐쇄된 작동을 위해 조정된다. 드럼은 진공 챔버와 개방된 소통 상태에 있으며, 적어도 하나의 전달 섹션이 공정 라인의 개별 장치와 동결-건조기 사이의 생성물 전달을 위해 제공되며, 동결-건조기 및 전달 섹션은 폐쇄 작동을 위해 별도로 조정되고, 여기서 전달 섹션은 온도-제어가능한 내벽 표면을 포함한다.
치료 항체는 제한된 부피의 고용량 투여를 필요로 할 수 있으며, 따라서 투여될 최종 용액 중 고농도의 항체 (이는 통상적인 동결-건조된 생성물에 대해 최대 수시간의 실행이 불가능하게 긴 재구성 시간을 초래함)는 이러한 상황 하에서 동결-건조의 적용 가능성을 제한한다. 단축된 재구성 시간을 갖는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 생산 방법이 유리할 것이다. 또한, 가공 중에 항-FXIa 항체에 대한 손상을 피하고 이에 따라 결합 친화도 손실을 피하는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 생산을 위한 동결-건조 방법이 바람직할 것이다. 특히, 개별 펠릿 간의 활성 (예컨대, 결합 친화도) 변화를 피해야 한다. 바람직하게는, 항-FXIa 항체를 포함하는 펠릿 생산을 위해 외부와의 엄격한 분리 조건 하에서 이러한 동결-건조 방법을 수행하여 멸균성을 보장하는 것이 가능해야 한다 - 액체 질소와 같은 극저온 가스의 카운터 또는 동시 냉각 유동에 의한 냉각을 피해야 한다는 것을 의미한다. 마지막으로, 크기 및 중량 분포가 좁은 균일한 동결-건조된 펠릿을 생성하는 재현가능한 공정은 추가 취급에 큰 이점을 제공한다. 본 발명은 이러한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 언급된 선행 기술 참고 문헌 중 어느 것도 이러한 방법을 개시하지 않는다.
상기 언급된 목적은 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 생산 방법에 의해 본 발명에 따라 달성되며, 방법은
a) 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적을 동결시켜 펠릿을 형성하는 단계;
b) 펠릿을 동결-건조시키는 단계를 포함하고;
여기서 단계 a)에서 액적은 온도-제어가능한 내벽 표면 및 용액의 동결 온도 미만의 내부 온도를 갖는 냉각탑 내로의 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적 형성에 의해 형성되고, 단계 b)에서 펠릿은 진공 챔버 내부에 수용된 회전 리셉터클에서 동결-건조된다.
본 발명에 따른 방법의 작동 원리는 몇몇 뚜렷한 장점을 갖는다. 첫째, 본 발명에 따른 방법에서, 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 분무된 액적은 WO 2006/008006 A1에 기재된 것과 같은 역류 방식으로 극저온 가스와 접촉하지 않는다는 점에 주목해야 한다. 냉각탑 내부 공간에 극저온 가스를 도입할 필요가 없으므로 극저온 가스에 대한 모든 취급 및 멸균 단계를 생략할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 모든 단계는 개별 단계 사이의 멸균성을 손상시키지 않고 멸균 조건 하에서 수행될 수 있다.
둘째, 본 발명에 따른 방법은 항-FXIa 항체에 심각한 손상을 일으키지 않는 것으로 실험적으로 밝혀졌고, 따라서 최종 생성물에서 결합 친화도 손실을 피한다. 실제로, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿은 통상적인 동결-건조 또는 WO 2006/008006에 따른 동결-건조 공정에 의해 수득되는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결건조물과 비교하여 간접적 ELISA에 의해 평가되는 바와 같이 FXIa 항원에 대해 증가된 결합 친화도를 나타내었다. 항-FXIa 항체에 대한 손상을 피하면 좁은 지정된 범위 내에서 원하는 양의 활성 항-FXIa 항체를 정확하게 충전할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 표준 동결건조와 비교하여 다양한 부피 및 적용 시스템에서 동결-건조된 펠릿의 파일링에 더 많은 유연성을 허용한다.
셋째, 진공 챔버 내부의 회전 리셉터클에서 동결-건조 단계를 수행함으로써 각각의 개별 펠릿의 공간 위치가 시간이 지남에 따라 고르게 분포된다. 이는 균일한 건조 조건을 보장하고 따라서 랙 상의 동결-건조된 바이알에 대한 경우와 같이 항체 활성, 예컨대, 결합 친화도의 공간적 변화를 제거한다.
마지막으로, 놀랍게도, 본 발명에 따라 생산된 항-FXIa 항체를 포함하는 펠릿은 특히 통상적인 동결-건조에 의해 수득되는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결건조물 및 WO 2006/008006 A1에 개시된 공정에 의해 수득되는 펠릿과 비교하여 상당히 단축된 재구성 시간을 나타낸다.
동결된 펠릿의 생성은 임의의 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 중요한 것은, 항체를 포함하는 액적을 액체 질소에 떨어뜨려 펠릿을 형성하는 것을 피해야 한다는 것이다.
후속 동결-건조 단계의 관점에서, 동결된 펠릿은 유리하게 좁은 입자 크기 분포를 갖는다. 그 후, 동결된 펠릿은 멸균 및 저온 조건 하에서 동결 건조기로 운반될 수 있다. 이어서, 펠릿은 리셉터클의 회전에 의해 건조 챔버 내부의 운반 표면에 분산된다. 승화 건조는 원칙적으로 펠릿에 적합한 임의의 종류의 동결 건조기에서 가능하다. 승화 증기 유동, 제어된 벽 온도 및 건조 챔버와 응축기 사이의 적절한 단면적을 위한 공간을 제공하는 동결 건조기가 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 항-FXIa 항체 변이체의 세부 사항이 하기에 기재된다.
본 발명에 따라 사용될 항-FXIa 항체는 혈장 인자 XI의 활성화된 형태인 FXIa에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항-FXIa 항체는 FXIa에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 항-FXIa 항체는 혈소판 응집 및 관련 혈전증을 억제할 수 있다. 바람직하게는, 항체 매개된 혈소판 응집 억제는 혈소판-의존적 일차 지혈을 손상시키지 않는다. 본 발명의 맥락에서 용어 "지혈을 손상시키지 않는"은 응고 인자 XIa의 억제가 원하지 않는 측정가능한 출혈 사건을 유발하지 않음을 의미한다.
본원에 사용된 "응고 인자 XIa", "인자 XIa" 또는 "FXIa"는 지모겐 인자 XI를 발현하는 임의의 포유동물 종으로부터의 임의의 FXIa를 지칭한다. 예컨대, FXIa는 인간, 비인간 영장류 (예컨대, 개코 원숭이), 마우스, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 토끼, 및 혈류, 응고 및/또는 혈전증의 조절에 관여되는 응고 인자 XI를 발현하는 임의의 다른 종일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 항체가 이러한 항원과 하나 이상의 기준 (reference) 항원(들)을 구별할 수 있는 경우, 결합 특이성은 절대적인 것이 아니라 상대적인 특성이기 때문에, 항체는 항원 (본원에서, FXIa)에 "특이적으로 결합"하거나, 이에 "특이적"이거나, 이를 "특이적으로 인식"한다. 가장 일반적인 형태에서 (및 정의된 기준이 언급되지 않은 경우), "특이적 결합"은, 예컨대 하기 방법 중 하나에 따라 결정된 관심 항원과 관련되지 않은 항원을 구별하는 항체의 능력을 지칭한다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-시험 및 펩티드 스캔을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 스코어링은 표준 발색 (예컨대, 2차 항체와 서양고추냉이 퍼옥사이드 및 테트라메틸 벤지딘과 과산화수소)에 의해 수행될 수 있다. 특정 웰에서의 반응은, 예컨대 450 ran에서의 광학 밀도로 스코어링된다. 전형적인 배경 (=음성 반응)은 0.1 OD일 수 있다; 전형적인 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 이는 양/음의 차이가 10배 초과일 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 기준 항원이 아니라 우유 분말, BSA, 트랜스페린 등과 같은 약 3 내지 5개의 관련되지 않은 항원 세트를 사용하여 수행된다.
그러나, "특이적 결합"은 또한 표적 항원과 기준점으로 사용되는 하나 이상의 밀접하게 관련된 항원(들), 예컨대 상동체를 구별하는 항체의 능력을 지칭할 수 있다. 예컨대, 항체는 기준 항원과 비교하여 표적 항원에 대해 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 106배 이상의 상대적 친화도를 가질 수 있다. 또한, "특이적 결합"은 표적 항원의 상이한 부분들, 예컨대 FXIa의 상이한 도메인 또는 영역을 구별하는 항체의 능력과 관련될 수 있다.
"친화도" 또는 "결합 친화도" KD는 종종 평형 결합 상수 (ka) 및 평형 해리 상수 (kd)를 측정하고 kd 대 ka의 몫 (KD = kd/ka)을 계산함으로써 결정된다. 용어 "면역특이적" 또는 "특이적으로 결합하는"은 바람직하게는 항체가 106M 이하의 친화도 KD (일가 친화도)로 응고 인자 XIa에 결합하는 것을 의미한다. 용어 "고친화도"는 항체가 107M 이하의 친화도 KD (일가 친화도)로 응고 인자 XIa에 결합하는 것을 의미한다. 이러한 친화도는, 통상적인 기술을 사용하여, 예컨대 평형 투석에 의해; 제조업체가 약술되는 일반적인 절차를 사용하여 비아코어 (BIAcore) 2000 기기를 사용하여; 방사성표지된 표적 항원을 사용한 방사면역검정에 의해; 또는 통상의 기술자에게 공지된 또 다른 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 친화도 데이터는, 예컨대 문헌 [Kaufman RJ, Sharp PA. (1982) Amplification and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary dna gene. [J Mol Biol.159:601 -621]에 기재된 방법에 의해 분석될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 자연으로부터 단리되거나 재조합 수단에 의해 제조된 면역글로불린 분자 (예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY를 포함하는 임의의 유형, 및/또는 IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgAI 및 IgA2를 포함하는 임의의 부류)를 포함하며, 모든 통상적으로 공지된 항체 및 이의 기능적 단편을 포함한다. 용어 "항체"는 또한 항체 CDR 삽입물을 천연 항체에서 발견되는 것과 동일한 활성 결합 형태로 배향할 수 있는 다른 단백질 스캐폴드로 확장되어 이러한 키메라 단백질로 관찰된 표적 항원의 결합은 CDR이 유래된 천연 항체의 결합 활성에 비례하여 유지된다.
이에 항체/면역글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 항원-결합 영역을 보유하는 항체/면역글로불린의 단편 (예컨대, IgG의 가변 영역)으로 정의된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 즉 CDR-I, -2 및/또는 -3 영역에서 발견되며; 그러나, 다양한 "프레임워크" 영역도 CDR에 대해 스캐폴드를 제공하는 것과 같이 항원-결합에서 중요한 역할을 할 수도 있다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 적어도 가변 경쇄 (VL)의 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 잔기 5 내지 109, 보다 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 아미노산 잔기 4 내지 111을 포함하고, 특히 바람직한 것은 완전한 VL 및 VH 쇄 (VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 아미노산 위치 1 내지 113; WO 97/08320에 따른 넘버링)이다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 부류의 면역글로불린은 IgG이다.
본 발명의 "기능적 단편"은 Fab, Fab1, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자 (scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 디술파이드-연결된 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하며, 이는 온전한 면역글로불린으로부터 제조되거나 재조합 수단에 의해 제조된다.
항원-결합 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 하기의 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다: 힌지 영역, CHI, CH2, CH3 및 CL 도메인. 본 발명에는 또한 가변 영역(들)과 힌지 영역, CHI, CH2, CH3 및 CL 도메인의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 항체 단편이 포함된다.
항체 및/또는 항원-결합 항체 단편은 단일특이적 (예컨대, 모노클로날), 이중특이적, 삼중특이적 또는 더 큰 다중특이적일 수 있다. 바람직하게는, 모노클로날 항체가 사용된다. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 상이한 결정 인자 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정 인자에 대해 지시된다. 모노클로날 항체는 특이성 외에도 균일 배양에 의해 합성되고 특이성 및 특성이 상이한 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다.
항체 또는 항원-결합 항체 단편은, 예컨대 인간, 인간화, 뮤린 (예컨대, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭일 수 있다. 바람직하게는, 인간 또는 인간화 항-FXIa 항체가 사용된다.
본원에 사용된 "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리, 인간 B 세포, 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트렌스제닉인 동물로부터 단리된 항체뿐만 아니라 합성 인간 항체를 포함한다.
"인간화 항체" 또는 기능적 인간화 항체 단편은 본원에서 (i) 비인간 공급원 (예컨대, 이종 면역계를 보유하는 트랜스제닉 마우스)으로부터 유래된 것으로서, 항체는 인간 배선 서열을 기반으로 하는 것; 또는 (ii) 키메라로서, 여기서 가변 도메인은 비인간 기원으로부터 유래되고 불변 도메인은 인간 기원으로부터 유래되는 것, 또는 (iii) CDR-이식된 것으로서, 여기서 가변 도메인의 CDR은 비인간 기원으로부터 유래되고 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크는 인간 기원이고 불변 도메인 (존재하는 경우)은 인간 기원인 것으로 정의된다.
본 발명에 따른 방법에 적합한 항체는, 예컨대 WO 2013/167669에 개시되어 있다. 특정 실시양태에서, 항-FXIa 항체는 WO 2013/167669의 표 9에 제시된 바와 같은 적어도 하나의 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-FXIa 항체는 WO 2013/167669의 표 9에 제시된 바와 같이 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열 중 적어도 하나 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 항-FXIa 항체는 i) 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열식별번호 (SEQ ID NO): 19 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열식별번호: 20; 또는 ii) 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열식별번호: 29 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열식별번호: 30; 또는 iii) 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열식별번호: 27 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열식별번호: 20을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-FXIa 항체는 WO 2013/167669에 개시된 항체 076D-M007-H04, 076D-M007-H04-CDRL3-N110D, 및 076D-M028-H17로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항-FXIa 항체는 본원에서 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열식별번호: 1 및 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열식별번호: 2로 표시되는 076D-M007-H04-CDRL3-N110D이다.
특정 실시양태에서, 항-FXIa 항체는 추가 모이어티, 특히 약물에 접합된다.
본 발명의 실시양태 및 부가적인 측면이 하기에 설명될 것이다. 이들은 문맥에서 달리 명백히 지시하지 않는 한 자유롭게 조합될 수 있다.
본 발명의 경우, 임의의 항-FXIa 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체는 공정 자체의 추가 변형 없이 처리될 수 있다. 그러나, 재구성에 필요한 시간의 유리한 단축을 실현하기 위해, 항-FXIa 항체는 본 발명에 따른 방법으로 처리되는 것이 적절하다.
공정은 바람직하게는 항-FXIa 항체 폴리펩티드에 대한 잠재적인 손상 및 최종 생성물에서 활성/친화도의 손실을 회피한다.
제2 측면에서, 본 발명은 통상적인 동결-건조에 의해 수득되는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결건조물과 비교하여 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 재구성 시간을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 방법은
a) 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적을 동결시켜 펠릿을 형성하는 단계;
b) 펠릿을 동결-건조시키는 단계
를 포함하고;
여기서 단계 a)에서 액적은 온도-제어가능한 내벽 표면(110) 및 용액의 동결 온도 미만의 내부 온도를 갖는 냉각탑(100) 내로의 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적 형성에 의해 형성되고, 단계 b)에서 펠릿은 진공 챔버(200) 내부에 수용된 회전 리셉터클(210)에서 동결-건조된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "통상적인 동결-건조" 및 "통상적으로 동결-건조 된"은 (진공) 건조 챔버 내에 하나 이상의 트레이 또는 선반을 포함하는 표준 동결-건조 챔버에서 수행되는 바이알에서의 표준 동결-건조 공정을 지칭하며, 분무-동결의 공정 단계를 포함하지 않는다. 전형적으로, 동결-건조될 생성물은 바이알에 충전된 다음 (진공) 건조 챔버에 배치된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "통상적인 동결-건조에 의해 수득되는 동결건조물과 비교하여 동결-건조된 펠릿의 재구성 시간을 감소시키는"은, 통상적인 동결-건조로 수득되는 동결건조물과 비교하여 재구성 매질, 예컨대 멸균수를 첨가 시 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 동결-건조된 펠릿의 완전 또는 거의 완전한 용해에 필요한 시간의 감소로 이해되어야 한다. 재구성 시간은 특히 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 감소된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "동결-건조된 펠릿의 완전 또는 거의 완전한 재구성/용해"는 재구성 매질에서 동결-건조된 펠릿의 고체 함량의 적어도 98%, 더욱 특히 동결-건조된 펠릿의 고체 함량의 적어도 98.5%, 가장 특히 동결-건조된 펠릿의 고체 함량의 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.75% 또는 적어도 99.9%의 용해를 지칭한다.
본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 방법은 단계 b) 이후에
c) 동결-건조된 펠릿을 저장 및 균질화하는 단계
d) 동결-건조된 펠릿을 용기에 적재하는 단계
를 추가로 포함한다.
저장 및 균질화 단계 c)는 또한 동결-건조에 사용되는 진공 챔버 내의 회전 리셉터클에서 수행될 수 있다. 단계 d)에서 사용자 정의된 양의 동결-건조된 펠릿이 최종 용기에 충전된다. 저장 용기는 격리된 충전 라인으로 전달되고 멸균 도킹 스테이션에 도킹된다. 용기의 내용물은 격리기 내부에서 충전 기계의 저장소로 전달된다. 처리된 항-FXIa 항체에 대해 손상이 없거나 최소한인 본 발명에 따른 방법은 좁은 특정 범위 내에서 원하는 항체의 양의 정확한 충전을 허용한다. 본 발명에 따른 방법은 최종 사용을 위한 용기로의 유연하고 개별화된 충전을 허용한다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 단계 a)에서 액적은 주파수-보조된 노즐을 통과함으로써 용액의 액적 형성에 의해 형성된다. 바람직하게는, 진동 주파수는 ≥ 200 Hz 내지 ≤ 5000 Hz, 더욱 특히 ≥ 400 Hz 내지 ≤ 4000 Hz 또는 ≥ 1000 Hz 내지 ≤ 2000 Hz이다.
주파수-보조된 노즐과 무관하게, 노즐 개구의 직경은 100 μm 내지 500 μm 범위, 바람직하게는 200 μm 내지 400 μm 범위, 매우 바람직하게는 300 μm 내지 400 μm 범위일 수 있다. 상기 노즐 직경은 약 200 μm 내지 약 1000 μm 범위, 바람직하게는 약 400 μm 내지 약 900 μm 범위, 매우 바람직하게는 약 600 μm 내지 800 μm 범위의 액적 크기를 초래한다.
이와 관련하여, "약" 주어진 값의 크기, 예컨대 주어진 크기 범위의 상한 또는 하한은 이 주어진 값으로부터 최대 ±30% 벗어나는 모든 액적 크기를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 약 400 μm의 생성된 액적 크기는 280 μm 내지 520 μm의 다양한 액적 크기를 포괄한다. 유사하게, 약 100 μm 내지 약 500 μm의 크기 범위는 70 mm 내지 650 μm의 액적 크기를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
형성된 액적은 약 상기 언급된 값인 중앙값 주변의 특정 액적 크기 분포를 나타낸다.
노즐이 주파수-보조된 본 발명의 실시양태에서, 중앙값 주변의 변화는 더 작을 수 있다. 따라서, 하기에 기재된 효과의 관점에서, 주파수-보조된 노즐을 통해 액적을 통과시키는 것은 최종 동결-건조된 펠릿에 대한 잠재적인 부정적인 영향을 더 낮추는데 더욱 유리하다. 또한, 이와 관련하여, 용어 "약" 주어진 값은 이 주어진 값으로부터 최대 ±30% 벗어나는 모든 값을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
일반적으로, 상기 주어진 크기의 액적은 양호한 항-FXIa 항체 친화도 유지와 함께 후속 단계 b) 내지 d)가 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌기 때문에 유리하다.
이에 얽매이지 없이, 동결 단계 a)에서 더 큰 표면 대 부피 비율로 인해 더 작은 액적이 너무 빨리 동결되고 그로 인해 취약한 항-FXIa 항체가 부분적으로 파괴된다는 가설이 세워졌다. 또한, 더 작은 액적은 정전기적으로 대전되는 경향이 증가하는 더 작은 펠릿을 초래하고, 후자는 이러한 펠릿의 후속 취급을 악화시킨다. 예컨대, 더 작은 정전기적으로 대전된 동결된 펠릿의 냉각탑을 통한 낙하는 덜 지시되는 경향이 있어 탑 뒤에 펠릿이 남아 생성물 수율을 감소시킨다. 더 큰 액적은 균일하게 동결되지 않는다. 액적의 내부 코어 구획이 불완전하게 동결되면 동결된 펠릿이 탑 바닥에서 덩어리져 균일한 펠릿 벌크의 형성을 방지하여 추가 처리를 방해한다. 불균일한 동결은 추가로 동결된 펠릿의 외부 껍질에서 항-FXIa 항체의 부분적 파괴를 초래할 수 있고 저장 동안 내부의 불완전하게 동결된 코어에서 항-FXIa 항체의 부분적 파괴를 초래할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 단계 a)에서 냉각탑의 내부 표면은 -120℃ 이하, 바람직하게는 ≥ -180℃ 내지 ≤ -120℃의 온도를 갖는다. 바람직하게는, 온도는 ≥ -160℃ 내지 ≤ -140℃이다.
상기에서 언급된 ≥ -160℃ 내지 ≤ -140℃의 온도는 2 m 내지 4 m, 특히 약 3 m의 거리에서 낙하하는 동안 동결되는 약 ≥ 600 μm 내지 약 ≤ 800 μm 범위의 액적 크기에 최적화된다.
원칙적으로, 낙하 거리에 대한 상한선은 없다. 냉각탑의 내부 표면 온도 및 낙하 거리는 지정된 크기의 액적이 선택된 낙하 거리에 걸쳐 완전히 동결되도록 적절하게 선택된다. 냉각탑의 내부 표면 온도가 -120℃ 미만이면 실행가능한 낙하 거리에 걸쳐 액적이 완전히 동결될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 냉각탑의 내부 표면은 내부 표면과 열적 접촉하는 하나 이상의 파이프를 통해 냉각제를 통과시킴으로써 냉각된다. 냉각제는 원하는 온도의 액체 질소 또는 질소 증기일 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 단계 a)에서 수득되는 펠릿의 펠릿 크기 중앙값은 약 ≥ 200 μm 내지 약 ≤ 1500 μm이다. 약 ≥ 500 μm 내지 약 ≤ 900 μm의 펠릿 크기 중앙값이 바람직하다.
200 μm보다 작은 크기의 펠릿은 이러한 펠릿에서 동결이 더 빠르기 때문에 동결-건조된 항-FXIa 항체가 손상될 수 있고 따라서 결합 친화도가 손실되어 더 높은 표적 용량을 요구할 수 있기 때문에 덜 유리하다. 또한, 생성된 분말의 정전기적 영향은 200 μm 미만의 크기에서 급격히 증가하여 본 공정 생성물의 취급 특성이 저하되며, 수증기에 펠릿이 포획되어 수율 손실이 예상될 수 있다.
펠릿 크기를 1500 μm 초과로 늘리면 기재된 설정에서 펠릿이 완전히 동결될 위험이 있으므로 이후 생성물의 전체 품질이 손상될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 단계 a)에서 항-FXIa 항체를 포함하는 용액은 ≥ 5 중량% 내지 ≤ 30 중량%의 용해된 고체 함량을 갖는다. ≥ 10 중량% 내지 ≤ 20 중량%의 용해된 고체의 함량이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 단계 a)에서 항-FXIa 항체를 포함하는 용액은 ≥ 5 mg/ml 내지 ≤ 300 mg/ml, 특히 ≥ 50 mg/ml 내지 ≤ 250 mg/ml, 더욱 특히 ≥ 100 mg/ml 내지 ≤ 200 mg/ml의 항체 농도를 갖는다.
투여를 위한 항-FXIa 항체의 필요 농도는 상대적으로 높을 수 있으며, 이는 일반적으로 동결건조물을 포함하는 통상적으로 수득되는 항-FXIa 항체의 재구성 시간이 비현실적으로 긴 문제를 야기한다. 본 발명에 따른 방법은 재구성 매질에서 상당히 더 빠르게 용해되는 동결-건조된 항-FXIa 항체를 포함하는 펠릿을 생성하는 것으로 실험적으로 밝혀졌다. 이 발견은 전혀 예상치 못한 일이었다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 단계 a)에서 항-FXIa 항체를 포함하는 용액은 용액 100 ml에 대해
항-FXIa 항체 ≥ 0.5 g 내지 ≤ 30 g
트레할로스 ≥ 1 g 내지 ≤ 25 g
히스티딘 ≥ 50 mg 내지 ≤ 1.5 g
글리신 ≥ 50 mg 내지 ≤ 1.5 g
아르기닌 ≥ 50 mg 내지 ≤ 5 g
폴리소르베이트 80 ≥ 5 mg 내지 ≤ 0.5 g
의 조성을 갖고, 나머지는 주사용수이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿에 관한 것이다. 상술된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 수득되는 동결-건조된 항-FXIa 항체를 포함하는 펠릿은 통상적인 동결-건조로 수득되는 동결건조물 또는 WO　2006/008006에 개시되는 바와 같은 유사한 분무-동결-기반 방법으로 수득되는 동결-건조된 펠릿과 비교하여 명백히 상이한 특성을 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿은 동일한 항-FXIa 항체를 포함하는 시작 용액 (공정 단계 a)에서 항-FXIa 항체를 포함하는 용액)을 통상적인 동결-건조에 적용함으로써 생성되는 동등한 항-FXIa 항체를 포함하는 동결건조물 또는 WO 2006/008006에 개시된 동결-건조 방법에 비해 상당히 더 짧은 재구성 시간을 나타낸다. 주사 전자 현미경 (SEM)은 3가지의 상이한 동결-건조 방법으로 수득되는 동결건조물 간의 형태학적 차이를 더욱 보여준다. 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 펠릿은 특히 균일한 표면 및 낮은 미세붕괴 발생을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 동결-건조된 펠릿의 한 실시양태에서, 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿은 통상적인 동결-건조에 의해 수득되는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결건조물에 비해 감소된 재구성 시간을 나타낸다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예를 참조하여 추가로 설명될 것이며 이에 의해 제한되는 것을 원하지 않는다.
도 1은 본 발명에 따른 방법을 위한 장치를 개략적으로 도시한다.
도 2는 항체 용액의 통상적인 동결-건조 (방법 1) 동안 시간에 따라 측정된 온도 및 압력 프로파일을 그래프로 도시한다.
도 3은 WO 2006/008006 (방법 2)에 기재된 방법에 따라 항체 용액의 동결 및 건조 동안 시간에 따라 측정된 온도 및 압력 프로파일을 그래프로 도시한다.
도 4는 본 발명 (방법 3)에 따른 항체 용액의 처리 동안 시간에 따라 측정된 냉각탑의 온도 프로파일을 그래프로 도시한다.
도 5는 본 발명 (방법 3)에 따른 항체 용액의 동결 및 건조 동안 시간에 따라 측정된 온도 및 압력 프로파일을 그래프로 도시한다.
도 6은 본 발명 (방법 3)에 따라 생산된 펠릿의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진을 도시한다.
도 7은 통상적인 동결-건조 (방법 1)에 따라 생산된 동결건조물의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진을 도시한다.
도 8은 WO 2006/008006 (방법 2)에 개시된 동결-건조 공정에 따라 생산된 동결건조물의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진을 도시한다.
도 1은 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 장치를 개략적으로 도시한다. 장치는 주요 구성 요소로서 냉각탑(100) 및 진공 건조 챔버(200)를 포함한다. 냉각탑은 내벽(110) 및 외벽(120)을 포함하여 내벽(110)과 외벽(120) 사이에 공간(130)을 형성한다.
이 공간(130)은 배관 형태의 냉각 수단(140)을 수용한다. 냉각제는 도면의 화살표로 표시되는 바와 같이 냉각 수단(140)으로 들어가고 나갈 수 있다.
냉각 수단(140)을 통해 유동하는 냉각제는 내벽(110)을 냉각시키므로 냉각탑(100)의 내부를 냉각시킨다. 동결된 펠릿 (냉동 펠릿)의 생산에서, 액체는 노즐(150)을 통해 냉각탑에 분무된다. 액체 액적은 참조 번호(160)로 표시된다.
액체 액적은 결국 아래로 향하는 경로에서 응고 (동결)되며, 이는 참조 번호(170)로 표시된다. 동결된 펠릿(170)은 밸브(190)가 진공 건조 챔버(200)로 들어가는 것을 허용하는 슈트(180)를 따라 이동한다.
본원에는 도시되지 않았지만, 슈트(180)는 펠릿(170)이 폐쇄된 밸브(190) 전에 수집되는 동안 동결 상태를 유지하도록 온도 제어되는 것이 물론 가능하고 심지어 바람직하다.
진공 건조 챔버(200) 내부에는 건조될 동결된 펠릿을 수용할 회전가능한 드럼(210)이 위치된다. 회전은 펠릿으로의 효율적인 에너지 전달을 달성하기 위해 수평 축을 중심으로 발생한다. 열은 드럼을 통하거나 캡슐화된 적외선 히터를 통해 도입될 수 있다. 그 결과, 참조 번호(220)로 표시된 동결-건조된 펠릿이 수득된다.
실시예
실시예 1: 통상적인 동결-건조에 의한 동결건조
이 실시예는 076D-M007-H04-CDRL3-N110D를 포함하는 액체 고농도 조성물의 통상적인 동결건조 (방법 1)를 기재한다. 조성물은 히스티딘-글리신-아르기닌 버퍼 시스템을 포함하였다. 안정화제로 트레할로스를 첨가하였다. 076D-M007-H04-CDRL3-N110D는 20 mM L-히스티딘, 50 mM L-아르기닌 히드로클로라이드, 50 mM 글리신, 5% 트레할로스 이수화물, 0.10% 폴리소르베이트 80, pH 5.0 (조성물 32)에 약 150 mg/ml로 제형화되었다.
적절한 동결건조 공정을 개발하려면 1차 건조를 수행할 수 있는 온도를 결정하는 붕괴 온도를 결정하는 것이 필수적이었다. 붕괴 온도는 리오-현미경 (lyo-microscope) (리오스태트 2 (Lyostat 2), 바이오파르마 (Biopharma))을 사용하여 진공 (0.1 mbar)을 끌어오기 전에 조성물을 -50℃로 동결시키고 샘플을 1℃/분의 램프로 20.0℃로 가열함으로써 측정하였다. 가열하는 동안, 조성물 사진을 촬영하고, 시험된 시스템의 붕괴가 관찰될 때까지 분석하였다.
076D-M007-H04-CDRL3-N110D의 붕괴 온도는 -14.3℃인 것으로 밝혀졌으며, 다음 동결건조 주기를 선택하기 위한 필수 파라미터이다.
항-FXIa 항체 076D-M007-H04-CDRL3-N110D를 포함하는 액체 조성물 32는 통상적인 동결-건조 방법 (방법 1)에 따라 처리되었다. 150 mg/ml 항-FXIa 항체를 함유하는 용액을 10R 유형 I 유리 바이알에 충전시키고, 통상적인 바이알 동결 건조기에서 동결-건조시켰다. 총 20개의 바이알을 바이알당 2.25 ml 용액으로 충전시키고, 마개를 절반만 씌우고, 버티스 제네시스 (Virtis Genesis) 동결 건조기에 적재하였다. 용액을 -45℃로 동결시키고, 1차 건조를 +10℃에서 수행한 다음, 40℃에서 2차 건조 단계를 수행하였다. 완전한 동결 건조 과정은 대략 38시간이 필요하였다. 바이알을 동결 건조기 내에서 마개를 씌우고, 적재를 푼 후 직접적으로 밀봉하였다.
조성물 32에 대한 통상적인 동결-건조 방법 (방법 1)에 따른 동결건조 주기의 세부 사항은 표 1에 요약되어 있다.
<표 1>
Figure pct00001
이렇게 수행된 통상적인 동결-건조 공정 동안 시간에 따라 측정된 압력 및 온도 프로파일은 도 2에 그래프로 도시된다.
상술된 통상적인 동결건조 방법은 이후에 재구성될 수 있는 황색 케이크 또는 분말을 생성하였다.
동결건조물의 재구성을 위해, 재구성 매질로서 주사용 멸균수 2 ml를 각각의 바이알에 주입하였다. 이어서, 바이알을 약 10 내지 20초 동안 부드럽게 교반하였다. 통상적인 동결-건조에 의해 수득된 이 동결건조물의 재구성은 재구성 시간이 137분이었다.
재구성 후, 어떠한 가시적인 입자도 없는 투명한 황색 용액이 관찰되었다. 응집 또는 응집의 힌트가 검출되지 않았다.
실시예 2: 2가지의 상이한 분무-동결-건조 방법에 의한 동결건조
실시예 1에 기재된 바와 같은 통상적인 동결-건조 방법 (방법 1)에 의해 수득된 동결건조물의 재구성 시간이 2시간 초과로 허용할 수 없을 정도로 길었기 때문에, 2가지의 상이한 동결-건조 방법을 적용하고 상술된 바와 같은 통상적인 동결-건조와 비교하였다.
먼저, 항-FXIa 항체 076D-M007-H04-CDRL3-N110D를 포함하는 액체 조성물 32를 WO 2006/008006에 기재된 방법 (방법 2)에 따라 처리하였다. 150 mg/ml 항-FXIa 항체를 포함하는 138 ml 용액을 400 μm 노즐을 통해 분무하고, 약 19.5 g/분의 속도 및 220 mbar의 압력 오버레이로 470 Hz의 주파수로 세분화하였다. 액적은 노즐에서 대략 25 cm 아래로 위치되고 공정 동안 교반되는 액체 질소로 충전된 격리된 용기에서 동결되었다. 분무가 완료된 후, 동결된 펠릿을 사전-냉각된 체를 통해 액체 질소를 부어 꺼내고, 플라스틱 호일이 늘어선 강철 랙에서 버티스 아드밴티지 프로 (Virtis Advantage Pro) 동결 건조기의 사전-냉각된 선반 위에 놓고, 동결건조시켰다. 1차 건조는 0℃ 선반 온도에서 33시간 동안 수행한 후, 30℃에서 5시간 동안 2차 건조를 수행하였다. 건조 완료 후, 건조된 펠릿을 유리병에 즉시 전달하고 단단히 폐쇄하였다. 그 후, 520 mg의 펠릿을 건조 질소 분위기 하에서 10R 유형 I 유리 바이알로 무게를 재었다. WO 2006/008006에 기재된 방법에 따른 항체 용액의 동결 및 건조 동안 시간에 따라 측정된 압력 및 온도 프로파일은 도 3에 그래프로 도시된다.
두번째로, 항-FXIa 항체 076D-M007-H04-CDRL3-N110D를 포함하는 액체 조성물 32를
a) 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적을 동결시켜 펠릿을 형성하는 단계;
b) 펠릿을 동결-건조시키는 단계
를 포함하고;
여기서 단계 a)에서 액적은 온도-제어가능한 내벽 표면 및 용액의 동결 온도 미만의 내부 온도를 갖는 냉각탑 내로의 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적 형성에 의해 형성되고, 단계 b)에서 펠릿은 진공 챔버 내부에 수용된 회전 리셉터클에서 동결-건조되는 것인,
본 발명에 따른 동결-건조된 펠릿의 재구성 시간을 감소시키기 위한 분무-동결-건조 기반 방법 (방법 3)에 따라 처리하였다.
이를 위해, 150 mg/ml 항-FXIa 항체를 함유하는 250 ml 용액을 벽-냉각된 냉각탑에 분무하여 이 용액을 동결-건조시켰다. 분무 노즐은 직경 400 μm의 하나의 구멍을 가졌다. 이는 약 800 μm의 액적 크기에 해당한다. 진동 주파수는 1445Hz이고 편향 압력은 0.4 bar였으며, 펌프는 14 rpm에서 작동하였다. 건조 완료 후, 건조된 펠릿을 유리병에 즉시 전달하고 단단히 폐쇄하였다. 그 후, 520 mg의 펠릿을 건조 질소 분위기 하에서 10R 유형 I 유리 바이알로 무게를 재었다. 시간에 따라 측정된 냉각탑의 온도 프로파일은 도 4에 그래프로 도시된다. 항체 용액의 동결 및 건조 동안 시간에 따라 측정된 온도 및 압력 프로파일은 도 5에 그래프로 도시된다.
본 발명에 따른 동결-건조 방법 (방법 3)은 좁은 크기 및 중량 분포 및 높은 표면적을 나타내는 균일한 펠릿을 생성하였다. 이 방법으로 수득된 펠릿의 잔류 습도는 0.268%였다. 통상적인 동결-건조 (방법 1)에 의해 수득된 동결건조물은 0.15%의 잔류 수분을 포함하였다.
3가지의 상이한 동결-건조 공정으로 수득된 펠릿의 크기 배제 크로마토그래피 분석은 표 2에 제공된다.
<표 2>
Figure pct00002
종합적으로, 3가지 동결-건조 방법에 대해 크기 배제 크로마토그래피로 비교가능한 분석 데이터를 수득하였다.
샘플에 존재하는 전체 단백질성 성분과 비교하여 온전한 항체의 양을 결정하기 위해, IgG 순도를 모세관 SDS-겔 전기영동 (CGE)으로 분석하였다. 시험 및 참조 샘플은 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)의 존재 하에 노출된 융합-실리카 모세관을 사용하여 CGE로 분리되었다. 시험은 비-환원 조건 하에 수행되었다. 분리된 샘플은 220 nm에서 흡광도로 모니터링되었다. 검정의 의도는 환원 후 주요 피크의 피크 면적을 통합하고 부산물을 분석하는 것이었다.
모세관 겔 전기영동 (CGE) 및 ELISA 분석 결과는 표 3에 제공된다.
<표 3>
Figure pct00003
3가지의 상이한 동결-건조 방법으로 수득된 펠릿의 재구성 시간은 하기와 같이 비교되었다. 재구성 매질로서 주사용 멸균수 2 ml를 각각의 바이알에 주입하였다. 사진을 찍은 후, 바이알을 약 10 내지 20초 동안 부드럽게 교반하였다. 시간 경과에 따른 펠릿의 재구성을 시각적으로 관찰하고 사진으로 문서화하였다.
3가지의 상이한 동결-건조 방법으로 수득된 펠릿의 재구성 시간은 하기에 제공된다:
동결-건조 방법 재구성 시간 Ab 농도
방법 1 137분 150 mg/ml
방법 2 16분 150 mg/ml
방법 3 11분 150 mg/ml
본 발명에 따른 방법 (방법 3)으로 수득된 동결-건조된 항-FXIa 항체를 포함하는 펠릿의 재구성은 통상적인 동결-건조 (방법 1)로 수득된 동등한 항-FXIa 항체를 포함하는 동결건조물의 재구성보다 상당히 더 빠르고, 또한 WO 2006/008006 (방법 2)에 따라 수득된 동결-건조된 펠릿에 비해서도 더 빨랐다.
이어서, 3가지의 상이한 동결-건조 방법으로 수득된 펠릿을 주사 전자 현미경 (SEM) 측정하였다. 따라서, 샘플 제조는 질소 분위기 하에서 글로브 백에서 수행되었으며, 각각의 샘플은 개별적으로 제조되었다. 샘플을 홀더에 놓고, 금으로 스퍼터링하였다. 그 후, 주사 전자 현미경 측정을 수행하였다. SEM 사진은 도 6-8에 도시된다.
본 발명에 따른 방법에 따라 생산된 펠릿은 특히 균일한 형태를 나타내며, 이는 이후 공정 단계에서 취급 특성을 개선할 수 있음을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer AG <120> Method for the production of freeze-dried pellets comprising an anti-coagulation factor XIa (FXIa) antibody <130> BHC191033 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr 20 25 30 Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (13)

  1. a) 항-응고 인자 XIa (FXIa) 항체를 포함하는 용액의 액적을 동결시켜 펠릿을 형성하는 단계;
    b) 펠릿을 동결-건조시키는 단계
    를 포함하고;
    단계 a)에서 액적은 온도-제어가능한 내벽 표면(110) 및 용액의 동결 온도 미만의 내부 온도를 갖는 냉각탑(100) 내로의 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적 형성에 의해 형성되고,
    단계 b)에서 펠릿은 진공 챔버(200) 내부에 수용된 회전 리셉터클(210)에서 동결-건조되는 것을 특징으로 하는, 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿을 생산하는 방법.
  2. a) 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적을 동결시켜 펠릿을 형성하는 단계;
    b) 펠릿을 동결-건조시키는 단계
    를 포함하고;
    단계 a)에서 액적은 온도-제어가능한 내벽 표면(110) 및 용액의 동결 온도 미만의 내부 온도를 갖는 냉각탑(100) 내로의 항-FXIa 항체를 포함하는 용액의 액적 형성에 의해 형성되고,
    단계 b)에서 펠릿은 진공 챔버(200) 내부에 수용된 회전 리셉터클(210)에서 동결-건조되는 것을 특징으로 하는, 통상적인 동결-건조에 의해 수득되는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결건조물과 비교하여 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 재구성 시간을 감소시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b) 후에
    c) 동결-건조된 펠릿을 저장 및 균질화하는 단계
    d) 동결-건조된 펠릿을 용기에 적재하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)에서 액적이 주파수-보조된 노즐을 통해 용액을 통과시킴으로써 액적 형성에 의해 제조되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 진동 주파수가 ≥ 200 Hz 내지 ≤ 5000 Hz, 특히 ≥ 400 Hz 내지 ≤ 4000 Hz이거나 ≥ 100 Hz 내지 ≤ 2000 Hz인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 냉각탑(100)의 내부 표면(110)이 ≤ -120℃의 온도를 갖는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 냉각탑(100)의 내부 표면(110)이 내부 표면(110)과 열적 접촉하는 하나 이상의 파이프(140)를 통해 냉각제를 통과시킴으로써 냉각되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 수득되는 펠릿의 펠릿 크기 중앙값이 약 ≥ 200 μm 내지 ≤ 1500 μm, 특히 약 ≥ 500 μm 내지 ≤ 900 μm인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 항-FXIa 항체를 포함하는 용액이 ≥ 5 중량% 내지 ≤ 30 중량%, 특히 ≥ 10 중량% 내지 ≤ 20 중량%의 용해된 고체의 함량을 갖는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 항-FXIa 항체를 포함하는 용액이 ≥ 5 mg/ml 내지 ≤ 300 mg/ml, 특히 ≥ 50 mg/ml 내지 ≤ 250 mg/ml, 더욱 특히 ≥ 100 mg/ml 내지 ≤ 200 mg/ml의 항체 농도를 갖는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 항-FXIa 항체를 포함하는 용액이 용액 100 ml에 대해
    항-FXIa 항체 ≥ 0.5 g 내지 ≤ 30 g
    트레할로스 ≥ 1 g 내지 ≤ 25 g
    히스티딘 ≥ 50 mg 내지 ≤ 1.5 g
    글리신 ≥ 50 mg 내지 ≤ 1.5 g
    아르기닌 ≥ 50 mg 내지 ≤ 5 g
    폴리소르베이트 80 ≥ 5 mg 내지 ≤ 0.5 g
    의 조성을 갖고, 나머지는 주사용수인 방법.
  12. 제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿.
  13. 제12항에 있어서, 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿이 통상적인 동결-건조에 의해 수득되는 항-FXIa 항체를 포함하는 동결건조물과 비교하여 감소된 재구성 시간을 나타내는 것인 항-FXIa 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿.
KR1020217003292A 2018-07-05 2019-07-05 항-응고 인자 XIa (FXIa) 항체를 포함하는 동결-건조된 펠릿의 생산 방법 KR20210029221A (ko)

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