BR112020026492A2

BR112020026492A2 - Método para a produção de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo antifator de coagulação xia (fxia)

Info

Publication number: BR112020026492A2
Application number: BR112020026492-0A
Authority: BR
Inventors: Stefan Christian SCHNEID; Stefan Heke; Matthias Plitzko
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 2018-07-05
Filing date: 2019-07-05
Publication date: 2021-04-06
Also published as: CN112367975A; SG11202100028PA; WO2020008022A1; EP3817723A1; IL279865A; PE20210779A1; SG11202100046UA; JP2021529800A; EP3817727A1; KR20210029221A; WO2020008035A1; MX2021000037A; AR115713A1; AU2019297498A1; PE20210462A1; CA3105261A1; MX2021000028A; BR112020026789A2; US20210290534A1; KR20210028673A

Abstract

patente de invenção: método para a produção de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo antifator de coagulação xia (fxia). a presente invenção refere-se a um método para a produção de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo anti-fxia que compreende as etapas de: a) congelar gotículas de uma solução compreendendo um anticorpo anti-fxia para formar péletes; b) liofilizar os péletes; em que na etapa a) os péletes são formados por meio da formação de gotículas da solução compreendendo um anticorpo anti-fxia em uma torre de resfriamento que tem uma superfície de parede interna controlável por temperatura e uma temperatura interna abaixo da temperatura de congelamento da solução, e em que em etapa b) os péletes são liofilizados em um receptáculo rotativo que está alojado dentro de uma câmara a vácuo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO

PARA A PRODUÇÃO DE PÉLETES LIOFILIZADOS

COMPREENDENDO UM ANTICORPO ANTIFATOR DE COAGULAÇÃO XIa (FXIa)”.

[0001] A presente invenção refere-se a um método para a produção de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo antifator de coagulação XIa (FXIa), o método compreendendo as etapas de: a) congelar gotículas de uma solução compreendendo um anticorpo anti- FXIa para formar péletes; e b) liofilizar os péletes. A presente invenção refere-se ainda a um método para reduzir o tempo de reconstituição de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo anti-FXIa e péletes liofilizados compreendendo um anticorpo anti-FXIa obtido pelo método de acordo com a presente invenção.

[0002] Em 1964, Macfarlane e Davie & Ratnoff [Macfarlane RG. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its functin as a biochemical amplifier. Nature 1964; 202: 498-9; Davie EW, Ratnoff OD. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science 1964; 145: 1310-

2.] introduziram suas hipóteses em cascata para o processo de coagulação do sangue. Desde então, o conhecimento nesta invenção da função da coagulação in vivo cresceu. Nos últimos anos, a teoria de duas vias distintas, a chamada via extrínseca e intrínseca, que iniciam a coagulação e convergem em uma via comum, levando à geração de trombina e deposição de fibrina, tem sido revisada. No modelo atual, a iniciação da coagulação ocorre quando o fator VII ativado pela protease plasmática entra em contato e, com isso, forma um complexo com o Fator Tecidual (FT). Este complexo Fator Tecidual-FVIIa pode ativar o zimogênio FX em sua forma ativa FXa, que, por sua vez, pode converter a protrombina (fator de coagulação II) em trombina (Ila). A trombina, peça chave na coagulação, por sua vez, pode catalisar a conversão do fibrinogênio em fibrina. Além disso, a trombina ativa receptores específicos expressos pelas plaquetas, o que leva à ativação destas. As plaquetas ativadas em combinação com a fibrina são essenciais para a formação do coágulo e, portanto, são peças fundamentais da hemostasia normal.

[0003] A segunda via de amplificação é formada pelo fator de coagulação XI (FXI). Está bem confirmado que o FXI é, como os outros membros da cascata de coagulação, um zimogênio de serina protease plasmática com um papel chave na ligação entre a fase de iniciação e a fase de amplificação da coagulação do sangue in vivo [Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry 1991; 30: 10363-70; Gailani D, Broze Jr GJ. Factor XI activation in a revised modelo of blood coagulation. Science 1991; 253: 909-12; Kravtsov DV, Matafonov A, Tucker El, Sun MF, Walsh PN, Gruber A, e outros. O fator XI contribui para a geração de trombina na ausência do fator XII. Blood 2009; 1 14: 452-8.3-5]. O fator XI de coagulação (FXI) é sintetizado no fígado e circula no plasma como um dímero ligado por ligação dissulfeto complexado com Cininogênio de Alto Peso Molecular (HMWK). Cada cadeia polipeptídica deste dímero tem aproximadamente 80 kD. O zimogênio Fator XI é convertido em sua forma ativa, o fator de coagulação Xla (FXIa), seja por meio da fase de contato da coagulação do sangue, seja por meio da ativação mediada por trombina na superfície das plaquetas. Durante essa ativação do fator XI, uma ligação peptídica interna é clivada em cada uma das duas cadeias, resultando no fator Xla ativado, uma serina protease composta por duas cadeias pesadas e duas leves mantidas juntas por ligações dissulfeto. Esta serina protease FXIa converte o fator de coagulação IX em IXa, que subsequentemente ativa o fator de coagulação X (Xa). Xa, então, pode mediar a ativação do fator de coagulação II / trombina.

[0004] A deficiência de FXI geralmente não leva a sangramento espontâneo, mas está associada ao aumento do risco de sangramento com provocações hemostáticas, enquanto a severidade do sangramento está fracamente correlacionada com o nível plasmático de FXI. A deficiência severa de FXI em humanos tem certos efeitos protetores de doenças trombóticas. No entanto, um alto nível de FXI foi associado a eventos trombóticos. A inibição de FXI foi, portanto, proposta como uma nova abordagem no desenvolvimento de novos antitrombóticos para atingir uma relação risco-benefício melhorada.

[0005] O documento WO 2013/167669 descreve anticorpos capazes de se ligar seletivamente à forma ativada do fator plasmático XI, FXIa, inibindo assim a agregação plaquetária e trombose associada. Esses anticorpos revelaram não comprometer a hemostasia.

[0006] Como muitos outros biofármacos, as imunoglobulinas não são estáveis em solução por longos períodos de tempo. A liofilização, também conhecida como secagem por congelamento, é um processo para secar material termossensível e / ou sensível à hidrólise por meio da sublimação de cristais de gelo em vapor de água, ou seja, por meio da transição direta de água da fase sólida para a fase gasosa.

[0007] Em processos convencionais, a liofilização é geralmente realizada em câmaras de liofilização padrão compreendendo uma ou mais bandejas ou prateleiras dentro de uma câmara de secagem (a vácuo). Os frascos podem ser preenchidos com o produto a ser liofilizado e dispostos nessas bandejas. Esses secadores normalmente não têm paredes com temperatura controlada e fornecem transferência de calor não homogênea para os frascos colocados na câmara do secador. Especialmente aqueles frascos que são posicionados nas bordas trocam energia de forma mais intensa do que aqueles posicionados no centro das placas, devido à transferência de calor radiante e à condução de gás no espaço entre a parede da câmara e a pilha de placas / prateleiras. Esta não uniformidade de distribuição de energia leva a uma variação da cinética de congelamento e secagem entre os frascos nas bordas e aqueles no centro, podendo resultar em variação nas atividades dos conteúdos ativos dos respectivos frascos e perdas de rendimento do produto. Para garantir a uniformidade do produto final, é necessário realizar um extenso trabalho de desenvolvimento e validação tanto em escala de laboratório quanto em escala de produção.

[0008] O documento WO 2006/008006 A1 refere-se a um processo de fabricação estéril, incluindo liofilização, armazenamento, ensaio e enchimento de produtos biofarmacêuticos peletizados em recipientes finais, tais como frascos. O processo descrito combina congelamento por pulverização e liofilização e compreende as etapas de: a) congelar gotículas do produto para formar péletes, em que as gotículas são formadas pela passagem de uma solução do produto através de bicos assistidos por frequência e péletes são formadas a partir das ditas gotículas, passando-as através de um fluxo contracorrente de gás criogênico; b) liofilizar os péletes; c) armazenar e homogeneizar os péletes liofilizados; d) ensaiar os péletes liofilizados enquanto estão sendo armazenados e homogeneizados; e e) carregar os péletes liofilizados nos ditos recipientes.

[0009] O documento WO 2013/050156 A1 descreve uma linha de processo para a produção de partículas liofilizadas sob condições fechadas compreendendo pelo menos uma câmara de pulverização para geração de gotículas e liofilização das gotículas de líquido para formar partículas e um liofilizador em massa para liofilizar as partículas, o liofilizador compreendendo um tambor rotativo para receber as partículas. Além disso, uma seção de transferência é fornecida para uma transferência de produto da câmara de pulverização para o liofilizador. Para a produção das partículas sob condições fechadas de ponta a ponta, cada um dos dispositivos e da seção de transferência é adaptado separadamente para a operação preservando a esterilidade do produto a ser liofilizado e / ou contenção.

[0010] O documento WO 2013/050161 A1 descreve uma linha de processo para a produção de partículas liofilizadas em condições fechadas, a linha de processo compreendendo um liofilizador para a produção em massa de partículas liofilizadas em condições fechadas, o liofilizador compreendendo um tambor rotativo para receber as partículas congeladas, e uma câmara a vácuo estacionária que aloja o tambor rotativo, em que para a produção das partículas em condições fechadas, a câmara a vácuo é adaptada para operação fechada durante o processamento das partículas. O tambor está em comunicação aberta com a câmara a vácuo e pelo menos uma seção de transferência é fornecida para uma transferência de produto entre um dispositivo separado da linha de processo e o liofilizador, o liofilizador e a seção de transferência sendo separadamente adaptados para operação fechada, em que a seção de transferência compreende uma superfície de parede interna controlável por temperatura.

[0011] Os anticorpos terapêuticos podem requerer a administração de altas doses em volumes limitados e, portanto, altas concentrações do anticorpo na solução final a ser administrada, o que resulta em tempos de reconstituição impraticavelmente longos de até várias horas para produtos convencionalmente liofilizados, restringindo a aplicabilidade da liofilização sob tais circunstâncias. Um método para a produção de anticorpo anti-FXIa compreendendo péletes liofilizados com um tempo de reconstituição reduzido seria favorável. Além disso, um método de liofilização para a produção de anticorpo anti-FXIa compreendendo péletes liofilizados que evita danos ao anticorpo anti- FXIa durante o processamento e, portanto, as perdas de afinidade de ligação, seria desejável. Em particular, variações na atividade (por exemplo, afinidade de ligação) entre péletes individuais devem ser evitadas. De preferência, deveria ser possível realizar tal método de liofilização para a produção de anticorpo anti-FXIa compreendendo péletes sob condições de separação estritas a partir do exterior para garantir esterilidade - o que significa que o resfriamento por um fluxo de resfriamento contracorrente ou concorrente de um gás criogênico tal como nitrogênio líquido precisaria ser evitado. Por último, um processo reproduzível produzindo péletes liofilizados homogêneos de distribuição de peso e tamanho estreita ofereceria vantagens importantes para manipulação posterior. A presente invenção tem como objetivo fornecer tal método. Nenhuma das referências da técnica mencionadas anteriormente descreve tal método.

[0012] O objetivo declarado acima é alcançado de acordo com a presente invenção por um método para a produção de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo anti-FXIa, o método compreendendo as etapas de:

[0013] a) congelar gotículas de uma solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa para formar péletes;

[0014] b) liofilizar os péletes;

[0015] em que na etapa a) as gotículas são formadas por meio da formação de gotículas da solução compreendendo um anticorpo anti- FXIa em uma torre de resfriamento que tem uma superfície de parede interna controlável por temperatura e uma temperatura interna abaixo da temperatura de congelamento da solução e na etapa b) os péletes são liofilizados em um receptáculo rotativo que está alojado dentro de uma câmara a vácuo.

[0016] O princípio de operação do método de acordo com a invenção tem várias vantagens distintas. Em primeiro lugar, deve ser notado que no método de acordo com a invenção, as gotículas pulverizadas do anticorpo anti-FXIa compreendendo a solução não entram em contato com um gás criogênico em um fluxo contracorrente,

como descrito em WO 2006/008006 A1. Não há necessidade de introduzir um gás criogênico no espaço interno da torre de resfriamento e, portanto, todas as etapas de manipulação e esterilização do gás criogênico podem ser omitidas. Todas as etapas do método de acordo com a invenção podem ser realizadas em condições estéreis e sem comprometer a esterilidade entre as etapas individuais.

[0017] Em segundo lugar, verificou-se experimentalmente que o método de acordo com a presente invenção não resulta em danos significativos ao anticorpo anti-FXIa, evitando assim perdas de afinidade de ligação no produto final. De fato, o anticorpo anti-FXIa compreendendo os péletes liofilizados obtidos pelo método de acordo com a presente invenção exibiu afinidade de ligação aumentada com o antígeno FXIa conforme avaliado por ELISA indireto em comparação com o anticorpo anti-FXIa compreendendo liofilizados obtidos por liofilização convencional ou pelo processo de liofilização de acordo com o documento WO 2006/008006. A prevenção de danos ao anticorpo anti-FXIa permite o preenchimento preciso de uma quantidade desejada de anticorpo anti-FXIa ativo dentro de uma estreita faixa especificada. Além disso, o método de acordo com a presente invenção permite mais flexibilidade no depósito dos péletes liofilizados em diversos volumes e sistemas de aplicação em comparação com a liofilização padrão.

[0018] Em terceiro lugar, conduzindo a etapa de liofilização em um receptáculo rotativo dentro da câmara a vácuo, a posição espacial de cada pélete individual é uniformemente distribuída ao longo do tempo. Isso garante condições de secagem uniformes e, portanto, elimina variações espaciais da atividade do anticorpo, por exemplo, afinidade de ligação, como seria o caso de frascos liofilizados em uma prateleira.

[0019] Por último, foi surpreendentemente descoberto que o anticorpo anti-FXIa compreendendo péletes produzidos de acordo com a presente invenção exibe um tempo de reconstituição consideravelmente reduzido, em particular em comparação com o anticorpo anti-FXIa compreendendo liofilizados obtidos por liofilização convencional, mas também em comparação com péletes obtidos pelo processo descrito em WO 2006/008006 A1.

[0020] A criação de péletes congelados pode ser realizada de acordo com qualquer tecnologia conhecida. É importante, no entanto, evitar a queda de gotículas compreendendo anticorpo em nitrogênio líquido para formar péletes.

[0021] Tendo em vista a subsequente etapa de liofilização, os péletes congelados apresentam favoravelmente uma distribuição de tamanho de partículas estreita. Posteriormente, os péletes congelados podem ser transportados em condições estéreis e frias para um liofilizador. Os péletes são então distribuídos através das superfícies de transporte dentro da câmara de secagem pela rotação do receptáculo. A secagem por sublimação é, em princípio, possível em qualquer tipo de liofilizador adequado para péletes. Liofilizadores que fornecem espaço para fluxo de vapor de sublimação, temperaturas de parede controladas e áreas transversais adequadas entre a câmara de secagem e o condensador são preferenciais.

[0022] Detalhes das variantes do anticorpo anti-FXIa que podem ser empregues no método de acordo com a invenção são descritos abaixo.

[0023] O anticorpo anti-FXIa a ser usado de acordo com a presente invenção é capaz de se ligar à forma ativada do fator XI plasmático, FXIa. De preferência, o anticorpo anti-FXIa se liga especificamente a FXIa. De preferência, o anticorpo anti-FXIa é capaz de inibir a agregação plaquetária e trombose associada. De preferência, a inibição da agregação plaquetária mediada por anticorpos não compromete a hemostasia primária dependente das plaquetas. No contexto da presente invenção, o termo “sem comprometer a hemostasia” significa que a inibição do fator de coagulação XIa não leva a eventos de sangramento indesejáveis e mensuráveis.

[0024] Tal como aqui utilizado, “fator de coagulação XIa”, “fator XIa” ou “FXIa” refere-se a qualquer FXIa de qualquer espécie de mamífero que expressa o fator zimogênio XI. Por exemplo, FXIa pode ser de humano, primata não humano (tal como babuíno), camundongo, cachorro, gato, vaca, cavalo, porco, coelho e qualquer outra espécie que expressa o fator de coagulação XI envolvido na regulação do fluxo sanguíneo, coagulação, e / ou trombose.

[0025] Tal como aqui utilizado, um anticorpo “liga-se especificamente a”, é “específico para” ou “reconhece especificamente” um antígeno (aqui, FXIa) se tal anticorpo é capaz de discriminar entre tal antígeno e um ou mais antígenos de referência, uma vez que a especificidade de ligação não é absoluta, mas uma propriedade relativa. Em sua forma mais geral (e quando nenhuma referência definida é mencionada), “ligação específica” se refere à capacidade do anticorpo de discriminar entre o antígeno de interesse e um antígeno não relacionado, conforme determinado, por exemplo, de acordo com um dos seguintes métodos. Tais métodos compreendem, mas não estão limitados a Western blots, testes de ELISA, RIA, ECL, IRMA e varreduras de peptídeos. Por exemplo, pode ser realizado um ensaio ELISA padrão. O escore pode ser realizado por desenvolvimento de cor padrão (por exemplo, anticorpo secundário com peróxido de rábano e tetrametil benzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em certos poços é classificada pela densidade óptica, por exemplo, em 450 ran. O fundo típico (= reação negativa) pode ser 0,1 OD; a reação positiva típica pode ser 1 OD. Isso significa que a diferença positiva / negativa pode ser mais de 10 vezes. Tipicamente, a determinação da especificidade de ligação é realizada usando não um único antígeno de referência, mas um conjunto de cerca de três a cinco antígenos não relacionados, tal como leite em pó, BSA, transferrina ou similares.

[0026] No entanto, “ligação específica” também pode se referir à capacidade de um anticorpo de discriminar entre o antígeno alvo e um ou mais antígenos estreitamente relacionados, por exemplo, homólogos, que são usados como pontos de referência. Por exemplo, o anticorpo pode ter pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 5 vezes 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes, 106 vezes ou afinidade relativa maior com o antígeno alvo em comparação com o antígeno de referência. Adicionalmente, “ligação específica” pode estar relacionada com a capacidade de um anticorpo discriminar entre diferentes partes do seu antígeno alvo, por exemplo, diferentes domínios ou regiões de FXIa.

[0027] “Afinidade” ou “afinidade de ligação” KD são frequentemente determinados pela medição da constante de associação em equilíbrio (ka) e constante de dissociação em equilíbrio (kd) e cálculo do quociente de kd para ka (KD = kd / ka). O termo “imunoespecífico” ou “ligação específica” significa preferencialmente que o anticorpo se liga ao fator de coagulação XIa com uma afinidade KD menor ou igual a 106 M (afinidade monovalente). O termo “alta afinidade” significa que o KD que o anticorpo se liga ao fator de coagulação XIa com uma afinidade KD menor ou igual a 107 M (afinidade monovalente). Tais afinidades podem ser prontamente determinadas usando técnicas convencionais, tal como por diálise em equilíbrio; usando o instrumento BIAcore 2000, usando os procedimentos gerais descritos pelo fabricante; por radioimunoensaio usando antígeno alvo radiomarcado; ou por outro método conhecido pelo versado na técnica. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método descrito por Kaufman RJ, Sharp PA. (1982) Amplification and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary dna gene. [J Mol Biol.159: 601 a 621].

[0028] Tal como aqui utilizado, o termo “anticorpo” inclui moléculas de imunoglobulina (por exemplo, qualquer tipo, incluindo IgG, IgE1, IgM, IgD, IgA e IgY, e / ou qualquer classe, incluindo IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e Ig A2) isolado da natureza ou preparado por meios recombinantes e inclui todos os anticorpos convencionalmente conhecidos e fragmentos funcionais dos mesmos. O termo “anticorpo” também se estende a outros arcabouços de proteína que são capazes de orientar insertos de CDR de anticorpo na mesma conformação de ligação ativa encontrada em anticorpos naturais, de modo que a ligação do antígeno alvo observada com essas proteínas quiméricas seja mantida em relação à atividade de ligação do anticorpo natural a partir do qual as CDRs foram derivadas.

[0029] Um “fragmento funcional” ou “fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno” de um anticorpo / imunoglobulina é aqui definido como um fragmento de um anticorpo / imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de uma IgG) que mantém a região de ligação ao antígeno. Uma “região de ligação ao antígeno” de um anticorpo é tipicamente encontrada em uma ou mais regiões hipervariáveis de um anticorpo, isto é, as regiões CDR-1, -2 e / ou -3; no entanto, as regiões de “estrutura” variáveis também podem desempenhar um papel importante na ligação ao antígeno, tal como fornecendo um arcabouço para as CDRs. De preferência, a “região de ligação ao antígeno” compreende pelo menos resíduos de aminoácidos 4 a 103 da cadeia leve variável (VL) e 5 a 109 da cadeia pesada variável (VH), mais preferencialmente resíduos de aminoácidos 3 a 107 de VL e 4 a 111 de VH, e particularmente preferenciais são as cadeias VL e VH completas (posições de aminoácidos 1 a 109 de VL e 1 a 113 de VH; numeração de acordo com WO 97/08320). Uma classe preferencial de imunoglobulinas para uso na presente invenção é IgG.

[0030] “Fragmentos funcionais” da invenção incluem fragmentos Fab, Fab1, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos, Fvs ligados por ligação dissulfeto (sdFv), e fragmentos compreendendo um domínio VL ou VH, que são preparados a partir de imunoglobulinas intactas ou preparados por meios recombinantes.

[0031] Os fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno podem compreender a(s) região(ões) variável(eis) isoladamente ou em combinação com todas ou uma parte das seguintes: região de dobradiça, domínios CH1, CH2, CH3 e CL. Também estão incluídos na invenção fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno compreendendo qualquer combinação de região(ões) variável(eis) com uma região de dobradiça, domínio CH1 CH2, CH3 e CL.

[0032] O anticorpo e / ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno pode ser monoespecífico (por exemplo, monoclonal), biespecífico, triespecífico ou de maior multiespecificidade. De preferência, um anticorpo monoclonal é usado. O termo “anticorpo monoclonal”, conforme aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados pela cultura homogênea, não contaminada por outras imunoglobulinas com especificidades e características diferentes. O modificador “monoclonal”

indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular.

[0033] O anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno pode ser, por exemplo, humano, humanizado, murino (por exemplo, camundongo e rato), de burro, ovelha, coelho, cabra, porquinho-da-Índia, camelídeo, cavalo ou galinha. De preferência, um anticorpo anti-FXIa humano ou humanizado é usado.

[0034] Tal como aqui utilizado, anticorpos “humanos” incluem anticorpos tendo a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobulinas humanas, de células B humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas, bem como anticorpos humanos sintéticos.

[0035] Um “anticorpo humanizado” ou fragmento de anticorpo humanizado funcional é definido aqui como aquele que é (i) derivado de uma fonte não humana (por exemplo, um camundongo transgênico que possui um sistema imunológico heterólogo), anticorpo que é baseado em uma sequência de linhagem germinativa humana; ou (ii) quimérico, em que o domínio variável é derivado de uma origem não humana e o domínio constante é derivado de uma origem humana ou (iii) enxertado com CDR, em que as CDRs do domínio variável são de origem não humana, enquanto uma ou mais estruturas do domínio variável são de origem humana e o domínio constante (se houver) é de origem humana.

[0036] Os anticorpos adequados para o método de acordo com a presente invenção são, por exemplo, descritos no documento WO 2013/167669. Em modalidades particulares, o anticorpo anti-FXIa compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos de CDR como mostrado na Tabela 9 de WO 2013/167669. Em modalidades particulares, o anticorpo anti-FXIa compreende pelo menos uma das sequências de aminoácidos para o domínio de cadeia leve variável e pelo menos uma das sequências de aminoácidos para o domínio de cadeia pesada variável como mostrado na Tabela 9 de WO 2013/167669. Em tais modalidades particulares, o anticorpo anti-FXIa compreende i) SEQ ID NO: 19 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável de cadeia leve e SEQ ID NO: 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável de cadeia pesada; ou ii) SEQ ID NO: 29 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável de cadeia leve e SEQ ID NO: 30 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável de cadeia pesada; ou iii) SEQ ID NO: 27 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável de cadeia leve e SEQ ID NO: 20 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável de cadeia pesada. Em modalidades particulares, o anticorpo anti-FXIa é selecionado a partir dos anticorpos 076D-M007-H04, 076D- M007-H04-CDRL3-N110D e 076D-M028-H17 descritos em WO 2013/167669. Em modalidades preferencialmente particulares, o anticorpo anti-FXIa é 076D-M007-H04-CDRL3-N110D, aqui representado por SEQ ID NO: 1 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável de cadeia pesada e SEQ ID NO: 2 para a sequência de aminoácidos para o domínio variável de cadeia leve.

[0037] Em modalidades particulares, o anticorpo anti-FXIa é conjugado a uma outra porção, em particular um fármaco.

[0038] As modalidades e aspectos adicionais da presente invenção serão descritos abaixo. Eles podem ser combinados livremente, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0039] Para a presente invenção, qualquer anticorpo anti-FXIa ou fragmento funcional ou variante do mesmo pode ser processado sem a necessidade de variação adicional do próprio processo. Para a realização da redução vantajosa do período de tempo necessário para a reconstituição, é, no entanto, relevante que um anticorpo anti-FXIa seja processado no método de acordo com a presente invenção.

[0040] O processo preferencialmente evita danos potenciais ao polipeptídeo do anticorpo anti-FXIa e, portanto, perdas de atividade / afinidade no produto final.

[0041] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um método para reduzir o tempo de reconstituição de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo anti-FXIa em comparação com o anticorpo anti-FXIa compreendendo liofilizados obtidos por liofilização convencional, o método compreendendo as etapas de:

[0042] a) congelar gotículas de uma solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa para formar péletes;

[0043] b) liofilizar os péletes;

[0044] em que na etapa a) as gotículas são formadas por meio da formação de gotículas da solução compreendendo um anticorpo anti- FXIa em uma torre de resfriamento (100) que tem uma superfície de parede interna controlável por temperatura (110) e uma temperatura interna abaixo da temperatura de congelamento da solução, e em que na etapa b) os péletes são liofilizados em um receptáculo rotativo (210) que está alojado dentro de uma câmara a vácuo (200).

[0045] No contexto da presente invenção, os termos “liofilização convencional” e “convencionalmente liofilizado” referem-se a um processo de liofilização padrão em frascos realizado em uma câmara de liofilização padrão compreendendo uma ou mais bandejas ou prateleiras dentro uma câmara de secagem (a vácuo) e não inclui a etapa de processo de congelamento por pulverização. Tipicamente, o produto a ser liofilizado é preenchido em frascos que são então colocados na câmara de secagem (a vácuo).

[0046] No contexto da presente invenção, o termo “redução do tempo de reconstituição de péletes liofilizados em comparação com liofilizados obtidos por liofilização convencional” deve ser entendido como uma redução do período de tempo necessário para a dissolução completa ou quase completa dos péletes liofilizados obtidos pelo método de acordo com a presente invenção após a adição do meio de reconstituição, por exemplo, água estéril, em comparação com os liofilizados obtidos por liofilização convencional. O tempo de reconstituição é particularmente reduzido em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70 %, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%. No contexto da presente invenção, o termo “reconstituição / dissolução completa ou quase completa de péletes liofilizados” refere-se à dissolução de pelo menos 98% do teor de sólidos dos péletes liofilizados no meio de reconstituição, mais particularmente de pelo menos 98,5% do teor de sólidos dos péletes liofilizados, mais particularmente pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,75% ou pelo menos 99,9% do teor de sólidos dos péletes liofilizados.

[0047] Em uma modalidade do método de acordo com a invenção, o método compreende ainda as etapas c) e d) após a etapa b):

[0048] c) armazenar e homogeneizar os péletes liofilizados;

[0049] d) carregar os péletes liofilizados em recipientes.

[0050] A etapa de armazenamento e homogeneização c) também pode ser realizada no receptáculo rotativo dentro da câmara a vácuo usada para liofilização. Na etapa d), quantidades definidas pelo usuário de péletes liofilizados são colocadas nos recipientes finais. Os recipientes de armazenamento são transferidos para uma linha de envasamento isolada e ancorados em uma estação de ancoragem estéril. O conteúdo dos recipientes é transferido de dentro do isolador para o armazenamento da máquina envasadora. O método de acordo com a invenção que resulta em nenhum ou apenas um dano mínimo ao anticorpo anti-FXIa processado permite o envasamento preciso da quantidade de anticorpo desejada dentro de intervalos estreitos especificados. O método de acordo com a presente invenção permite o envasamento flexível e individualizado em recipientes para uso final.

[0051] Em outra modalidade do método de acordo com a invenção na etapa a) as gotículas são formadas por meio da formação de gotículas da solução passando através de bicos assistidos por frequência. De preferência, a frequência de oscilação é de ≥ 200 Hz a ≤ 5000 Hz, mais particularmente de ≥ 400 Hz a ≤ 4000 Hz ou de ≥ 1000 Hz a ≤ 2000 Hz.

[0052] Independentemente de o bico ser assistido por frequência, o diâmetro da abertura do bico pode estar na faixa de 100 µm a 500 µm, de preferência na faixa de 200 µm a 400 µm, muito preferencialmente na faixa de 300 µm a 400 µm. Os ditos diâmetros de bico resultam em tamanhos de gotículas na faixa de cerca de 200 µm a cerca de 1000 µm, de preferência na faixa de cerca de 400 µm a cerca de 900 µm, muito preferencialmente na faixa de cerca de 600 µm a 800 µm.

[0053] Neste contexto, um tamanho de “cerca de” um determinado valor, por exemplo, o limite superior ou inferior de uma determinada faixa de tamanho deve ser entendido como abrangendo todos os tamanhos de gotículas desviando até ± 30% deste dado valor. Por exemplo, um tamanho de gotícula resultante de cerca de 400 µm abrange tamanhos de gotícula que variam entre 280 µm e 520 µm. Da mesma forma, a faixa de tamanho de cerca de 100 µm a cerca de 500 µm deve ser entendida como abrangendo tamanhos de gotícula de 70 µm a 650 µm.

[0054] As gotículas formadas exibem uma certa distribuição de tamanho de gotícula em torno de um valor médio que deve ser próximo ao citado acima.

[0055] Nas modalidades da invenção em que o bico é assistido por frequência, a variação em torno do valor médio pode ser menor. Tendo em vista os efeitos descritos abaixo, a passagem das gotículas através de um bico assistido por frequência é, portanto, uma vantagem adicional para reduzir ainda mais o impacto negativo potencial nos péletes liofilizados finais. Também neste contexto, o termo “cerca de” um determinado valor deve ser entendido como englobando todos os valores desviando até ± 30% deste dado valor.

[0056] Geralmente as gotículas dos tamanhos dados acima são vantajosas, pois foi descoberto que as etapas subsequentes b) a d) podem ser realizadas com boa manutenção da afinidade do anticorpo anti-FXIa.

[0057] Sem estar limitado a isso, supõe-se que gotículas menores congelam muito rapidamente na etapa de congelamento a) devido à razão de superfície para volume muito maior e que o frágil anticorpo anti-FXIa é, portanto, parcialmente destruído. Além disso, gotículas menores resultam em péletes menores que têm uma tendência aumentada de se tornarem eletrostaticamente carregados, o último prejudicando a manipulação subsequente de tais péletes. Por exemplo, a queda de péletes congelados menores eletrostaticamente carregados através da torre de resfriamento tende a ser menos direcionada, resultando em péletes que permanecem para trás na torre, diminuindo assim o rendimento do produto. Gotículas maiores não congelam de maneira homogênea. O congelamento incompleto do compartimento do núcleo interno das gotículas faz com que os péletes congelados se aglomerem na parte inferior da torre, evitando a formação de um volume de pélete homogêneo e, assim, dificultando o processamento posterior. O congelamento não homogêneo pode resultar ainda na destruição parcial do anticorpo anti-FXIa na casca externa do pellet congelado e destruição parcial do anticorpo anti-FXIa no núcleo interno incompletamente congelado durante o armazenamento.

[0058] Em outra modalidade do método de acordo com a invenção, na etapa a) a superfície interna da torre de resfriamento tem uma temperatura não superior a -120° C, de preferência de ≥ -180° C a ≤ - 120° C. De preferência, a temperatura é de ≥ −160° C a ≤ −140° C.

[0059] As temperaturas citadas acima de ≥ −160° C a ≤ −140° C são otimizadas para tamanhos de gotículas na faixa de cerca de ≥ 600 μm a cerca de ≤ 800 μm que são congeladas enquanto caem a uma distância de 2 m a 4 m, particularmente cerca de 3 m.

[0060] Principalmente, não há limite superior em relação à distância de queda. A temperatura da superfície interna na torre de resfriamento e a distância de queda são escolhidas adequadamente de modo que as gotículas de um determinado tamanho sejam completamente congeladas na distância de queda escolhida. Uma temperatura da superfície interna na torre de resfriamento abaixo de -120° C permite o congelamento completo das gotículas em distâncias de queda viáveis.

[0061] Em outra modalidade do método de acordo com a invenção, a superfície interna da torre de resfriamento é resfriada pela passagem de um refrigerante através de um ou mais tubos que estão em contato térmico com a superfície interna. O refrigerante pode ser nitrogênio líquido ou vapor de nitrogênio a uma temperatura desejada.

[0062] Em outra modalidade do método de acordo com a invenção, o tamanho médio dos péletes obtidos na etapa a) é de cerca de ≥ 200 μm a cerca de ≤ 1500 μm. É preferencial um tamanho médio de pélete de cerca de ≥ 500 μm a cerca de ≤ 900 μm.

[0063] Péletes de tamanho menor do que 200 µm são menos favoráveis, pois nesses péletes o congelamento seria mais rápido, o que pode resultar em danos ao anticorpo anti-FXIa liofilizado e, portanto, perda na afinidade de ligação exigindo dosagem alvo mais alta. Além disso, as influências eletrostáticas do pó resultante aumentam drasticamente em tamanhos abaixo de 200 µm, levando a propriedades de manipulação inferiores do produto do presente processo, e podem ser esperadas perdas de rendimento devido ao aprisionamento de péletes no vapor de água.

[0064] O aumento do tamanho do pélete para mais de 1500 µm pode colocar em risco o congelamento completo do pélete na configuração descrita e, portanto, prejudicar a qualidade geral de um produto posterior.

[0065] Em outra modalidade do método de acordo com a invenção, a solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa na etapa a) tem um teor de sólidos dissolvidos de ≥ 5% em peso a ≤ 30% em peso. É preferencial um teor de sólidos dissolvidos de ≥ 10% em peso a ≤ 20% em peso.

[0066] Em outra modalidade do método de acordo com a invenção, a solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa na etapa a) tem uma concentração de anticorpo de ≥ 5 mg / ml a ≤ 300 mg / ml, particularmente de ≥ 50 mg / ml a ≤ 250 mg / ml, mais particularmente de ≥ 100 mg / ml a ≤ 200 mg / ml.

[0067] A concentração necessária do anticorpo anti-FXIa para administração pode ser relativamente alta, o que comumente causa problemas de tempos de reconstituição impraticavelmente longos de anticorpo anti-FXIa convencionalmente obtido compreendendo liofilizados. Verificou-se experimentalmente que o método de acordo com a presente invenção produz um anticorpo anti-FXIa liofilizado que compreende péletes que são dissolvidos de forma significativamente mais rápida em meio de reconstituição. Esse achado foi totalmente inesperado.

[0068] Em outra modalidade do método de acordo com a invenção, a solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa na etapa a) tem a seguinte composição em relação a 100 ml da solução, o equilíbrio sendo água para injeção:

[0069] Anticorpo anti-FXIa de ≥ 0,5 g a ≤ 30 g

[0070] Trealose de ≥ 1 g a ≤ 25 g

[0071] Histidina de ≥ 50 mg a ≤ 1,5 g

[0072] Glicina de ≥ 50 mg a ≤ 1,5 g

[0073] Arginina de ≥ 50 mg a ≤ 5 g

[0074] Polissorbato 80 de ≥ 5 mg a ≤ 0,5 g

[0075] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a péletes liofilizados compreendendo um anticorpo anti-FXIa que pode ser obtido pelo método de acordo com a invenção. Conforme detalhado acima, o anticorpo anti-FXIa liofilizado compreendendo péletes obtidos pelo método de acordo com a presente invenção mostra características distintamente diferentes em comparação com liofilizados obtidos por liofilização convencional ou péletes liofilizados obtidos por um método congelamento por pulverização similar baseado em WO 2006/008006. Em particular, o anticorpo anti-FXIa compreendendo péletes liofilizados obtidos pelo método de acordo com a presente invenção mostra tempos de reconstituição significativamente mais curtos em comparação com o anticorpo anti-FXIa equivalente compreendendo liofilizados que foram gerados submetendo um anticorpo anti-FXIa idêntico compreendendo solução (solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa na etapa a) do processo) à liofilização convencional ou ao método de liofilização descrito em WO 2006/008006. A microscopia eletrônica de varredura (SEM) revelou ainda diferenças morfológicas entre os liofilizados obtidos pelos três métodos diferentes de liofilização. Os péletes obtidos pelo método de acordo com a presente invenção são caracterizados por uma superfície particularmente homogênea e baixa ocorrência de microcolapsos.

[0076] Em uma modalidade dos péletes liofilizados de acordo com a invenção, os péletes liofilizados compreendendo um anticorpo anti- FXIa exibem um tempo de reconstituição reduzido em comparação com o anticorpo anti-FXIa compreendendo liofilizados obtidos por liofilização convencional.

[0077] A presente invenção será ainda descrita com referência às seguintes figuras e exemplos, sem desejar ser limitado por eles. Figuras:

[0078] A Figura 1 mostra esquematicamente um aparelho para o método de acordo com a invenção.

[0079] A Figura 2 representa graficamente o perfil de temperatura e pressão medido ao longo do tempo durante a liofilização convencional (Método 1) da solução de anticorpo.

[0080] A Figura 3 representa graficamente o perfil de temperatura e pressão medido ao longo do tempo durante o congelamento e secagem da solução de anticorpo de acordo com o método descrito em WO 2006/008006 (Método 2).

[0081] A Figura 4 representa graficamente o perfil de temperatura na torre de resfriamento medido ao longo do tempo durante o processamento da solução de anticorpo de acordo com a presente invenção (Método 3).

[0082] A Figura 5 representa graficamente o perfil de temperatura e pressão medido ao longo do tempo durante o congelamento e secagem da solução de anticorpo de acordo com a presente invenção (Método 3).

[0083] A Figura 6 mostra imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) de um pélete produzido de acordo com a presente invenção (Método 3).

[0084] A Figura 7 mostra imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) de um liofilizado produzido de acordo com a liofilização convencional (Método 1).

[0085] A Figura 8 mostra imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) de um liofilizado produzido de acordo com o processo de liofilização descrito em WO 2006/008006 (Método 2).

[0086] A Figura 1 representa esquematicamente um aparelho para conduzir o método de acordo com a invenção. O aparelho compreende, como componentes principais, a torre de resfriamento 100 e a câmara de secagem a vácuo 200. A torre de resfriamento compreende uma parede interna 110 e uma parede externa 120, definindo assim um espaço 130 entre a parede interna 110 e a parede externa 120.

[0087] Este espaço 130 aloja um meio de resfriamento 140 em forma de tubulação. Um refrigerante pode entrar e sair do meio de resfriamento 140, conforme indicado pelas setas do desenho.

[0088] O refrigerante que flui através do meio de resfriamento 140 leva a um resfriamento da parede interna 110 e, assim, a um resfriamento do interior da torre de resfriamento 100. Na produção de péletes congelados (criopéletes), o líquido é pulverizado na torre de resfriamento através do bico 150. Gotículas de líquido são simbolizadas de acordo com o número de referência 160.

[0089] As gotículas de líquido eventualmente se solidificam (congelam) em seu caminho para baixo, o que é simbolizado de acordo com o número de referência 170. Os péletes congelados 170 descem por uma calha 180, onde uma válvula 190 permite a entrada na câmara de secagem a vácuo 200.

[0090] Embora não representado aqui, está claro que também é possível e até mesmo preferencial que a calha 180 seja controlada por temperatura de modo a manter os péletes 170 em um estado congelado enquanto eles são coletados antes da válvula fechada 190.

[0091] Dentro da câmara de secagem a vácuo 200, um tambor rotativo 210 está localizado para acomodar os péletes congelados a serem secos. A rotação ocorre em torno do eixo horizontal de modo a conseguir uma transferência eficiente de energia para os péletes. O calor pode ser introduzido através do tambor ou através de um aquecedor infravermelho encapsulado. Como um resultado final, são obtidos péletes liofilizados simbolizados pelo número de referência 220. Exemplos Exemplo 1: Liofilização por secagem por congelamento convencional

[0092] Este exemplo descreve a liofilização convencional (Método 1) de uma composição líquida de alta concentração compreendendo 076D-M007-H04-CDRL3-N110D. A composição compreendia um sistema tampão histidina-glicina-arginina. Trealose foi adicionada como estabilizador. 076D-M007-H04-CDRL3-N110D foi formulado em aproximadamente 150 mg / ml em:

[0093] L-Histidina a 20 mM, cloridrato de L-arginina a 50 mM, glicina a 50 mM, trealose di-hidratada a 5%, polissorbato 80 a 0,10%, pH 5,0 (composição 32).

[0094] Para desenvolver um processo de liofilização adequado, era essencial determinar a temperatura de colapso que decidia em qual temperatura a secagem primária poderia ser realizada. A temperatura de colapso foi medida usando um lio-microscópio (Lyostat 2, Biopharma) congelando a composição a -50° C antes de extrair o vácuo (0,1 mbar) e aquecendo a amostra com uma rampa de 1° C / minuto a 20° C. Durante o aquecimento da composição, fotos foram tiradas e analisadas até que um colapso do sistema testado pudesse ser observado.

[0095] A temperatura de colapso de 076D-M007-H04-CDRL3- N110D foi de -14,3° C e é um parâmetro essencial para a seleção do ciclo de liofilização seguinte.

[0096] A composição líquida 32 compreendendo o anticorpo anti- FXIa 076D-M007-H04-CDRL3-N110D foi processada de acordo com um método de liofilização convencional (Método 1). A solução contendo 150 mg / ml de anticorpo anti-FXIa foi envasada em frascos de vidro

10R tipo I e liofilizada em um liofilizador de frasco convencional. Um total de 20 frascos foram envasados com 2,25 ml de solução por frasco, semi-tampados e carregados em um liofilizador Virtis Genesis. A solução foi congelada a -45° C, e a secagem primária foi realizada a +10° C, seguida por uma etapa de secagem secundária a 40° C. O processo de liofilização completo exigiu aproximadamente 38 horas. Os frascos foram tampados dentro do liofilizador e selados imediatamente após a descarga.

[0097] Os detalhes do ciclo de liofilização de acordo com um método de liofilização convencional (Método 1) para a composição 32 estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1: Ciclo de liofilização da composição 32 (Método 1) Tempo Temperatura Pressão [hh:mm] [° C] [mbar] Carregamento 00:01 20,0 1000 Congelamento 00:30 -5,0 1000 Congelamento 01:00 -5,0 1000 Congelamento 00:40 -45,0 1000 Congelamento 03:30 -45,0 1000 Evacuação 00:01 -45,0 0,100 Secagem 01:00 10 0,1 primária Secagem 19:00 10 0,1 primária Secagem 01:00 40 0,04 secundária Secagem 10:00 40 0,04 secundária Resumo do tempo Carregamento 00:01 Congelamento 05:41 Secagem 20:00 primária Secagem 11:00 secundária Total 36:42

[0098] O perfil de pressão e temperatura medido ao longo do tempo durante o processo de liofilização convencional assim conduzido é representado graficamente na Figura 2.

[0099] O método de liofilização convencional descrito acima resultou em um bolo ou pó amarelado que pode ser subsequentemente reconstituído.

[0100] Para a reconstituição do liofilizado, 2 ml de água estéril para injeção como meio de reconstituição foram injetados em cada um dos frascos. Os frascos foram então agitados suavemente durante cerca de 10 a 20 segundos. A reconstituição deste liofilizado obtido por liofilização convencional resultou em um tempo de reconstituição de 137 min.

[0101] Após a reconstituição, foi observada uma solução clara amarelada sem quaisquer partículas visíveis. Nenhuma agregação ou indicações de agregação foram detectadas. Exemplo 2: Liofilização por dois diferentes métodos de secagem por pulverização e congelamento

[0102] Como o tempo de reconstituição do liofilizado obtido por um método de liofilização convencional, conforme descrito no Exemplo 1 (Método 1) foi, com mais de 2 horas, inaceitavelmente longo, dois outros métodos de liofilização diferentes foram aplicados e comparados com o a secagem por congelamento convencional conforme descrito acima.

[0103] Em primeiro lugar, a composição líquida 32 compreendendo o anticorpo anti-FXIa 076D-M007-H04-CDRL3-N110D foi processada de acordo com o método descrito em WO 2006/008006 (Método 2). 138 ml de solução contendo 150 mg / ml de anticorpo anti-FXIa foram pulverizados através de um bico de 400 µm e atomizados a uma frequência de 470 Hz com uma taxa de cerca de 19,5 g / min e uma sobreposição de pressão de 220 mbar. As gotículas foram congeladas em um recipiente isolado preenchido com nitrogênio líquido que foi posicionado aproximadamente 25 cm abaixo do bico e agitado durante todo o processo. Após a conclusão da pulverização, os péletes congelados foram removidos despejando o nitrogênio líquido através de uma peneira pré-resfriada e colocados em uma prateleira de aço forrada com folha de plástico nas prateleiras pré-resfriadas de um liofilizador Virtis Advantage Pro e liofilizados. A secagem primária foi conduzida em temperatura de prateleira de 0° C ao longo de uma duração de 33 horas, seguida pela secagem secundária por 5 horas a 30° C. Após a conclusão da secagem, os péletes secos foram instantaneamente transferidos para garrafas de vidro que foram fechadas com firmeza. Subsequentemente, 520 mg de péletes foram pesados em frascos de vidro 10R tipo I sob uma atmosfera de nitrogênio seco. O perfil de pressão e temperatura medido ao longo do tempo durante o congelamento e a secagem da solução de anticorpo de acordo com o método descrito em WO 2006/008006 é representado graficamente na Figura 3.

[0104] Em segundo lugar, a composição líquida 32 compreendendo o anticorpo anti-FXIa 076D-M007-H04-CDRL3-N110D foi processada de acordo com o método baseado em secagem por pulverização e congelamento para reduzir o tempo de reconstituição de péletes liofilizados de acordo com a presente invenção (Método 3) que compreende as etapas de:

[0105] a) congelar gotículas de uma solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa para formar péletes;

[0106] b) liofilizar os péletes;

[0107] em que na etapa a) as gotículas são formadas por meio da formação de gotículas da solução compreendendo um anticorpo anti- FXIa em uma torre de resfriamento que tem uma superfície de parede interna controlável por temperatura e uma temperatura interna abaixo da temperatura de congelamento da solução, e na etapa b) os péletes são liofilizados em um receptáculo rotativo que está alojado dentro de uma câmara a vácuo.

[0108] Para este propósito, 250 ml de solução contendo 150 mg / ml de anticorpo anti-FXIa foram liofilizados pulverizando a solução em uma torre de resfriamento de parede resfriada. O bico de pulverização tinha uma abertura com um diâmetro de 400 μm. Isso corresponde a um tamanho de gotícula de cerca de 800 μm. A frequência de oscilação foi de 1445 Hz, a pressão de deflexão de 0,4 bar e a bomba foi operada a 14 rpm. Após a conclusão da secagem, os péletes secos foram instantaneamente transferidos para garrafas de vidro que foram fechadas com firmeza. Subsequentemente, 520 mg de péletes foram pesados em frascos de vidro 10R tipo I sob uma atmosfera de nitrogênio seco. O perfil de temperatura na torre de resfriamento medido ao longo do tempo é representado graficamente na Figura 4. O perfil de temperatura e pressão medido ao longo do tempo durante o congelamento e a secagem da solução de anticorpo é representado graficamente na Figura 5.

[0109] O método de liofilização de acordo com a presente invenção (Método 3) produziu péletes uniformes exibindo uma distribuição de tamanho e peso estreita e uma área de superfície elevada. A umidade residual nos péletes obtidos por este método foi de 0,268%. Os liofilizados obtidos por liofilização convencional (Método 1) continham 0,15% de umidade residual.

[0110] As análises de cromatografia por exclusão de tamanho dos péletes obtidos pelos três diferentes processos de liofilização são fornecidas na Tabela 2.

[0111] Tabela 2: Análises de cromatografia por exclusão de tamanho dos péletes obtidos pelos três processos de liofilização diferentes

SEC Soma de agregados Dímero [% Soma de agregados de alto Monômero Amostra de baixo peso área] peso molecular (HMW) [% área] molecular (LMW) Método 3 1,66 1,82 1,20 96,96 (como descrito aqui) Método 1 1,35 1,41 1,13 97,45 (Liofilização Convencional) Método 2 1,57 1,77 1,15 97,07 (WO 2006/008006)

[0112] No geral, dados analíticos comparáveis foram obtidos por cromatografia por exclusão de tamanho para os três métodos de liofilização.

[0113] Para determinar a quantidade de anticorpo intacto em relação aos componentes proteináceos gerais presentes na amostra, a pureza de IgG foi analisada por eletroforese em gel de SDS capilar (CGE). As amostras de teste e de referência foram separadas por CGE usando um capilar nu de sílica fundida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS). O teste foi realizado em condições não redutoras. As amostras separadas foram monitoradas por absorbância a 220 nm. A intenção do ensaio era integrar a área do pico do pico principal e analisar os subprodutos após a redução.

[0114] Os resultados da eletroforese em gel capilar (CGE) e análises de ELISA são apresentados na Tabela 3.

[0115] Tabela 3: Eletroforese em gel capilar (CGE) e análises de ELISA dos péletes obtidos pelos três diferentes processos de liofilização

CGE ELISA IgG HL

HHL HH Amostra [% área [% área [% área corr.] [% área corr.] corr.] corr.] 112 Método 3 95,82 2,51 0,38 0,18 (111,95) 101 Método 1 95,80 2,60 0,36 0,17 (100,73) Método 2 95,83 2,55 0,38 0,17 87 (86,87)

[0116] Os tempos de reconstituição dos péletes obtidos pelos três diferentes métodos de liofilização foram comparados como segue. 2 ml de água estéril para injeção como meio de reconstituição foram injetados em cada um dos frascos. Depois de tirar as fotografias, os frascos foram agitados suavemente durante cerca de 10 a 20 segundos. A reconstituição dos péletes ao longo do tempo foi observada visualmente e documentada fotograficamente.

[0117] Os tempos de reconstituição dos péletes obtidos pelos três diferentes métodos de liofilização são dados abaixo:

[0118] Método de Tempo de Concentração

[0119] Liofilização Reconstituição de Ab

[0120] Método 1 137 min 150 mg / ml

[0121] Método 2 16 min 150 mg / ml

[0122] Método 3 11 min 150 mg / ml

[0123] A reconstituição do anticorpo anti-FXIa liofilizado compreendendo péletes obtidos com o método de acordo com a presente invenção (Método 3) foi significativamente mais rápida do que a reconstituição de anticorpo anti-FXIa equivalente compreendendo liofilizados obtidos por liofilização convencional (Método 1), mas também mais rápido em comparação com péletes liofilizados obtidos de acordo com WO 2006/008006 (Método 2).

[0124] Os péletes obtidos pelos três diferentes métodos de liofilização foram posteriormente submetidos a medições de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Portanto, o preparo das amostras foi realizado em uma sacola-luva sob atmosfera de nitrogênio, sendo cada amostra preparada individualmente. A amostra foi colocada em um suporte e pulverizada com ouro. Posteriormente, foi realizada a medição de microscopia eletrônica de varredura. Imagens SEM são mostradas nas Figuras 6 a 8.

[0125] Pode-se observar que os péletes produzidos de acordo com o método de acordo com a invenção apresentam uma morfologia particularmente homogênea, o que pode melhorar as propriedades de manipulação em etapas posteriores do processo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo antifator de coagulação XIa (FXIa), o método compreendendo as etapas de: a) congelar gotículas de uma solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa para formar péletes; b) liofilizar os péletes; caracterizado pelo fato de que na etapa a) as gotículas são formadas por meio da formação de gotículas da solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa em uma torre de resfriamento (100) que tem uma superfície de parede interna controlável por temperatura (110) e uma temperatura interna abaixo da temperatura de congelamento da solução e que na etapa b) os péletes são liofilizados em um receptáculo rotativo (210) que está alojado dentro de uma câmara a vácuo (200).

2. Método para reduzir o tempo de reconstituição de péletes liofilizados compreendendo um anticorpo anti-FXIa em comparação com o anticorpo anti-FXIa compreendendo liofilizados obtidos por liofilização convencional, compreendendo as etapas de: a) congelar gotículas de uma solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa para formar péletes; b) liofilizar os péletes; caracterizado pelo fato de que na etapa a) as gotículas são formadas por meio da formação de gotículas da solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa em uma torre de resfriamento (100) que tem uma superfície de parede interna controlável por temperatura (110) e uma temperatura interna abaixo da temperatura de congelamento da solução e que na etapa b) os péletes são liofilizados em um receptáculo rotativo (210) que está alojado dentro de uma câmara a vácuo (200).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ainda compreende as etapas c) e d) após a etapa b): c) armazenar e homogeneizar os péletes liofilizados; d) carregar os péletes liofilizados em recipientes.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que na etapa a), as gotículas são feitas por meio de formação de gotículas passando a solução através de bicos assistidos por frequência.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a frequência de oscilação é de ≥ 200 Hz a ≤ 5000 Hz, particularmente de ≥ 400 Hz a ≤ 4000 Hz ou é de ≥ 100 Hz a ≤ 2000 Hz.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que na etapa a), a superfície interna (110) da torre de resfriamento (100) tem uma temperatura de ≤ -120° C.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a superfície interna (110) da torre de resfriamento (100) é resfriada passando um refrigerante através de um ou mais tubos (140) que estão em contato térmico com a superfície interna (110).

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o tamanho médio dos péletes obtidos na etapa a) é de cerca de ≥ 200 μm a ≤ 1500 μm, particularmente de cerca de ≥ 500 μm a ≤ 900 μm.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa na etapa a) tem um teor de sólidos dissolvidos de ≥ 5% em peso a ≤ 30% em peso, particularmente de ≥ 10% em peso a ≤

20% em peso.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa na etapa a) tem uma concentração de anticorpo de ≥ 5 mg / ml a ≤ 300 mg / ml, particularmente de ≥ 50 mg / ml a ≤ 250 mg / ml, mais particularmente de ≥ 100 mg / ml a ≤ 200 mg / ml.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo um anticorpo anti-FXIa na etapa a) tem a seguinte composição em relação a 100 ml da solução, o equilíbrio sendo água para injeção: Anticorpo anti-FXIa de ≥ 0,5 g a ≤ 30 g Trealose de ≥ 1 g a ≤ 25 g Histidina de ≥ 50 mg a ≤ 1,5 g Glicina de ≥ 50 mg a ≤ 1,5 g Arginina de ≥ 50 mg a ≤ 5 g Polissorbato 80 de ≥ 5 mg a ≤ 0,5 g

12. Péletes liofilizados, caracterizados pelo fato de que compreendem um anticorpo anti-FXIa obtido pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 11.

13. Péletes liofilizados, caracterizados pelo fato de que compreendem um anticorpo anti-FXIa, de acordo com a reivindicação 12, em que os péletes liofilizados compreendem um anticorpo anti-FXIa exibem um tempo de reconstituição reduzido em comparação com o anticorpo anti-FXIa compreendendo liofilizados obtidos por liofilização convencional.