KR20210019915A - 메밀 발효 추출물을 유효성분으로 하는 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메밀 발효 추출물을 유효성분으로 하는 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 메밀에 대한 발효 추출공정을 거침으로서 그 효능을 증대시키고, 나아가 종래의 기능성 원료와 복합적으로 사용함으로써 그 효능을 더욱 증대시킬 수 있는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 이를 위한 본 발명은 쓴 메밀 추출물과 가르시니아 추출물을 유효성분으로 하여 이루어진 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물이다. 또한, 본 발명은 쓴 메밀 추출물과 와일드망고종자 추출물을 유효성분으로 하여 이루어진 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물이다.

Description

메밀 발효 추출물을 유효성분으로 하는 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물{Functional health food composition for Preventing and Improving Obesity and metabolic disease fermented fagopyrum tataricum extract}

본 발명은 메밀 발효 추출물을 유효성분으로 하는 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 메밀에 대한 발효 추출공정을 거침으로서 그 효능을 증대시키고, 나아가 종래의 기능성 원료와 복합적으로 사용함으로써 그 효능을 더욱 증대시킬 수 있는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

최근 경제적 발전과 과도한 영양 섭취 등의 식습관 변화에 의해 비만, 당뇨병, 고인슐린 혈증, 지질 이상증, 고혈압, 동맥경화 또는 간질환 등 다양한 질환을 포함하는 대사성 질환의 발병이 급증하고 있다. 이와 같은 질환들은 각각 발생하기도 일반으로 서로 밀접한 관련을 맺고 있으면서 여러 증상들이 복합적으로 동반 발생되는 경우가 대부분이다.

현재 대한민국 성인 비만율은 33.4%로 OECD는 우리나라 고도비만 인구가 2030년에는 현재의 두 배 수준에 이를 것으로 전망 했다. 특히 고도비만이 2-30대에서 급속히 증가하고 있어 심각한 사회 문제로 대두 되고 있다. 비만은 체네 지방 조직이 과다한 상태를 의미하며, 비만 인구가 증가한 이유로 꼽히는 것은 최근 서구화된 식생활과 에너지 과잉 섭취이다. 비만의 문제점은 고혈압, 심혈관질환, 동맥경화 등 심혈관 질환 및 당뇨와 같은 대사성 질환과 관련이 있다는 것이며, 관련 연구들이 다수 보고되고 있다.

비만인 경우 일반적으로 체중이 많이 나가지만 비만이 아니더라도 근육이 많은 사람은 체중이 많이 나갈 수 있기 때문에 체내에 지방조직이 과다한 상태를 비만으로 정의한다. 남자는 체지방이 체중의 25％, 여자는 체중의 30％ 이상일 때, 임상적으로는 BMI(Body Mass Index:체질량지수)가 30.1 이상인 경우를 비만이라 한다. 비만은 열량의 섭취와 소비 불균형으로 발생되는 대사성 질환의 일종으로, 지방조직의 기능에 필요한 지방량 보다 훨씬 많은 지방이 체내에 축적되어 있는 상태이며 이것이 원인이 되어 인체 내의 정상적인 생화학적 및 생리적 기능에 장애를 가지게 된다. 단순히 신체활동의 불편, 작업능률의 저하, 신체발육의 변칙적인 성장 뿐 아니라 당뇨병, 고지혈증, 고혈압, 혈중 콜레스테롤 상승, 신장질환, 뇌졸증, 지방간 및 관상동맥질환, 그리고 관절질환 등의 다양한 질병의 원인이 된다. 지난 수십년간 비만의 발생율은 급속히 증가함에 따라 비만에의 관심이 계속적으로 고조되면서 비만의 원인이 단순히 유전적인 원인에 있다기 보다는 에너지 균형을 파괴하는 환경적 요인과의 복합적인 요인에 의해 결정 된다고 인식 되고 있다.

지방세포의 체내기능은 몸에 필요한 에너지를 축적하는 세포로, 필요시 중성지방(triacylglyceride)을 분해시켜 이용한다. 지방조직은 에너지 축적의 기능뿐만 아니라, 내분비 기관으로 지방대사, 당 대사를 포함한 체내 에너지대사를 조절하는 기능을 수행하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 지방세포는 mesenchymal precursor에서 preadipocyte를 거쳐 지방세포로 분화되며, 분화과정 동안 형태적, 생화학적 변화를 통하여 체내 지방을 축적하며, 지방조직은 크기의 증가, 새로운 preadipocyte로부터 분화된다.

이러한, 지방세포의 크기는 일반적으로 식사 조절로 가능하지만 새로운 전구지방세포가 지방세포로 분화되는 과정은 식사조절로는 효과가 없기 때문에 비만의 근본적 치료 또는 억제를 제어하기 위해서는 지방세포의 분화과정을 조절하는 것이 중요하다. 지방세포 분화는 인슐린이나 인슐린 성장인자-I (insulin like growth factor-1), 성장호르몬 등의 자극에 의하여 촉진되며 이 과정에 CCAAT 인핸서 결합 단백질(CCAAT enhancer-binding protein (C/EBP)) 류(family), 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma)등의 전사인자들의 증가가 관찰된다. 이들, 전사인자들은 지방세포 조절인자와 더불어 지방세포의 분화를 촉진시키며 지방산 결합단백질인 aP2 나 지방산 생합성효소 (fatty acid synthase)과 같은 효소들의 발현량이 증가한다. 한편, 지방간의 진행에도 과다한 중성지방의 축적이 관여되고 있음이 보고되어 있다 [J. Clin. Invest.,98, 1575 ∼ 1584 (1996)]. 최근에는 지방세포의 분화를 저해할 수 있다면 생성되는 지방세포의 수를 조절할 수 있으며 그에 따라 축적되는 여분의 에너지를 배출할 수 있다는 아이디어를 바탕으로 하여 지방세포 분화를 저해하는 물질들을 탐색하고자 하는 연구가 진행되고 있다.

또한, 당뇨병은 일반적으로 복합적인 요인들로부터 유래된 질병화 과정을 의미하는 것으로, 구강 당부하 검사 동안 금식 상태 또는 글루코오스 투여 후 플라즈마 글루코오스의 증가된 정도 또는 고혈당증에 의해 특징지어 진다. 지속적이거나 조절되지 않은 고혈당증은 증가된 조기 이환율 및 사망률과 관련이 있다. 종종 비정상적인 글루코오스 항상성은 지방, 리포단백질 및 아포리포프로테인(apolipoprotein) 대사의 변이 및 다른 대사성 및 혈류역학(hemodynamic) 질병과 직접 및 간접적으로 관련이 있다. 유형 2 당뇨병을 가진 환자들은 관상동맥질환, 뇌졸증,말초혈관 질환, 고혈압, 신장병, 신경장애 및 망막증을 포함하는, 거대혈관 및 미세혈관의 합병증을 나타낸다.

소장에 존재하는 α-glucosidase는 탄수화물의 소화에서 마지막 단계를 촉진시켜 포도당으로 전환시키는 효소로서, 당뇨병 환자의 경우 α-glucosidase의 활성이 정상인에 비해 높아져 있어 탄수화물 섭취 시 혈당이 상승한다. 따라서 α-glucosidase 억제는 탄수화물의 분해를 지연하여 약화된 췌장에서 분비되는 인슐린만으로도 체내 혈당을 조절하여 당뇨병을 치료할 수 있다. 또한, α-glucosidase저해제는 고인슐린혈증이나 저혈당을 유발하지 않고, 인슐린분비를 촉진시키며 글루카곤 분비를 억제하는 glucagon-like peptide(glp1)의 소장에서의 분비를 촉진하는 장점을 가지고 있다. 이에, α-glucosidase 저해제는 섭취한 탄수화물의 흡수를 막고 바로 배출시켜 식후 혈당 저하를 유도하므로 typeⅡ 인슐린 비의존성 당뇨, 비만과 고지혈증 등의 대사성 질환 치료제로서의 개발 가능성으로서 관심을 받고 있는 물질이다.

메밀은 마디풀과의 메밀속에 속하는 일년생 초본으로 재배종과 야생종을 포함하여 20여종이 지구상에 분포되어 있다. 재배종에는 단메밀(Fagopyrum esculentum, 보통 메밀)과 쓴메밀(F. tataricum, 타타리 메밀)두 종이 주류를 이루며, 우리나라를 비롯한 중국, 일본 등의 대부분의 아시아지역과 유럽, 캐나다, 미국 등지에서는 주로 단메밀)이 재배되어 왔다. 메밀은 영양학적으로 매우 유용한 작물로, 많은 기능 성분들이 보고되어 있다. 메밀의 대표적인 phenol성 물질은 rutin, hyperin, qucertin, qucercitrin 등의 flavonols를 비롯하여, orientin, isoorientin, vitexin, isovitexin 등의 flavons 등 많은 종류의 플라보노이들이 함유 되어 있다고 보고되어 있다. 특히, rutin은 동맥경화(griffith et al., 1995), 뇌일혈 및 고혈압(Matsubara et al., 1995: Lee et al., 2000) 등 심혈관계질환 질환의 예방과 치료, 당뇨병(lee et al., 1994), 항산화 효과(Kwon, 1993: Christel et al., 2000: Holasova et al., 2002)등의 여러가지 생리 활성이 있음이 확인 되었다.

쓴메밀 (fagopyrum tataricum)은 보통 메밀 품종에 비해 쓴맛이 강해 불려진 이름으로서, 중세 유럽에 타타르 인에 의해 유럽에 도입되었기 때문에 타타르메밀, 달단 메밀로 불리기도 한다. 마디풀과에 속하며 일년초로 원산지는 동부 아시아의 북부 바이칼호, 만주, 아무르강변 및 중앙 아시아이다. 다른 곡물에 비하여 단백질, 아미노산, 미타민, 미네랄이 풍부하고 일반 메밀보다 루틴, 퀘르세틴 등 항산화 물질이 더 풍부한 것으로 알려져 있다. 루틴과 퀘르세틴은 해독작용 특히 간 손산 혹은 간의 염증에 효과가 있는 것으로 알려졌다. 그 외에도 쓴 메밀에 함유되어있는 항산화 물질은 염증, 비만, 비만에 의해 발병되는 대사성 질환 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 앞서 언급하였듯이, 지방세포는 타 세포들과는 달리 preadipocyte 형태에서 분화를 거쳐 adipocyte가 된다. preadipocyte의 분화를 통해 adipocyte가 증가되면 체내에서 사용되지 못한 추가 에너지를 지방의 형태로 축적할 수 있게 된다. 그러므로 지방 분화의 억제는 체내 지방 축적을 억제할 수 있게 한다. 본 발명에서는 마우스의 지방 세포로부터 유래된 3T3-L1에 농도별로 처리한 결과와, 지방세포 분화 관련 바이오마커인 C/EBP-α, aP-2 등의 변화를 통해 발효메밀 추출물과 가르시니아 내지 와일드 망고 종자 추출물과 복합처리 하였을 때 효능을 확인하고, 동물 실험을 통한 지방조직 및 간조직 내의 체지방 축적 억제 효능 및 그 시너지 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2018-0037900 A KR 10-2013-0013856 A KR 10-2009-0044026 A

본 발명은 메밀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하고자 한다.

이를 위한 본 발명은 쓴 메밀 추출물과 가르시니아 추출물을 유효성분으로 하여 이루어진 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물이다.

또한, 본 발명은 쓴 메밀 추출물과 와일드망고종자 추출물을 유효성분으로 하여 이루어진 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물이다.

그리고, 상기 쓴 메밀 추출물은 쓴 메밀 발효 추출물인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 쓴 메밀 추출물과 가르시니아 추출물 내지 와일드망고종자 추출물은 중량비로 1 : 1의 혼합물인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 쓴 메밀 추출물과 가르시니아 추출물 내지 와일드망고종자 추출물의 복합물은 50 내지 100 ug/ml의 농도인 것이 바람직하다.

이하 본 발명은 좀더 상세히 설명한다.

일반적으로 메밀의 추출물이 비만이나 대사성 질환에 어느 정도의 효과가 있다는 내용들의 문헌이 많이 알려져 있다. 그러나, 해당 문헌을 통해 실험을 해보면 그 결과가 일률적이지 않은 경우가 많으며, 이는 여러 가지 조건에 따라 그 효과가 달라질 수 있음을 암시하고 있다. 또한 발효과정을 거친 경우에 따라 루틴 등의 함량의 차이가 나는 경우를 제시하는 문헌들도 찾아볼 수 있다.

그러나 보다 구체적인 조건들에 따라 효과의 차이가 있으며, 루틴 등의 함량이 반드시 비례적으로 특정 효과를 나타내는 것은 아니다. 한편, 추출물의 효과가 있다고 하더라도, 보다 인체 안전성을 고려하여야 하는 경우도 발생하게 된다.

본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미한다. 추출물은 물, 유기용매, 또는 이의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 본 발명에서는 에탄올을 포함한 유기용매를 사용하여 메밀을 추출하여 실험을 하였다. 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 저급알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 예시할 수 있으며, 에탄올이 가장 바람직하다. 다만, 식품 안전성 등을 고려하여 주정을 사용하는 것이 바람직하다. 하였다. 물론 추출용액은 다양하게 사용될 수 있다.

구체적으로 메밀 건조물 또는 분말에 대하여 3배의 70% 주정을 사용하여 약 80℃에서 4 시간 가량 추출할 수 있다. 용매의 사용량, 추출시간은 적절하게 선택하여 이를 증가시킬 수 있다. 상기 추출액을 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 제조할 수도 있으며 상기 추출방법들에서 추출 공정은 필요에 따라 2회 이상 반복하여 실시할 수 있으며, 여과 후 얻어진 추출물을 동결 건조 또는 감압건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.

한편 상기 추출물은 기능성 식품은 물론 약제학적 조성물로도 사용가능하다. 이 경우 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 활성 성분을 수송하는 역할을 하는 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제 또는 용매와 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 운반체(vehicle)를 의미한다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remingtons's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)를 모두 사용 가능하다. 또한, 본 발명에서, 약제학적으로 허용가능한 염이란 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산, 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 의미한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예들 들어, 나트륨, 알칼리토금속, 예들 들어, 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 약제화하기 위한 제제는 임상 투여시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한 치료제의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃를 첨가할 수 있다. 이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가 만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 제제는 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약 형태, 예를 들면 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약 및 앰플제로 존재하고, 약제 중 유효 화합물의 함량은 개별 투약량의 분율 또는 배수에 해당한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투여량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투여량은 바람직하기로는 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명에서 상기 메밀의 발효는 누룩균, 유산균 및 바실러스균 등을 활용할 수 있다. 누룩곰팡이속에 속하는 종류만 해도 약 170종이 넘는다. 통상 아스페르길루스속은 푸른곰팡이(Penicillium속)와 유사한 성질을 보이지만 푸른곰팡이가 저온지대를 좋아하는 데 반하여, 아스페르길루스속 균은 온대를 좋아한다. 아스페르길루스속 균에는 청주, 된장, 간장 등 양조공업이나 발효공업상 중요한 균주가 많다. 좁은 의미로는 청주, 된장, 간장 양조용의 Aspergillus oryzae와 간장누룩균 A. sojae를 가리킨다. 이들은 어느 것이나 분생자가 백색 또는 황색, 황록색인 것에서부터 황누룩균이라고 한다. 이것에 대하여, 분생자가 흑색인 흑누룩균이 있고 이것에는 A. usanmii, A. saitoi, A. awamori 등이 포함된다. 이들은 엄밀히 흑곰팡이와 구별되고 있다.

바람직하게는 상기 누룩균은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 아시더스(Aspergillus acidus), 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus usamii), 아스퍼질러스 시로우사미(Aspergillus shirousamii), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

발효의 과정의 구체적 모습은 보다 다양하다. 본 발명에서는 대략적으로 메밀 추출물을 침지한 후 고온에서 증자하고, 발효균을 원료 대비 0.1% 접종후 비교적 저온에서 배양하였다. 발효균은 Asp. oryzae SW 101을 사용하였다. 종균의 특성을 고려하여 어느 정도의 융통성을 가질 수 있음은 물론이다.

메밀을 발효시키지 않고 추출하는 경우에는 발효시킨 경우보다 세포독성적 측면에서 상대적으로 좋지 않는 결과를 보여주었다. 따라서 어느 정도 효과가 비슷한 경우라면, 메밀을 발효시킨 경우가 보다 바람직하다. 물론, 보다 효과가 좋은 경우라면 용량의 조절 등을 통해 적절히 이를 조절하는 것은 가능할 것이다.

우선 각 추출물의 농도별로 분화 억제의 효과를 확인하였다. 이후, 복합추출물과의 대비를 통해, 그 시너지 효과를 확인하였다. 최종적으로 동물 실험을 통해 이를 검증하였다. 종합적으로 볼때, 단일추출물보다 복합추출물의 형태가 유의미한 개선 효과가 있음을 확인할 수 있다.

메밀 발효 추출물의 비만 및 대사성 질환 예방 및 개선용 조성물 및 이를 포함하는 기능성 식품은 안전하게 사용될 수 있고, 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하며, 비만 및 대사성 질환 예방 및 개선 효과가 우수하다. 또한, 기존의 기능성 원료와의 복합 처방 시에도 부작용이 없고, 더 우수한 효과를 나타낸다.

도 1 은 각 추출물의 농도별 3T3-L1 세포의 분화 억제 효능을 평가한 결과를 보여준다.
도 2는 메밀주정발효 추출물과 가르시니아 내지 와일드망고종자 추출물을 혼합한 복합물의 농도별 3T3-L1 세포의 분화 억제 효능을 평가한 결과를 보여준다.
도 3과 도 5는 각 추출물의 농도별 지방세포분화 억제 관련 바이오마커의 발현정도를 보여준다.
도 4와 6은 복합추출물의 농도별 지방세포분화 억제 관련 바이오마커의 발현정도를 보여준다.
도 7과 도 8은 동물 실험을 통한 복합 추출물의 효과를 보여준다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

<재료 및 추출물의 제조>

쓴 메밀을 사용하여 메밀주정발효 추출물(FFT)을 제조하였다. 공정을 간략히 기술하면 아래와 같다.

전배양 (30℃, 46h) - 추출 (70% 주정, 1: 10, 80℃, 4 h) - 여과 - 농축 (50-55℃, 10-15 brix) - 2차 배양 (30℃, 46h) - 멸균 (95-100℃, 1h) - 여과 - 농축 (50-55℃, 65-70 brix) - 살균 (95℃, 2h)

메밀을 분쇄하고 주정을 사용하여 추출한다. 추출물을 메시망으로 여과시키고, 이를 가열하여 주정을 제거하고 농축을 시키게 된다. 2차 배양은 발효의 과정인데, 침지한 후 증자하고 발효균을 원료 대비 0.1% 접종후 배양한다. 발효균은 발효균은 Asp. oryzae SW 101을 사용하였다. 2차 배양 과정을 거치지 않는 형태의 과정을 통해 발효되지 않은 형태인, 메밀주정 추출물(FT)을 또한 제조하였다.

가르시니아 추출물과 와일드망고종자 추출물의 제조는 일반적인 추출공정을 거쳤다. 즉, 원물 - 추출 - 농축- 분무건조 - 균질화 - 포장의 과정으로 통상적 방법으로 제조하였다.

복합물은 메밀추출물(FFT 또는 FT)과 가르시니아 추출물 또는 와일드망고종자 추출물을 중량기준으로 1 : 1로 혼합하여 사용하였다.

<지방 세포 분화 억제 효능 평가>

3T3-L1 세포의 분화 억제 효능을 평가하였다. 3T3-L1 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium high glucose(DMEM)에 10% calf serum, antibiotics를 첨가하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 confluent 상태가 되면 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 원심분리하여 세포를 모아서 3×10^5 cells/well의 밀도로 96 well에 분주한 후 100% confluency 상태에서 48시간 방치 후 DMEM에 10% BCS와 23 mg/mL IBMX, 5 mg/mL insulin, 1 mM dexamethasone이 첨가된 배지(MDI)를 처리하였다. 분화를 48시간 동안 유도하고 그 후 2일 마다 10% FBS DMEM배지에 5 mg/mL의 insulin이 첨가된 배지를 교체하였으며 시료의 처리는 분화유도 배지 첨가 시점부터 함께 처리하였다.

배지 상층액은 따라내고 PBS로 워싱한다. Well에 분주되어 있는 세포를 조심스럽게 떼어내 AdipoRed Agent를 넣어 세포를 염색시킨다. 세포가 분주된 well 은 fluorimeter로 흡광도를 측정하여 adipocyte 의 differentiation rate를 확인한다.

도 1은 각 추출물의 농도별로 분화 억제의 효과를 보여준다. FT는 발효하지 않은 형태의 메밀주정 추출물이며, FFT는 메밀주정발효 추출물이며, G.C는 가르시니아 추출물, I.G는 와일드망고종자 추출물을 나타낸다. 이를 볼 때 전반적으로 체지방 축적을 억제하는 경향을 보여주고 있다. 가르시니아와 와일드망고종자 추출물은 체지방 축적 억제용 건강식품으로 알려져 있는데, 메밀주정발효 추출물의 경우 상당히 효과가 있는 것을 알 수 있다.

도 2의 경우, 메밀주정발효 추출물과 가르시니아 추출물의 복합추출물(MFG)내지 메밀주정발효 추출물과 와일드망고종자 추출물을 혼합한 복합물(MFI)의 분화억제 효과를 보여준다. 도 1과 대비할 때 단일 추출물보다 뛰어난 효과를 보여줌을 확인할 수 있다. 대략적으로 50 내지 100 ug/ml의 농도에서 유의적인 효과를 보여주고 있다.

<바이오마커를 통한 효능 평가>

Well에 seeding 되어있는 세포를 트리졸 (trizol)을 피펫팅하여 녹여 튜브에 옮겨담고 클로로포름을 넣고 피펫팅하여 섞는다. 혼합된 용액을 원심분리가 가능한 튜브에 옮겨 담아 원심분리 한다. 원심분리된 상등액만 따서 새 튜브에 옮겨 닮고 동량의 isopropanol을 넣고 피펫팅하여 섞고 다시 원심분리 한다. RNA pellet 이 딸려오지 않게 isopropanol을 제거한 뒤, 75% 에탄올로 워싱하고 다시 원심분리한다. 에탄올을 제거한 뒤, pellet을 말려 DEPC water를 적당량 넣고 RNA pellet을 녹여 RNA 추출 용액을 만든다. 추출된 RNA는 qPCR kit (Sybr green kit)를 사용하여 체지방 축적을 억제하는 효능 바이오마커인 C/EBP, aP-2의 발현을 확인한다.

도 3과 도 5는 각 추출물의 농도별 지방세포분화 억제 관련 바이오마커의 발현정도를 보여준다. C/EBP의 경우 농도 의존성이 유의적으로 나타나고 있으며, aP-2의 경우 그 경향성이 다소 약하다고 볼 수 있다. 전반적으로는 각 추출물의 효능이 어느 정도 존재하는 것을 알 수 있다.

도 4와 6은 복합추출물의 농도별 지방세포분화 억제 관련 바이오마커의 발현정도를 보여준다. 도 3과 도 4를 대비할 때, C/EBP의 경우 MFG의 복합물의 경우 효과가 확실히 탁월함을 알 수 있다. 도 5와 도 6을 대비할 때, aP-2의 경우 MFG와 MFI모두 그 효과가 상당히 개선됨을 확인할 수 있다.

종합적으로 볼때, 단일추출물보다 복합추출물의 형태가 유의미한 개선 효과가 있음을 확인할 수 있다.

<동물 실험을 통한 효능평가>

실험동물 종은 6-wk-old, Male, Ob/ob 마우스이다. 사육조건은 빛 12시간, 암전 12 시간, SPF(Specific Pathogen Free), 순응기간 7일이다. 이후, High-carbohydrate diet(HCD)를 각 군당 12주 섭취하였다. 대조군 및 실험군(메밀 주정 추출물군, 가르시니아추출물 군, 와일드망고 추출물군, 메밀+가르시니아 추출복합물, 메밀+와일드망고 추출 복합물군 등)에 동물의 무게에 상응하는 대조물질 및 시험 물질을 경구 투여 하였다. 마지막 사료 섭취 후, 희생하여 각 조직을 용도에 맞게 전처리 후 보관하였다.

HCD 조성은 아래와 같다.

마우스를 해부하여 조직 (부고환 지방, 간)을 분리해내어 파라핀으로 고정하였다. 이를 5-20 μm 단위로 조직을 잘라 절편을 만들어 Slide glass에 고정한다. 고정된 슬라이드에서 파라핀을 녹여 제거한 뒤, Hematoxylin과 Eosin에 염색한다. 염색된 조직은 임상병리 전문가에게 해독을 요청하였다.

도 7은 지방조직을 통해 본 복합 추출물의 효과를 보여준다. 식욕억제호르몬인 Leptin이 KO 된 ob/ob 마우스에 FFE 100 (발효메밀주정추출물 100 mg/kg B.W.), FFE 200 (발효메밀주정추출물 200 mg/kg B.W.), G100 (가르시니아추출물 100 mg/kg B.W.), FG (가르시니아, 발효메밀주정추출물 복합물 (1:1 비율) 100 mg/kg B.W.), W 100 (와일드망고종자추출물 100 mg/kg B.W.), FW100 (와일드망고종자, 발효메밀주정추출물 복합물 (1:1 비율) 100 mg/kg　B.W.)을 섭취시켰다. 마우스의 부고환 지방 조직을 H&E staining 하여 조직병리한 결과 FG 100, FW 100에서 단일 추출물보다 지방구의 크기가 작아진 것을 확인하였다.

도 8은 간 조직을 통해 본 복합 추출물의 효과를 보여준다. 위의 동물실험의 ob/ob 마우스의 간 조직을 해부하여 H&E staining 하여 조직병리한 결과, FG (가르시니아 복합물), FW (와일드망고종자 복합물)의 경우 단일 추출물보다 간 조직 지방구의 크기가 작아진 것을 확인하였다.

<추출물의 세포 독성 평가>

각 추출물들과 복합물들이 MOVAS 세포에서 세포독성이 있는지 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 농도별로 24시간 동안 처리한 결과, 발효하지 않은 메밀 추출물의 경우 50ug/ml 미만까지 독성이 나타나지 않았고, 발효된 메밀 추출물이 사용한 것에서는 모든 농도에서 독성이 나타나지 않았다. 메밀 추출물을 포함한 복합물의 경우에도 유사한 결과를 보여주었다. 이를 토대로 볼 때, 발효의 과정을 거치는 것을 사용하는 것이 타당하다.

<기능성식품의 제조>

<음료의 제조>

복합추출물(메밀주정발효 추출물+가르시니아 추출물) 10 mg, 꿀 300mg, 치옥토산 아미드 3mg, 니코틴산아미드 5 mg, 염산리보플라빈 나트륨 2mg, 이노시톨 15 mg, 오르트산 25 mg, 물 100 ml를 사용하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<캔디의 제조>

복합추출물(메밀주정발효 추출물+와일드망고종자 추출물) 1.5%, 설탕 55%, 물엿 40%, 오렌지향 0.1%, 물엿 잔량의 함량으로 캔디를 제조하였다.

<초코렛의 제조>

복합추출물(메밀주정발효 추출물+와일드망고종자 추출물) 1.5%, 코코아버터 35%, 코코아 매스 15%, 레시틴 0.5%, 바닐라향 0.5%, 설탕 잔량의 함량으로 초코렛을 제조하였다.

종합적으로 평가한 결과, 메밀주정발효 추출물+가르시니아 추출물이나, 메밀주정발효 추출물+와일드망고종자 추출물의 복합추출물 형태를 사용하여, 건강기능성 식품을 만드는 것이 비만 관리 및 당뇨를 포함한 대사성 질환의 개선에 도움이 될 것으로 판단하였다.

Claims (5)

1. 쓴 메밀 추출물과 가르시니아 추출물을 유효성분으로 하여 이루어진 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
2. 쓴 메밀 추출물과 와일드망고종자 추출물을 유효성분으로 하여 이루어진 비만 또는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 쓴 메밀 추출물은 쓴 메밀 발효 추출물인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
   
4. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 쓴 메밀 추출물과 가르시니아 추출물 내지 와일드망고종자 추출물은 중량비로 1 : 1의 혼합물인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
   
5. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 쓴 메밀 추출물과 가르시니아 추출물 내지 와일드망고종자 추출물의 복합물은 50 내지 100 ug/ml의 농도인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.

Images