KR20210018916A - 디피콜린 산을 생산하는 미생물 컨소시엄 및 담체와의 제형화를 위한 미생물 선택 방법 - Google Patents

디피콜린 산을 생산하는 미생물 컨소시엄 및 담체와의 제형화를 위한 미생물 선택 방법 Download PDF

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앰백 홍콩 리미티드
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Abstract

담체와의 제형화를 위한 미생물을 선택하는 방법이 제공된다. 일부 예에서, 상기 방법은 하나 이상의 디피콜린 산 (dipicolinic acid) (DPA) 신타제 (synthase) 유전자를 포함하는 미생물, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하는 미생물, 및 / 또는 DPA를 생성하는 미생물을 확인하는 단계; 그리고 담체와 제형화된 미생물을 선택하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 부가적으로 담체와 선택된 미생물을 제형화하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 미생물에서 하나 이상의 DPA 신타제 유전자 또는 하나 이상의 DpaA 및 / 또는 DpaB 단백질을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 상기 방법은 예를 들어 형광 분석을 사용하여 미생물 또는 미생물을 함유하는 배지에서 DPA를 검출하는 것을 포함한다. 다른 예에서, 상기 방법은 예를 들어, 형광 분석을 사용하여 미생물 또는 미생물을 함유하는 배지에서 DPA를 검출하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나 및/또는 DPA를 생성하는 하나 이상의 미생물을 포함하는 미생물 조성물이 또한 제공된다.

Description

디피콜린 산을 생산하는 미생물 컨소시엄 및 담체와의 제형화를 위한 미생물 선택 방법
본 개시 내용은 디피콜린 산(dipicolinic acid, DPA)을 생산하는 미생물 (microbes) 및 개선된 생존력 (viability) 을 갖는 미생물을 확인하는 방법, 미생물을 담체(carriers)와 함께 제형화(co-formulations)하는 방법, 및 미생물 및 / 또는 제형을 포함하는 조성물(compositions)에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
이는 2018 년 6 월 6 일에 출원된 미국 가출원 번호 62 / 681,469의 혜택을 주장하며, 이는 그 전체가 여기에 참조로 포함된다.
배경기술
미생물 기반 식물 생물 자극제는 생태계의 건강을 보호하는 지속 가능한 농업을 제공한다. 또한 식물 및 토양 미생물 군에 유익한 미생물을 보충하면 식물 성장과 식물 건강을 촉진하고, 생산성을 높이고, 토양 비옥도를 개선하며, 화학 물질 투입량을 줄여 보다 지속 가능한 농업을 만들 수 있다. 현재의 농업에서 미생물 생물 자극제는 수많은 습식 또는 건식 담체와 함께 공동 적용 및 / 또는 제형화될 수 있다.
요약
미생물 접종제(microbial inoculants)는 사용되는 담체(들)의 화학적 성질에 민감할 수 있다. 또한 적용 전 저장 조건과 저장 기간도 미생물에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 요인은 생존력에 부정적인 영향을 미치고 궁극적으로 현장에서의 효능을 제한할 수 있다. 미생물 생존을 개선 및/또는 담체 또는 종자와 미생물의 제형화를 개선하는 조성물 및 방법이 본원발명에 개시된다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 연장된 생존력을 가진 하나 이상의 미생물을 선택하는 것을 포함하거나 단독으로 및 / 또는 하나 이상의 담체 또는 종자와의 제화형된 형태로 생존하는 것을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 것은 디피콜린 산 (DPA)을 생산하는 미생물 및 이러한 미생물을 포함하는 조성물이다. 하나의 예에서, 상기 조성물은 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus drentensis, Bacillus subtilis, Clostridium bifermentans, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus paracasei, Fontibacillus sp. (panacisegetis), Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Paenibacillus azoreducens, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus cookii, Paenibacillus sp. (chitinolyticus), Paenibacillus sp. (P1XP2), Pseudomonas sp., 및 Streptomyces griseus (일부 예에서, 본원에서 "DFC" 컨소시엄으로 지칭됨) 를 포함한다. 한 실시 양태에서, 상기 조성물은 2019 년 5 월 16 일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC, Manassas, VA)에 기탁된 미생물 종의 세포 및 할당된 기탁 번호 PTA-125924를 포함한다. 다른 구체 예에서, 개시된 미생물 컨소시엄 또는 조성물은 서열 번호: 3-25와 적어도 95 % 동일성 (예를 들어, 적어도 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성 또는 그 이상)을 갖는 16S rDNA 서열을 갖는 미생물로 필수적으로 이루어지거나 또는 둘 이상(예를 들어, 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상 또는 모두) 의 미생물로 이루어지는 것을 포함한다.
또한 개시된 미생물 또는 컨소시엄 (예를 들어, DFC 컨소시엄) 및 하나 이상의 담체 (예를 들어, 건조 담체 또는 액체 담체) 또는 하나 이상의 종자를 포함하는 조성물이 개시된다. 일부 예에서, 담체는 액체 또는 건식 비료 (fertilizer), 토양 유래 물질 (a soil-derived substance), 유기 물질 (an organic substance), 불활성 물질 (an inert material), 먼지 제어 화학 물질 (a dust control chemical) 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물 (a mixture) 을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 디피콜린 산 (DPA) 신타제 유전자를 포함하는 미생물, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하는 미생물, 및/또는 검출 가능한 양의 DPA를 생성하는 미생물을 확인하는 단계; 및 담체와 제형화를 위한 상기 미생물을 선택하는 단계를 포함하는, 담체 또는 종자와 제형화를 위한 미생물을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 선택된 미생물은 표 26에 열거된 것들 모두를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 표 25 또는 26에 포함된 것들 중 하나 이상을 포함한다.
일부 예에서, 방법은 미생물에서 하나 이상의 DPA 신타제 (synthase) 유전자 (예를 들어, DPA 신타제 서브 유닛 (subunit) A (DpaA) 유전자 및 / 또는 DPA 신타제 서브 유닛 B (DpaB) 유전자) 또는 하나 이상의 DpaA 및 / 또는 DpaB 단백질을 검출하는 것을 포함한다. DpaA 유전자는 도 1의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % (예를 들어, 적어도 60 %) 서열 동일성을 갖는 DpaA 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호: 26-41). DpaB 유전자는 도 1의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % (예를 들어, 적어도 60 %) 서열 동일성을 갖는 DpaB 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호: 42-56). DpaA 단백질은 도 1의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % (예를 들어, 적어도 60 %) 서열 동일성을 갖는 DpaA 단백질을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호: 26-41).
DpaB 단백질은 도 1의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % (예를 들어, 적어도 60 %) 서열 동일성을 갖는 DpaB 단백질을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호: 42-56). 추가 예에서, 방법은 미생물에서 하나 이상의 Isf 유전자 또는 단백질을 검출하는 것을 포함한다. Isf 유전자는 도 1의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % (예를 들어, 적어도 60 %) 서열 동일성을 갖는 Isf 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호: 57-67). Isf 단백질은 도 1의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % (예를 들어, 적어도 60 %) 서열 동일성을 갖는 Isf 단백질을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호 57-67). 다른 예에서, 방법은 예를 들어 형광 분석을 사용하여 미생물 또는 미생물을 함유하는 배지에서 DPA를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 방법은 액체 또는 건식 형태의 선택된 미생물 (여기에 개시된 미생물 컨소시엄을 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 하나 이상의 액체 또는 건식 담체와 접촉시킴으로써 하나 이상의 선택된 미생물을 담체와 함께 제형화하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 담체는 액체 또는 건식 비료, 토양 유래 물질, 유기 물질, 불활성 물질, 먼지 제어 화학 물질 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물을 포함한다. 다른 예에서, 방법은 종자를 하나 이상의 선택된 미생물 (본원에 개시된 미생물 컨소시엄을 포함하지만 이에 제한되지 않음)로 처리하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 방법은 하나 이상의 선택된 미생물 및 DPA 신타제 유전자를 포함하지 않거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하지 않거나, 및/또는 검출 가능한 양의 DPA를 생산하지 않는 하나 이상의 미생물과 담체 또는 종자를 함께 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시 내용의 전술한 및 다른 특징은 첨부 도면을 참조하여 진행되는 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
포자를 형성하지 않는 미생물은 종종 포자를 형성하는 미생물보다 처리 및 현장 적용 중에 발생하는 해로운 요인에 더 취약하다. 대규모 미생물 인벤토리 (inventories) 에서 포자를 형성하는 미생물을 식별하기위한 선택 과정은 지루하고 시간이 많이 소요될 수 있다. 여기에는 일반적으로 생존성 및 저장-수명 (shelf-life) 이 연장된 최종 산물의 제한적 보증 때문에 생존성에 대한 습식-실험실 테스트 (wet-lab testing) (예를 들어, 선택한 캐리어와의 제형화) 가 포함된다.
독립형 생물 자극제 제제로서 및 / 또는 습식 또는 건식 담체 또는 종자와의 복합 제형에서 연장 된 저장 수명의 높은 신뢰도를 갖는 미생물을 선택하기위한 신규 전략 및 방법이 본원에 개시된다. 따라서 현장 시험에서 신제품 테스트에 대한 리드 타임 (lead time) 을 크게 단축한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 확인된 DPA 유전자 또는 단백질을 갖는 및 / 또는 DPA를 생산하는 포자 형성 박테리아는 시간이 지남에 따라 생존성 측면에서 담체와의 제형화된 형태의 확인된 DPA 유전자 및 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주를 능가한다. 마지막으로, DPA 생산 균주를 포함하는 미생물 컨소시엄이 설명된다.
I. 용어
달리 명시되지 않는 한, 기술 용어는 일반적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 Jones and Bartlett Learning, 2012 (ISBN 1449659853) 에서 발행한 Krebs et al., Lewin의 Genes XI; Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829) 에서 발행한 Kendrew et al. (eds.) 의 The Encyclopedia of Molecular Biology; Wiley, John & Sons, Inc., 2011 (ISBN 8126531789) 에서 발행한 Robert A. Meyers (ed.) 의 Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference; 및 George P. R*?*dei 의 Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2 판 (2nd Edition), 2003 (ISBN: 0-471-26821-6) 에서 찾을 수 있다.
용어 및 방법에 대한 다음의 설명은 본 개시 내용을 더 잘 설명하고 당업자가 본 개시 내용을 실행하도록 안내하기 위해 제공된다. 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 하나 이상 (one or more than one) 을 지칭한다. 예를 들어, "세포를 포함하는" ("comprising a cell") 이라는 용어는 단일 또는 복수의 세포를 포함하고 "적어도 하나의 세포를 포함하는" ("comprising at least one cell.") 이라는 문구와 동등한 것으로 간주된다. 본원에 사용된 "포함하다" ("comprises") 는 "포함한다" ("includes.") 를 의미한다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는" ("comprising A or B") 은 추가 요소를 제외하지 않고 "A, B 또는 A와 B를 포함한다" ("including A, B, or A and B") 를 의미한다. 본 명세서에 언급 된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다. 상충되는 경우 용어 설명을 포함한 본 명세서가 우선한다.
본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 개시된 기술을 실행하거나 테스트하는 데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 설명된다. 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
본 개시의 다양한 실시예의 검토를 용이하게 하기위해, 특정 용어에 대한 다음 설명이 제공된다:
담체 (Carrier): 예를 들어, 미생물 또는 미생물 컨소시엄과 같은 미생물에 대한 전달 운송 수단 (예를 들어, 제형화된 형태 또는 접종제로서)으로 사용될 수 있는 물질이 본 명세서에 기술되었다(본 명세서에서 "농업-담체" ("agro-carriers") 라고도 함). 캐리어는 액체 또는 고체 (건조) 일 수 있다. 예시적인 담체는 액체 또는 건식 비료, 토양 유래 물질 (예를 들어, 목탄 (charcoal), 점토 (clays), 잔디 (turf)) 유기 물질 (예를 들어, 톱밥 (sawdust), 밀 / 대두 / 귀리 밀 기울 (wheat/soy/oat bran), 퇴비 (composts)) 및 불활성 물질 (예를 들어, 펄라이트 (perlite), 질석 (vermiculite), 벤토나이트 (bentonite), 아조마이트® (Azomite®), 카올린 (kaolin), 규산염 (silicates), 활석 (talc))을 포함한다. 일부 예에서, 종자는 담체라고도 할 수 있다.
접촉 (Contacting): 고체 및 / 또는 액체 형태를 포함하여 직접적인 물리적 결합으로 배치. 예를 들어, 접촉은 하나 이상의 미생물 (예를 들어, 미생물 컨소시엄의 미생물) 및 담체 또는 종자와 함께 발생할 수 있다. 접촉은 또한 하나 이상의 미생물, 미생물 / 담체 제형 또는 미생물 / 종자 제형 및 토양, 식물 및 / 또는 식물 부분 (예를 들어, 잎, 줄기, 묘목, 뿌리 및 / 또는 씨앗)과 함께 발생할 수 있다.
배양 (Culturing): 탄소, 질소 및 무기 염의 동화 가능한 공급원이있는 상태에서 하나 이상의 유기체 또는 세포의 의도적인 성장. 예에서, 그러한 성장은 고체 또는 반고체 영양 배지에서, 또는 영양분이 용해되거나 현탁된 액체 배지에서 발생할 수 있다. 추가 예에서, 배양은 표면에서 또는 침지 배양에 의해 수행될 수 있다. 영양 배지는 복잡한 영양소로 구성되거나 화학적으로 정의될 수 있다.
디피콜린 산 (Dipicolinic acid) (pyridine-2,6-dicarboxylic acid; DPA): 아래의 구조를 갖는 화합물
Figure pct00001
대부분의 미생물에서 DPA는 디피콜리네이트 신타제 (dipicolinate synthase) 효소에 의해 다이하이드로디피콜리네이트 (dihydrodipicolinate)를 DPA로 전환하여 생성된다. DPA 신타제에는 두 개의 서브 유닛, 즉 서브 유닛 A (DpaA 또는 spoVFA)와 서브 유닛 B (DpaB 또는 spoVFB)가 있다. 예시적인 DpaA 및 DpaB 아미노산 서열이 본원에서 제공된다 (도 1 및 2).
일부 박테리아 (예를 들어, 일부 Clostridium)는 확인 가능한 DpaA 및 DpaB 유전자가 부족함에도 불구하고 DPA를 합성할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 박테리아는 구조적으로 관련된 단백질인 전자 전달 플라보 단백질 (electron transfer flavoprotein) (EtfA)을 사용하는 것으로 제안되며, 이는 플라빈 모노뉴클레오티드(a flavin mononucleotide) (FMN) 산화 환원 효소 (oxidoreductase) 이다. EtfA는 다이하이드로디피콜리네이트를 디피콜린 산으로 전환함으로써 생합성 경로의 최종 단계를 촉매하는 것으로 생각된다 (Orsburn et al., Mol. Microbiol. 75:178-186, 2010). 또는 일부 박테리아는 DPA 생산에 철-황 플라보 단백질 (iron-sulfur flavoprotein) (Isf) 을 사용할 수 있다.
이종 (Heterologous): 다른 유전적 근원이나 종에서 유래함. 예를 들어, 세포에 이종성인 핵산은 그것이 발현되는 세포 이외의 유기체 또는 종에서 유래한다. 이종성 핵산을 박테리아 세포에 도입하는 방법은 예를 들어 전기 천공, 리포 펙션 및 입자 총 가속을 포함하는 핵산을 사용한 형질 전환을 포함한다.
용어 이종성 사용의 또 다른 예에서, 이종성 프로모터 (promoter) 에 작동 가능하게 연결된 핵산은 프로모터의 것과 다른 유기체, 종 또는 유전자로부터 유래된다. 용어 이종성 사용의 다른 예에서, 폴리펩티드 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산은 예를 들어 비-천연 적으로 발생하는 융합 단백질을 형성하기 위해 제 2 폴리펩티드 또는 이의 일부를 코딩하는 이종성 핵산에 작동 가능하게 연결된다.
분리됨 (Isolated): "분리된" 생물학적 구성 요소 (예를 들어, 핵산, 단백질 또는 유기체)가 다른 생물학적 구성 요소 (예를 들어, 다른 세포, 세포 파편 또는 기타 단백질 또는 핵산)로부터 실질적으로 분리 또는 정제되었다. "분리된" 생물학적 성분에는 표준 정제 방법으로 정제된 성분이 포함된다. 이 용어는 또한 재조합 핵산, 단백질 또는 미생물뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 또는 펩티드를 포함한다. 용어 "분리된" (또는 "풍부한" 또는 "정제된")은 절대 순도를 필요로 하지 않으며, 적어도 50 % 분리된, 예를 들어 적어도 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 심지어 100% 분리된, 미생물 또는 분자를 포함할 수 있다.
미생물 (Microbe): 박테리아 (bacteria), 고세균 (archaebacterial), 진균 (fungi) 및 조류 (algae) (예를 들어, 미세 조류 (microalgae))를 포함하지만 이에 국한되지 않는 미생물. 일부 예에서, 미생물은 단-세포 유기체 (예를 들어, 박테리아, 시아노박테리아 (cyanobacteria), 일부 균류 또는 일부 조류) 이다. 다른 예에서, 용어 미생물은 특정 진균 또는 조류 (예를 들어, 다세포 (multicellular) 사상 (filamentous) 진균 또는 다세포 조류)와 같은 다세포 유기체 (multi-cellular organisms) 를 포함한다.
미생물 조성물 (Microbial composition): 적어도 하나의 미생물 유형 (또는 종)의 세포 (또는 적어도 하나의 미생물 유형의 세포 집단)를 포함하는 조성물 (고체, 액체 또는 적어도 부분적으로 둘 다일 수 있음). 일부 예에서, 미생물 조성물은 예를 들어 액체 중의 현탁액으로서 액체 (예: 저장, 배양 또는 발효 배지 또는 액체 비료)에 적어도 하나의 유형 (종)의 미생물 (또는 하나 이상의 미생물 집단)의 세포를 포함한다. 다른 예에서, 미생물 조성물은 고체 또는 젤라틴 (gelatinous) 배지 (배양 플레이트를 포함 하나 이에 제한되지 않음), 또는 슬러리 (slurry) 또는 페이스트 (paste) 의 표면에 있거나 내장 된 하나 이상의 미생물 (또는 하나 이상의 미생물 집단) 유형 (종)의 세포를 포함한다. 다른 예에서, 미생물 조성물은 건조 물질 또는 종자와 함께 하나 이상의 유형 (또는 종)의 미생물 (또는 하나 이상의 미생물 집단), 예컨대 건조 물질 또는 종자의 표면 또는 그에 함침된 세포를 포함한다.
미생물 컨소시엄 (Microbial consortium): 두 개 이상의 미생물 종으로 이루어진 세포의 혼합물, 연합 또는 집합으로, 일부 경우에는 서로 물리적 접촉을 한다. 컨소시엄의 미생물은 직접적인 물리적 접촉이나 생화학적 상호 작용, 또는 둘 다를 통해 서로 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 컨소시엄의 미생물은 영양소, 대사 산물 또는 가스를 서로 교환 할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 컨소시엄의 미생물 중 적어도 일부는 대사적으로 상호 의존적이다. 이러한 상호 의존적 상호 작용은 시간과 문화 조건의 변화에 따라 성격과 범위가 변할 수 있다.
형질 도입 및 형질 전환 (Transduced and Transformed): 바이러스 또는 벡터는 핵산을 세포로 전달할 때 세포를 "형질 도입" ("transduces") 합니다. 세포는 세포 게놈 내로의 핵산 도입 또는 에피솜 복제 (episomal replication) 에 의해 DNA가 세포에 의해 복제될 때 세포 내로 형질 도입된 핵산에 의해 "형질 전환" ("transformed") 된다. 본원에 사용된 용어 "형질 전환" 은 박테리아 접합 (bacterial conjugation), 바이러스 벡터를 사용한 형질 감염 (transfection with viral vectors), 플라스미드 벡터를 사용한 형질 전환 (transformation with plasmid vectors), 및 전기 천공 (electroporation), 리포 펙션 (lipofection) 및 입자 총 가속 (particle gun acceleration) 에 의한 네이키드 (naked) DNA 도입을 포함하여 핵산 분자가 이러한 세포에 도입될 수 있는 모든 기술을 포함한다.
벡터 (Vector): 숙주 세포에 도입되어 형질 도입 또는 형질 도입된 숙주 세포를 생성 할 수 있는 핵산 분자. 재조합 (Recombinant) DNA 벡터는 재조합 DNA를 포함하는 벡터이다. 벡터는 복제 기점 (origin of replication )과 같은 숙주 세포에서 복제할 수 있도록하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 (marker) 유전자, 이종 (heterologous) 핵산의 도입을 위한 클로닝 부위 (cloning site), 프로모터 (a promoter) (예를 들어, 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 위한), 및 / 또는 당 업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 그람 음성 (gram negative) 및 / 또는 그람 양성 (gram positive) 박테리아 세포에서의 발현을 위한 플라스미드를 포함하는 플라스미드 벡터를 포함한다. 예시적인 벡터는 E. coli 에서 사용하기 위한 것을 포함한다.
생존력 (Viability) : 세포 (예를 들어, 미생물 세포)가 성장 또는 번식을 위한 적절한 조건에서 성장하거나 번식할 수 있는 능력. 일부 예에서, "생존" ("survival") 또는 "생존성" ("survivability") 은 액체 또는 건조 상태로, 단독으로, 다른 미생물 세포와의 혼합물로, 및/또는 담체 또는 종자와 함께 제형화 될 때 저장 기간 후 세포 (예를 들어, 미생물) 의 생존력을 나타낸다.
II. 제형에서 생존력 있는 미생물을 확인하는 방법
액체 또는 고체 담체와 함께 제형화될 때 생존할 수 있거나 생존하는 미생물을 확인하는 방법이 본원에 개시된다. 미생물은 담체 또는 종자와 개별적으로 제형화될 수 있거나 (예를 들어, 단일 균주 또는 미생물 종은 담체 또는 종자와 함께 제형화된다) 또는 담체 또는 종자와 함께 제형화된 미생물의 혼합물 또는 컨소시엄 (예를 들어, 둘 이상의 균주 또는 미생물 종) 의 일부일 수 있다 . 다른 구체 예에서, 상기 방법은 컨소시엄 (독립형 컨소시엄으로서 또는 담체 또는 종자와 제형화된)에서 장기간 동안 생존할 수 있거나 생존하는 미생물을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 예에서, 본원에 개시된 방법으로 확인된 미생물, 예를 들어, 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나, 및 / 또는 검출 가능한 양의 DPA를 생산하는 미생물은 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하지 않거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하지 않거나, 및 / 또는 검출 가능한 양의 DPA를 생산하지 않는 미생물보다 생존력 (단독으로 또는 제형화된 형태로)을 증가시켰다. 일부 예에서, 본원에 개시된 방법으로 확인된 미생물은 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하지 않거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하지 않거나, 및 / 또는 검출 가능한 양의 DPA를 생성하지 않는 미생물에 비해 적어도 10 % 생존력(예를 들어, 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 1.5 배, 적어도 2 배, 적어도 5 배, 또는 그 이상의 증가된 생존력)을 증가시켰다. 증가된 생존력은 설정된 기간 후 더 많은 수의 생존 가능한 세포 및 / 또는 더 긴 기간 동안의 생존력을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 방법은 게놈에 DPA 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나, 및 / 또는 검출 가능한 양의 DPA를 생성하는 미생물을 확인하는 단계를 포함한다. 이러한 미생물은 개별적으로 또는 액체 또는 고체 담체와 함께 제형화될 때 생존할 수 있거나 생존하는 미생물로 확인된다 (예를 들어, DPA 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하지 않거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하지 않거나, 및 / 또는 검출 가능한 양의 DPA를 생성하지 않는 하나 이상의 미생물과 비교하여). 확인된 미생물은 액체 또는 고체 담체 또는 종자와의 제형화와 같은 후속 사용을 위해 추가로 선택될 수 있다. 일부 예에서, 미생물은 적어도 1 일, 적어도 3 일, 적어도 5 일, 적어도 7 일, 적어도 10 일, 적어도 2 주, 적어도 3 주, 적어도 4 주, 적어도 5 주, 적어도 6 주, 적어도 7 주, 적어도 2 개월, 적어도 3 개월, 적어도 4 개월, 적어도 5 개월, 적어도 6 개월, 적어도 8 개월, 적어도 10 개월, 적어도 1 년, 적어도 2 년, 또는 그 이상 (예를 들어, 적어도 1-28 일, 적어도 5-21 일, 적어도 2-6 주, 적어도 4-8 주, 적어도 2-6 개월, 적어도 3-9 개월, 적어도 4-10 개월, 적어도 6 개월 내지 1 년, 적어도 1-2 년, 또는 그 이상) 동안 생존할 수 있거나 생존 (개별적으로 또는 담체 또는 종자와 함께 제형화될 때) 한다.
미생물의 생존성 또는 생존을 결정하는 방법은 배양 시 미생물의 성장을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 미생물 세포 (액체 또는 건조 상태, 또는 담체 또는 종자와 제형화된 형태) 를 함유하는 제제 (a preparation)는 액체 배지에 접종되고, 미생물 성장에 적합한 조건 하에서 배양되고, 및 정의된 기간 후 미생물의 존재 및 / 또는 양이 측정된다. 다른 예에서, 미생물 세포 (액체 또는 건조 상태, 또는 담체 또는 종자와 제형화된 형태) 를 함유하는 제제는 고체 또는 반고체 배지를 함유하는 플레이트에 스트리킹 되고, 미생물 성장에 적합한 조건 하에서 배양되고, 및 미생물의 존재 및 / 또는 양 (예를 들어, 존재, 크기 및 / 또는 콜로니(colonies) 수)이 측정된다. 일부 예에서, 미생물은 예를 들어 PCR 방법을 사용하여 확인된다. 미생물 세포 생존력 및 동일성을 결정하기 위한 예시적인 방법이 실시예 1에 제공된다.
추가 실시 양태에서, 방법은 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나, 및 / 또는 검출 가능한 양의 DPA를 생성하는 하나 이상의 미생물을 선택하는 단계; 및 선택적으로 하나 이상의 상기 선택된 미생물을 하나 이상의 담체 또는 종자와 제형화하는 단계를 포함한다. 방법은 하나 이상의 상기 선택된 미생물을 하나 이상의 담체 또는 종자와 제형화를 준비하는 단계를 포함한다. 방법은 하나 이상의 미생물을 하나 이상의 담체 또는 종자와, 예를 들어 고체 (건조) 또는 액체 형태로 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 예에서, 담체(들) 또는 종자(들)는 미생물 혼합물과 접촉된다. 상기 혼합물은 DPA 신타제를 발현하거나 DPA를 생성하는 미생물 (예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 선택되거나 생산된 미생물, DFC를 포함하나 이에 제한되지 않음) 을 포함하고 또한 DPA 신타제를 발현하지 않거나 DPA를 생성하지 않는 하나 이상의 미생물을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 담체는 약 103-109 세포/mL 또는 그 이상 (예를 들어, 약 1 x 103 세포/mL, 약 5 x 103 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL, 약 5 x 104 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL, 약 5 x 106 세포/mL, 약 1 x 107 세포/mL, 약 5 x 107 세포/mL, 약 1 x 108 세포/mL, 약 5 x 108 세포/mL, 약 1 x 109 세포/mL, 약 5 x 109 세포/mL, 또는 그 이상) 의 각 미생물을 포함하는 액체와 접촉된다.
일부 구체 예에서, 하나 이상의 선택된 미생물 (및 선택적으로 하나 이상의 추가 미생물)을 포함하는 액체는 하나 이상의 건조 담체 또는 종자와 접촉하여 배치된다. 일부 예에서, 미생물을 포함하는 액체는 신선 또는 냉동 박테리아 배양물 또는 신선 또는 냉동 박테리아 배양물의 혼합물이다. 다른 예에서, 미생물을 포함하는 액체는 동결-건조된(freeze-dried) 미생물이 첨가된 액체이다. 하나 이상의 미생물을 포함하는 액체는 건조 담체 또는 종자에 스며들도록 허용된다. 일부 예에서, 건조 담체 또는 종자가 포화되도록, 예를 들어 담체 또는 종자 전체에 미생물의 비교적 균일한 분포를 제공하도록 하나 이상의 미생물을 포함하는 액체의 양이 사용된다. 그러나, 비-포화량의 액체도 사용될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 상기 양은 약 35 μL/g 내지 6 mL/g 이다. 일부 예에서, 미생물-함침 담체 또는 종자는 건조되고 (예를 들어, 실온 또는 약 30-35 °C에서) 주변 온도에서 저장된다 (예를 들어, 밀폐된 또는 기밀 용기에).
다른 구체 예에서, 하나 이상의 선택된 미생물 (및 선택적으로 하나 이상의 추가 미생물)을 포함하는 액체는 하나 이상의 액체 담체와 혼합된다. 일부 예에서, 미생물을 포함하는 액체는 신선 또는 냉동 박테리아 배양물 또는 신선 또는 냉동 박테리아 배양물의 혼합물이다. 다른 예에서, 미생물을 포함하는 액체는 동결-건조된 미생물이 첨가된 액체이다. 미생물을 포함하는 액체는 임의의 선택된 양, 예를 들어, 0.5-1%, 1-5%, 2-10%, 3-6%, 4-8%, 5-15%, 8-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-75%, 또는 70-90% (v/v)와 같이, 0.1%에서 90% (v/v)사이로 액체 담체와 혼합될 수 있다. 일부 예에서, 미생물은 약 0.1 %, 약 0.2 %, 약 0.5 %, 약 1 %, 약 2 %, 약 3 %, 약 4 %, 약 5 %, 약 6 %, 약 7 %, 약 8 %, 약 9 %, 약 10 %, 약 20%, 약 30 %, 약 40 %, 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 % 또는 약 90 % (v / v)로 액체 담체와 혼합된다. 비-제한적인 일 예에서, 미생물의 혼합물은 0.5 % (v / v) 또는 1 : 180의 비율로 액체 담체에 첨가된다. 다른 비-제한적인 예에서, 미생물의 혼합물은 농축 액체 담체 (예를 들어, 10배 농축 액체 담체) 에 90 % (v / v)로 첨가되어 1 배 농도의 액체 담체를 생성한다. 사용될 희석 인자에 따라, 원하는 미생물 세포의 최종 농도를 얻기 위해 혼합물 내 미생물 세포의 양이 조정될 수 있다. 미생물의 혼합물은 주변 온도에서 보관된다 (예를 들어, 밀폐된 또는 기밀 용기에).
일부 실시 양태에서, 미생물의 건조 제제 (예를 들어, 동결-건조된 미생물)는 건조 담체 또는 종자와의 제형화에 사용된다. 일부 예에서, 동결-건조된 미생물은 건조 담체 또는 종자 (예를 들어, 약 40mg 미생물 / kg 담체 또는 종자 내지 약 1g 미생물 / kg 담체 또는 종자)와 혼합된다. 이 실시 양태의 일부 예에서, 동결-건조된 미생물은 액체에 첨가되고 나서 건조 담체 또는 종자와 접촉된다. 다른 예에서, 동결-건조된 미생물은 액체에 첨가 된 다음 상기 설명된 바와 같이 건조 담체 또는 종자와 접촉된다.
A. DPA 신타제 핵산 검출
일부 실시 양태에서, 이 방법은 하나의 미생물 또는 미생물 집단에서 하나 이상의 DPA 신타제 핵산 분자 (예를 들어, DNA, cDNA 또는 mRNA)의 존재를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 방법은 미생물의 게놈에서 하나 이상의 DPA 신타제 유전자 (예를 들어, DpaA 및 / 또는 DpaB)를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 예에서 미생물은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 포함한다. 예시적인 DPA 신타제 유전자는 B. subtilis DpaA (GenBank 수탁 번호 NC_000964.3, 1744367-1745260, 2018 년 6 월 3 일에 GenBank에 존재하는 바와 같이 본원에 참고로 포함됨) 및 DpaB (GenBank 수탁 번호 NC_000964.3, 1745236-1745865, 2018 년 6 월 3 일에 GenBank에 존재하는 바와 같이 본원에 참고로 포함됨)를 포함한다. 일부 예에서, DpaA 유전자는 도1에 나타낸 단백질 또는 도 1에 나타낸 단백질과 적어도 20 % 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 35 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 55 % , 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 % 또는 그 이상)을 갖는 단백질을 코딩한다 (예를 들어, 서열 번호 : 26-39). 일부 예에서, DpaB 유전자는 도 2에 나타낸 단백질 또는 도 2에 나타낸 단백질과 적어도 20 % 서열 동일성(예를 들어, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 35 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 % 또는 그 이상)을 갖는 단백질을 코딩한다 (예를 들어, 서열 번호 42-54). 일부 예에서, DpaA 또는 DpaB 단백질은 각각 도 1 및 2 의 "Consensus60"서열 (서열 번호 : 각각 40 및 55) 에서 확인된 하나 이상의 보존된 영역을 갖는다.
다른 구체 예에서, 상기 방법은 DPA 합성을 위한 대체 경로에 관여하는 하나 이상의 핵산 (예를 들어, DNA, mRNA 또는 cDNA)의 존재를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 전자 전달 플라보 단백질 (예를 들어, EtfA) 또는 철-황 플라보 단백질 (예를 들어, Isf)을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 존재 또는 발현을 확인하는 단계를 포함한다. 전자 전달 플라보 단백질은 알파(alpha) 와 베타(beta) 서브 유닛으로 이루어진 이종이량체 (heterodimer) 이며 아데닌 뉴클레오타이드 알파 가수 분해 효소(adenine nucleotide alpha hydrolase) 상과 (superfamily) 의 일부이다. 예시적인 박테리아 EtfA 핵산 서열은 GenBank 수탁 번호 CP000312.1 (2508382-2509389), NC_004578.1 (2407768-2408697), NC_009089.1 (977905-978927), NC_019382.1 (1357738-1356809, 보완), NC_003030.1 (2833696-2833268, 보완), NC_002971.4 (1062557-1061613, 보완) 및 NC_003063.2 (650447-651376)를 포함하며, 이들 각각은 2018 년 6 월 3 일 GenBank에 존재하는 바와 같이 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 박테리아 EtfA 아미노산 서열은 ABG86939, NP_792007.1, YP_001087282.1, YP_006967336.1, NP_349315.1, NP_820116.1 및 NP_357016.2를 포함하며, 이들 각각은 2018년 6 월 3 일에 GenBank에 존재하는 바와 같이 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 Isf 핵산 및 단백질 서열은 GenBank 수탁 번호 CP016318 (3060700-3061308) 및 ARE63607을 각각 포함하고, (2018 년 6 월 3 일 GenBank에 존재하는 바와 같이 본원에 참조로 포함됨) 그리고 이들은 도3에 도시되었다 (예를 들어, 서열 번호 57-66).
일부 예에서, DPA 신타제 핵산 (또는 EtfA 또는 Isf 핵산)은 미생물의 서열 분석에 의해 확인될 수 있다 (예를 들어, 전체 게놈 시퀀싱(sequencing) 및 / 또는 DPA 신타제-특이적 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 를 사용한 시퀀싱). 일부 예에서, 서열 분석은 GenBank (ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/), ENSEMBL (ensembl.org/index.html), IMG (img.jgi.doe.gov), MicrobesOnline (microbesonline.org), SEED (theseed.org) 또는 GOLD (gold.jgi-psf.gov)를 포함하는 하나 이상의 데이터베이스(databases) 에 존재하는 서열을 사용하여 수행된다. DPA 신타제 유전자를 확인하기위한 예시적인 방법은 하기 실시예 1에 제공된다. 유사한 방법이 EtfA 또는 Isf 유전자를 확인하는 데 사용될 수 있다.
일부 예에서, 하나의 미생물 또는 미생물 집단으로부터의 핵산은 검출 전에 분리, 증폭, 또는 둘 모두를 수행한다. 일부 예에서, 발현의 증폭 및 검출은 동시에 또는 거의 동시에 발생한다. 일부 예에서, 핵산 발현은 PCR (예를 들어, PCR, 실시간 PCR, RT-PCR 또는 정량적 RT-PCR)에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 시판되는 키트(kits) 를 사용하여 분리 및 증폭될 수 있다. 한 예에서, 핵산은 DpaA 및 / 또는 DpaB (또는 EtfA 또는 Isf) 핵산의 증폭을 허용하는 프라이머(primers) 와 함께 그러한 산물의 증폭을 허용하기에 충분한 조건 하에서 배양될 수 있다. 그 결과 앰플리콘(amplicons) 을 감지할 수 있다.
또 다른 예에서, 하나의 미생물 또는 미생물 집단으로부터의 핵산은 매우 엄격한 조건 하에서 DpaA 및 / 또는 DpaB (또는 EtfA 또는 Isf) 핵산 분자 (예를 들어, cDNA, 게놈 (genomic) DNA, or RNA (예를 들어, mRNA))에 결합할 수 있는 프로브(probes) 와 함께 배양된다. 그 결과 혼성화(hybridization) 가 검출될 수 있다. 다른 예에서, 미생물(들)로부터 얻은 분리된 핵산 분자를 어레이(an array) 에 적용하여 하나의 미생물 또는 미생물 집단이 스크리닝 (screened) 된다. 한 예에서, 어레이는 DpaA 및 / 또는 DpaB (또는 EtfA 또는 Isf) 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예에서, 미생물 핵산 분자는 분리된 핵산 분자와 올리고뉴클레오티드 프로브 간의 혼성화를 위하여 충분한 시간 동안 DpaA 및 / 또는 DpaB (또는 EtfA 또는 Isf)에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 어레이와 함께 배양된다. 그렇게 함으로써 분리된 핵산 분자 : 올리고뉴클레오티드 복합체를 형성한다. 그런다음 분리된 핵산 분자 : 올리고뉴클레오티드 복합체는 핵산이 샘플에 존재하는지 확인하기 위해 분석된다.
B. DPA 신타제 단백질 검출
대안으로 또는 DPA 신타제 핵산 검출에 추가하여 단백질은 면역 분석(immunoassays) (예를 들어, 웨스턴 블롯(Western blot), 면역 조직 화학(immunohistochemistry), 유세포 분석(flow cytometry) 또는 ELISA) 또는 질량 분석(mass spectrometry)과 같은 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 예에서, DpaA 단백질은 도 1에 나타낸 단백질과 적어도 20 % 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 35 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 55 % , 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 % 또는 그 이상) 을 갖는 단백질을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호 26-39). 일부 예에서, DpaB 단백질은도 2에 도시된 단백질과 적어도 20 % 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 35 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 % 또는 그 이상) 을 갖는 단백질을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호 42-54). 일부 예에서, DpaA 또는 DpaB 단백질은 각각 도 1 및 2의 "Consensus60" 서열에서 확인된 하나 이상의 보존된 영역을 갖는다 (각각 서열 번호 : 40 및 55). 다른 예에서, Isf 단백질은 도 3에 나타낸 단백질과 적어도 20 % 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 35 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 % 또는 그 이상) 을 갖는 단백질을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호 57-66).
일부 예에서 단백질은 검출 전에 정제된다. 한 예에서, DpaA 및 / 또는 DpaB (또는 Isf) 단백질은 미생물 샘플을 DpaA 및 / 또는 DpaB (또는 Isf)에 특이적으로 결합하는 항체 (an antibody) 와 함께 배양함으로써 검출될 수 있다. 상기 항체 ( "1 차 항체")는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 1 차 항체는 직접 라벨링 (labeled) 될 수 있거나, 상기 샘플은 라벨링된 2 차 항체 (예를 들어, 형광 라벨 (a fluorescent label) 로)와 후속적으로 배양될 수 있다. 그러면 라벨은 예를 들어 현미경 (microscopy), ELISA, 유세포 분석 또는 분광 광도법(spectrophotometry) 에 의해 검출될 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 샘플은 DpaA 및 / 또는 DpaB 단백질의 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블롯팅에 의해 분석된다. DpaA, DpaB 또는 Isf에 대한 항체는 예를 들어 도 1 내지 3의 아미노산 서열을 사용하여 당업자에 의해 생성될 수 있다.
1차 항체 또는 2차 항체에 적합한 라벨에는 다양한 효소(enzymes), 보결분자단(prosthetic groups), 형광 물질 (fluorescent materials), 발광 물질 (luminescent materials), 자성 물질 (magnetic agents) 및 방사성 물질 (radioactive materials) 이 포함된다. 적합한 효소의 비-제한적인 예는 홍당무 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리인산분해효소 (alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다제 (beta-galactosidase) 또는 아세틸콜린에스테라제 (acetylcholinesterase) 를 포함한다. 적합한 보결분자단 복합체의 비-제한적인 예는 스트렙타비딘 / 비오틴 (streptavidin/biotin) 및 아비딘 / 비오틴 (avidin/biotin) 을 포함한다. 적합한 형광 물질의 비-제한적인 예는 움벨리페론 (umbelliferone), 플루오레세인 (fluorescein), 플루오레세인 아이소사이아네이트 (fluorescein isothiocyanate), 로다민 (rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인 (dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드 (dansyl chloride) 또는 피코에리트린 (phycoerythrin) 을 포함한다. 비-제한적인 예시 발광 물질은 루미놀 (luminol) 이고; 비-제한적인 예시 자성 물질은 가돌리늄 (gadolinium) 이고; 그리고 비-제한적인 예시 방사성 표지는 125I, 131I, 35S or 3H 를 포함한다.
C. DPA 검출
일부 실시 양태에서, 이 방법은 DPA (예를 들어, 검출 가능한 DPA 수준)를 생성하는 하나의 미생물 또는 미생물 집단을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 적어도 1 nM DPA (예를 들어, 적어도 2 nM, 적어도 5 nM, 적어도 10 nM, 적어도 25 nM, 적어도 50 nM, 적어도 100 nM, 적어도 200 nM, 적어도 500 nM DPA 또는 그 이상) 를 검출하는 단계를 포함한다. 한 예에서, 상기 방법은 테르븀 (terbium) -DPA 형광 분석 (예를 들어, Rosen, Anal. Chem. 69:1082-1085, 1997; Pellegrino et al., Anal. Chem. 70:1755-1760, 1998; Ammann et al., Int. J. Microbiol. 2011:435281, 2011) 을 사용하여 DPA를 검출하는 단계를 포함한다. 간단히 말해서, DPA를 테르븀 (III)과 접촉 시키면 테르븀 (III)에 비해 형광이 증가하는 복합체가 형성되어 샘플에서 DPA를 검출 및 / 또는 정량할 수 있다. 예시적인 테르븀-DPA 분석은 실시예 1에 기술되어 있다.
III. 미생물 및 제형화
게놈에 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나, 및 / 또는 DPA를 생산하는 미생물이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 미생물은 게놈에 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나, 및 / 또는 DPA를 생성하도록 변형된다. 또한 하나 이상의 담체 또는 종자와 미생물의 제형화가 개시된다.
A. 미생물
하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 보유하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나, 및 / 또는 DPA를 생산하는 미생물에는 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus sp. (B. kochii, B. pocheonensis, 및 Bacillus sp. (균주 R-27341)와 밀접한 관련이 있음), Clostridium beijerinckii, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus cookii, Paenibacillus lautus, Virgibacillus halophilus, Paenibacillus azoreducens, 및 Bacillus firmus가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 이러한 박테리아는 PCT 공개 번호 WO 2018/045004 (전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다. 추가 미생물에는 표 25 및 26에 나열된 미생물이 포함된다. 일부 예에서, 이러한 미생물은 포자 형성 능력 (sporulation ability) 도 가지고 있다. 그러나 포자 형성 능력과 식별 가능한 DPA 신타제 유전자의 존재 또는 DPA 생산은 완전히 일치하지는 않다 (예를 들어, 표 6 참조).
추가 실시 양태에서, 본원에서 건조 제형 컨소시엄 (Dry Formulation Consortium) (DFC) 으로 참조된 것들을 포함하여, 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 보유하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나 및 / 또는 DPA를 생산하는 미생물을 포함하는 조성물이 개시된다. DFC의 미생물에는 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus drentensis, Bacillus subtilis, Clostridium bifermentans, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus paracasei, Fontibacillus sp. (panacisegetis), Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Paenibacillus azoreducens, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus cookii, Paenibacillus sp. (chitinolyticus), Paenibacillus sp. (P1XP2), Pseudomonas sp., 및 Streptomyces griseus가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시 양태에서, 조성물은 2019 년 5 월 16 일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC, Manassas, VA) 에 기탁된 미생물 종의 세포 및 할당된 기탁 번호 PTA-125924를 포함한다.
당업자는 미생물의 동정이, 특히 종 또는 균주 수준에서, 항상 가능한 것은 아니라는 것을 인식할 것이다. 일부 예에서, 본원에 기술된 조성물의 미생물은 16S rDNA 시퀀싱 및 전체 게놈 시퀀싱에 이어 공개 데이터베이스의 서열과 비교하여 분석되었다. 그러나 서열 데이터베이스의 정보의 한계 (일부 종 또는 균주 및 / 또는 시간 경과에 따른 명명법 변경에 대한 정보가 거의 또는 전혀 없다는 것을 포함) 로 인해 최종적인 종 또는 균주 식별을 제공하는 것이 어려울 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 개시된 조성물에 포함된 미생물 종은 본원에 제공된 16S rDNA 서열 (서열 번호 3-25) 에 대한 서열 동일성에 의해 확인된다. 일부 예에서, 개시된 미생물 컨소시엄 또는 조성물은 서열 번호 3-25에 대해 적어도 95 % 동일성 (예를 들어, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상) 을 갖는 16S rDNA 서열의 둘 이상 (예를 들어, 5 개 또는 그 이상, 10 개 또는 그 이상, 15 개 또는 그 이상, 20 개 또는 그 이상 또는 모두)의 미생물을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다.
하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 보유하거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하거나 및 / 또는 검출 가능한 양의 DPA를 생산하는 미생물은 자연적으로 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 보유하지 않거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하지 않거나 및 / 또는 DPA를 생산하지 않지만, 그러하도록 변형된 미생물을 또한 포함한다. 일부 예에서, 자연적으로 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 보유하지 않거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하지 않거나 및 / 또는 DPA를 생산하지 않는 미생물은 하나 이상의 이종 DPA 신타제 유전자, 예를 들어, DpaA 및 / 또는 DpaB 또는 하나 이상의 Isf 유전자를 발현하도록 변형된다. 예시적인 DpaA 및 DpaB 유전자 및 단백질 및 Isf 유전자 및 단백질은 서열 번호 : 26-67 포함하여 섹션 II 및 도 1내지 3 에 기술된다.
하나 이상의 이종 DPA 신타제 유전자를 발현하도록 변형될 수 있는 박테리아는 Azotobacter (예를 들어, Azotobacter vinelandii), Clostridium (예를 들어, Clostridium pasteurianum), Streptomyces (예를 들어, Streptomyces griseus, Streptomyces venezuelae, Streptomyces pratensis), Sporolactobacillus spp. (예를 들어, Sporolactobacillus dextrus ), Sporosarcina spp. (예를 들어, Sporosarcina halophila ), Desulfotomaculum spp. (예를 들어, Desulfotomaculum guttoideum), Nocardiopsis Spp. (예를 들어, Nocardiopsis sinuspersici), Promicromonospora spp. (예를 들어, Promicromonospora enterophila, Promicromonospora soli), Brevibacillus spp. (예를 들어, Brevibacillus centrosporus), Rummeliibacillus spp. (예를 들어, Rummeliibacillus pycnus), Lysinibacillus spp., Terribacillus spp. (예를 들어, Terribacillus shanxiensis), Micromonospora spp. (예를 들어, Micromonospora fulva, Micromonospora palomenea), Saccharopolyspora spp. (예를 들어, Saccharopolyspora spinose, Saccharopolyspora indica), 및 Fontibacillus spp. (예를 들어, Fontibacillus panacisegetis)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 이러한 박테리아는 PCT 공개 번호 WO 2018/045004 (전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다.
일부 예에서, 이종 DpaA 및 / 또는 DpaB 유전자는 프로모터의 제어하에 배치된다. 일부 예에서, 상기 프로모터는 구성적 (constitutive) 프로모터인 반면, 다른 예에서는 유도성 (inducible) 이다 (예를 들어, 유도성 T7 프로모터). 추가 예에서, 상기 프로모터는 아라비노스-유도성(arabinose-inducible) 프로모터 (예를 들어, pBAD 시스템), lac 프로모터 (직접 IPTG / 락토스 (lactose) 유도), trc 프로모터 (직접 IPTG / 락토스 유도), 테트라 사이클린 유도성 (tetracycline-inducible) 프로모터, 또는 pho 촉진제 (인산염 결핍 유도). 이종 DpaA 및 / 또는 DpaB 유전자는 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 벡터에 포함될 수 있다. 유사한 방법이 EtfA 또는 Isf 유전자에 사용될 수 있다.
여러 유전자 (예를 들어, 둘 이상의 DPA 신타제 및 / 또는 Isf 유전자) 가 박테리아에서 동시에 발현될 수 있다. 단일 경로에서 다중 효소의 적절하고 조화된 생산을 보장하기 위해, 이종 유전자를 코딩하는 각 핵산은 선택적으로 유도성 T7 프로모터와 같은 단일 유형의 프로모터의 제어하에 배치된다. 한 가지 예는 Duet ™ 벡터 (Novozymes)로, 단일 세포에서 4 개의 플라스미드를 효과적으로 증식하고 유지하기 위해 호환 가능한 레플리콘(replicon) 및 약물 내성(drug resistance) 유전자로 설계되었다. 이를 통해 최대 8 개의 서로 다른 단백질을 공동 발현할 수 있다. 다른 예에서, 벡터는 pET21 또는 pET28 벡터와 같은 pET 벡터이다. pET 및 pET 기반 벡터는 예를 들어 Novagen (San Diego, CA) 또는 Clontech (Mountain View, CA) 에서 시판된다.
한 예에서 상기 벡터는 pET21a 또는 pET28a이다. 일부 예에서, 상기 pET 벡터는 저항성 마커 (예를 들어, 암피실린 (ampicillin) 또는 카나마이신 (kanamycin) 저항성) 및 T7 프로모터를 포함한다. 다중 클로닝 부위 (multiple cloning site) 는 하나 이상의 유전자 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상) 가 단일 벡터에서 발현될 수 있도록 조작되었다. 일부 예에서, 상기 유전자는 단일 mRNA 및 다중 폴리 펩타이드 (multiple polypeptides) 가 생성되는 멀티 시스 트론 (multicistronic) 생성물 (예를 들어, 바이 시스 트론(bi-cistronic), 트리 시스 트론 (tri-cistronic) 등의 생성물) 으로 발현된다. 다른 예에서, 유전자는 각각의 유전자에 대해 생성된 개별 mRNA 및 폴리펩티드와 함께 다중 모노 시스 트론 (monocistronic) 생성물로 발현된다. 발현될 유전자 및 형질 전환되는 숙주 세포에 따라 적절한 벡터가 선택될 수 있다.
일부 예에서, 플라스미드 (plasmid) 는 염색체 외로 도입되고 숙주 미생물 내에서 복제된다. 다른 예에서, 플라스미드 도입 후, 이중 상동성 재조합 (double homologous recombination) 이 발생하고 하나 이상의 유전자가 게놈에 삽입된다.
재조합 DNA로 박테리아 세포의 형질 전환 (transformation) 을 수행할 수 있다. 숙주가 박테리아인 경우, 기하 급수적 성장기 이후 수확된 세포로부터 DNA 흡수가 가능한 적격 세포를 준비할 수 있고 이어서 당업계에 잘 알려진 절차를 사용하여 CaCl2 방법에 의해 처리된다. 그렇지 않으면 MgCl2 또는 RbCl을 사용할 수 있다. 박테리아는 또한 전기 천공, 접합 또는 형질 도입에 의해 변형될 수 있다.
B. 담체 및 종자 처리
하나 이상의 담체와 하나 이상의 미생물을 제형화하는 방법 및 하나 이상의 미생물 및 하나 이상의 담체를 포함하는 조성물이 본원에 개시되어 있다. 담체는 액체 또는 고체 (건조) 일 수 있다. 담체에는 액체 또는 건식 비료 (liquid or dry fertilizers) (예를 들어, 요소 (urea), 칼륨 (potash), 인산 암모늄 (ammonium phosphate) 및 / 또는 질산 암모늄 (ammonium nitrate) 을 포함한 비료), 토양 유래 물질 (soil-derived substances) (예를 들어, 점토 (clay), 이탄 (peat), 석탄 (coal), 무기 토양 (inorganic soil)), 유기 물질 (organic substances) (예를 들어, 목탄 (charcoal), 톱밥 (sawdust), 밀 / 대두 / 귀리 기울 (wheat/soy/oat bran), 퇴비 (compost), 코코 야자 껍질 (coco coir)) 및 / 또는 불활성 물질 (inert materials) (예를 들어, 펄라이트 (perlite), 질석 (vermiculite), 벤토나이트 (bentonite), 아조마이트® (Azomite®), 카올린 (kaolin), 규산염 (silicates), 경석 (pumice), 활석(talc))이 포함된다. 예시적인 담체는 아조마이트® (Azomite®), 펄라이트(perlite), 바이오차 (biochar), 건조 비료 (예를 들어, 요소, 염화칼륨 (MOP) 또는 제 1인산 암모늄 (MAP)), 액체 비료 (예를 들어, 요소 질산 암모뉴(UAN)) 및 먼지 제어 화학 물질 (dust control chemicals) (예를 들어, ArrMaz, FL, USA에서 사용 가능) 을 포함한다. 추가의 대표적인 담체는 몬모릴로나이트 (montmorillonite), 아타풀자이트 (attapulgite), 함수 알루미노실리케이트 (hydrous aluminosilicate) (Agsorb Products Group, IL, USA), 적옥토 (akadama) (Eastern Leaf Inc, CA, USA), 세라미스 점토 과립 (Seramis Clay granules) (Greens hydroponics, UK), Aquasmart?? Pro (Aquasmart, TX, USA), Pyro-Gro (Green Air products, OR, USA), 분쇄용암 (crushed lava), 점토 자갈 (clay pebbles) 을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 담체와의 제형화는 WO 2018/045004 (전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함됨; 본 명세서에서 AMC1이라고 함)에 기재된 22 가지 미생물의 컨소시엄 및 본원에 기재된 하나 이상의 담체를 포함한다. 다른 구체 예에서, 담체와의 제형화는 본원에 개시된 23 가지 미생물 (예를 들어, 표 26 또는 ATCC 기탁 PTA-125924 에 나열된 미생물)의 컨소시엄 및 하나 이상의 담체를 포함한다. 복합 제형은 또한 본원에 기재된 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 그 이상)의 미생물 및 하나 이상의 담체를 포함한다. 일부 예에서, 제형화는 하나 이상의 DPA 신타제 및 / 또는 Isf 유전자(들) (또는 DPA를 생성) 및 담체를 포함하거나 발현하는 하나 이상의 미생물을 포함한다. 다른 예에서, 제형화는 DPA 신타제 유전자(들)를 포함하거나 발현하거나 DPA를 생성하는 하나 이상의 미생물과 담체를 포함 및 DPA 신타제 유전자(들)를 포함하지 않거나 발현하지 않거나 DPA를 생성하지 않는 하나 이상의 미생물과 담체를 포함한다. 담체 및 하나 이상의 미생물을 제형화하는 방법은 하나 이상의 담체를 하나 이상의 미생물과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 미생물은 액체 형태 (예를 들어, 액체 배지에 있음)이거나 고체 또는 건조 형태이다.
또한 본원에는 하나 이상의 미생물로 종자를 처리하는 방법 (예를 들어, 하나 이상의 종자와 함께 하나 이상의 미생물을 제형화) 및 하나 이상의 미생물 및 하나 이상의 종자를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 이러한 실시 양태에서, 상기 종자는 미생물에 대한 "담체"이다. 일부 실시 양태에서, 종자 처리는 WO 2018/045004 (전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 22 개 미생물의 컨소시엄 및 하나 이상의 종자를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 종자 처리는 본원에 개시된 23 종의 미생물 (예를 들어, 표 26 또는 ATCC 기탁 PTA-125924 에 열거된 미생물) 및 하나 이상의 종자의 컨소시엄을 포함한다. 다른 예에서, 제형화는 하나 이상의 DPA 신타제 및 / 또는 Isf 유전자 (들) 포함하거나 발현 (또는 DPA를 생성) 하는 하나 이상의 미생물 및 종자를 포함한다. 다른 예에서, 제형화는 DPA 신타제 유전자 (들)를 포함 또는 발현하거나 DPA를 생성하는 하나 이상의 미생물 및 DPA 신타제 유전자 (들)를 포함 또는 발현하지 않거나 DPA 를 생산하지 않는 적어도 하나의 미생물 및 하나의 종자를 포함한다. 하나 이상의 미생물로 처리될 수 있는 예시적인 종자는 옥수수 종자 (corn seeds), 해바라기 종자 (sunflower seeds), 카놀라 종자 (canola seeds), 밀 종자 (wheat seeds), 오이 종자 (cucumber seeds), 토마토 종자 (tomato seeds), 벼 종자 (rice seeds) 및 목화 종자 (cotton seeds)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 미생물 처리된 종자는 미생물을 직접 종자에 적용하여 (예를 들어, 종자를 하나 이상의 미생물과 접촉) 제조한다. 다른 예에서, 미생물 처리된 종자는 미리 살충제 및 / 또는 살균제로 처리된 종자에 오버코트로서 미생물을 적용함으로써 제조된다 (예를 들어, 살충제 및 / 또는 살균제 처리된 종자와 하나 이상의 미생물과 접촉). 추가의 예에서, 미생물 처리된 종자는 미생물을 살충제 및 / 또는 살균제 (예를 들어, 살충제 / 살균제 슬러리)와 혼합하고 그 혼합물을 종자에 적용하여 제조한다 (예를 들어, 종자를 살충제 및 / 또는 살균제의 혼합물 및 하나 이상의 미생물과 접촉). 미생물과 조합하여 사용될 수 있는 예시적인 살충제 및 살균제는 메탈 락실 (metalaxyl), 트리플록시스트로빈 (trifloxystrobin), 이프코나졸 (ipconazole), 클로티아니딘 (clothianidin), 티아메톡삼 (thiamethoxam), 플루디옥소닐 (fludioxonil), 메페녹삼 (mefenoxam), 아족시스트로빈 (azoxystrobin), 티아벤다졸 (thiabendazole), 피라클로스트로빈 (pyraclostrobin), 이미다클로프리드, (imidacloprid), 플럭사피록사드 (fluxapyroxad) 및 / 또는 세덱산 (sedexane) 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 종자에 적용되는 하나 이상의 미생물은 액체 형태 (예를 들어, 액체 배지에 있음)이거나 고체 또는 건조 형태이다. 처리된 종자를 제조하는 방법은 종자 처리 : 오레곤 농약 살포기 훈련 매뉴얼 (Seed Treatment: Oregon Pesticide Applicator Training Manual) (Paulsrud et al., Urbana, Illinois, 2001) 및 실시예 13에 설명된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
IV. 사용 방법
개시된 미생물 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 액체 또는 건조 담체와 함께 제형화된 형태로 토양, 식물 또는 식물 부분 (plant parts) (예를 들어, 뿌리 (roots), 줄기 (stems), 잎 (foliage), 종자 (seeds) 또는 묘목 (seedlings))에 처리하도록 사용될 수 있다. 다른 예에서, 개시된 미생물 조성물은 처리된 종자의 형태로 사용될 수 있다.
일부 예에서, 개시된 조성물 및 / 또는 담체 또는 개시된 조성물로 처리된 종자를 사용한 처리는 식물 성장 (plant growth) 을 개선, 스트레스 내성 (stress tolerance) 을 개선 및 / 또는 작물 수확량 (crop yield) 을 증가시킨다. 일부 실시 양태에서 상기 방법은 토양, 식물 (예를 들어, 식물 잎, 줄기, 뿌리, 묘목 또는 기타 식물 부분) 또는 종자를 미생물 조성물 또는 본원에 개시된 제형과 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 구체 예에서, 방법은 개시된 조성물로 처리된 종자를 심는 것을 포함한다. 또한 방법은 처리된 식물, 식물 부분 또는 종자를 성장 및 / 또는 처리된 토양에서 식물, 식물 부분 또는 종자를 재배하는 것을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 단독으로 또는 하나 이상의 미생물 및 담체 또는 종자의 제형으로서 적용될 조성물 (들)의 양 (예를 들어, 에이커 또는 헥타르 당)이 계산되고 조성물은 처리될 영역을 분무하거나 관개하기에 충분한 양으로 물 (또는 일부 예에서 액체 비료)에 희석된다 (조성물이 액체 인 경우). 이 조성물은 종자를 심을 때 에이커 당 0.5 내지2 리터 (liters) (예를 들어, 0.5L / 에이커, 1L / 에이커, 1.5L / 에이커 또는 2L / 에이커)의 속도로 적용 될 수 있다. 또한 조성물은 동일하거나 상이한 양으로 성장하는 동안 1 회 이상 토양 (예를 들어, 식물 뿌리 근처) 또는 식물에 적용될 수 있다. 다른 예에서, 조성물은 희석된 제초제 (herbicides), 살충제 (insecticides), 농약 (pesticides) 또는 식물 성장 조절 화학 물질 (plant growth regulating chemicals) 과 혼합 될 수 있다. 적용할 조성물이 고체 (예를 들어, 건조 제제) 인 경우, 고체는 토양, 식물 또는 식물 부분에 직접 적용될 수 있거나 사용 전에 물 (또는 기타 액체)에 현탁 또는 용해될 수 있다.
일부 예에서, 개시된 조성물로 토양, 종자, 식물 또는 식물 부분을 처리하면 식물 성장 (예를 들어, 전체 식물 크기, 잎의 양, 뿌리 수, 뿌리 지름, 뿌리 길이, 곁눈 생산, 과일 생산, 꽃가루 생산 및 / 또는 종자 생산)이 약 5 % 이상 증가한다 (예를 들어, 적어도 약10 % , 약 30 %, 약 50 %, 약 75 %, 약 100 %, 약 2 배, 약 3 배, 약 5 배, 약 10 배 또는 그 이상). 다른 예에서, 개시된 방법은 처리되지 않은 작물에 비해 약 10-75 % (예를 들어 약 20-60 % 또는 약 30-50 %)까지 작물 생산 (crop production)을 증가시킨다. 작물 성능 (crop performance) 의 다른 측정에는 과일의 품질(quality of fruit), 수확량 (yield), 전분 또는 고형분 함량 (starch or solids content), 당 함량 (sugar content) 또는 브릭스 (brix), 과일 또는 수확 가능한 작물 (harvestable product) 의 저장-수명 (shelf-life), 시장성 있는 수확량 (marketable yield) 또는 목표 크기 (target size) 의 생산, 과일 또는 작물의 품질 (quality), 잔디 분얼 (grass tillering) 및 잔디의 유동인구에 대한 저항력 (resistance to foot traffic in turf), 수분 (pollination) 및 과일 세트 (fruit set), 개화 (bloom), 꽃 수 (flower number), 꽃 수명 (flower lifespan), 개화 품질 (bloom quality), 뿌리 내리기 (rooting) 및 뿌리 질량 (root mass), 숙박에 대한 작물 저항성 (crop resistance to lodging), 열 (heat), 가뭄 (drought), 추위 (cold) 에 대한 비생물적 스트레스 내성 (abiotic stress tolerance) 및 스트레스 후 회복, 열악한 토양에 대한 적응성 (adaptability to poor soils), 광합성 (photosynthesis) 및 녹화 (greening) 수준 (level) 및 식물 건강 (plant health). 제품의 효능을 결정하기 위해, 대조군에는 미생물을 추가하지 않은 동일한 농경법이 포함되고, 동시에 수행된다.
개시된 방법 및 조성물 및 / 또는 제형은 임의의 작물과 연계하여 사용될 수 있다 (예를 들어, 직접 작물 처리 또는 식재 (planting) 전 또는 후에 토양 처리를 위해). 대표적인 작물은 알팔파(alfalfa), 아몬드 (almond), 바나나 (banana), 보리 (barley), 브로콜리 (broccoli), 양배추 (cabbage), 대마초 (cannabis), 캐놀라 (canola), 당근 (carrots), 감귤류 및 과수원 작물 (citrus and orchard tree crops), 옥수수 (corn), 면화 (cotton), 오이 (cucumber), 꽃 (flowers) 및 장식물 (ornamentals), 마늘 (garlic), 포도 (grapes), 홉 (hops), 원예 식물 (horticultural plants), 부추 (leek), 멜론 (melon), 기름 야자 나무 (oil palm), 양파 (onion), 땅콩과 콩류 (peanuts and legumes), 파인애플 (pineapple), 포플러 (poplar), 소나무 (pine) 와 목재용 나무 (wood-bearing trees), 감자 (potato), 나무 딸기 (raspberry), 쌀 (rice), 참깨 (sesame), 수수 (sorghum), 대두 (soybean), 호박 (squash), 딸기 (strawberry), 사탕 수수 (sugarcane), 해바라기 (sunflower), 토마토 (tomato), 잔디 및 벼과 사료 작물 (turf and forage grasses), 수박 (watermelon), 밀 (wheat) 및 유칼립투스 (eucalyptus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
도 1은 표시된 박테리아(bacteria) 로부터의 DpaA 단백질 서열의 정렬이다. 기본 설정으로 Clustal Omega (clustal.org/omega)를 사용하여 13 개 균주(strains) (서열 번호: 26-39)의 14 개의 DpaA 서열을 정렬했다. 이어서, 60 %의 최소 서열 동일성 역치 (threshold) 를 사용하여 컨센서스 서열 (consensus sequence)이 생성되었다 ("컨센서스 60"; 서열 번호: 40). PRK08306 (서열 번호: 41)은 NCBI CDD 보존 도메인 패밀리 데이터베이스 (Conserved Domain Family database) (ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi)에서 검색된 DpaA 수퍼 패밀리의 컨센서스 서열이다.
도 2는 표시된 박테리아로부터의 DpaB 단백질 서열의 정렬이다. 기본 설정으로 Clustal Omega (clustal.org/omega)를 사용하여 13 개 균주 (서열 번호: 42-54)의 13 개의 DpaB 서열을 정렬했다. 이어서, 60 %의 최소 서열 동일성 역치를 사용하여 컨센서스 서열이 생성되었다 ("컨센서스 60"; 서열 번호 : 55). PRK08305 (서열 번호: 56)는 NCBI CDD 보존 도메인 패밀리 데이터베이스 (Conserved Domain Family database) (ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi)에서 검색된 DpaB 수퍼 패밀리의 공통 서열이다.
도 3은 5 개의 박테리아 (서열 번호: 57-66)로부터의 10 개의 Isf 단백질 서열 및 하나의 컨센서스 서열 (서열 번호: 67)의 정렬을 보여준다.
도 4는 표시된 담체와 조합된 박테리아의 생존을 요약한 그래프이다.
도 5는 미생물 컨소시엄 (AMC1)이 주입된 펄라이트 또는 펄라이트로 처리된 식물에서 32 일 오이 싹 건조 중량을 보여주는 그래프이다.
도 6은 펄라이트, DFC 미생물 컨소시엄이 함침된 펄라이트, 벤토나이트 및 DFC 미생물 컨소시엄이 함침된 벤토나이트로 처리된 식물에서 32 일 오이 싹 건조 중량을 보여주는 그래프이다.
도 7은 처리되지 않은 식물, 액체 DFC 컨소시엄으로 처리된 식물, 및 DFC 미생물 컨소시엄이 함침된 펄라이트로 처리된 식물에서 32 일 오이 싹 건조 중량을 보여주는 그래프이다.
도 8은 살충제 / 살균제 처리와 함께 옥수수 및 대두 종자와 조합된 DFC 컨소시엄의 박테리아 생존을 보여주는 그래프이다.
서열 번호 1은 Streptomyces pratensis 로부터의 컨센서스 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 2은 Streptomyces venezuelae 로부터의 컨센서스 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 3은 Bacillus firmus 로부터의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 4은 Paenibacillus azoreducens 로부터의 컨센서스 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 5는 Bacillus amyloliquefaciens 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 6은 Bacillus flexus 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 7은 Bacillus licheniformis 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 8은 Bacillus megaterium 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 9는 Bacillus pumilus 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 10은 Bacillus koreensis 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 11은 Bacillus drentensis 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 12는 Bacillus subtilis 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 13은 Clostridium bifermentans 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 14는 Clostridium beijerinckii 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 15는 Clostridium pasteurianum 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 16은 Lactobacillus paracasei 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 17은 Fontibacillus sp. (panacisegetis) 의 부분적인16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 18은 Oceanobacillus oncorhynchi 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 19는 Paenibacillus lautus 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 20은 Paenibacillus chibensis 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 21은 Paenibacillus cookii 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 22는 Paenibacillus sp. (chitinolyticus) 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 23은 Paenibacillus sp. (P1XP2) 의 부분적인16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 24는 Pseudomonas sp. 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 25는 Streptomyces griseus 의 16S rDNA 핵산 서열이다.
서열 번호 26-39는 DpaA 의 아미노산 서열이다.
서열 번호 40-41은 DpaA 의 컨센서스 아미노산 서열이다.
서열 번호 42-54는 DpaB 의 아미노산 서열이다.
서열 번호 55-56은 DpaB 컨센서스 아미노산 서열이다.
서열 번호 57-66은 Isf 아미노산 서열이다.
서열 번호 67은 Isf 컨센서스 아미노산 서열이다.
다음 실시예는 어떤 특별한 특징 및 / 또는 실시 양태를 설명하기 위해 제공된다. 이러한 실시예는 기술된 특별한 특징 또는 실시예로 개시를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
재료 및 방법
미생물의 분리 및 식별 : 모든 미생물은 아그리노스 미생물 수집 (Agrinos microbial collection (AMC))에서 유래되었으며 이전에 WO 2018/045004에 설명되어 있다. 단, 본원에 설명 된 4 개의 추가 미생물은 예외다. 이러한 추가 미생물은 아래에 설명된 대로 분리되었다.
박테리아 Streptomyces pratensis 와 Streptomyces venezuelae 는 벌크 (bulk) 토양에서 분리되었다 (N38° 38’49.402”, W121° 40”5.775”). 간단히 말해, 토양 샘플은 연속 희석 및 여러 유형의 반-고체 배지 (semi-solid media) 에 플레이팅(plating)하기 전에 멸균한 (sterile) 인산염 완충 식염수 (phosphate buffered saline) -TWEEN® 80 용액에 현탁되었다. S. pratensis 및 S. venezuelae 는 30 °C에서 최대 3 일 동안 배양한 후 만니톨 (mannitol) (HIMEDIA # M372) 플레이트에 아조토박터(Azotobacter) 배지 (medium) 한천 (agar) 에서 분리되었다. 동종 (isogenic)이 될 때까지 반-고체 배지 MP (아래 참조)에 균주를 반복적으로 스트리킹 했다.
Bacillus firmus 는 이전에 비료 (UAN32)와 1 : 180의 비율로 혼합시켰던, HYT® A (Agrinos AS) 샘플에서 분리되었다. 실온에서 3 주 동안 배양 한 후, 혼합물의 분취량을 여러 유형의 반-고체 배지에 플레이팅하고 30 °C에서 최대 3 일 동안 배양했다. B. firmus 콜로니 (colony)는 Pikovskaya의 배지 한천 플레이트 (HIMEDIA # M520)에서 수집되었다. 동종 (isogenic)이 될 때까지 반-고체 배지 MP (아래 참조)에 균주를 반복적으로 스트리킹 했다.
Paenibacillus azoreducens 는 HYT® A (Agrinos AS) 샘플에서 분리되었다. P. azoreducens 는 1-10mM 황산 암모늄 (ammonium sulfate) 한천 배지 (0.585g/L NaCl, 0.075g/L KCl, 0.147g/L CaCl2, 0.049g/L MgSO4, 1.32-0.132g/L (NH4)2SO4, 0.054g/L KH2PO4 포함하는 pH 7.5 HEPES 완충액) 에서 성장하는 콜로니로 분리되었다. 동종 (isogenic)이 될 때까지 반-고체 배지 MP (아래 참조)에 균주를 반복적으로 스트리킹 했다.
새로 기술된 미생물의 분류학적 분류 : 새로 기술된 4 개의 균주 모두에 대해, 생물학적으로 순수한 분리물의 전체-게놈 시퀀싱이 아래 기술된 대로 수행되었다. 새로운 (De novo) 게놈 조립 (genome assembly) 은 계층적 게놈 조립 분석과정(Hierarchical Genome Assembly Process) (HGAP, Pacific Biosciences, Menlo Park, CA USA)으로 수행되었다.
분류학적 식별은 주로 16S 리보솜 RNA (rRNA) 서열을 사용하여 이루어졌다. 16S rRNA 서열은 RNAmmer (cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/)를 사용하여 새로운 (de novo) 게놈 어셈블리 내에서 처음 확인되었다. 16S 서열은 NCBI BLASTn, the Ribosomal Database Project (RDP) Naive Bayesian Classifier (Wang et al. Appl. Environ. Microbiol. 73:5261-5267, 2007), 및 Greengenes 새로운 (de novo) 계통 발생 트리 구성 (phylogenetic tree construction) 및 순위 매핑 (rank mapping) (DeSantis et al. Appl. Environ. Microbiol. 72 : 5069-502, 2006)으로 서열 짝 정렬을 사용하여 분류되었다. 그런 다음 세 가지 방법의 조화를 사용하여 종 할당이 이루어졌다.
위의 내용을 바탕으로 미생물 식별은 다음과 같이 이루어졌습니다:
· Streptomyces pratensis. 16S 시퀀스를 사용하여 전체 게놈 분류학적 분류도 수행되었다. 단백질 코딩 서열은 Prodigal (Hyatt et al. BMC Bioinformatics, 11:119, 2010)을 사용하여 확인되었다. 이 분류는 특정 게놈에 대한 서열 세트와 일치하는 한 쌍을 찾기 위해 49 개의 보존된 Clusters of Orthologous Group families (Tatsuov et al. Science 278:631-637, 1997) 세트를 사용했다. 그런 다음 선택된 게놈의 서열을 참조 정렬에 삽입하고, 가장 가까운 이웃을 추출 및 연결하고 FastTree2 (대략적인 최대 가능성 방법, Price et al. PLoS One 5:e9490, 2010)를 사용하여 그것들로부터 나무를 렌더링(render)했다. 이 엄격한 분류 방법은 가장 적합한 참조 종으로 Streptomyces pratensis 를 선택했다. Streptomyces pratensis ATCC 33331에 대한 참조 게놈은 NCBI RefSeq에서 다운로드했고 MUMmer (mummer.sourceforge.net/)를 사용하여 얻어진 전체 게놈 서열에 대해 정렬되었다. 정렬은 광범위한 글로벌 일치 (global agreement) 를 나타냈고 게놈 차원 (genome-wide scale)에서 매우 밀접한 관련이 있음을 확인했다. 공통 16S 서열은 서열 번호 1로 제공된다.
· Streptomyces venezuelae. 모든 분석 결과는이 분리주가 S. venezuelae 로 식별되었음을 강력하게 뒷받침한다. 공통 16S 서열은 서열 번호 2로 제공된다.
· Bacillus firmus. 모든 분석 결과는이 분리균이 B. firmus.임을 강력하게 뒷받침했다. 공통 16S 서열은 서열 번호 3으로 제공된다.
· Paenibacillus azoreducens. 모든 분석의 결과는이 분리가 P. azoreducens. 로 식별되었음을 강력하게 뒷받침했습니다. 공통 16S 서열은 서열 번호 4로 제공된다.
미생물 대사 활동 가능성의 확인 : 모든 잠재적 미생물 대사 활동은 그 전문이 본원에 참고로 포함 된 WO 2018/045004에 기재된 바와 같이 실험실 분석을 사용하여 평가되었다. 미생물이 신진 대사 과정에서 황-함유 화합물을 황화물로 환원시키는 지 여부를 확인하기 위해 bioMerieux의 API® 식별 제품이 제조업체의 권장 사항에 따라 사용되었다 (bioMerieux, Inc., Durham, NC USA). 새로 확인된 미생물에 대한 주요 대사 활동 프로파일링 (profiling) 의 결과는 표 1에 나와 있다.
새로운 미생물 분리물의 대사활동
미생물 질소 대사 내염성 미네랄 용해성 셀룰로오스 용해성/키틴 용해성 다른 식물에 유익한 활동 황 대사 철 대사/사이드로-포어 (sidero-pore)
Streptomyces venezuelae N, D ≥2.5% 키틴 + 셀룰로오스 M + IAA 사이드로포어 생합성 및 수송
Streptomyces pratensis N ≥2.5% 키틴 + 셀룰로오스 M + IAA 사이드로포어 생합성 및 수송
Bacillus firmus N ＜5% 셀룰로오스 M + IAA 사이드로포어 수송
Paenibacillus azoreducens N ＜2.5% P, Ca IAA H2S 사이드로포어 수송
D : 탈질화, N : 질소 고정, P : 인산염, Ca : 칼슘, IAA : 인돌 -3- 아세트산 생성, M : 말산 동화, H2S : 황화수소 생성
박테리아에서 디피콜린산 (DPA) 생산 평가 : 관심 박테리아 균주에서 DPA 생산의 평가는 Rosen (Anal. Chem. 69:1082-1085, 1997); Pellegrino et al. (Anal. Chem. 70:1755-1760, 1998); 및 Ammann et al. (Int. J. Microbiol. 2011:435281, 2011) 에 본질적으로 기술된 바와 같이 테르븀 (terbium) -DPA 형광 분석 (fluorescence assay) 으로 수행되었다. 간단히, 각 동종 균주는 호기성 (aerobically) 또는 혐기성 (anaerobically) 한천 배지 (표 2 참조)에서 성장했다. 호기성 균주 (aerobic strains) 는 최대 3 일 동안 30 ° C에서 성장한 반면, 혐기성 균주 (anaerobic strains) 는 최대 3 일 동안 Pack-Anaero 혐기성 가스 생성 주머니 (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc., Tokyo, Japan) 가 있는 BD GasPak EZ 컨테이너 시스템 (container systems) (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA) 에서 35 ° C에서 성장했다. DPA 분석의 경우, 플레이트에서 성장하는 콜로니에서 약 5 μL의 박테리아를 취하여 10 mL의 아세트산 나트륨 완충액 (0.2 M, pH 5)에 재현탁했다. 현탁액을 121 ° C, 15 게이지 압력 (psig) 에서 15 분 동안 오토클레이브 (autoclaved) 하고 약 30 분 동안 실온에서 냉각시켰다. 동일한 부피의 오토클레이브된 현탁액과 30μM 테르븀 (III) 클로라이드 헥사하이드레이트 (Terbium(III) chloride hexahydrate) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO USA) 용액을 이어서 혼합하였다. 그런 다음 Cytation 5 Imaging Reader (BioTek, Winooski, VT USA)를 사용하여 형광을 측정했다 (272 nm 여기, 545 nm 방출).
반-고체 배지에서이 연구에 사용된 박테리아 배양 : 마스터 세포 은행 (master cell banks) 으로서 -80 °C에서 보관된 동종 박테리아 균주는 뚜렷한 콜로니의 형성이 관찰될 때까지 한천 배지 (표 2)에서 성장되었다. 간단히, 호기성 균주는 최대 3 일 동안 30 °C에서 성장한 반면, 혐기성 균주는 최대 3 일 동안 Pack-Anaero 혐기성 가스 생성 주머니 (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc., Tokyo, Japan) 가 있는 BD GasPak EZ 컨테이너 시스템 (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA) 에서 35 °C에서 성장했다.
미생물 배양에 사용되는 한천 배지
속 (Genus) 한천-기반 배지* (Agar-based medium)
Bacillus spp. MP, NA (amyloliquefaciens; flexus; licheniformis; subtilis), BHI (subtilis; licheniformis; flexus), RCM (firmus; sp.(pocheonensis)), YPD (megaterium; amyloliquefaciens), RhX (amyloliquefaciens)
Lactobacillus spp. RCM, MP, MRS
Virgibacillus spp. YPD, MP
Paenibacillus spp. BHI, MP, NA (cookii, lautus), RCM (azoreducens), R2A (chibensis)
Clostridium spp. RCM (pasteurianum; beijerinckii), AMAS (pasteurianum), NA (beijerinckii), MP (pasteurianum; beijerinckii), MP
Oceanobacillus spp. BHI, RhX, NA, MP
Acetobacter spp. RCM, YPD, MP
Pseudomonas spp. MP, YPD, BHI (putida), RCM (sp. (fluorescens))
Streptomyces spp. MP, BHI, NA (pratensis), YPD (griseus)
Azotobacter spp. MP, AMAS, RhX
* NA : 영양 한천 (nutrient agar) (BD # 213000); YPD : 효모 펩톤 덱스트로스(yeast peptone dextrose) (BD # 242720); BHI : 뇌심장침출 한천 (Brain Heart infusion agar) (Teknova, CA, USA); RhX : 111 Rhizobium X 배지 (medium) (ATCC); AMAS : 아조토박터 배지 한천 (azotobacter medium agar) (HIMEDIA # M372); RCM : 클로스트리듐 배지 강화 (reinforce clostridium medium) (BD # 218081); MRS : 락토바실리 (Lactobacilli) MRS (BD # 288210); R2A : R2A 한천 (agar) (HIMEDIA # SMEB962), MP : 당밀 배지 한천 (Molasses medium agar) (2 % w / v 당밀 (molasses), 0.15g / L MgSO4, 0.1g / L CaCl2, 0.12g / L FeSO4, 1g / L K2SO4, 5g / L 효모 추출물 (Yeast extract), 10g / L 펩톤 (peptone), 5g / L NaCl, 0.1g / L NaMoO4, 0.01g / L MnCl2, 0.03g / L KH2PO4, 0.03 g / L Na2HPO4 및 15 g / L 한천 (agar))
액체 배지에서 이 연구에 사용된 개별 박테리아 균주의 배양 : 한천-성장 균주 (agar-grown strains) 에서 선별된 콜로니를 적절한 멸균 액체 배지 (표 3)에 접종하고 최대 3 일 동안 배양했다. 호기성 균주는 진탕 (shaking) (125-175 rpm)과 함께 30 ° C에서 배양되었고, 혐기성 균주는 교반없이 (with no agitation) 35 ° C에서 밀봉된 혈청병 또는 Hungate 튜브 (tubes) 에서 N2 가스 하에서 배양되었다. 필요한 경우, 동일한 부피의 개별적으로 성장한 균주를 혼합하여 미생물 컨소시엄을 생성했다. 균주 당 mL 당 세포 수 를 보여주는 전형적인 결과 (아래 참조) 는 표 4에 요약되어 있다. 미생물 함량은 WO 2018/045004에 기재된 바와 같이 Supermix For Probes (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 드롭릿 디지털 (droplet digital) PCR (ddPCR)에 의해 결정되었다.
미생물 배양에 사용되는 액체 배지
속 액체 배지*
Bacillus spp. BHI (flexus; licheniformis; sp.(pocheonensis); subtilis), YPDS (megaterium; amyloliquefaciens), NB (firmus)
Lactobacillus spp. RCM
Virgibacillus spp. BHIS
Paenibacillus spp. BHI (chibensis; cookii; lautus), NB (azoreducens)
Clostridium spp. RCM
Oceanobacillus spp. BHIS
Acetobacter spp. YPD
Pseudomonas spp. YPDS 0.5%
Streptomyces spp. YEME
Azotobacter spp. MP
*YPD : 효모 펩톤 덱스트로스(yeast peptone dextrose) (BD # 242720); YPDS : 0.5g / L NaCl이 보충된 효모 펩톤 덱스트로스 (BD # 242720); BHI : 뇌심장침출 (Brain Heart infusion) (Teknova, CA, USA);
RCM : 클로스트리듐 배지 강화 (reinforce clostridium medium) (BD # 218081); BHIS : 45g / L NaCl이 보충된 뇌심장침출 (Teknova, CA, USA); MP : 당밀 배지 (Molasses medium) (2 % w / v 당밀 (molasses), 0.15g / L MgSO4, 0.1g / L CaCl2, 0.12g / L FeSO4, 1g / L K2SO4, 5g / L 효모 추출물 (Yeast extract), 10g / L 펩톤 (peptone), 5g / L NaCl, 0.1g / L NaMoO4, 0.01g / L MnCl2, 0.03g / L KH2PO4 및 0.03 g / L Na2HPO4) YEME : 효모 추출물-맥아 추출물 (malt extract) 배지 (3g / L 효모 추출물, 5g / L 박토-펩톤 (bacto-peptone); 3g / L 맥아 추출물; 10g / L 포도당 (glucose); 340g / L 수크로스 (sucrose); 5mM MgCl2); NB : 영양배지 (nutrient broth) (BD # 234000)
개별적으로 배양된 균주를 혼합하여 최종 액체 제제의 mL 당 일반적인 박테리아 세포 수
미생물 최종 액상 제제 mL 당 박테리아 세포 수 (개별 혼합)
Bacillus megaterium 2.53E+07
Lactobacillus paracasei/casei 7.66E+07
Clostridium beijerinckii 1.97E+07
Acetobacter pasteurianus 4.58E+07
Lactobacillus buchneri 1.77E+07
Bacillus subtilis 5.26E+07
Paenibacillus cookii 9.14E+07
Lactobacillus vini 9.06E+07
Bacillus licheniformis 5.00E+08
Paenibacillus lautus 5.16E+07
Oceanobacillus oncorhynchi 2.12E+07
Bacillus amyloliquefaciens 8.30E+07
Bacillus sp. 1.26E+08
Pseudomonas putida 1.02E+08
Pseudomonas sp. 1.96E+08
Streptomyces griseus 3.76E+07
Paenibacillus chibensis 9.34E+07
Bacillus flexus 5.88E+07
Clostridium pasteurianum 3.29E+07
Azotobacter vinelandii 6.02E+07
Virgibacillus halophilus 1.95E+07
Lactobacillus delbrueckii 3.36E+07
발효에 의한 공동-배양 미생물 컨소시엄 생산 : 호기성 및 / 또는 혐기성 박테리아 모두 인산염 (phosphates), 나트륨 (sodium), 칼륨(potassium) 및 염화물 (chlorides) (시판되는 인산염 완충 식염수 (Phosphate Buffered Saline) 형태) 뿐만 아니라 식품 등급 유청 분말 (Whey powder) (0.1 % w / v) 형태의 아미노산, 질소 및 펩타이드 / 단백질 그리고 효소로 생산된 비-GMO 대두 추출물 (0.25% w/v; Ferti-Nitro Plus Plant N; Ferti-Organic, Brownsville, TX USA과 같은 필수 요소가 보충된 2 % 당밀 (molasses) 이 포함된 배지에서 배양되었다. 염화나트륨 농도는 0 내지 4 % w / v 범위였다. 상기 기재된 표 4의 균주 (본원에서 AMC1로 지칭됨)를 6.67E-05 내지 6.67E-04 범위의 각 균주에 대해 OD600의 최종 접종에서 1.5 리터 작업 부피로 2L DASGIP bioreactors (Eppendorf North America Hauppauge, NY) 에 접종하였다. 수산화 암모늄 (ammonium hydroxide) 과 인산 (phosphoric acid) 을 각각 염기 및 산 용액으로 사용하여 pH를 5.5와 6.9 사이로 유지했다. 온도는 28ºC에서 35ºC 사이로 조절되었다. 혐기성 발효는 혐기성 환경을 유지하기 위해 N2 가스로 지속적으로 살포되었다. 살포된 공기는 발효 기간 (일반적으로 최대 3 일) 동안 미생물의 산소 공급원으로 호기성 발효에 사용되었다. 일부 실험의 경우, 발효 후 서로 다른 균주를 포함하는 배치 (batches) 가 풀링(pool) 하여 22 가지 균주의 완전한 박테리아 혼합물을 생성했다. 균주 당 mL 당 세포 수 (아래 참조) 를 보여주는 전형적인 결과는 표 5에 요약되어 있다. 발효물의 미생물 함량은 WO 2018/045004에 기재된 바와 같이 Supermix For Probes (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 드롭릿 디지털 (droplet digital) PCR (ddPCR)에 의해 결정되었다.
공동-배양을 통한 최종 액체 제제 mL 당 일반적인 박테리아 세포 수
미생물 최종 액체 제제의 mL 당 박테리아 세포 수 (공동-배양)
Bacillus megaterium 1.40E+04
Lactobacillus paracasei/casei 9.60E+05
Clostridium beijerinckii 1.60E+07
Acetobacter pasteurianus 1.20E+07
Lactobacillus buchneri 1.00E+05
Bacillus subtilis 1.30E+06
Paenibacillus cookii 6.60E+03
Lactobacillus vini 8.20E+04
Bacillus licheniformis 9.30E+05
Paenibacillus lautus 2.00E+09
Oceanobacillus oncorhynchi 2.00E+09
Bacillus amyloliquefaciens 6.00E+05
Bacillus sp. 3.20E+05
Pseudomonas putida 2.30E+07
Pseudomonas sp. 1.20E+07
Streptomyces griseus 7.50E+06
Paenibacillus chibensis 5.80E+03
Bacillus flexus 6.00E+06
Clostridium pasteurianum 4.80E+06
Azotobacter vinelandii 1.30E+07
Virgibacillus halophilus 6.10E+06
Lactobacillus delbrueckii 2.00E+06
동결-건조된 미생물 컨소시엄 생산 : 일부 실험에서 생산된 미생물 컨소시엄은 농업-담체 (agro-carriers) 와의 제형화된 형태로 실험 전에 동결 건조되었다. 컨소시엄들 (Consortia) 은 동일한 부피의 개별 배양된 박테리아를 모으거나(pooling) 공동-배양된 발효물을 사용하여 생성되었다 (위에서 설명). 동결 건조는 본질적으로 WO 2018/045004에 기술된 바와 같이 수행되었다. 간단히, 동결-건조된 미생물 제제는 제조업체의 권장 사항에 따라 액체 미생물 컨소시엄들과 만니톨 (mannitol) / 동결 보호제 (lyoprotectant) 용액 (OPS Diagnostics, Lebanon, NJ, USA) 을 혼합하여 생산하고 미생물 현탁액을 동결 건조 바이알 (lyophilization vials) (OPS Diagnostics, Lebanon, NJ, USA) 에 분취 (aliquoted) 했다. -80 °C에서 60 분 후, 혼합물을 FreeZone 6 동결 건조 시스템 (Labconco, Kansas City, MO)에 넣고, 진공을 적용하고, 샘플의 물을 승화 (sublimate) 시켰다. 샘플은 필요할 때까지 4 °C에서 보관되었다. 일부 실험에서는 미생물 배양에 다음 화학 물질의 최종 농도 0.75 g / L Tryptic Soy Broth (Becton, Dickinson and Company, USA), 10 g / L 수크로스 (Sigma Aldrich, USA) 및 5 g / L 탈지유 (skim milk) (Carnation, Nestle S.A, CH) 를 첨가하여 동결 보호 용액을 제조했다.
농업-담체와 미생물의 제형화 : 액체 미생물 컨소시엄 (공동-배양에서 생성되거나 개별적으로 성장한 다음 모아짐) 또는 위에서 기술한 대로 생성된 개별 박테리아 균주가 펄라이트, 아조마이트® (Azomite, UT, USA), 경석, 일 염기성 인산 암모늄 비료 (Monobasic Ammonium phosphate fertilizer) (MAP; Mosaic, MN, USA), 칼륨 비료의 염화물 (Muriate of potash fertilizer) (MOP; Mosaic, MN, USA) 및 바이오차 (Biochar) (Cool Terra®; Cool Planet Energy system, CO, USA) 와 같은 농업-담체에게 함침되었다. 캐리어의 수분 보유 특성에 따라, 다양한 양의 미생물 컨소시엄을 사용하여 그램(gram) 당 35μL에서 최대 6mL까지 담체를 포화시켰다. 그 다음 미생물 / 농업-담체 혼합물을 추가의 저장-수명 미생물 생존성 연구 및 식물 분석을 위해 밀폐 용기에 저장하기 전에 30 °C-35 °C에서 밤새 건조했다.
요소 및 질산 암모늄 수용액 (UAN32; TGI, CA, USA) 또는 비료 먼지 제어제 (DUSTROL; ArrMaz FL, USA) 와 같은 액체 농약 (agro-chemicals) 과 제형화의 경우, 위에서 상세히 설명한 대로 생성된 액체 미생물 컨소시엄은 저장 및 미생물 생존성 분석 전에 다양한 비율 (아래 예에 설명됨) 로 혼합되었다. 모든 작업은 오염을 최소화하기 위해 위생적인 조건에서 수행되었다.
어떤 경우에는 배양액이 담체 화학에 미치는 영향을 최소화하기 위해 동결-건조된 박테리아 컨소시엄이 사용되었다. 세부 사항은 적절한 예에 설명되어 있다.
DPA 신타제 생산을 위한 박테리아 게놈 분석
미생물 게놈 DNA 추출: 최적화된 액체 배지 및 배양 조건에서 다양한 종의 박테리아 세포를 성장시키고 수확했다. PowerSoil DNA 분리 키트 (isolation kit) (MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA USA)는 소규모 게놈 DNA 추출에 사용되었다. 대규모 게놈 DNA 추출의 경우, 제조업체 권장 방법에 따라 GenElute 박테리아 게놈 DNA 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA) 또는 Qiagen 게놈 DNA 버퍼 세트 (Buffer Set) 및 게놈-팁 (Genomic-tip) 500/G (Qiagen, Hilden, Germany) 가 사용되었다. 그 결과 생성된 게놈 DNA는 동일한 부피의 이소프로판올 (isopropanol) 로 침전시키고, 70% 에탄올로 세척하고, 공기-건조 및 TE 완충액으로 재현탁시켰다.
전체 게놈 시퀀싱 (WGS) : 생물학적으로 순수한 분리물 (isolates) 의 전체 게놈 시퀀싱은 제조업체가 권장하는 서열 라이브러리 (sequence library) 준비 및 시퀀싱 방법에 따라 PacBio RSII 시스템 (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA USA)을 사용하여 수행되었다. 평균 24kb 길이의 평균 73,000 개의 판독이 미생물 분리물로부터 생성되었으며, 계층적 게놈 어셈블리 프로세스 (Hierarchical Genome Assembly Process) (HGAP, Pacific Biosciences, Menlo Park, CA USA)를 사용한 새로운 (de novo) 게놈 어셈블리가 뒤따랐다.
선택한　박테리아　균주의　DPA　신타제　코딩　시퀀스　확인　:　초기　생물　정보학　분석에는　Bacilli　종류의　일부　구성원; 바실러스 (Bacillus) (Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus sp., 및 Bacillus flexus), 뿐만 아니라 락토바실러스 (Lactobacillus) (Lactobacillus delbrueckii) 이　포함되었다.　 먼저,　이전에　획득한　전체-게놈 시퀀스를 사용하여 BPGA-버전-1.3　(iicb.res.in/bpga/index.html) 으로　게놈　다양성을　추정하고　코어 (core) (보존),　액세서리　(accessory) (필수 (dispensable)),　및 고유 (unique)　(균주-특이성 (strain-specific)) 유전자　풀 (gene pool) 을　결정하기 위해서 박테리아　팬-게놈　분석 (pan-genome analysis) 을 수행했다. 그런　다음　액세서리　유전자　세트 (accessory gene set) 의 모든 디피콜리네이트 신타제 서브 유닛　A　(DpaA)에　대해　검색을　수행했다. 사용자　지정　Bash　스크립트 (script) (Free Software Foundation, 2007) 를　사용하여　DpaA　및　DpaB 에 대한 표　1에 나와있는　균주의　완전한　검색이 이어졌다.
간단히 말해서, 단백질 코딩 유전자는 두 단계로 주석을 달았다. Prodigal (PROkaryotic DYnamic programming Gene-finding ALgorithm (Hyatt et al., BMC Bioinformatics 11 : 119, 2010))은 후보 유전자의 좌표를 확인하는 데 사용되었지만 추정 유전자 산물을 설명하지는 않는다. 그런 다음 이러한 후보 유전자를 계층적 방식으로 대규모 데이터베이스와 비교했다. 신뢰할 수 있는 더 작은 데이터베이스에서 시작하여 중간 크기이지만 도메인 별 데이터베이스로 이동하고, 마지막으로 큐레이트된 (curated) 단백질 패밀리 모델로 이동한다. 기본적으로 10-6의 e-value 임계값은 다음과 같은 일련의 데이터베이스에서 사용되었다:
1. 실제 단백질 또는 전사 증거가 있고 단편이 아닌 UniProt의 모든 박테리아 단백질. BLAST +는 검색에 사용된다.
2. 지정된 속에 대한 RefSeq에서 완성된 박테리아 게놈의 모든 단백질. BLAST +는 검색에 사용된다.
3. Pfam (Punta et al., 2012) 및 TIGRFAM (Haft et al., 2013)을 포함한 일련의 숨겨진 Markov 모델 프로파일 데이터베이스. 이는 HMMER 3.1 패키지 (Eddy, 2011)의 hmmscan을 사용하여 수행된다.
4. 일치하는 항목이 없으면 '가상 단백질' 이라고 표시한다.
그런 다음 이러한 데이터를 포자 형성 및 건식 제제 생존성 (표 6 참조) 과 함께 표로 작성하여 DPA 신타제와 생존력 간의 상관 관계를 설정했다. 그런 다음 Clustal Omega (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) 및 Seaview 4 (Gouy et al. Mol. Biol. Evol. 27:221-224, 2010) 를 사용하여 계산된 아미노산 조성 및 빈도 통계를 사용하여 DpaA 및 DpaB 유전자의 정렬을 수행했다. 그런 다음 DpaA 및 DpaB 아미노산 정렬을 사용하여 패키지 Biostrings 및 seqinr (Pages et al., 2016; Charif and Lobry, Structural Approaches to Sequence Evolution, pp. 207-232, 2007; R Core Team, 2016) 을 사용하여 R에서 컨센서스 서열 및 확률 매트릭스 (matrices) 를 계산했다.
DPA를 포자화하고 생산할 수 있는 균주 요약
박테리아 균주 포자화 능력 DPA 신타제 유전자의 존재 DPA 생산
A. pasteurianus N NF ND
A. vinelandii Y NF ND
B. amyloliquefaciens Y Y Y
B. flexus Y Y Y
B. licheniformis Y Y Y
B. megaterium Y Y Y
B. subtilis Y Y Y
Bacillus sp. Y Y Y
C. beijerinckii Y NF Y
C. pasteurianum Y NF ND
L. buchneri N NF ND
L. casei/paracasei N NF ND
L. delbrueckii N NF ND
L. vini N NF ND
O. oncorhynchi Y Y ND
P. chibensis Y Y Y
P. cookie Y Y Y
P. lautus Y Y Y
P. putida N NF ND
Pseudomonas sp. N NF ND
S. griseus Y NF ND
V. halophilus Y Y ND
S. venezuelae Y NF ND
S. pratensis Y NF ND
P. azoreducens Y Y Y
B. firmus Y Y Y
Y: 네; N: 아니오; NF: 찾을 수 없음; ND: 감지되지 않음
컨소시엄 내 박테리아 생존성 분석
액체 제형 샘플 준비 : 각 저장-수명 시점에 대해, 1 mL의 제형 (농약 (agrochemical) / 박테리아 컨소시엄 (bacterial consortium))을 멸균 펩톤 수 (sterile peptone water) 에 10-1에서 10-5로 연속 희석했다.
건식 제제 샘플 준비 : 각 저장-수명 시점에 대해, 0.03-1g의 건조 제형 (농업-담체 / 박테리아 컨소시엄)을 펩톤 수 또는 기타 적절한 배지와 같은 배양액에 최대 3mL로 현탁하고 실온에서 최대 1 시간 동안 배양했다. 어떤 경우에는 수조 초음파 세척기 (VWR 초음파 클리너)를 사용하여 건조 매트릭스에서 박테리아를 방출하기 위해 부드러운 초음파 처리 (35 khz)가 사용되었다. 이어서 현탁액을 멸균 펩톤 수 또는 다른 유형의 배양액에서 10-1에서 10-5로 연속 희석 하였다. 다른 경우에는 성장을 위해 건조 물질 (dry material) 을 액체 배지에 직접 첨가했다.
생존성 분석 : 처리(들) 를 받은 상기 박테리아 균주에 증식할 기회가 주어졌다. 컨소시엄에서 각 균주의 성장 잠재력을 극대화하기 위해 chA (반-건조 키틴 (semi-dry chitin), 5 g/L; K2HPO4, 0.7g/L; KH2PO4, 0.3g/L; MgSO4.5H2O, 0.5g/L; FeSO4.7H2O, 0.01g/L; ZnSO4, 0.001g/L; MnCl2, 0.001g/L 및 한천, 15g/L), RCM, NA, MP, YPD, RhX, AMAS 및 / 또는 BHIS와 같은 여러 가지 한천 배지가 사용되었다. 일부 예에서, 위에서 생성된 각 연속 희석액을 하나 이상의 한천 배지에 중복하여 도포했다. 다른 경우에, 위에서 생성된 건조 물질은 하나 이상의 액체 배지에 여섯 번 현탁되었다. 플레이트 배양의 경우, 플레이트를 한 세트는 30 ° C에서 호기성으로 다른 세트는 35 ° C에서 혐기성으로 정적 인큐베이터 (static incubators) 에서 3 일 동안 배양했다. 액체 배양의 경우, 튜브를 30 °C에서 호기성으로 흔들거나 35 °C에서 혐기성으로 정적상태로 7 일 동안 배양했다. 상기 처리(들) 에서 살아남은 박테리아는 콜로니를 형성하거나 액체 배양에서 증식하여 성장했으며, 이러한 성장은 드롭릿 디지털 (droplet digital) PCR (ddPCR)을 사용하여 샘플링되고 확인되었다.
제조업체의 권장 사항에 따라 DNeasy PowerLyzer PowerSoil 키트 (Qiagen, Inc., Germantown, MD USA)를 사용하여 수확된 세포에서 게놈 DNA를 추출했다. 그런 다음 DNA는 Quantas Fluorometer 및 QuantiFluor dsDNA (Promega Corporation, Madison, WI USA)를 사용하여 정량화되었고 ddPCR (Dreo et al., Anal. Bioanal. Chem. 406:6513-6528, 2014; Yin, et al., Journal of Microbiological Methods 65:21-31, 2006) 과 함께 균주 특이적 프로브 (strain specific probes) 를 사용하여 확인 및 정량화를 위한 처리가 되었다. 요약하면, ddPCR 반응은 DNA 샘플, 프라이머 및 프로브를 결합하여 제조업체의 권장 사항에 따라 Bio-Rad의 ddPCR Supermix for Probes를 사용하여 준비되었다 (WO 2018/045004에 이전에 설명된 대로 16S 유전자의 고유한 서열 및 / 또는 WGS 게놈 어셈블리에서 확인된 고유 코딩 유전자 서열을 사용하여 설계되었으며, 여기에 참조로 포함됨). 그런 다음 제조업체의 권장 사항에 따라 QX200 ™ 액적 (droplet) 생성기 또는 AutoDG ™ 기기를 사용하여 액적을 생성했다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 Bio-Rad의 ddPCR Supermix for Probes에서 권장하는 열 순환 조건을 사용하여 Eppendorf Mastercycler® 넥서스 (nexus) 구배를 사용하여 수행되었다. PCR 프로토콜 (protocol) 에 따라 QX200 액적 판독기를 사용하여 반응을 읽었다. 마지막으로 QuantaSoft ™ 소프트웨어 (software) 로 농도를 분석했다.
액체 또는 건식 농업-담체와의 제형화 후 단일 균주 생존성 확인의 경우, 표 2에 설명된 바와 같이 주어진 균주에 가장 적합한 한천 배지를 사용하여 단순 플레이팅 (plating) 을 수행했다.
실시예 2
선택된 박테리아 균주에서 DPA 신타제 코딩 시퀀스의 확인
디피콜리네이트 신타제 서브 유닛 A (DpaA) : 박테리아 균주에서 얻은 DpaA의 아미노산 정렬은 28.4 %의 아미노산만 보존하면서 분기된다는 것을 보여주었다. 결과는 표 7-9 및 도. 1에 요약되어 있다. Oceanobacillus oncorhynchi 는 대부분의 다른 균주보다 더 다양하게 나타났다. 정렬된 위치로 정의된 분모와 퍼센트 동일성을 계산함으로써 O. oncorhynchi 는 BLOSUM62를 사용하는 컨센서스 서열과 58 % 동일성을 가졌다. 또한, 이러한 아미노산 변화는 분석된 대부분의 균주에 대해 보존된 영역에 있는 것으로 나타났다. DpaA의 아미노산 정렬은 또한 Virgibacillus halophilus 가 유전자의 복제로 인해 두 개의 유전자 사본을 가지고 있음을 보여주었다. 첫 번째 사본은 매우 다양했으며 (컨센서스 서열과 51 % 동일성, 위와 동일한 방법), 두 번째 사본은 상당한 아미노산 변화와 더불어 29 개 아미노산으로 잘린 것으로 나타났다. 또한 DpaA의 다른 모든 경우는 오페론의 일부로 DpaB와 함께 순차적으로 위치했지만 V. halophilus 에서는 두 유전자가 539 개의 다른 유전자로 분리되어 있다.
DpaA 유전자 사본 수
DPA 유전자가 있는 균주 DpaA 유전자 사본 수
Bacillus megaterium 1
Bacillus subtilis 1
Paenibacillus cookie 1
Bacillus licheniformis 1
Paenibacillus lautus 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1
Bacillus amyloliquefaciens 1
Bacillus sp. 1
Paenibacillus chibensis 1
Bacillus flexus 1
Bacillus firmus 1
Virgibacillus halophilus 2
Paenibacillus azoreducens 1
DpaA 유전자의 서열 다양성
선택된 영역: 303 100.0%
완전 (갭 없음, X 없음) 262 86.5%
변이 208 68.6%
정보 176 58.1%
갭 또는 X 41 13.5%
동일 54 17.8%
동일하지 않고 보존 32 10.6%
총 보존 86 28.4%
DpaA 유전자의 아미노산 조성
아미노산 구성 (모든 부위)
그룹 1: 30.50%
E: 5.7
D: 6
Q: 3.4
N: 3.1
H: 2.3
R: 4.3
K: 5.6
그룹 2: 29.90%
I: 9.3
L: 10.2
M: 2.8
V: 7.6
그룹 3: 33.50%
A: 9
P: 3.7
S: 5.8
G: 8.3
T: 6.7
그룹 4: 4.90%
F: 3.2
Y: 1.6
그룹 5: 1.30%
W: 0.1
C: 1.2
디피콜리네이트 신타제 서브 유닛 B (DpaB): 박테리아 균주에서 DpaB의 아미노산 정렬은 45.5 %의 아미노산이 보존된 DpaA보다 더 보존된 것으로 나타났다. 결과는 표 10-12 및 도. 2에 요약되어 있다. 중복 또는 주요 잘림이 감지되지 않았다. 위에서 언급했듯이 DpaB의 모든 사본은 DpaB가 DpaA의 상류에 539 개의 유전자가 있는 V. halophilus 를 제외하고는 오페론의 일부로 DpaA와 함께 순차적으로 위치했다.
DpaB 유전자 사본 수
DPA 유전자가 있는 균주 DpaB 유전자 사본 수
Bacillus megaterium 1
Bacillus subtilis 1
Paenibacillus cookii 1
Bacillus licheniformis 1
Paenibacillus lautus 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1
Bacillus amyloliquefaciens 1
Bacillus sp. 1
Paenibacillus chibensis 1
Bacillus flexus 1
Bacillus firmus 1
Virgibacillus halophilus 1
Paenibacillus azoreducens 1
DpaB 시퀀스 다양성
선택된 영역: 202 100.0%
완전 (갭 없음, X 없음): 196 97.0%
변이: 133 65.8%
정보: 104 51.5%
갭 또는 X: 6 3.0%
동일: 63 31.2%
동일하지 않고 보존: 29 14.4%
총 보존: 92 45.5%
DpaB 유전자의 아미노산 조성
아미노산 조성 (모든 부위)
그룹 1: 30.30%
E: 4.8
D: 4.7
Q: 3.8
N: 6.2
H: 1.4
R: 3.2
K: 6.3
그룹 2: 29.00%
I: 6.5
L: 9.8
M: 4.3
V: 8.4
그룹 3: 34.30%
A: 8.3
P: 6.6
S: 5.2
G: 7
T: 7.1
그룹 4 4.70%
F: 3
Y: 1.7
그룹 5: 1.70%
W: 0.6
C: 1.1
DPA의 생산 (위에 설명된 분석에서) 과 DPA 유전자의 존재 간의 상관 관계 : 표 6에서 언급한 바와 같이, Clostridium beijerinckii 는 Terbium-DPA 형광 분석 (fluorescence assay) 을 통해 DPA 생산 균주로 검출되었지만 DpaA 또는 DpaB는 게놈에서 식별할 수 없었다. 우리는 C. beijerinckii 가 이전에 DPA 생산에 연루된 EtfA와 구조적으로 관련된 철-황 플라보 단백질 (iron-sulfur flavoprotein) (Isf)을 가지고 있음을 발견했다 (Orsburn et al., Mol. Microbiol. 75:178-186, 2010). 철-황 플라보 단백질의 6 개 사본이 C. beijerinckii 의 게놈에서 발견되었다. 이들 서열은 4 개의 다양한 박테리아로부터의 isf 서열과 정렬되었다: Archaeoglobus fulgidus, Methanocaldococcus jannaschii, Methanosarcina thermophila, 및 Peptoclostridium difficile (도. 3). 이 Isf 단백질은 Clostridium pasteurianum 에는없고 C. pasteurianum 에서는 DPA 생산이 검출되지 않았다. DPA 생산에서 Isf의 역할에 대한 추가 자료는 실시예 12에서 제공된다.
실시예 3
담체에서의 선택된 단일 균주의 생존
개별 균주가 함침된 아조마이트® 에서 박테리아 생존성 평가가 수행되었다. 실험실 분석에서 DPA를 생산하는 능력 및 / 또는 DPA 유전자 식별 결과에 따라 4 가지 균주를 선택했다. 함침된 물질은 박테리아 생존성을 평가하기 전에 5 일 동안 건조 상태로 보관되었다. 결과는 표 13에 나와 있다. 검출 가능한 DPA 생산 (2/2)을 가진 균주의 100 %는 5 일 동안 생존할 수 있었다. DPA 생산이 검출되지 않는 균주의 경우 50 % (1/2 균주)가 5 일 동안 생존 가능했다.
건조 아조마이트® 와의 제형화에서 개별 박테리아의 생존 vs. DPA 생산
미생물 DPA 생산 5-일 생존력
Streptomyces venezuelae 0 1
Streptomyces pratensis 0 0
Bacillus firmus 1 1
Paenibacillus azoreducens 1 1
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 생산 열 (column) 은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다.
두 번째 실험에서는 균주 수가 확장되었다. 함침 후 아조마이트®에서 박테리아 생존성 평가는 1 개월에 걸쳐 수행되었다. 간단히 말해서, 아조마이트®를 개별 동종 균주로 함침시키고, 건조시키고, 박테리아 생존력 분석을 위해 3, 7, 14, 21 및 28 일에 샘플을 채취했다. 결과는 표 14에 나타낸 바와 같으며, 확인된 DPA 유전자를 갖고 DPA를 생산하는 100 % (4/4) 박테리아가 1 개월 동안 생존 가능함을 보여준다. 확인된 DPA 유전자가 없고 DPA 생산을 검출할 수 없는 균주의 경우 40 % (2/5 균주)가 1 개월 동안 생존할 수 있었다.
건조 아조마이트® 와의 제형화에서 개별 박테리아의 생존 vs. DPA 유전자 식별 및 DPA 생산
미생물 DPA 유전자 DPA 생산 3일 7일 14일 21일 28일
Bacillus subtilis 1 1 1 1 1 1 1
Paenibacillus putida 0 0 1 0 0 0 0
Pseudomonas sp. 0 0 1 1 1 1 1
Streptomyces griseus 0 0 1 1 1 1 1
Streptomyces venezuelae 0 0 1 0 0 0 0
Streptomyces pratensis 0 0 0 0 0 0 0
Bacillus firmus 1 1 1 1 1 1 1
Paenibacillus azoreducens 1 1 1 1 1 1 1
1 = 감지 됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열 (column) 은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다.
그런 다음 두 번째 농업-담체 (펄라이트) 를 테스트했다. 이전에 아조마이트®에서 설명한 대로 미생물 생존성 평가를 1 개월 동안 수행했다. 결과는 표 15에 나타낸 바와 같으며, 확인된 DPA 유전자를 갖고 DPA를 생산하는 박테리아의 100 % (4/4)가 1 개월 동안 생존 가능함을 보여준다. DPA 유전자가 검출되지 않고 DPA 생산이 검출되지 않는 균주의 경우 60 % (3/5 균주)가 1 개월 동안 생존 가능했다.
건식 펄라이트와의 제형화에서 개별 박테리아의 생존 vs. DPA 유전자 식별 및 DPA 생산
미생물 DPA 유전자 DPA 생산 3일 7일 14일 21일 28일
Bacillus subtilis 1 1 1 1 1 1 1
Paenibacillus putida 0 0 1 1 1 1 0
Pseudomonas sp. 0 0 1 1 1 1 0
Streptomyces griseus 0 0 1 1 1 1 0
Streptomyces venezuelae 0 0 0 0 0 0 0
Streptomyces pratensis 0 0 0 0 0 0 0
Bacillus firmus 1 1 1 1 1 1 1
Paenibacillus azoreducens 1 1 1 1 1 1 1
1 = 감지 됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다.
실시예 4
담체에서의 미생물 컨소시엄의 생존
다음 실험에서 22 개의 박테리아를 개별적으로 성장시킨 후 혼합하여 위에서 설명한대로 컨소시엄을 생성했다. 펠릿화된 형태 (pelletized form) 의 건조 아조마이트®를 0.23-0.4 mL의 컨소시엄 (펠릿의 완전성 (integrity) 을 보존하기 위해)으로 함침시키고, 건조하고 2 주 동안 저장 한 후 컨소시엄에서 미생물 생존력을 분석하기 위한 분석을 사용하여 생존한 박테리아를 분석했다 (실시예 1). 두 번의 독립적인 실험이 수행되었으며 그 결과는 표 16에 요약되어 있다. 우리는 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아 균주의 83 % 및 92 %가 아조마이트®에 함침 후 2 주 동안 생존할 수 있음을 관찰했다. 두 시험에서 일관된 생존력을 보이지 않는 균주는 O. oncorhynchi였다. 위에서 언급했듯이, O. oncorhynchi DPA 신타제 서브 유닛 A는 BLOSUM62를 사용한 컨센서스 서열과 58 % 동일성으로 대부분의 다른 조사된 균주보다 더 다양하게 나타난다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주의 경우, 결과는 동일한 기간 내에 생존 가능한 박테리아의 60 %에서 70 % 사이로 다양했다. 두 시험 사이의 재현성은 낮았으며 함침 당시이 미생물 세트의 다른 대사 상태에 기인할 수 있다.
건조 아조마이트® 와의 제형화에서 개별 박테리아의 생존
박테리아 속/종 DPA 유전자 DPA 생산 시험1 시험2
2주 2주
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 1 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생산하는 박테리아
Bacillus flexus 1 1 1 1
Bacillus licheniformis 1 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1 1
Bacillus sp. 1 1 1 1
Bacillus subtilis 1 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 1 1
Paenibacillus cookii 1 1 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1 0 1 0
Paenibacillus lautus 1 0 1 1
Virgibacillus halophilus 1 0 0 0
Clostridium beijerinckii 0 1 1 1
Acetobacter pasteurianus 0 0 0 1 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
Azotobacter vinelandii 0 0 1 1
Clostridium pasteurianum 0 0 1 1
Lactobacillus buchneri 0 0 1 1
Lactobacillus delbrueckii 0 0 0 0
Lactobacillus paracasei/casei 0 0 1 0
Lactobacillus vini 0 0 0 0
Pseudomonas putida 0 0 1 0
Pseudomonas sp. 0 0 1 0
Streptomyces griseus 0 0 1 1
1 = 감지 됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다.
위에서 설명한 아조마이트®를 사용한 실험과 유사하게 22 개의 박테리아를 개별적으로 성장시킨 후 혼합하여 컨소시엄을 생성했다. 펄라이트를 2-6 mL의 컨소시엄으로 함침시키고, 건조하고 2 주 동안 보관 한 후 컨소시엄의 미생물 생존력을 분석하기 위한 분석을 사용하여 생존 한 박테리아를 분석했다 (실시예 1). 두 번의 독립적인 실험이 수행되었으며, 그 결과는 표 17에 요약되어 있다. 우리는 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아 균주의 58 % 및 100 %가 펄라이트에 함침된 후 2 주 동안 생존할 수 있음을 관찰했다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주의 경우, 결과는 동일한 기간 내에 생존 가능한 박테리아의 60 %에서 80 % 사이로 다양했다. 아조마이트® 실험과 비교할 때, 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아는 다른 함침 기질을 사용해도 우수한 재현성을 나타냈다. 그들은 또한 우리의 분석에서 확인된 DPA 유전자가 없거나 검출 가능한 DPA 생산이 없는 군을 능가했다.
펄라이트와의 제형화에서 컨소시엄으로부터의 개별 박테리아의 생존
박테리아 속/종 DPA 유전자 DPA 생산 시험1 시험2
2주 2주
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 1 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아
Bacillus flexus 1 1 0 1
Bacillus licheniformis 1 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1 1
Bacillus sp. 1 1 1 1
Bacillus subtilis 1 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 1 1
Paenibacillus cookii 1 1 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1 0 0 1
Paenibacillus lautus 1 0 1 1
Virgibacillus halophilus 1 0 0 1
Clostridium beijerinckii 0 1 1 1
Acetobacter pasteurianus 0 0 1 0 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
Azotobacter vinelandii 0 0 0 0
Clostridium pasteurianum 0 0 1 1
Lactobacillus buchneri 0 0 1 1
Lactobacillus delbrueckii 0 0 0 0
Lactobacillus paracasei/casei 0 0 1 1
Lactobacillus vini 0 0 1 0
Pseudomonas putida 0 0 1 1
Pseudomonas sp. 0 0 1 1
Streptomyces griseus 0 0 1 1
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 컬럼은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트 된 균주를 나타낸다.
실시예 5
액체 먼지 제어제와 함께 제형화된 미생물 컨소시엄의 생존
아래 실험에서, 관심 박테리아 균주는 위에서 설명한 대로 배지를 사용하여 반-고체 한천 플레이트에서 성장했다 (표 2 참조). 먼지 제어 화학 물질 (dust control chemical) / 박테리아 제형은 200 μL의 멸균 펩톤 수에 한천 플레이트에서 긁어낸 1 μL 루프풀 (loopful) 을 현탁한 다음 5 % v / v의 비율로 먼지 제어 화학 물질과 혼합하여 생성되었다. 이어서, 제형에서 각 균주의 생존성은 박테리아 / 농약 혼합물이 있는 신선한 배지 (표 3)를 접종하고 성장 징후에 대한 점수를 매김으로써 결정되었다.
MDC-200과 함께 제형화된 박테리아의 생존성: 먼지 제어제 MDC-200 (ArrMaz, FL, USA)과의 제형화 후 박테리아 생존력 평가를 1 개월 동안 수행했다. 결과는 표 18에 나타난 바와 같다. 우리는 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생산하는 박테리아의 92 % (11/12)가 1 개월 동안 생존 가능함을 관찰했다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출할 수 없는 DPA 생산이 있는 균주의 경우 0 % (0/10 균주)가 1 개월 동안 생존할 수 있었다.
DUSTROL® 3275와 함께 제형화된 박테리아의 생존성: DUSTROL® 3275 (ArrMaz, FL, USA)와의 제형화 후 박테리아 생존력 평가를 1 개월에 걸쳐 수행했다. 결과는 표 18에 나타낸 바와 같다. 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 100 % (12/12)가 1 개월 동안 생존 가능함을 관찰했다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출할 수 없는 DPA 생산이 없는 균주의 경우 0 % (0/10 균주)가 1 개월 동안 생존할 수 있었다.
DUSTROL® 3133과 함께 제형화된 박테리아의 생존성: DUSTROL® 3133 (ArrMaz, FL, USA)과의 제형화 후 박테리아 생존력 평가를 1 개월에 걸쳐 수행했다. 결과는 표 18에 나타낸 바와 같다. 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 100 % (12/12)가 1 개월 동안 생존 가능함을 관찰했다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출할 수 없는 DPA 생산이 없는 균주의 경우 0 % (0/10 균주)가 1 개월 동안 생존할 수 있었다.
DUSTROL® 3139와 함께 제형화된 박테리아의 생존성 : DUSTROL® 3139 (ArrMaz, FL, USA)와의 제형화 후 박테리아 생존력 평가를 1 개월에 걸쳐 수행했다. 결과는 표 18에 나타낸 바와 같다. 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 92 % (11/12)가 1 개월 동안 생존 가능함을 관찰했다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출할 수 없는 DPA 생산이 없는 균주의 경우 0 % (0/10 균주)가 1 개월 동안 생존할 수 있었다.
DUSTROL® 3001과 함께 제형화된 박테리아의 생존성: DUSTROL® 3001 (ArrMaz, FL, USA)과의 제형화 후 박테리아 생존력 평가를 1 개월에 걸쳐 수행했다. 결과는 표 18에 나타낸 바와 같다. 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 33 % (4/12)가 1 개월 동안 생존 가능함을 관찰했다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출할 수 없는 DPA 생산이 없는 균주, 0 % (0/10 균주)는 1 개월 동안 생존할 수 있었다. 이 실험에서 감소된 생존은 DUSTROL® 3001의 하나 이상의 구성 요소와 미생물 (DPA 생산 여부에 관계없이) 의 비 호환성 때문일 수 있다.
DUSTROL® 3010과 함께 제형화된 박테리아의 생존성: DUSTROL® 3010 (ArrMaz, FL, USA)과의 제형화 후 박테리아 생존력 평가를 1 개월에 걸쳐 수행했다. 결과는 표 18에 나타낸 바와 같다. 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 75 % (9/12)가 1 개월 동안 생존 가능한 것으로 관찰되었다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출할 수 없는 DPA 생산이 있는 균주의 경우, 20 % (2/10 균주)가 1 개월 동안 생존할 수 있었다.
액체 먼지 제어 화학 물질과의 제형화된 컨소시엄으로부터의 개별 박테리아의 1 개월 생존
박테리아 속/종 DPA 유전자 DPA 생산 MDC-200 DUSTROL® 3275 DUSTROL® 3133 DUSTROL® 3139 DUSTROL® 3001 DUSTROL® 3010
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 1 1 1 1 1 확인된 DPA 유전자 및 / 또는 DPA 생산을 가진 박테리아
Bacillus flexus 1 1 1 1 1 1 0 1
Bacillus licheniformis 1 1 1 1 1 1 0 1
Bacillus megaterium 1 1 1 1 1 1 0 1
Bacillus sp. 1 1 1 1 1 1 0 1
Bacillus subtilis 1 1 1 1 1 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 1 1 1 1 1 1
Paenibacillus cookii 1 1 1 1 1 1 0 0
Oceanobacillus oncorhynchi 1 0 1 1 1 1 0 1
Paenibacillus lautus 1 0 1 1 1 1 1 0
Virgibacillus halophilus 1 0 0 1 1 0 0 0
Clostridium beijerinckii 0 1 1 1 1 1 0 1
Acetobacter pasteurianus 0 0 0 0 0 0 0 1 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
Azotobacter vinelandii 0 0 0 0 0 0 0 0
Clostridium pasteurianum 0 0 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus buchneri 0 0 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus delbrueckii 0 0 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus casei 0 0 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus vini 0 0 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas putida 0 0 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas sp. 0 0 0 0 0 0 0 0
Streptomyces griseus 0 0 0 0 0 0 0 1
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다. 다음 6 개 열 (MDC-200, DUSTROL® 3275, 3133, 3139, 3001 및 3010)은 각 제형에서 1 개월 생존력을 나타낸다. 마지막 열은 A) 알려진 DPA 유전자를 보유하거나 DPA를 생성하거나 둘 다 및 B) 알려진 DPA 유전자를 보유하지 않거나 DPA를 생성하지 않는 균주 그룹에 대한 생존성을 요약한다.
실시예 6
액체 UAN 비료와 함께 제형화된 미생물 컨소시엄의 생존
액체 UAN 비료와 함께 제형화 후 박테리아 생존력 평가는 1 개월 동안 다양한 시점에서 수행되었다. 간단히 말해서, 각 동종 균주는 호기성 또는 혐기성으로 액체 배지 (위에서 설명한 바와 같이)에서 성장시켰다. 그런 다음 배양액을 동일한 비율로 혼합하고 혼합물을 1 : 180 (미생물 : UAN)의 비율로 UAN32와 결합했다. 미생물 생존율은 0, 7, 14 및 28 일에 평가되었으며 표 19에 요약되어 있다. 0 일 시점 (제형화 후 ~ 1 시간) 동안, 식별된 DPA 유전자 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아 균주의 83 % (10/12)가 생존 가능하게 유지되었다. 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아의 경우 0 일 시점에서 20 % (2/10 균주) 만 생존할 수 있었다. 7 일 시점까지, 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아 균주의 67 % (8/12)가 생존 가능한 상태로 유지되었다. 7 일 후에는 이 균주 세트의 생존력에 변화가 없었다. 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아의 경우 7 일 시점에 10 % (1/10 균주) 만 생존할 수 있었다.
UAN 비료와 함께 제형화된 박테리아의 한 달 동안의 생존성
속/종 DPA 유전자 DPA 생산 UAN -
0 Day 		UAN -
7 일 		UAN -
14 일 		UAN -
30 일
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 0 0 0 확인된 DPA 유전자 및 / 또는 DPA 생산을 가진 박테리아
Bacillus flexus 1 1 1 1 1 1
Bacillus licheniformis 1 1 1 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1 1 1 1
Bacillus sp. 1 1 1 1 1 1
Bacillus subtilis 1 1 1 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 1 1 1 1
Paenibacillus cookii 1 1 1 1 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1 0 0 0 0 0
Paenibacillus lautus 1 0 1 1 1 1
Virgibacillus halophilus 1 0 0 0 0 0
Clostridium beijerinckii 0 1 1 0 0 0
Acetobacter pasteurianus 0 0* 0* 0* 0* 1 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
Azotobacter vinelandii 0 0 0 0 0 0
Clostridium pasteurianum 0 0 1 1 1 1
Lactobacillus buchneri 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus delbrueckii 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus casei 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus vini 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas putida 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas sp. 0 0 0 0 0 0
Streptomyces griseus 0 0 1 0 0 0
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다. 다음 4 개의 열은 위에서 설명한 분석을 사용하여 제형의 생존성을 테스트 한 시점을 나타낸다.
실시예 7
바이오차 (biochar) 와 함께 제형화된 미생물 컨소시엄의 생존
이 실험에서 표 4에 표시된 22 개의 박테리아를 개별적으로 성장시킨 후 혼합하여 위에서 설명한 대로 컨소시엄을 생성했다. 1g의 바이오차 (Cool Terra®; Cool Planet Energy system, CO, USA)를 ~ 0.5 mL의 컨소시엄으로 함침시키고, 건조하고, 7 일 동안 저장한 후 이전에 설명한 생존성 분석을 사용하여 어떤 박테리아가 생존했는지 분석했다. 결과는 표 20에 요약되어 있다. 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 66.7 % (7/12 균주)는 바이오차에 함침 후 7 일 동안 생존할 수 있었다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주의 경우, 30 % (3/10 균주)가 동일한 시간 프레임 (frame) 내에 생존 가능한 상태를 유지했다.
7 일 후 바이오차 (biochar)에서 컨소시엄으로부터의 박테리아의 생존
박테리아 속/종 DPA 유전자 DPA 생산 7일
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 확인된 DPA 유전자 및 / 또는 DPA 생산을 가진 박테리아
Bacillus flexus 1 1 1
Bacillus licheniformis 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1
Bacillus sp. 1 1 1
Bacillus subtilis 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 0
Paenibacillus cookii 1 1 0
Oceanobacillus oncorhynchi 1 0 0
Paenibacillus lautus 1 0 1
Virgibacillus halophilus 1 0 0
Clostridium beijerinckii 0 1 1
Acetobacter pasteurianus 0 0 0 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
Azotobacter vinelandii 0 0 0
Clostridium pasteurianum 0 0 1
Lactobacillus buchneri 0 0 1
Lactobacillus delbrueckii 0 0 0
Lactobacillus paracasei/casei 0 0 1
Lactobacillus vini 0 0 0
Pseudomonas putida 0 0 0
Pseudomonas sp. 0 0 0
Streptomyces griseus 0 0 0
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다.
실시예 8
건조 비료 과립과 함께 제형화된 미생물 컨소시엄의 생존
이 실험에서는 표 4에 표시된 22 개의 박테리아를 개별적으로 성장시킨 후 혼합하여 컨소시엄을 생성하고 위에서 설명한대로 35μL / g의 비율로 MOP (0-0-60) 건조 비료에 함침했다. 그런 다음 비료를 실온에서 저장하고 주기적으로 샘플링하여 이전에 설명한대로 미생물 생존 성을 평가했다. 결과는 표 21에 요약되어 있다. 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 66.7 % (8/12 균주)는 최대 7 일까지 생존할 수 있었다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주의 경우, 30 % (3/10 균주)가 동일한 시간 프레임 내에 생존 가능한 상태를 유지했다.
7 일 후 MOP에서 컨소시엄으로부터의 박테리아의 생존
박테리아 속/종 DPA 유전자 DPA 생산 7 일째 생존
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 확인된 DPA 유전자 및 / 또는 DPA 생산을 가진 박테리아
Bacillus flexus 1 1 1
Bacillus licheniformis 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1
Bacillus sp. 1 1 0
Bacillus subtilis 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 0
Paenibacillus cookii 1 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1 0 1
Paenibacillus lautus 1 0 1
Virgibacillus halophilus 1 0 0
Clostridium beijerinckii 0 1 0
Acetobacter pasteurianus 0 0 1 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
Azotobacter vinelandii 0 0 0
Clostridium pasteurianum 0 0 1
Lactobacillus buchneri 0 0 0
Lactobacillus delbrueckii 0 0 0
Lactobacillus paracasei/casei 0 0 0
Lactobacillus vini 0 0 0
Pseudomonas putida 0 0 0
Pseudomonas sp. 0 0 1
Streptomyces griseus 0 0 1
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다.
표 4에 표시된 22 개의 박테리아는 또한 개별적으로 성장한 후 혼합하여 컨소시엄을 생성하고 위에서 설명한대로 35 μL / g의 비율로 MAP (11-52-0) 에 함침되었다. 그런 다음 비료를 실온에서 저장하고 주기적으로 샘플링하여 이전에 설명한대로 미생물 생존성을 평가했다. 결과는 표 22에 요약되어 있다. 이 경우, 확인된 DPA 유전자 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 58.3 % (7/12 균주)는 최대 7 일까지 생존할 수 있었다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주의 경우, 40 % (4/10 균주)가 동일한 시간 프레임 내에 생존 가능한 상태를 유지했다.
7 일 후 MAP에서 컨소시엄의 박테리아 생존
박테리아 속/종 DPA 유전자 DPA 생산 7 일째 생존
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 확인된 DPA 유전자 및 / 또는 DPA 생산을 가진 박테리아
Bacillus flexus 1 1 0
Bacillus licheniformis 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1
Bacillus sp. 1 1 0
Bacillus subtilis 1 1 0
Paenibacillus chibensis 1 1 0
Paenibacillus cookii 1 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1 0 1
Paenibacillus lautus 1 0 1
Virgibacillus halophilus 1 0 0
Clostridium beijerinckii 0 1 1
Acetobacter pasteurianus 0 0 1 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
Azotobacter vinelandii 0 0 0
Clostridium pasteurianum 0 0 1
Lactobacillus buchneri 0 0 0
Lactobacillus delbrueckii 0 0 0
Lactobacillus paracasei/casei 0 0 0
Lactobacillus vini 0 0 0
Pseudomonas putida 0 0 1
Pseudomonas sp. 0 0 1
Streptomyces griseus 0 0 0
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다.
실시예 9
DPA 발현 / 생산과 비교한 컨소시엄에서 미생물의 생존
이 실험에서 표 4에 표시된 22 개의 박테리아를 개별적으로 성장시킨 후 혼합하여 위에서 설명한대로 컨소시엄을 생성했다. 그런 다음 컨소시엄을 실온에서 저장하고 이전에 설명한대로 미생물 생존성을 평가하기 위해 주기적으로 샘플링했다. 결과는 표 23에 요약되어 있다.
2 주차에 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생산하는 박테리아의 83 % (10/12 균주)가 생존할 수 있었다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주의 경우, 60 % (6/10 균주)가 동일한 시간 프레임 내에 생존 가능한 상태를 유지했다. 7.5 주 후, 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생성하는 박테리아의 58 % (7/12 균주)가 생존할 수 있었다. 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주의 경우, 50 % (5/10 균주)가 해당 기간 동안 생존할 수 있었다.
사용된 배지에서 컨소시엄으로부터의 박테리아의 생존
박테리아 속/종 DPA 유전자 DPA 생산 2 주 7.5 주
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 1 확인된 DPA 유전자 및 / 또는 DPA 생산을 가진 박테리아
Bacillus flexus 1 1 1 0
Bacillus licheniformis 1 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1 1
Bacillus sp. 1 1 1 1
Bacillus subtilis 1 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 1 1
Paenibacillus cookii 1 1 1 0
Oceanobacillus oncorhynchi 1 0 0 0
Paenibacillus lautus 1 0 1 0
Virgibacillus halophilus 1 0 0 0
Clostridium beijerinckii 0 1 1 1
Acetobacter pasteurianus 0 0 1 1 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
Azotobacter vinelandii 0 0 0 0
Clostridium pasteurianum 0 0 1 1
Lactobacillus buchneri 0 0 1 1
Lactobacillus delbrueckii 0 0 1 0
Lactobacillus paracasei/casei 0 0 1 1
Lactobacillus vini 0 0 1 1
Pseudomonas putida 0 0 0 0
Pseudomonas sp. 0 0 0 0
Streptomyces griseus 0 0 0 0
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만. DPA 유전자 열은 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유한 균주를 나타낸다. DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다.
실시예 10
미생물 생존 요약
테스트된 모든 경우에서, 액체 또는 건식 제제로서, 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생산하는 포자 형성 박테리아는 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 균주를 농업-담체와 제형화된 형태로 시간 경과에 따라 생존성 측면에서 능가한다 (표 24 및 도. 4). 따라서 농업-담체 (습식 및 / 또는 건식)와 제형화를 위한 선택된 식물 / 토양 유익한 특성을 가진 미생물 컨소시엄의 합리적 설계에서 또는 종자 처리로서, 포자 형성 및 DPA 생성 미생물의 선택은 원하는 미생물 기능 (desired microbial functionalities) (예를 들어, 질소 대사(nitrogen metabolism), 황 대사 (sulfur metabolism), 염분 내성 (salt tolerance), 미네랄 염 용해 (mineral salt solubilization), 셀룰로스 분해 (cellulose degradation), 키틴 분해 (chitin degradation), 식물 호르몬 생성 (phytohormone production), 철 대사 (iron metabolism), 유기물의 탈 인산화 (dephosphorylation of organic matter) 이에 국한되지 않음) 이 생존 미생물에 유지되도록 하는 데 도움이 될 수 있다. 경우에 따라 이는 합리적으로 설계된 컨소시엄에 존재하는 미생물 기능에 충분한 중복성을 보장하여 목표 작물, 토양 및 적용 요구 (application practice needs) 와 지리적 (geographical) 및 규제적 (regulatory) 문제 (challenges) 를 준수할 수 있다.
농약 / 담체와의 제형에서 미생물 균주의 생존
담체 (저장-수명 테스트 완료) 확인된 DPA 유전자를 갖거나 및 / 또는 DPA를 생산하는 박테리아 확인된 DPA 유전자가 없고 검출 가능한 DPA 생산이 없는 박테리아
MDC-200 (1 개월) 92% 0%
DUSTROL® 3275 (1 개월) 100% 0%
DUSTROL® 3133 (1 개월) 100% 0%
DUSTROL® 3139 (1 개월) 92% 0%
DUSTROL® 3001 (1 개월) 33% 0%
DUSTROL® 3010 (1 개월) 75% 20%
UAN (1 개월) 67% 0%
펄라이트 (2 주) 75-100% 60-80%
아조마이트® (2 주) 83.3% 60%
바이오차 (1 주) 66.7% 30%
MOP (1 주) 66.7% 30%
MAP (1 주) 58.3% 40%
노후된 액체/사용된 배지 (7.5 주) 58% 50%
실시예 11
식물 생장 촉진 활성 평가
The Seed Kingdom (Lubbock, TX)에서 구입한 오이 종자는 액체 비료 (물에 25ppm NPK)의 희석 혼합물이 함침된 롤 발아 지 (rolled germination paper) (Anchor Paper, Saint Paul, MN) 에서 22-24 ° C에서 4 일 동안 사전-발아되었다. 포팅 배지 (potting medium) (Sunshine Mix)를 P, 30.97 ppm; K, 39.1 ppm; Ca, 40.0 ppm; Mg, 14.59 ppm; S, 20.143 ppm; Fe, 1.010 ppm; Cu, 0.019 ppm; Co, 0.012 ppm; B, 2.44 ppm; Mn, 0.494 ppm; Mo, 0.001 ppm 및 Zn, 0.056 ppm 을 함유하도록 변형된 Hoagland 용액 (Hoagland, Calif. Agric. Exp. Stn. Bull. 347:36-39, 1938) 으로 전-처리했다. 포팅 배지 (potting medium) 파운드당 (per pound) 1L의 비율이 사용되었다. 각 포트 (pots) 에, 비슷한 길이의 사전-발아된 (pre-germinated) 오이 묘목 (cucumber seedlings) 을 이식하기 전에 1mL의 10 % w / v 요소 용액을 첨가했다. 각 처리 (대조군 포함)에 대해 17-18 식물을 정의된 성장 조건에서 평지에서 무작위로 분류하여 온도 (16-24 ° C) 및 12 시간 광주기를 제어했다. 컨트롤 포트 (control pots) 에는 2g의 처리되지 않은 펄라이트가 들어 있다. 실험용 포트는 표 4에 표시된 22 개의 박테리아 2mL가 함침된 펄라이트로 처리되었다. 함침된 펄라이트는 이 분석에 사용하기 전에 2 주 동안 건조한 상태로 보관되었다. 평지에 변형된 Hoagland 용액으로 일주일에 3 번 물을 주었다. 28 ~ 32 일 후, 새싹을 건조하고 각 식물에 대한 무게를 기록했다. 데이터는 일원 분산 분석 (Analysis Of Variance) 및 사후 Tukey 테스트로 분석하여 실험 내 샘플을 비교했다. 미생물이 함침된 펄라이트로 처리된 식물에서 새싹 건조 중량이 증가했지만 통계적 유의성에 도달하지 않았다 (도 5). 실시예 4 (표 17)에 기재된 바와 같이, 확인된 DPA 유전자 및 / 또는 검출 가능한 DPA 생산을 갖는 미생물은 주로 출발 컨소시엄의 서브 세트 (subset) 인 함침된 펄라이트에서 생존하였다.
실시예 12
DPA를 생산하는 컨소시엄
추가 DPA 생산 컨소시엄을 설계하는 데 사용하기에 적합한 균주를 식별하기 위해 사내 미생물 컬렉션 (in-house microbial collection) 을 선별했다. 포자화하는 것으로 알려진 속 (genera) 유래의 균주는 적절한 배지에서 박테리아 글리세롤 스톡 (bacterial glycerol stocks) 에서 부활하여 최대 3 일 동안 성장할 수 있었다. 그런 다음 단일 콜로니를 선택하고 순도를 확인하기 위해 3 회 이상 계대했다. 균주는 실시예 1에 기술된 바와 같이 테르븀-DPA 형광 분석을 사용하여 DPA 생산에 대해 테스트되었다. 전체-게놈 시퀀싱을 위해 DPA를 생성하는 것으로 표시된 균주를 선택했다. 생물학적으로 순수한 분리물의 전체-게놈 시퀀싱은 서열 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대한 제조업체의 권장 방법에 따라 Illumina NovaSeq 6000 시퀀싱 시스템 (Illumina, Inc., San Diego, CA USA)을 사용하여 수행되었다. 미생물 분리물로부터 평균 87bp 길이의 평균 5,133,928 개의 판독이 생성되었다. 새로운 게놈 조립은 SPAdes 3.12.0을 사용하여 수행되었다 (Nurk et al., J. Comput. Biol. 20:714-737, 2013). 조립된 콘티그 (contig) 는 PROKKA로 주석을 달았다 (Seemann, Bioinformatics 30(14):2068-2069, 2014). 주석이 달린 게놈은 디피콜리네이트 신타제 서브 유닛 A (DpaA) 및 디피콜리네이트 신타제 서브 유닛 B (DpaB) 및 철-황 플라보 단백질 (Isf, 표 25) 의 존재에 대해 평가되었다. 대부분의 경우 DPA를 생산한 균주는 DpaA 및 DpaB 유전자를 모두 보유하고 Isf 유전자가 부족했다. DPA를 생산하고 DpaA 및 DpaB 가 결여된 모든 균주는 하나 이상의 Isf 유전자 사본을 보유했다. 세 가지 경우에 균주는 세 가지 (DpaA, DpaB, 및 Isf) 유전자를 모두 소유했다. 따라서, 테르븀-DPA 형광 분석을 통한 DPA 생산의 검출은 DpaA, DpaB 및 / 또는 Isf 유전자의 존재와 완벽하게 연관되었다.
DpaA, DpaB 및 Isf에 대한 전체-게놈 분류학 분류, DPA-생산 및 유전자 사본 번호
전체 게놈 ID DPA 생산 유전자 사본 번호
DpaA DpaB Isf
Bacillus megaterium 1 1 1 0
Bacillus koreensis 1 1 1 0
Bacillus clausii 1 1 1 0
Clostridium beijerinckii 1 0 0 6
Bacillus subtilis 1 1 1 0
Clostridium sp. (carboxidivorans) 1 0 0 1
Paenibacillus cookii 1 1 1 0
Clostridium sp. (scatologenes) 1 0 0 1
Bacillus licheniformis 1 1 1 0
Paenibacillus lautus 1 1 1 0
Brevibacillus sp. (choshinensis) 1 1 1 0
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1 0
Bacillus sp. (pocheonensis) 1 1 1 0
Lysinibacillus sp. (fusiformis) 1 1 1 0
Lysinibacillus sp. (chungkukjangi) 1 1 1 0
Bacillus pumilus 1 1 1 0
Rummeliibacillus sp. (pycnus) 1 1 1 0
Bacillus cereus 1 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 1 0
Bacillus flexus 1 1 1 0
Brevibacillus parabrevis 1 1 1 0
Bacillus aryabhattai 1 1 1 0
Paenibacillus sp. (amylolyticus) 1 1 1 0
Clostridium beijerinckii 1 0 0 11
Bacillus subtilis 1 1 1 0
Paenibacillus sp. (chitinolyticus) 1 1 1 0
Bacillus sp. (wudalianchiensis) 1 1 1 0
Paenibacillus larvae 1 1 1 0
Bacillus licheniformis 1 3 3 0
Paenibacillus sp. (agaridevorans) 1 1 1 0
Clostridium sp. (tyrobutyricum) 1 0 0 1
Paenibacillus sp. (alvei) 1 1 1 0
Bacillus sp. (selenatarsenatis) 1 1 1 0
Paenibacillus sp. (P1XP2) 1 1 1 0
Fontibacillus sp. (panacisegetis) 1 1 1 0
Bacillus firmus 1 1 1 0
Bacillus subtilis 1 1 1 0
Lysinibacillus sp. (chungkukjangi) 1 1 1 0
Paenibacillus sp. (ehimensis) 1 1 1 0
Paenibacillus lactis 1 1 1 0
Bacillus farraginis 1 1 1 0
Paenibacillus sp. (P1XP2) 1 1 1 0
Brevibacillus massiliensis 1 1 1 0
Paenibacillus azoreducens 1 1 1 0
Bacillus litoralis 1 1 1 0
Bacillus endophyticus 1 1 1 0
Paenibacillus xylanexedens 1 1 1 0
Bacillus frigoritolerans 1 1 1 0
Bacillus velezensis 1 1 1 0
Clostridium aerotolerans 1 1 1 1
Sphingomonas koreensis 1 0 0 2
Clostridium beijerinckii 1 0 0 10
Clostridium aerotolerans 1 1 1 2
Brevibacillus sp. (brevis) 1 2 2 0
Bacillus sp. (cereus) 1 1 1 0
Bacillus badius 1 1 1 0
Bacillus aryabhattai 1 1 1 0
Bacillus anthracis 1 1 1 0
Bacillus flexus 1 1 1 0
Bacillus drentensis 1 1 1 0
Bacillus sp. (cuccumis) 1 1 1 0
Paenibacillus peoriae 1 1 1 0
Bacillus sp. (cereus) 1 1 1 0
Bacillus aryabhattai 1 1 1 0
Bacillus sp. (solani) 1 1 1 0
Terribacillus sp. (aidingensis) 1 1 1 0
Bacillus sp. (circulans) 1 1 1 0
Brevibacterium frigoritolerans 1 1 1 0
DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다, 1 = 감지 됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만.
DPA 생산에 양성으로 테스트된 균주의 경우, WO 2018/045004 및 실시예 1에 설명된 바와 같이 실험실 분석을 사용하여 잠재적 미생물 대사 활성 (예를 들어, 질소 대사, 황 대사, 염분 내성, 미네랄 염 용해, 셀룰로스 분해, 키틴 분해, 식물 호르몬 생성, 철 대사, 유기물의 탈 인산화 이에 국한되지 않음) 을 평가했다. 가장 많은 대사 활성을 갖는 균주는 그들의 대사 활성을 위해 선택된 DPA 생산이 결여된 5 개의 균주와 함께 미생물 컨소시엄에서 공동-발효를 위해 선택되었다 (실시예 1 참조). 본 명세서에서 건식 제형 컨소시엄 (DFC) 으로도 지칭되는 컨소시엄 (표 26 참조) 에서 공동-발효가 가능한 것으로 입증된 균주를 벤토나이트, 펄라이트 및 / 또는 우레아와 같은 담체와의 제형화를 위해 선택하였다.
이 예에 포함된 모든 컨소시엄은 다음과 같이 발효되었다. 호기성 및 혐기성 박테리아 균주는 모두 2-10 % 당 공급원 (sugar source) 을 포함하는 배지에서 배양되었다. 아미노산, 질소 및 펩티드는 다음 중 하나 이상의 형태로 제공되었다: 식품 등급 유청 분말 (0.1-0.5 % w / v), 효모 추출물 (0.1-0.5 % w / v), 효소적으로 생산된 비-GMO 대두 추출물 (0.1-0.5 % w / v, Ferti-Nitro Plus Plant N, Ferti -Organic, Brownsville, TX USA), 스피루리나 (spirulina) (0.1-0.5 % w / v) 및 / 또는 펩톤 (0.1-0.5 % w / v). 필요한 경우, 다시마 추출물 (kelp extract) (0.1-0.5 % w / v), 정제된 B-비타민 (Sigma) 및 / 또는 Wolfe의 미량 금속 용액 (Wolfe's trace metal solution) 을 통해 추가 비타민과 미량 영양소를 제공했다. 필요한 경우 추가 염을 인산염 완충 식염수 용액 및 / 또는 염화나트륨 첨가 (0-4 % w / v)로 첨가했다. AMC1 (상기 설명됨) 로부터의 균주를 1.5 리터 작업 부피로 2L DASGIP 생물 반응기 (Eppendorf North America Hauppauge, NY) 에 접종했다. 발효 중 pH는 5.0에서 7.0 사이로 유지되었다. 발효 중 통기 조건은 교반, 가스 조성 (공기 및 / 또는 질소 가스) 및 가스 유속을 변경하여 제어하여 목표 산소 전달 속도 (kLa를 사용하여 추정) 를 얻었으며 kLa (시간당) 가 0에서 110까지 범위로 설정되었다. 온도는 28 °C에서 35 °C 사이로 조절되었다.
담체와의 제형화 또는 종자 처리 용으로 설계된 공동-배양 컨소시엄 ( "DFC")
분류 DPA-생산
Bacillus amyloliquefaciens 1
Bacillus firmus 1
Bacillus flexus 1
Bacillus licheniformis 1
Bacillus megaterium 1
Bacillus pumilus 1
Bacillus koreensis 1
Bacillus drentensis 1
Bacillus subtilis 1
Clostridium bifermentans 1
Clostridium beijerinckii 1
Clostridium pasteurianum 0
Lactobacillus paracasei 0
Fontibacillus sp. (panacisegetis) 1
Oceanobacillus oncorhynchi 0
Paenibacillus lautus 1
Paenibacillus azoreducens 1
Paenibacillus chibensis 1
Paenibacillus cookii 1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus) 1
Paenibacillus sp. (P1XP2) 1
Pseudomonas sp. 0
Streptomyces griseus 0
DPA 생산 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다, 1 = 검출됨, 0 = 검출되지 않음 또는 검출 한계 미만.
제형을 만들기 위해 DFC 발효물 (fermentate) 을 벤토나이트 또는 펄라이트에 적용한 후 약 24 시간 동안 건조시켰다. 어떤 경우에는 적용 전에 원심 분리를 통해 발효물을 농축했다. 그런 다음 제형의 생존력을 테스트했다. 또한 식물의 유익한 특성을 확인하기 위해 식물 생장 실 (plant growth room) 시험에서 특정 제형화가 테스트되었다.
담체와 함께 DFC 및 AMC1의 생존력 : DFC 액체, AMC1 액체, DFC-함침 펄라이트, AMC1-함침 펄라이트, DFC 함침 벤토나이트 및 AMC1- 함침 벤토나이트를 포함하는 현장 시험을 준비하기 위해 DFC 및 AMC1을 각각 공동 발효하고 펄라이트 또는 벤토나이트 담체를 각각 2 mL / g 또는 1 mL / g로 함침시켰다. 함침된 펄라이트와 벤토나이트는 1 ~ 3 주 동안 건조 상태로 보관되었으며, 이 시점에서 적용 시점에 생존 가능한 균주 수를 결정하기 위해 생존력 분석을 수행했다. 또한, 액체는 1 주일 동안 저장되었고, 이 시점에서 생존력 분석을 수행하여 적용 시점에 생존 가능한 균주 수를 결정했다. 액체에서, 23 개의 DFC 균주 중 16 개가 1 주 후에 생존할 수 있는 반면, 22 개의 AMC1 균주 중 14 개가 생존 할 수 있었다 (표 27).
노화 후 액체에서 DFC 및 AMC1 컨소시엄의 생존력
DFC 액체 AMC1 액체
T0 - 적용 시
Bacillus amyloliquefaciens 1 1
Bacillus flexus 0 1
Bacillus licheniformis 1 1
Bacillus megaterium 1 1
Bacillus subtilis 0 0
Paenibacillus chibensis 1 1
Paenibacillus cookii 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 0 1
Paenibacillus lautus 1 1
Clostridium beijerinckii 1 1
Clostridium pasteurianum 1 1
Lactobacillus paracasei 1 1
Pseudomonas sp. 0 0
Streptomyces griseus 1 0
Bacillus koreensis 0
Bacillus pumilus 1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus) 1
Paenibacillus sp. (P1XP2) 1
Fontibacillus sp. (panacisegetis) 1
Bacillus firmus 0
Clostridium bifermentans 1
Paenibacillus azoreducens 1
Bacillus drentensis 0
Bacillus sp. 0
Virgibacillus halophilus 0
Acetobacter pasteurianus 1
Azotobacter vinelandii 0
Lactobacillus buchneri 1
Lactobacillus delbrueckii 0
Lactobacillus vini 1
Pseudomonas putida 0
총 생존 가능 수: 16 14
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만
함침된 펄라이트에서 23 개 DFC 균주 중 17 개 대 ( versus) AMC1 균주 22 개 중 14 개가 최대 3 주 후에 생존할 수 있었다 (표 28).
노화 후 펄라이트에 함침된 DFC 및 AMC1 컨소시엄의 생존력
DFC 펄라이트 AMC1 펄라이트
T0 - 적용 시
Bacillus amyloliquefaciens 1 1
Bacillus flexus 1 1
Bacillus licheniformis 1 1
Bacillus megaterium 1 1
Bacillus subtilis 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1
Paenibacillus cookii 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 0 0
Paenibacillus lautus 1 1
Clostridium beijerinckii 1 1
Clostridium pasteurianum 1 1
Lactobacillus paracasei 0 1
Pseudomonas sp. 0 0
Streptomyces griseus 0 0
Bacillus koreensis 1
Bacillus pumilus 1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus) 1
Paenibacillus sp. (P1XP2) 1
Fontibacillus sp. (panacisegetis) 1
Bacillus firmus 1
Clostridium bifermentans 0
Paenibacillus azoreducens 1
Bacillus drentensis 0
Bacillus sp. 1
Virgibacillus halophilus 0
Acetobacter pasteurianus 1
Azotobacter vinelandii 0
Lactobacillus buchneri 1
Lactobacillus delbrueckii 0
Lactobacillus vini 0
Pseudomonas putida 0
총 생존 가능 수: 17 14
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만
함침된 벤토나이트에서 23 개 DFC 균주 중 17 개 대 AMC1 균주 22 개 중 14 개가 최대 3 주 후에 생존할 수 있었다 (표 29). 이것은 DPA 생산 균주가 액체에 저장될 때 뿐만 아니라 펄라이트 또는 벤토나이트와 같은 담체에서 건조될 때 향상된 생존력을 유지하는 방법을 보여준다.
노화 후 벤토나이트에 함침된 DFC 및 AMC1 컨소시엄의 생존력
DFC 벤토나이트 AMC1 벤토나이트
T0 - 적용 시
Bacillus amyloliquefaciens 1 1
Bacillus flexus 1 1
Bacillus licheniformis 1 1
Bacillus megaterium 1 1
Bacillus subtilis 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1
Paenibacillus cookii 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 0 0
Paenibacillus lautus 1 1
Clostridium beijerinckii 1 1
Clostridium pasteurianum 1 1
Lactobacillus paracasei 1 1
Pseudomonas sp. 0 0
Streptomyces griseus 0 0
Bacillus koreensis 0
Bacillus pumilus 1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus) 1
Paenibacillus sp. (P1XP2) 1
Fontibacillus sp. (panacisegetis) 1
Bacillus firmus 1
Clostridium bifermentans 0
Paenibacillus azoreducens 1
Bacillus drentensis 0
Bacillus sp. 1
Virgibacillus halophilus 0
Acetobacter pasteurianus 0
Azotobacter vinelandii 0
Lactobacillus buchneri 1
Lactobacillus delbrueckii 0
Lactobacillus vini 1
Pseudomonas putida 0
총 생존 가능 수: 17 14
1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만
3 개월 숙성 후, DFC-함침 펄라이트는 15 개 균주가 생존 가능한 반면, AMC1 함침-펄라이트는 11 개 균주만 생존 가능하고 그 중 하나만 DPA를 생산하지 않았다 (표 30 및 31).
시간 경과에 따른 펄라이트 및 벤토나이트에 함침된 AMC1의 생존력
DPA 펄라이트 - 3 개월 벤토나이트 - 3 개월
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1
Bacillus flexus 1 1 1
Bacillus licheniformis 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1
Bacillus sp. 1 0 0
Bacillus subtilis 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 1
Paenibacillus cookii 1 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1 1 1
Paenibacillus lautus 1 1 1
Virgibacillus halophilus 0 0 0
Clostridium beijerinckii 1 1 1
Acetobacter pasteurianus 0 0 0
Azotobacter vinelandii 0 0 0
Clostridium pasteurianum 0 1 1
Lactobacillus buchneri 0 0 1
Lactobacillus delbrueckii 0 0 0
Lactobacillus paracasei 0 0 1
Lactobacillus vini 0 0 0
Pseudomonas putida 0 0 0
Pseudomonas sp. 0 0 0
Streptomyces griseus 0 0 0
총 생존 가능 수: 11 13
DPA 열은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트된 균주를 나타낸다. 1 = 감지 됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만.
동일한 3 개월의 숙성 후, DFC-함침 벤토나이트는 19 개의 균주가 생존 가능한 반면 AMC1-함침 펄라이트는 13 개의 균주에서 생존 가능한 것으로 나타났고 그 중 3 개만이 DPA를 생산하지 않았다 (표 30 및 31).
시간 경과에 따른 펄라이트 및 벤토나이트에 함침된 DFC의 생존력
DPA 펄라이트 - 3 개월 벤토나이트 - 3 개월
Bacillus amyloliquefaciens 1 1 1
Bacillus flexus 1 0 1
Bacillus licheniformis 1 1 1
Bacillus megaterium 1 1 1
Bacillus subtilis 1 1 1
Paenibacillus chibensis 1 1 1
Paenibacillus cookii 1 1 1
Oceanobacillus oncorhynchi 1 1 1
Paenibacillus lautus 1 1 1
Clostridium beijerinckii 1 1 1
Clostridium pasteurianum 0 1 1
Lactobacillus paracasei 0 0 1
Pseudomonas sp. 0 0 0
Streptomyces griseus 0 0 0
Bacillus koreensis 1 0 1
Bacillus pumilus 1 1 1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus) 1 1 1
Paenibacillus sp. (P1XP2) 1 1 1
Fontibacillus sp. (panacisegetis) 1 1 1
Bacillus firmus 1 0 1
Clostridium bifermentans 1 0 0
Paenibacillus azoreducens 1 1 1
Bacillus drentensis 1 0 0
총 생존 가능 수: 15 19
DPA 컬럼은 Terbium-DPA 형광 분석을 통해 DPA 생산에 대해 양성으로 테스트 된 균주를 나타냅니다. 1 = 감지됨 및 0 = 감지되지 않음 또는 감지 한계 미만.
DFC 식물 유익한 활동의 평가: The Seed Kingdom (Lubbock, TX) 에서 구입한 오이 종자는 희석된 액체 비료 혼합물 (물 속 NPK 25ppm) 이 함침된 롤 발아 지 (Anchor Paper, Saint Paul, MN)에서 22 °C에서 4 일 동안 사전 발아되었다. 종자 준비 시, 포팅 배지 (Sunshine Mix)는 67.60 kg 삼인산칼슘 (Tricalcium phosphate) (TCP) ha-1과 변형된 Hoagland 용액 (Hoagland, Calif. Agric. Exp. Stn. Bull. 347:36-39, 1938) 의 전-처리로 준비되었다. 이 Hoagland 용액, NK +는 N, 56.03 ppm; P, 0 ppm; K, 39.1 ppm; Ca, 40.0 ppm; Mg, 14.59 ppm; S, 20.143 ppm; Fe, 1.010 ppm; Cu, 0.019 ppm; Co, 0.012 ppm; B, 2.44 ppm; Mn, 0.494 ppm; Mo, 0.001 ppm 및 Zn, 0.056 ppm 을 함유하도록 변형되었으며, 이는 포팅 배지 파운드당 1L의 비율로 적용되었다. 대조군 처리는 또한 포팅 배지 파운드당 미처리 펄라이트 10g 또는 미처리 벤토나이트 20g을 함유했다. 대조적으로, 실험용 포트는 대조군 포트와 동일한 양의 펄라이트 또는 벤토나이트를 가졌지만 이러한 캐리어에는 각각 DFC 2 mL / g 또는 DFC 1 mL / g이 함침되었다. 함침된 펄라이트 및 벤토나이트는 이 분석에 사용하기 전에 2 주 동안 건조 상태로 보관되었으며, 이때 적용 시점에 생존할 수 있는 DFC의 균주 수를 결정하기 위해 생존력 분석을 수행했다. 대부분의 균주 (23 개 균주 중 15-18 개)가 제형화 및 노화 과정에서 살아 남았다.
오이 종자의 사전 발아 후 비슷한 길이의 묘목을 선택하고 각 화분에 하나를 이식했다. 각 처리 (대조군 포함)에 대해 18 개의 식물을 정의된 성장 조건에서 평지에서 무작위로 분류하여 온도 (16-24 ° C) 및 12 시간 광주기를 제어했다. N, 0 ppm; P, 14.49 ppm; K, 19.55 ppm; Ca, 20.0 ppm; Mg, 14.59 ppm; S, 20.143 ppm; Fe, 1.010 ppm; Cu, 0.019 ppm; Co, 0.012 ppm; B, 2.44 ppm; Mn, 0.494 ppm; Mo, 0.001 ppm 및 Zn, 0.056 ppm 을 함유하는 변형된 Hoagland 용액, PK +로 이식 후 3 일 동안 평지에 처음으로 물을 주었다. 그런 다음 평지에 NK + Hoagland 용액으로 주 3 회 물을 주었다. 32 일 후, 새싹을 수확하고 각 식물에 대해 건조 중량을 기록했다. 데이터는 일원 분산 분석 (Analysis Of Variance) 및 사후 Tukey 테스트로 분석하여 실험 내 샘플을 비교했습니다. 이 시험은 두 차례에 걸쳐 두 번 수행되었다.
초기 시험의 결과는 대조군과 비교했을 때 DFC 함침 펄라이트 및 DFC 함침 벤토나이트 둘 다에 대해 싹 무게의 유의한 증가를 보여 주었다 (도 6). 두 번째 실험의 결과는 또한 DFC 액체 처리와 DFC 함침 펄라이트 모두에 대해 싹 무게가 크게 증가한 것으로 나타났으며, DFC 함침 펄라이트가 DFC 액체 처리보다 더 나은 성능을 보였지만 크게 다르지 않았다 (도 7). 따라서, 담체와의 제형은 신선한 액체 제품과 비교할 때 효능에 영향을 미치지 않았다.
실시예 13
미생물 종자 처리
미생물 종자 처리는 배치 처리기 (batch treater) SGS (SGS North America, Brookings, SD USA)를 사용하여 옥수수 및 대두 종자에 적용되었다. 각 처리에 대해 1kg의 종자가 처리되었다. 별도의 종자 처리에서, 미생물은 처리되지 않은 종자에 직접 적용되거나, 살충제 / 살균제 패키지로 이전에 처리된 종자에 오버코트로 적용되거나, 종자 적용 전에 살충제 / 살균제 슬러리와 혼합되었다. 옥수수의 경우 살충제 / 살균제 처리는 메탈락실 (metalaxyl), 트라이플록시스트로빈 (trifloxystrobin), 이프코나졸 (ipconazole) 및 클로티아니딘 (clothianidin) 을 포함하는 엑셀러론 (Acceleron) 혼합물 또는 크루저 (Cruiser) (티아메톡삼 (thiamethoxam)), 플루디옥소닐 (fludioxonil), 메페녹삼 (mefenoxam), 아족시스트로빈 (azoxystrobin) 및 티아벤다졸 (thiabendazole) 을 포함하는 크루저맥스 (CruiserMaxx) 혼합물로 이루어졌다. 대두의 경우 살충제 / 살균제 처리는 메탈락실 (metalaxyl), 피라클로스트로빈 (pyraclostrobin), 이미다클로프리드 (imidacloprid) 및 플룩사피록사드 (fluxapyroxad) 가 포함된 엑셀러론 (Acceleron) 혼합물 또는 크루저 (Cruiser) (티아메톡삼 (thiamethoxam)), 메페녹삼 (mefenoxam), 플루디옥소닐 (fludioxonil) 및 sedexane이 포함된 크루저맥스 (CruiserMaxx) 혼합물로 구성되었다.
종자 처리 후, 생존력은 48 시간 이내에 및 그 후 3 주 이내에 (실시예 1에서와 같이) 시험되었다. 압도적인 대다수의 균주 (23 개 균주 중 19-20 개)가 초기 제형 과정에서 살아남았다. 3 주 후, 생존성의 약간의 감소만이 관찰되었다 (23 개 균주 중 17-18 개가 생존 가능함; 도 8).
이것은 DPA 생산 균주를 선택하는 것이 벤토나이트 및 펄라이트와 같은 건조 비료에 효과적일뿐만 아니라 종자 처리로도 효과적이라는 것을 보여준다. 또한, 발아 가능성에 대한 종자 처리의 영향을 결정하기 위해 종자를 발아 테스트했다. Cold Vigor 테스트를 수행하여 100 개의 씨앗을 4 번 복제하여 발아를 테스트했다. 100 개의 종자 복제물을 적신 크레이프 셀룰로스 종이 (crepe cellulose paper) 에 심고 밤새 10 °C에서 냉각시켰다. 그런 다음 씨앗을 70 %의 수분 보유 용량까지 젖은 1 인치의 비-멸균 모래로 덮고 빛없이 7 일 동안 10 °C로 되돌렸다. 그런 다음 씨앗을 4 일 동안 25 °C로 옮겼다. 모래를 통해 나온 묘목을 평가했다. 결과는 AOSA 규칙에 따라 정상으로 분류된 묘목 수를 나타내는 백분율로 보고되었다. 82 % 이상의 점수는 Iowa State Seed Lab 및 SGS에 따르면 옥수수 종자 로트 (corn seed lot) 를 마케팅 (marketing) 하는 데 허용되는 최소 점수로 간주된다. 모든 처리는 발아율이 83.8 % 이상이었다 (표 32). 이것은 종자 처리의 형태로 잘 수행하는 것 외에도 DPA 생산 균주가 상기 종자의 발아에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 보여준다.
냉력 발아 시험을 이용한 DFC 처리 옥수수 및 대두 종자의 평균 발아율
옥수수
대두
처리안된 DFC 처리된 처리안된 DFC 처리된
살균제 처리 없음 90.30% 87.50% 87.50% 83.80%
엑셀러론 처리된 89.30% 87.90% 86.00% 84.90%
크루저맥스 처리된 88.00% 86.00% 85.00% 88.65%
본 개시의 원리가 적용될 수있는 많은 가능한 실시예를 고려하여, 예시된 실시예는 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 인식해야 한다. 오히려, 본 발명의 범위는 다음의 청구 범위에 의해 정의된다. 따라서 우리는 이러한 청구 범위와 정신에 포함되는 모든 것을 발명이라고 주장한다.
<110> Agrinos AS Gordon, Benjamin Kendirgi, Frederic <120> MICROBIAL CONSORTIA PRODUCING DIPICOLINIC ACID AND METHODS FOR SELECTING MICROBES FOR CO-FORMULATION WITH CARRIERS <130> 9223-100757-03 <150> 62/681,469 <151> 2018-06-06 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1524 <212> DNA <213> Streptomyces pratensis <400> 1 catggagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt 60 cgaacgatga agcccttcgg ggtggattag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggcaat 120 ctgcccttca ctctgggaca agccctggaa acggggtcta ataccggata acactctgtc 180 cctcatgggg cggggttaaa agctccggcg gtgaaggatg agcccgcggc ctatcagctt 240 gttggtgggg taatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg 300 ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 360 acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta 420 aacctctttc agcagggaag aagcgcaagt gacggtacct gcagaagaag caccggctaa 480 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggtgcgagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540 taaagagctc gtaggcggct tgtcacgtcg 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<211> 1548 <212> DNA <213> Bacillus firmus <400> 3 tatggagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt 60 cgagcggaca gatgggagct tgctccctga agtcagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120 ggcaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggataattc 180 tttccctcac atgagggaaa gctgaaagat ggtttcggct atcacttaca gatgggcccg 240 cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct 300 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360 gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag 420 gttttcggat cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag taccggagta actgccggta 480 ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540 gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggttccttaa 600 gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag 660 tgcagaagag aagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 720 caccagtggc gaaggcgact ctttggtctg taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg 780 agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 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tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1140 atttagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1200 tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaaag 1260 ggctgcaaga ccgcgaggtc aagccaatcc cataaaacca ttctcagttc ggattgtagg 1320 ctgcaactcg cctacatgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1380 aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1440 agtcggtggg gtaaccttta tggagccagc cgcctaaggt gggacagatg attggggtga 1500 agtcgtaaca aggtagccgt atcggaaggt gcggctggat cacctccttt 1550 <210> 7 <211> 1549 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 7 catggagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt 60 cgagcggacc gacgggagct tgctccctta ggtcagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120 ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatgcttg 180 attgaaccgc atggttccaa tcataaaagg tggcttttag ctaccactta cagatggacc 240 cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac 300 ctgagagggt gatcggccac 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420 ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag ggaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt 480 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 540 cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtttctta 600 agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg gggaacttga 660 gtgcagaaga gaaaagcgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 720 acaccagtgg cgaaggcggc tttttggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg 780 gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta 840 gagggtttcc gccctttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg 900 gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 960 tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga caactctaga 1020 gatagagcgt tccccttcgg gggacagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1140 atttagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1200 tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaaag 1260 ggctgcaaga 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cgagcgaatc ttcaggagct tgctcctgtt ggttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120 ggcaacctgc ctgtaagact gggataacac cgggaaaccg gtgctaatac cggataatcc 180 ttttcctctc atgaggaaaa gctgaaagtc ggtttcggct gacacttaca gatgggcccg 240 cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct 300 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360 gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agcgatgaag 420 gccttcgggt cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag taccggagta actgccggta 480 ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540 gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtcctttaa 600 gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg gggacttgag 660 tgcagaagag gaaagcggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 720 caccagtggc gaaggcggct ttctggtctg taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg 780 agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 840 ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 900 ccgcaaggct 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gtcctcaagg aagataatga cggtacttga ggaggaagcc ccggctaact acgtgccagc 300 agccgcggta atacgtaggg ggctagcgtt atccggaatt actgggcgta aagggtgcgt 360 aggtggtttt ttaagtcaga agtgaaaggc tacggctcaa ccgtagtaag cttttgaaac 420 tagagaactt gagtgcagga gaggagagta gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag 480 atattaggag gaataccagt agcgaaggcg gctctctgga ctgtaactga cactgaggca 540 cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 600 tactaggtgt cgggggttac ccccctcggt gccgcagcta acgcattaag tactccgcct 660 gggaagtacg ctcgcaagag tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagtagcg 720 gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac ctaagcttga catcccactg 780 acctctccct aatcggagat ttcccttcgg ggacagtggt gacaggtggt gcatggttgt 840 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgccttt 900 agttgccagc attaagttgg gcactctaga gggactgccg aggataactc ggaggaaggt 960 ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgcttagggc tacacacgtg ctacaatggg 1020 tggtacagag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcc cttaaagcca ttctcagttc 1080 ggattgtagg 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atttaagtgg gatgtgaaat actcgggctt aacctgggtg 600 ctgcattcca aactggatat ctagagtgca ggagaggaaa gtagaattcc tagtgtagcg 660 gtgaaatgcg tagagattag gaagaatacc agtggcgaag gcgactttct ggactgtaac 720 tgacactgag gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780 cgtaaacgat gaatactagg tgtaggggtt gtcatgacct ctgtgccgcc gctaacgcat 840 taagtattcc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc agcggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttacctagac 960 ttgacatctc ctgaattacc cttaatcggg gaagcccttc ggggcaggaa gacaggtggt 1020 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080 ccttattgtt agttgctacc atttagttga gcactctagc gagactgccc gggttaaccg 1140 ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgtctagggc tacacacgtg 1200 ctacaatggc tggtacagag agatgctaaa ccgtgaggtg gagccaaact ttaaaaccag 1260 tctcagttcg gattgtaggc tgaaactcgc ctacatgaag ctggagttgc tagtaatcgc 1320 gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380 gagagttggc aatacccaaa gttcgtgagc taacgcgcaa gcggggcagc gacctaaggt 1440 agggtcagcg attggggtga agtcgtaaca aggtagccgt aggagaacct gcggctggat 1500 cacctccttt 1510 <210> 15 <211> 1505 <212> DNA <213> Clostridium pasteurianum <400> 15 aattgagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt 60 cgagcgagaa accttcgggt ttctagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 120 ctcaaagagg ggaatagcct cccgaaaggg agattaatac cgcataatat tacagcttcg 180 catgaagcag taattaaagg agtaatccgc tttgagatgg acccgcggcg cattagctag 240 ttggagaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 300 cacattggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca 360 caatgggcga aagcctgatg cagcaacgcc gcgtgagtga tgacggtctt cggattgtaa 420 agctctgtct tttgggacga taatgacggt accaaaggag gaagccacgg ctaactacgt 480 gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttactg ggcgtaaagg 540 atgtgtaggc ggatacttaa gtgagatgtg aaagccccgg gcttaacttg gggactgcat 600 ttcaaactgg gtgtctagag tgcaggagag gaaagcggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 660 tgcgtagaga ttaggaagaa catcagtggc gaaggcggct ttctggactg taactgacgc 720 tgaggcatga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780 cgatgagtac taggtgtagg aggtatcgac tccttctgtg ccgcagtaaa cacaataagt 840 actccgcctg ggaagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900 caagcagcgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc tagacttgac 960 atctcctgaa tagcgtagag atacgtgaag cccttcgggg caggaagaca ggtggtgcat 1020 ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080 atcattagtt gctaccatta agttgagcac tctagtgaga ctgcccgggt taaccgggag 1140 gaaggcgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgtc tagggctaca cacgtgctac 1200 aatggtgaga acaacgagat gcaataccgc gaggtggagc caaacttgaa aactcatccc 1260 agttcggatt gtaggctgaa attcgcctac atgaagttgg agttgctagt aatcgcgaat 1320 cagaatgtcg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga 1380 gctggtaaca cccgaagtcc gtgaggtaac ctttatggag ccagcggccg aaggtgggat 1440 tagtgattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtaggag aacctgcggc tggatcacct 1500 ccttt 1505 <210> 16 <211> 1567 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 16 tatgagagtt tgatcctggc tcaggatgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc 60 gaacgagttc tcgttgatga tcggtgcttg caccgagatt caacatggaa cgagtggcgg 120 acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc ttaagtgggg gataacattt ggaaacagat 180 gctaataccg catagatcca agaaccgcat ggttcttggc tgaaagatgg cgtaagctat 240 cgcttttgga tggacccgcg gcgtattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg 300 atgatacgta gccgaactga gaggttgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa 360 ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac 420 gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg 480 gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc 540 cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga 600 gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa agccctcggc ttaaccgagg aagcgcatcg 660 gaaactggga aacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg 720 cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg 780 aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg 840 atgaatgcta ggtgttggag ggtttccgcc cttcagtgcc gcagctaacg cattaagcat 900 tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 960 agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 1020 cttttgatca cctgagagat caggtttccc cttcgggggc aaaatgacag gtggtgcatg 1080 gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta 1140 tgactagttg ccagcattta gttgggcact ctagtaagac tgccggtgac aaaccggagg 1200 aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1260 atggatggta caacgagttg cgagaccgcg aggtcaagct aatctcttaa agccattctc 1320 agttcggact gtaggctgca actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat 1380 cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga 1440 gtttgtaaca cccgaagccg gtggcgtaac ccttttaggg agcgagccgt ctaaggtggg 1500 acaaatgatt agggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg agaacctgcg gctggatcac 1560 ctccttt 1567 <210> 17 <211> 512 <212> DNA <213> Fontibacillus sp. (panacisegetis) <400> 17 ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtagg taacctgcct gtaagactgg gataactagc 60 ggaaacgtta gctaataccg gataatttat tttctcgcat ggggaagtaa tgaaagacgg 120 agcaatctgt cacttgcaga tggacctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaacggct 180 caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgaac ggccacactg ggactgagac 240 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 300 acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgccaggga 360 agaacgttcg gtagagtaac tgctaccgga gtgacggtac ctgagaagaa agccccggct 420 aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggggcaag cgttgtccgg aattattggg 480 cgtaaagcgc gcgcaggcgg ctatttaagt ct 512 <210> 18 <211> 1561 <212> DNA <213> Oceanobacillus oncorhynchi <400> 18 ttatggagag tttgatcttg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag 60 tcgagcgcgg gaagcgaacg gaactcttcg gagggaagtt cgtggaacga gcggcggacg 120 ggtgagtaac acgtaggcaa cctgcctgta agactgggat aactcgcgga aacgcgagct 180 aataccggat aacactttct atcacctgat ggaaagttga aaggcggctt ttgctgtcac 240 ttacagatgg gcctgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg 300 atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 360 ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 420 gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg tcagggaaga acaagtacga 480 tagtaactga tcgtaccttg acggtacctg accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 540 cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgctcg 600 caggcggttc tttaagtctg atgtgaaatc ttgcggctca accgcaaacg tgcattggaa 660 actggaggac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 720 agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg 780 agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 840 agtgctaggt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgaa gttaacgcat taagcactcc 900 gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaagaat tgacggggac ccgcacaagc 960 ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 1020 ttgaccgctc tagagataga gttttccctt cggggacaaa gtgacaggtg gtgcatggtt 1080 gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttaatc 1140 ttagttgcca gcatttagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1200 gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1260 gacggaacaa agggaagcga acccgcgagg tccagcaaat cccataaaac cgttctcagt 1320 tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagccggaat cgctagtaat cgcggatcag 1380 catgccgcgg tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1440 cgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttggagccag ccgccgaagg tgggacgaat 1500 gattggggtg aagtcgtaac aaggtagccg tatcggaagg tgcggctgga tcacctcctt 1560 t 1561 <210> 19 <211> 1553 <212> DNA <213> Paenibacillus lautus <400> 19 attggagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt 60 cgagcggact tgatggagtg cttgcactcc tgaaggttag cggcggacgg gtgagtaaca 120 cgtaggcaac ctgccctcaa gactgggata actaccggaa acggtagcta ataccggata 180 atttattttg cagcattgtg aaataatgaa aggcggagca atctgtcact tgaggatggg 240 cctgcggcgc attagctagt tggtggggta acggcccacc aaggcgacga tgcgtagccg 300 acctgagagg gtgaacggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 360 agcagtaggg aatcttccgc aatgggcgaa agcctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 420 gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgc caaggaagaa cgtcttctag agtaactgct 480 aggagagtga cggtacttga gaagaaagcc ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 540 atacgtaggg ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggcggttct 600 ttaagtctgg tgtttaaacc cgaggctcaa cttcgggtcg cactggaaac tggggaactt 660 gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag atatgtggag 720 gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggg ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 780 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt 840 taggggtttc gatacccttg gtgccgaagt taacacatta agcattccgc ctggggagta 900 cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcag tggagtatgt 960 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaagtctt gacatccctc tgaatcctct 1020 agagatagag gcggccttcg ggacagaggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatttt agttgccagc 1140 acttcgggtg ggcactctag aatgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 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gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgc cagggaagaa cgtccggtag agtaactgct 480 accggagtga cggtacctga gaagaaagcc ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 540 atacgtaggg ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggcggtcac 600 ttaagtctgg tgtttaaggc caaggctcaa ccttggttcg cactggaaac tgggtgactt 660 gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag atatgtggag 720 gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggg ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 780 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt 840 taggggtttc gatacccttg gtgccgaagt taacacatta agcattccgc ctggggagta 900 cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcag tggagtatgt 960 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaagtctt gacatccctc tgaatcctct 1020 agagatagag gcggccttcg ggacagaggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatttt agttgccagc 1140 atttcggatg ggcactctag aatgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg cggggatgac 1200 gtcaaatcat catgcccctt atgacttggg ctacacacgt actacaatgg ccagtacaac 1260 gggaagcgaa atcgcgagat ggagccaatc ctatcaaagc tggtctcagt tcggattgca 1320 ggctgcaacc cgcctgcatg aagtcggaat tgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1380 tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tacaacaccc 1440 gaagtcggtg gggtaacccg caagggagcc agccgccgaa ggtggggtag atgattgggg 1500 tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1553 <210> 21 <211> 1552 <212> DNA <213> Paenibacillus cookii <400> 21 cttggagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt 60 cgagcggagt tgatggggag cttgctctcc tgagacttag cggcggacgg gtgagtaaca 120 cgtaggcaac ctgcccgtaa gaccgggata actaccggaa acggtagcta ataccggata 180 atttatcgct tcgcatggag cggtaatgaa agacggagca atctgtcact tacggatggg 240 cctgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg 300 acctgagagg gtgaacggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 360 agcagtaggg aatcttccgc aatgggcgaa agcctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 420 gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgc cagggaagaa cgtcgggtag agtaactgct 480 atccgagtga cggtacctga gaagaaagcc ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 540 atacgtaggg ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggcggtcac 600 ttaagtctgg tgtttaaggc tagggctcaa ctctagttcg cactggaaac tgggtgactt 660 gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 720 gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggg ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 780 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt 840 taggggtttc gatacccttg gtgccgaagt taacacatta agcattccgc ctggggagta 900 cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcag tggagtatgt 960 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatccctc tgaatcctct 1020 agagatagag gcggccttcg ggacagagga gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatttt agttgccagc 1140 acattaaggt gggcactcta gaatgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gcggggatga 1200 cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tactacaatg gccagtacaa 1260 cgggaagcga agtcgcgaga cggagccaat cctatcaaag ctggtctcag ttcggattgc 1320 aggctgcaac ccgcctgcat gaagtcggaa ttgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1380 gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttacaacacc 1440 cgaagtcggt ggggtaaccg caaggagcca gccgccgaag gtggggtaga tgattggggt 1500 gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct tt 1552 <210> 22 <211> 1330 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. (chitinolyticus) <400> 22 ctgtggctta cggatgggcc tgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 60 ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gaacggccac actgggactg agacacggcc 120 cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgcaag tctgacggag 180 caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgcca gggaagaacg 240 ccaaggagag taactgctct ttgggtgacg gtacctgaga agaaagcccc ggctaactac 300 gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggggg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 360 gcgcgcgcag gcggtttttt aagtctggtg tttaatcccg aggctcaacc tcggttcgca 420 ccggaaactg ggagactgga gtgcaggaga ggaaagtgga attccacgtg tagcggtgaa 480 atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggcct gtaactgacg 540 ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 600 acgatgaatg ctaggtgtta ggggtttcga tacccttggt gccgaagtta acacagtaag 660 cattccgcct ggggagtacg ctcgcaagag tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc 720 acaagcagtg gagtatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 780 catccctctg accggcttag agataagcct ttccttcggg acagaggtga caggtggtgc 840 atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 900 ttgaacttag ttgccagcag gtaaagctgg gcactctaag ttgactgccg gtgacaaacc 960 ggaggaaggc ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgta 1020 ctacaatggc cggtacaacg ggaagcgaag gagcgatccg gagccaatcc tagaaaagcc 1080 ggtctcagtt cggattgcag gctgcaactc gcctgcatga agtcggaatt gctagtaatc 1140 gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc 1200 acgagagttt acaacacccg aagtcggtga ggtaaccgca aggagccagc cgccgaaggt 1260 ggggtagatg attggggtga agtcgtaaca aggtagccgt atcggaaggt gcggctggat 1320 cacctccttt 1330 <210> 23 <211> 866 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. (P1PXP2) <400> 23 cagagggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatactc 60 cactgcttgt gcgggtcccc gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc 120 aggcggaatg cttaatgtgt taacttcggc accaagggta tcgaaacccc taacacctag 180 cattcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt 240 cgcgcctcag cgtcagttac agcccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat 300 atctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagtcacc 360 cagtttccag tgcgaaccaa ggttgagcct tggccttaaa caccagactt aaatgaccgc 420 ctgcgcgcgc tttacgccca ataattccgg acaacgcttg ccccctacgt attaccgcgg 480 ctgctggcac gtagttagcc ggggctttct tctcaggtac cgtcactccg atagcagtta 540 ctctaccgga cgttcttccc tggcaacaga gctttacgat ccgaaaacct tcatcactca 600 cgcggcgttg ctccgtcagg ctttcgccca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg 660 taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgttc accctctcag gtcggctacg 720 catcgtcgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgca ggcccatccg 780 caagtgacag attgctccgt ctttcatcat cccctcagga gaggaaatga gatatccggt 840 attagctcac gtttccgtgg gttatc 866 <210> 24 <211> 1533 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. <400> 24 ctgaagagtt tgatcatggc tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc 60 gagcggatga cgggagcttg ctccttgatt cagcggcgga cgggtgagta atgcctagga 120 atctgcctgg tagtggggga caacgtttcg aaaggaacgc taataccgca tacgtcctac 180 gggagaaagc aggggacctt cgggccttgc gctatcagat gagcctaggt cggattagct 240 agtaggtgag gtaatggctc acctaggcga cgatccgtaa ctggtctgag aggatgatca 300 gtcacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360 gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc ttcggattgt 420 aaagcacttt aagttgggag gaagggcagt aagctaatac cttgctgttt tgacgttacc 480 gacagaataa gcaccggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga gggtgcaagc 540 gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt tcgttaagtt ggatgtgaaa 600 gccccgggct caacctggga actgcatcca aaactggcga gctagagtat ggtagagggt 660 ggtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatag gaaggaacac cagtggcgaa 720 ggcgaccacc tggactgata ctgacactga ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780 agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtcaactag ccgttggaat ccttgagatt 840 ttagtggcgc agctaacgca ttaagttgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa 900 ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 960 cgcgaagaac cttaccaggc cttgacatgc agagaacttt ccagagatgg attggtgcct 1020 tcgggaactc tgacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080 ttaagtcccg taacgagcgc aacccttgtc cttagttacc agcacgttat ggtgggcact 1140 ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc 1200 ccttacggcc tgggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggttg ccaagccgcg 1260 aggtggagct aatctcacaa aaccgatcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc 1320 gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcaaat cagaatgttg cggtgaatac gttcccgggc 1380 cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca ccagaagtag ctagtctaac 1440 cttcgggggg acggttacca cggtgtgatt catgactggg gtgaagtcgt aacaaggtag 1500 ccgtagggga acctgcggct ggatcacctc ctt 1533 <210> 25 <211> 1523 <212> DNA <213> Streptomyces griseus <400> 25 acggagagtt tgatcctggc tcaggacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc 60 gaacgatgaa gcctttcggg gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc 120 tgcccttcac tctgggacaa gccctggaaa cggggtctaa taccggataa cactctgtcc 180 cgcatgggac ggggttaaaa gctccggcgg tgaaggatga gcccgcggcc tatcagcttg 240 ttggtggggt aatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc 300 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca 360 caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa 420 acctctttca gcagggaaga agcgagagtg acggtacctg cagaagaagc gccggctaac 480 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540 aaagagctcg taggcggctt gtcacgtcgg atgtgaaagc ccggggctta accccgggtc 600 tgcattcgat acgggctagc tagagtgtgg taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg 660 tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cggatctctg ggccattact 720 gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780 gtaaacgttg ggaactaggt gttggcgaca ttccacgtcg tcggtgccgc agctaacgca 840 ttaagttccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900 cccgcacaag cagcggagca tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg 960 cttgacatat accggaaagc atcagagatg gtgcccccct tgtggtcggt atacaggtgg 1020 tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080 cccttgttct gtgttgccag catgcccttc ggggtgatgg ggactcacag gagactgccg 1140 gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc 1200 tgcacacgtg ctacaatggc cggtacaatg agctgcgatg ccgcgaggcg gagcgaatct 1260 caaaaagccg gtctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa gtcggagttg 1320 ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380 ccgtcacgtc acgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cccaacccct tgtgggaggg 1440 agctgtcgaa ggtgggactg gcgattggga cgaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa 1500 ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1523 <210> 26 <211> 299 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 26 Met Leu Thr Asp Leu His Ile Ala Val Ile Gly Gly Asp Ala Arg Gln 1 5 10 15 Leu Glu Val Ile Arg Lys Leu Ile Gln Leu Asp Ala Lys Thr Ser Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Asp Gln Leu Asp His Gly Phe Thr Gly Ala Thr Lys Tyr 35 40 45 Gln Ile Glu Glu Leu Asp Phe Ser Asp Val Asp Ala Ile Ile Leu Pro 50 55 60 Val Pro Gly Thr Asn His Glu Gly Gln Val Asp Thr Ile Phe Ser Asn 65 70 75 80 Glu Lys Val Val Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Lys Thr Pro Glu His 85 90 95 Cys Ile Ile Tyr Ser Gly Ile Ser Asn Gly Tyr Leu Asn Glu Leu Val 100 105 110 Lys Thr Thr Asn Arg Lys Leu Val Gln Leu Phe Glu Arg Asp Asp Val 115 120 125 Ala Ile Tyr Asn Ser Ile Pro Thr Val Glu Gly Thr Ile Met Leu Val 130 135 140 Ile Gln His Thr Asp Phe Thr Ile His Gly Ser Asn Ile Ser Val Leu 145 150 155 160 Gly Leu Gly Arg Val Gly Met Ser Val Ala Arg Ser Phe Ala Ala Leu 165 170 175 Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ala Arg Lys Ser Glu His Leu Ala Arg 180 185 190 Ile Ala Glu Met Gly Leu Gln Pro Phe Tyr Leu Ser Glu Leu Asp Lys 195 200 205 Glu Ile Ala Asp Ser Asp Ile Cys Ile Asn Thr Ile Pro Tyr Pro Ile 210 215 220 Leu Thr Ala Lys Thr Leu Ser Asn Val Pro Thr His Ala Leu Ile Ile 225 230 235 240 Asp Leu Ala Ser Lys Pro Gly Gly Thr Asp Phe Arg Tyr Ala Glu Lys 245 250 255 Arg Gly Ile Lys Ala Ile Leu Ala Pro Gly Leu Pro Gly Ile Val Ala 260 265 270 Pro Lys Thr Ala Gly Gln Ile Val Ala Asn Val Leu Val Asn Leu Leu 275 280 285 Lys Asp Ala Ala Asp Ala Arg Glu Glu Lys Lys 290 295 <210> 27 <211> 297 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 27 Met Leu Thr Gly Leu Lys Ile Ala Val Ile Gly Gly Asp Ala Arg Gln 1 5 10 15 Leu Glu Ile Ile Arg Lys Leu Thr Glu Gln Gln Ala Asp Ile Tyr Leu 20 25 30 Val Gly Phe Asp Gln Leu Asp His Gly Phe Thr Gly Ala Val Lys Cys 35 40 45 Asn Ile Asp Glu Ile Pro Phe Gln Gln Ile Asp Ser Ile Ile Leu Pro 50 55 60 Val Ser Ala Thr Thr Gly Glu Gly Val Val Ser Thr Val Phe Ser Asn 65 70 75 80 Glu Glu Val Val Leu Lys Gln Asp His Leu Asp Arg Thr Pro Ala His 85 90 95 Cys Val Ile Phe Ser Gly Ile Ser Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Ile Ala 100 105 110 Ala Gln Ala Lys Arg Lys Leu Val Lys Leu Phe Glu Arg Asp Asp Ile 115 120 125 Ala Ile Tyr Asn Ser Ile Pro Thr Val Glu Gly Thr Ile Met Leu Ala 130 135 140 Ile Gln His Thr Asp Tyr Thr Ile 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Glu Ile Pro Phe Gln Lys Ile Asp Ser Ile Ile Leu Pro 50 55 60 Val Ser Ala Thr Thr Gly Glu Gly Val Val Ser Thr Val Phe Ser Asn 65 70 75 80 Glu Glu Val Val Leu Lys Gln Ser Tyr Leu Glu Arg Thr Pro Glu His 85 90 95 Cys Val Ile Tyr Ser Gly Ile Ser Asn Ala Tyr Leu Glu Gly Ile Ala 100 105 110 Ser Glu Ala Gly Arg Lys Leu Val Lys Leu Phe Glu Arg Asp Asp Ile 115 120 125 Ala Ile Phe Asn Ser Ile Pro Thr Val Glu Gly Thr Ile Met Met Ala 130 135 140 Ile Gln His Thr Asp Tyr Thr Ile His Gly Ser Asn Val Ala Val Leu 145 150 155 160 Gly Met Gly Arg Thr Gly Met Thr Ile Ala Arg Thr Phe Ala Ala Leu 165 170 175 Gly Ala Lys Val Lys Val Gly Ala Arg Ser Ser Ala His Leu Ala Arg 180 185 190 Ile Thr Glu Met Gly Leu Ser Pro Phe Gln Leu Glu Glu Leu Thr Glu 195 200 205 His Val Asn Asp Ile Asp Ile Cys Ile Asn Thr Val Pro Ser Leu Ile 210 215 220 Leu Asn Gln Ser Val Leu Ser Arg Met Thr Pro Lys Thr Leu Ile Leu 225 230 235 240 Asp Leu Ala Ser Arg Pro Gly Gly Thr Asp Phe Lys Tyr Ala Glu Lys 245 250 255 Gln Gly Ile Lys Ala 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MISC_FEATURE <222> (154) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (162)..(163) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (173) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (176)..(181) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (184) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (186) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (188) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (191)..(192) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (194)..(202) <223> X is any amino acid <400> 55 Met Met Xaa Xaa Lys Gly Lys Arg Ile Gly Phe Gly Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 His Cys Thr Tyr Xaa Xaa Val Xaa Pro Xaa Ile Glu Xaa Leu Val Xaa 20 25 30 Xaa Gly Ala Glu Val Xaa Pro Xaa Val Xaa Xaa Thr Val Gln Xaa Thr 35 40 45 Asp Thr Arg Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 50 55 60 Xaa Thr Gly Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Ile Val Xaa Ala 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Pro Ile Tyr Met Met Gln Met Ser Ala Gln Gly Lys Ile 85 90 95 Ile Ile Asp Arg Met Phe Ala Arg Phe Ser Pro Arg Tyr Ser Pro Tyr 100 105 110 Phe Lys Glu Glu Ser Ala Ala Glu Lys Arg Leu Val Leu Thr Phe Asn 115 120 125 Gln Gly Asn Pro Asp Pro Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Ile Asp Tyr Thr 130 135 140 Lys His Met Phe Glu Leu Leu Glu Phe Asp Val Thr Glu Val Pro Val 145 150 155 160 Val Thr Gly Leu Arg Asn Gly Pro Ala Asn Glu Arg Glu Asp Leu Asn 165 170 175 Ile Met Leu Lys Asp Val Gly Lys Thr Ile Val Ser Glu Gly Ile Ser 180 185 190 Lys <210> 62 <211> 208 <212> PRT <213> Clostridium beijerinckii <400> 62 Met Lys Val Leu Leu Ile Asn Gly Ser Pro Lys Ala Lys Gly Cys Thr 1 5 10 15 Tyr Thr Thr Leu Cys Glu Val Ala Asp Glu Leu Glu Lys Glu Asn Ile 20 25 30 Glu Thr Glu Ile Phe Gln Ile Gly Asn Lys Pro Ile Ser Gly Cys Ile 35 40 45 Asp Cys Gly Gly Cys Tyr Lys Ser Gly Glu Gly Lys Cys Val Phe Ser 50 55 60 Asp Asp Ile Val Asn Ile Ala Leu Glu Lys Ala Lys Glu Ala Asp Gly 65 70 75 80 Phe Ile Phe Gly Ser Pro Val His Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Ile 85 90 95 Thr Ser Phe Leu Asp Arg Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Cys Phe Ala His 100 105 110 Lys Pro Gly Ala Ala Val Val Ser Cys Arg Arg Gly Gly Ala Ala Ser 115 120 125 Ala Phe Asp Gln Leu Asn Lys Tyr Phe Thr Ile Ser Asn Met Pro Val 130 135 140 Val Ser Ser Gln Tyr Trp Asn Met Val His Gly Asn Thr Pro Glu Glu 145 150 155 160 Val Lys Gln Asp Leu Glu Gly Met Gln Thr Met Arg Met Leu Gly Lys 165 170 175 Asn Met Ala Trp Leu Leu Lys Ser Ile Asp Ala Gly Lys Lys Ala Gly 180 185 190 Ile Ser Leu Pro Glu Ser Glu Pro Arg Val Ala Thr Asn Phe Ile Arg 195 200 205 <210> 63 <211> 201 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 63 Met Lys Leu Leu Ala Ile Asn Gly Ser Pro Asn Lys Arg Asn Thr Leu 1 5 10 15 Phe Leu Leu Glu Val Ile Ala Glu Glu Val Lys Lys Leu Gly His Glu 20 25 30 Ala Glu Ile Ile His Leu Lys Asp Tyr Glu Ile Lys Glu Cys Lys Gly 35 40 45 Cys Asp Ala Cys Leu Lys Gly Asp Cys Ser Gln Lys Asp Asp Ile Tyr 50 55 60 Lys Val Leu Glu Lys Met Gln Glu Ala Asp Ala Ile Val Ile Gly Thr 65 70 75 80 Pro Thr Tyr Phe Gly Asn Val Thr Gly Ile Val Lys Asn Leu Ile Asp 85 90 95 Arg Ser Arg Met Ala Arg Met Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Asn Arg Val 100 105 110 Phe Ala Pro Val Val Thr Ser Gly Leu Arg Asn Gly Gly Ala Glu Tyr 115 120 125 Ala Ala Met Ser Leu Ile Val Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Met Leu Pro 130 135 140 Val Ser Ile Val Glu Asn Pro Ile Thr Thr Gly Thr Phe Pro Val Gly 145 150 155 160 Val Ile Gln Gly Asp Ala Gly Trp Arg Ser Val Lys Lys Asp Glu Ile 165 170 175 Ala Ile Asn Ser Ala Lys Ala Leu Ala Lys Arg Ile Val Glu Val Ala 180 185 190 Glu Ala Thr Lys Asn Leu Arg Glu Ser 195 200 <210> 64 <211> 193 <212> PRT <213> Methanocaldococcus jannaschii, <400> 64 Met Lys Val Ile Gly Ile Ser Gly Ser Pro Arg Pro Glu Gly Asn Thr 1 5 10 15 Thr Leu Leu Val Arg Glu Ala Leu Asn Ala Ile Ala Glu Glu Gly Ile 20 25 30 Glu Thr Glu Phe Ile Ser Leu Ala Asp Lys Glu Leu Asn Pro Cys Ile 35 40 45 Gly Cys Asn Met Cys Lys Glu Glu Gly Lys Cys Pro Ile Ile Asp Asp 50 55 60 Val Asp Glu Ile Leu Lys Lys Met Lys Glu Ala Asp Gly Ile Ile Leu 65 70 75 80 Gly Ser Pro Val Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Gln Leu Lys Met Leu 85 90 95 Met Asp Arg Ser Arg Pro Leu Arg Ile Gly Phe Gln Leu Arg Asn Lys 100 105 110 Val Gly Gly Ala Val Ala Val Gly Ala Ser Arg Asn Gly Gly Gln Glu 115 120 125 Thr Thr Ile Gln Gln Ile His Asn Phe Phe Leu Ile His Ser Met Ile 130 135 140 Val Val Gly Asp Asn Asp Pro Thr Ala His Tyr Gly Gly Thr Gly Val 145 150 155 160 Gly Lys Ala Pro Gly Asp Cys Lys Asn Asp Asp Ile Gly Leu Glu Thr 165 170 175 Ala Arg Asn Leu Gly Lys Lys Val Ala Glu Val Val Lys Leu Ile Lys 180 185 190 Lys <210> 65 <211> 225 <212> PRT <213> Peptoclostridium difficile <400> 65 Met Ile Ile Thr Val Ile Asn Gly Ser Pro Arg Lys Asn Gly Ala Thr 1 5 10 15 Ser Lys Val Leu Thr Tyr Leu Tyr Lys Asp Ile Glu Arg Leu Ile Pro 20 25 30 Asp Val Lys Ile Asn Tyr Phe Asp Leu Ser Glu Val Asn Pro Ser Tyr 35 40 45 Cys Ile Gly Cys Leu Asn Cys Tyr Lys Met Gly Lys Cys Ile Asn Gln 50 55 60 Asn Asp Lys Val Glu Tyr Ile His Asp Ile Ile Thr Lys Ser Asp Gly 65 70 75 80 Val Ile Phe Gly Ser Pro Thr Tyr Gly Ser Ser Val Thr Gly Leu Phe 85 90 95 Lys Val Phe Thr Asp Arg Ala His Met Met Leu Glu Arg Leu Leu Tyr 100 105 110 Arg Lys Pro Cys Ile Ala Val Thr Thr Tyr Glu Asn Ala Arg Gly Ser 115 120 125 Lys Ala Ile Ser Phe Ile Lys Ser Met Val Leu Asp Ser Gly Gly Tyr 130 135 140 Val Cys Gly Ser Leu Ser Ile Lys Thr Gly Phe Asn Gln Asn Pro Ile 145 150 155 160 Thr Glu Lys Val Glu Ser Lys Ile Gln Lys Val Ser Lys Lys Phe Ile 165 170 175 Tyr Cys Ile Glu Glu Lys Lys Asn Pro Pro Val Leu Ser Gln Ile Tyr 180 185 190 Asn Phe Ile Ala Ile Asn Ala Val Leu Lys Pro Met Ala Phe Lys Asp 195 200 205 Ile Glu Gln Tyr Lys Gly Ile Ile Asp Arg Trp Glu Glu Gln Gly Ile 210 215 220 Ile 225 <210> 66 <211> 191 <212> PRT <213> Methanosarcina thermophila <400> 66 Met Lys Ile Thr Gly Ile Ser Gly Ser Pro Arg Lys Gly Gln Asn Cys 1 5 10 15 Glu Lys Ile Ile Gly Ala Ala Leu Glu Val Ala Lys Glu Arg Gly Phe 20 25 30 Glu Thr Asp Thr Val Phe Ile Ser Asn Glu Glu Val Ala Pro Cys Lys 35 40 45 Ala Cys Gly Ala Cys Arg Asp Gln Asp Phe Cys Val Ile Asp Asp Asp 50 55 60 Met Asp Glu Ile Tyr Glu Lys Met Arg Ala Ala Asp Gly Ile Ile Val 65 70 75 80 Ala Ala Pro Val Tyr Met Gly Asn Tyr Pro Ala Gln Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Phe Asp Arg Ser Val Leu Leu Arg Arg Lys Asn Phe Ala Leu Lys Asn 100 105 110 Lys Val Gly Ala Ala Leu Ser Val Gly Gly Ser Arg Asn Gly Gly Gln 115 120 125 Glu Lys Thr Ile Gln Ser Ile His Asp Trp Met His Ile His Gly Met 130 135 140 Ile Val Val Gly Asp Asn Ser His Phe Gly Gly Ile Thr Trp Asn Pro 145 150 155 160 Ala Glu Glu Asp Thr Val Gly Met Gln Thr Val Ser Glu Thr Ala Lys 165 170 175 Lys Leu Cys Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Lys Asn Arg Asp Lys 180 185 190 <210> 67 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Isf sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(6) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(19) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(28) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(43) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(50) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(53) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(59) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(64) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(70) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(74) <223> X is any amino acid <220> 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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Ala Ala 20 25 30 Lys Xaa Leu Ile Xaa Gly Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Leu Xaa Asp 35 40 45 Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Cys Xaa Gly Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Ser Asn Ser Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Asp Asp Xaa Xaa Xaa Ile 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ala Asp Xaa Ile Xaa Phe Gly Ser Pro 85 90 95 Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Gly Gln Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Asp Arg 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ile Thr Xaa Phe Ile Tyr Thr 130 135 140 Met Asn Val Lys Glu Glu Val Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Ile Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Lys Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Val Ser Lys Lys Phe Ile Tyr 210 215 220 Cys Ile Glu Glu Lys Lys Asn Pro Pro Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Leu Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Gly 245 250 255 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270 Gly Ile Ser Xaa Pro Glu Ser Glu Pro Arg Val Ala Thr Asn Phe Ile 275 280 285 Arg

Claims (47)

  1. 각각의 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus drentensis, Bacillus subtilis, Clostridium bifermentans, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus paracasei, Fontibacillus sp. (panacisegetis), Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Paenibacillus azoreducens, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus cookii, Paenibacillus sp. (chitinolyticus), Paenibacillus sp. (P1XP2), Pseudomonas sp., 및 Streptomyces griseus 각각을 포함하거나 이로 이루어진 미생물 종 (microbial species) 의 세포를 포함하는 조성물.
  2. 서열 번호 3 내지 25 각각에 대해 적어도 99 % 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA 핵산 서열을 갖는 미생물을 포함하거나 이로 이루어진 미생물 종의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 서열 번호 3 내지 25 각각의 16S rDNA 핵산 서열을 갖는 미생물 (microbes) 을 포함하거나 이로 이루어진 미생물 종의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 아메리칸 타입 컬쳐 컬랙션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-125924를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 키틴 (chitin), 키토산 (chitosan), 글루코사민 (glucosamine), 아미노산 (amino acids) 및 액체 비료 (liquid fertilizer) 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물과 토양 (soil), 식물 (plants), 식물 부분 (plant parts) 또는 종자 (seeds) 를 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 토양, 식물, 식물 부분 또는 종자를 키틴, 키토산, 글루코사민 및 아미노산 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 토양, 식물, 식물 부분 또는 종자를 액체 비료와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 토양, 식물, 식물 부분 또는 종자를 하나 이상의 농약 (pesticides), 하나 이상의 살균제 (fungicides), 하나 이상의 제초제 (herbicides), 하나 이상의 살충제 (insecticides), 하나 이상의 식물 호르몬 (plant hormones), 하나 이상의 식물 유도제 (plant elicitors), 또는 이들의 둘 이상의 조합 (combinations) 과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 토양, 식물, 식물 부분 또는 종자를 상기 조성물과 접촉시키기 전에 상기 조성물에서 미생물 종을 활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물과 담체 또는 종자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 담체는 요소 (urea), 칼리 (potash), 인산 암모늄 (ammonium phosphate), 질산 암모늄 (ammonium nitrate), 점토 (clay), 이탄 (peat), 석탄 (coal), 무기 토양 (inorganic soil), 목탄 (charcoal), 톱밥 (sawdust), 밀 / 대두 / 귀리 기울 (wheat/soy/oat bran), 퇴비 (compost), 코코 코이어 (coco coir), 펄라이트 (perlite), 질석 (vermiculite), 벤토나이트 (bentonite), 아조마이트|, 카올린 (kaolin), 규산염 (silicates), 부석 (pumice), 활석 (talc), 액체 비료 (a liquid fertilizer) 또는 액체 먼지 제어 화학 물질 (a liquid dust control chemical) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서, 종자는 옥수수 종자, 해바라기 종자, 카놀라 종자, 밀 종자, 오이 종자, 토마토 종자, 벼 종자 및 / 또는 목화 종자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 살충제 및 / 또는 살균제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 하나 이상의 디피콜린 산 (dipicolinic acid) (DPA) 신타제 (synthase) 유전자를 포함하는 미생물, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하는 미생물 및 / 또는 DPA를 생성하는 미생물을 확인하는 단계; 및
    담체 또는 종자와의 제형화를 위한 상기 미생물을 선택하는 단계;
    를 포함하는 담체 또는 종자와의 제형화를 위한 미생물을 선택하기 위한 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 선택된 미생물을 담체 또는 종자와 함께 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 하나 이상의 DPA 신타제 유전자가 DPA 신타제 서브 유닛 (subunit) A (DpaA) 유전자 및 / 또는 DPA 신타제 서브 유닛 B (DpaB) 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, DpaA 유전자가 서열 번호 26-41의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % 서열 동일성을 갖는 DpaA 단백질을 코딩하거나, 또는 DpaB 유전자가 서열 번호 42-56의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % 서열 동일성을 갖는 DpaB 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, DpaA 유전자가 서열 번호 26-41의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60 % 서열 동일성을 갖는 DpaA 단백질을 코딩하거나, 또는 DpaB 유전자가 서열 번호 42-56의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60 % 서열 동일성을 갖는 DpaB 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, DpaA 유전자가 서열 번호 26-41의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진 DpaA 단백질을 코딩하거나, 또는 DpaB 유전자가 서열 번호 42-56의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진 DpaB 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질이 DPA 신타제 서브 유닛 A (DpaA) 단백질 및 / 또는 DPA 신타제 서브 유닛 B (DpaB) 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, DpaA 단백질이 서열 번호 26-41의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % 서열 동일성을 포함하하거나, 또는 DpaB 단백질이 서열 번호 42-56의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, DpaA 단백질이 서열 번호 26-41의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60 % 서열 동일성을 포함하는 거나, 또는 DpaB 단백질이 서열 번호 42-56의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60 % 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, DpaA 단백질이 서열 번호 26-41의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 DpaB 단백질이 서열 번호 42-56의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 15 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디피콜린 산 (DPA) 신타제신타제 유전자를 포함하는 미생물을 확인하는 단계는 하나 이상의 DPA 신타제신타제 유전자를 코딩하는 핵산 또는 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, mRNA 또는 cDNA 인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 핵산을 검출하는 단계는 핵산 서열 분석 (sequencing), 핵산 증폭 (amplification), 핵산 혼성화 (hybridization) 및 마이크로 어레이 분석 (microarray analysis) 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 15 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하는 미생물을 확인하는 단계는 면역 분석 (immunoassay) 또는 질량 분석 (mass spectrometry) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 면역 분석은 웨스턴 블롯팅 (western blotting), ELISA, 유세포 분석 (flow cytometry) 또는 면역조직화학 (immunohistochemistry) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, DPA를 생성하는 미생물을 확인하는 단계는 미생물 또는 미생물을 함유하는 배지에서 DPA를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, DPA 검출은 형광 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 형광 분석은 테르븀 (Terbium)-DPA 형광 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, DPA를 생산하는 미생물을 확인하는 단계는 하나 이상의 EtfA (electron transfer flavoprotein) 또는 Isf (iron-sulfur flavoprotein) 유전자를 포함하거나 및 / 또는 하나 이상의 EtfA 또는 Isf 단백질을 발현하는 미생물을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, Isf 단백질이 서열 번호 57-66의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 20 % 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, Isf 단백질이 서열 번호 57-66의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60 % 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, Isf 단백질이 서열 번호 57-66의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 15 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하지 않거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하지 않거나, 및 / 또는 DPA를 생성하지 않는 미생물과 비교하여, 상기 선택된 미생물이 담체 또는 종자와 함께 제형화될 때 증가된 생존력을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 16 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 미생물을 담체 또는 종자와 제형화하는 단계는 하나 이상의 선택된 미생물을 담체 또는 종자와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 하나 이상의 선택된 미생물이 액체 배지에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 하나 이상의 선택된 미생물이 고체 또는 건조 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 DPA 신타제 유전자를 포함하지 않거나, 하나 이상의 DPA 신타제 단백질을 발현하지 않거나, 및 / 또는 DPA를 생성하지 않는 하나 이상의 미생물과 담체 또는 종자를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 16 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체는 건조, 고체 또는 액체 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 건조 또는 고체 담체는 건조 비료 (dry fertilizer), 토양 유래 물질 (a soil-derived substance), 유기 물질 (an organic substance), 불활성 물질 (an inert material) 또는 이들의 둘 이상의 혼합물 (a mixture) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 건조 비료는 요소, 칼리, 인산 암모늄 및 / 또는 질산 암모늄을 포함하고;
    토양 유래 물질은 점토, 이탄, 석탄 또는 무기 토양을 포함하고;
    유기 물질은 목탄, 톱밥, 밀 / 대두 / 귀리 기울, 퇴비 또는 코코 야자 껍질을 포함하고; 또는
    불활성 물질은 펄라이트, 질석, 벤토나이트, 아조마이트®, 카올린, 규산염, 부석 또는 활석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 42 항에 있어서, 액체 담체는 액체 비료 또는 액체 먼지 제어 화학 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 16 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 종자는 옥수수 종자, 해바라기 종자, 카놀라 종자, 밀 종자, 오이 종자, 토마토 종자, 벼 종자 및 / 또는 목화 종자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 종자는 하나 이상의 살충제 및 / 또는 살균제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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