CN114008221A - 用于分离和表征由化学诱变产生的泌铵突变体库的高通量方法 - Google Patents

用于分离和表征由化学诱变产生的泌铵突变体库的高通量方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于快速诱变、筛选和靶向能够在存在外源氮的情况下固定大气氮的候选微生物的高通量方法。所述方法利用能够检测组合物中铵和/或谷氨酰胺的存在/不存在并用荧光报告子发出信号的微生物生物传感器。本公开还利用能够加工数千种候选微生物的快速视觉检测测定。所公开的方法和生物传感器可以用于鉴定具有改善的固氮能力的突变细菌。还公开了具有改善的固氮能力的突变细菌，以及利用这些新细菌为植物提供固定的氮的方法。

Description

用于分离和表征由化学诱变产生的泌铵突变体库的高通量 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月25日提交的美国临时申请序列号62/838,780的优先权权益，所述申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
关于序列表的声明
随本文以电子方式提交的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本，文件名：PIVO_014_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2020年4月22日，文件大小约148千字节。
发明背景
现有技术中用于随机诱变微生物并评价和选择在外源氮的存在下增加固定大气氮的能力的技术是缓慢的，并且不能规模诱变和选择潜在的候选微生物，因为计量固氮酶活性和铵分泌是缓慢的过程。显然需要快速筛选以确定单个微生物或无数个微生物是否能够固氮，并且更重要的是在外源氮的存在下进行快速筛选。
本公开的组合物和使用所述组合物的方法通过将大规模微生物诱变与依赖修饰的微生物充当生物传感器以筛选游离铵和/或谷氨酰胺的存在或不存在的筛选过程相结合，同时将所述生物传感器与诱变的微生物共培养解决了研究过程中的这一瓶颈。这些方法进一步与快速鉴定固定大气氮的候选微生物的高通量测定相结合。
发明内容
一方面，本文提供了一种能够检测组合物中铵的存在的生物传感器，所述生物传感器包括包含以下的细菌：(a)编码报告分子的核酸序列，(b)选自可操作地连接至(a)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(c)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(d)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子。在一些情况下，报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。在一些情况下，荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。在一些情况下，荧光蛋白是GFP。在一些情况下，GFP是超折叠GFP。在一些情况下，启动子或其片段选自nifHDK操纵子。在一些情况下，启动子是nifH启动子。在一些情况下，抑制性固氮调节蛋白是NifL。在一些情况下，正固氮调节蛋白是NifA。在一些情况下，细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。
另一方面，本文提供了一种检测组合物中铵的存在的方法，所述方法包括：(a)用生物传感器接种组合物，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(b)将经接种的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和(c)在(b)之后检测与对照组合物相比经接种的组合物的报告分子输出。在一些情况下，所述方法还包括基于检测的报告分子输出量化所述组合物中铵的量。在一些情况下，刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。在一些情况下，刺激是光。在一些情况下，报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。在一些情况下，荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。在一些情况下，荧光蛋白是GFP。在一些情况下，GFP是超折叠GFP。在一些情况下，步骤(b)需要将经接种的组合物暴露于足以使荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。在一些情况下，步骤(c)需要在(b)之后检测与对照组合物相比经接种的组合物的荧光输出强度。在一些情况下，使用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测荧光。在一些情况下，启动子或其片段选自nifHDK操纵子。在一些情况下，启动子是nifH启动子。在一些情况下，抑制性固氮调节蛋白是NifL。在一些情况下，正固氮调节蛋白是NifA。
一方面，本文提供了一种用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法，所述方法包括：(a)将细菌群体暴露于微生物组合物中的诱变剂；(b)将所述微生物组合物与生物传感器共培养，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(c)将共培养的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和(d)将能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起报告分子输出降低或无报告分子输出的细菌突变体。在一些情况下，在(c)之后检测与对照组合物相比共培养的组合物的报告分子输出。在一些情况下，对照组合物包含不表达报告分子的微生物。在一些情况下，对照组合物包含表达报告分子的功能缺失变体的微生物。在一些情况下，刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。在一些情况下，刺激是光。在一些情况下，报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。在一些情况下，荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。在一些情况下，荧光蛋白是GFP。在一些情况下，GFP是超折叠GFP。在一些情况下，步骤(c)需要将经接种的组合物暴露于足以使荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。在一些情况下，使用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测荧光。在一些情况下，所述方法还包括分离(d)中鉴定的能够固定大气氮的细菌突变体。在一些情况下，分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。在一些情况下，分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。在一些情况下，分离的细菌突变体包括在glnA中包含至少一个遗传变异的细菌。在一些情况下，glnA中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属(Klebsiella)glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属(Kosakonia)glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属(Metakosakonia)glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，glnA中的至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属(Paraburkholderia)glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，分离的细菌突变体包括在glnE中包含至少一个遗传变异的细菌。在一些情况下，glnE中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，glnE中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在一些情况下，在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至E取代。在一些情况下，在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至D取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些情况下，GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
一方面，本文提供了一种用于高通量鉴定能够固定大气氮的一种或多种细菌突变体的方法，所述方法包括：(a)将细菌群体暴露于诱变剂；(b)将(a)中的细菌群体转移到一个或多个包含培养基的样品中；(c)在(b)中的一个或多个样品中的每一个内共培养生物传感器，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(d)将(c)中的一个或多个样品中的每一个暴露于足以激活报告分子的刺激；和(e)从(d)中的一个或多个样品中将一种或多种能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起所述报告分子输出降低的细菌突变体。在一些情况下，在(d)之后测量与对照组合物相比(d)中的一个或多个样品的报告分子输出。在一些情况下，对照组合物包含不表达报告分子的微生物。在一些情况下，对照组合物包含表达报告分子的功能缺失变体的微生物。在一些情况下，刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。在一些情况下，刺激是光。在一些情况下，报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。在一些情况下，荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。在一些情况下，荧光蛋白是GFP。在一些情况下，GFP是超折叠GFP。在一些情况下，步骤(d)需要将经接种的组合物暴露于足以使荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。在一些情况下，使用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测荧光。在一些情况下，所述方法还包括分离能够固定大气氮的细菌突变体。在一些情况下，分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。在一些情况下，分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。在一些情况下，分离的细菌突变体包括在glnA中包含至少一个遗传变异的细菌。在一些情况下，glnA中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，glnA中的至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO43-46组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，分离的细菌突变体包含glnE中的至少一个遗传变异。在一些情况下，glnE中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，glnE中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在一些情况下，在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至E取代。在一些情况下，在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至D取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些情况下，GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些情况下，细菌群体包含至少100,000个细菌，并且其中用于高通量鉴定的方法在不到四小时内完成。在一些情况下，启动子或其片段选自nifHDK操纵子。在一些情况下，启动子是nifH启动子。在一些情况下，抑制性固氮调节蛋白是NifL。在一些情况下，正固氮调节蛋白是NifA。在一些情况下，诱变剂选自丝裂霉素C(MMC)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、亚硝酸(NA)、二环氧丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基-2-氯乙基]-氨基丙胺)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)。在一些情况下，诱变剂是EMS。在一些情况下，细菌群体选自野生型细菌、转基因突变细菌、非属间突变细菌和属间突变细菌。
一方面，本文提供了一种用于鉴定涉及固定大气氮的新细菌基因、途径和/或调节元件的方法，所述方法包括：(a)将细菌群体暴露于微生物组合物中的诱变剂；(b)用生物传感器接种微生物组合物，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(c)将经接种的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；(d)在(c)之后测量与对照组合物相比经接种的组合物的报告分子输出；(e)从与对照组合物相比表现出报告分子输出降低的经接种的组合物中分离细菌作为能够固定大气氮的细菌；(f)对来自(e)的能够固定大气氮的细菌的基因组进行测序；和(g)从测序的基因组中鉴定含有突变的基因、途径和/或调节元件。在一些情况下，对照组合物包含不表达报告分子的微生物。在一些情况下，对照组合物包含表达报告分子的功能缺失变体的微生物。在一些情况下，刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。在一些情况下，刺激是光。在一些情况下，报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。在一些情况下，荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。在一些情况下，荧光蛋白是GFP。在一些情况下，GFP是超折叠GFP。在一些情况下，步骤(c)需要将经接种的组合物暴露于足以使荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。在一些情况下，使用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测荧光。在一些情况下，所述方法还包括确定所述基因、途径和/或调节元件是否含有已知与大气氮的固定相关联的突变。在一些情况下，所鉴定的突变包括glnA或glnE中的至少一个突变。在一些情况下，glnA中的至少一个突变包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQID NO:2的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，glnA中的至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ IDNO:4的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因包含选自由SEQ ID NO20-23组成的组的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，glnE中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，glnE中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在一些情况下，在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至E取代。在一些情况下，在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至D取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些情况下，GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些情况下，启动子或其片段选自nifHDK操纵子。在一些情况下，启动子是nifH启动子。在一些情况下，抑制性固氮调节蛋白是NifL。在一些情况下，正固氮调节蛋白是NifA。在一些情况下，诱变剂选自丝裂霉素C(MMC)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、亚硝酸(NA)、二环氧丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基-2-氯乙基]-氨基丙胺)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)。在一些情况下，诱变剂是EMS。在一些情况下，细菌群体选自野生型细菌、转基因突变细菌、非属间突变细菌和属间突变细菌。
另一方面，本文提供了一种用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法，所述方法包括：(a)将细菌群体暴露于诱变剂；(b)将暴露于(a)中的诱变剂的细菌群体暴露于微生物组合物中的固氮生长抑制剂；(c)将所述微生物组合物与生物传感器共培养，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(d)将共培养的组合物暴露于足以激活报告分子的刺激；和(e)将能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起报告分子输出降低或没有报告分子输出的细菌突变体。在一些情况下，固氮生长抑制剂是乙二胺(EDA)或甲基铵。在一些情况下，在(d)之后测量与对照组合物相比(d)中的一个或多个样品的报告分子输出。在一些情况下，对照组合物包含不表达报告分子的微生物。在一些情况下，对照组合物包含表达报告分子的功能缺失变体的微生物。在一些情况下，刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。在一些情况下，刺激是光。在一些情况下，报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。在一些情况下，荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。在一些情况下，荧光蛋白是GFP。在一些情况下，GFP是超折叠GFP。在一些情况下，步骤(d)需要将经接种的组合物暴露于足以使荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。在一些情况下，使用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测荧光。在一些情况下，所述方法还包括分离被鉴定为能够固定大气氮的细菌突变体。在一些情况下，分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。在一些情况下，分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。在一些情况下，分离的细菌突变体包括在glnA中包含遗传变异的细菌。在一些情况下，glnA中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，glnA中的至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，分离的细菌突变体包含glnE中的至少一个遗传变异。在一些情况下，glnE中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，glnE中的至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在一些情况下，包含至少一个遗传变异的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在一些情况下，在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至E取代。在一些情况下，在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至D取代。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些情况下，GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些情况下，启动子或其片段选自nifHDK操纵子。在一些情况下，启动子是nifH启动子。在一些情况下，抑制性固氮调节蛋白是NifL。在一些情况下，正固氮调节蛋白是NifA。在一些情况下，诱变剂选自丝裂霉素C(MMC)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、亚硝酸(NA)、二环氧丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基-2-氯乙基]-氨基丙胺)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)。在一些情况下，诱变剂是EMS。在一些情况下，细菌群体选自野生型细菌、转基因突变细菌、非属间突变细菌和属间突变细菌。
再一方面，本文提供了一种微生物组合物，其包含：一种或多种选自由以下组成的组的分离的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌和保藏为PTA-126726的细菌。在一些情况下，所述组合物还包含农业上可接受的载剂。在一些情况下，一种或多种分离的细菌以高于野生型亲本谱系细菌的速率固定大气氮。
一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含突变glnE基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，突变glnE基因在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含核苷酸取代。在一些情况下，突变glnE基因与克雷伯氏菌属glnE基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，突变glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnE蛋白。在一些情况下，突变glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有氨基酸取代的突变GlnE蛋白。在一些情况下，在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至E取代。在一些情况下，在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至D取代。在一些情况下，突变GlnE蛋白与克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。在一些情况下，突变glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些情况下，突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含编码GlnE蛋白的突变glnE基因，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，GlnE蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处的氨基酸取代。在一些情况下，在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至E取代。在一些情况下，在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G746D取代。在一些情况下，GlnE蛋白与克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些情况下，突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
另一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含突变GlnE蛋白，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，GlnE蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处的氨基酸取代。在一些情况下，在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至E取代。在一些情况下，在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至D取代。在一些情况下，GlnE蛋白与克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些情况下，突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些情况下，固氮细菌是变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)CI4874。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含突变glnA基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，突变glnA基因与克雷伯氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，突变glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnA蛋白。在一些情况下，突变glnA基因的表达产生具有至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的突变GlnA蛋白。在一些情况下，突变GlnA蛋白与克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些情况下，突变glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，突变GlnA蛋白包含选自由SEQID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一个氨基酸取代选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和N339D及在其同源物中的同源位置处的相同氨基酸取代组成的组。在一些情况下，突变GlnA蛋白与克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
另一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一个氨基酸取代选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。在一些情况下，突变GlnA蛋白与克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，固氮细菌选自由变栖克雷伯氏菌CI3296、变栖克雷伯氏菌CI3936、变栖克雷伯氏菌CI3933、变栖克雷伯氏菌CI3927、变栖克雷伯氏菌CI3925、变栖克雷伯氏菌CI3943、变栖克雷伯氏菌CI3940、变栖克雷伯氏菌CI3938、蔗糖科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)CI4065、肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)CI4875、肠内甲烷嗜热杆菌CI4876、肠内甲烷嗜热杆菌CI4877和肠内甲烷嗜热杆菌CI4878组成的组。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含突变glnA基因，所述基因在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，突变glnA基因与副伯克霍尔德氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，突变glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnA蛋白。在一些情况下，突变glnA基因的表达产生具有至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的突变GlnA蛋白。在一些情况下，突变GlnA蛋白与副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些情况下，突变glnA基因包含选自由SEQ IDNO 20-23组成的组的核酸序列。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列。在一些情况下，突变GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一个氨基酸取代选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。在一些情况下，突变GlnA蛋白与副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
一方面，本文提供了一种固氮细菌，其包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一个氨基酸取代选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。在一些情况下，突变GlnA蛋白与副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些情况下，GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。在一些情况下，固氮细菌选自由热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)CI4751、热带副伯克霍尔德氏菌CI4753、热带副伯克霍尔德氏菌CI4879和热带副伯克霍尔德氏菌CI4752组成的组。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。
一方面，本文提供了一种包含固氮细菌和载剂的微生物组合物。在一些情况下，载剂是农业上可接受的载剂。在一些情况下，细菌是经遗传工程化的。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变glnE基因的固氮细菌，所述基因在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含编码GlnE蛋白的突变glnE基因的固氮细菌，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变GlnE蛋白的固氮细菌，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变glnA基因的固氮细菌，所述基因在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因的固氮细菌，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变GlnA蛋白的固氮细菌，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变glnA基因的固氮细菌，所述基因在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因的固氮细菌，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变GlnA蛋白的固氮细菌，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌选自由保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌和保藏为PTA-126726的细菌组成的组。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌选自由变栖克雷伯氏菌CI3296、变栖克雷伯氏菌CI3936、变栖克雷伯氏菌CI3933、变栖克雷伯氏菌CI3927、变栖克雷伯氏菌CI3925、变栖克雷伯氏菌CI3943、变栖克雷伯氏菌CI3940、变栖克雷伯氏菌CI3938、变栖克雷伯氏菌CI4874、蔗糖科萨克氏菌CI4065、肠内甲烷嗜热杆菌CI4875、肠内甲烷嗜热杆菌CI4876、肠内甲烷嗜热杆菌CI4877、肠内甲烷嗜热杆菌CI4878、热带副伯克霍尔德氏菌CI4751、热带副伯克霍尔德氏菌CI4753、热带副伯克霍尔德氏菌CI4879和热带副伯克霍尔德氏菌CI4752组成的组。
另一方面，本文提供了一种向植物提供固定的氮的方法，其包括将微生物组合物施加到植物、植物部分或植物所在的场所或植物将生长的场所，其中所述微生物组合物包含本文提供的固氮细菌中的至少一种。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌选自表6中所见的微生物菌株。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变glnE基因的固氮细菌，所述基因在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含编码GlnE蛋白的突变glnE基因的固氮细菌，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变GlnE蛋白的固氮细菌，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变glnA基因的固氮细菌，所述基因在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因的固氮细菌，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变GlnA蛋白的固氮细菌，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变glnA基因的固氮细菌，所述基因在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因的固氮细菌，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌是包含突变GlnA蛋白的固氮细菌，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌选自由保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌和保藏为PTA-126726的细菌组成的组。在一些情况下，所述至少一种固氮细菌选自由变栖克雷伯氏菌CI3296、变栖克雷伯氏菌CI3936、变栖克雷伯氏菌CI3933、变栖克雷伯氏菌CI3927、变栖克雷伯氏菌CI3925、变栖克雷伯氏菌CI3943、变栖克雷伯氏菌CI3940、变栖克雷伯氏菌CI3938、变栖克雷伯氏菌CI4874、蔗糖科萨克氏菌CI4065、肠内甲烷嗜热杆菌CI4875、肠内甲烷嗜热杆菌CI4876、肠内甲烷嗜热杆菌CI4877、肠内甲烷嗜热杆菌CI4878、热带副伯克霍尔德氏菌CI4751、热带副伯克霍尔德氏菌CI4753、热带副伯克霍尔德氏菌CI4879和热带副伯克霍尔德氏菌CI4752组成的组。在一些情况下，微生物组合物在植物中产生1％或更多的固定的氮。在一些情况下，组合物是固体。在一些情况下，组合物是液体。在一些情况下，施加包括用微生物组合物包被种子或其他植物繁殖构件。在一些情况下，微生物组合物中的至少一种固氮细菌具有至少约1.0×104cfu/克植物根部组织鲜重的平均每单位植物根部组织的定殖能力，并且产生至少约1×10-15mmol N/细菌细胞/小时的固定的N。在一些情况下，施加包括进行微生物组合物的沟内处理。在一些情况下，沟内处理包括以约1×106至约3×1012cfu/英亩的每英亩浓度施加微生物组合物。在一些情况下，微生物组合物是包含约1×106至约1×1011cfu细菌细胞/毫升的液体制剂。
附图说明
图1A-B描绘了用于检测游离铵的存在或不存在的分子电路的图示。T＝终止子，Pcon＝控制nifA和nifL的转录的组成型启动子，PnifH＝控制gfp的转录的启动子(图1A)，在不存在游离铵或低于给定的游离铵浓度阈值的情况下，NifL与NifA解离，NifA反过来作用于可操作地连接至gfp的nifH启动子，从而引起GFP的表达。所述图进一步描绘了分子氮(大气氮，N2)进入固氮细菌并分泌游离氮，所述游离氮被包含分子电路的生物传感器菌株感测到(图1B)。Gln，谷氨酰胺；Glu，谷氨酸盐；2-OG，2-酮戊二酸；GS，谷氨酰胺合成酶；GOGAT，谷氨酸合酶。
图2描绘了在厌氧条件下相对于不能固氮的菌株(每个平板的左侧)表现出固氮生长的野生型变栖克雷伯氏菌菌株(每个平板的右侧)。右侧平板与左侧平板的不同之处在于其含有EDA，EDA抑制变栖克雷伯氏菌137野生型的固氮生长。
图3A-B描绘了在具有0.2％EDA的固体培养基上生长的变栖克雷伯氏菌137菌株(图3A)和在具有100mM甲基铵的固体培养基上生长的热带副伯克霍尔德氏菌8菌株(图3B)。在图3A和图3B中的每一个内，左侧平板铺板有在没有诸如2-氨基嘌呤(2AP)或EMS的诱变剂的情况下孵育的克雷伯氏菌属137或副伯克霍尔德氏菌属8，并且右侧平板铺板有用诱变剂2AP或EMS处理的变栖克雷伯氏菌137或副伯克霍尔德氏菌属8。在存在诸如0.2％EDA或100mM甲基铵的铵类似物的情况下生长的由2AP或EMS化学诱变的菌株在平板上表现出较高的存活率
图4描绘了用EDA突变体的上清液培养的生物传感器菌株的荧光输出，表明EDA突变体将铵分泌到培养基中。
图5A-B描绘了在存在不同浓度的游离铵(图5A)和谷氨酰胺(图5B)的情况下生物传感器菌株的标准化响应曲线和对应的荧光输出。铵和谷氨酰胺的解离常数(Km)分别为约0.5mM和约0.6mM。
图6描绘了包含327种突变变栖克雷伯氏菌菌株的EDA抗性突变体库的作为GFP表达和荧光的结果的荧光范围，以荧光任意单位(au)表示，表明EDA抗性突变体库的大约1/5包含能够以高于137野生型菌株的水平分泌固定的氮的突变体。
图7描绘了与生物传感器共培养的21种变栖克雷伯氏菌EDA抗性突变菌株的作为GFP表达和荧光的结果的nifH启动子活性，以荧光任意单位(au)表示。黑色条表示不存在铵，并且灰色条表示存在铵。在137野生型(左图)中，生物传感器中的nifH启动子在存在铵的情况下被阻遏，而EDA抗性突变体中的许多nifH启动子在存在铵的情况下是有活性的或去阻遏的(右图)。
图8描绘了通过乙炔还原测定评估的20种变栖克雷伯氏菌EDA抗性突变株的固氮酶活性。将乙烯生产用作固氮酶活性的代表。在存在5mM磷酸铵的情况下，所有20种突变菌株都显示出固氮酶活性。
图9描绘了在孵育72小时之后从19种变栖克雷伯氏菌EDA抗性突变菌株中分泌的铵的量。十二(12)种变栖克雷伯氏菌EDA抗性突变株分泌超过20mM的铵。
图10A-B描绘了使用诸如EDA和甲基铵的铵类似物通过随机诱变和选择鉴定的四种不同物种中的铵分泌突变体以及通过全基因组测序鉴定的四种不同物种中GlnA中的突变的大致位置(图10A)。(图10B)，提供了从热带副伯克霍尔德氏菌、肠内甲烷嗜热杆菌和蔗糖科萨克氏菌分泌的铵的量。
图11示出了在实施例6中描述的实验，其中在相对丰度百分比方面，在九种植物中确定了137突变体条形码化的菌株的差异定殖。
具体实施方式
用于构建对肥料中存在的固定的氮具有抗性，同时还表现出改善的铵分泌同时平衡铵同化的微生物产品的开发计划依赖于基于先前鉴定的候选基因和途径的合理方法。在一些司法管辖区，利用异源构建体、基因和载体的传统遗传修饰被认为是遗传修饰的生物体。产生在存在肥料的情况下分泌铵的微生物的随机过程的性质需要分析大型突变体库。然而，利用乙炔还原测定来计量固氮酶活性和铵分泌的主要技术是缓慢且不成规模的。本公开的生物传感器菌株允许以高通量方式分析大型突变体库。
其他共培养方法依赖于共培养菌株的生长来解决氮水平的问题。在固氮条件下生物质量的增加通常显示几乎没有变化，并且由于测定条件的厌氧性质，在任何生长发生之前需要很长的孵育时间。这种定性输出必然排除高通量选择过程。
虽然相信本领域技术人员或普通技术人员可以很好地理解以下术语，但阐述以下定义以促进对当前公开的主题的解释。在不偏离本公开的情况下本领域技术人员可能会想到各种变型、变化和替换。应当理解，可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。
定义
在描述本公开的上下文中(尤其在随附权利要求书的上下文中)使用术语“一个/种(a/an)”和“所述”以及类似的提及物应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文中另外指明或与上下文明显相矛盾。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指明，否则本文中对值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值被并入本说明书中，就如同其在本文中被单独叙述一样。例如，如果公开了范围10-15，则还公开了11、12、13和14。除非本文中另外指明或以其他方式明显与上下文矛盾，否则本文中描述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，而不是对另外要求保护的本公开的范围构成限制。本说明书中的语言不应解释为指明实践本公开所必需的任何未要求保护的要素。
如本文所用，术语“约”与术语“大约”同义使用。说明性地，使用关于量的术语“约”表示略微超出所引用值的值，例如±0.1％至10％。
贯穿本说明书提及“一个实施方案”、“实施方案”、“一方面”或“方面”意指结合实施方案描述的特定的特征、结构或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书在不同位置出现短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”未必全部指同一个实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定的特征、结构或特性可以任何合适的方式组合。
本公开的肥料和外源氮可以包含以下含氮分子：铵、硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酰胺等。本公开的氮源可以包括无水氨、硫酸铵、尿素、磷酸二铵、尿素-形式、磷酸一铵、硝酸铵、氮溶液、硝酸钙、硝酸钾、硝酸钠等。
如本文所用，“外源氮”是指在非氮限制条件下存在的土壤、田地或生长培养基中容易得到的非大气氮，包括氨、铵、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、尿酸、铵酸等。
如本文所用，“非氮限制条件”是指在土壤、田地和培养基中可以大于约4mM氮的浓度得到的非大气氮，如Kant等人(2010.J.Exp.Biol.62(4):1499-1509)所公开，其以引用的方式并入本文中。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以进行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含一种或多种修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可以在聚合物组装之前或之后赋予核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以间杂有非核苷酸组分。聚合之后可以诸如通过与标记组分缀合进一步修饰多核苷酸。
如本文所用，“控制序列”是指操纵子、启动子、沉默子或终止子。
如本文所用，“引入”是指通过现代生物技术手段引入，而不是自然发生的引入。
如本文所用，“引入的遗传物质”意指添加到受体基因组并作为其组分保留的遗传物质。
在一些实施方案中，本公开的基因的天然或内源控制序列由一个或多个属内控制序列置换。
如本文所用，“组成型启动子”是在大多数条件下和/或在大多数发育阶段期间具有活性的启动子。在生物技术中使用的表达载体中使用组成型启动子有若干个优点，诸如：用于选择转基因细胞或生物体的蛋白质的高水平产生；报告蛋白或可评分标记物的高水平表达，易于检测和定量；作为调节转录系统的部分的转录因子的高水平产生；在生物体中需要遍在活性的化合物的产生；以及所有发育阶段期间需要的化合物的产生。非限制性的示例性组成型启动子包括CaMV 35S启动子、冠瘿碱(opine)启动子、泛素启动子、醇脱氢酶启动子等。
如本文所用，“非组成型启动子”是在某些条件下、在某些类型细胞中和/或在某些发育阶段期间有活性的启动子。例如，组织特异性的、组织优选的、细胞类型特异性的、细胞类型优选的诱导型启动子和处于发育控制下的启动子是非组成型启动子。处于发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织中启动转录的启动子。
如本文所用，“诱导型”或“可阻遏型”启动子是在化学或环境因素控制下的启动子。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、某些化学品、光的存在、酸性或碱性条件等。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一个核酸序列的功能由另一个调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制下)时，启动子与所述编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接至调节序列。在另一个实例中，本公开的互补RNA区可以直接或间接地可操作地连接至靶mRNA的5'、或靶mRNA的3'、或靶mRNA内，或者第一互补区是靶mRNA的5'，而其互补序列位于靶mRNA的3'。
如本文所用，“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片段的人工组合，例如自然界中未一起存在的调控序列和编码序列。例如，嵌合构建体可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或源自相同来源但以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。这类构建体可以自身使用或者可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法，如本领域技术人员熟知的。例如，可以使用质粒载体。技术人员非常清楚为了成功转化、选择和繁殖包含本公开的分离的核酸片段中的任一种的宿主细胞，在载体上必须存在遗传元件。技术人员还将认识到不同的独立转化事件将引起不同的表达水平和模式(Jones等人，(1985)EMBO J.4:2411-2418；De Almeida等人，(1989)Mol.Gen.Genetics 218:78-86)，因此必须筛选多个事件以获得展示所需表达水平和模式的种系。此种筛选可以通过DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析等来完成。载体可以是质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等，它们自主复制或可以整合到宿主细胞的染色体中。载体也可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一链内的DNA和RNA两者组成的多核苷酸、多聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等，它们不能自主复制。如本文所用，术语“表达”是指例如mRNA或蛋白质(前体或成熟)的功能性终产物的产生。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以间杂有非氨基酸。所述术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵，诸如与标记组分缀合。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸及D或L旋光异构体两者，以及氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文所用，术语“微生物(microorganism)”或“微生物(microbe)”应被广义地采用。这些术语可互换使用，包括但不限于两个原核域，细菌域和古菌域。所述术语还可以涵盖真核真菌和原生生物。
如本文所用，“分离”、“分离的”、“分离的微生物”等术语旨在意指一种或多种微生物已经与在特定环境(例如土壤、水、植物组织等)中与其相关联的至少一种物质分离。因此，“分离的微生物”在其天然存在的环境中并不存在；而是通过本文所述的各种技术，微生物已从其天然环境中移出并处于非天然存在的状态。因此，分离的菌株或分离的微生物可以作为例如生物学上纯的培养物存在，或作为孢子(或其他形式的菌株)存在。在各个方面，分离的微生物可以与可接受的载剂缔合，所述载剂可以是农业上可接受的载剂。
在本公开的某些方面，分离的微生物作为“分离的和生物学上纯的培养物”存在。本领域技术人员将会理解，特定微生物的分离的和生物学上纯的培养物表示所述培养物基本上不含其他活生物体，而是仅含有所讨论的单个微生物。培养物可以含有不同浓度的所述微生物。本公开指出，分离的和生物学上纯的微生物通常“必然不同于较不纯的或不纯的物质”。参见，例如In re Bergstrom,427F.2d 1394,(CCPA 1970)(讨论纯化的前列腺素)，还参见In re Bergy,596 F.2d 952(CCPA 1979)(讨论纯化的微生物)，还参见Parke-Davis和Co.v.H.K.Mulford和Co.,189F.95(S.D.N.Y.1911)(作者讨论纯化的肾上腺素)，部分增补，部分修订，196F.496(2d Cir.1912)，其各自以引用的方式并入本文。此外，在一些方面，本公开提供了在分离的和生物学上纯的微生物培养物内必定存在的浓度或纯度限制的某些定量测量。在某些实施方案中，这些纯度值的存在是将目前公开的微生物与以天然状态存在的那些微生物区分开的另一属性。参见，例如Merck和Co.v.Olin Mathieson ChemicalCorp.,253 F.2d 156(4th Cir.1958)(讨论由微生物产生的维生素B12的纯度限制)，其以引用的方式并入本文。
术语“生物学上纯的培养物”或“基本上纯的培养物”是指本文所述的细菌物种的培养物，其不含足以干扰培养物的复制或者通过正常的细菌学技术检测到的量的其他细菌物种。
在一些实施方案中，本公开的微生物已被修饰，使得它们不是天然存在的细菌。
如本文所用，“属间微生物”是通过有意组合由最初从不同分类学属的生物体中分离的遗传物质而形成的微生物。“属间突变体”可以与“属间微生物”互换使用。示例性的“属间微生物”包括含有首先不同于受体微生物的属中的微生物中鉴定的移动遗传元件的微生物。进一步的解释尤其可见于40CFR§725.3中。
在一些方面，本文教导的微生物是“非属间的”，这意味着微生物不是属间的。
“非属间改造的微生物”与“非属间工程化的微生物”具有同义含义，并且将互换使用。
本公开的微生物可以包括孢子和/或营养细胞。在一些实施方案中，本公开的微生物包括处于活的非可培养(VBNC)状态的微生物。如本文所用，“孢子(spore或spores)”是指由适于存活和传播的细菌和真菌产生的结构。孢子通常表征为休眠结构；然而，孢子能够在萌发过程中分化。萌发是孢子分化成能够代谢活性、生长和繁殖的营养细胞中。单一孢子的萌发产生单一真菌或细菌营养细胞。真菌孢子是无性繁殖的单位，并且在一些情况下是真菌生命周期中的必要结构。细菌孢子是存活条件的结构，其通常可能无益于营养细胞的存活或生长。
如本文所用，“微生物组合物”是指包含一种或多种本公开的微生物的组合物。在一些实施方案中，将微生物组合物施用到植物(包括各种植物部分)和/或农田。
如本文所用，“载剂”、“可接受的载剂”或“农业上可接受的载剂”是指可以与微生物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，其不会对微生物造成不利影响。
如本文所用，“植物部分”是指植物的任何部分，诸如种子、根部、茎、组织等。
在一些实施方案中，固氮和同化遗传调节网络包含多核苷酸编码基因和非编码序列，其指导、调控和/或调节微生物固氮和/或同化并且可以包含nif簇(例如，nifA、nifB、nifC、……nifZ)的多核苷酸序列、编码氮调节蛋白C的多核苷酸、编码氮调节蛋白B的多核苷酸、gln簇(例如glnA和glnD)的多核苷酸序列、draT和氨转运蛋白/渗透酶。在一些情况下，Nif簇可以包括NifB、NifH、NifD、NifK、NifE、NifN、NifX、hesa和NifV。在一些情况下，Nif簇可以包括NifB、NifH、NifD、NifK、NifE、NifN、NifX、hesa和NifV的子集。
在一些实施方案中，相对于未暴露于本公开的微生物的对照微生物，测量微生物中固氮的增加和/或微生物或含有微生物的培养基中1％或更多的氮的产生。微生物的所有增加或减少都是相对于对照微生物测量的。
在一些实施方案中，相对于不表达报告基因或不表达其功能缺失变体的对照微生物，测量微生物或含有微生物的培养基中报告基因(诸如gfp)输出的增加或减少。微生物中所有报告基因的增加或减少都是相对于对照微生物测量的。
固氮的调节
为了利用元素氮(N)进行化学合成，生命形式在称为固氮的过程中将可在大气中得到的氮气(N2)转化为氨。由于生物固氮的能量密集型性质，固氮生物(diazotroph)(固定大气氮气的细菌和古细菌)已进化出响应环境氧和可用氮对nif基因簇的精密且严格的调节。Nif基因编码固氮中所涉及的酶(诸如固氮酶复合物)和调节固氮的蛋白质。Shamseldin(2013.Global J.Biotechnol.Biochem.8(4):84-94)公开了nif基因及其产物的详细描述，并且以引用的方式并入本文。
在变形菌门(Proteobacteria)中，固氮调节围绕σ54依赖性增强子结合蛋白NifA，即nif簇的正转录调节子为中心。活性NifA的细胞内水平受两个关键因素控制：nifLA操纵子的转录和通过与NifL的蛋白质-蛋白质相互作用对NifA活性的抑制。这两个过程都经由PII蛋白信号级联响应于细胞内谷氨酰胺水平。这种级联由GlnD介导，GlnD直接感测谷氨酰胺并且分别响应结合的谷氨酰胺的存在或不存在而催化两种PII调节蛋白(GlnB和GlnK)的尿苷酰化或去尿苷酰化。在氮过量的条件下，未修饰的GlnB发出nifLA启动子失活的信号。然而，在氮限制的条件下，GlnB被翻译后修饰，这抑制了其活性并且导致nifLA操纵子的转录。以此方式，经由PII蛋白信号级联，响应于环境氮而严格控制nifLA转录。在NifA调节的翻译后水平上，GlnK以依赖于细胞内游离GlnK的总体水平的方式来抑制NifL/NifA相互作用。
NifA由nifLA操纵子转录，其启动子由磷酸化NtrC(另一种σ54依赖性调节子)激活。NtrC的磷酸化状态由组氨酸激酶NtrB介导，NtrB与去尿苷酰化GlnB相互作用，但不与尿苷酰化GlnB相互作用。在氮过量的条件下，谷氨酰胺的高细胞内水平导致GlnB的去尿苷酰化，然后GlnB与NtrB相互作用以使其磷酸化活性失活并激活其磷酸酶活性，从而引起NtrC的去磷酸化和nifLA启动子的失活。然而，在氮限制的条件下，低水平的细胞内谷氨酰胺引起GlnB的尿苷酰化，这抑制GlnB与NtrB的相互作用，并且允许NtrC的磷酸化和nifLA操纵子的转录。以此方式，经由PII蛋白信号级联，响应于环境氮而严格控制nifLA表达。nifA、ntrB、ntrC和glnB是可以在本文所述的方法中突变的所有基因。这些过程也可能响应于氨、尿素或硝酸盐的细胞内或细胞外水平。
虽然一些内生菌具有在体外固氮的能力，但遗传学通常在田地中被高水平的外源化肥沉默。可以将外源氮的感测与固氮酶的表达解除联系，以促进基于田地的固氮。改善固氮酶活性随时间的积分进一步有助于增加氮产生，以供作物利用。使用本文所述的方法促进基于田地的固氮的遗传变异的具体靶标包括一种或多种选自由以下组成的组的基因：nifA、nifL、ntrB、ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。
使用本文所述的方法促进基于田地的固氮的遗传变异的另一靶标是NifA蛋白。NifA蛋白典型地是固氮基因表达的激活子。增加NifA产生(组成型地或在高氨条件期间)避开天然氨感测途径。另外，减少NifL蛋白(已知的NifA的抑制剂)产生也导致游离活性NifA水平增加。另外，增加nifLA操纵子的转录水平(组成型地或在高氨条件期间)也导致NifA蛋白总体较高的水平。通过改变启动子本身或通过降低NtrB(最初会引起高氮条件期间nifLA操纵子关闭的ntrB和ntrC信号级联的一部分)的表达来实现nifLA表达的升高水平。通过本文所述的这些或任何其他方法实现的NifA的高水平增加内生菌的固氮活性。
生物传感器
本公开的生物传感器微生物能够基于共培养系统筛选泌铵微生物。生物传感器的使用具有明显的优势，包括：(i)可以通过在液体培养物中以及在固体培养基上生物传感器的荧光检测来观察自突变体库的铵分泌；(ii)可以用生物传感器菌株分析将大气氮固定为铵的突变体的细胞内氮水平；(iii)因为生物传感器利用由共培养库固定的铵，所以此系统更适合微生物在没有人工铵积累的情况下驻留的田地环境。
在一些方面，生物传感器包含充当电路的异源序列。参见图1A-B。在一些方面，所述电路包含编码在启动子控制下的抑制性固氮调节蛋白的核酸序列和编码在启动子控制下的正固氮调节蛋白的核酸序列两者。在一些方面，编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列和编码正固氮调节蛋白的核酸序列各自处于组成型启动子的控制下。在一些方面，编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列和编码正固氮调节蛋白的核酸序列作为在组成型启动子控制下的操纵子存在。在一些方面，编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列和编码正固氮调节蛋白的核酸序列的转录方向各自在与电路的一个或多个其他元件的转录相反的方向上。在一些方面，包含编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列和编码正固氮调节蛋白的核酸序列的操纵子的转录方向在与电路的一个或多个其他元件的转录相反的方向上。在一些方面，所述电路包含在启动子控制下的nifLA操纵子。在一些方面，nifLA操纵子处于组成型启动子的控制下。在一些方面，nifLA操纵子的转录方向在与电路的一个或多个其他元件的转录相反的方向上。在一些方面，所述电路包含编码荧光蛋白或其功能片段和/或融合物、或另一种报告蛋白或分子的核苷酸序列。在一些方面，编码报告蛋白的核苷酸序列处于启动子和终止子的控制下。在一些方面，编码荧光蛋白的核苷酸序列处于启动子和终止子的控制下。在一些方面，报告蛋白可操作地连接至选自Nif调节子的启动子或其片段或处于其控制下。在一些方面，荧光蛋白可操作地连接至选自Nif调节子的启动子或其片段或处于其控制下。在一些方面，报告蛋白可操作地连接至选自nifHDK操纵子的启动子或其片段或处于其控制下。在一些方面，荧光蛋白可操作地连接至选自nifHDK操纵子的启动子或其片段或处于其控制下。在一些方面，报告蛋白可操作地连接至nifH启动子或处于其控制下。在一些方面，荧光蛋白可操作地连接至nifH启动子或处于其控制下。在一些方面，报告蛋白的转录方向在与电路的一个或多个其他元件的转录相反的方向上。在一些方面，荧光蛋白的转录方向在与电路的一个或多个其他元件的转录相反的方向上。在一些方面，电路包含一个或多个组成型启动子。在一些方面，电路包含一个或多个终止子。
在一些方面，编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列是编码NifL的nifL基因。在一些方面，编码正固氮调节蛋白的核酸序列是编码NifA的nifA基因。在一些方面，在存在游离铵或谷氨酰胺的情况下，NifL与NifA结合。在一些方面，在不存在游离铵或谷氨酰胺的情况下，NifL不与NifA结合。在一些方面，未结合的NifA作用于nifH启动子以启动报告蛋白(例如，GFP)的转录和表达。在一些方面，在存在游离铵或谷氨酰胺的情况下，包含所述电路的微生物不表达可检测量的报告蛋白(例如，GFP)。在一些方面，在不存在游离铵或谷氨酰胺的情况下，包含所述电路的微生物表达可检测量的报告蛋白(例如，GFP)。
在一些方面，诸如报告蛋白、分子或酶的报告元件由生物传感器产生或表达。报告蛋白响应于活的工程化的生物传感器的细胞质中的某些预定变化而发出可检测的信号。在一些方面，报告蛋白是生物发光光蛋白，诸如水母发光蛋白，其源自水螅类维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)。在一些方面，然后生物传感器细胞内报告蛋白的产生将通过引入的遗传物质的表达来控制。在一些方面，其他光蛋白或其他类型的报告蛋白、酶和分子可以并入本公开的各种替代实施方案中并且与本公开的各种替代实施方案一起使用。
在一些方面，报告子可以是具有响应于生物传感器电路的激活而经历可检测变化的荧光特性的蛋白质。在一些方面，报告子或报告蛋白可以是钙敏感的发光或荧光分子，诸如obelin、thalassicolin、mitrocomin(halistaurin)、clytin(phialidin)、mnemopsin、berovin、Indo-1、Fura-2、Quin-2、Fluo-3、Rhod-2、钙绿、BAPTA、cameleons或类似分子。在一些方面，报告蛋白可以是包括Ca'结合结构域和相关荧光蛋白的嵌合蛋白。在一些方面，报告子可以是适于产生发光或荧光信号的酶。在一些方面，报告蛋白可以是酶，诸如分别产生发光或荧光信号的荧光素酶或碱性磷酸酶。在一些方面，报告子还可以是荧光蛋白或可以包括荧光、带电或磁性纳米颗粒、纳米点或量子点。在一些方面，报告子可以是具有荧光、紫外线或可见光特性的染料，其中荧光、紫外线或可见光特性响应于生物传感器电路的激活而经历可检测的变化。
在一些方面，报告基因是荧光报告基因。在一些方面，荧光报告基因编码荧光蛋白。在一些方面，荧光报告基因编码水母发光蛋白。在一些方面，荧光蛋白选自远红外类别荧光蛋白。在一些方面，远红外荧光蛋白是mPlum或其变体。
在一些方面，荧光蛋白选自红色类别荧光蛋白。在一些方面，红色荧光蛋白选自RFP、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed-单体或其变体。在一些方面，荧光蛋白选自橙色类别荧光蛋白。在一些方面，橙色荧光蛋白选自OFP、mOrange、mKO或其变体。
在一些方面，荧光蛋白选自黄绿色类别荧光蛋白。在一些方面，黄绿色荧光蛋白选自YFP、mCitrine、Venus、YPet、EYFP或其变体。
在一些方面，荧光蛋白选自绿色类别荧光蛋白。在一些方面，绿色荧光蛋白选自GFP、EGFP、Emerald或其变体。在一些方面，荧光蛋白选自青色类别荧光蛋白。在一些方面，青色荧光蛋白选自Cypet、mCFPm、Cerulean、CFP或其变体。在一些方面，荧光蛋白选自UV可激发的绿色类别荧光蛋白。在一些方面，UV可激发的绿色荧光蛋白选自T-sapphire。在一个实施方案中，GFP是超折叠GFP。
在一些方面，报告基因可操作地连接至来自Nif调节子的启动子或其片段。启动子选自nifRLA操纵子、nifHDK操纵子、nifEN操纵子、nifBQ操纵子、nifJ操纵子、nifUSVM操纵子或nifWF操纵子。在一些方面，启动子选自nifHDK操纵子。在一些方面，启动子选自nifH。
在一些方面，修饰nifL的氧传感器，使得氧的存在不会改变NifL在其氧化形式或还原形式之间的构象形状。在一些方面，修饰nifA和/或nifL基因，使得氧的浓度对NifA激活控制生物传感器电路中报告基因的转录的启动子的能力没有影响。在一些方面，修饰nifA和/或nifL基因，使得氧的浓度对NifA激活nifH启动子的能力没有影响。
在一些方面，生物传感器电路中利用的nifA基因和nifL基因从下列属的物种中分离：克雷伯氏菌属、科萨克氏菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、拉恩氏菌属(Rahnella)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、迪克氏菌属(Dickeya)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、船蛆杆菌属(Teredinibacter)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基原卵菌属(Methylovulum)、硫囊菌属(Thiocystis)、硫网菌属(Thiodictyon)、硫黄球菌属(Thioflavicoccus)、水螺菌属(Aquaspirillum)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、固氮弓菌属(Azoarcus)和沃廉氏菌属(Wolinella)。在一些方面，生物传感器电路中利用的nifA基因和nifL基因从肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)或动物胶科(Zoogloeaceae)内的任何物种中分离。在一些方面，nifA选自所列属的一个物种，并且nifL选自所列属的不同物种。在一些方面，nifA选自所列属的物种，并且nifL选自与nifA不同的属的物种。
在一些方面，生物传感器电路中利用的nifH启动子从下列属的物种中分离：克雷伯氏菌属、科萨克氏菌属、沙雷氏菌属、拉恩氏菌属、果胶杆菌属、迪克氏菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、船蛆杆菌属、甲基单胞菌属、甲基原卵菌属、硫囊菌属、硫网菌属、硫黄球菌属、水螺菌属、脱氯单胞菌属、固氮弓菌属和沃廉氏菌属。在一些方面，生物传感器电路中利用的nifH启动子从肠杆菌科、红环菌科或动物胶科内的任何物种中分离。
在一些方面，nifH启动子以及nifL基因和nifA基因各自从相同属内的不同物种中分离。在一些方面，nifH启动子以及nifL基因和nifA基因各自从不同的细菌属中分离。在一些方面，nifH启动子以及nifL基因和nifA基因各自从相同物种中分离。
在一些方面，nifH启动子、nifL基因和nifA基因各自从克雷伯氏菌属的物种中分离。在一些方面，nifH启动子、nifL基因和nifA基因中的至少一种从克雷伯氏菌属的物种中分离。
在一些方面，nifH启动子、nifL基因和nifA基因各自从科萨克氏菌属的物种中分离。在一些方面，nifH启动子、nifL基因和nifA基因中的至少一种从科萨克氏菌属的物种中分离。
在一些方面，nifH启动子、nifL基因和nifA基因各自从固氮菌属的物种中分离。在一些方面，nifH启动子、nifL基因和nifA基因中的至少一种从固氮菌属的物种中分离。
在一些方面，控制编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列和/或编码正固氮调节蛋白的核酸序列的组成型启动子选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一些方面，控制nifLA的组成型启动子选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。在一些方面，组成型启动子选自大肠杆菌组成型启动子。在一些方面，组成型启动子是组成型σ70启动子。在一些方面，组成型启动子是组成型σS启动子。在一些情况下，组成型启动子是组成型σ32启动子。在一些情况下，组成型启动子是组成型σ54启动子。在一些方面，组成型启动子选自枯草芽孢杆菌组成型启动子。在一些情况下，组成型启动子是组成型σA启动子。在一些情况下，组成型启动子是组成型σB启动子。
在一些方面，所述一种或多种转录终止子选自rho非依赖性终止子和rho依赖性终止子。在一些方面，所述一种或多种转录终止子选自任何一种或多种细菌终止子。在一些方面，生物传感器电路包含两个或更多个转录终止子。在一些方面，所述两个或更多个转录终止子来自不同物种。在一些方面，所述两个或更多个转录终止子来自相同属。在一些方面，所述两个或更多个转录终止子来自不同属。
在一些方面，生物传感器是原核细胞或真核细胞。在一些方面，生物传感器是酵母或真菌细胞。在一些方面，生物传感器是昆虫细胞、哺乳动物细胞、动物细胞、植物细胞或细菌细胞。在一些方面，生物传感器是固定的细胞。在一些方面，生物传感器是人造细胞。在一些方面，生物传感器是合成细胞。在一些方面，昆虫细胞是sf9细胞或果蝇(Drosophila)施耐德2细胞。在一些方面，哺乳动物细胞是HEK细胞、CHO细胞、COS细胞、3t3细胞或其他培养的、永生化的或传代的哺乳动物细胞。在一些方面，酵母或真菌细胞是酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)或念珠菌属(Candida)细胞。
在一些方面，细菌细胞是下列分类群中的一种或多种的物种：无色杆菌属(Achromobacter)、嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、食酸菌属(Acidovoraz)、不动杆菌属(Acinetobacter)、游动放线菌属(Actinoplanes)、阿德勒菌属(Adlercreutzia)、气球菌属(Aerococcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、阿波菲菌属(Afipia)、壤霉菌属(Agromyces)、曲杆菌属(Ancylobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、奇杆菌属(Atopostipes)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、包西氏菌属(Bosea)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、暂定属盐重构菌属(Candidatus Haloredivivus)、柄杆菌属(Caulobacter)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、珊瑚珍珠菌属(Coraliomargarita)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短小杆菌属(Curtobacterium)、弯曲杆菌属(Curvibacter)、异常球菌属(Deinococcus)、代尔夫特菌属(Delftia)、德库菌属(Desemzia)、德沃斯氏菌属(Devosia)、独岛菌属(Dokdonella)、戴氏菌属(Dyella)、栖水菌属(Enhydrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、埃希氏菌属/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、铁球菌属(Ferroglobus)、丝状单胞菌属(Filimonas)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、黄壤杆菌属(Flavisolibacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、冰冻小杆菌属(Frigoribacterium)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、盐棒杆菌属(Halobaculum)、盐单胞菌属(Halomonas)、盐简菌属(Halosimplex)、草螺菌属(Herbaspirillum)、薄层菌属(Hymenobacter)、克雷伯氏菌属、考克氏菌属(Kocuria)、科萨克氏菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)、勒克氏菌属(Leclercia)、伦茨氏菌属(Lentzea)、藤黄杆菌属(Luteibacter)、藤黄单胞菌属(Luteimonas)、马赛菌属(Massilia)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲烷嗜热杆菌、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、微枝形杆菌属(Microvirga)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、诺卡氏菌属(Nocardia)、大洋杆菌属(Oceanibaculum)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、奥卡杆菌属(Okibacterium)、寡养菌属(Oligotropha)、稻土菌属(Oryzihumus)、嗜草酸菌属(Oxalophagus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Panteoa/Pantoea)、副伯克霍尔德氏菌、泥单胞菌属(Pelomonas)、透明球菌属(Perlucidibaca)、植物杆菌属(Plantibacter)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、产丙酸棒形菌属(Propioniciclava)、假棒形杆菌属(Pseudoclavibacter)、假单胞菌属、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、拉恩氏菌属、雷尔氏菌属(Ralstonia)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、根瘤菌属、红球菌属、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、玫瑰色不完全光合菌属(Roseateles)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、塞巴鲁德氏菌属(Sebaldella)、沉积物杆菌属(Sediminibacillus)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、申氏杆菌属(Shinella)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、中华孢囊菌属(Sinosporangium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、鞘氨醇细胞菌属(Sphingosinicella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、寡养单胞菌属(Strenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属、憎叶菌属(Stygiolobus)、硫磺球形菌属(Sulfurisphaera)、塔特姆氏菌属(Tatumella)、温单胞菌属(Tepidimonas)、热单胞菌属(Thermomonas)、硫杆菌属(Thiobacillus)、贪噬菌属(Variovorax)、WPS-2属地位未定(genera incertae sedis)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和齐默尔曼氏菌属(Zimmermannella)。
在一些方面，细菌细胞是下列分类群中的一种或多种的物种：放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、嗜酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、嗜酸芽孢杆菌(Bacillus acidoterrestris)、土壤芽胞杆菌(Bacillus agri)、亚莎华芽孢杆菌(Bacillus aizawai)、白色芽孢杆菌(Bacillus albolactis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、短小芽孢杆菌(Bacillusaminoglucosidicus)、噬胺芽胞杆菌(Bacillus aminovorans)、溶淀粉杆菌(Bacillusamylolyticus)(也称为溶淀粉类芽胞杆菌(Paenibacillus amylolyticus))、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、解硫胺素芽胞杆菌(Bacillus aneurinolyticus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、产氮芽胞杆菌(Bacillus azotoformans)、栗褐芽胞杆菌(Bacillus badius)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(同义词：内生藻芽孢杆菌(Bacillus endorhythmos)、水母芽孢杆菌(Bacillus medusa))、角质孢子芽孢杆菌(Bacillus chitinosporus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、体内寄生虫芽孢杆菌(Bacillus endoparasiticus)、苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、库斯塔克芽孢杆菌(Bacillus kurstaki)、栖乳芽孢杆菌(Bacillus lacticola)、乳病芽孢杆菌(Bacilluslactimorbus)、乳杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)(也称为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus))、灿烂芽胞杆菌(Bacillus lautus)、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、摩洛哥芽孢杆菌(Bacillus maroccanus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、Bacillus metiens、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、食线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocida)、致黑芽孢杆菌(Bacillus nigrificans)、黑色芽孢杆菌(Bacillus nigrum)、泛酸芽孢杆菌(Bacilluspantothenticus)、金龟子芽孢杆菌(Bacillus popillae)、冷解糖芽胞杆菌(Bacilluspsychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)、史密斯芽胞杆菌(Bacillus smithii)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)、单鞭毛芽孢杆菌(Bacillus uniflagellatus)、慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)(以前称为侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus))、铁杉下色杆菌(Chromobacterium subtsugae)、食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)、大肠杆菌、变栖克雷伯氏菌、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)、产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、蒲黄类芽孢杆菌属(Paenibacillus popilliae)(以前称为乳状芽孢杆菌(Bacillus popilliae))、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、穿刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)(以前称为穿刺芽孢杆菌(Bacillus penetrans))、杀虫剂巴斯德氏芽菌(Pasteuria usgae)、胡萝卜软腐病果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)(以前称为胡萝卜软腐病欧文氏菌(Erwiniacarotovora))、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、致黄假单胞菌(Pseudomonasaureofaciens)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(以前称为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas proradix、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、嗜虫沙雷氏菌(Serratiaentomophila)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、哥伦比亚链霉菌(Streptomycescolombiensis)、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)、高氏链霉菌(Streptomycesgoshikiensis)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、普拉斯链霉菌(Streptomyces prasinus)、萨腊赛链霉菌(Streptomyces saraceticus)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、发光致病杆菌(Xenorhabdus luminescens)和嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)。在一些情况下，细菌可以是褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、肺炎克雷伯氏菌、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、球形红细菌(Rhodobacter spharoides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红细菌(Rhodobcter palustris)、深红红螺菌(Rhodosporillum rubrum)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)。
在一些方面，需要对细胞进行遗传操纵以产生生物传感器。对细胞进行遗传操纵和修饰以产生生物传感器通常涉及使用适当选择的遗传递送媒介物，其在选择的细胞类型中有效发挥作用。在一些方面，可以利用基因递送媒介物，例如像细菌质粒载体或病毒载体，用于将适当的遗传物质引入生物传感器细胞中。
在一些方面，利用指导引入的遗传元件在选择的生物传感器细胞中的高水平表达的启动子元件是可用的。在一些方面，启动子元件直接源自生物传感器细胞本身，然后用于由生物传感器电路表达一种或多种目标基因。在一些方面，可以使用诸如电穿孔、转染等标准技术将生物传感器电路引入生物传感器细胞中。本领域技术人员或普通技术人员已知的其他遗传工程方法也与本公开兼容。
在一些方面，生物传感器表现出高协同性，这意味着生物传感器对铵具有窄响应范围。在一些情况下，如果铵的浓度或量超出生物传感器的窄响应范围，所述生物传感器表现出开启信号(高报告蛋白，例如，GFP)或关闭信号(无报告蛋白，例如，GFP)。在一些方面，阳性对照的铵水平可以通过以下来量化：来自响应曲线的约1.4mM(0.7mM*2，来自2倍稀释(x0.5))。在一些方面，当将培养基稀释四(4)倍(x0.25)时，对于产生高报告蛋白(例如，GFP)信号的生物传感器，铵水平为约0.35mM。在报告蛋白是荧光蛋白的实施方案中，可以通过施加足以使荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发来检测报告蛋白。在报告蛋白是荧光蛋白的实施方案中，可以用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选来检测荧光。
在一些方面，非生物传感器微生物在培养基中生长，然后从培养基中去除非生物传感器微生物。在一些方面，所得培养基基本上不含非生物传感器微生物。在一些方面，将一种或多种生物传感器添加到基本上不含非生物传感器微生物的培养基中。
在一些方面，非生物传感器微生物在培养基中生长并且将培养基用缓冲溶液或培养基稀释。在一些方面，培养基以至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500、1:4000、1:4500、1:5000、1:5500、1:6000、1:6500、1:7000、1:7500、1:8000、1:8500、1:9000、1:9500或1:10000稀释。在一些方面，在稀释之前从培养基中去除非生物传感器微生物，使得培养基基本上不含非生物传感器微生物。在一些方面，将一种或多种生物传感器添加到稀释的培养基中。在一些方面，将一种或多种生物传感器添加到基本上不含非生物传感器微生物的培养基中。在一些方面，将一种或多种生物传感器添加到基本上不含非生物传感器微生物的稀释的培养基中。
在一些方面，由于一种或多种生物传感器在其中操作的响应曲线，在添加一种或多种生物传感器之前稀释培养基。
在一些方面，修饰生物传感器菌株的铵转运蛋白。在一些方面，修饰生物传感器菌株的铵转运蛋白的调节序列。在一些方面，修饰引起对铵转运蛋白表达的调控。在一些方面，所述调控是铵转运蛋白表达的增加。在一些方面，所述调控是铵转运蛋白表达的降低。在一些方面，所述调控引起生物传感器菌株中铵和/或谷氨酰胺响应曲线的变化。在一些方面，铵和/或谷氨酰胺响应曲线的这种变化使得生物传感器菌株能够有效地指示放置生物传感器菌株的培养基中铵和/或谷氨酰胺的存在或不存在。在一些方面，氨转运蛋白是AmtB。
在一些方面，稀释在培养基中生长的非生物传感器微生物，使得稀释的培养基包含至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018个生物传感器微生物。
细菌
可用于本文公开的方法和组合物中的微生物可以从任何来源获得。在一些方面，微生物可以是细菌、古细菌、原生动物或真菌。本公开的微生物可以是固氮微生物，例如固氮细菌、固氮古细菌、固氮真菌、固氮酵母或固氮原生动物。可用于本文公开的方法和组合物中的微生物可以是产孢子微生物，例如产孢子细菌。在一些方面，可用于本文公开的方法和组合物的细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。在一些方面，细菌可以是厚壁菌门(Firmicute phylum)的产内生孢子细菌。在一些方面，细菌可以是固氮生物。在一些方面，细菌可能不是固氮生物。
本公开的方法和组合物可以与例如像嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacterthermoautotrophicus)的古细菌一起使用。
在一些方面，可用于本文公开的方法和组合物中的细菌可以是下列分类群中的一个或多个的物种：无色杆菌属、嗜酸硫杆菌属、食酸菌属、食酸菌属、不动杆菌属、游动放线菌属、阿德勒菌属、气球菌属、气单胞菌属、阿波菲菌属、壤霉菌属、曲杆菌属、节杆菌属、奇杆菌属、固氮螺菌属、芽孢杆菌属、蛭弧菌属、拜叶林克氏菌属、包西氏菌属、慢生根瘤菌属、短芽孢杆菌属、短波单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、候选属盐重构菌属、柄杆菌属、纤维单胞菌属、纤维弧菌属、金黄杆菌属、柠檬酸杆菌属、梭菌属、珊瑚珍珠菌属、棒状杆菌属、贪铜菌属、短小杆菌属、弯曲杆菌属、异常球菌属、代尔夫特菌属、德库菌属、德沃斯氏菌属、独岛菌属、戴氏菌属、栖水菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、埃希氏菌属/志贺氏菌属、微小杆菌属、铁球菌属、丝状单胞菌属、芬戈尔德菌属、黄壤杆菌属、黄杆菌属、冰冻小杆菌属、葡糖醋杆菌属、哈夫尼菌属、盐棒杆菌属、盐单胞菌属、盐简菌属、草螺菌属、薄层菌属、克雷伯氏菌属、考克氏菌属、科萨克氏菌属、乳杆菌属、勒克氏菌属、伦茨氏菌属、藤黄杆菌属、藤黄单胞菌属、马赛菌属、中间根瘤菌属、甲烷嗜热杆菌、甲基杆菌属、微杆菌属、微球菌属、微枝形杆菌属、分枝杆菌属、奈瑟氏菌属、诺卡氏菌属、大洋杆菌属、苍白杆菌属、奥卡杆菌属、寡养菌属、稻土菌属、嗜草酸菌属、类芽孢杆菌属、泛菌属、副伯克霍尔德氏菌、泥单胞菌属、透明球菌属、植物杆菌属、多核杆菌属、丙酸杆菌属、产丙酸棒形菌属、假棒形杆菌属、假单胞菌属、假诺卡氏菌属、假黄单胞菌属、嗜冷杆菌属、拉恩氏菌属、雷尔氏菌属、莱茵海默氏菌属、根瘤菌属、红球菌属、红假单胞菌属、玫瑰色不完全光合菌属、瘤胃球菌属、塞巴鲁德氏菌属、沉积物杆菌属、沉积物杆状菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、申氏杆菌属、中华根瘤菌属、中华孢囊菌属、鞘氨醇杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、鞘氨醇盒菌属、鞘氨醇细胞菌属、葡萄球菌属、寡养单胞菌属、寡养单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、憎叶菌属、硫磺球形菌属、塔特姆氏菌属、温单胞菌属、热单胞菌属、硫杆菌属、贪噬菌属、WPS-2属地位未定、黄单胞菌属和齐默尔曼氏菌属。
在一些方面，可以使用的细菌包括但不限于放射形土壤杆菌、嗜酸热芽孢杆菌、嗜酸芽孢杆菌、土壤芽胞杆菌、亚莎华芽孢杆菌、白色芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、噬胺芽胞杆菌、溶淀粉杆菌(也称为溶淀粉类芽胞杆菌)、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽胞杆菌、萎缩芽孢杆菌、产氮芽胞杆菌、栗褐芽胞杆菌、蜡样芽孢杆菌(同义词：内生藻芽孢杆菌、水母芽孢杆菌)、角质孢子芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、体内寄生虫芽孢杆菌、苛求芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、库斯塔克芽孢杆菌、栖乳芽孢杆菌、乳病芽孢杆菌、乳杆菌、侧孢芽孢杆菌(也称为侧孢短芽孢杆菌)、灿烂芽胞杆菌、缓死芽胞杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、摩洛哥芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、Bacillus metiens、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、食线虫芽孢杆菌、致黑芽孢杆菌、黑色芽孢杆菌、泛酸芽孢杆菌、金龟子芽孢杆菌、冷解糖芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、史密斯芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、单鞭毛芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、短短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌(以前称为侧孢芽孢杆菌)、铁杉下色杆菌、食酸戴尔福特菌、大肠杆菌、变栖克雷伯氏菌、嗜酸乳酸杆菌、抗生素溶杆菌、产酶溶杆菌、蜂房类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、蒲黄类芽孢杆菌属(以前称为乳状芽孢杆菌)、成团泛菌、穿刺巴斯德氏芽菌(以前称为穿刺芽孢杆菌)、杀虫剂巴斯德氏芽菌、胡萝卜软腐病果胶杆菌(以前称为胡萝卜软腐病欧文氏菌)、铜绿假单胞菌、致黄假单胞菌、洋葱假单胞菌(以前称为洋葱伯克霍尔德氏菌)、绿针假单胞菌、荧光假单胞菌、Pseudomonas proradix、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌、嗜虫沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、哥伦比亚链霉菌、鲜黄链霉菌、高氏链霉菌、灰绿链霉菌、淡紫灰链霉菌、普拉斯链霉菌、萨腊赛链霉菌、委内瑞拉链霉菌、野油菜黄单胞菌、发光致病杆菌、蔗糖科萨克氏菌、肠内甲烷嗜热杆菌、热带副伯克霍尔德氏菌和嗜线虫致病杆菌，在一些情况下，细菌可以是褐球固氮菌、巴氏甲烷八叠球菌、肺炎克雷伯氏菌、棕色固氮菌、球形红细菌、荚膜红细菌、沼泽红细菌、深红红螺菌、豌豆根瘤菌或菜豆根瘤菌。
出于专利程序目的的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约
本公开的微生物保藏是根据出于专利程序目的的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款进行的。参见表7。本公开考虑包含表7中列出的微生物中的任一种以及其衍生物、变体和/或突变体的实施方案。此外，本公开考虑包含表7中列出的微生物中的任一种以及其衍生物、变体和/或突变体的农业组合物。此外，本公开考虑利用表7中列出的微生物中的任一种以及其衍生物、变体和/或突变体的方法。本公开的方法可以包括将所述微生物施加到植物或植物部分(诸如种子)，或施加到所述植物或植物部分将在其中生长的区域，以便向所述植物供应固定的大气氮。
申请人声明依照37C.F.R.§1.808(a)(2)“保藏人对保藏材料的公众可获得性所施加的所有限制将在授予专利时不可撤销地去除”。所述声明受制于此部分的段落(b)(即，37C.F.R.§1.808(b))。
在一些方面，细菌选自表7。在一些方面，细菌选自表7并且保藏于毕格罗国家海洋藻类和微生物保藏中心(Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota)(NCMA)，位于60Bigelow Drive,East Boothbay,Maine 04544,USA，其中名称、分类、登录号和保藏日期见表7。在一些方面，细菌选自表7并且保藏于美国菌种保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC)，位于10801University Boulevard,Manassas,Virginia 20110-2209,USA，其中名称、分类、登录号和保藏日期见表7。
表7：根据布达佩斯条约保藏的微生物
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随机诱变
本公开涉及将微生物或微生物群体暴露于诱变剂以便随机诱变基因组和基因组外DNA使得微生物的DNA积累一个或多个突变的方法。目标是将微生物暴露于诱变剂，所述诱变剂的剂量足够高以引起基因突变，但又足够低，不会引起太多有害的基因突变。在一些方面，所述一个或多个突变产生终止密码子。
在一些方面，微生物群体包含相同属或物种的微生物。在一些方面，细菌群体包含一个或多个不同的微生物属或物种。在某些方面，微生物群体包含至少1018、1017、1016、1015、1014、1013、1012、1011、1010、109、108、107、106、105、104、103或102个微生物细胞。
在一些方面，微生物群体出现在固体培养基上。在一些方面，微生物群体出现在液体培养基中。在一些方面，微生物群体出现在半固体培养基中。
在一些方面，微生物群体暴露于一种或多种诱变剂。在一些方面，微生物群体暴露于一种或多种诱变剂持续相对于亲本微生物足以引起至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34或至少35个突变的时间段。
在一些方面，灭活一种或多种微生物中的核苷酸序列。在一些方面，核苷酸序列是蛋白质的编码区。在一些方面，核苷酸序列是前导序列，即信号肽序列。在一些方面，核苷酸序列是调节或控制序列。在一些方面，调节或控制序列选自启动子、终止子、操纵子、阻遏物、激活子、反式作用元件或顺式作用元件。
在一些实施方案中，随机诱变选自化学诱变和紫外线诱变。在一些情况下，化学诱变剂选自丝裂霉素C(MMC)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、亚硝酸(NA)、二环氧丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基-2-氯乙基]-氨基丙胺)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)。在一些方面，选择EMS。在一些方面，选择一种或多种化学诱变剂。
在一些方面，将诱变剂施加到微生物群体。在一些方面，将诱变剂施加到培养基并且将微生物在适合生长的条件下孵育。在一些方面，将微生物洗涤一次或多次以去除残留的痕量诱变剂。在一些方面，所得诱变的细胞是能够针对任何数量的表型变化进行筛选的突变体库。
在一些方面，施加到微生物群体的化学诱变剂的浓度为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％、3％、3.25％、3.5％、3.75％、4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％、6％、6.25％、6.5％、6.75％、7％、7.25％、7.5％、7.75％、8％、8.25％、8.5％、8.75％、9％、9.25％、9.5％、9.75％、10％、10.25％、10.5％、10.75％、11％、11.25％、11.5％、11.75％、12％、12.25％、12.5％、12.75％、13％、13.25％、13.5％、13.75％、14％、14.25％、14.5％、14.75％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％。
在一些方面，施加到微生物群体的化学诱变剂的浓度为约0.05％、约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2％、约2.25％、约2.5％、约2.75％、约3％、约3.25％、约3.5％、约3.75％、约4％、约4.25％、约4.5％、约4.75％、约5％、约5.25％、约5.5％、约5.75％、约6％、约6.25％、约6.5％、约6.75％、约7％、约7.25％、约7.5％、约7.75％、约8％、约8.25％、约8.5％、约8.75％、约9％、约9.25％、约9.5％、约9.75％、约10％、约10.25％、约10.5％、约10.75％、约11％、约11.25％、约11.5％、约11.75％、约12％、约12.25％、约12.5％、约12.75％、约13％、约13.25％、约13.5％、约13.75％、约14％、约14.25％、约14.5％、约14.75％、约15％、约15.5％、约16％、约16.5％、约17％、约17.5％、约18％、约18.5％、约19％、约19.5％或约20％。
在一些方面，诱变库可以通过选择在诸如乙二胺(EDA)和甲基铵的铵类似物上生长的能力来优化，这将抑制微生物的生长，否则这些微生物在存在外源氮源的情况下不能固氮。鉴于固氮生物的固氮在存在固定的氮的情况下受到阻遏，谷氨酰胺合成酶(GlnA)对铵的同化可以通过诸如乙二胺(EDA)和甲基铵的铵类似物与GlnA的铵结合位点的结合而受到抑制。因此，可以选择性地进化具有固氮基因簇的微生物的固氮作用，而EDA或甲基铵抑制微生物的铵同化。在一些实施方案中，使用EDA或甲基铵作为负选择压力提供了鉴定突变体的能力，所述突变体能够在存在EDA的情况下生长和繁殖(否则将会是抑制)，从而克服肥料中固定的氮的固氮酶阻遏等。
在一些方面，EDA或甲基铵的选择压力包括在存在第一EDA或甲基铵浓度的情况下培养微生物，然后在存在第二EDA或甲基铵浓度的情况下培养微生物。在一些方面，EDA或甲基铵的选择压力还包括在存在第三EDA或甲基铵浓度的情况下培养微生物。在一些方面，EDA或甲基铵的选择压力还包括在存在第四EDA或甲基铵浓度的情况下培养微生物。
在一些方面，第一EDA或甲基铵浓度是最低浓度。在一些方面，第二EDA或甲基铵浓度高于第一EDA或甲基铵浓度。在一些方面，第三EDA或甲基铵浓度高于第一EDA或甲基铵浓度和第二EDA或甲基铵浓度。在一些方面，第四EDA或甲基铵浓度高于第一EDA或甲基铵浓度、第二EDA或甲基铵浓度和第三EDA或甲基铵浓度。
在一些方面，EDA浓度为0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.2％、0.21％、0.22％、0.23％、0.24％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.29％、0.3％、0.31％、0.32％、0.33％、0.34％、0.35％、0.36％、0.37％、0.38％、0.39％、0.4％、0.41％、0.42％、0.43％、0.44％、0.45％、0.46％、0.47％、0.48％、0.49％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％或1.9％。
在一些方面，EDA浓度为约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.11％、约0.12％、约0.13％、约0.14％、约0.15％、约0.16％、约0.17％、约0.18％、约0.19％、约0.2％、约0.21％、约0.22％、约0.23％、约0.24％、约0.25％、约0.26％、约0.27％、约0.28％、约0.29％、约0.3％、约0.31％、约0.32％、约0.33％、约0.34％、约0.35％、约0.36％、约0.37％、约0.38％、约0.39％、约0.4％、约0.41％、约0.42％、约0.43％、约0.44％、约0.45％、约0.46％、约0.47％、约0.48％、约0.49％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％或约1.9％。
在一些实施方案中，甲基铵浓度为5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。
在一些实施方案中，甲基铵浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM或约200mM。
在一些实施方案中，诱变方法与EDA或甲基铵选择组合以进一步清除假阳性的突变体库。
一方面，本文提供一种包含一种或多种细菌的组合物，所述细菌在固氮或同化遗传调节网络的至少一种基因或非编码多核苷酸中包含至少一个遗传变异。应当认识到，可以使用本文提供的方法(例如，随机诱变)进行突变，或者可以通过使用遗传工程方法或本领域已知的其他方法引入突变。所述组合物还可以包含农业上可接受的载剂。所述农业上可接受的载剂可以是本领域已知的任何载剂。
在一些方面，本文中的细菌中的一种或多种包含在选自由以下组成的组的成员中的至少一个遗传变异：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、GlnA、GlnB、GlnK、Drat、AmtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、GlnD、FlnE、NifJ、NifH、NifD、NifK、NifY、NifE、NifN、NifU、NifS、NifV、NifW、NifZ、NifM、NifF、NifB、NifQ、与固氮酶生物合成相关联的基因或其组合。
在一些方面，所述细菌中的一种或多种在固氮或同化遗传调节网络的至少一个基因或非编码多核苷酸中包含至少一个遗传变异，其产生以下中的一者或多者：NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；NifL、NtrB、谷氨酰胺合成酶、GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰基去除活性降低；或GlnD的尿苷酰基去除活性降低。
在一些方面，所述细菌中的一种或多种选自表6中所列的细菌菌株。
在一些方面，所述细菌中的一种或多种以高于野生型亲本谱系细菌的速率固定大气氮。
在一些方面，所述细菌中的一种或多种选自：变栖克雷伯氏菌CI3296、变栖克雷伯氏菌CI3936、变栖克雷伯氏菌CI3933、变栖克雷伯氏菌CI3927、变栖克雷伯氏菌CI3925、变栖克雷伯氏菌CI3943、变栖克雷伯氏菌CI3940、变栖克雷伯氏菌CI3938、变栖克雷伯氏菌CI4874、蔗糖科萨克氏菌CI4065、肠内甲烷嗜热杆菌CI4875、肠内甲烷嗜热杆菌CI4876、肠内甲烷嗜热杆菌CI4877、肠内甲烷嗜热杆菌CI4878、热带副伯克霍尔德氏菌CI4751、热带副伯克霍尔德氏菌CI4753、热带副伯克霍尔德氏菌CI4879和热带副伯克霍尔德氏菌CI4752。所述一种或多种细菌可以是经遗传工程化的。所述一种或多种细菌可以是如本文提供的组合物的一部分。所述组合物可以包含如本文提供的农业上可接受的载剂。
在一些方面，所述细菌中的一种或多种选自：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。所述一种或多种细菌可以是经遗传工程化的。所述一种或多种细菌可以是如本文提供的组合物的一部分。所述组合物可以包含如本文提供的农业上可接受的载剂。
在一些方面，所述细菌中的一种或多种在glnA中包含至少一个遗传变异。所述一种或多种细菌可以是经遗传工程化的。所述至少一个遗传变异可以经由如本文所述的随机诱变引入。所述一种或多种细菌可以是如本文提供的组合物的一部分。所述组合物可以包含如本文提供的农业上可接受的载剂。
在一些情况下，所述一种或多种细菌可以包含突变glnA基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，突变glnA基因可以与克雷伯氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，在所述至少核苷酸取代之外，突变glnA基因的其余部分可以与克雷伯氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个实施方案中，克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。在一些情况下，克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一个实施方案中，包含至少一个遗传变异或突变的突变glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
在一些情况下，所述一种或多种细菌可以包含突变glnA基因，所述基因在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。在一些情况下，突变glnA基因可以与副伯克霍尔德氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，在所述至少核苷酸取代之外，突变glnA基因的其余部分可以与副伯克霍尔德氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个实施方案中，副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在一个实施方案中，包含至少一个遗传变异或突变的突变glnA基因包含选自由SEQ ID NO20-23组成的组的核酸序列。
在一个实施方案中，本文提供的包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因的表达编码在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一个实施方案中，本文提供的包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因的表达产生具有至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，本文中的由包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因编码的GlnA蛋白与克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，本文提供的由包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因编码的不包括至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白的剩余部分与克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。克雷伯氏菌属GlnA蛋白可以包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一个实施方案中，本文提供的由包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因编码的GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
在一个实施方案中，包含至少一个遗传变异或本文提供的glnA基因的表达编码在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。在一个实施方案中，本文提供的包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因的表达产生具有至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。在一些情况下，由包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因编码的GlnA蛋白与副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，由包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因编码的不包括至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白的剩余部分与副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白可以包含SEQID NO:27的氨基酸序列。在一个实施方案中，本文提供的由包含至少一个遗传变异或突变的glnA基因编码的GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
在一些方面，所述一种或多种细菌包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些方面，所述一种或多种细菌包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含具有至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，突变GlnA蛋白与克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，在所述至少一个氨基酸取代之外，突变GlnA蛋白与克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。克雷伯氏菌属GlnA蛋白可以包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。在一些情况下，克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一个实施方案中，突变GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
在一些方面，所述一种或多种细菌包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些方面，所述一种或多种细菌包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含具有至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和Q219H或在其同源物中的同源氨基酸位置组成的组的氨基酸取代的氨基酸序列。在一些情况下，突变GlnA蛋白与副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，在所述至少一个氨基酸取代之外，突变GlnA蛋白与副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白可以包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一个实施方案中，突变GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
在一些方面，所述一种或多种细菌包含glnE中的至少一个遗传变异。所述一种或多种细菌可以包含突变glnE基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。所述一种或多种细菌可以包含突变glnE基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含核苷酸取代。在一些情况下，突变glnE基因可以与克雷伯氏菌属glnE基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，在所述至少核苷酸取代之外，突变glnE基因的其余部分可以与克雷伯氏菌属glnE基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个实施方案中，克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。在一个实施方案中，包含至少一个遗传变异或突变的突变glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
在一个实施方案中，包含至少一个遗传变异或突变的glnE基因的表达编码在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。在另一个实施方案中，包含至少一个遗传变异或突变的glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有氨基酸取代的突变GlnE蛋白。在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代可以是G至E取代。在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代可以是G至D取代。在一些情况下，由包含至少一个遗传变异或突变的glnE基因编码的GlnE蛋白与克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，由包含至少一个遗传变异或突变的glnE基因编码的不包括至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白的剩余部分与克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。克雷伯氏菌属GlnE蛋白可以包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一个实施方案中，由包含至少一个遗传变异或突变的glnE基因编码的突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在一些方面，所述一种或多种细菌包含突变GlnE蛋白，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。在其他方面，所述一种或多种细菌包含突变GlnE蛋白，所述蛋白在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含氨基酸取代。在一些情况下，在位置322或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至E取代。在一些情况下，在位置746或同源氨基酸位置处的氨基酸取代是G至D取代。在一些情况下，突变GlnE蛋白与克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，在所述至少一个氨基酸取代之外，突变GlnE蛋白与克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。克雷伯氏菌属GlnE蛋白可以包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列。在一个实施方案中，突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
本领域技术人员将认识到，核苷酸和蛋白质序列同源物可以具有相同长度或可以含有插入和/或缺失。在一些情况下，同源物中的同源核苷酸和/或氨基酸位置与碱基序列中的核苷酸或氨基酸位置相同。在其他情况下，同源物中的同源核苷酸和/或氨基酸位置与碱基序列中的核苷酸或氨基酸位置不同。同源物中的同源核苷酸或氨基酸位置(在同源物中将基于本文公开的取代位置发生取代的位置)可以通过将同源物与具有本文公开的取代的碱基序列对齐并鉴定在同源物中与含有如本文公开的取代的碱基序列中核苷酸或氨基酸的位置对齐的核苷酸或氨基酸的位置来鉴定。这种序列对齐可以通过本领域技术人员已知的方法进行。
施加
可以采用本公开的利用本文鉴定的菌株的方法，以引入或改善多种期望性状中的一种或多种。可以引入或改善的性状的实例包括：根部生物质量、根长、高度、芽长、叶数、水分利用效率、总生物质量、产量、果实大小、籽粒大小、光合作用速率、耐旱性、耐热性、耐盐性、对线虫胁迫的抗性、对真菌病原体的抗性、对细菌病原体的抗性、对病毒病原体的抗性、代谢物水平以及蛋白质组表达。期望的性状，包括高度、总生物质量、根部和/或芽生物质量、种子萌发、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物籽粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合，可以用于测量生长，并且与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，没有改善的性状的植物)的生长速率进行比较。
如本文所述，待引入或改善的优选性状是固氮。在一些情况下，与在相同条件下在土壤中生长的参考农业植物相比，由本文所述的方法产生的植物表现出的性状差异大至少约5％，例如至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％、或至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大。在另外的实例中，与在相似条件下在土壤中生长的参考农业植物相比，由本文所述的方法产生的植物表现出的性状差异大至少约5％，例如至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％、或至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大。
可以在包括施加一种或多种生物或非生物胁迫源的条件下评估有待利用本文鉴定的微生物菌株来改善的性状。胁迫源的实例包括非生物胁迫(诸如热胁迫、盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫和低养分胁迫)和生物胁迫(诸如线虫胁迫、昆虫食草胁迫、真菌病原体胁迫、细菌病原体胁迫和病毒病原体胁迫)。
通过利用本文鉴定的微生物菌株的方法和组合物来改善的性状可以是固氮，包括在先前不能进行固氮的植物中固氮。在一些情况下，与引入任何遗传变异之前从植物中分离的细菌相比，根据本文所述的方法分离的细菌产生1％或更多(例如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多)的植物氮，这可以表示固氮能力增加至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或更多)。在一些情况下，细菌产生5％或更多的植物氮。在重复引入遗传变异、暴露于多种植物和从具有改善的性状的植物中分离细菌的步骤一或多次(例如1、2、3、4、5、10、15、25或更多次)后，可以实现所需的固氮水平。在一些情况下，在存在补充有谷氨酰胺、氨或其他化学氮源的肥料的情况下实现提高的固氮水平。用于评估固氮程度的方法是已知的，其实例在本文中描述。
测量在农业相关的田地环境中输送的氮
在田地中，输送的氮的量可以通过定殖乘以活性的函数来确定。
Figure BDA0003318753660000671
以上等式需要(1)平均每单位植物组织的定殖，和(2)作为固定的氮的量或由每个微生物细胞分泌的氨的量的活性。为了转换成每英亩氮的磅数，在整个成熟期，随时间推移追踪玉米生长生理学，例如，植物和相关的根部系统的大小。
可以通过以下等式计算每英亩季节输送到作物的氮的磅数：
递送的氮＝∫植物组织(t)x定殖(t)x活性(t)dt
植物组织(t)是随生长时间(t)推移的玉米植物组织的鲜重。用于合理地进行计算的值详细地描述于标题为Roots，Growth and Nutrient Uptake(Mengel.Dept.ofAgronomy Pub.#AGRY-95-08(Rev.5月-95.第1-8页)的出版物中。
定植(t)是在生长季节期间，在任何特定时间t下，在植物组织内每克植物组织鲜重存在的目标微生物的量。在仅可用的单个时间点的情况下，将单个时间点归一化为在季节上的峰值定殖速率，并且相应地调整剩余时间点的定殖速率。
活性(t)是在生长季节期间，在任何特定时间t下，每单位时间由目标微生物固定的N的速率。在本文公开的实施方案中，此活性速率通过在存在5mM谷氨酰胺的情况下在ARA培养基中的体外乙炔还原测定(ARA)或在存在5mM铵离子的情况下在ARA培养基中的铵分泌测定来近似。
随后通过对以上函数进行数值积分来计算氮输送量。在其中在设定时间点离散地测量上述变量的值的情况下，通过进行线性插值法来近似那些时间点之间的值。
固氮
本文所述的是增加植物中的固氮的方法，其包括将植物暴露于一种或多种本文所述的细菌，包括通过施加包含如本文所述的细菌的组合物。应当理解，可以使用本文提供的方法和组合物(例如，通过使用如本文提供的生物传感器)或通过本领域已知的其他方法来产生和/或鉴定细菌。这些细菌在一种或多种调节固氮的基因中包含一个或多个遗传变异，其中所述细菌在植物中产生1％或更多(例如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多)的氮，这可以表示与不存在细菌的植物相比，固氮能力为至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或更多)。在存在补充有谷氨酰胺、尿素、硝酸盐或氨的肥料的情况下，细菌可以产生氮。遗传变异可以是任何数量和任何组合的本文所述的任何遗传变异，包括本文提供的实例。
在本文所述的植物中发生的固氮的量可以以若干种方式，例如通过乙炔还原(AR)测定测量。乙炔还原测定可以在体外或体内进行。特定细菌向植物提供固定的氮的证据可以包括：1)接种后，总植物N显著增加，优选伴随有植物中N浓度增加；2)接种后，在N限制条件下氮缺乏症状减轻(其应包括干物质增加)；3)通过使用15N方法(其可以是同位素稀释实验、15N2还原测定或15N天然丰度测定)记录N2固定；4)固定的N并入植物蛋白或代谢物中；和5)所有这些效应都在未接种的植物或接种有接种菌株的突变体的植物中没有见到。
农业组合物
包含本文所述的细菌或细菌群体的组合物可以呈液体、泡沫或干产品的形式。包含本文所述的细菌或细菌群体的组合物也可以用于改善植物性状。包含细菌或细菌群体的组合物可以包含工程化的或随机诱变的微生物，其包含如本文提供的glnA基因和/或glnE基因中的遗传变异的中一个或任何组合。本文提供的包含如本文提供的微生物的一种或多种菌株的任何组合物还可以包含来自如本文提供的表6的一种或多种菌株。
在一些实例中，包含细菌群体的组合物可以呈干粉、粉末和水的浆液或可流动种子处理剂的形式。包含细菌群体的组合物可以包被在种子的表面上，并且可呈液体形式。
所述组合物可以在诸如连续搅拌釜反应器、分批反应器的生物反应器中和在农场中制造。在一些实例中，组合物可以储存在诸如水罐的容器中或以小型散装储存。在一些实例中，组合物可以储存在选自由以下组成的组的物件内：瓶、广口瓶、安瓿、包装、器皿、包、盒子、储藏箱、包封、纸箱、容器、筒仓、运输容器、车厢和/或箱子。
组合物也可以用于改善植物性状。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被到种子上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被到幼苗上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被到种子的表面上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被为种子表面上方的层。在一些实例中，包被到种子上的组合物可以呈液体形式、呈干产品形式、呈泡沫形式、呈粉末和水的浆液形式或呈可流动种子处理剂形式。在一些实例中，可以通过用一种或多种组合物对种子和/或幼苗进行喷涂、浸没、包被、囊封和/或撒粉，将一种或多种组合物施加到种子和/或幼苗。在一些实例中，可以将多种细菌或细菌群体包被到植物的种子和/或幼苗上。在一些实例中，细菌组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌可以选自表6中所见的细菌菌株。
组合物的实例可以包括用于商业上重要的农作物的种子包衣，所述农作物例如高粱、芥花、番茄、草莓、大麦、水稻、玉蜀黍和小麦。组合物的实例还可以包括用于玉米、大豆、芥花、高粱、马铃薯、水稻、蔬菜、谷类和油籽的种子包衣。如本文提供的种子可以是遗传修饰的生物体(GMO)、非GMO、有机或常规的。在一些实例中，可以将组合物喷涂在植物的地上部分上，或通过插入到种有植物种子的沟中、浇水到土壤中或将根部浸入组合物的悬浮液中而施加到根部。在一些实例中，可以以维持细胞活力和人工接种并定殖宿主植物的能力的合适方式使组合物脱水。细菌物种可以以108至1010CFU/ml之间的浓度存在于组合物中。在一些实例中，组合物可以补充有痕量的金属离子，诸如钼离子、铁离子、锰离子或这些离子的组合。如本文所述的组合物的实例中的离子浓度可以在约0.1mM至约50mM之间。组合物的一些实例也可以与载剂一起配制，所述载剂诸如β-葡聚糖、羧甲基纤维素(CMC)、细菌细胞外聚合物质(EPS)、糖、动物乳或其他合适的载剂。在一些实例中，泥炭或种植材料可以用作载剂，或生物聚合物可以用作载剂，其中组合物包埋在所述生物聚合物中。包括本文所述的细菌群体的组合物可以改善植物性状，诸如促进植物生长、维持叶子中的高叶绿素含量、增加果实或种子数目以及增加果实或种子单位重量。
可以将包含本文所述的细菌群体的组合物包被到种子的表面上。因此，还考虑包含用本文所述的一种或多种细菌包被的种子的组合物。种子包衣可以通过将细菌群体与多孔的化学惰性粒状载剂混合而形成。或者，组合物可以直接插入到其中种植了种子的沟中，或喷涂到植物叶片上，或通过将根部浸入组合物的悬浮液中进行施加。有效量的组合物可以用于用活细菌生长来填充邻近植物根部的底土区域，或用活细菌生长来填充植物的叶片。一般来说，有效量是足以产生具有改善性状(例如所需的固氮水平)的植物的量。
本文所述的细菌组合物可以使用农业上可接受的载剂来配制。可用于这些实施方案的制剂可以包含选自由以下组成的组的至少一个成员：增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗细菌剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、抗复合剂、除草剂、杀线虫剂、杀虫剂、植物生长调节剂、肥料、杀鼠剂、干燥剂、杀菌剂、养分、激素或其任何组合。在一些实例中，组合物可以是储存稳定的。例如，本文所述的组合物中的任一种可以包含农业上可接受的载剂(例如，肥料(诸如非天然存在的肥料)、粘合剂(诸如非天然存在的粘合剂)和农药(诸如非天然存在的农药)中的一种或多种)。非天然存在的粘合剂可以是例如聚合物、共聚物或合成蜡。例如，本文所述的包衣的种子、幼苗或植物中的任一种可以在种子包衣中含有这种农业上可接受的载剂。在本文所述的组合物或方法中的任一种中，农业上可接受的载剂可以是或可以包含非天然存在的化合物(例如，非天然存在的肥料、非天然存在的粘合剂(诸如聚合物、共聚物或合成蜡)或非天然存在的农药)。下文描述了农业上可接受的载剂的非限制性实例。农业上可接受的载剂的另外的实例是本领域中已知的。
在一些情况下，将细菌与农业上可接受的载剂混合。载剂可以是固体载剂或液体载剂，并且呈各种形式，包括微球、粉末、乳液等。载剂可以是赋予多种特性(诸如增加的稳定性、可湿性或可分散性)的许多载剂中的任何一种或多种。组合物中可以包含润湿剂，诸如天然或合成的表面活性剂，其可以是非离子或离子表面活性剂或其组合。油包水乳液也可以用于配制包含分离的细菌的组合物(参见，例如美国专利号7,485,451)。可以制备的合适制剂包含可湿性粉末、颗粒、凝胶、琼脂条或团粒、增稠剂等、微囊封粒子等、液体诸如水性流体、水性悬浮液、油包水乳液等。制剂可以包含谷物或豆科植物产品，例如磨碎的谷物或豆类、来源于谷物或豆类的汤或粉、淀粉、糖或油。
在一些实施方案中，农业载剂可以是土壤或植物生长培养基。可以使用的其他农业载剂包括水、肥料、植物类油、保湿剂或其组合。或者，农业载剂可以是固体，诸如硅藻土、壤土、二氧化硅、海藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种壳、其他植物和动物产品或组合，包括颗粒、团粒或悬浮液。还考虑前述成分中的任一种的混合物作为载剂，诸如但不限于佩斯塔(pesta)(粉和高岭土)，壤土、砂土或粘土中基于琼脂或粉的团粒等。制剂可以包含细菌的食物来源，诸如大麦、水稻或其他生物材料，诸如种子，植物部分，甘蔗渣，来自谷物加工的壳或茎秆，来自建筑场所垃圾的磨碎植物材料或木材，锯末，或来自纸、织物或木材的再循环的小纤维。
例如，肥料可以用于帮助促进生长或为种子、幼苗或植物提供养分。肥料的非限制性实例包括氮、磷、钾、钙、硫、镁、硼、氯、锰、铁、锌、铜、钼和硒(或其盐)。肥料的另外的实例包括一种或多种氨基酸、盐、碳水化合物、维生素、葡萄糖、NaCl、酵母提取物、NH4H2PO4、(NH4)2SO4、甘油、缬氨酸、L-亮氨酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸氢钾、木糖、来苏糖和卵磷脂。在一个实施方案中，制剂可以包含增粘剂或粘附剂(被称作粘合剂)以帮助将其他活性剂结合到物质(例如，种子表面)。此类剂可用于将细菌与可以含有其他化合物的载剂(例如，非生物的控制剂)组合，以产生包衣组合物。此类组合物帮助在植物或种子周围产生包衣，以维持微生物和其他剂与植物或植物部分之间的接触。在一个实施方案中，粘合剂选自由以下组成的组：海藻酸盐、树胶、淀粉、卵磷脂、芒柄花黄素(formononetin)、聚乙烯醇、芒柄花黄素碱金属盐(alkali formononetinate)、橙皮素(hesperetin)、聚乙酸乙烯酯、脑磷脂、阿拉伯胶、黄原胶、矿物油、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、阿拉伯半乳聚糖、甲基纤维素、PEG 400、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈、甘油、三乙二醇、乙酸乙烯酯、结冷胶(Gellan Gum)、聚苯乙烯、聚乙烯、羧甲基纤维素、印度树胶(Gum Ghatti)和聚氧乙烯-聚氧丁烯嵌段共聚物。
在一些实施方案中，粘合剂可以是例如蜡，诸如巴西棕榈蜡(carnauba wax)、蜂蜡、中国蜡、虫胶蜡、鲸蜡(spermaceti wax)、小烛树蜡(candelilla wax)、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡(ouricury wax)和米糠蜡，多糖(例如，淀粉、糊精、麦芽糖糊精、海藻酸盐和壳聚糖)、脂肪、油、蛋白质(例如，明胶和玉米蛋白)、阿拉伯胶和虫胶。粘合剂可以是非天然存在的化合物，例如聚合物、共聚物和蜡。例如，可以用作粘合剂的聚合物的非限制性实例包括：聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯共聚物、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、纤维素(例如，乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮、氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物、木质素磺酸钙、丙烯酸共聚物、聚乙烯基丙烯酸酯、聚环氧乙烷、丙烯酰胺聚合物和共聚物、聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体和聚氯丁二烯。
在一些实例中，粘合剂、抗真菌剂、生长调节剂和农药(例如，杀虫剂)中的一种或多种是非天然存在的化合物(例如，以任何组合)。农业上可接受的载剂的另外的实例包括分散剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVPIVA S-630)、表面活性剂、粘结剂和填充剂。
制剂还可以含有表面活性剂。表面活性剂的非限制性实例包括氮-表面活性剂共混物，诸如Prefer 28(Cenex)、Surf-N(US)、Inhance(Brandt)、P-28(Wilfarm)和Patrol(Helena)；酯化的种子油包括Sun-It II(AmCy)、MSO(UAP)、Scoil(Agsco)、Hasten(Wilfarm)和Mes-100(Drexel)；并且有机硅表面活性剂包括Silwet L77(UAP)、Silikin(Terra)、Dyne-Amic(Helena)、Kinetic(Helena)、Sylgard 309(Wilbur-Ellis)和Century(Precision)。在一个实施方案中，表面活性剂以0.01％v/v至10％v/v之间的浓度存在。在另一个实施方案中，表面活性剂以0.1％v/v至1％v/v之间的浓度存在。
在某些情况下，制剂包含微生物稳定剂。这种剂可以包括干燥剂，其可以包含可以被分类为干燥剂的任何化合物或化合物的混合物，而不管一种或多种化合物是否以实际上对液体接种菌具有干燥作用的浓度使用。此类干燥剂理想地与所使用的细菌群体相容，并且应促进微生物群体经受在种子上的施加而存活以及经受干燥而存活的能力。合适干燥剂的实例包括海藻糖、蔗糖、甘油和亚甲二醇中的一种或多种。其他合适的干燥剂包括但不限于非还原糖和糖醇(例如，甘露糖醇或山梨糖醇)。引入制剂中的干燥剂的量可以在按重量/体积计约5％至约50％的范围内，例如，在约10％至约40％之间、在约15％至约35％之间或在约20％至约30％之间。在一些情况下，制剂含有诸如杀真菌剂、抗菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀虫剂、植物生长调节剂、杀鼠剂、杀菌剂或养分的剂是有利的。在一些实例中，剂可以包括提供对种子表面传播的病原体的防范的保护剂。在一些实例中，保护剂可以提供一定水平的对土壤传播的病原体的控制。在一些实例中，保护剂可以主要在种子表面上有效。
在一些实例中，杀真菌剂可以包含能够抑制真菌生长或杀死真菌的化合物或剂，无论是化学的还是生物的。在一些实例中，杀真菌剂可以包含能够抑制真菌或杀真菌的化合物。在一些实例中，杀真菌剂可以是保护剂，或主要在种子表面上有效的剂，从而提供对种子表面传播的病原体的防范并提供一定水平的对土壤传播的病原体的控制。保护剂杀真菌剂的非限制性实例包括克菌丹(captan)、代森锰(maneb)、福美双(thiram)或咯菌腈(fludioxonil)。
在一些实例中，杀真菌剂可以是内吸性杀真菌剂，其可以被吸收到出苗的幼苗中并抑制或杀死宿主植物组织内的真菌。用于种子处理剂的内吸性杀真菌剂包括但不限于以下：嘧菌酯(azoxystrobin)、萎锈灵(carboxin)、精甲霜灵(mefenoxam)、甲霜灵(metalaxyl)、噻菌灵(thiabendazole)、三氟敏(trifloxystrobin)和各种三唑杀真菌剂，包括苯醚甲环唑(difenoconazole)、种菌唑(ipconazole)、戊唑醇(tebuconazole)和灭菌唑(triticonazole)。精甲霜灵和甲霜灵主要用于靶向水霉真菌腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)。根据植物物种，一些杀真菌剂相比于其他杀真菌剂是优选的，因为病原真菌物种的敏感性存在细微差异，或因为植物的杀真菌剂分布或敏感性存在差异。在一些实例中，杀真菌剂可以是生物控制剂，诸如细菌或真菌。此类生物体可以寄生到病原真菌，或者分泌毒素或其他可以杀死真菌或以其他方式阻止真菌生长的物质。任何类型的杀真菌剂，尤其通常在植物上使用的杀真菌剂，可以用作种子组合物中的控制剂。
在一些实例中，种子包衣组合物包含具有抗细菌特性的控制剂。在一个实施方案中，具有抗细菌特性的控制剂选自本文其他地方所述的化合物。在另一个实施方案中，化合物是链霉素(Streptomycin)、土霉素(oxytetracycline)、欧索林酸(oxolinic acid)或庆大霉素(gentamicin)。可以用作种子包衣组合物的一部分的抗细菌化合物的其他实例包括基于双氯酚和苄醇半缩甲醛的那些化合物(来自ICI的
Figure BDA0003318753660000751
或来自Thor Chemie的
Figure BDA0003318753660000752
RS和来自Rohm&Haas的
Figure BDA0003318753660000753
MK 25)和异噻唑啉酮衍生物，诸如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(来自Thor Chemie的
Figure BDA0003318753660000754
MBS)。
在一些实例中，生长调节剂选自由以下组成的组：脱落酸(Abscisic acid)、甲草胺(amidochlor)、嘧啶醇(ancymidol)、6-苄基氨基嘌呤、芸苔素内酯(brassinolide)、仲丁灵(butralin)、克美素(chlormequat)(矮壮素(chlormequat chloride))、氯化胆碱、环丙酰草胺(cyclanilide)、丁酰肼(daminozide)、调呋酸(dikegulac)、噻节因(dimethipin)、2,6-二甲基嘌啶、乙烯利(ethephon)、氟节胺(flumetralin)、呋嘧醇(flurprimidol)、嗪草酸甲酯(fluthiacet)、福芬素(forchlorfenuron)、赤霉酸(gibberellicacid)、抗倒胺(inabenfide)、吲哚-3-乙酸、顺丁烯二酰肼、氟磺酰草胺(mefluidide)、壮棉素(mepiquat)(缩节胺(mepiquat chloride))、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、多效唑(paclobutrazol)、调环酸三硫代磷酸酯(prohexadione phosphorotrithioate)、2,3,5-三碘苯甲酸、抗倒酯(trinexapac-ethyl)和烯效唑(uniconazole)。生长调节剂的另外的非限制性实例包括油菜素甾醇(brassinosteroid)、细胞分裂素(例如，激动素(kinetin)和玉米素(zeatin))、生长素(例如，吲哚乙酸和吲哚基乙酰基天冬氨酸)、类黄酮和异类黄酮(例如，芒柄花黄素和香叶木素(diosmetin))、植物抗毒素(例如，大豆抗毒素(glyceolline))和诱导植物抗毒素的寡糖(例如，果胶、几丁质、壳聚糖、聚半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸)和吉贝素(gibellerin)。此类剂理想地与施加制剂的农业种子或幼苗相容(例如，其不应对植物的生长或健康有害)。此外，所述剂理想地是一种不会导致人类、动物或工业使用的安全性问题的剂(例如，没有安全性问题，或化合物足够不稳定以至于来源于所述植物的商品植物产品含有可忽略量的所述化合物)。
线虫拮抗性生物控制剂的一些实例包括ARF18；30节丛孢属物种(Arthrobotrysspp.)；毛壳菌属物种(Chaetomium spp.)；柱孢属物种(Cylindrocarpon spp.)；外瓶霉属物种(Exophilia spp.)；镰刀菌属物种(Fusarium spp.)；粘帚霉属物种(Gliocladiumspp.)；被毛孢属物种(Hirsutella spp.)；蜡蚧菌属物种(Lecanicillium spp.)；单顶孢属物种(Monacrosporium spp.)；漆斑菌属物种(Myrothecium spp.)；新赤壳属物种(Neocosmospora spp.)；拟青霉属物种(Paecilomyces spp.)；普可尼亚属物种(Pochoniaspp.)；壳多孢属物种(Stagonospora spp.)；囊泡-丛枝菌根真菌(vesicular-arbuscularmycrookizal fungi)；伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp.)；巴斯德氏芽菌属物种(Pasteuria spp.)；短芽孢杆菌属物种(Brevibacillus spp.)；假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)；和根际细菌(Rhizobacteria)。尤其优选的线虫拮抗生物控制剂包括ARF18、少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)、指状节丛孢菌(Arthrobotrysdactyloides)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、异丝藻柱孢(Cylindrocarponheteronema)、甄氏外瓶霉(Exophilia jeanelmei)、嗜鱼外瓶霉(Exophilia pisciphila)、曲霉镰刀菌(Fusarium aspergilus)、茄镰刀菌(Fusarium solani)、链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)、绿粘帚霉(Gliocladiumvixens)、洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)、明尼苏达被毛孢(Hirsutellaminnesotensis)、轮枝蜡蚧菌(Lecanicillium lecanii)、掘氏单顶孢(Monacrosporiumdrechsleri)、桥区单顶孢(Monacrosporium gephyropagum)、疣孢漆斑菌(Myrotehciumverrucaria)、侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta)、淡紫拟青霉菌(Paecilomyceslilacinus)、厚垣普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、异皮壳多孢菌(Stagonosporaheteroderae)、菜豆壳多孢菌(Stagonospora phaseoli)、囊泡-丛枝菌根真菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、穿刺巴斯德氏芽菌、多刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria thornei)、西泽巴斯德氏芽菌(Pasteuria nishizawae)、分支巴斯德氏芽菌(Pasteuria ramosa)、杀虫剂巴斯德氏菌、侧孢短芽孢杆菌菌株G4、荧光假单胞菌和根际细菌。
养分的一些实例可以选自由以下组成的组：氮肥，包含但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、无压氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、硫包衣尿素、脲甲醛、IBDU、聚合物包衣尿素、硝酸钙、脲醛和亚甲基脲，磷肥，诸如磷酸氢二铵、磷酸一铵、多磷酸铵、浓过磷酸钙和三重过磷酸钙，和钾肥，诸如氯化钾、硫酸钾、硫酸钾镁、硝酸钾。此类组合物可以在种子包衣组合物内以游离盐或离子的形式存在。或者，养分/肥料可以复合或螯合，以提供随时间推移的持续释放。
杀鼠剂的一些实例可以包括选自由以下组成的物质的组：2-异戊酰基茚满-1,3-二酮、4-(喹喔啉-2-基氨基)苯磺酰胺、α-氯醇、磷化铝、安妥(antu)、三氧化二砷、碳酸钡、双鼠脲(bisthiosemi)、溴鼠灵(brodifacoum)、溴敌隆(bromadiolone)、溴鼠胺(bromethalin)、氰化钙、氯醛糖、氯敌鼠(chlorophacinone)、胆钙化醇、氯杀鼠灵(coumachlor)、克灭鼠(coumafuryl)、杀鼠迷(coumatetralyl)、鼠立死(crimidine)、鼠得克(difenacoum)、噻鼠灵(difethialone)、敌鼠(diphacinone)、麦角钙化醇、氟鼠灵(flocoumafen)、氟乙酰胺、氟鼠啶(flupropadine)、氟鼠啶盐酸盐、氰化氢、碘甲烷、林丹(lindane)、磷化镁、溴甲烷、鼠特灵(norbormide)、毒鼠磷(phosacetim)、膦、磷、杀鼠酮(pindone)、亚砷酸钾、灭鼠优(pyrinuron)、海葱糖苷(scilliroside)、亚砷酸钠、氰化钠、氟乙酸钠、番木鳖碱(strychnine)、硫酸铊、华法林(warfarin)和磷化锌。
在液体形式，例如溶液或悬浮液中，细菌群体可以混合或悬浮于水或水性溶液中。合适的液体稀释剂或载剂包括水、水性溶液、石油馏出物或其他液体载剂。
固体组合物可以通过将细菌群体分散在适当分开的固体载剂之中或之上而制备，所述固体载剂诸如泥炭、小麦、麸、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土(fuller'searth)、巴氏灭菌土壤等。当此类制剂用作可湿性粉末时，可以使用生物相容的分散剂，诸如非离子、阴离子、两性或阳离子分散剂和乳化剂。
配制时使用的固体载剂包括例如矿物载剂，诸如高岭土、叶蜡石、膨润土、蒙脱石、硅藻土、酸性白土、蛭石和珠光体，以及无机盐，诸如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素、氯化铵和碳酸钙。此外，可以使用有机细粉，例如小麦粉、麦麸和米糠。液体载剂包括诸如大豆油和棉籽油的植物油、甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚丙二醇等。
细菌群体在作物上的施加
本文所述的细菌或细菌群体的组合物可以施加在沟中，在滑石中施加或作为种子处理剂施加。组合物可以以散装、小型散装、袋装形式或在滑石中施加到种子包装。
播种机可以种植经处理的种子，并且根据常规方式、双行或不需要耕种的方式生长作物。可以使用控制料斗或单个料斗分配种子。也可以使用压缩空气或手动分配种子。可以使用可变速率技术进行种子放置。另外，可以使用可变速率技术来施加本文所述的细菌或细菌群体。在一些实例中，细菌可以施加到玉米、大豆、芥花、高粱、马铃薯、水稻、蔬菜、谷类、假谷类和油籽的种子。谷类的实例可以包括大麦、福尼奥米(fonio)、燕麦、帕尔默草(palmer's grass)、黑麦、珍珠粟(pearl millet)、高粱、斯佩尔特小麦(spelt)、画眉草(teff)、黑小麦和小麦。假谷类的实例可以包括面包坚果(breadnut)、荞麦、香蒲、奇亚(chia)、亚麻、籽粒苋(grain amaranth)、汉扎(hanza)、藜麦和芝麻。在一些实例中，种子可以是遗传修饰的生物体(GMO)、非GMO、有机或常规的。
可以另外使用添加剂，诸如微肥、PGR、除草剂、杀虫剂和杀真菌剂，来处理作物。添加剂的实例包括作物保护剂，诸如杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂；增强剂，诸如着色剂、聚合物、粒化剂、预激剂和消毒剂；和其他剂，诸如接种菌、PGR、软化剂和微量养分。PGR可以是影响根部生长、开花或茎伸长的天然或合成植物激素。PGR可以包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯和脱落酸(ABA)。
组合物可以与液体肥料组合施加在沟中。在一些实例中，液体肥料可以保持在罐中。NPK肥料含有钠、磷和钾的大量养分。
组合物通过提供固定的氮可以改善植物性状，诸如促进植物生长、维持叶片中的高叶绿素含量、增加果实或种子数目以及增加果实或种子单位重量。可以采用本公开的方法来引入或改善多种期望性状中的一种或多种。可以引入或改善的性状的实例包括：根部生物质量、根长、高度、芽长、叶数、水分利用效率、总生物质量、产量、果实大小、籽粒大小、光合作用速率、耐旱性、耐热性、耐盐性、对低氮胁迫的耐受性、氮使用效率、对线虫胁迫的抗性、对真菌病原体的抗性、对细菌病原体的抗性、对病毒病原体的抗性、代谢物水平、对代谢物水平的调控、蛋白质组表达。期望的性状，包括高度、总生物质量、根部和/或芽生物质量、种子萌发、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物籽粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合，可以用于测量生长，并且与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，没有引入和/或改善的性状的植物)的生长速率进行比较。在一些实例中，期望的性状，包括高度、总生物质量、根部和/或芽生物质量、种子萌发、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物籽粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合，可以用于测量生长，并且与在相似条件下生长的参考农业植物(例如，没有引入和/或改善的性状的植物)的生长速率进行比较。
宿主植物的农学性状可以包括但不限于以下：与在没有所述种子处理制剂的情况下由种子生长的等值线植物相比，改变的油含量、改变的蛋白质含量、改变的种子碳水化合物组成、改变的种子油组成和改变的种子蛋白质组成、耐化学品性、耐寒性、延迟的衰老、抗病性、耐旱性、穗重、生长改善、健康增强、耐热性、除草剂耐受性、草食动物抗性、改善的固氮、改善的氮利用率、改善的根部架构、改善的水分使用效率、增加的生物质量、增加的根长、增加的种子重量、增加的芽长、增加的产量、在水受限条件下增加的产量、仁粒质量、仁粒含水量、金属耐受性、穗数、每只穗的仁粒数、荚数、养分增强、病原体抗性、害虫抗性、光合能力改善、耐盐性、持绿性、活力改善、增加的成熟种子的干重、增加的成熟种子的鲜重、增加的每株植物成熟种子的数目、增加的叶绿素含量、增加的每株植物的荚数、增加的每株植物的荚长、减少的每株植物枯萎叶片的数目、减少的每株植物严重枯萎叶片的数目、和增加的每株植物非枯萎叶片的数目、代谢物水平的可检测调控、转录物水平的可检测调控和蛋白质组中的可检测调控。
在一些情况下，用与经接种植物的植物元件相同的植物物种中分离出的细菌或细菌群体来接种植物。例如，通常存在于一种玉蜀黍(Zea mays)(玉米)品种中的细菌或细菌群体与另一种在自然状态下缺乏所述细菌和细菌群体的玉蜀黍品种的植物的植物元件相关联。在一个实施方案中，细菌和细菌群体来源于与经接种植物的植物元件相同的植物的相关物种的植物。例如，将通常存在于Iltis等人的二倍体多年生蜀黍(Zeadiploperennis)(二倍体多年生类蜀黍(diploperennial teosinte))中的细菌和细菌群体施加到玉蜀黍(玉米)，或反之亦然。在一些情况下，用与经接种植物的植物元件异源的细菌和细菌群体来接种植物。在一个实施方案中，细菌和细菌群体来源于另一个物种的植物。例如，将通常存在于双子叶植物中的细菌和细菌群体施加到单子叶植物(例如，用大豆来源的细菌和细菌群体接种玉米)，或反之亦然。在其他情况下，待接种到植物上的细菌和细菌群体来源于正在接种的植物的相关物种。在一个实施方案中，细菌和细菌群体来源于相关分类单元，例如来源于相关物种。另一个物种的植物可以是农业植物。在另一个实施方案中，细菌和细菌群体是接种到任何宿主植物元件中的经设计组合物的一部分。
在一些实例中，细菌或细菌群体是外源的，其中所述细菌和细菌群体从与经接种植物不同的植物中分离。例如，在一个实施方案中，细菌或细菌群体可以从与经接种植物相同的物种的不同植物中分离。在一些情况下，细菌或细菌群体可以从与经接种植物相关的物种中分离。
在一些实例中，本文所述的细菌和细菌群体能够从一种组织类型移动到另一种组织类型。例如，本公开在种子外部包被后对植物成熟组织内细菌和细菌群体的检测和分离证明了细菌和细菌群体从种子外部移动到成熟植物的营养组织内的能力。因此，在一个实施方案中，细菌的群体和细菌群体能够从种子外部移动到植物的营养组织中。在一个实施方案中，包被到植物种子上的细菌和细菌群体能够在种子萌发成营养状态时定位到植物的不同组织。例如，细菌和细菌群体可以定位到植物中的组织中的任一种，包括：根部、不定根部、种子5根部、根毛、芽、叶、花、苞、穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐茎、根茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、排水孔、瓣片、萼片、颖片、叶轴、维管形成层、韧皮部和木质部。在一个实施方案中，细菌和细菌群体能够定位到植物的根部和/或根毛。在另一个实施方案中，细菌和细菌群体能够定位到植物的光合组织，例如叶和芽。在其他情况下，细菌和细菌群体定位到植物的维管组织中，例如在木质部和韧皮部中。在再一实施方案中，细菌和细菌群体能够定位到植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实)。在另一个实施方案中，细菌和细菌群体能够定位到植物的根部、芽、叶和生殖组织。在再一实施方案中，细菌和细菌群体定殖植物的果实或种子组织。在再一实施方案中，细菌和细菌群体能够定殖植物，使得所述细菌和细菌群体存在于植物的表面中(即，其存在可检测地存在于植物外部或植物的表层)。在再其他实施方案中，细菌和细菌群体能够定位到植物的基本上全部或全部组织。在某些实施方案中，细菌和细菌群体不定位到植物的根部。在其他情况下，细菌和细菌群体不定位到植物的光合组织。
还可以通过测量作物的相对成熟度或作物热单位(CHU)来评估组合物的有效性。例如，可以将细菌群体施加到玉米，并且可以根据玉米仁粒的相对成熟度或玉米仁粒达到最大重量的时间来评估玉米生长。作物热单位(CHU)也可以用于预测玉米作物的成熟。CHU通过测量作物生长的每日最高温度来确定热量积累的量。
在实例中，细菌可以定位到植物中的组织中的任一种，包括：根部、不定根部、种子根部、根毛、芽、叶、花、苞穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐茎、根茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、排水孔、瓣片、萼片、颖片、叶轴、维管形成层、韧皮部和木质部。在另一个实施方案中，细菌或细菌群体能够定位到植物的光合组织，例如叶和芽。在其他情况下，细菌和细菌群体定位到植物的维管组织中，例如在木质部和韧皮部中。在另一个实施方案中，细菌或细菌群体能够定位到植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊或果实)。在另一个实施方案中，细菌和细菌群体能够定位到植物的根部、芽、叶和生殖组织。在另一个实施方案中，细菌或细菌群体定殖植物的果实或种子组织。在再一实施方案中，细菌或细菌群体能够定殖植物，使得所述细菌或细菌群体存在于植物的表面中。在另一个实施方案中，细菌或细菌群体能够定位到植物的基本上全部或全部组织。在某些实施方案中，细菌或细菌群体不定位到植物的根部。在其他情况下，细菌和细菌群体不定位到植物的光合组织。
可以通过测量作物生长的各种特征来评估施加到作物的细菌组合物的有效性，这些特征包含但不限于种植率、播种活力、根部强度、耐旱性、株高、脱水和测试重量。
植物物种
本文所述的方法和细菌适用于多种植物中的任一种，诸如大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属和小麦属(Triticeae)中的植物。合适的植物的其他非限制性实例包括苔藓、地衣和藻类。在一些情况下，植物具有经济、社会和/或环境价值，诸如粮食作物、纤维作物、油料作物、林业或纸浆和造纸工业中的植物、用于生物燃料生产的原料和/或观赏植物。在一些实例中，植物可以用于生产具有经济价值的产品，诸如谷物、面粉、淀粉、糖浆、粗粉、油、膜、包装、营养食品产品、纸浆、动物饲料、鱼饲料、用于工业化学品的散装材料、谷类产品、加工的人类食品、糖、酒精和/或蛋白质。作物植物的非限制性实例包括玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦黑小麦、荞麦、甜玉米、甘蔗、洋葱、番茄、草莓和芦笋。在一些实施方案中，本文所述的方法和细菌适用于多种转基因植物、非转基因植物及其杂交植物中的任一种。
在一些实例中，可以使用本文公开的方法和组合物获得或改善的植物可以包括对于农业、园艺、用于生产生物燃料分子和其他化学品的生物质量和/或林业来说重要或令人感兴趣的植物。这些植物的一些实例可以包括菠萝、香蕉、椰子、百合、家山黧豆(grasspea)和草；以及双子叶植物，例如像豌豆、苜蓿、粘果酸浆(tomatillo)、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、小扁豆、大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝菜、油菜(rape)、苹果树、葡萄、棉花、葵花、拟南芥(thale cress)、芥花、柑橘属(包括橙、柑橘(mandarin)、金橘(kumquat)、柠檬、酸橙、葡萄柚、红橘(tangerine)、橘柚(tangelo)、香橼(citron)和柚子(pomelo))、胡椒、菜豆(bean)、生菜、柳枝稷(Panicum virgatum)(风倾草(switch))、二色高粱(Sorghum bicolor)(高粱(sorghum)、苏丹草(sudan))、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒属)、蔗属物种(Saccharum sp.)(能源甘蔗(energycane))、欧洲大叶杨(Populusbalsamifera)(白杨)、玉蜀黍(玉米)、大豆(Glycine max)(大豆(soybean))、甘蓝型油菜(Brassicanapus)(芥花)、普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)(棉花)、水稻(Oryza sativa)(水稻(rice))、向日葵(Helianthus annuus)(葵花(sunflower))、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris)(甜菜(sugarbeet))、御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠粟)、黍属物种(Panicum spp.)、高粱属物种、芒属物种、蔗属物种、蔗茅属物种(Erianthus spp.)、白杨物种(Populus spp.)、黑麦(Secale cereale)(黑麦(rye))、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptusspp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属-25小麦X黑麦)、竹子、红花(Carthamus tinctorius)(红花(safflower))、桐油树(Jatropha curcas)(麻风树属(Jatropha))、普通蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻(castor))、油棕(Elaeis guineensis)(油棕(oil palm))、海枣(Phoenix dactylifera)(椰枣(date palm))、肯氏假槟榔(Archontophoenix cunninghamiana)(国王假槟榔(king palm))、金山葵(Syagrusromanzoffiana)(皇后葵(queen palm))、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻(Linumusitatissimum))、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Manihot esculenta)(木薯(cassaya))、番茄(Lycopersicon esculentum)(番茄(tomato))、莴苣(Lactuca saliva)(生菜)、大蕉(Musa paradisiaca)(香蕉)、马铃薯(Solanum tuberosum)(马铃薯(potato))、甘蓝(Brassica oleracea)(椰菜、花椰菜、球芽甘蓝)、山茶(Camellia sinensis)(茶)、草莓(Fragaria ananassa)(草莓(straw berry))、可可树(Theobroma cacao)(可可(cocoa))、小粒咖啡(Coffea arabica)(咖啡)、酿酒葡萄(Vitis vinifera)(葡萄)、菠萝(Ananascomosus)(菠萝(pineapple))、辣椒(Capsicumannum)(辣椒和甜椒)、洋葱(Alliumcepa)(洋葱(onion))、厚皮甜瓜(Cucumis melo)(甜瓜)、黄瓜(Cucumis sativus)(黄瓜(cucumber))、笋瓜(Cucurbita maxima)(南瓜属(squash))、南瓜(Cucurbita moschata)(南瓜属)、菠菜(Spinacea oleracea)(菠菜(spinach))、西瓜(Citrullus lanatus)(西瓜(watermelon))、咖啡黄葵(Abelmo schus esculentus)(秋葵)、茄(Solanum melongena)(茄子)、罂粟(Papaver somniferum)(罂粟(opiumpoppy))、东方罂粟(Papaverorientale)、欧洲红豆杉(Taxus baccata)、短叶红豆杉(Taxus brevifolia)、黄花蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabis saliva)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、长春花(Vinca rosea)、正鸡纳树(Cinchona officinalis)、秋水仙(Coichicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、洋地黄(Digitalislanata)、毛地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属物种(Dioscorea 5spp.)、穿心莲(Andrographis paniculata)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属物种(Berberis spp.)、三尖杉属物种(Cephalotaxus spp.)、麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属物种(Ephedra spp.)、古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthus wornorii)、赛莨菪属物种(Scopolia spp.)、千层塔(Lycopodium serratum)(蛇足石杉(Huperziaserrata))、石松属物种(Lycopodium spp.)、蛇根木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属物种(Rauwolfia spp.)、血根草(Sanguinaria canadensis)、天仙子属物种(Hyoscyamusspp.)、金盏花(Calendula officinalis)、短舌匹菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)、小白菊(Tanacetum parthenium)、灰白银胶菊(Partheniumargentatum)(银胶菊(guayule))、橡胶树属物种(Hevea spp.)(橡胶)、留兰香(Menthaspicata)(薄荷)、辣薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、红木(Bixa orellana)、六出花属物种(Alstroemeria spp.)、蔷薇属物种(Rosa spp.)(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus)(康乃馨)、矮牵牛属物种(Petunia spp.)(矮牵牛)、一品红(Poinsettia pulcherrima)(一品红(poinsettia))、烟草(Nicotiana tabacum)(烟草(tobacco))、白羽扇豆(Lupinusalbus)(羽扇豆)、海燕麦(Uniola paniculata)(燕麦)、大麦(Hordeum vulgare)(大麦(barley))和黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦)。
在一些实例中，可以使用单子叶植物。单子叶植物属于以下目：泽泻目(Alismatales)、天南星目(Arales)、棕榈目(Arecales)、凤梨目(Bromeliales)、鸭跖草目(Commelinales)、环花目(Cyclanthales)、莎草目(Cyperales)、谷精草目(Eriocaulales)、水鳖目(Hydrocharitales)、灯芯草目(Juncales)、百合目(Lilliales)、茨藻目(Najadales)、兰目(Orchidales)、露兜树目(Pandanales)、禾本目(Poales)、帚灯草目(Restionales)、霉草目(Triuridales)、香蒲目(Typhales)和姜目(Zingiberales)。属于裸子植物纲(Gymnospermae)的植物是苏铁目(Cycadales)、银杏目(Ginkgoales)、买麻藤目(Gnetales)和松目(Pinales)。在一些实例中，单子叶植物可以选自由玉蜀黍、水稻、小麦、大麦和甘蔗组成的组。
在一些实例中，可以使用双子叶植物，包括属于以下目的植物：马兜铃目(Aristochiales)、菊目(Asterales)、肉穗果目(Batales)、桔梗目(Campanulales)、白花菜目(Capparales)、石竹目(Caryophyllales)、木麻黄目(Casuarinales)、卫矛目(Celastrales)、山茱萸目(Cornales)、岩梅目(Diapensales)、五桠果目(Dilleniales)、川续断目(Dipsacales)、柿树目(Ebenales)、杜鹃花目(Ericales)、杜仲目(Eucomiales)、大戟目(Euphorbiales)、豆目(Fabales)、壳斗目(Fagales)、龙胆目(Gentianales)、牻牛儿苗目(Geraniales)、小二仙草目(Haloragales)、金缕梅目(Hamamelidales)、Middles、胡桃目(Juglandales)、唇形目(Lamiales)、樟目(Laurales)、玉蕊目(Lecythidales)、莱脱纳目(Leitneriales)、木兰目(Magniolales)、锦葵目(Malvales)、杨梅目(Myricales)、桃金娘目(Myrtales)、睡莲目(Nymphaeales)、罂粟目(Papeverales)、胡椒目(Piperales)、车前目(Plantaginales)、蓝雪目(Plumb aginales)、川苔草目(Podostemales)、花荵目(Polemoniales)、远志目(Polygalales)、蓼目(Polygonales)、报春花目(Primulales)、山龙眼目(Proteales)、大花草目(Rafflesiales)、毛茛目(Ranunculales)、鼠李目(Rhamnales)、蔷薇目(Rosales)、茜草目(Rubiales)、杨柳目(Salicales)、檀香目(Santales)、无患子目(Sapindales)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、玄参目(Scrophulariales)、山茶目(Theales)、昆栏树目(Trochodendrales)、伞形目(Umbellales)、荨麻目(Urticales)以及堇菜目(Violates)。在一些实例中，双子叶植物可以选自由棉花、大豆、胡椒以及番茄组成的组。
在一些情况下，待改善的植物不容易适合于实验条件。例如，作物植物可能花费过长时间才能生长到足以在多个迭代中连续地实际评估改善的性状。因此，最初分离出细菌的第一植物和/或施加了遗传操纵的细菌的多个植物可以是模型植物，诸如更适合于在所需条件下进行评价的植物。模型植物的非限制性实例包括狗尾草属(Setaria)、短柄草属(Brachypodium)和拟南芥属(Arabidopsis)。然后可以将根据本公开的方法使用模型植物分离的细菌的能力施加于另一种类型的植物(例如，作物植物)，以确认赋予改善的性状。
可以通过本文公开的方法改善的性状包括植物的任何可观察到的特征，包括例如生长速率、高度、重量、颜色、味道、气味、植物的一种或多种化合物(包含例如代谢物、蛋白质、药物、碳水化合物、油以及任何其他化合物)产生的变化。还设想了基于基因型信息选择植物(例如，包括响应于细菌的植物基因表达模式，或鉴定基因标记物(诸如与固氮增加相关联的标记物)的存在)。还可以基于与某一特征或性状(诸如期望的特征或性状)的存在相反的某一特征或性状(诸如不期望的特征或性状)的不存在、遏止或抑制来选择植物。
农业组合物的浓度和施加速率
如前所述，可以多种方式将包含所产生和/或鉴定的微生物的本公开的农业组合物施加到植物。在两个特定方面，本公开考虑沟内处理剂或种子处理剂
对于种子处理剂实施方案，本公开的微生物可以多种浓度存在于种子上。例如，微生物可以以下列cfu浓度/种子存在于种子处理剂中：1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010或更高。在特定方面，种子处理组合物包含约1×104至约1×108cfu/种子。在其他特定方面，种子处理组合物包含约1×105至约1×107cfu/种子。在其他方面，种子处理组合物包含约1×106cfu/种子。一般而言，本文提供的农业或微生物组合物中存在的一种或多种细菌可以具有至少约1.0×104个细菌细胞/克植物根部组织鲜重的平均每单位植物根部组织的定殖能力，并且可以产生至少约1×10- 17mmol N/细菌细胞/小时的固定的N。
在美国，约10％的玉米种植面积的种子密度在约36,000个种子/英亩以上；1/3的玉米种植面积的种子密度在约33,000个种子/英亩至36,000个种子/英亩之间；1/3的玉米种植面积的种子密度在约30,000个种子/英亩至33,000个种子/英亩之间，并且其余部分的面积是可变的。参见，Steve Butzen所写的“Corn Seeding Rate Considerations”，可获自：https://www.pioneer.com/home/site/us/agronomy/library/corn-seeding-rate-considerations/
下表8利用所考虑的种子处理剂实施方案中的各种cfu浓度/种子(横列)和各种种子面积种植密度(第1列：15K-41K)来计算cfu/英亩的总量，其可以用于各种农业场景(即，种子处理剂浓度/种子×种植的种子密度/英亩)。因此，如果利用具有1×106cfu/种子的种子处理剂并且种植30,000个种子/英亩，则总cfu含量/英亩将为3×1010(即，30K*1×106)。
表8：种子处理实施方案的总CFU/英亩计算
Figure BDA0003318753660000881
Figure BDA0003318753660000891
对于沟内实施方案，本公开的微生物可以以下列cfu浓度/英亩施加：1×106、3.20×1010、1.60×1011、3.20×1011、8.0×1011、1.6×1012、3.20×1012或更高。因此，在各方面，液体沟内组合物可以以约1×106至约3×1012cfu/英亩之间的浓度施加。
在一些方面，沟内组合物包含在液体制剂中。在液体沟内实施方案中，微生物可以以下列cfu浓度/毫升存在：1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或更高。在某些方面，液体沟内组合物包含浓度为约1×106至约1×1011cfu/毫升的微生物。在其他方面，液体沟内组合物包含浓度为约1×107至约1×1010cfu/毫升的微生物。在其他方面，液体沟内组合物包含浓度为约1×108至约1×109cfu/毫升的微生物。在其他方面，液体沟内组合物包含浓度高达约1×1013cfu/毫升的微生物。
生物传感器施加
在一些方面，本文提供了利用如本文提供的生物传感器来检测组合物或培养基中铵的存在的方法。所述方法可以包括：(a)用生物传感器接种组合物，其中所述生物传感器包括表达报告蛋白的细菌，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达报告分子；(b)将经接种的组合物暴露于足以激活报告分子的刺激；和(c)在(b)之后检测与对照组合物相比经接种的组合物的报告分子输出。在一些情况下，所述方法还包括基于检测的报告分子输出量化所述组合物中铵的量。
在一些方面，本文提供了利用如本文提供的生物传感器来鉴定包含至少一个遗传变异的细菌的方法，所述至少一个遗传变异被引入固氮或同化遗传调节网络的至少一种基因或非编码多核苷酸中。所述至少一个遗传变异可以经由本文所述的随机诱变方法引入。
在一个实施方案中，本文提供了用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法。用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法可以包括：(a)将细菌群体暴露于微生物组合物中的诱变剂；(b)将所述微生物组合物与生物传感器共培养，其中所述生物传感器包括表达报告蛋白的细菌，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达报告分子；(c)将共培养的组合物暴露于足以激活报告分子的刺激；和(d)将能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起报告分子输出减少或无报告分子输出的细菌突变体。对照可以是包含生物传感器的共培养物，所述生物传感器包括已知能够固定大气氮的细菌和细菌菌株。对照可以是包含生物传感器的共培养物，所述生物传感器包括已知不能固定大气氮的细菌和细菌菌株。在一些情况下，所述方法还包括分离(d)中鉴定的能够固定大气氮的细菌突变体。
用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法可以包括：(a)将细菌群体暴露于诱变剂；(b)将暴露于(a)中的诱变剂的细菌群体暴露于微生物组合物中的固氮生长抑制剂；(c)将所述微生物组合物与生物传感器共培养，其中所述生物传感器包括表达报告蛋白的细菌；(d)将共培养的组合物暴露于足以激活报告分子的刺激，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；和(e)将能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起报告分子输出减少或无报告分子输出的细菌突变体。对照可以是包含生物传感器的共培养物，所述生物传感器包括已知能够固定大气氮的细菌和细菌菌株。对照可以是包含生物传感器的共培养物，所述生物传感器包括已知不能固定大气氮的细菌和细菌菌株。在一些情况下，所述方法还包括分离在(e)中鉴定的能够固定大气氮的细菌突变体。固氮生长抑制剂可以是乙二胺(EDA)或甲基铵。
利用如本文提供的生物传感器的本文提供的方法中的任一种在性质上可以是高通量的。
在一个实施方案中，用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法是高通量的并且包括：(a)将细菌群体暴露于诱变剂；(b)将(a)中的细菌群体转移到一个或多个包含培养基的样品中；(c)在(b)中的一个或多个样品中的每一个内共培养生物传感器，其中所述生物传感器包括表达报告蛋白的细菌，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达报告分子；(d)将(c)中的一个或多个样品中的每一个暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和(e)从(d)中的一个或多个样品中将一种或多种能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起所述报告分子输出降低的细菌突变体。对照可以是包含生物传感器的共培养物，所述生物传感器包括已知能够固定大气氮的细菌和细菌菌株。对照可以是包含生物传感器的共培养物，所述生物传感器包括已知不能固定大气氮的细菌和细菌菌株。在一些情况下，所述方法还包括分离在(e)中鉴定的能够固定大气氮的细菌突变体。
除了利用如本文提供的生物传感器的上述方法中的任一种之外，可以在将包含生物传感器(包括细菌)的组合物或共培养物暴露于足以激活报告蛋白的刺激之后测量或检测与对照组合物相比的报告蛋白输出。对照组合物可以包含不表达报告蛋白的微生物。对照组合物可以包含表达报告蛋白的功能缺失变体的微生物。
在一些方面，本文提供了利用如本文提供的生物传感器来鉴定遗传变异的方法，所述遗传变异被引入突变细菌细胞的固氮或同化遗传调节网络的至少一种基因或非编码多核苷酸中。所述至少一个遗传变异可以经由本文所述的随机诱变方法引入。在一些情况下，除了用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的上述实施方案中的任一个之外，所述方法还包括在分离所述鉴定的细菌之后对鉴定为能够固定大气氮的细菌的基因组进行测序；以及从测序的基因组中鉴定含有突变的基因、途径和/或调节元件。在一些情况下，所述方法还包括确定所述基因、途径和/或调节元件是否含有已知与大气氮的固定相关联的突变。
在一个实施方案中，用于采用所述生物传感器的方法中的任一种的生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子。用于生物传感器的启动子或其片段可以选自nifHDK操纵子。在一个实施方案中，启动子是nifH启动子。抑制性固氮调节蛋白可以是NifL。正固氮调节蛋白可以是NifA。
用于本文提供的方法中的任一种的细菌群体可以是本领域已知的和/或本文提供的任何细菌群体。在一个实施方案中，细菌群体选自野生型细菌、转基因突变细菌、非属间突变细菌和属间突变细菌。
在一个实施方案中，刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。在一个实施方案中，刺激是光。
除了上述实施方案中的任一个之外，报告蛋白或分子可以是本领域已知的和/或本文提供的任何报告蛋白。在一些方面，报告子可以是适于产生发光或荧光信号的酶。在一些方面，报告蛋白可以是酶，诸如分别产生发光或荧光信号的荧光素酶或碱性磷酸酶。在一些方面，报告子还可以是荧光蛋白或可以包括荧光、带电或磁性纳米颗粒、纳米点或量子点。在一些方面，报告子可以是具有荧光、紫外线或可见光特性的染料，其中荧光、紫外线或可见光特性响应于生物传感器电路的激活而经历可检测的变化。在一个实施方案中，报告蛋白或分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。荧光蛋白可以是本领域已知的和/或本文提供的任何荧光蛋白，例如像GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。在一个实施方案中，荧光蛋白是GFP。在一个实施方案中，GFP是超折叠GFP。在一个实施方案中，报告蛋白是荧光蛋白并且刺激是光，使得暴露包含生物传感器(包括细菌)的共培养物需要将所述共培养物暴露于足以使荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。然后可以用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测和/或测量荧光输出(例如，强度)。
在上述实施方案中的任一个中使用的诱变剂可以是本领域已知的和/或本文提供的任何诱变剂。诱变剂可以选自丝裂霉素C(MMC)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、亚硝酸(NA)、二环氧丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基-2-氯乙基]-氨基丙胺)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)。在一个实施方案中，诱变剂是EMS。
高通量方法
在一些方面，高通量方法能够对至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000个细菌进行所述方法。在一些方面，高通量方法能够在小于1小时、小于2小时、小于3小时、小于4小时、小于5小时、小于6小时、小于7小时、小于8小时、小于9小时、小于10小时、小于11小时、小于12小时、小于24小时、小于36小时、小于48小时、小于60小时或小于72小时内进行。在一些方面，高通量方法能够在小于1天、小于2天、小于3天、小于4天、小于5天、小于6天或小于7天内进行。
在一些方面，高通量方法能够在小于1小时、小于2小时、小于3小时、小于4小时、小于5小时、小于6小时、小于7小时、小于8小时、小于9小时、小于10小时、小于11小时、小于12小时、小于24小时、小于36小时、小于48小时、小于60小时或小于72小时内对至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000个细菌进行所述方法。
在一些方面，本公开的方法包括使用微量的培养基或另一种液体，其中可以将诱变的微生物与生物传感器一起放置。在报告蛋白是荧光蛋白的实施方案中，这些小体积的液体相当于微滴，其可以与生物传感器菌株一起利用以快速筛选随机微生物突变体并经由荧光激活液滴分选来分选和收集液滴。
在一些方面，微滴包含小于2μL、小于3μL、小于4μL、小于5μL、小于6μL、小于7μL、小于8μL、小于9μL、小于10μL、小于11μL、小于12μL、小于13μL、小于14μL、小于15μL、小于16μL、小于17μL、小于18μL、小于19μL、小于20μL、小于21μL、小于22μL、小于23μL、小于24μL、小于25μL、小于30μL、小于35μL、小于40μL、小于45μL、小于50μL、小于55μL、小于60μL、小于65μL、小于70μL、小于75μL、小于80μL、小于85μL、小于90μL、小于95μL、小于100μL、小于125μL、小于150μL、小于175μL、小于200μL、小于225μL、小于250μL、小于275μL、小于300μL、小于325μL、小于350μL、小于375μL、小于400μL、小于425μL、小于450μL、小于475μL或小于500μL的液体。
在一些方面，微滴在直径上小于1μM、小于2μM、小于3μM、小于4μM、小于5μM、小于6μM、小于7μM、小于8μM、小于9μM、小于10μM、小于15μM、小于20μM、小于25μM、小于30μM、小于35μM、小于40μM、小于45μM、小于50μM、小于55μM、小于60μM、小于65μM、小于70μM、小于75μM、小于80μM、小于85μM、小于90μM、小于95μM、小于100μM、小于125μM、小于150μM、小于175μM、小于200μM、小于225μM、小于250μM、小于275μM、小于300μM、小于350μM、小于400μM、小于450μM、小于500μM、小于550μM、小于600μM、小于650μM、小于700μM、小于750μM、小于800μM、小于850μM、小于900μM、小于950μM或小于1000μM。
可以对分选的液滴进行测序以鉴定负责改善铵分泌的遗传修饰。高通量方法提供了一种靶向遗传工程以增强固氮和氨分泌微生物的方法。
在固氮条件下培养突变体库后，通过由流式细胞仪、酶标仪或其他荧光输出检测方法分析来自生物传感器的GFP，来定量测量或检测培养基中分泌的铵的水平。由于生物传感器携带抗生素选择标记物，我们可以通过施加生物传感器对其有抗性的抗生素来裂解固氮微生物，从而进一步使得能够使用生物传感器分析由突变的微生物固定的氮的细胞内水平。
在一些方面，在添加一种或多种生物传感器微生物之前或在稀释培养基之前将突变体合并在一起。在一些方面，合并的突变体包含2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100种不同的突变体。
实施例
实施例1.克雷伯氏菌属、科萨克氏菌属和甲烷嗜热杆菌属的生物传感器测定
第1天-通过将单个菌落接种到含有1ml富培养基(例如，Lennox LB或SOB)的96深孔板中，启动用于铵分泌测定的培养物。在30℃下在900rpm摇动下孵育培养物过夜。
第2天-将过夜培养物在含有17.1mM乙酸铵的ARA基本培养基中稀释100倍，至96孔板中。稀释可以是2μL过夜培养物至200μL新鲜基本培养基。乙酸铵可以用其他氮源取代。将96孔板在30℃下在900rpm摇动下孵育24小时。通过将单个菌落接种到在15ml质粒培养管中的1ml补充有15μg/ml庆大霉素的LB培养基中，启动生物传感器菌株的培养物，并且在37℃下在250rpm下孵育过夜。
第3天-通过将50μL过夜培养物添加到96深孔板中的450μL无铵ARA基本培养基中，稀释用于铵分泌测定的培养物。将96孔板转移到厌氧Coy室中，并且在30℃下在900rpm摇动下生长24小时(可以调整孵育时间)。将生物传感器培养物在15mL培养管中的补充15μg/mL庆大霉素的含有17.1mM乙酸铵的ARA基本培养基中稀释100倍，并且在37℃下在250rpm下孵育约24小时。
第4天-将20μL补充有150μg/ml庆大霉素的10X ARA盐培养基和20μL过夜生长的生物传感器添加到新的96孔反应板中。从室中取出用于铵分泌测定的培养物，并以4,000g离心20分钟以分离细胞团粒。将160μL上清液添加到反应板中，使总量为200μL。可以基于铵分泌水平调整上清液的稀释。如果使用小于160μL的上清液，向其余反应物中填充1X ARA缓冲液以使体积达到200μL。将96孔板转移到厌氧Coy室中，并且在30℃下在900rpm摇动下生长15-18小时。
第5天-从厌氧室中取出板，并且在室温下孵育大约一小时用于GFP成熟，然后读数。荧光信号可以通过酶标仪或流式细胞仪分析。通过将细胞在补充有2mg/ml卡那霉素的冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，可以阻止生物传感器的翻译，但是荧光信号在室温下在12小时内是稳定的，并且在4℃下持续稳定若干天。
包括阳性对照和阴性对照是必要的。此实验分别利用变栖克雷伯氏菌菌株137-2084和138-1590作为阳性对照和阴性对照。菌株137-2084和138-1590来源于变栖克雷伯氏菌137。固定的氮(例如，铵或谷氨酰胺)的标准曲线可以在第4天的反应板中通过使固定的氮源不同而产生，其中含有分泌的铵的上清液用1X无铵ARA缓冲液置换。
表1：10X ARA盐培养基(每升)
200g蔗糖
0.25g MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>0
10g NaCl
1g CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O
29mg FeCl<sub>3</sub>
2.5mg Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O
如果添加氮：6μL/mL的22％乙酸铵(最终17.1mM)
表2：ARA缓冲液(每升)
25g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
3g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
如果添加氮：6μL/mL的22％乙酸铵(最终17.1mM)
实施例2：副伯克霍尔德氏菌属和草螺菌属的生物传感器测定
第1天-通过将单个菌落接种到含有1ml富培养基(例如，Lennox LB或SOB)的96深孔板中，启动用于铵分泌测定的培养物。在30℃下在900rpm摇动下孵育培养物过夜。
第2天-将过夜培养物在含有10mM氯化铵的JMV基本培养基中稀释100倍，至96孔板中。稀释可以是2μL过夜培养物至200μL新鲜基本培养基。氯化铵可以用其他氮源取代。将96孔板在30℃下在900rpm摇动下孵育24小时。
第3天-通过将50μL过夜培养物添加到96深孔板中的450μL无铵JMV基本培养基中，稀释用于铵分泌测定的培养物。将96孔板转移到缺氧Coy室中，并且在30℃下在缺氧条件(1～3％氧)下在900rpm摇动下生长48小时(可以调整孵育时间)。通过将单个菌落接种到在15ml质粒培养管中的1ml补充有15μg/ml庆大霉素的LB培养基中，启动生物传感器菌株的培养物，并且在37℃下在250rpm下孵育过夜。
第4天-将生物传感器培养物在15mL培养管中的补充15μg/mL庆大霉素的含有17.1mM乙酸铵的ARA基本培养基中稀释100倍，并且在37℃下在250rpm下孵育约24小时。
第5天-将20μL补充有150μg/ml庆大霉素的10X ARA盐培养基和20μL过夜生长的生物传感器添加到新的96孔反应板中。从室中取出用于铵分泌测定的培养物，并以4,000g离心20分钟以分离细胞团粒。将160μL上清液添加到反应板中，使总量为200μL。可以基于铵分泌水平调整上清液的稀释。如果使用小于160μL的上清液，向其余反应物中填充1X JMV缓冲液以使体积达到200μL。将96孔板转移到厌氧Coy室中，并且在30℃下在900rpm摇动下生长15-18小时。
第6天-从厌氧室中取出板，并且在室温下孵育大约一小时用于GFP成熟，然后读数。荧光信号可以通过酶标仪或流式细胞仪分析。通过将细胞在补充有2mg/ml卡那霉素的冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，可以阻止生物传感器的翻译，但是荧光信号在室温下在12小时内是稳定的，并且在4℃下持续稳定若干天。
包括阳性对照和阴性对照是必要的。此实验分别利用热带副伯克霍尔德氏菌野生型和热带副伯克霍尔德氏菌8-4752作为阴性对照和阳性对照。菌株137-4752来源于热带副伯克霍尔德氏菌8。固定的氮(例如，铵或谷氨酰胺)的标准曲线可以在第5天的反应板中通过使固定的氮源不同而产生，其中含有分泌的铵的上清液用1X无铵JMV缓冲液置换。
表3：10X JMV盐培养基(每升)
50g甘露醇
18.02g葡萄糖
2g MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>0
1g NaCl
1g CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O
0.65g Fe-EDTA
10ml的痕量元素
如果添加氮：10μL/mL的1M氯化铵(最终10mM)
表4：痕量元素(每升)
0.04g CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O
0.12g ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O
1.4g H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
1g Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O
1.175g MnSO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O
表5：JMV缓冲液(每升)
0.6g K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
1.8g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
使用KOH将pH值调整至7.0
实施例3：联合EDA-2AP选择测定
将克雷伯氏菌属、科萨克氏菌属、甲烷嗜热杆菌属、副伯克霍尔德氏菌属或草螺菌属的单菌落接种到富培养基中，并且在30℃下生长过夜。将过夜培养物的等分试样(5μL)稀释到1mL补充有0.5mg/mL至1mg/mL之间的2-氨基嘌呤的富培养基中，并且在30℃下生长24小时。在所述24小时结束时，将培养物用PBS洗涤两次并铺板在补充有约0.1％EDA至约0.2％EDA的EDA或约25mM至约200mM甲基铵的甲基铵的无铵基本培养基上，并且将板在30℃下在厌氧条件或缺氧条件下分别孵育诸如克雷伯氏菌属的兼性厌氧菌和诸如副伯克霍尔德氏菌属的专性需氧菌(图3A)。所得单个菌落被表明为对EDA或甲基铵的抗性突变体，并且进行选择、在液体培养基中生长并储存。
将生物传感器菌株与EDA或甲基铵抗性突变体组合用于共培养生物传感器菌株与单个抗性突变体和各种对照菌株，允许确定来自抗性突变体的固氮活性的铵分泌程度，如通过生物传感器菌株的GFP荧光的存在/不存在或其程度所确定的。生物传感器可以检测到来自5种选择的EDA抗性突变体的铵分泌比来自137野生型及其通过靶向工程改造的衍生物的铵分泌高(图4)。另外，由于无法检测来自野生型菌株的铵分泌，因此生物传感器可以检测到来自选择的甲基铵抗性突变体的铵分泌比来自其自身野生型的铵分泌高(图10A-B)。这些方法提供低假阳性率。由来自变栖克雷伯氏菌的327种突变体和20％的EDA抗性突变体组成的库显示出改善的铵分泌。(图6)。另外，当突变体暴露于铵时，我们可以检测到固氮酶表达。我们引入在nifH启动子的调节下的含有GFP的质粒。在野生型背景中，nifH表达被17mM乙酸铵阻遏，而一些突变体即使在存在17mM乙酸铵的情况下也表现出nifH表达，这表明在那些突变体中铵对固氮酶表达的阻遏得到缓解(图7)。这些突变体在存在铵的情况下也显示出固氮酶活性(图8)，并且在孵育72小时后，铵的分泌量更高达22.7mM(图9)。
实施例4：联合甲基铵-EMS选择测定
将克雷伯氏菌属、科萨克氏菌属、甲烷嗜热杆菌属、副伯克霍尔德氏菌属或草螺菌属的单菌落接种到富培养基中，并且在30℃下生长过夜。将过夜培养物的等分试样(10μL)稀释到1mL富培养基中，并且在30℃下生长5小时至约1的光密度。将通过离心收集的细胞团粒用1mL ARA基本培养基洗涤两次。将细胞团粒重新悬浮在1mL ARA基本培养基加14μL EMS中，并且在30℃下孵育2小时。将通过离心收集的细胞团粒用1mL ARA基本培养基洗涤两次，并且重新悬浮在1mL ARA基本培养基中。将细胞的等分试样(50μl)稀释到950μL富培养基中，在30℃下孵育过夜并且铺板在补充有约0.1％EDA至约0.2％EDA的EDA或约25mM至约200mM甲基铵的甲基铵的无铵基本培养基上，并且将板在30℃下在厌氧条件或缺氧条件下分别孵育诸如克雷伯氏菌属的兼性厌氧菌和诸如副伯克霍尔德氏菌属的专性需氧菌(图3B)。所得单个菌落被表明为对EDA或甲基铵的抗性突变体，并且进行选择、在液体培养基中生长并储存。
将生物传感器菌株与EDA或甲基铵抗性突变体组合用于共培养生物传感器菌株与单个抗性突变体和各种对照菌株，允许确定来自抗性突变体的固氮活性的铵分泌程度，如通过生物传感器菌株的GFP荧光的存在/不存在或其程度所确定的。生物传感器可以检测到来自选择的EDA抗性突变体的铵分泌比来自其野生型的铵分泌高(图4)。
实施例5：单核苷酸多态性(SNP)的鉴定
为了鉴定由变栖克雷伯氏菌、蔗糖科萨克氏菌、肠内甲烷嗜热杆菌和热带副伯克霍尔德氏菌产生的铵分泌突变体中的突变，使用全基因组测序分析它们的基因组序列。将基因组DNA从每个突变体中分离出，并用Illumina MiSeq v3测序。使用Bowtie 2将序列读长与参考序列对齐(图10A和表6)。来自四个物种的每个突变体的蛋白质序列和铵分泌水平的变化列于表6中并描绘于图10B中。大多数SNP是在glnA中鉴定出的，所述glnA在四个物种中编码谷氨酰胺合成酶。另外，我们还鉴定了通过调节谷氨酰胺合成酶的腺苷酸化影响谷氨酰胺合成酶活性的变栖克雷伯氏菌的glnE中的突变。值得注意的是，表6中的具有编辑的诱变的微生物已经如表7中所示保藏。
表6：氨分泌突变体中的SNP及其氨分泌水平。
Figure BDA0003318753660001021
实施例6：确定微生物菌株的相对丰度
为了确定如本文提供的实施例中所述鉴定和分离的一些菌株的定殖能力，使用如在2020年1月7日提交的PCT/US2020/012564中所述的cocoseq测定，计算一系列来源于变栖克雷伯氏菌亲本菌株137的细菌菌株的相对丰度百分比。
具体地，将独特的天然存在的cocoseq条形码插入以下菌株中：137、137-1036、137-3933、137-3944、137-4073、137-4074、137-2285。将所有得到的条形码化菌株以相等的比率合并以产生接种物(最终光密度为1.0)，然后将所述接种物施加到无菌砂中的十株幼苗(每株幼苗1mL接种物)。接种后三周收获成功萌发的植物，并将其与先前的定殖实验相似地加工以产生根际的纯化gDNA。将纯化的gDNA用作cocoseq PCR的模板(每个反应3ulgDNA)，如在2020年1月7日提交的PCT/US2020/012564中所述，所述专利以引用的方式并入本文。随后的PCR产物在Illumina MiSeq平台(2×75bp)上测序，并且经由内部软件分析所得数据以鉴定和列举cocoseq条形码。
如图11中可见，本文提供的实施例中鉴定的菌株(例如，137-3933)具有与亲本137菌株相似的定殖能力。
实施例7：用本公开的诱变的菌株进行的试验
将利用表6中所述的保藏的突变微生物中的每一种及其对应的亲本菌株进行实验，以便评价突变微生物固氮的能力。将突变微生物和相应的亲本菌株添加到包含农业上可接受的载剂的液体组合物中，并施加到植物、植物部分(例如，种子)或植物所在的场所或植物将生长的场所。待测试的植物将包括玉米、大豆、芥花、高粱、马铃薯、水稻、蔬菜、谷物(例如大麦、黑麦、高粱)、假谷类(例如面包坚果、荞麦、芝麻)和油籽。
在一组实验中，对于每种待测试的植物，微生物组合物将以约1×106至约1×1011cfu细菌细胞/毫升的浓度或以约1×106至约3×1012cfu/英亩的每英亩浓度沟内施加。
在另一组实验中，微生物组合物将通过以约1×104至约1×108cfu/种子的浓度包被具体植物的种子来施加。
每种微生物的相对和/或绝对丰度将使用如在2020年1月7日提交的PCT/US2020/012564中所述的cocoseq测定来评估。在本实施例中测试的微生物中的每一种(即，来自表6的微生物及其相应亲本菌株)的固N活性将使用体外ARA测定在5mM谷氨酰胺或磷酸铵下评估。
本公开的编号的实施方案
本公开考虑的其他主题在以下编号实的施方案中陈述：
1)一种能够检测组合物中铵的存在的生物传感器，所述生物传感器包括包含以下的细菌：(a)编码报告分子的核酸序列，(b)选自可操作地连接至(a)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(c)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(d)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子。
2)如实施方案1所述的生物传感器，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
3)如实施方案2所述的生物传感器，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
4)如实施方案3所述的生物传感器，其中所述荧光蛋白是GFP。
5)如实施方案4所述的生物传感器，其中所述GFP是超折叠GFP。
6)如上述实施方案中任一项所述的生物传感器，其中所述启动子或其片段选自nifHDK操纵子。
7)如上述实施方案中任一项所述的生物传感器，其中所述启动子是nifH启动子。
8)如上述实施方案中任一项所述的生物传感器，其中所述抑制性固氮调节蛋白是NifL。
9)如上述实施方案中任一项所述的生物传感器，其中所述正固氮调节蛋白是NifA。
10)如上述实施方案中任一项所述的生物传感器，其中所述细菌是大肠杆菌。
11)一种检测组合物中铵的存在的方法，所述方法包括：(a)用生物传感器接种组合物，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(b)将经接种的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和(c)在(b)之后检测与对照组合物相比经接种的组合物的报告分子输出。
12)如实施方案11所述的方法，所述方法还包括基于检测的报告分子输出量化所述组合物中铵的量。
13)如实施方案11或12所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
14)如实施方案11-13中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
15)如实施方案14所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
16)如实施方案15所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
17)如实施方案15或16所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
18)如实施方案17所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
19)如实施方案15-18中任一项所述的方法，其中步骤(b)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
20)如实施方案15-19中任一项所述的方法，其中步骤(c)需要在(b)之后检测与所述对照组合物相比所述经接种的组合物的荧光输出强度。
21)如实施方案15-20中任一项所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
22)一种用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法，所述方法包括：(a)将细菌群体暴露于微生物组合物中的诱变剂；(b)将所述微生物组合物与生物传感器共培养，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(c)将共培养的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和(d)将能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起报告分子输出降低或无报告分子输出的细菌突变体。
23)如实施方案22所述的方法，其中在(c)之后检测与对照组合物相比所述共培养的组合物的报告分子输出。
24)如实施方案23所述的方法，其中所述对照组合物包含不表达所述报告分子的微生物。
25)如实施方案23所述的方法，其中所述对照组合物包含表达所述报告分子的功能缺失变体的微生物。
26)如实施方案22-25中任一项所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
27)如实施方案22-25中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
28)如实施方案27所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
29)如实施方案28所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
30)如实施方案28或29所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
31)如实施方案30所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
32)如实施方案28-31中任一项所述的方法，其中步骤(c)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
33)如实施方案28-32中任一项所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
34)如实施方案22-33中任一项所述的方法，所述方法还包括分离(d)中鉴定的能够固定大气氮的细菌突变体。
35)如实施方案34所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。
36)如实施方案34所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。
37)如实施方案34或36所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括在glnA中包含至少一个遗传变异的细菌。
38)如实施方案37所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
39)如实施方案38所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
40)如实施方案38所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
41)如实施方案38或40所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
42)如实施方案38所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
43)如实施方案38或42所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
44)如实施方案37-43中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
45)如实施方案37-44中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
46)如实施方案37-44中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
47)如实施方案45或46所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列。
48)如实施方案45或46所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
49)如实施方案45、46或48中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
50)如实施方案45或46所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
51)如实施方案45、46或50中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
52)如实施方案45-51中任一项所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ IDNO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
53)如实施方案37所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
54)如实施方案53所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQID NO:4的核酸序列。
55)如实施方案37、53或54中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。
56)如实施方案37或53-55中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
57)如实施方案37或53-55中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
58)如实施方案56或57所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
59)如实施方案56-58中任一项所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ IDNO 43-46组成的组的氨基酸序列。
60)如实施方案34或36所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括在glnE中包含至少一个遗传变异的细菌。
61)如实施方案60所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
62)如实施方案60或61所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
63)如实施方案61或62所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ IDNO:5的核酸序列。
64)如实施方案60-63中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
65)如实施方案60-64中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
66)如实施方案60-64中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
67)如实施方案65或66所述的方法，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
68)如实施方案65-67中任一项所述的方法，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
69)如实施方案65-68中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
70)如实施方案65-69中任一项所述的方法，其中所述GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
71)一种用于高通量鉴定能够固定大气氮的一种或多种细菌突变体的方法，所述方法包括：(a.将细菌群体暴露于诱变剂；(b)将(a)中的细菌群体转移到一个或多个包含培养基的样品中；(c)在(b)中的一个或多个样品中的每一个内共培养生物传感器，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(d)将(c)中的一个或多个样品中的每一个暴露于足以激活报告分子的刺激；和(e)从(d)中的一个或多个样品中将一种或多种能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起所述报告分子输出降低的细菌突变体。
72)如实施方案71所述的方法，其中在(d)之后测量与对照组合物相比(d)中的一个或多个样品的报告分子输出。
73)如实施方案72所述的方法，其中所述对照组合物包含不表达所述报告分子的微生物。
74)如实施方案72所述的方法，其中所述对照组合物包含表达所述报告分子的功能缺失变体的微生物。
75)如实施方案71-74中任一项所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
76)如实施方案71-75中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
77)如实施方案76所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
78)如实施方案77所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
79)如实施方案77或78所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
80)如实施方案79所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
81)如实施方案77-80中任一项所述的方法，其中步骤(d)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
82)如实施方案77-81中任一项所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
83)如实施方案71-80中任一项所述的方法，所述方法还包括分离能够固定大气氮的所述细菌突变体。
84)如实施方案83所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。
85)如实施方案83所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。
86)如实施方案83或85所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括在glnA中包含至少一个遗传变异的细菌。
87)如实施方案86所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
88)如实施方案87所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
89)如实施方案87所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
90)如实施方案87或89所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
91)如实施方案87所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
92)如实施方案87或91所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
93)如实施方案86-92中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
94)如实施方案86-93中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
95)如实施方案86-93中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
96)如实施方案94或95所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列。
97)如实施方案94或95所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
98)如实施方案94、95或97中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
99)如实施方案94或95所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
100)如实施方案94、95或99中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
101)如实施方案94-100中任一项所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
102)如实施方案86所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
103)如实施方案102所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQID NO:4的核酸序列。
104)如实施方案86、102或103中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO20-23组成的组的核酸序列。
105)如实施方案86或102-104中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
106)如实施方案86或102-104中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
107)如实施方案105或106所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
108)如实施方案105-107中任一项所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
109)如实施方案83或85所述的方法，其中所述分离的细菌突变体在glnE中包含至少一个遗传变异。
110)如实施方案109所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
111)如实施方案109或110所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
112)如实施方案110或111所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQID NO:5的核酸序列。
113)如实施方案109-112中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
114)如实施方案109-113中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
115)如实施方案109-113中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
116)如实施方案114或115所述的方法，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
117)如实施方案114-116中任一项所述的方法，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
118)如实施方案114-117中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
119)如实施方案114-118中任一项所述的方法，其中所述GlnE蛋白包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列。
120)如实施方案71-119中任一项所述的方法，其中所述细菌群体包含至少100,000个细菌，并且其中所述用于高通量鉴定的方法在不到四小时内完成。
121)一种用于鉴定涉及固定大气氮的新细菌基因、途径和/或调节元件的方法，所述方法包括：(a)将细菌群体暴露于微生物组合物中的诱变剂；(b)用生物传感器接种微生物组合物，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(c)将经接种的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；(d)在(c)之后测量与对照组合物相比经接种的组合物的报告分子输出；(e)从与对照组合物相比表现出报告分子输出降低的经接种的组合物中分离细菌作为能够固定大气氮的细菌；(f)对来自(e)的能够固定大气氮的细菌的基因组进行测序；和(g)从测序的基因组中鉴定含有突变的基因、途径和/或调节元件。
122)如实施方案121所述的方法，其中所述对照组合物包含不表达所述报告分子的微生物。
123)如实施方案121所述的方法，其中所述对照组合物包含表达所述报告分子的功能缺失变体的微生物。
124)如实施方案121-123中任一项所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
125)如实施方案121-124中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
126)如实施方案125所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
127)如实施方案126所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
128)如实施方案126或127所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
129)如实施方案128所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
130)如实施方案126-129中任一项所述的方法，其中步骤(c)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
131)如实施方案126-129中任一项所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
132)如实施方案121-131中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述基因、途径和/或调节元件是否含有已知与大气氮的固定相关联的突变。
133)如实施方案121-132中任一项所述的方法，其中所述鉴定的突变包括glnA或glnE中的至少一个突变。
134)如实施方案133所述的方法，其中所述glnA中的至少一个突变包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
135)如实施方案134所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ IDNO:1的核酸序列。
136)如实施方案134所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
137)如实施方案134或136所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
138)如实施方案134所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
139)如实施方案134或138所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
140)如实施方案133-139中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
141)如实施方案133-140中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
142)如实施方案133-140中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
143)如实施方案141或142所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQID NO:24的氨基酸序列。
144)如实施方案141或142所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
145)如实施方案141、142或144中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
146)如实施方案141或142所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
147)如实施方案141、142或146中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
148)如实施方案141-147中任一项所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
149)如实施方案133所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
150)如实施方案149所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQID NO:4的核酸序列。
151)如实施方案133、149或150中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。
152)如实施方案133或147-151中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
153)如实施方案133或147-151中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
154)如实施方案152或153所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
155)如实施方案152-154中任一项所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
156)如实施方案133所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
157)如实施方案133或156所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
158)如实施方案156或157所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQID NO:5的核酸序列。
159)如实施方案133或156-158中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
160)如实施方案133或156-159中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
161)如实施方案133或156-159中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
162)如实施方案160或161所述的方法，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
163)如实施方案160-162中任一项所述的方法，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
164)如实施方案160-163中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
165)如实施方案160-164中任一项所述的方法，其中所述GlnE蛋白包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列。
166)一种用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法，所述方法包括：(a)将细菌群体暴露于诱变剂；(b)将暴露于(a)中的诱变剂的细菌群体暴露于微生物组合物中的固氮生长抑制剂；(c)将所述微生物组合物与生物传感器共培养，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：(i)编码报告分子的核酸序列，(ii)选自可操作地连接至(i)的核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，(iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和(iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；(d)将共培养的组合物暴露于足以激活报告分子的刺激；和(e)将能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起报告分子输出降低或没有报告分子输出的细菌突变体。
167)如实施方案166所述的方法，其中所述固氮生长抑制剂是乙二胺(EDA)或甲基铵。
168)如实施方案166或167所述的方法，其中在(d)之后测量与对照组合物相比(d)中的一个或多个样品的报告分子输出。
169)如实施方案168所述的方法，其中所述对照组合物包含不表达所述报告分子的微生物。
170)如实施方案168所述的方法，其中所述对照组合物包含表达所述报告分子的功能缺失变体的微生物。
171)如实施方案166-170中任一项所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
172)如实施方案166-171中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
173)如实施方案172所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
174)如实施方案173所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
175)如实施方案173或174所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
176)如实施方案175所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
177)如实施方案173-176中任一项所述的方法，其中步骤(d)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
178)如实施方案173-177中任一项所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
179)如实施方案166-178中任一项所述的方法，所述方法还包括分离能够固定大气氮的细菌突变体。
180)如实施方案179所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。
181)如实施方案179所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。
182)如实施方案179或181所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括在glnA中包含遗传变异的细菌。
183)如实施方案182所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
184)如实施方案183所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ IDNO:1的核酸序列。
185)如实施方案183所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
186)如实施方案183或185所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
187)如实施方案183所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
188)如实施方案183或187所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
189)如实施方案182-188中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
190)如实施方案182-189中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
191)如实施方案182-189中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
192)如实施方案190或191所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQID NO:24的氨基酸序列。
193)如实施方案190或191所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
194)如实施方案190、191或193中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
195)如实施方案190或191所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
196)如实施方案190、191或195中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
197)如实施方案190-196中任一项所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
198)如实施方案182所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
199)如实施方案198所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQID NO:4的核酸序列。
200)如实施方案182、198或199中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。
201)如实施方案182或198-200中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
202)如实施方案182或198-200中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
203)如实施方案201或202所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
204)如实施方案201-203中任一项所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
205)如实施方案179或181所述的方法，其中所述分离的细菌突变体在glnE中包含至少一个遗传变异。
206)如实施方案205所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
207)如实施方案205或206所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
208)如实施方案206或207所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQID NO:5的核酸序列。
209)如实施方案205-208中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
210)如实施方案205-209中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
211)如实施方案205-209中任一项所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
212)如实施方案210或211所述的方法，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
213)如实施方案210-212中任一项所述的方法，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
214)如实施方案210-213中任一项所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
215)如实施方案210-214中任一项所述的方法，其中所述GlnE蛋白包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列。
216)如实施方案11-215中任一项所述的方法，其中所述启动子或其片段选自nifHDK操纵子。
217)如实施方案11-216中任一项所述的方法，其中所述启动子是nifH启动子。
218)如实施方案11-217中任一项所述的方法，其中所述抑制性固氮调节蛋白是NifL。
219)如实施方案11-218中任一项所述的方法，其中所述正固氮调节蛋白是NifA。
220)如实施方案22-219中任一项所述的方法，其中所述细菌群体选自野生型细菌、转基因突变细菌、非属间突变细菌和属间突变细菌。
221)如实施方案22-220中任一项所述的方法，其中所述诱变剂选自丝裂霉素C(MMC)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、亚硝酸(NA)、二环氧丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基-2-氯乙基]-氨基丙胺)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)。
222)如实施方案95221所述的方法，其中所述诱变剂是EMS。
223)一种微生物组合物，其包含：一种或多种选自由以下组成的组的分离的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌和保藏为PTA-126726的细菌。
224)如实施方案223所述的微生物组合物，其还包含农业上可接受的载剂。
225)如实施方案223所述的微生物组合物，其中所述一种或多种分离的细菌以高于野生型亲本谱系细菌的速率固定大气氮。
226)一种固氮细菌，其包含突变glnE基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。
227)如实施方案226所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因在所述克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含核苷酸取代。
228)如实施方案226或227所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因与所述克雷伯氏菌属glnE基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
229)如实施方案226所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnE蛋白。
230)如实施方案227所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因的表达产生在所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有氨基酸取代的突变GlnE蛋白。
231)如实施方案229或230所述的固氮细菌，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
232)如实施方案229-231中任一项所述的固氮细菌，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
233)如实施方案229-232中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变GlnE蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
234)如实施方案226-233中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。
235)如实施方案226-234中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
236)如实施方案226-235中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
237)如实施方案229-236中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
238)一种固氮细菌，其包含编码GlnE蛋白的突变glnE基因，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
239)如实施方案238所述的固氮细菌，其中所述GlnE蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处的氨基酸取代。
240)如实施方案238或239所述的固氮细菌，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
241)如实施方案238-240中任一项所述的固氮细菌，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G746D取代。
242)如实施方案238-241中任一项所述的固氮细菌，其中所述GlnE蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
243)如实施方案238-242中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
244)如实施方案238-243中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
245)一种固氮细菌，其包含突变GlnE蛋白，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
246)如实施方案245所述的固氮细菌，其中所述GlnE蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处的氨基酸取代。
247)如实施方案245或246所述的固氮细菌，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
248)如实施方案245-247中任一项所述的固氮细菌，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
249)如实施方案245-248中任一项所述的固氮细菌，其中所述GlnE蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
250)如实施方案245-249中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
251)如实施方案245-250中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
252)如实施方案226-251中任一项所述的固氮细菌，其中所述固氮细菌是变栖克雷伯氏菌CI4874。
253)一种固氮细菌，其包含突变glnA基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。
254)如实施方案253所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因与所述克雷伯氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
255)如实施方案253或254所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnA蛋白。
256)如实施方案253或254所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因的表达产生具有至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的突变GlnA蛋白。
257)如实施方案255或256所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
258)如实施方案253-257中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
259)如实施方案253-257中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
260)如实施方案253-257或259中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
261)如实施方案253-257中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
262)如实施方案253-257或261中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
263)如实施方案253-262中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
264)如实施方案255-258中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
265)如实施方案255-257、259-260或263中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
266)如实施方案255-257或261-263中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
267)如实施方案255-266中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
268)一种固氮细菌，其包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
269)如实施方案268所述的固氮细菌，其中所述至少一个氨基酸取代选自由所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和N339D及在其同源物中的同源位置处的相同氨基酸取代组成的组。
270)如实施方案268或269所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
271)如实施方案268-270中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
272)如实施方案268-270中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
273)如实施方案268-270或272中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
274)如实施方案268-270中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
275)如实施方案268-270或274中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
276)如实施方案268-275中任一项所述的固氮细菌，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
277)一种固氮细菌，其包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
278)如实施方案277所述的固氮细菌，其中所述至少一个氨基酸取代选自由所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。
279)如实施方案277或278所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
280)如实施方案277-279中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
281)如实施方案277-279中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
282)如实施方案277-279或281中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
283)如实施方案277-279中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
284)如实施方案277-279或283中任一项所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
285)如实施方案277-284中任一项所述的固氮细菌，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
286)如实施方案253-285中任一项所述的固氮细菌，其中所述固氮细菌选自由变栖克雷伯氏菌CI3296、变栖克雷伯氏菌CI3936、变栖克雷伯氏菌CI3933、变栖克雷伯氏菌CI3927、变栖克雷伯氏菌CI3925、变栖克雷伯氏菌CI3943、变栖克雷伯氏菌CI3940、变栖克雷伯氏菌CI3938、蔗糖科萨克氏菌CI4065、肠内甲烷嗜热杆菌CI4875、肠内甲烷嗜热杆菌CI4876、肠内甲烷嗜热杆菌CI4877和肠内甲烷嗜热杆菌CI4878组成的组。
287)一种固氮细菌，其包含突变glnA基因，所述基因在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。
288)如实施方案287所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因与所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
289)如实施方案287或288所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnA蛋白。
290)如实施方案287或288所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因的表达产生具有至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的突变GlnA蛋白。
291)如实施方案289或290所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
292)如实施方案287-291中任一项所述的固氮细菌，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:4的核酸序列。
293)如实施方案287-292中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。
294)如实施方案289-293中任一项所述的固氮细菌，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
295)如实施方案289-294中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
296)一种固氮细菌，其包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
297)如实施方案296所述的固氮细菌，其中所述至少一个氨基酸取代选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。
298)如实施方案296或297所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
299)如实施方案296-298中任一项所述的固氮细菌，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
300)如实施方案296-299中任一项所述的固氮细菌，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
301)一种固氮细菌，其包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
302)如实施方案301所述的固氮细菌，其中所述至少一个氨基酸取代选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。
303)如实施方案301或302所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
304)如实施方案301-303中任一项所述的固氮细菌，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
305)如实施方案301-304中任一项所述的固氮细菌，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
306)如实施方案287-305中任一项所述的固氮细菌，其中所述固氮细菌选自由热带副伯克霍尔德氏菌CI4751、热带副伯克霍尔德氏菌CI4753、热带副伯克霍尔德氏菌CI4879和热带副伯克霍尔德氏菌CI4752组成的组。
307)如实施方案226-306中任一项所述的固氮细菌，其中所述细菌是经遗传工程化的。
308)一种微生物组合物，其包含如实施方案226-307中任一项所述的固氮细菌和载剂。
309)一种向植物提供固定的氮的方法，其包括将微生物组合物施加到植物、植物部分或植物所在的场所或植物将生长的场所，其中所述微生物组合物包含至少一种如实施方案226-306中任一项所述的固氮细菌。
310)如实施方案309所述的方法，其中所述微生物组合物在植物中产生1％或更多的固定的氮。
311)如实施方案309-310中任一项所述的方法，其中所述组合物是固体。
312)如实施方案309-310中任一项所述的方法，其中所述组合物是液体。
313)如实施方案309-312中任一项所述的方法，其中所述施加包括用所述微生物组合物包被种子或其他植物繁殖构件。
314)如实施方案313所述的方法，其中所述微生物组合物中的至少一种固氮细菌具有至少约1.0×104cfu/克植物根部组织鲜重的平均每单位植物根部组织的定殖能力，并且产生至少约1×10-15mmol N/细菌细胞/小时的固定的N。
315)如实施方案313所述的方法，其中所述施加包括进行微生物组合物的沟内处理。
316)如实施方案315所述的方法，其中所述沟内处理包括以约1×106至约3×1012cfu/英亩的每英亩浓度施加所述微生物组合物。
317)如实施方案315或316所述的方法，其中所述微生物组合物是包含约1×106至约1×1011cfu细菌细胞/毫升的液体制剂。
具有SEQ ID NO标识符的本公开的序列
Figure BDA0003318753660001411
Figure BDA0003318753660001421
*****
以引用的方式并入
出于所有目的，本文中引用的所有参考文献、论文、出版物、专利、专利出版物和专利申请的全文均以引用的方式并入本文。
然而，提及本文引用的任何参考文献、论文、出版物、专利、专利出版物和专利申请不是并且不应认为是承认或以任何形式暗示其构成有效现有技术或形成世界上任何国家的公共常识的部分。
序列表
<110> 皮沃特生物股份有限公司(Pivot Bio, Inc.)
<120> 用于分离和表征由化学诱变产生的泌铵突变体库的高通量方法
<130> PIVO-014/01WO 316309-2068
<150> US 62/838,780
<151> 2019-04-25
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 1
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacga ttccgtctca tcaggtaaat 120
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<211> 1410
<212> DNA
<213> 蔗糖科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)
<400> 2
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cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacta tcccagccca tcaagtaaac 120
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ggcgtaatca aacacgcaaa agcgatcaac gccctgtcta acccgaccac caactcctac 960
aagcgtctgg tcccgggtta tgaagcgccg gtaatgctgg cttactctgc acgtaaccgt 1020
tctgcatcta tccgtattcc ggtagtggct tctccgaaag cgcgtcgtat cgaagtgcgc 1080
ttcccggacc cggctgctaa cccgtatctg tgcttcgcag cgctgttgat ggctggtctg 1140
gatggcatta aaaacaaaat ccacccgggc gaagcgatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccggctgaag aagcgaaaga aatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agcgctcaac 1260
gcgctggatg ctgaccgcga gttcctgact gctggtggcg tattcaccga cgacgctatc 1320
gatgcttaca tcgcgctgcg tatcgaagag aacgaccgtg ttcgcatgac gccgcacccg 1380
gtagagttcg aactgtacta cagcgtttaa 1410
<210> 3
<211> 1410
<212> DNA
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 3
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtcaagtt tgttgatttg 60
cgcttcaccg acactaaagg taaagagcag cacgtcacga tcccagctca tcaggtaaat 120
gctgacttct ttgaagaagg caaaatgttt gatggctcct cgattggtgg ctggaaaggc 180
attaacgaat ctgacatggt actgatgccg gacgcctcta ccgctgtcat tgacccgttc 240
tacgaagaac cgactctgat catccgttgc gatatcctcg agccgggcac tatgcagggc 300
tacgatcgcg acccgcgctc catcgcaaaa cgcgctgaag aatacctgcg cgcaacaggc 360
atcgcagaca ccgttctgtt cgggcctgag ccagagttct tcctgttcga cgacgtacgt 420
ttcggcagct ctatttccgg ttcccacgtc gctatcgatg atatcgaagg cgcatggaac 480
tcctccacca aatacgaagg cggtaacaaa ggtcaccgtc cggctgttaa aggtggttac 540
ttcccggttc cgccagtgga ctccgcacaa gacctgcgtt ccactatgtg tctggtaatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcat caccacgaag ttgcaactgc tggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa taccatgacc aaaaaagcag acgaaattca gatctacaaa 720
tatgtggttc acaacgttgc tcaccgcttc ggtaaaaccg caacctttat gccaaaaccg 780
atgttcggtg ataacggttc cggtatgcac tgccacatgt ctctgtccaa gaacggcgta 840
aacctgttct ctggcgacaa atatgctggt ctgtctgagc aggcgctgta ctacatcggc 900
ggcgttatta aacacgctaa agcgatcaac gccctgtcca acccgactac caactcctac 960
aaacgtctgg tcccgggtta cgaagcaccg gtcatgctgg cttactctgc ccgtaaccgt 1020
tcagcttcca tccgtattcc ggtggttgca tctccgaaag cgcgtcgtat tgaagtgcgt 1080
ttcccggacc cggctgctaa cccgtacctg tgcttcgcag cgctgctgat ggctggtctt 1140
gatggcatca agaacaaaat ccatccgggc gaagcgatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccagctgaag aagcgaaaga aatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agcactgaac 1260
tgcctgaacg aagaccgcga gttcctgact gcgggtggcg tattcaccga cgacgcaatt 1320
gatgcttaca tcgctctgcg tatcgaagaa aacgaccgcg tacgcatgac gccgcacccg 1380
gtagagttcg agctgtacta cagcgtttaa 1410
<210> 4
<211> 1416
<212> DNA
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 4
atgagtaaat ccgtggccga cgtcatgcaa ctcgtcaagg acgaagacgt caagtttgtc 60
gacttccgct ttaccgacac gcgcggcaag gagcaacacg tctcggttcc gctgtcgcac 120
ttcgacgaag acaagttcga gtcgggtcat gcatttgacg gttcgtcgat cgccggctgg 180
aagggcatcg aagcctcgga catgctgctc gttccggatg cgaacacggc cttcatcgac 240
ccgttctacg aagagtcgac gctggttctg acctgcgacg tggtcgagcc ggctgacggc 300
aagggctacg agcgcgaccc gcgctcgctc gccaagcgcg ctgaagcgta cctgaagagc 360
acgggcctcg gcgacacggc cttcttcggt ccggaacccg aattcttcat tttcgactcg 420
gtccagtgga acacggacat gtcgggctcg ttcgtcaaga tcggctcgga agaagcaccg 480
tggtcgtcga gcaaggaatt cgaaggcggc aacacgggtc accgtccggg cgtcaagggc 540
ggctacttcc cggtcgcgcc ggtcgacacg ttccaggaca tccgttcgga aatgtgtctg 600
ctgctcgaac agatcggcat cccggtcgaa gtgcaccacc acgaagtcgc tggccagggc 660
cagaacgaaa tcggcacgaa gttctcgacg ctggttcagc gcgcggactg gacgcagcag 720
atgaagtaca tcatccataa cgtggcgcac acgtatggca agacggcgac gttcatgccg 780
aagccgatcg ttggcgacaa cggttcgggc atgcacgttc accagtcgat ctggaaggac 840
ggccagaacc tgttcgcagg caacggctac gcaggtctgt cggaattcgc gctgttctac 900
atcggcggca tcatcaagca cgctcgcgcg ctgaacgcca tcacgaaccc gtcgacgaac 960
tcgtacaagc gtctggttcc gcacttcgaa gcaccggtca agctggctta ctcggcacgc 1020
aaccgttcgg cgtcgatccg tattccgcac gtctcgaacc cgaagggtcg ccgtatcgaa 1080
acgcgcttcc cggacccgat ggccaacccg tacctgtgct tctcggcact gatgatggca 1140
ggtctggacg gcgtgcagaa caagatccat ccgggcgaag ccgccgacaa gaacctgtac 1200
gacctgccgc cggaagagga tgcaaagatc ccgaccgttt gcgccggcct cgaccaggct 1260
ctggaagcgc ttgacaagga tcgcgagttc ctgacgcgcg gtggcgtgtt cacggattcg 1320
atgatcgacg cctacctcgc actgaaggaa ggcgaactgc aacgcgtgcg catgacgacg 1380
cacccggtcg agttcgaact gtactactcg ctgtaa 1416
<210> 5
<211> 2838
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 5
atgatgccgc tttctccgca attacagcag cactggcaga cggtcgctga ccgtctgcca 60
gcggattttc ccattgccga actgagccca caggccaggt cggtcatggc gttcagcgat 120
tttgtcgaac agagtgtgat cgcccagccg ggctggctga atgagcttgc ggactcctcg 180
ccggaggcgg aagagtggcg gcattacgag gcctggctgc aggatcgcct gcaggccgtc 240
actgacgaag cggggttgat gcgagagctg cgtctcttcc gccgccagat gatggtccgc 300
atcgcctggg cgcaggcgct gtcgctggtg agcgaagaag agactctgca gcagctgagc 360
gtcctggcgg agaccctgat tgtcgccgcc cgcgactggc tgtacgccgc ctgctgtaag 420
gagtggggaa cgccatgcaa tgccgagggc cagccgcagc cgctgctgat cctcgggatg 480
ggaaagctgg gcggcggcga gctgaacttc tcttccgata tcgatctgat ctttgcctgg 540
cctgagcatg gcgccacccg cggcggccgc cgcgagctgg ataacgccca gttctttacc 600
cgtctggggc agcggctgat caaggccctt gaccagccga cgcaggacgg ctttgtctat 660
cgggttgaca tgcgcctgcg gccgtttggc gacagtgggc cgctggtact cagttttgcg 720
gcgctggaag attattacca ggagcagggt cgggactggg aacgctatgc gatggtgaaa 780
gcgcggatca tgggcgataa cgacggcgtg tacgccagcg agttgcgcgc gatgctccgt 840
cctttcgtct tccgccgtta tatcgacttc agcgtgatcc agtcgctgcg taacatgaaa 900
ggcatgatcg cccgcgaagt gcggcgtcgc gggctgaaag acaacatcaa gctcggcgcc 960
ggcgggatcc gtgaaattga gtttatcgtt caggtctttc aactgatccg cggtggtcgc 1020
gaacctgcac tgcagcagcg cgccctgctg ccgacgctgg cggcgattga tgagctacat 1080
ctgctgccgg aaggcgacgc ggcgctgctg cgcgaggcct atctgttcct gcgccggctg 1140
gaaaacctgc tgcaaagcat caacgatgag cagacccaga ccctgccgca ggatgaactt 1200
aaccgcgcca ggctggcgtg ggggatgcat accgaagact gggagacgct gagcgcgcag 1260
ctggcgagcc agatggccaa cgtgcggcga gtgtttaatg aactgatcgg cgatgatgag 1320
gatcagtccc cggatgagca actggccgag tactggcgcg agctgtggca ggatgcgctg 1380
gaagaagatg acgccagccc ggcgctggcg catttaaacg ataccgaccg ccgtagcgtg 1440
ctggcgctga ttgccgattt tcgtaaagag ctggatcggc gcaccatcgg cccgcgcggc 1500
cgccaggtgc tggatcagct gatgccgcat ctgctgagcg aaatctgctc gcgcgccgat 1560
gcgccgctgc ctctggcgcg gatcacgccg ctgttgaccg ggatcgtcac ccgtaccacc 1620
tatcttgagc tgctgagcga attccccggc gcgctgaagc acctgatcac gctctgcgcg 1680
gcgtcgccga tggtcgccag ccagctggcg cgccacccgc tgctgctgga tgagctgctg 1740
gatcccaaca ccctctatca gccgacggcg accgatgcct atcgcgacga gctgcgccag 1800
tacctgctgc gcgtgccgga agaggatgaa gagcagcagc tggaggcgtt gcgccagttt 1860
aagcaggcgc agcagctgca tatcgcggcg gcggatatcg ctggtaccct gccggtgatg 1920
aaggtcagcg atcacttaac ctggcttgcc gaagcgatcc tcgacgcggt ggtgcagcag 1980
gcatgggggc agatggtcgc tcgctacggc cagccgaccc acctgcacga tcgccagggt 2040
cgcggcttcg ccgtcgtcgg ctacggtaag cttggcggct gggagctggg ctacagctcc 2100
gatctcgatc tggtgttcct ccatgactgc ccggcggagg tgatgaccga cggcgagcgg 2160
gagattgacg gccgtcagtt ctacctgcgg ctggcccagc ggatcatgca cctgttcagc 2220
acccgcacct cgtccggtat tctctacgaa gtggacgccc ggctgcgtcc ttctggcgcg 2280
gcggggatgc tggtcaccac cgccgacgcg tttgctgact atcagcagaa cgaagcctgg 2340
acgtgggaac atcaggcgct ggtgcgcgcc cgcgtggtct atggcgaccc ggcgctgcag 2400
gcgcgctttg acgccattcg tcgcgatatc ctgaccaccc cgcgggaggg gatgaccctg 2460
cagaccgagg ttcgcgagat gcgcgagaag atgcgcgccc accttggcaa caaacatccc 2520
gatcgttttg atatcaaagc cgatgccggc gggatcaccg atattgaatt tattactcag 2580
tatctggtcc tacgctatgc cagtgacaag ccgaagctga cccgctggtc tgacaacgtg 2640
cgtattcttg agctgctggc gcagaacgac atcatggacg aggaggaggc gcgcgcctta 2700
acgcatgcgt acaccacctt gcgtgatgcg ctccatcacc tggccctgca ggagcagccg 2760
ggacacgtgg cgccagaggc cttcagccgg gagcgtcagc aggtcagcgc cagctggcag 2820
aagtggctga tggcttaa 2838
<210> 6
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 6
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacga ttccgtctca tcaggtaaat 120
gccgaattct tcgaagaagg caaaatgttt gatggctcct cgatcggtgg ctggaaaggt 180
atcaacgaat ctgacatagt cctgatgccg gacgcttcca ccgcggtcat tgacccgttc 240
tacgaagaac cgaccctgat catccgctgc gatatcctcg agccaggcac cctgcagggc 300
tatgaccgtg acccgcgctc catcgcgaaa cgcgctgaag agtacctgcg cgccaccggc 360
atcgctgaca ccgtcctgtt cgggccagaa ccagaattct tcctgttcga cgacatccgt 420
tttggcgcct ctatctccgg ctcccatgtc gcgatcgatg acatcgaagg tgcgtggaac 480
tcctccacca aatacgaagg cggtaacaaa ggtcaccgtc cgggcgtgaa agggggttac 540
ttcccggttc cgccagtaga ctcttctcag gatatccgtt ccaccatgtg tatgatcatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcac caccacgaag tggctaccgc aggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa caccatgacc aaaaaagcgg acgaaattca gatttacaaa 720
tacgttgttc acaacgtcgc tcaccgcttc ggtaaaaccg cgacctttat gccgaaacca 780
atgttcggcg ataacggctc cggcatgcac tgccatatgt ctctggcgaa aaacgggact 840
aacctgttct ccggcgacaa atacgcaggt ctgtctgagc aggcgctgtt ctacatcggc 900
ggcgtaatca aacacgctaa agctatcaac gccctggcga acccgaccac caactcctac 960
aagcgtctgg tcccgggtta cgaagcgccg gttatgctgg cttactctgc gcgtaaccgc 1020
tctgcctcca tccgtattcc ggtggtgacc tctccgaaag cgcgtcgtat cgaagtgcgc 1080
ttcccggacc cggctgccaa cccgtacctg tgctttgcgg cgctgctgat ggctggcctt 1140
gatggtatca agaacaaaat ccatccgggc gaagcaatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccgccggaag aagcgaaaga gatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agccctgcag 1260
gccctggatg ctgaccgcga gttcctgacg gctggcggcg tgttcaccaa tgacgctatc 1320
gatgcttaca tcgccctgcg tctggaagag aacgaccgcg tacgcatgac tccgcatccg 1380
gttgagttcg aactgtacta cagcgtctaa 1410
<210> 7
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 7
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacga ttccgtctca tcaggtaaat 120
gccgaattct tcgaagaagg caaaatgttt gatggctcct cgatcggtgg ctggaaaggt 180
atcaacgaat ctgacgtggt cctgatgccg gacgcttcca ccgcggtcat tgacccgttc 240
tacgaagaac cgaccctgat catccgctgc gatatcctcg agccaggcac cctgcagggc 300
tatgaccgtg acccgcgctc catcgcgaaa cgcgctgaag agtacctgcg cgccaccggc 360
atcgctgaca ccgtcctgtt cgggccagaa ccagaattct tcctgttcga cgacatccgt 420
tttggcgcct ctatctccgg ctcccatgtc gcgatcgatg acatcgaagg tgcgtggaac 480
tcctccacca aatacgaagg cggtaacaaa ggtcaccgtc cgggcgtgaa agggggttac 540
ttcccggttc cgccagtaga ctcttctcag gatatccgtt ccaccatgtg tatgatcatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcac caccacgaag tggctaccgc aggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa caccatgacc aaaaaagcgg acgaaattca gatttacaaa 720
tacgttgttc acaacgtcgc tcaccgcttc ggtaaaaccg cgacctttat gccgaaacca 780
atgttcggcg ataacggctc cggcatgcac tgccatatgt ctctggcgaa aaacgggact 840
aacctgttct ccggcgacaa atacgcaggt ctgtctgagc aggcgctgtt ctacatcggc 900
ggcgtaatca aacacgctaa agctatcaac gccctggcga acccgaccac caactcctac 960
aagcgtctgg tcccgggtta cgaagcgccg gttatgctgg cttactctgc gcgtaaccgc 1020
tctgcctcca tccgtattcc ggtggtgacc tctccgaaag cgcgtcgtat cgaagtgcgc 1080
ttcccggacc cggctgccaa cccgtacctg tgctttgcgg cgctgctgat ggctggcctt 1140
gatggtatca agaacaaaat ccatccgggc gaagcaatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccgccggaag aagcgaaaga gatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agccctgcag 1260
gccctggatg ctgaccgcga gttcctgacg gctggcggcg tgttcaccaa tgacgctatc 1320
gatgcttaca tcgccctgcg tctggaagag aacgaccgcg tacgcatgac tccgcatccg 1380
gttgagttcg aactgtacta cagcgtctaa 1410
<210> 8
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 8
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacga ttccgtctca tcaggtaaat 120
gccgaattct tcgaagaagg caaaatgttt gatggctcct cgatcggtgg ctggaaaggt 180
atcaacgaat ctgacatggt cctgatgccg gacgcttcca ccgcggtcat tgacccgttc 240
tacgaagaac cgaccctgat catccgctgc gatatcctcg agccaggcac cctgcagggc 300
tatgaccgtg acccgcgctc catcgcgaaa cgcgctgaag agtacctgcg cgccaccggc 360
atcgctgaca ccgtcctgtt cgggccagaa ccagaattct tcctgttcga cgacatccgt 420
tttggcgcct ctatctccgg ctcccatgtc gcgatcgatg acatcgaatg tgcgtggaac 480
tcctccacca aatacgaagg cggtaacaaa ggtcaccgtc cgggcgtgaa agggggttac 540
ttcccggttc cgccagtaga ctcttctcag gatatccgtt ccaccatgtg tatgatcatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcac caccacgaag tggctaccgc aggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa caccatgacc aaaaaagcgg acgaaattca gatttacaaa 720
tacgttgttc acaacgtcgc tcaccgcttc ggtaaaaccg cgacctttat gccgaaacca 780
atgttcggcg ataacggctc cggcatgcac tgccatatgt ctctggcgaa aaacgggact 840
aacctgttct ccggcgacaa atacgcaggt ctgtctgagc aggcgctgtt ctacatcggc 900
ggcgtaatca aacacgctaa agctatcaac gccctggcga acccgaccac caactcctac 960
aagcgtctgg tcccgggtta cgaagcgccg gttatgctgg cttactctgc gcgtaaccgc 1020
tctgcctcca tccgtattcc ggtggtgacc tctccgaaag cgcgtcgtat cgaagtgcgc 1080
ttcccggacc cggctgccaa cccgtacctg tgctttgcgg cgctgctgat ggctggcctt 1140
gatggtatca agaacaaaat ccatccgggc gaagcaatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccgccggaag aagcgaaaga gatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agccctgcag 1260
gccctggatg ctgaccgcga gttcctgacg gctggcggcg tgttcaccaa tgacgctatc 1320
gatgcttaca tcgccctgcg tctggaagag aacgaccgcg tacgcatgac tccgcatccg 1380
gttgagttcg aactgtacta cagcgtctaa 1410
<210> 9
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 9
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacga ttccgtctca tcaggtaaat 120
gccgaattct tcgaagaagg caaaatgttt gatggctcct cgatcggtgg ctggaaaggt 180
atcaacgaat ctgacatggt cctgatgccg gacgcttcca ccgcggtcat tgacccgttc 240
tacgaagaac cgaccctgat catccgctgc gatatcctcg agccaggcac cctgcagggc 300
tatgaccgtg acccgcgctc catcgcgaaa cgcgctgaag agtacctgcg cgccaccggc 360
atcgctgaca ccgtcctgtt cgggccagaa ccagaattct tcctgttcga cgacatccgt 420
tttggcgcct ctatctccgg ctcccatgtc gcgatcgatg acatcgaagg tgcgtggaac 480
tcctccacca aatacgaagg cggtaacaaa ggtcaccgtc tgggcgtgaa agggggttac 540
ttcccggttc cgccagtaga ctcttctcag gatatccgtt ccaccatgtg tatgatcatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcac caccacgaag tggctaccgc aggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa caccatgacc aaaaaagcgg acgaaattca gatttacaaa 720
tacgttgttc acaacgtcgc tcaccgcttc ggtaaaaccg cgacctttat gccgaaacca 780
atgttcggcg ataacggctc cggcatgcac tgccatatgt ctctggcgaa aaacgggact 840
aacctgttct ccggcgacaa atacgcaggt ctgtctgagc aggcgctgtt ctacatcggc 900
ggcgtaatca aacacgctaa agctatcaac gccctggcga acccgaccac caactcctac 960
aagcgtctgg tcccgggtta cgaagcgccg gttatgctgg cttactctgc gcgtaaccgc 1020
tctgcctcca tccgtattcc ggtggtgacc tctccgaaag cgcgtcgtat cgaagtgcgc 1080
ttcccggacc cggctgccaa cccgtacctg tgctttgcgg cgctgctgat ggctggcctt 1140
gatggtatca agaacaaaat ccatccgggc gaagcaatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccgccggaag aagcgaaaga gatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agccctgcag 1260
gccctggatg ctgaccgcga gttcctgacg gctggcggcg tgttcaccaa tgacgctatc 1320
gatgcttaca tcgccctgcg tctggaagag aacgaccgcg tacgcatgac tccgcatccg 1380
gttgagttcg aactgtacta cagcgtctaa 1410
<210> 10
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 10
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacga ttccgtctca tcaggtaaat 120
gccgaattct tcgaagaagg caaaatgttt gatggctcct cgatcggtgg ctggaaaggt 180
atcaacgaat ctgacatggt cctgatgccg gacgcttcca ccgcggtcat tgacccgttc 240
tacgaagaac cgaccctgat catccgctgc gatatcctcg agccaggcac cctgcagggc 300
tatgaccgtg acccgcgctc catcgcgaaa cgcgctgaag agtacctgcg cgccaccggc 360
atcgctgaca ccgtcctgtt cgggccagaa ccagaattct tcctgttcga cgacatccgt 420
tttggcgcct ctatctccgg ctcccatgtc gcgatcgatg acatcgaagg tgcgtggaac 480
tcctccacca aatacgaagg cggtaacaaa ggtcaccgtc cgggcgtgaa agggggttac 540
ttcccggttc cgccagtaga ctcttttcag gatatccgtt ccaccatgtg tatgatcatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcac caccacgaag tggctaccgc aggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa caccatgacc aaaaaagcgg acgaaattca gatttacaaa 720
tacgttgttc acaacgtcgc tcaccgcttc ggtaaaaccg cgacctttat gccgaaacca 780
atgttcggcg ataacggctc cggcatgcac tgccatatgt ctctggcgaa aaacgggact 840
aacctgttct ccggcgacaa atacgcaggt ctgtctgagc aggcgctgtt ctacatcggc 900
ggcgtaatca aacacgctaa agctatcaac gccctggcga acccgaccac caactcctac 960
aagcgtctgg tcccgggtta cgaagcgccg gttatgctgg cttactctgc gcgtaaccgc 1020
tctgcctcca tccgtattcc ggtggtgacc tctccgaaag cgcgtcgtat cgaagtgcgc 1080
ttcccggacc cggctgccaa cccgtacctg tgctttgcgg cgctgctgat ggctggcctt 1140
gatggtatca agaacaaaat ccatccgggc gaagcaatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccgccggaag aagcgaaaga gatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agccctgcag 1260
gccctggatg ctgaccgcga gttcctgacg gctggcggcg tgttcaccaa tgacgctatc 1320
gatgcttaca tcgccctgcg tctggaagag aacgaccgcg tacgcatgac tccgcatccg 1380
gttgagttcg aactgtacta cagcgtctaa 1410
<210> 11
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 11
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacga ttccgtctca tcaggtaaat 120
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ccgccggaag aagcgaaaga gatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agccctgcag 1260
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gatgcttaca tcgccctgcg tctggaagag aacgaccgcg tacgcatgac tccgcatccg 1380
gttgagttcg aactgtacta cagcgtctaa 1410
<210> 12
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 12
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacga ttccgtctca tcaggtaaat 120
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<210> 13
<211> 1410
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 13
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
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<210> 14
<211> 2838
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 14
atgatgccgc tttctccgca attacagcag cactggcaga cggtcgctga ccgtctgcca 60
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cctttcgtct tccgccgtta tatcgacttc agcgtgatcc agtcgctgcg taacatgaaa 900
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ctggcgagcc agatggccaa cgtgcggcga gtgtttaatg aactgatcgg cgatgatgag 1320
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gatcccaaca ccctctatca gccgacggcg accgatgcct atcgcgacga gctgcgccag 1800
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gcatgggggc agatggtcgc tcgctacggc cagccgaccc acctgcacga tcgccagggt 2040
cgcggcttcg ccgtcgtcgg ctacggtaag cttggcggct gggagctggg ctacagctcc 2100
gatctcgatc tggtgttcct ccatgactgc ccggcggagg tgatgaccga cggcgagcgg 2160
gagattgacg gccgtcagtt ctacctgcgg ctggcccagc ggatcatgca cctgttcagc 2220
acccgcacct cgtccgatat tctctacgaa gtggacgccc ggctgcgtcc ttctggcgcg 2280
gcggggatgc tggtcaccac cgccgacgcg tttgctgact atcagcagaa cgaagcctgg 2340
acgtgggaac atcaggcgct ggtgcgcgcc cgcgtggtct atggcgaccc ggcgctgcag 2400
gcgcgctttg acgccattcg tcgcgatatc ctgaccaccc cgcgggaggg gatgaccctg 2460
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tatctggtcc tacgctatgc cagtgacaag ccgaagctga cccgctggtc tgacaacgtg 2640
cgtattcttg agctgctggc gcagaacgac atcatggacg aggaggaggc gcgcgcctta 2700
acgcatgcgt acaccacctt gcgtgatgcg ctccatcacc tggccctgca ggagcagccg 2760
ggacacgtgg cgccagaggc cttcagccgg gagcgtcagc aggtcagcgc cagctggcag 2820
aagtggctga tggcttaa 2838
<210> 15
<211> 1410
<212> DNA
<213> 蔗糖科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)
<400> 15
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aatgagcacg aagtgaagtt tgtcgatctg 60
cgcttcaccg ataccaaagg taaagaacag cacgtcacta tcccagccca tcaagtaaac 120
gctgacttct ttgaagaagg taaaatgttt gatggttctt cgattggtgg ctggaaaggc 180
atcaacgaat cagacatagt gctgatgccg gacgcgacta ccgctgtcat tgacccgttc 240
tacgaagagt ctacgctgat cattcgttgc gatatcctcg aaccaggcac catgcagggc 300
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ctggcagaca ccgttctgtt tgggccagag ccggaattct tcctgttcga cgacgtgcgc 420
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gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcac caccacgaag tggcaacggc tggtcagaac 660
gaagtggcta cccgcttcaa caccatgacc aaaaaagcgg acgaaattca gatttacaaa 720
tacgtggtgc acaacgttgc tcaccgcttt ggtaaaaccg cgacctttat gccgaaaccg 780
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<210> 16
<211> 1410
<212> DNA
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 16
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtcaagtt tgttgatttg 60
cgcttcaccg acactaaagg taaagagcag cacgtcacga tcccagctca tcaggtaaat 120
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ttcccggttc cgccagtgga ctccgcacaa gacctgcgtt ccactatgtg tctggtaatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcat caccacgaag ttgcaactgc tggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa taccatgacc aaaaaagcag acgaaattca gatctacaaa 720
tatgtggttc acaacgttgc tcaccgcttc ggtaaaaccg caacctttat gccaaaaccg 780
atgttcggtg ataacggttc cggtatgcac tgccacatgt ctctgtccaa gaacggcgta 840
aacctgttct ctggcgacaa atatgctggt ctgtctgagc aggcgctgta ctacatcggc 900
ggcgttatta aacacgctaa agcgatcaac gccctgtcca acccgactac caactcctac 960
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gtagagttcg agctgtacta cagcgtttaa 1410
<210> 17
<211> 1410
<212> DNA
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 17
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtcaagtt tgttgatttg 60
cgcttcaccg acactaaagg taaagagcag cacgtcacga tcccagctca tcaggtaaat 120
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ttcccggttc cgccagtgga ctccgcacaa gacctgcgtt ccactatgtg tctggtaatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcat caccacgaag ttgcaactgc tagtcagaac 660
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<211> 1410
<212> DNA
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 18
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtcaagtt tgttgatttg 60
cgcttcaccg acactaaagg taaagagcag cacgtcacga tcccagctca tcaggtaaat 120
gctgacttct ttgaagaagg caaaatgttt gatggctcct cgattggtgg ctggaaaggc 180
attaacgaat ctgacatggt actgatgccg gacgcctcta ccgctgtcat tgacccgttc 240
tacgaagaac cgactctgat catccgttgc gatatcctcg agccgggcac tatgcagggc 300
tacgatcgcg acccgcgctc catcgcaaaa cgcgctgaag aatacctgcg cgcaacaggc 360
atcgcagaca ccgttctgtt cgggcctgag ccagagttct tcctgttcga cgacgtacgt 420
ttcggcagct ctatttccgg ttcccacgtc gctatcgatg atatcgaagg cgcatggaac 480
tcctccacca aatacgaagg cggtaacaaa ggtcaccgtc cggctgttaa aggtggttac 540
ttcccggttc cgccagtgga ctccgcacaa gacctgcgtt ccactatgtg tctggtaatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcat caccacgaag ttgcaactgc tggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa taccatgacc aaaaaagcag acgaaattca gatctacaaa 720
tatgtggttc acaacgttgc tcaccgcttc ggtaaaaccg caatctttat gccaaaaccg 780
atgttcggtg ataacggttc cggtatgcac tgccacatgt ctctgtccaa gaacggcgta 840
aacctgttct ctggcgacaa atatgctggt ctgtctgagc aggcgctgta ctacatcggc 900
ggcgttatta aacacgctaa agcgatcaac gccctgtcca acccgactac caactcctac 960
aaacgtctgg tcccgggtta cgaagcaccg gtcatgctgg cttactctgc ccgtaaccgt 1020
tcagcttcca tccgtattcc ggtggttgca tctccgaaag cgcgtcgtat tgaagtgcgt 1080
ttcccggacc cggctgctaa cccgtacctg tgcttcgcag cgctgctgat ggctggtctt 1140
gatggcatca agaacaaaat ccatccgggc gaagcgatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccagctgaag aagcgaaaga aatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agcactgaac 1260
tgcctgaacg aagaccgcga gttcctgact gcgggtggcg tattcaccga cgacgcaatt 1320
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gtagagttcg agctgtacta cagcgtttaa 1410
<210> 19
<211> 1410
<212> DNA
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 19
atgtccgctg aacacgtttt gacgatgctg aacgagcacg aagtcaagtt tgttgatttg 60
cgcttcaccg acactaaagg taaagagcag cacgtcacga tcccagctca tcaggtaaat 120
gctgacttct ttgaagaagg caaaatgttt gatggctcct cgattggtgg ctggaaaggc 180
attaacgaat ctgacatggt actgatgccg gacgcctcta ccgctgtcat tgacccgttc 240
tacgaagaac cgactctgat catccgttgc gatatcctcg agccgggcac tatgcagggc 300
tacgatcgcg acccgcgctc catcgcaaaa cgcgctgaag aatacctgcg cgcaacaggc 360
atcgcagaca ccgttctgtt cgggcctgag ccagagttct tcctgttcga cgacgtacgt 420
ttcggcagct ctatttccgg ttcccacgtc gctatcgatg atatcgaagg cgcatggaac 480
tcctccacca aatacgaagg cggtaacaaa ggtcaccgtc cggctgttaa aggtggttac 540
ttcccggttc cgccagtgga ctccgcacaa gacctgcgtt ccactatgtg tctggtaatg 600
gaagagatgg gcctggttgt tgaagctcat caccacgaag ttgcaactgc tggtcagaac 660
gaagtggcaa cccgcttcaa taccatgacc aaaaaagcag acgaaattca gatctacaaa 720
tatgtggttc acaacgttgc tcaccgcttc ggtaaaaccg caacctttat gccaaaaccg 780
atgttcggtg ataacggttc cggtatgcac tgccacatgt ctctgtccaa gaacggcgta 840
aacctgttct ctggcgacaa atatgctggt ctgtctgagc aggcgctgta ctacatcggc 900
ggcgttatta aacacgctaa agcgatcaac gccctgtcca acccgactac caactcctac 960
aaacgtctgg tcccgggtta cgaagtaccg gtcatgctgg cttactctgc ccgtaaccgt 1020
tcagcttcca tccgtattcc ggtggttgca tctccgaaag cgcgtcgtat tgaagtgcgt 1080
ttcccggacc cggctgctaa cccgtacctg tgcttcgcag cgctgctgat ggctggtctt 1140
gatggcatca agaacaaaat ccatccgggc gaagcgatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200
ccagctgaag aagcgaaaga aatcccgcag gttgcaggct ctctggaaga agcactgaac 1260
tgcctgaacg aagaccgcga gttcctgact gcgggtggcg tattcaccga cgacgcaatt 1320
gatgcttaca tcgctctgcg tatcgaagaa aacgaccgcg tacgcatgac gccgcacccg 1380
gtagagttcg agctgtacta cagcgtttaa 1410
<210> 20
<211> 1416
<212> DNA
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 20
atgagtaaat ccgtggccga cgtcatgcaa ctcgtcaagg acgaagacgt caagtttgtc 60
gacttccgct ttaccgacac gcgcggcaag gagcaacacg tctcggttcc gctgtcgcac 120
ttcgacgaag acaagttcga gtcgggtcat gcatttgacg gttcgtcgat cgccggctgg 180
aagggcatcg aagcctcgga catgctgctc gttccggatg cgaacacggc cttcatcgac 240
ccgttctacg aagagtcgac gctggttctg acctgcgacg tggtcgagcc ggctgacggc 300
aagggctgcg agcgcgaccc gcgctcgctc gccaagcgcg ctgaagcgta cctgaagagc 360
acgggcctcg gcgacacggc cttcttcggt ccggaacccg aattcttcat tttcgactcg 420
gtccagtgga acacggacat gtcgggctcg ttcgtcaaga tcggctcgga agaagcaccg 480
tggtcgtcga gcaaggaatt cgaaggcggc aacacgggtc accgtccggg cgtcaagggc 540
ggctacttcc cggtcgcgcc ggtcgacacg ttccaggaca tccgttcgga aatgtgtctg 600
ctgctcgaac agatcggcat cccggtcgaa gtgcaccacc acgaagtcgc tggccagggc 660
cagaacgaaa tcggcacgaa gttctcgacg ctggttcagc gcgcggactg gacgcagcag 720
atgaagtaca tcatccataa cgtggcgcac acgtatggca agacggcgac gttcatgccg 780
aagccgatcg ttggcgacaa cggttcgggc atgcacgttc accagtcgat ctggaaggac 840
ggccagaacc tgttcgcagg caacggctac gcaggtctgt cggaattcgc gctgttctac 900
atcggcggca tcatcaagca cgctcgcgcg ctgaacgcca tcacgaaccc gtcgacgaac 960
tcgtacaagc gtctggttcc gcacttcgaa gcaccggtca agctggctta ctcggcacgc 1020
aaccgttcgg cgtcgatccg tattccgcac gtctcgaacc cgaagggtcg ccgtatcgaa 1080
acgcgcttcc cggacccgat ggccaacccg tacctgtgct tctcggcact gatgatggca 1140
ggtctggacg gcgtgcagaa caagatccat ccgggcgaag ccgccgacaa gaacctgtac 1200
gacctgccgc cggaagagga tgcaaagatc ccgaccgttt gcgccggcct cgaccaggct 1260
ctggaagcgc ttgacaagga tcgcgagttc ctgacgcgcg gtggcgtgtt cacggattcg 1320
atgatcgacg cctacctcgc actgaaggaa ggcgaactgc aacgcgtgcg catgacgacg 1380
cacccggtcg agttcgaact gtactactcg ctgtaa 1416
<210> 21
<211> 1416
<212> DNA
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 21
atgagtaaat ccgtggccga cgtcatgcaa ctcgtcaagg acgaagacgt caagtttgtc 60
gacttccgct ttaccgacac gcgcggcaag gagcaacacg tctcggttcc gctgtcgcac 120
ttcgacgaag acaagttcga gtcgggtcat gcatttgacg gttcgtcgat cgccggctgg 180
aagggcatcg aagcctcgga catgctgctc gttccggatg cgaacacggc cttcatcgac 240
ccgttctacg aagagtcgac gctggttctg acctgcgacg tggtcgagcc ggctgacggc 300
aagggctacg agcgcgaccc gcgctcgctc gccaagcgcg ctgaagcgta cctgaagagc 360
acgggcctcg gcgacacggc cttcttcggt ccggaacccg aattcttcat tttcgactcg 420
gtccagtgga acacggacat gtcgggctcg ttcgtcaaga tcggctcgga agaagcaccg 480
tggtcgccga gcaaggaatt cgaaggcggc aacacgggtc accgtccggg cgtcaagggc 540
ggctacttcc cggtcgcgcc ggtcgacacg ttccaggaca tccgttcgga aatgtgtctg 600
ctgctcgaac agatcggcat cccggtcgaa gtgcaccacc acgaagtcgc tggccagggc 660
cagaacgaaa tcggcacgaa gttctcgacg ctggttcagc gcgcggactg gacgcagcag 720
atgaagtaca tcatccataa cgtggcgcac acgtatggca agacggcgac gttcatgccg 780
aagccgatcg ttggcgacaa cggttcgggc atgcacgttc accagtcgat ctggaaggac 840
ggccagaacc tgttcgcagg caacggctac gcaggtctgt cggaattcgc gctgttctac 900
atcggcggca tcatcaagca cgctcgcgcg ctgaacgcca tcacgaaccc gtcgacgaac 960
tcgtacaagc gtctggttcc gcacttcgaa gcaccggtca agctggctta ctcggcacgc 1020
aaccgttcgg cgtcgatccg tattccgcac gtctcgaacc cgaagggtcg ccgtatcgaa 1080
acgcgcttcc cggacccgat ggccaacccg tacctgtgct tctcggcact gatgatggca 1140
ggtctggacg gcgtgcagaa caagatccat ccgggcgaag ccgccgacaa gaacctgtac 1200
gacctgccgc cggaagagga tgcaaagatc ccgaccgttt gcgccggcct cgaccaggct 1260
ctggaagcgc ttgacaagga tcgcgagttc ctgacgcgcg gtggcgtgtt cacggattcg 1320
atgatcgacg cctacctcgc actgaaggaa ggcgaactgc aacgcgtgcg catgacgacg 1380
cacccggtcg agttcgaact gtactactcg ctgtaa 1416
<210> 22
<211> 1416
<212> DNA
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 22
atgagtaaat ccgtggccga cgtcatgcaa ctcgtcaagg acgaagacgt caagtttgtc 60
gacttccgct ttaccgacac gcgcggcaag gagcaacacg tctcggttcc gctgtcgcac 120
ttcgacgaag acaagttcga gtcgggtcat gcatttgacg gttcgtcgat cgccggctgg 180
aagggcatcg aagcctcgga catgctgctc gttccggatg cgaacacggc cttcatcgac 240
ccgttctacg aagagtcgac gctggttctg acctgcgacg tggtcgagcc ggctgacggc 300
aagggctacg agcgcgaccc gcgctcgctc gccaagcgcg ctgaagcgta cctgaagagc 360
acgggcctcg gcgacacggc cttcttcggt ccggaacccg aattcttcat tttcgactcg 420
gtccagtgga acacggacat gtcgggctcg ttcgtcaaga tcggctcgga agaagcaccg 480
tggtcgtcga gcaaggaatt cgaaggcggc gacacgggtc accgtccggg cgtcaagggc 540
ggctacttcc cggtcgcgcc ggtcgacacg ttccaggaca tccgttcgga aatgtgtctg 600
ctgctcgaac agatcggcat cccggtcgaa gtgcaccacc acgaagtcgc tggccagggc 660
cagaacgaaa tcggcacgaa gttctcgacg ctggttcagc gcgcggactg gacgcagcag 720
atgaagtaca tcatccataa cgtggcgcac acgtatggca agacggcgac gttcatgccg 780
aagccgatcg ttggcgacaa cggttcgggc atgcacgttc accagtcgat ctggaaggac 840
ggccagaacc tgttcgcagg caacggctac gcaggtctgt cggaattcgc gctgttctac 900
atcggcggca tcatcaagca cgctcgcgcg ctgaacgcca tcacgaaccc gtcgacgaac 960
tcgtacaagc gtctggttcc gcacttcgaa gcaccggtca agctggctta ctcggcacgc 1020
aaccgttcgg cgtcgatccg tattccgcac gtctcgaacc cgaagggtcg ccgtatcgaa 1080
acgcgcttcc cggacccgat ggccaacccg tacctgtgct tctcggcact gatgatggca 1140
ggtctggacg gcgtgcagaa caagatccat ccgggcgaag ccgccgacaa gaacctgtac 1200
gacctgccgc cggaagagga tgcaaagatc ccgaccgttt gcgccggcct cgaccaggct 1260
ctggaagcgc ttgacaagga tcgcgagttc ctgacgcgcg gtggcgtgtt cacggattcg 1320
atgatcgacg cctacctcgc actgaaggaa ggcgaactgc aacgcgtgcg catgacgacg 1380
cacccggtcg agttcgaact gtactactcg ctgtaa 1416
<210> 23
<211> 1416
<212> DNA
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 23
atgagtaaat ccgtggccga cgtcatgcaa ctcgtcaagg acgaagacgt caagtttgtc 60
gacttccgct ttaccgacac gcgcggcaag gagcaacacg tctcggttcc gctgtcgcac 120
ttcgacgaag acaagttcga gtcgggtcat gcatttgacg gttcgtcgat cgccggctgg 180
aagggcatcg aagcctcgga catgctgctc gttccggatg cgaacacggc cttcatcgac 240
ccgttctacg aagagtcgac gctggttctg acctgcgacg tggtcgagcc ggctgacggc 300
aagggctacg agcgcgaccc gcgctcgctc gccaagcgcg ctgaagcgta cctgaagagc 360
acgggcctcg gcgacacggc cttcttcggt ccggaacccg aattcttcat tttcgactcg 420
gtccagtgga acacggacat gtcgggctcg ttcgtcaaga tcggctcgga agaagcaccg 480
tggtcgtcga gcaaggaatt cgaaggcggc aacacgggtc accgtccggg cgtcaagggc 540
ggctacttcc cggtcgcgcc ggtcgacacg ttccaggaca tccgttcgga aatgtgtctg 600
ctgctcgaac agatcggcat cccggtcgaa gtgcaccacc acgaagtcgc tggccacggc 660
cagaacgaaa tcggcacgaa gttctcgacg ctggttcagc gcgcggactg gacgcagcag 720
atgaagtaca tcatccataa cgtggcgcac acgtatggca agacggcgac gttcatgccg 780
aagccgatcg ttggcgacaa cggttcgggc atgcacgttc accagtcgat ctggaaggac 840
ggccagaacc tgttcgcagg caacggctac gcaggtctgt cggaattcgc gctgttctac 900
atcggcggca tcatcaagca cgctcgcgcg ctgaacgcca tcacgaaccc gtcgacgaac 960
tcgtacaagc gtctggttcc gcacttcgaa gcaccggtca agctggctta ctcggcacgc 1020
aaccgttcgg cgtcgatccg tattccgcac gtctcgaacc cgaagggtcg ccgtatcgaa 1080
acgcgcttcc cggacccgat ggccaacccg tacctgtgct tctcggcact gatgatggca 1140
ggtctggacg gcgtgcagaa caagatccat ccgggcgaag ccgccgacaa gaacctgtac 1200
gacctgccgc cggaagagga tgcaaagatc ccgaccgttt gcgccggcct cgaccaggct 1260
ctggaagcgc ttgacaagga tcgcgagttc ctgacgcgcg gtggcgtgtt cacggattcg 1320
atgatcgacg cctacctcgc actgaaggaa ggcgaactgc aacgcgtgcg catgacgacg 1380
cacccggtcg agttcgaact gtactactcg ctgtaa 1416
<210> 24
<211> 469
<212> PRT
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 24
Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
20 25 30
Thr Ile Pro Ser His Gln Val Asn Ala Glu Phe Phe Glu Glu Gly Lys
35 40 45
Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
50 55 60
Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Pro Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
85 90 95
Thr Leu Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala
100 105 110
Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly
115 120 125
Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Ile Arg Phe Gly Ala Ser
130 135 140
Ile Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn
145 150 155 160
Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Gly Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ser Gln Asp Ile
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Met Ile Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr
210 215 220
Arg Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe
245 250 255
Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His
260 265 270
Met Ser Leu Ala Lys Asn Gly Thr Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Phe Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys
290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ala Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Thr Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
370 375 380
Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
Pro Pro Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
405 410 415
Glu Ala Leu Gln Ala Leu Asp Ala Asp Arg Glu Phe Leu Thr Ala Gly
420 425 430
Gly Val Phe Thr Asn Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Leu
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 25
<211> 469
<212> PRT
<213> 蔗糖科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)
<400> 25
Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
20 25 30
Thr Ile Pro Ala His Gln Val Asn Ala Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys
35 40 45
Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
50 55 60
Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Thr Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Ser Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
85 90 95
Thr Met Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala
100 105 110
Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Thr Gly Leu Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly
115 120 125
Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Val Arg Phe Gly Ser Ser
130 135 140
Ile Ser Gly Ser Ser Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn
145 150 155 160
Thr Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Ala Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ser Gln Asp Leu
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Leu Val Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr
210 215 220
Arg Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe
245 250 255
Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His
260 265 270
Met Ser Leu Ser Lys Asn Gly Thr Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Ser Glu Met Ala Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys
290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ser Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ala Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
370 375 380
Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
Pro Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
405 410 415
Glu Ala Leu Asn Ala Leu Asp Ala Asp Arg Glu Phe Leu Thr Ala Gly
420 425 430
Gly Val Phe Thr Asp Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Ile
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 26
<211> 469
<212> PRT
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 26
Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
20 25 30
Thr Ile Pro Ala His Gln Val Asn Ala Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys
35 40 45
Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
50 55 60
Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Pro Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
85 90 95
Thr Met Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala
100 105 110
Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly
115 120 125
Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Val Arg Phe Gly Ser Ser
130 135 140
Ile Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn
145 150 155 160
Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Ala Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ala Gln Asp Leu
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Leu Val Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr
210 215 220
Arg Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe
245 250 255
Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His
260 265 270
Met Ser Leu Ser Lys Asn Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys
290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ser Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ala Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
370 375 380
Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
Pro Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
405 410 415
Glu Ala Leu Asn Cys Leu Asn Glu Asp Arg Glu Phe Leu Thr Ala Gly
420 425 430
Gly Val Phe Thr Asp Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Ile
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 27
<211> 471
<212> PRT
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 27
Met Ser Lys Ser Val Ala Asp Val Met Gln Leu Val Lys Asp Glu Asp
1 5 10 15
Val Lys Phe Val Asp Phe Arg Phe Thr Asp Thr Arg Gly Lys Glu Gln
20 25 30
His Val Ser Val Pro Leu Ser His Phe Asp Glu Asp Lys Phe Glu Ser
35 40 45
Gly His Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Ala Gly Trp Lys Gly Ile Glu
50 55 60
Ala Ser Asp Met Leu Leu Val Pro Asp Ala Asn Thr Ala Phe Ile Asp
65 70 75 80
Pro Phe Tyr Glu Glu Ser Thr Leu Val Leu Thr Cys Asp Val Val Glu
85 90 95
Pro Ala Asp Gly Lys Gly Tyr Glu Arg Asp Pro Arg Ser Leu Ala Lys
100 105 110
Arg Ala Glu Ala Tyr Leu Lys Ser Thr Gly Leu Gly Asp Thr Ala Phe
115 120 125
Phe Gly Pro Glu Pro Glu Phe Phe Ile Phe Asp Ser Val Gln Trp Asn
130 135 140
Thr Asp Met Ser Gly Ser Phe Val Lys Ile Gly Ser Glu Glu Ala Pro
145 150 155 160
Trp Ser Ser Ser Lys Glu Phe Glu Gly Gly Asn Thr Gly His Arg Pro
165 170 175
Gly Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Val Asp Thr Phe Gln
180 185 190
Asp Ile Arg Ser Glu Met Cys Leu Leu Leu Glu Gln Ile Gly Ile Pro
195 200 205
Val Glu Val His His His Glu Val Ala Gly Gln Gly Gln Asn Glu Ile
210 215 220
Gly Thr Lys Phe Ser Thr Leu Val Gln Arg Ala Asp Trp Thr Gln Gln
225 230 235 240
Met Lys Tyr Ile Ile His Asn Val Ala His Thr Tyr Gly Lys Thr Ala
245 250 255
Thr Phe Met Pro Lys Pro Ile Val Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His
260 265 270
Val His Gln Ser Ile Trp Lys Asp Gly Gln Asn Leu Phe Ala Gly Asn
275 280 285
Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Glu Phe Ala Leu Phe Tyr Ile Gly Gly Ile
290 295 300
Ile Lys His Ala Arg Ala Leu Asn Ala Ile Thr Asn Pro Ser Thr Asn
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Tyr Ser Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro His Val Ser
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Asn Pro Lys Gly Arg Arg Ile Glu Thr Arg Phe Pro Asp Pro Met Ala
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Asn Pro Tyr Leu Cys Phe Ser Ala Leu Met Met Ala Gly Leu Asp Gly
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<400> 28
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370 375 380
Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
Pro Pro Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
405 410 415
Glu Ala Leu Gln Ala Leu Asp Ala Asp Arg Glu Phe Leu Thr Ala Gly
420 425 430
Gly Val Phe Thr Asn Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Leu
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 35
<211> 469
<212> PRT
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 35
Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
20 25 30
Thr Ile Pro Ser His Gln Val Asn Ala Glu Phe Phe Glu Glu Gly Lys
35 40 45
Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
50 55 60
Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Pro Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
85 90 95
Thr Leu Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala
100 105 110
Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly
115 120 125
Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Ile Arg Phe Gly Ala Ser
130 135 140
Ile Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn
145 150 155 160
Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Gly Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ser Gln Asp Ile
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Met Ile Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe
245 250 255
Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Ser Met His Cys His
260 265 270
Met Ser Leu Ala Lys Asn Gly Thr Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
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290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ala Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Thr Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
370 375 380
Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
Pro Pro Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
405 410 415
Glu Ala Leu Gln Ala Leu Asp Ala Asp Arg Glu Phe Leu Thr Ala Gly
420 425 430
Gly Val Phe Thr Asn Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Leu
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 36
<211> 469
<212> PRT
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 36
Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
20 25 30
Thr Ile Pro Ser His Gln Val Asn Ala Glu Phe Phe Glu Glu Gly Lys
35 40 45
Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
50 55 60
Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Pro Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
85 90 95
Thr Leu Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala
100 105 110
Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly
115 120 125
Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Ile Arg Phe Gly Ala Ser
130 135 140
Ile Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn
145 150 155 160
Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Gly Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ser Gln Asp Ile
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Met Ile Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr
210 215 220
Arg Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe
245 250 255
Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His
260 265 270
Met Ser Leu Ala Lys Asn Gly Thr Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Phe Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys
290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ala Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Thr Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
370 375 380
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420 425 430
Gly Val Phe Thr Asn Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Leu
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Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 37
<211> 945
<212> PRT
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 37
Met Met Pro Leu Ser Pro Gln Leu Gln Gln His Trp Gln Thr Val Ala
1 5 10 15
Asp Arg Leu Pro Ala Asp Phe Pro Ile Ala Glu Leu Ser Pro Gln Ala
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
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195 200 205
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Leu Ala Ala Ile Asp Glu Leu His Leu Leu Pro Glu Gly Asp Ala Ala
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Ala Ser Pro Ala Leu Ala His Leu Asn Asp Thr Asp Arg Arg Ser Val
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485 490 495
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660 665 670
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675 680 685
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725 730 735
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Gln Ala Leu Val Arg Ala Arg Val Val Tyr Gly Asp Pro Ala Leu Gln
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Ser Arg Glu Arg Gln Gln Val Ser Ala Ser Trp Gln Lys Trp Leu Met
930 935 940
Ala
945
<210> 38
<211> 469
<212> PRT
<213> 蔗糖科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)
<400> 38
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1 5 10 15
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20 25 30
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Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
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Thr Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Ala Val
165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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260 265 270
Met Ser Leu Ser Lys Asn Gly Thr Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
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His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ser Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
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Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ala Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
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Gly Val Phe Thr Asp Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Ile
435 440 445
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Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 39
<211> 469
<212> PRT
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 39
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1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
20 25 30
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Tyr Glu Glu Pro Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
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Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly
115 120 125
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130 135 140
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Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly Leu Arg Pro Ala Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ala Gln Asp Leu
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Leu Val Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr
210 215 220
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Met Ser Leu Ser Lys Asn Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys
290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ser Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ala Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
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Pro Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
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420 425 430
Gly Val Phe Thr Asp Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Ile
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 40
<211> 469
<212> PRT
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 40
Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
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Thr Ile Pro Ala His Gln Val Asn Ala Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys
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Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
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Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe
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Tyr Glu Glu Pro Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
85 90 95
Thr Met Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala
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Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Val Arg Phe Gly Ser Ser
130 135 140
Ile Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn
145 150 155 160
Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Ala Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ala Gln Asp Leu
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Leu Val Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Ser Gln Asn Glu Val Ala Thr
210 215 220
Arg Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe
245 250 255
Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His
260 265 270
Met Ser Leu Ser Lys Asn Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys
290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ser Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ala Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
370 375 380
Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
Pro Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
405 410 415
Glu Ala Leu Asn Cys Leu Asn Glu Asp Arg Glu Phe Leu Thr Ala Gly
420 425 430
Gly Val Phe Thr Asp Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Ile
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 41
<211> 469
<212> PRT
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 41
Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
20 25 30
Thr Ile Pro Ala His Gln Val Asn Ala Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys
35 40 45
Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
50 55 60
Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Pro Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
85 90 95
Thr Met Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala
100 105 110
Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly
115 120 125
Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Val Arg Phe Gly Ser Ser
130 135 140
Ile Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn
145 150 155 160
Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Ala Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ala Gln Asp Leu
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Leu Val Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr
210 215 220
Arg Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Ile Phe
245 250 255
Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His
260 265 270
Met Ser Leu Ser Lys Asn Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys
290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ser Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ala Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
370 375 380
Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
Pro Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
405 410 415
Glu Ala Leu Asn Cys Leu Asn Glu Asp Arg Glu Phe Leu Thr Ala Gly
420 425 430
Gly Val Phe Thr Asp Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Ile
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 42
<211> 469
<212> PRT
<213> 肠内甲烷嗜热杆菌(Metakosakonia intestini)
<400> 42
Met Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val
20 25 30
Thr Ile Pro Ala His Gln Val Asn Ala Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys
35 40 45
Met Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser
50 55 60
Asp Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Pro Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly
85 90 95
Thr Met Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala
100 105 110
Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly
115 120 125
Pro Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Val Arg Phe Gly Ser Ser
130 135 140
Ile Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn
145 150 155 160
Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Ala Val
165 170 175
Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ala Gln Asp Leu
180 185 190
Arg Ser Thr Met Cys Leu Val Met Glu Glu Met Gly Leu Val Val Glu
195 200 205
Ala His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr
210 215 220
Arg Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Tyr Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe
245 250 255
Met Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His
260 265 270
Met Ser Leu Ser Lys Asn Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Asp Lys Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys
290 295 300
His Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ser Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr
305 310 315 320
Lys Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Val Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser
325 330 335
Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ala Ser Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro
355 360 365
Tyr Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys
370 375 380
Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
Pro Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu
405 410 415
Glu Ala Leu Asn Cys Leu Asn Glu Asp Arg Glu Phe Leu Thr Ala Gly
420 425 430
Gly Val Phe Thr Asp Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Ile
435 440 445
Glu Glu Asn Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu
450 455 460
Leu Tyr Tyr Ser Val
465
<210> 43
<211> 471
<212> PRT
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 43
Met Ser Lys Ser Val Ala Asp Val Met Gln Leu Val Lys Asp Glu Asp
1 5 10 15
Val Lys Phe Val Asp Phe Arg Phe Thr Asp Thr Arg Gly Lys Glu Gln
20 25 30
His Val Ser Val Pro Leu Ser His Phe Asp Glu Asp Lys Phe Glu Ser
35 40 45
Gly His Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Ala Gly Trp Lys Gly Ile Glu
50 55 60
Ala Ser Asp Met Leu Leu Val Pro Asp Ala Asn Thr Ala Phe Ile Asp
65 70 75 80
Pro Phe Tyr Glu Glu Ser Thr Leu Val Leu Thr Cys Asp Val Val Glu
85 90 95
Pro Ala Asp Gly Lys Gly Cys Glu Arg Asp Pro Arg Ser Leu Ala Lys
100 105 110
Arg Ala Glu Ala Tyr Leu Lys Ser Thr Gly Leu Gly Asp Thr Ala Phe
115 120 125
Phe Gly Pro Glu Pro Glu Phe Phe Ile Phe Asp Ser Val Gln Trp Asn
130 135 140
Thr Asp Met Ser Gly Ser Phe Val Lys Ile Gly Ser Glu Glu Ala Pro
145 150 155 160
Trp Ser Ser Ser Lys Glu Phe Glu Gly Gly Asn Thr Gly His Arg Pro
165 170 175
Gly Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Val Asp Thr Phe Gln
180 185 190
Asp Ile Arg Ser Glu Met Cys Leu Leu Leu Glu Gln Ile Gly Ile Pro
195 200 205
Val Glu Val His His His Glu Val Ala Gly Gln Gly Gln Asn Glu Ile
210 215 220
Gly Thr Lys Phe Ser Thr Leu Val Gln Arg Ala Asp Trp Thr Gln Gln
225 230 235 240
Met Lys Tyr Ile Ile His Asn Val Ala His Thr Tyr Gly Lys Thr Ala
245 250 255
Thr Phe Met Pro Lys Pro Ile Val Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His
260 265 270
Val His Gln Ser Ile Trp Lys Asp Gly Gln Asn Leu Phe Ala Gly Asn
275 280 285
Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Glu Phe Ala Leu Phe Tyr Ile Gly Gly Ile
290 295 300
Ile Lys His Ala Arg Ala Leu Asn Ala Ile Thr Asn Pro Ser Thr Asn
305 310 315 320
Ser Tyr Lys Arg Leu Val Pro His Phe Glu Ala Pro Val Lys Leu Ala
325 330 335
Tyr Ser Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro His Val Ser
340 345 350
Asn Pro Lys Gly Arg Arg Ile Glu Thr Arg Phe Pro Asp Pro Met Ala
355 360 365
Asn Pro Tyr Leu Cys Phe Ser Ala Leu Met Met Ala Gly Leu Asp Gly
370 375 380
Val Gln Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Ala Asp Lys Asn Leu Tyr
385 390 395 400
Asp Leu Pro Pro Glu Glu Asp Ala Lys Ile Pro Thr Val Cys Ala Gly
405 410 415
Leu Asp Gln Ala Leu Glu Ala Leu Asp Lys Asp Arg Glu Phe Leu Thr
420 425 430
Arg Gly Gly Val Phe Thr Asp Ser Met Ile Asp Ala Tyr Leu Ala Leu
435 440 445
Lys Glu Gly Glu Leu Gln Arg Val Arg Met Thr Thr His Pro Val Glu
450 455 460
Phe Glu Leu Tyr Tyr Ser Leu
465 470
<210> 44
<211> 471
<212> PRT
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 44
Met Ser Lys Ser Val Ala Asp Val Met Gln Leu Val Lys Asp Glu Asp
1 5 10 15
Val Lys Phe Val Asp Phe Arg Phe Thr Asp Thr Arg Gly Lys Glu Gln
20 25 30
His Val Ser Val Pro Leu Ser His Phe Asp Glu Asp Lys Phe Glu Ser
35 40 45
Gly His Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Ala Gly Trp Lys Gly Ile Glu
50 55 60
Ala Ser Asp Met Leu Leu Val Pro Asp Ala Asn Thr Ala Phe Ile Asp
65 70 75 80
Pro Phe Tyr Glu Glu Ser Thr Leu Val Leu Thr Cys Asp Val Val Glu
85 90 95
Pro Ala Asp Gly Lys Gly Tyr Glu Arg Asp Pro Arg Ser Leu Ala Lys
100 105 110
Arg Ala Glu Ala Tyr Leu Lys Ser Thr Gly Leu Gly Asp Thr Ala Phe
115 120 125
Phe Gly Pro Glu Pro Glu Phe Phe Ile Phe Asp Ser Val Gln Trp Asn
130 135 140
Thr Asp Met Ser Gly Ser Phe Val Lys Ile Gly Ser Glu Glu Ala Pro
145 150 155 160
Trp Ser Pro Ser Lys Glu Phe Glu Gly Gly Asn Thr Gly His Arg Pro
165 170 175
Gly Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Val Asp Thr Phe Gln
180 185 190
Asp Ile Arg Ser Glu Met Cys Leu Leu Leu Glu Gln Ile Gly Ile Pro
195 200 205
Val Glu Val His His His Glu Val Ala Gly Gln Gly Gln Asn Glu Ile
210 215 220
Gly Thr Lys Phe Ser Thr Leu Val Gln Arg Ala Asp Trp Thr Gln Gln
225 230 235 240
Met Lys Tyr Ile Ile His Asn Val Ala His Thr Tyr Gly Lys Thr Ala
245 250 255
Thr Phe Met Pro Lys Pro Ile Val Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His
260 265 270
Val His Gln Ser Ile Trp Lys Asp Gly Gln Asn Leu Phe Ala Gly Asn
275 280 285
Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Glu Phe Ala Leu Phe Tyr Ile Gly Gly Ile
290 295 300
Ile Lys His Ala Arg Ala Leu Asn Ala Ile Thr Asn Pro Ser Thr Asn
305 310 315 320
Ser Tyr Lys Arg Leu Val Pro His Phe Glu Ala Pro Val Lys Leu Ala
325 330 335
Tyr Ser Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro His Val Ser
340 345 350
Asn Pro Lys Gly Arg Arg Ile Glu Thr Arg Phe Pro Asp Pro Met Ala
355 360 365
Asn Pro Tyr Leu Cys Phe Ser Ala Leu Met Met Ala Gly Leu Asp Gly
370 375 380
Val Gln Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Ala Asp Lys Asn Leu Tyr
385 390 395 400
Asp Leu Pro Pro Glu Glu Asp Ala Lys Ile Pro Thr Val Cys Ala Gly
405 410 415
Leu Asp Gln Ala Leu Glu Ala Leu Asp Lys Asp Arg Glu Phe Leu Thr
420 425 430
Arg Gly Gly Val Phe Thr Asp Ser Met Ile Asp Ala Tyr Leu Ala Leu
435 440 445
Lys Glu Gly Glu Leu Gln Arg Val Arg Met Thr Thr His Pro Val Glu
450 455 460
Phe Glu Leu Tyr Tyr Ser Leu
465 470
<210> 45
<211> 471
<212> PRT
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 45
Met Ser Lys Ser Val Ala Asp Val Met Gln Leu Val Lys Asp Glu Asp
1 5 10 15
Val Lys Phe Val Asp Phe Arg Phe Thr Asp Thr Arg Gly Lys Glu Gln
20 25 30
His Val Ser Val Pro Leu Ser His Phe Asp Glu Asp Lys Phe Glu Ser
35 40 45
Gly His Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Ala Gly Trp Lys Gly Ile Glu
50 55 60
Ala Ser Asp Met Leu Leu Val Pro Asp Ala Asn Thr Ala Phe Ile Asp
65 70 75 80
Pro Phe Tyr Glu Glu Ser Thr Leu Val Leu Thr Cys Asp Val Val Glu
85 90 95
Pro Ala Asp Gly Lys Gly Tyr Glu Arg Asp Pro Arg Ser Leu Ala Lys
100 105 110
Arg Ala Glu Ala Tyr Leu Lys Ser Thr Gly Leu Gly Asp Thr Ala Phe
115 120 125
Phe Gly Pro Glu Pro Glu Phe Phe Ile Phe Asp Ser Val Gln Trp Asn
130 135 140
Thr Asp Met Ser Gly Ser Phe Val Lys Ile Gly Ser Glu Glu Ala Pro
145 150 155 160
Trp Ser Ser Ser Lys Glu Phe Glu Gly Gly Asp Thr Gly His Arg Pro
165 170 175
Gly Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Val Asp Thr Phe Gln
180 185 190
Asp Ile Arg Ser Glu Met Cys Leu Leu Leu Glu Gln Ile Gly Ile Pro
195 200 205
Val Glu Val His His His Glu Val Ala Gly Gln Gly Gln Asn Glu Ile
210 215 220
Gly Thr Lys Phe Ser Thr Leu Val Gln Arg Ala Asp Trp Thr Gln Gln
225 230 235 240
Met Lys Tyr Ile Ile His Asn Val Ala His Thr Tyr Gly Lys Thr Ala
245 250 255
Thr Phe Met Pro Lys Pro Ile Val Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His
260 265 270
Val His Gln Ser Ile Trp Lys Asp Gly Gln Asn Leu Phe Ala Gly Asn
275 280 285
Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Glu Phe Ala Leu Phe Tyr Ile Gly Gly Ile
290 295 300
Ile Lys His Ala Arg Ala Leu Asn Ala Ile Thr Asn Pro Ser Thr Asn
305 310 315 320
Ser Tyr Lys Arg Leu Val Pro His Phe Glu Ala Pro Val Lys Leu Ala
325 330 335
Tyr Ser Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro His Val Ser
340 345 350
Asn Pro Lys Gly Arg Arg Ile Glu Thr Arg Phe Pro Asp Pro Met Ala
355 360 365
Asn Pro Tyr Leu Cys Phe Ser Ala Leu Met Met Ala Gly Leu Asp Gly
370 375 380
Val Gln Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Ala Asp Lys Asn Leu Tyr
385 390 395 400
Asp Leu Pro Pro Glu Glu Asp Ala Lys Ile Pro Thr Val Cys Ala Gly
405 410 415
Leu Asp Gln Ala Leu Glu Ala Leu Asp Lys Asp Arg Glu Phe Leu Thr
420 425 430
Arg Gly Gly Val Phe Thr Asp Ser Met Ile Asp Ala Tyr Leu Ala Leu
435 440 445
Lys Glu Gly Glu Leu Gln Arg Val Arg Met Thr Thr His Pro Val Glu
450 455 460
Phe Glu Leu Tyr Tyr Ser Leu
465 470
<210> 46
<211> 471
<212> PRT
<213> 热带副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia tropica)
<400> 46
Met Ser Lys Ser Val Ala Asp Val Met Gln Leu Val Lys Asp Glu Asp
1 5 10 15
Val Lys Phe Val Asp Phe Arg Phe Thr Asp Thr Arg Gly Lys Glu Gln
20 25 30
His Val Ser Val Pro Leu Ser His Phe Asp Glu Asp Lys Phe Glu Ser
35 40 45
Gly His Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Ala Gly Trp Lys Gly Ile Glu
50 55 60
Ala Ser Asp Met Leu Leu Val Pro Asp Ala Asn Thr Ala Phe Ile Asp
65 70 75 80
Pro Phe Tyr Glu Glu Ser Thr Leu Val Leu Thr Cys Asp Val Val Glu
85 90 95
Pro Ala Asp Gly Lys Gly Tyr Glu Arg Asp Pro Arg Ser Leu Ala Lys
100 105 110
Arg Ala Glu Ala Tyr Leu Lys Ser Thr Gly Leu Gly Asp Thr Ala Phe
115 120 125
Phe Gly Pro Glu Pro Glu Phe Phe Ile Phe Asp Ser Val Gln Trp Asn
130 135 140
Thr Asp Met Ser Gly Ser Phe Val Lys Ile Gly Ser Glu Glu Ala Pro
145 150 155 160
Trp Ser Ser Ser Lys Glu Phe Glu Gly Gly Asn Thr Gly His Arg Pro
165 170 175
Gly Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Val Asp Thr Phe Gln
180 185 190
Asp Ile Arg Ser Glu Met Cys Leu Leu Leu Glu Gln Ile Gly Ile Pro
195 200 205
Val Glu Val His His His Glu Val Ala Gly His Gly Gln Asn Glu Ile
210 215 220
Gly Thr Lys Phe Ser Thr Leu Val Gln Arg Ala Asp Trp Thr Gln Gln
225 230 235 240
Met Lys Tyr Ile Ile His Asn Val Ala His Thr Tyr Gly Lys Thr Ala
245 250 255
Thr Phe Met Pro Lys Pro Ile Val Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His
260 265 270
Val His Gln Ser Ile Trp Lys Asp Gly Gln Asn Leu Phe Ala Gly Asn
275 280 285
Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Glu Phe Ala Leu Phe Tyr Ile Gly Gly Ile
290 295 300
Ile Lys His Ala Arg Ala Leu Asn Ala Ile Thr Asn Pro Ser Thr Asn
305 310 315 320
Ser Tyr Lys Arg Leu Val Pro His Phe Glu Ala Pro Val Lys Leu Ala
325 330 335
Tyr Ser Ala Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro His Val Ser
340 345 350
Asn Pro Lys Gly Arg Arg Ile Glu Thr Arg Phe Pro Asp Pro Met Ala
355 360 365
Asn Pro Tyr Leu Cys Phe Ser Ala Leu Met Met Ala Gly Leu Asp Gly
370 375 380
Val Gln Asn Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Ala Asp Lys Asn Leu Tyr
385 390 395 400
Asp Leu Pro Pro Glu Glu Asp Ala Lys Ile Pro Thr Val Cys Ala Gly
405 410 415
Leu Asp Gln Ala Leu Glu Ala Leu Asp Lys Asp Arg Glu Phe Leu Thr
420 425 430
Arg Gly Gly Val Phe Thr Asp Ser Met Ile Asp Ala Tyr Leu Ala Leu
435 440 445
Lys Glu Gly Glu Leu Gln Arg Val Arg Met Thr Thr His Pro Val Glu
450 455 460
Phe Glu Leu Tyr Tyr Ser Leu
465 470

Claims (317)

1.一种生物传感器，其能够检测组合物中铵的存在，所述生物传感器包括包含以下的细菌：
a)编码报告分子的核酸序列，
b)选自可操作地连接至(a)的所述核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，
c)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和
d)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
3.如权利要求2所述的生物传感器，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
4.如权利要求3所述的生物传感器，其中所述荧光蛋白是GFP。
5.如权利要求4所述的生物传感器，其中所述GFP是超折叠GFP。
6.如上述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中所述启动子或其片段选自nifHDK操纵子。
7.如权利要求1-5中任一项所述的生物传感器，其中所述启动子是nifH启动子。
8.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述抑制性固氮调节蛋白是NifL。
9.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述正固氮调节蛋白是NifA。
10.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述细菌是大肠杆菌。
11.一种检测组合物中铵的存在的方法，所述方法包括：
a)用生物传感器接种组合物，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：
i)编码报告分子的核酸序列，
ii)选自可操作地连接至(i)的所述核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，
iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和
iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；
b)将经接种的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和
c)在(b)之后检测与对照组合物相比所述经接种的组合物的报告分子输出。
12.如权利要求11所述的方法，所述方法还包括基于检测的报告分子输出量化所述组合物中铵的量。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
14.如权利要求11-12中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
19.如权利要求15所述的方法，其中步骤(b)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
20.如权利要求15所述的方法，其中步骤(c)需要在(b)之后检测与所述对照组合物相比所述经接种的组合物的荧光输出强度。
21.如权利要求15所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
22.一种用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法，所述方法包括：
a)将细菌群体暴露于微生物组合物中的诱变剂；
b)将所述微生物组合物与生物传感器共培养，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：
i)编码报告分子的核酸序列，
ii)选自可操作地连接至(i)的所述核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，
iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和
iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；
c)将共培养的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和
d)将能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起报告分子输出降低或没有报告分子输出的细菌突变体。
23.如权利要求22所述的方法，其中在(c)之后检测与对照组合物相比所述共培养的组合物的报告分子输出。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述对照组合物包含不表达所述报告分子的微生物。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述对照组合物包含表达所述报告分子的功能缺失变体的微生物。
26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
27.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
32.如权利要求28所述的方法，其中步骤(c)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
33.如权利要求28所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
34.如权利要求22所述的方法，所述方法还包括分离(d)中鉴定的能够固定大气氮的所述细菌突变体。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。
37.如权利要求34或36所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括在glnA中包含至少一个遗传变异的细菌。
38.如权利要求37所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ IDNO:2的核酸序列。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
43.如权利要求38所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ IDNO:3的核酸序列。
44.如权利要求37所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
45.如权利要求37所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
46.如权利要求37所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
49.如权利要求45所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列。
50.如权利要求45所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
51.如权利要求45所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列。
52.如权利要求45所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
53.如权利要求37所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ IDNO:4的核酸序列。
55.如权利要求37所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。
56.如权利要求37所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
57.如权利要求37所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列。
59.如权利要求56所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
60.如权利要求34或36所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括在glnE中包含至少一个遗传变异的细菌。
61.如权利要求60所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
62.如权利要求60所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。
64.如权利要求60所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
65.如权利要求60所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
66.如权利要求60所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
67.如权利要求65所述的方法，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
68.如权利要求65所述的方法，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
69.如权利要求65所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
70.如权利要求65所述的方法，其中所述GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
71.一种用于高通量鉴定一种或多种能够固定大气氮的细菌突变体的方法，所述方法包括：
a)将细菌群体暴露于诱变剂；
b)将(a)中的所述细菌群体转移到一个或多个包含培养基的样品中；
c)在(b)中的所述一个或多个样品中的每一个内共培养生物传感器，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：
i)编码报告分子的核酸序列，
ii)选自可操作地连接至(i)的所述核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，
iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和
iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；
d)将(c)中的所述一个或多个样品中的每一个暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和
e)从(d)中的所述一个或多个样品中将一种或多种能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起所述报告分子输出降低的细菌突变体。
72.如权利要求71所述的方法，其中在(d)之后测量与对照组合物相比(d)中的所述一个或多个样品的所述报告分子输出。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述对照组合物包含不表达所述报告分子的微生物。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述对照组合物包含表达所述报告分子的功能缺失变体的微生物。
75.如权利要求71-74中任一项所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
76.如权利要求71-74中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
81.如权利要求77所述的方法，其中步骤(d)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
82.如权利要求77所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
83.如权利要求71所述的方法，所述方法还包括分离能够固定大气氮的所述细菌突变体。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。
85.如权利要求83所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。
86.如权利要求83所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括在glnA中包含至少一个遗传变异的细菌。
87.如权利要求86所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
90.如权利要求87或89所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQID NO:2的核酸序列。
91.如权利要求87所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
92.如权利要求87所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ IDNO:3的核酸序列。
93.如权利要求86所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
94.如权利要求86所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
95.如权利要求86所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
96.如权利要求94所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
97.如权利要求94所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
98.如权利要求94所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列。
99.如权利要求94所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
100.如权利要求94所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列。
101.如权利要求94所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
102.如权利要求86所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ IDNO:4的核酸序列。
104.如权利要求86所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。
105.如权利要求86所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
106.如权利要求86所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列。
108.如权利要求105所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
109.如权利要求83或85所述的方法，其中所述分离的细菌突变体在glnE中包含至少一个遗传变异。
110.如权利要求109所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
111.如权利要求109所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
112.如权利要求110所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。
113.如权利要求109所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
114.如权利要求109所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
115.如权利要求109所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
116.如权利要求114所述的方法，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
117.如权利要求114所述的方法，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
118.如权利要求114所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
119.如权利要求114所述的方法，其中所述GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
120.如权利要求71所述的方法，其中所述细菌群体包含至少100,000个细菌，并且其中所述用于高通量鉴定的方法在不到四小时内完成。
121.一种用于鉴定涉及固定大气氮的新细菌基因、途径和/或调节元件的方法，所述方法包括：
a)将细菌群体暴露于微生物组合物中的诱变剂；
b)用生物传感器接种所述微生物组合物，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：
i)编码报告分子的核酸序列，
ii)选自可操作地连接至(i)的所述核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，
iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和
iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列；其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；
c)将经接种的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激，
d)在(c)之后测量与对照组合物相比所述经接种的组合物的报告分子输出；
e)从与所述对照组合物相比表现出所述报告分子输出降低的经接种的组合物中分离细菌作为能够固定大气氮的细菌；
f)对来自(e)的能够固定大气氮的所述细菌的基因组进行测序；和
g)从所述测序的基因组中鉴定含有突变的基因、途径和/或调节元件。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述对照组合物包含不表达所述报告分子的微生物。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述对照组合物包含表达所述报告分子的功能缺失变体的微生物。
124.如权利要求121-123中任一项所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
125.如权利要求121-123中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
128.如权利要求126所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
130.如权利要求126所述的方法，其中步骤(c)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
131.如权利要求126所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
132.如权利要求121所述的方法，所述方法还包括确定所述基因、途径和/或调节元件是否含有已知与大气氮的固定相关联的突变。
133.如权利要求121所述的方法，其中所述鉴定的突变包括glnA或glnE中的至少一个突变。
134.如权利要求133所述的方法，其中glnA中的所述至少一个突变包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
136.如权利要求134所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
137.如权利要求134或136所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
138.如权利要求134所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
139.如权利要求134所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQID NO:3的核酸序列。
140.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
141.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
142.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
143.如权利要求141所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
144.如权利要求141所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
145.如权利要求141所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQID NO:25的氨基酸序列。
146.如权利要求141所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
147.如权利要求141所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQID NO:26的氨基酸序列。
148.如权利要求141所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
149.如权利要求133所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ IDNO:4的核酸序列。
151.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。
152.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
153.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
154.如权利要求152所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列。
155.如权利要求152所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
156.如权利要求133所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
157.如权利要求133所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
158.如权利要求156所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。
159.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
160.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
161.如权利要求133所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
162.如权利要求160所述的方法，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
163.如权利要求160所述的方法，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
164.如权利要求160所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
165.如权利要求160所述的方法，其中所述GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
166.一种用于鉴定能够固定大气氮的细菌突变体的方法，所述方法包括：
a)将细菌群体暴露于诱变剂；
b)将暴露于(a)中的所述诱变剂的所述细菌群体暴露于微生物组合物中的固氮生长抑制剂；
c)将所述微生物组合物与生物传感器共培养，其中所述生物传感器包括包含以下的细菌：
i)编码报告分子的核酸序列，
ii)选自可操作地连接至(i)的所述核酸序列的Nif调节子的启动子或其片段，
iii)编码抑制性固氮调节蛋白的核酸序列，和
iv)编码正固氮调节蛋白的核酸序列，其中所述细菌在不存在铵的情况下表达所述报告分子；
d)将共培养的组合物暴露于足以激活所述报告分子的刺激；和
e)将能够固定大气氮的细菌突变体鉴定为与对照相比引起报告分子输出降低或没有报告分子输出的细菌突变体。
167.如权利要求166所述的方法，其中所述固氮生长抑制剂是乙二胺(EDA)或甲基铵。
168.如权利要求166所述的方法，其中在(d)之后测量与对照组合物相比(d)中的所述一个或多个样品的所述报告分子输出。
169.如权利要求168所述的方法，其中所述对照组合物包含不表达所述报告分子的微生物。
170.如权利要求168所述的方法，其中所述对照组合物包含表达所述报告分子的功能缺失变体的微生物。
171.如权利要求166-170中任一项所述的方法，其中所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、遗传刺激和能量刺激组成的组。
172.如权利要求166-170中任一项所述的方法，其中所述刺激是光。
173.如权利要求172所述的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白、功能片段和/或其融合物。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、CFP或其功能变体或片段。
175.如权利要求173所述的方法，其中所述荧光蛋白是GFP。
176.如权利要求175所述的方法，其中所述GFP是超折叠GFP。
177.如权利要求173所述的方法，其中步骤(d)需要将所述经接种的组合物暴露于足以使所述荧光蛋白、功能片段和/或其融合物发荧光的光激发。
178.如权利要求173所述的方法，其中所述荧光用流式细胞仪、酶标仪或荧光激活液滴分选检测。
179.如权利要求166所述的方法，所述方法还包括分离鉴定为能够固定大气氮的所述细菌突变体。
180.如权利要求179所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括选自以下的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌、保藏为PTA-126726的细菌及其组合。
181.如权利要求179所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括包含至少一个遗传变异的细菌，所述遗传变异引入选自由以下组成的组的成员中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、与固氮酶的生物合成相关联的基因或其组合。
182.如权利要求179或181所述的方法，其中所述分离的细菌突变体包括在glnA中包含遗传变异的细菌。
183.如权利要求182所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
184.如权利要求183所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
185.如权利要求183所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
186.如权利要求183或185所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
187.如权利要求183所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
188.如权利要求183或187所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
189.如权利要求182所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 6-13和15-19组成的组的核酸序列。
190.如权利要求182所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
191.如权利要求182所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
192.如权利要求190所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
193.如权利要求190所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
194.如权利要求190所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQID NO:25的氨基酸序列。
195.如权利要求190所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
196.如权利要求190所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQID NO:26的氨基酸序列。
197.如权利要求190所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
198.如权利要求182所述的方法，其中glnA中的所述至少一个遗传变异包括在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
199.如权利要求198所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQ IDNO:4的核酸序列。
200.如权利要求182所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因包含选自由SEQ ID NO 20-23组成的组的核酸序列。
201.如权利要求182所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnA蛋白。
202.如权利要求182所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnA基因的表达产生包含至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的GlnA蛋白。
203.如权利要求201所述的方法，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列。
204.如权利要求201所述的方法，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
205.如权利要求179或181所述的方法，其中所述分离的细菌突变体在glnE中包含至少一个遗传变异。
206.如权利要求205所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
207.如权利要求205所述的方法，其中glnE中的所述至少一个遗传变异包括在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处的至少一个核苷酸取代。
208.如权利要求206所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ ID NO:5的核酸序列。
209.如权利要求205所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
210.如权利要求205所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
211.如权利要求205所述的方法，其中包含所述至少一个遗传变异的所述glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代的GlnE蛋白。
212.如权利要求210所述的方法，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
213.如权利要求210所述的方法，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
214.如权利要求210所述的方法，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
215.如权利要求210所述的方法，其中所述GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
216.如权利要求11、22、71、121或166中任一项所述的方法，其中所述启动子或其片段选自nifHDK操纵子。
217.如权利要求11、22、71、121或166中任一项所述的方法，其中所述启动子是nifH启动子。
218.如权利要求11、22、71、121或166中任一项所述的方法，其中所述抑制性固氮调节蛋白是NifL。
219.如权利要求11、22、71、121或166中任一项所述的方法，其中所述正固氮调节蛋白是NifA。
220.如权利要求22、71、121或166中任一项所述的方法，其中所述细菌群体选自野生型细菌、转基因突变细菌、非属间突变细菌和属间突变细菌。
221.如权利要求22、71、121或166中任一项所述的方法，其中所述诱变剂选自丝裂霉素C(MMC)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、亚硝酸(NA)、二环氧丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基-2-氯乙基]-氨基丙胺)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)。
222.如权利要求221所述的方法，其中所述诱变剂是EMS。
223.一种微生物组合物，其包含：一种或多种选自由以下组成的组的分离的细菌：保藏为PTA-126709的细菌、保藏为PTA-126710的细菌、保藏为PTA-126711的细菌、保藏为PTA-126712的细菌、保藏为PTA-126713的细菌、保藏为PTA-126714的细菌、保藏为PTA-126715的细菌、保藏为PTA-126716的细菌、保藏为PTA-126717的细菌、保藏为PTA-126718的细菌、保藏为PTA-126719的细菌、保藏为PTA-126720的细菌、保藏为PTA-126721的细菌、保藏为PTA-126722的细菌、保藏为PTA-126723的细菌、保藏为PTA-126724的细菌、保藏为PTA-126725的细菌和保藏为PTA-126726的细菌。
224.如权利要求223所述的微生物组合物，其还包含农业上可接受的载剂。
225.如权利要求223所述的微生物组合物，其中所述一种或多种分离的细菌以高于野生型亲本谱系细菌的速率固定大气氮。
226.一种固氮细菌，其包含突变glnE基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和/或2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。
227.如权利要求226所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因在所述克雷伯氏菌属glnE基因的核苷酸位置965和2838或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含核苷酸取代。
228.如权利要求226或227所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因与所述克雷伯氏菌属glnE基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
229.如权利要求226所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnE蛋白。
230.如权利要求227所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因的表达产生在所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有氨基酸取代的突变GlnE蛋白。
231.如权利要求229或230所述的固氮细菌，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
232.如权利要求229所述的固氮细菌，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
233.如权利要求229所述的固氮细菌，其中所述突变GlnE蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
234.如权利要求226所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnE基因包含SEQ IDNO:5的核酸序列。
235.如权利要求226所述的固氮细菌，其中所述突变glnE基因包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
236.如权利要求226所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列。
237.如权利要求229所述的固氮细菌，其中所述突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
238.一种固氮细菌，其包含编码GlnE蛋白的突变glnE基因，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
239.如权利要求238所述的固氮细菌，其中所述GlnE蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处的氨基酸取代。
240.如权利要求238或239所述的固氮细菌，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
241.如权利要求238-239中任一项所述的固氮细菌，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G746D取代。
242.如权利要求238所述的固氮细菌，其中所述GlnE蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
243.如权利要求238所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列。
244.如权利要求238所述的固氮细菌，其中所述突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
245.一种固氮细菌，其包含突变GlnE蛋白，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和/或746或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
246.如权利要求245所述的固氮细菌，其中所述GlnE蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnE蛋白的氨基酸位置322和746或在其同源物中的同源氨基酸位置处的氨基酸取代。
247.如权利要求245或246所述的固氮细菌，其中在位置322或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至E取代。
248.如权利要求245-246中任一项所述的固氮细菌，其中在位置746或所述同源氨基酸位置处的所述氨基酸取代是G至D取代。
249.如权利要求245所述的固氮细菌，其中所述GlnE蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
250.如权利要求245所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnE蛋白包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列。
251.如权利要求245所述的固氮细菌，其中所述突变GlnE蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
252.如权利要求226、238或245中任一项所述的固氮细菌，其中所述固氮细菌是变栖克雷伯氏菌CI4874。
253.一种固氮细菌，其包含突变glnA基因，所述基因在克雷伯氏菌属glnA基因的核苷酸位置198、469、515、521、566、622、652、764、802、986和/或1015或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。
254.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因与所述克雷伯氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
255.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因的表达产生在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnA蛋白。
256.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因的表达产生具有至少一个选自由克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和/或N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的突变GlnA蛋白。
257.如权利要求255或256所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
258.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因包含SEQ IDNO:1的核酸序列。
259.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是科萨克氏菌属glnA基因。
260.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
261.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物是甲烷嗜热杆菌属glnA基因。
262.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属glnA基因的同源物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
263.如权利要求253所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因包含选自由SEQ ID NO6-13和15-19组成的组的核酸序列。
264.如权利要求255或256所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQID NO:24的氨基酸序列。
265.如权利要求255或256所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
266.如权利要求255或256所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
267.如权利要求255或256所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白包含选自由SEQ IDNO 29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
268.一种固氮细菌，其包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
269.如权利要求268所述的固氮细菌，其中所述至少一个氨基酸取代选自由所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和N339D及在其同源物中的同源位置处的相同氨基酸取代组成的组。
270.如权利要求268或269所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
271.如权利要求268或269所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQID NO:24的氨基酸序列。
272.如权利要求268或269所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
273.如权利要求268或269所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
274.如权利要求268或269所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
275.如权利要求268或269所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
276.如权利要求268或269所述的固氮细菌，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
277.一种固氮细菌，其包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含在克雷伯氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置66、157、172、174、189、208、218、255、268、329和/或339或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
278.如权利要求277所述的固氮细菌，其中所述至少一个氨基酸取代选自由所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的M66I、M66V、G157C、H172L、P174L、S189F、E208K、G218S、T255I、G268S、A329V和N339D及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。
279.如权利要求277或278所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
280.如权利要求277或278所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白包含SEQID NO:24的氨基酸序列。
281.如权利要求277或278所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是科萨克氏菌属GlnA蛋白。
282.如权利要求277或278所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
283.如权利要求277或278所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物是甲烷嗜热杆菌属GlnA蛋白。
284.如权利要求277或278所述的固氮细菌，其中所述克雷伯氏菌属GlnA蛋白的同源物包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
285.如权利要求277或278所述的固氮细菌，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO29-36和38-42组成的组的氨基酸序列。
286.如权利要求253、268或277中任一项所述的固氮细菌，其中所述固氮细菌选自由变栖克雷伯氏菌CI3296、变栖克雷伯氏菌CI3936、变栖克雷伯氏菌CI3933、变栖克雷伯氏菌CI3927、变栖克雷伯氏菌CI3925、变栖克雷伯氏菌CI3943、变栖克雷伯氏菌CI3940、变栖克雷伯氏菌CI3938、蔗糖科萨克氏菌CI4065、肠内甲烷嗜热杆菌CI4875、肠内甲烷嗜热杆菌CI4876、肠内甲烷嗜热杆菌CI4877和肠内甲烷嗜热杆菌CI4878组成的组。
287.一种固氮细菌，其包含突变glnA基因，所述基因在副伯克霍尔德氏菌属glnA基因的核苷酸位置308、487、511和/或657或在其同源物中的同源核苷酸位置处包含至少一个核苷酸取代。
288.如权利要求287所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因与所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因或其同源物共有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
289.如权利要求287所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因的表达产生在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源位置处具有至少一个氨基酸取代的突变GlnA蛋白。
290.如权利要求287所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因的表达产生具有至少一个选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和/或Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组的氨基酸取代的突变GlnA蛋白。
291.如权利要求289或290所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
292.如权利要求287所述的固氮细菌，其中所述副伯克霍尔德氏菌属glnA基因包含SEQID NO:4的核酸序列。
293.如权利要求287所述的固氮细菌，其中所述突变glnA基因包含选自由SEQ ID NO20-23组成的组的核酸序列。
294.如权利要求289或290所述的固氮细菌，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
295.如权利要求289-294中任一项所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO 43-46组成的组的氨基酸序列。
296.一种固氮细菌，其包含编码GlnA蛋白的突变glnA基因，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
297.如权利要求296所述的固氮细菌，其中所述至少一个氨基酸取代选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。
298.如权利要求296或297所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
299.如权利要求296或297所述的固氮细菌，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
300.如权利要求296或297所述的固氮细菌，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO43-46组成的组的氨基酸序列。
301.一种固氮细菌，其包含突变GlnA蛋白，所述蛋白包含在副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的氨基酸位置103、163、171和/或219或在其同源物中的同源氨基酸位置处具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
302.如权利要求301所述的固氮细菌，其中所述至少一个氨基酸取代选自由副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白的Y103C、S163P、N171D和Q219H及在其同源物中的同源氨基酸位置处的相同氨基酸取代组成的组。
303.如权利要求301或302所述的固氮细菌，其中所述突变GlnA蛋白与所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白或其同源物共有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
304.如权利要求301或302所述的固氮细菌，其中所述副伯克霍尔德氏菌属GlnA蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
305.如权利要求301或302所述的固氮细菌，其中所述GlnA蛋白包含选自由SEQ ID NO43-46组成的组的氨基酸序列。
306.如权利要求287、296或301所述的固氮细菌，其中所述固氮细菌选自由热带副伯克霍尔德氏菌CI4751、热带副伯克霍尔德氏菌CI4753、热带副伯克霍尔德氏菌CI4879和热带副伯克霍尔德氏菌CI4752组成的组。
307.如权利要求226、238、245、253、268、277、287、296或301中任一项所述的固氮细菌，其中所述细菌是经遗传工程化的。
308.一种微生物组合物，其包含如权利要求226、238、245、253、268、277、287、296或301中任一项所述的固氮细菌和载剂。
309.一种向植物提供固定的氮的方法，其包括将微生物组合物施加到植物、植物部分或所述植物所在的场所或所述植物将生长的场所，其中所述微生物组合物包含至少一种如权利要求226、238、245、253、268、277、287、296或301中任一项所述的固氮细菌。
310.如权利要求309所述的方法，其中所述微生物组合物在所述植物中产生1％或更多的固定的氮。
311.如权利要求309所述的方法，其中所述组合物是固体。
312.如权利要求309所述的方法，其中所述组合物是液体。
313.如权利要求309所述的方法，其中所述施加包括用所述微生物组合物包被种子或其他植物繁殖构件。
314.如权利要求313所述的方法，其中所述微生物组合物中的至少一种固氮细菌具有至少约1.0×104cfu/克植物根部组织鲜重的平均每单位植物根部组织的定殖能力，并且产生至少约1×10-15mmol N/细菌细胞/小时的固定的N。
315.如权利要求313所述的方法，其中所述施加包括进行微生物组合物的沟内处理。
316.如权利要求315所述的方法，其中所述沟内处理包括以约1×106至约3×1012cfu/英亩的每英亩浓度施加所述微生物组合物。
317.如权利要求315所述的方法，其中所述微生物组合物是包含约1×106至约1×1011cfu细菌细胞/毫升的液体制剂。
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