CN116004439A - 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法 - Google Patents

产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116004439A
CN116004439A CN202211302440.3A CN202211302440A CN116004439A CN 116004439 A CN116004439 A CN 116004439A CN 202211302440 A CN202211302440 A CN 202211302440A CN 116004439 A CN116004439 A CN 116004439A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dpa
microorganism
seq
seed
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211302440.3A
Other languages
English (en)
Inventor
F·肯迪尔基
B·戈登
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amwack Hong Kong Ltd
Original Assignee
Amwack Hong Kong Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amwack Hong Kong Ltd filed Critical Amwack Hong Kong Ltd
Publication of CN116004439A publication Critical patent/CN116004439A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A01N63/23—B. thuringiensis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/25—Paenibacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/28—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G1/00—Mixtures of fertilisers belonging individually to different subclasses of C05
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/60—Biocides or preservatives, e.g. disinfectants, pesticides or herbicides; Pest repellants or attractants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G5/00—Fertilisers characterised by their form
    • C05G5/20—Liquid fertilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G5/00—Fertilisers characterised by their form
    • C05G5/40—Fertilisers incorporated into a matrix
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/03—Amine-lyases (4.3.3)
    • C12Y403/03007—4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (4.3.3.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/61—Streptomyces venezuelae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90206—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了选择与运载体共配制的微生物的方法。在一些实例中，所述方法包括鉴定包含一或多种吡啶二羧酸(DPA)合酶基因的微生物、表达一或多种DPA合酶蛋白的微生物和/或产生DPA的微生物；以及选择与运载体共配制的微生物。所述方法任选地包括将选定的微生物与运载体共配制。在一些实例中，所述方法包括检测微生物中的一或多种DPA合酶基因或一或多种DpaA和/或DpaB蛋白。在其他实例中，所述方法包括例如使用荧光测定检测微生物或含有微生物的培养基中的DPA。还提供了包含一或多种微生物的微生物组合物，所述微生物包含一或多种DPA合酶基因、表达一或多种DPA合酶蛋白和/或产生DPA。

Description

产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法
本申请是2019年6月5日提交的题为“产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法”的中国专利申请201980052489.8的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年6月6日提交的美国临时申请号62/681,469的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及产生吡啶二羧酸的微生物和鉴定具有提高的生存力(viability)的微生物的方法，将微生物与运载体共配制的方法，以及包括该微生物和/或共配制物的组合物。
背景技术
基于微生物的植物生物刺激剂提供了可持续的农业实践，可以保护生态系统的健康。此外，向植物和土壤微生物组补充有益微生物具有促进植物生长和植物适应性、提高生产力、改善土壤肥力和减少化学物投入的潜力，从而导致更可持续的农业实践。在当前的农业实践中，微生物生物刺激剂可以与许多湿的或干的运载体共同施用和/或共配制。
发明概述
微生物接种剂可能对所用运载体的化学性质敏感。此外，施用前的储存条件和储存时间也会影响微生物。这些因素可能会对它们的生存力产生负面影响，并最终限制其田间效力。本文公开了导致改善的微生物存活和/或改善的微生物与运载体或种子的共配制的组合物和方法。在一些实施方案中，所述方法包括选择一或多种单独和/或与一或多种运载体或种子共配制时具有延长的生存力或存活(survival)的微生物。
在一些实施方案中，本文公开了产生吡啶二羧酸(DPA)的微生物以及包括这些微生物的组合物。在一个实例中，组合物包括解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、韩国芽孢杆菌(Bacillus koreensis)、钻特省芽孢杆菌(Bacillus drentensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、溪苔芽孢杆菌属物种(Fontibacillus sp.)(panacisegetis)、小鳟鱼大洋芽孢杆菌(Oceanobacillusoncorhynchi)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)、氮还原类芽孢杆菌(Paenibacillus azoreducens)、千叶类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)、库氏类芽孢杆菌(Paenibacillus cookii)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)(解几丁质类芽孢杆菌(Paenibacillus chitinolyticus))、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)(P1XP2)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)和灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(在一些实例中，在本文中称为“DFC”聚生体)。在一个实施方案中，所述组合物包括于2019年5月16日在美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)保藏的分配的保藏号为PTA-125924的微生物物种的细胞。在其他实施方案中，公开的微生物聚生体或组合物包括、基本上由或由具有与SEQ ID NO：3-25具有至少95％的相同性(例如至少96％、97％、98％、99％或更高相同性)的16S rDNA序列的两个或更多个(例如5个或更多个，10个或更多个，15个或更多个，20个或更多个或全部)微生物组成。
还公开了包括所公开的微生物或聚生体(例如DFC聚生体)和一或多种运载体(例如干燥运载体或液体运载体)或一或多种种子的组合物。在一些实例中，所述运载体包括液体或干燥肥料、源自土壤的物质、有机物质、惰性材料、粉尘控制化学品或其两种或更多种的混合物。
在一些实施方案中，所述方法包括选择与运载体或种子共配制的微生物，包括鉴定包含一或多种吡啶二羧酸(DPA)合酶基因的微生物、表达一或多种DPA合酶蛋白的微生物和/或产生可检测量DPA的微生物；以及选择与运载体共配制的微生物。在一些实施方案中，所述方法还包括将选定的微生物与运载体或种子共配制。在一些实例中，所选微生物包括表25或26中包括的一或多种，包括但不限于表26中列出的所有。
在一些实例中，所述方法包括检测微生物中一或多种DPA合酶基因(例如DPA合酶亚基A(DpaA)基因和/或DPA合酶亚基B(DpaB)基因)或一或多种DpaA和/或DpaB蛋白。DpaA基因包括编码与图1中的任一氨基酸序列(例如SEQ ID NO：26-41)具有至少20％(例如至少60％)序列相同性的DpaA蛋白的核酸。DpaB基因包括编码与图2中的任一氨基酸序列(例如SEQ ID NO：42-56)具有至少20％(例如至少60％)序列相同性的DpaB蛋白的核酸。DpaA蛋白包括与图1中的任一氨基酸序列(例如SEQ ID NO：26-41)具有至少20％(例如至少60％)序列相同性的DpaA蛋白。DpaB蛋白包括与图2中的任一氨基酸序列(例如SEQ ID NO：42-56)具有至少20％(例如至少60％)序列相同性的DpaB蛋白。在进一步的实例中，所述方法包括检测微生物中一或多种Isf基因或蛋白质。Isf基因包括编码与图3中的任一氨基酸序列(例如SEQ ID NO：57-67)具有至少20％(例如至少60％)序列相同性的Isf蛋白的核酸。Isf蛋白包括与图3中的任一氨基酸序列(例如SEQ ID NO：57-67)具有至少20％(例如至少60％)序列相同性的Isf蛋白。在其他实例中，所述方法包括例如利用荧光测定检测微生物或含有微生物的培养基中的DPA。
在一些实施方案中，所述方法包括通过使液体或干燥形式的所选微生物(包括但不限于本文公开的微生物聚生体)与一或多种液体或干燥运载体接触来共配制一或多种所选微生物与运载体。在一些实例中，所述运载体包括液体或干燥肥料、源自土壤的物质、有机物质、惰性材料、粉尘控制化学品、或其两种或更多种的混合物。在其他实例中，所述方法包括用所述一或多种所选微生物(包括但不限于本文公开的微生物聚生体)处理种子。在一些实例中，所述方法进一步包括将所述一或多种所选微生物与不包含一或多种DPA合酶基因、不表达一或多种DPA合酶蛋白的一或多种微生物和/或不产生可检测量DPA的微生物和运载体或种子共配制。
根据参照附图进行的以下详细描述，本公开的前述和其他特征将变得更加明显。
附图简述
图1是来自所示细菌的DpaA蛋白序列的比对。使用Clustal Omega(clustal.org/omega)在默认设置下比对来自13个菌株的14个DpaA序列(SEQ ID NO：26-39)。然后使用60％的最小序列相同性阈值产生共有序列(“共有序列60(Consensus60)”；SEQ ID NO：40)。PRK08306(SEQ ID NO：41)是从NCBI CDD Conserved Domain Family数据库(ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi)中检索到的DpaA超家族的共有序列。
图2是来自所示细菌的DpaB蛋白序列的比对。使用Clustal Omega(clustal.org/omega)在默认设置下比对来自13个菌株的13个DpaB序列(SEQ ID NO：42-54)。然后使用60％的最小序列相同性阈值产生共有序列(“共有序列60”；SEQ ID NO：55)。PRK08305(SEQID NO：56)是从NCBI CDD Conserved Domain Family数据库(ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi)中检索到的DpaB超家族的共有序列。
图3显示了来自五个细菌的10个Isf蛋白序列(SEQ ID NO：57-66)和共有序列(SEQID NO：67)的比对。
图4是概述与所示运载体组合的细菌的存活的图。
图5是显示用珍珠岩或微生物聚生体(AMC1)浸渍的珍珠岩处理的植物中的32天黄瓜苗干重的图。
图6是显示用珍珠岩、DFC微生物聚生体浸渍的珍珠岩、膨润土和DFC微生物聚生体浸渍的膨润土处理的植物中的32天黄瓜苗干重的图。
图7是显示未处理植物、用液体DFC聚生体处理的植物和用DFC微生物聚生体浸渍的珍珠岩处理的植物中的32天黄瓜苗干重的图。
图8是显示来自DFC聚生体的与玉米和大豆种子组合的、并用杀虫剂/杀真菌剂处理的细菌的存活的图。
序列表
本文中或所附序列表中列出的任何核酸和氨基酸序列使用如37C.F.R.§1.822定义的核苷酸和氨基酸的标准字母缩写表示。在至少一些情况下，仅显示每个核酸序列的一条链，但应理解互补链通过任何提及所显示的链而被包括。
SEQ ID NO：1是草生链霉菌(Streptomyces pratensis)的共有16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：2是委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)的共有16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：3是坚强芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：4是氮还原类芽孢杆菌的共有16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：5是解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：6是弯曲芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：7是地衣芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：8是巨大芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：9是短小芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：10是韩国芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：11是钻特省芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：12是枯草芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：13是双酶梭菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：14是拜氏梭菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：15是巴氏梭菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：16是类干酪乳杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：17是溪苔芽孢杆菌属物种(panacisegetis)的部分16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：18是小鳟鱼大洋芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：19是灿烂类芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：20是千叶类芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：21是库氏类芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：22是类芽孢杆菌属物种(解几丁质类芽孢杆菌)的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：23是类芽孢杆菌属物种(P1XP2)的部分16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：24是假单胞菌属物种的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：25是灰色链霉菌的16S rDNA核酸序列。
SEQ ID NO：26-39是DpaA氨基酸序列。
SEQ ID NO：40-41是DpaA共有氨基酸序列。
SEQ ID NO：42-54是DpaB氨基酸序列。
SEQ ID NO：55-56是DpaB共有氨基酸序列。
SEQ ID NO：57-66是Isf氨基酸序列。
SEQ ID NO：67是Isf共有氨基酸序列。
发明详述
与形成孢子的微生物相比，不形成孢子的微生物通常在加工和田间施用期间更容易受到有害因素的影响。从大型微生物清单中鉴定形成孢子的微生物的选择过程可能既繁琐又耗时。这通常涉及湿实验室测试生存性(survivability)(例如，在与所选运载体共配制物中)，同时对生存性和最终产品延长保质期保证有限。
本文公开了一种新策略和方法，用于选择极有可能具有延长保质期的微生物，无论是作为独立的生物刺激剂制剂和/或与湿或干运载体或种子共配制，从而显著加快了新产品在现场测试的研制周期。如本文所述，就与运载体共配制时随时间的生存性而言，具有鉴定出的DPA基因或蛋白和/或产生DPA的形成孢子的细菌胜过无鉴定的DPA基因且无可检测的DPA产生的菌株。最后，描述了包括产生DPA的菌株的微生物聚生体。
I.术语
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于：Krebs et al,Lewin’s Genes XI，Jones and Bartlett Learning出版，2012(ISBN1449659853)；Kendrew等(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Publishers出版，1994(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers(ed.),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，Wiley,John&Sons,Inc.出版，2011(ISBN8126531789)；George P.Redei,Encyclopedic Dictionary of Genetics,Genomics,and Proteomics,2nd Edition,2003(ISBN:0-471-26821-6)。
提供以下术语和方法的解释以更好地描述本公开并指导本领域普通技术人员实践本公开。除非上下文另外明确指出，否则单数形式“a”，“an”和“the”是指一或多个。例如，术语“包含细胞”包括单数细胞或复数细胞，并且被认为等价于短语“包含至少一个细胞”。如本文所用，“包含”是指“包括”。因此，“包含A或B”是指“包括A，包括B或包括A和B”，而不排除其他元素。出于所有目的，本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。
尽管与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可以用于实践或测试所公开的技术，但是在下面描述了合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的，而无意于进行限制。
为了便于浏览本公开的各个实施方案，提供了对特定术语的以下解释：
运载体：可以用作微生物例如本文所述的微生物或微生物聚生体的递送媒介物(例如，在共配制物中或作为接种剂)的物质(在本文中也称为“农用运载体”)。所述运载体可以是液体或固体(干燥的)。示例性运载体包括液体或干燥肥料、源自土壤的物质(例如木炭、粘土、草皮)、有机物质(例如木屑、小麦/大豆/燕麦麸、堆肥)和惰性材料(例如珍珠岩、蛭石、膨润土、高岭土、硅酸盐、滑石)。在一些实例中，种子也可以被称为运载体。
接触：直接物理关联的放置，包括固体和/或液体形式。例如，接触可以在一或多种微生物(例如微生物聚生体中的微生物)和运载体或种子之间发生。接触也可能在一或多种微生物、微生物/运载体共配制物、或微生物/种子共配制物和土壤、植物和/或植物部分(例如叶子、茎、苗、根和/或种子)之间发生。
培养：在可同化的碳、氮和无机盐来源存在下，一或多种生物体或细胞的有意生长。在一个实例中，这样的生长可以在固体或半固体营养培养基中或在其中营养物溶解或悬浮的液体培养基中进行。在另一个实例中，培养可以在表面上或通过浸没培养进行。营养培养基可以由复杂的营养成分组成，或可以是化学确定的。
吡啶二羧酸(吡啶2,6-二羧酸；DPA)：具有以下结构的化合物
在大多数微生物中，DPA是通过吡啶二羧酸合酶将二氢吡啶二羧酸转化为DPA而产生的。DPA合酶具有两个亚基，亚基A(DpaA或spoVFA)和亚基B(DpaB或spoVFB)。本文提供了示例的DpaA和DpaB氨基酸序列(图1和2)。
尽管缺乏可识别的DpaA和DpaB基因，但某些细菌(例如某些梭菌)能够合成DPA。不受理论束缚，这些细菌可能利用结构相关蛋白，电子转移黄素蛋白(etfA)，其为黄素单核苷酸(FMN)氧化还原酶。认为EtfA通过将二氢吡啶二羧酸转化为吡啶二羧酸来催化生物合成途径中的最后一步(Orsbum等，Mol.Microbiol.75：178-186，2010)。或者，某些细菌可利用铁硫黄素蛋白(Isf)生产DPA。
异源：源自不同遗传来源或物种。例如，与细胞异源的核酸来源于表达它的细胞以外的生物体或物种。将异源核酸引入细菌细胞的方法包括例如用核酸转化，包括电穿孔，脂转染和粒子枪加速。
在使用术语异源的另一个实例中，可操作地连接至异源启动子的核酸来自不同于该启动子的生物体、物种或基因。在使用术语异源的其他实例中，将编码多肽或其部分的核酸与编码第二多肽或其部分的异源核酸可操作地连接，例如以形成非天然存在的融合蛋白。
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质或生物体)已经与其他生物组分(例如其他细胞、细胞碎片或其他蛋白质或核酸)实质性分离或从中纯化。已经“分离”的生物组分包括通过标准纯化方法纯化的那些组分。该术语还涵盖重组核酸、蛋白质或微生物，以及化学合成的核酸或肽。术语“分离的”(或“富集的”或“纯化的”)不需要绝对纯度，可以包括至少50％分离的，例如至少75％、80％、90％、95％、98％、99％或甚至100％分离的微生物或分子。
微生物：微生物，包括但不限于细菌、古细菌、真菌和藻类(例如微藻类)。在一些实例中，微生物是单细胞生物(例如细菌、蓝细菌、某些真菌或某些藻类)。在其他实例中，术语微生物包括多细胞生物，例如某些真菌或藻类(例如多细胞丝状真菌或多细胞藻类)。
微生物组合物：包括至少一种类型(或物种)的微生物的细胞(或至少一种类型的微生物的细胞群)的组合物(可以是固体、液体或至少部分是两者)。在一些实例中，微生物组合物包括在液体(如储存、培养或发酵培养基或液体肥料)中，例如在液体中作为悬浮物，的一或多种类型(物种)微生物(或一或多种微生物群)的细胞。在其他实例中，微生物组合物包括在固体或凝胶状介质(包括但不限于培养板)，或浆液或浆糊的表面上或包埋在其中的一或多种类型(物种)微生物(或一或多种微生物群)的细胞。在其他实例中，微生物组合物包括与干燥材料或种子结合，例如在干燥材料或种子表面上或浸渍在其中的一或多种类型(或物种)微生物(或一或多种微生物群)的细胞。
微生物聚生体：两种或更多种微生物种的细胞的混合物、群丛(association)或集聚(assemblage)，在某些情况下彼此物理接触。聚生体中的微生物可能通过直接物理接触或通过生化相互作用或两者相互影响。例如，聚生体中的微生物可以彼此交换营养物、代谢物或气体。因此，在一些实例中，聚生体中的至少一些微生物在代谢上是相互依赖的。这种相互依赖的相互作用可能会随着时间和培养条件的变化而在特征和程度上发生变化。
转导和转化：当病毒或载体将核酸转移到细胞中时，其“转导”细胞。当DNA通过将核酸掺入细胞基因组中或通过游离型复制被细胞复制时，细胞被转导到细胞中的核酸“转化”。如本文所用，术语转化涵盖可以将核酸分子引入这种细胞的所有技术，包括细菌缀合、用病毒载体转染、用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速导入裸DNA。
载体：可以被引入宿主细胞、从而产生转化的或转导的宿主细胞的核酸分子。重组DNA载体是包括重组DNA的载体。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一或多种选择性标记基因，用于引入异源核酸的克隆位点，启动子(例如用于表达可操作地连接的核酸)和/或本领域已知的其他遗传元件。载体包括质粒载体，包括用于在革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌细胞中表达的质粒。示例性载体包括用于大肠杆菌(E.coli)的那些。
生存力：细胞(例如微生物细胞)在适于生长或繁殖的合适条件下生长或繁殖的能力。在一些实例中，“存活”或“生存性”是指细胞(例如微生物)单独、在与其他微生物细胞的混合物中和/或与运载体或种子共配制时，在液态或干燥状态下储存一段时间后的生存力。
II.鉴定共配制物中具有生存力的微生物的方法
本文公开了鉴定与液体或固体运载体共配制时仍保持生存或存活的微生物的方法。微生物可以与运载体或种子单独共配制(例如，单个菌株或微生物物种与运载体或种子共配制)或者可以是与运载体或种子共配制的微生物聚生体或微生物混合物的一部分(例如两种或更多种微生物菌株或物种)。在其他实施方案中，该方法包括鉴定在聚生体(作为独立聚生体或与运载体或种子共配制)中保持生存或存活时间延长的微生物。
在一些实例中，用本文公开的方法鉴定的微生物，例如包含一或多种DPA合酶基因、表达一或多种DPA蛋白和/或产生可检测量的DPA的微生物(独立或共配制)，与不包含一或多种DPA合酶基因、不表达一或多种DPA合酶蛋白和/或不产生可检测量的DPA的微生物相比，具有改善的生存力。在一些实例中，用本文公开的方法鉴定的微生物与不包括一或多种DPA合酶基因、不表达一或多种DPA合酶蛋白和/或不产生可检测量的DPA的微生物相比，具有至少10％的增加的生存力(例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍或更多的增加的生存力)。增加的生存力可以包括在设定的时间段后有更多数量的活细胞和/或更长时间的生存力。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括鉴定微生物，所述微生物在其基因组中包括一或多种编码DPA合酶的基因、表达一或多种DPA合酶蛋白和/或产生可检测量的DPA。此类微生物被鉴定为单独地或与液体或固体运载体共配制时可以保持生存或存活的微生物(例如与不包含编码DPA合酶基因、不表达一或多种DPA合酶蛋白质和/或不产生可检测量的DPA的一或多种微生物相比)。所鉴定的微生物可以进一步选择用于下游用途，例如用于与液体或固体运载体或种子共配制。在一些实例中，所述微生物保持生存或存活(单独地或与运载体或种子共配制时)至少1天、至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少8个月、至少10个月、至少1年、至少2年或更长时间(例如至少1-28天、至少5-21天、至少2-6周、至少4-8周、至少2-6个月、至少3-9个月、至少4-10个月、至少6个月至1年、至少1-2年或更长)。
确定微生物的生存力或存活的方法包括检测培养物中微生物的生长。在一些实例中，将含有微生物细胞的制剂(呈液态或干态，或与运载体或种子共配制)接种在液体培养基中，在适合微生物生长的条件下孵育，并且在规定的时间后测量微生物的存在和/或量。在其他实例中，将含有微生物细胞的制剂(呈液态或干态，或与运载体或种子共配制)在含有固体或半固体培养基的平板上划线，在适合微生物生长的条件下孵育，并测量微生物的存在和/或量(例如菌落的存在、大小和/或数量)。在一些实例中，例如使用PCR方法鉴定微生物。实施例1提供了确定微生物细胞生存力和特性的示例性方法。
在进一步的实施方案中，所述方法包括选择一或多种微生物，和任选地将所述一或多种所选微生物与一或多种运载体或种子共配制，所述微生物包括一或多种DPA合酶基因、表达一或多种DPA合酶蛋白和/或产生可检测量的DPA。在一些实例中，所述方法包括制备一或多种所选微生物与一或多种运载体或种子的共配制物。所述方法包括使所述一或多种微生物与所述一或多种例如固体(干)或液体形式的运载体或种子接触。在一些实例中，使所述一或多种运载体或种子与微生物的混合物接触。所述混合物包括表达DPA合酶或产生DPA的微生物(例如使用本文所述的方法选择或产生的微生物，包括但不限于DFC)并且还可以包括不表达DPA合酶或不产生DPA的一或多种微生物。在一些实例中，使所述运载体与包括每种微生物约103-109个细胞/mL或更多(例如约1×103个细胞/mL、约5×103个细胞、约1×104细胞/mL、约5×104细胞/mL、约1×105细胞/mL、约5×105细胞/mL、约1×106细胞/mL、约5×106细胞/mL、约1×107细胞/mL、约5×107细胞/mL、约1×108细胞/mL、约5×108个细胞/mL、约1×109个细胞/mL、约5×109个细胞/mL或更多)的液体接触。
在一些实施方案中，将包括一或多种所选微生物(和任选地包括一或多种其他微生物)的液体与一或多种干燥运载体或种子接触。在一些实例中，所述包括微生物的液体是新鲜或冷冻细菌培养物或新鲜或冷冻细菌培养物的混合物。在其他实例中，所述包括微生物的液体是已经添加了冷冻干燥微生物的液体。使所述包括一或多种微生物的液体渗透入所述干燥的运载体或种子中。在一些实例中，使用一定量的所述包括一或多种微生物的液体，以使所述干燥的运载体或种子饱和，例如使微生物相对均匀地分布在整个运载体或种子中。但是，也可以使用非饱和量的液体。在非限制性实例中，该量为约35μL/g至6mL/g。在一些实例中，将经微生物浸渍的运载体或种子干燥(例如在室温或在约30-35℃)并在环境温度存储(例如在密闭或气密容器中)。
在其他实施方案中，将包括一或多种所选微生物(和任选地包括一或多种其他微生物)的液体与一或多种液体运载体混合。在一些实例中，所述包括微生物的液体是新鲜或冷冻细菌培养物或新鲜或冷冻细菌培养物的混合物。在其他实例中，所述包括微生物的液体是已经添加了冻干微生物的液体。可以将所述包含微生物的液体以任何选定的量与液体运载体混合，例如0.1％-90％(v/v)，例如0.5-1％、1-5％、2-10％、3-6％、4-8％、5-15％、8-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-75％或70-90％(v/v)。在一些实例中，微生物以约0.1％、约0.2％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％(v/v)与液体运载体混合。在一个非限制性实例中，将微生物混合物以0.5％(v/v)或1：180的比例添加到液体运载体中。在另一个非限制性实例中，将微生物混合物以90％(v/v)添加到浓缩的液体运载体(例如10X浓缩的液体运载体)中，以产生1X浓度的液体运载体。可以调节混合物中微生物细胞的量以达到所需的微生物细胞最终浓度，取决于将使用的稀释因子。微生物混合物在室温存储(例如在密闭或气密容器中)。
在一些实施方案中，将微生物的干燥制剂(例如冷冻干燥微生物)与干燥的运载体或种子一起共配制。在一些实例中，将冷冻干燥的微生物与干燥的运载体或种子混合(例如约40mg微生物/kg运载体或种子至约1g微生物/kg运载体或种子)。在该实施方案的一些实例中，将冷冻干燥的微生物添加至液体中，然后使其与干燥的运载体或种子接触。在其他实例中，将冷冻干燥的微生物添加到液体中，然后如上所述与干燥的运载体或种子接触。
A.检测DPA合酶核酸
在一些实施方案中，所述方法包括鉴定微生物或微生物群体中一或多种DPA合酶核酸分子(例如DNA、cDNA或mRNA)的存在。在一些实例中，所述方法包括在微生物基因组中检测一或多种DPA合酶基因(例如DpaA和/或DpaB)。在一些实例中，微生物包括DpaA和DpaB基因。示例性DPA合酶基因包括枯草芽孢杆菌DpaA(GenBank登录号NC_000964.3，1744367-1745260，以引用方式并入，如2018年6月3日在GenBank中的存在)和DpaB(GenBank登录号NC_000964.3，1745236-1745865，以引用方式并入，如2018年6月3日在GenBank中的存在)。在一些实例中、DpaA基因编码图1所示的蛋白或与图1所示蛋白具有至少20％序列相同性(例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高)的蛋白(例如SEQ ID NO：26-39)。在一些实例中，DpaB基因编码图2所示的蛋白或与图2所示蛋白具有至少20％序列相同性(例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高)的蛋白(例如SEQ ID NO：42-54)。在一些实例中，DpaA或DpaB蛋白分别具有在图1和图2中的“共有序列60”序列(分别为SEQ ID NO：40和55)中鉴定出的一或多个保守区域。
在其他实施方案中，所述方法包括鉴定与DPA合成的替代途径有关的一或多种核酸(例如DNA、mRNA或cDNA)的存在。在一些实例中，所述方法包括鉴定编码电子转移黄素蛋白(例如EtfA)或铁硫黄素蛋白(例如Isf)的一或多种核酸的存在或表达。电子转移黄素蛋白是由α和β亚基组成的异二聚体，并且是腺嘌呤核苷酸α水解酶超家族的一部分。示例性细菌EtfA核酸序列包括GenBank登录号CP000312.1(2508382-2509389)、NC_004578.1(2407768-2408697)、NC 009089.1(977905-978927)、NC_019023.1(1357738-1356809，互补)、NC_003030.1(2833696-2833268，互补)、NC_002971.4(1062557-1061613，互补)和NC_003063.2(650447-651376)，其各自通过引用并入本文，如2018年6月3日在GenBank中的存在。示例性细菌EtfA氨基酸序列包括ABG86939、NP_792007.1、YP_001087282.1、UR_006967336.1、NR_349315.1、NP_820116.1和NP_357016.2，其各自通过引用并入本文，如2018年6月3日在GenBank中的存在)。示例性的Isf核酸和蛋白序列分别包括GenBank登录号CP016318(3060700-3061308)和ARE63607(通过引用并入本文，如2018年6月3日在GenBank的存在)以及图3所示的那些(例如SEQ ID NO：57-66)。
在一些实例中，DPA合酶核酸(或EtfA或Isf核酸)可以通过微生物的序列分析(例如全基因组测序和/或使用DPA合酶特异性寡核苷酸测序)来鉴定。在一些实例中，使用存在于一或多个数据库中的序列进行序列分析，所述数据库包括GenBank(ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)、ENSEMBL(ensembl.org/index.html)、IMG(img.jgi.doe.gov)、MicrobesOnline(microbesonline.org)、SEED(theseed.org)或GOLD(gold.jgi-psf.gov)。在下面的实施例1中提供了鉴定DPA合酶基因的示例性方法。相似的方法可用于鉴定EtfA或Isf基因。
在一些实例中，在检测之前分离、扩增或分离和扩增来自微生物或微生物群体的核酸。在一些实例中，扩增和表达检测同时或几乎同时发生。在一些实例中，可以通过PCR(例如PCR、实时PCR、RT-PCR或定量RT-PCR)检测核酸表达。例如，可以通过使用市售试剂盒分离和扩增核酸。在一个实例中，可以在足以扩增此类产物的条件下，将核酸与允许扩增DpaA和/或DpaB(或EtfA或Isf)核酸的引物温育。可以检测得到的扩增子。
在另一个实例中，在高严格性条件下，将来自微生物或微生物群体的核酸与可以结合DpaA和/或DpaB(或EtfA或Isf)核酸分子(例如cDNA、基因组DNA或RNA(例如mRNA))的探针温育。然后可以检测所获得的杂交。在其他实例中，通过将获自一或多种微生物的分离的核酸分子应用于阵列来筛选微生物或微生物群体。在一个实例中，所述阵列包括与DpaA和/或DpaB(或EtfA或Isf)核酸互补的寡核苷酸。在一个实例中，将所述微生物核酸分子与包括与DpaA和/或DpaB(或EtfA或Isf)互补的寡核苷酸的阵列孵育足以允许分离的核酸分子和寡核苷酸探针杂交的时间，从而形成分离的核酸分子：寡核苷酸复合物。然后分析分离的核酸分子：寡核苷酸复合物以确定样品中是否存在核酸。
B.检测DPA合酶蛋白
作为替代方案或除了检测DPA合酶核酸之外，还可以使用诸如免疫测定(例如Western印迹、免疫组织化学、流式细胞术或ELISA)或质谱等方法检测蛋白质。在一些实例中，DpaA蛋白包括与图1所示蛋白具有至少20％序列相同性(例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更多)的蛋白质(例如SEQ ID NO：26-39)。在一些实例中，DpaB蛋白包括与图2所示蛋白具有至少20％序列相同性(例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更多)的蛋白质(例如SEQ ID NO：42-54)。在一些实例中，DpaA或DpaB蛋白分别具有在图1和图2中的“共有序列60”序列(分别为SEQ ID NO：40和55)中鉴定出的一或多个保守区域。在其他实例中，Isf蛋白包括与图3所示蛋白具有至少20％序列相同性(例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更多)的蛋白质(例如SEQ ID NO：57-66)。
在一些实例中，在检测之前纯化蛋白。在一个实例中，可以通过将微生物样品与特异性结合DpaA和/或DpaB(或Isf)的抗体孵育来检测DpaA和/或DpaB(或Isf)蛋白。抗体(“一抗”)可以包括可检测标记。例如，可以直接标记一抗，或者可以随后将样品与标记(例如用荧光标记)的二抗孵育。然后可以例如通过显微镜检查、ELISA、流式细胞术或分光光度法检测标记。在另一个实例中，通过Western印迹分析样品，以检测DpaA和/或DpaB蛋白的表达。DpaA、DpaB或Isf的抗体可以由本领域技术人员例如使用图1-3中的氨基酸序列来产生。
用于抗体或二抗的合适标记包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。合适酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适辅基复合物的非限制性实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白。非限制性示例性发光材料是鲁米诺；非限制性示例性磁性剂是钆，以及非限制性示例性放射性标记包括125I、131I、35S或3H。
C.检测DPA
在一些实施方案中，所述方法包括鉴定产生DPA(例如可检测水平的DPA)的微生物或微生物群。在一些实例中，所述方法包括检测至少1nM DPA(例如至少2nM，至少5nM，至少10nM，至少25nM，至少50nM，至少100nM，至少200nM，至少500nM DPA或更多)。在一个实例中，所述方法包括使用铽-DPA荧光测定检测DPA(参见例如Rosen，Anal.Chem.69：1082-1085，1997；Pellegrino等人，Anal.Chem.70：1755-1760，1998；Ammann等人，Int.J.Microbiol.2011：435281，2011)。简言之，使DPA与铽(III)接触形成与铽(III)相比具有荧光增强的复合物，从而检测和/或定量样品中的DPA。实施例1中描述了示例性的铽-DPA测定。
III.微生物和共配制物
本文公开了在其基因组中包括一或多种DPA合酶基因、表达一或多种DPA合酶蛋白和/或产生DPA的微生物。在一些实例中，将所述微生物修饰成在其基因组中包括一或多种DPA合酶基因、表达一或多种DPA合酶蛋白和/或产生DPA。还公开了微生物与一或多种运载体或种子的共配制物。
A.微生物
具有一或多种DPA合酶基因、表达一或多种DPA合酶蛋白和/或产生DPA的微生物包括但不限于解淀粉芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种(与科赫芽孢杆菌(B.kochii)、抱川芽孢杆菌(B.pocheonensis)和芽孢杆菌属物种(菌株R-27341)密切相关)、拜氏梭菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、千叶类芽孢杆菌、库氏类芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌(Virgibacillus halophilus)、氮还原类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌。在一些实例中，这些细菌包括在PCT公开号WO2018/045004中描述的细菌(通过引用整体并入本文)。另外的微生物包括表25和26中列出的那些。在一些实例中，这些微生物也具有孢子形成能力；然而，孢子形成能力和可鉴定的DPA合酶基因或DPA产生的存在并不完全一致(参见例如表6)。
在另外的实施方案中，公开了包括具有一或多种DPA合酶基因、表达一或多种DPA合酶蛋白和/或产生DPA的微生物的组合物，包括在本文中称为干配方聚生体(DryFormulation Consortium，DFC)的那些。DFC中的微生物包括但不限于解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、韩国芽孢杆菌、钻特省芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌、类干酪乳杆菌、溪苔芽孢杆菌属物种(panacisegetis)、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、氮还原类芽孢杆菌、千叶类芽孢杆菌、库氏类芽孢杆菌、类芽孢杆菌属物种(解几丁质类芽孢杆菌)、类芽孢杆菌属物种(P1XP2)、假单胞菌属物种和灰色链霉菌。在一个实施方案中，该组合物包括于2019年5月16日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)保藏号为PTA-125924的微生物物种的细胞。
本领域技术人员将认识到，并非总是能够鉴定微生物，特别是在物种或菌株水平上。在一些实例中，通过16S rDNA测序和全基因组测序，然后与公共数据库中的序列进行比较，来分析本文所述的组合物中的微生物。然而，由于序列数据库中信息的局限性(包括某些物种或菌株的信息很少或没有信息和/或命名法随时间的变化)，提供确定物种或菌株鉴定可能具有挑战性。因此，在一些实施方案中，通过与本文提供的16S rDNA序列(SEQ IDNO：3-25)的序列相同性来鉴定公开的组合物中包括的微生物物种。在一些实例中，公开的微生物聚生体或组合物包括、基本上组成为或组成为：两个或更多个(例如5个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多或全部)具有与SEQ ID NO：3-25具有至少95％相同性(例如至少96％、97％、98％、99％或更高)的16S rDNA序列的微生物。
具有一或多种DPA合酶基因、表达一或多种DPA合酶蛋白和/或产生可检测量的DPA的微生物还包括天然不具有一或多种DPA合酶基因、不表达一或多种DPA合酶蛋白和/或不产生DPA、但经过修饰后可以如此的微生物。在一些实例中，天然不具有一或多种DPA合酶基因、不表达一或多种DPA合酶蛋白和/或不产生DPA的微生物被修饰以表达一或多种异源DPA合酶基因例如DpaA和/或DpaB或一或多种Isf基因。示例性的DpaA和DpaB基因和蛋白以及Isf基因和蛋白在第II部分和图1-3中描述，包括SEQ ID NO：26-67)。
可以被修饰以表达一或多种异源DPA合酶基因的细菌包括但不限于固氮菌属(Azotobacter)(例如棕色固氮菌(Azotobacter Vinelandii))、梭菌属(Clostridium)(例如巴氏梭菌)、链霉菌属(Streptomyces)(例如灰色链霉菌、委内瑞拉链霉菌、草生链霉菌)、芽孢乳杆菌属物种(Sporolactobacillus spp.)(例如葡聚糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus dextrus))、芽孢八叠球菌属物种(Sporosarcina spp.)(例如嗜盐芽孢八叠球菌(Sporosarcina halophila))、脱硫肠状菌属物种(Desulfotomaculum spp.)(例如滴状脱硫肠状菌(Desulfotomaculum guttoideum))、拟诺卡氏菌属物种(Nocardiopsis Spp.)(例如Nocardiopsis sinuspersici)、原小单胞菌属物种(Promicromonospora spp.)(例如嗜肠原小单胞菌(Propromonomonospora enterophila)、Promicromonospora soli)、短小芽孢杆菌属物种(Brevibacillus spp.)(例如中孢短小芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus))、鲁梅尔芽孢杆菌属物种(Rummeliibacillusspp.)(例如Rummeliibacillus pycnus)、赖氨酸芽孢杆菌属物种(Lysinibacillus spp.)、土地芽孢杆菌属物种(Terribacillus spp.)(例如Terribacillus shanxiensis)、小单孢菌属物种(Micromonospora spp.)(例如Micromonospora fulva、Micromonosporapalomenea)、糖多孢菌属物种(Saccharopolyspora spp.)(例如刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinose)、Saccharopolyspora indica)和溪苔芽孢杆菌属物种(例如Fontibacillus panacisegetis)。在一些实例中，这些细菌包括PCT公开号WO 2018/045004中描述的那些(通过引用整体并入本文)。
在一些实例中，异源DpaA和/或DpaB基因置于启动子的控制之下。在一些实例中，所述启动子是组成型启动子，而在其他实例中，所述启动子是可诱导的(例如诱导型T7启动子)。在另外的实例中，所述启动子是阿拉伯糖诱导型启动子(例如pBAD系统)、lac启动子(直接IPTG/乳糖诱导)、trc启动子(直接IPTG/乳糖诱导)、四环素诱导型启动子或pho启动子(磷酸盐剥夺诱导的)。异源DpaA和/或DpaB基因可包括在载体中，例如可操作地连接至启动子。相似方法可用于EtfA或Isf基因。
多个基因(例如两个或更多个DPA合酶和/或Isf基因)可以同时在细菌中表达。为确保从单一途径充分和协调地产生多种酶，任选地将编码异源基因的每个核酸置于单一类型启动子例如可诱导的T7启动子的控制下。一个例子是DuetTM载体(Novozymes)，其设计有相容复制子和药物抗性基因，可在单个细胞中有效繁殖和维持四个质粒。这允许多达八种不同蛋白的共表达。在其他实例中，所述载体是pET载体，如pET21或pET28载体。pET和基于pET的载体是可商购的，例如可从Novagen(San Diego,CA)或Clontech(Mountain View,CA)获得。
在一个实例中，所述载体是pET21a或pET28a。在一些实例中，所述pET载体包括抗性标记(例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)和T7启动子。多克隆位点经操纵，使得可以从单个载体表达一个以上的基因(例如2、3、4或更多个)。在一些实例中，所述基因表达为多顺反子产物(例如双顺反子、三顺反子等产物)，具有产生的单个mRNA和多个多肽。在其他实例中，所述基因表达为多个单顺反子产物，每个基因产生单独的mRNA和多肽。可以根据要表达的基因和转化的宿主细胞选择合适的载体。
在一些实例中，质粒被染色体外引入并在宿主微生物内复制。在其他实例中，在引入质粒后，发生双重同源重组事件，并且将所述一或多种基因插入基因组。
可以用重组DNA转化细菌细胞。当宿主是细菌时，可以从指数生长期后收获的细胞中制备能够吸收DNA的感受态细胞，然后使用本领域熟知的方法通过CaCl2法处理。或者，可以使用MgCl2或RbCl。细菌也可以通过电穿孔、接合或转导来转化。
B.运载体和种子处理
本文公开了用于将一或多种微生物与一或多种运载体共配制的方法以及包括一或多种微生物和一或多种运载体的组合物。运载体可以是液体或固体(干燥的)。运载体包括液体或干燥肥料(例如包括尿素、钾碱、磷酸铵和/或硝酸铵等肥料)、土壤衍生物质(例如粘土、泥炭、煤、无机土壤)、有机物质(例如木炭、锯末、小麦/大豆/燕麦麸、堆肥、椰壳纤维)和/或惰性材料(例如珍珠岩、蛭石、膨润土、高岭土、硅酸盐、浮石、滑石)。示例性的运载体包括珍珠岩、生物炭(biochar)、干燥肥料(例如尿素、MOP或MAP)、液体肥料(例如UAN)和粉尘控制化学品(例如可从ArrMaz,FL,USA购得的那些)。其他示例性运载体包括蒙脱土、凹凸棒石、含水铝硅酸盐(Agsorb Products Group,IL,USA)、akadama(Eastern Leaf Inc,CA,USA)、Seramis Clay颗粒(Greens hydroponics,UK)、AquasmartTMPro(Aquasmart,TX,USA)、Pyro-Gro(Green Air products,OR,USA)、碎熔岩、粘土沙砾。
在一些实施方案中，与运载体的共配制物包括在WO 2018/045004中描述的22种微生物的聚生体(通过引用整体并入本文；在本文中称为AMC1)和一或多种本文所述的运载体。在其他实施方案中，与运载体的共配制物包括本文公开的23种微生物(例如表26中所列的微生物或ATCC保藏物PTA-125924)的聚生体和一或多种运载体。共配制物还包括一或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多种)微生物和本文所述的一或多种运载体。在一些实例中，共配制物包括至少一种微生物，其包括或表达一或多种DPA合酶和/或Isf基因(或产生DPA)和运载体。在其他实例中，共配制物包括至少一种包括或表达一或多种DPA合酶基因或产生DPA的微生物和至少一种不包括或不表达一或多种DPA合酶基因或不产生DPA的微生物以及运载体。共配制运载体和一或多种微生物的方法包括使所述一或多种运载体与所述一或多种微生物接触。在一些实例中，所述一或多种微生物为液体形式(例如在液体培养基中)或为固体或干燥形式。
本文还公开了用一或多种微生物处理种子的方法(例如将一或多种微生物与一或多个种子共配制)和包括一或多种微生物和一或多个种子的组合物。在这样的实施方案中，种子是微生物的“运载体”。在一些实施方案中，种子处理包括WO2018/045004中描述的22种微生物的聚生体(通过引用整体并入本文)和一或多个种子。在其他实施方案中，种子处理包括本文公开的23种微生物的聚生体(例如表26中列出的微生物或ATCC保藏物PTA-125924)和一或多个种子。在其他实例中，共配制物包括至少一种微生物以及种子，所述微生物包括或表达一或多种DPA合酶和/或Isf基因(或产生DPA)。在其他实例中，共配制物包括至少一种包括或表达一或多种DPA合酶基因或产生DPA的微生物和至少一种不包括或不表达一或多种DPA合酶基因或不产生DPA的微生物以及种子。可以用所述一或多种微生物处理的示例性种子包括但不限于玉米种子、向日葵种子、油菜种子、小麦种子、黄瓜种子、番茄种子、水稻种子和棉花种子。
在一些实例中，通过将微生物直接施用于种子(例如使种子与一或多种微生物接触)来制备经微生物处理的种子。在其他实例中，通过将微生物作为外涂层施用于预先用杀虫剂和/或杀真菌剂处理过的种子(例如使杀虫剂和/或杀真菌剂处理过的种子与一或多种微生物接触)来制备经微生物处理的种子。在另外的实例中，通过将微生物与杀虫剂和/或杀真菌剂(例如杀虫剂/杀真菌剂浆液)混合并将混合物施用于种子(例如使种子与杀虫剂和/或杀真菌剂与一或多种微生物的混合物接触)来制备经微生物处理的种子。可以与微生物结合使用的示例性杀虫剂和杀真菌剂包括但不限于甲霜灵、肟菌酯(trifloxystrobin)、种菌唑(ipconazole)、噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、咯菌腈(fludioxonil)、精甲霜灵(mefenoxam)、嘧菌酯(azoxystrobin)、噻苯达唑(thiabendazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、吡虫啉(imidacloprid)、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)和/或sedexane。在一些实例中，施加至种子的一或多种微生物为液体形式(例如在液体培养基中)或为固体或干燥形式。制备经处理的种子的方法包括但不限于在Seed Treatment:Oregon Pesticide Applicator Training Manual(Paulsrud等,Urbana,Illinois,2001)和实施例13中描述的方法。
IV.使用方法
单独或与一或多种液体或干燥运载体共配制的公开的微生物组合物可用于处理土壤、植物或植物部分(例如根、茎、叶、种子或苗)。在其他实例中，所公开的微生物组合物可以以处理过的种子的形式使用。
在一些实例中，用所公开的组合物和/或用所公开的组合物处理的运载体或种子的处理改善了植物生长，改善了胁迫耐受性，和/或增加了作物产量。在一些实施方案中，所述方法包括使土壤、植物(例如植物叶子、茎、根、苗或其他植物部分)或种子与本文公开的微生物组合物或共配制物接触。在其他实施方案中，所述方法包括种植用所公开的组合物处理的种子。所述方法还可包括在处理过的土壤中生长处理过的植物、植物部分或种子和/或栽培植物、植物部分或种子。
在一些实例中，计算待施用的单独或作为一或多种微生物和运载体或种子的共配制物的组合物的量(例如每英亩或公顷)并且将组合物用水(或在某些实例中为液态肥料)稀释至足以喷洒或灌溉要处理的区域(如果组合物为液体)的量。所述组合物可以在种子播种时以每英亩0.5-2升的比率(例如0.5L/英亩，1L/英亩，1.5L/英亩或2L/英亩)施用。所述组合物还可以在生长过程中以相同或不同的量一或多次施用于土壤(例如植物根附近)或植物。在其他实例中，所述组合物可以与稀释的除草剂、杀虫剂、农药或植物生长调节化学品混合。如果要施用的组合物是固体(例如干燥制剂)，则可以将固体直接施用到土壤、植物或植物部分上，或者可以在使用前将其悬浮或溶解在水(或其他液体)中。
在一些实例中，用公开的组合物处理土壤、种子、植物或植物部分可增加植物生长(例如整体植物大小、枝叶量、根数、根直径、根长、分蘖产量、果实产量、花粉产量和/或种子产量)至少约5％(例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍或更多)。在其他实例中，所公开的方法导致作物产量与未处理的农作物相比增加约10-75％(例如约20-60％或约30-50％)。其他农作物性能指标包括水果的质量、产率、淀粉或固体含量、糖含量或糖度、水果或可收获产品的保质期、可销售的产量或目标尺寸、水果或产品的质量、草分蘖(grass tillering)和对草坪的人流抵抗力、授粉和坐果、开花、开花数、花朵寿命、开花质量、生根和根量、农作物抗倒伏性、对热、干旱、寒冷的非生物应激耐受性和应激后恢复、对贫瘠土壤的适应性、光合作用和绿化水平以及植物健康。为了确定产品的功效，对照包括相同的农艺实践，但不添加微生物，并同时进行。
所公开的方法和组合物和/或共配制物可与任何作物结合使用(例如，用于直接作物处理或在种植之前或之后用于土壤处理)。示例性作物包括但不限于苜蓿、扁桃、香蕉、大麦、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、柑橘和果树作物、玉米、棉花、黄瓜、花卉和观赏植物、大蒜、葡萄、啤酒花、园艺植物、韭菜、瓜、油棕、洋葱、花生和豆类、菠萝、白杨、松树和木质树木(wood-bearing trees)、马铃薯、覆盆子、水稻、芝麻、高粱、大豆、南瓜、草莓、甘蔗、向日葵、番茄、草皮和牧草、西瓜、小麦和桉树。
实施例
提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制为所描述的特定特征或实施方案。
实施例1
材料和方法
微生物的分离和鉴定：除本文所述的四种额外的微生物外，所有微生物均源自Agrinos微生物收集中心(Agrinos microbial collection，AMC)并且先前在WO2018/045004中描述。如下所述分离这些额外的微生物。
从散土(N38°38’49.402”，W121°40”5.775”)分离草生链霉菌和委内瑞拉链霉菌。简言之，将土壤样品悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水-80溶液中，然后进行连续稀释并将其铺板到几种类型的半固体培养基上。在30℃孵育直至3天后，从具有甘露醇的固氮菌培养基琼脂(HIMEDIA#M372)板分离草生链霉菌和委内瑞拉链霉菌。将菌株重复划线到半固体培养基MP(见下文)上，直到等基因。
从预先与肥料(UAN32)以1：180的比例混合的A(Agrinos AS)样品中分离坚强芽孢杆菌。在室温下孵育三周后，将混合物的等分试样铺板在几种类型的半固体培养基上并于30℃孵育直至3天。从Pikovskaya培养基琼脂板(HIMEDIA#M520)收集坚强芽孢杆菌菌落。将该菌株反复划线到半固体培养基MP(见下文)上，直到等基因。
从A(Agrinos AS)的样品中分离氮还原类芽孢杆菌。氮还原类芽孢杆菌被分离为在1-10mM硫酸铵琼脂培养基(0.585g/L NaCl，0.075g/L KCl，0.147g/L CaCl2，0.049g/L MgSO4，1.32-0.132g/L(NH4)2SO4，0.054g/L KH2PO4，于pH 7.5的HEPES缓冲液中)上生长的群落。将该菌株反复划线到半固体培养基MP(见下文)上，直到等基因。
新描述的微生物的分类学分类：对于所有四个新描述的菌株，如下所述进行生物学纯分离物的全基因组测序。从头进行基因组组装通过层次基因组组装进程(Hierarchical Genome Assembly Process，HGAP，Pacific Biosciences，Menlo Park，CAUSA)进行。
分类鉴定主要使用16S核糖体RNA(rRNA)序列进行。首先使用RNAmmer(cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/)在从头基因组组装中鉴定16S rRNA序列。然后使用NCBIBLASTn成对比对、核糖体数据库计划(Ribosomal Database Project，RDP)朴素贝叶斯分类器(Wang等，Appl.Environ.Microbiol.73：5261-5267，2007)和Greengenes de novo系统发生树构建和秩映射(rank mapping)(DeSantis等Appl.Environ.Microbiol.72：5069-502，2006)对16S序列进行分类。然后使用三种方法的共识进行物种分配。
基于以上所述，如下进行微生物鉴定：
·草生链霉菌。使用16S序列，还进行了全基因组分类学分类。使用Prodigal(Hyatt等，BMC Bioinformatics，11：119，2010)鉴定蛋白质编码序列。该分类利用一组49个保守直系同源簇(Clusters of Orthologous Groups，COG)家族(Tatsuov等，Science 278：631-637，1997)来找到针对特定基因组的匹配对应序列集。然后将来自选定基因组的序列插入参考比对中，提取并连接最接近的邻居，并使用FastTree2(近似最大似然方法；Price等，PLoS One 5：e9490，2010)从中绘制树。这种严格分类方法选择了草生链霉菌作为最合适的参考物种。可从NCBI RefSeq下载草生链霉菌ATCC 33331的参考基因组，并使用MUMmer
(mummer.sourceforge.net/)将其与获得的全基因组序列进行比对。比对揭示了广泛的整体一致并证实了两者在全基因组范围内密切相关。共有的16S序列如SEQ ID NO：1所示。
·委内瑞拉链霉菌。所有分析的结果都强烈支持将这种分离物鉴定为委内瑞拉链霉菌。共有的16S序列如SEQ ID NO：2所示。
·坚强芽孢杆菌。所有分析的结果都强烈支持将这种分离物鉴定为坚强芽孢杆菌。
共有的16S序列如SEQ ID NO：3所示。
·氮还原类芽孢杆菌。所有分析的结果都强烈支持将这种分离物鉴定为氮还原类芽孢杆菌。共有的16S序列如SEQ ID NO：4所示。
微生物代谢活性潜能的鉴定。使用如WO 2018/045004(其通过引用整体并入本文)中所述的实验室测定法评估所有潜在的微生物代谢活性。为了确定微生物是否在代谢过程中将含硫化合物还原为硫化物，根据制造商的建议(bioMerieux，Inc.，Durham,NC USA)使用了bioMerieux的鉴定产品。表1列出了新鉴定的微生物的关键代谢活性分析结果。
表1：新微生物分离物的代谢活性
D：反硝化，N：固氮，P：磷酸盐，Ca：钙，IAA：产生吲哚-3-乙酸，M：苹果酸同化，H2S：产生硫化氢
评估细菌中吡啶二羧酸(DPA)产生：基本上按照Rosen(Anal.Chem.69：1082-1085，1997)、Pellegrino等(Anal.Chem.70:1755-1760,1998)和Ammann等(Int.J.Microbiol.2011:435281,2011)所述，用铽-DPA荧光测定进行对感兴趣细菌菌株中DPA产生的评估。简言之，每种等基因菌株在需氧或厌氧的琼脂培养基上生长(参见表2)。好氧菌株在30℃生长长达3天，而厌氧菌株在BD GasPak EZ容器系统(Becton，Dickinson andCompany，Franklin Lakes，NJ USA)中使用Pack-Anaero产生厌氧气体的小袋(MitsubishiGas Chemical Company,Inc.,Tokyo,Japan)在35℃生长长达3天。对于DPA测定，从平板上生长的菌落中提取约5μL细菌并重悬于10mL乙酸钠缓冲液(0.2M，pH 5)中。将悬浮液在121℃、15psig高压灭菌15分钟，在室温下冷却约30分钟。随后将等体积的高压灭菌的悬浮液和30μM氯化铽(III)六水合物(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO USA)混合。然后使用Cytation 5Imaging Reader(BioTek，Winooski，VT USA)测量荧光(272nm激发，545nm发射)。
在半固体培养基上培养本研究中使用的细菌：作为母细胞库在-80℃储存的等基因细菌菌株在琼脂培养基上生长(表2)，直到观察到形成独特菌落。简言之，需氧菌株在30℃生长长达3天，而厌氧菌株在BD GasPak EZ容器系统(Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ USA)中使用Pack-Anaero产生厌氧气体的小袋(Mitsubishi GasChemical Company,Inc.,Tokyo,Japan)在35℃生长长达3天。
表2用于培养微生物的琼脂培养基
*NA：营养琼脂(BD#213000)；YPD：酵母蛋白胨右旋糖(BD#242720)；BHI：脑心浸液琼脂(Teknova,CA,USA)；RhX：111根瘤菌X培养基(ATCC)；AMAS：固氮菌培养基琼脂(HIMEDIA#M372)；RCM：强化梭菌培养基(BD#2l808l)；MRS：乳杆菌MRS(BD#288210)；R2A：R2A琼脂(HIMEDIA#SMEB962)，MP：糖蜜培养基琼脂(2％w/v糖蜜，0.15g/L MgSO4，0.1g/L CaCl2，0.12g/L FeSO4，1g/L K2SO4、5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，0.1g/L NaMoO4，0.01g/L MnCl2，0.03g/L KH2PO4，0.03g/L Na2HPO4和15g/L琼脂)
在液体培养基中培养本研究中使用的各个细菌菌株：将琼脂生长菌株的选定菌落接种在适当的无菌液体培养基中(表3)并孵育长达3天。将需氧菌株在摇动(125-175rpm)下于30℃培养，而将厌氧菌株在35℃的密封血清瓶或Hungate管中在氮气下培养，无搅拌。当需要时，通过混合等体积的单独生长的菌株来产生微生物聚生体。表4总结了典型结果，说明每菌株每毫升的细胞数(见下文)。如WO 2018/045004所述，微生物含量通过液滴数字PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)使用Supermix For Probes(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)测定。
表3：用于培养微生物的液体培养基
*YPD：酵母蛋白胨右旋糖(BD#242720)；YPDS：酵母蛋白胨右旋糖(BD#242720)，补充0.5g/L NaCl；BHI：脑心灌注(Teknova,CA,USA)；RCM：强化梭菌培养基(BD#2l808l)；BHIS：脑心灌注(Teknova,CA,USA)补充45g/L NaCl；RCM：强化梭菌培养基(BD#2l808l)；MP：糖蜜培养基(2％w/v糖蜜，0.15g/L MgSO4，0.1g/L CaCl2，0.12g/L FeSO4，1g/LK2SO4，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，0.1g/L NaMoO4，0.01g/L MnCl2，0.03g/L KH2PO4和0.03g/L Na2HPO4)；YEME：酵母提取物-麦芽提取物培养基(3g/L酵母提取物，5g/L细菌蛋白胨)；3g/L麦芽提取物；10g/L葡萄糖；340g/L蔗糖5mM MgCl2)；NB：营养培养基(BD#234000)
表4：通过混合单独培养的菌株，每mL最终液体制剂中细菌细胞的典型数目。
通过发酵产生共培养的微生物聚生体：需氧和/或厌氧细菌都在含有2％糖蜜的培养基中培养，该培养基中添加了必需元素如磷酸盐、钠、钾和氯化物(以市售磷酸盐缓冲液的形式)以及氨基酸、氮和食品级乳清粉(0.1％w/v)形式的肽/蛋白质和酶促生产的非-GMO大豆提取物(0.25％w/v；Ferti-Nitro Plus Plant N；Ferti-Organic，Brownsville，TXUSA)。氯化钠浓度范围为0-4％w/v。将来自上述表4的菌株(在本文中称为AMC1)接种到具有1.5L工作体积的2L DASGIP生物反应器(Eppendorf North America Hauppauge,NY)中，每个菌株的最后接种OD600的范围为6.67E-05至6.67E-04。氢氧化铵和磷酸分别用作碱溶液和酸溶液，以将pH值维持在5.5至6.9。将温度控制在28℃至35℃。厌氧发酵连续通入N2气体以维持厌氧环境，而在发酵过程中(通常长达3天)，在有氧发酵中使用鼓风作为微生物的氧气来源。对于一些实验，在发酵之后，合并包含不同菌株的批次以产生22种菌株的完整细菌混合物。表5总结了典型结果，说明每菌株每毫升的细胞数(见下文)。如WO 2018/045004所述，使用Supermix For Probes(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)通过液滴数字PCR(ddPCR)测定发酵物中的微生物含量。
表5.通过共培养的每毫升最终液体制剂中典型的细菌细胞数
冻干微生物聚生体的生产。在一些实验中，在与农用运载体共配制实验之前，将产生的微生物聚生体冷冻干燥。通过合并等体积的单独培养的细菌或使用共培养的发酵物来产生聚生体(如上所述)。基本上如WO 2018/045004所述进行冷冻干燥。简言之，冷冻干燥的微生物制剂通过将液体微生物聚生体与甘露醇/冻干保护剂溶液(OPS DiagnosticsLebanon，NJ，USA)按照制造商的建议混合制备，并将微生物悬液等分到冻干小瓶中(OPSDiagnostics，Lebanon，NJ，USA)。在-80℃下60分钟后，将混合物置于FreeZone 6冷冻干燥系统(Labconco，Kansas City，MO)中，施加真空，并使样品中的水升华。样品需要保存在4℃直到需要。在某些实验中，通过向微生物培养物中添加以下化学品来制备冻干保护剂溶液，最终浓度为0.75g/L胰蛋白酶大豆肉汤(Becton，Dickinson and Company，USA)，10g/L蔗糖(Sigma Aldrich，USA)和5g/L脱脂乳(Carnation，NestléS.A，CH)。
微生物与农用运载体的共配制：将如上所述产生的液体微生物聚生体(由共培养物产生或单独生长然后合并)或各个细菌菌株浸渍到农用运载体如珍珠岩、(美Azomite，UT，USA)、浮石、磷酸二氢铵肥(MAP；Mosaic，MN，USA)、钾肥氯化物(MOP；Mosaic，MN，USA)和生物炭(CoolCool Planet Energy system,CO,USA)上。根据运载体的保水特性，使用了不同体积的微生物聚生体以使运载体从低至35μL/克直到6mL/克饱和。然后将微生物/农用运载体混合物在30℃-35℃干燥过夜，然后将其存储在气密容器中，以进行进一步的保质期微生物生存性研究和种植测定。
在与液态农用化学品(例如尿素和硝酸铵水溶液(UAN32；TGI,CA,USA)或肥料粉尘控制剂(DUSTROL；ArrMaz FL,USA)共配制的情况下，将如上所述产生的液体微生物聚生体在储存和微生物生存性分析之前，以各种比例混合(在以下实施例中描述)。所有工作均在卫生条件下进行，以使污染最小。
在某些情况下，使用了冻干细菌聚生体，以使培养液对运载体化学性质的影响最小化。适当地在实施例中描述细节。
用于DPA合酶生产的细菌基因组分析
微生物基因组DNA提取：从优化的液体肉汤和培养条件中生长和收获不同物种的细菌细胞。使用PowerSoft DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories，Inc，Carlsbad，CA USA)进行小规模基因组DNA提取。对于大规模基因组DNA提取，按照制造商推荐的方法使用GenElute细菌基因组DNA试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO USA)或Qiagen GenomicDNA Buffer Set和Genomic-tip 500/G(Qiagen，Hilden，Germany)。随后用等体积的异丙醇沉淀所得的基因组DNA，用70％乙醇洗涤，风干，并重悬于TE缓冲液中。
全基因组测序(WGS)：使用PacBio RSII系统(Pacific Biosciences，Menlo Park，CA USA)按照制造商推荐的序列库制备和测序方法，对生物纯分离株进行全基因组测序。从微生物分离物中平均产生了73,000个读段，平均长度为24kb，然后通过层次基因组组装进程(HGAP，Pacific Biosciences，Menlo Park，CA USA)进行从头基因组装配。
在选定菌株中鉴定DPA合酶编码序列：初始生物信息学分析包括选择杆菌类成员；芽孢杆菌(巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种和弯曲芽孢杆菌)，以及乳杆菌(德氏乳杆菌)。首先，使用先前获得的全基因组序列，使用BPGA-Version-1.3(iicb.res.in/bpga/index.html)进行细菌泛基因组分析以估计基因组多样性并确定核心(保守)、辅助(可有可无)和唯一(菌株特异性)基因库。然后搜索辅助基因集合中的任何吡啶二羧酸合酶亚基A(DpaA)。然后使用自定义的Bash脚本(FreeSoftware Foundation，2007)对表1中的菌株进行DpaA和DpaB完整搜索。
简言之，蛋白质编码基因在两个阶段被注释。使用Prodigal(原核动力学编程基因发现算法(Hyatt等，BMC Bioinformatics 11：119，2010))来鉴定候选基因的坐标，但是没有描述推定的基因产物。然后将这些候选基因与大型数据库进行分层比较，从较小的可信赖数据库开始，移至中等大小的结构域特异的数据库，最后到蛋白质家族的精选模型。默认情况下，以下系列数据库使用的e值阈值为10-6：
1.UniProt中所有具有真实蛋白质或转录本证据且不是片段的细菌蛋白质。BLAST+用于搜索。
2.RefSeq中来自特定属的最终细菌基因组的所有蛋白质。BLAST+用于搜索。
3.一系列隐马尔可夫模型谱数据库，包括Pfam(Punta等，2012)和TIGRFAM(Haft等，2013)。这使用HMMER 3.1软件包中的hmmscan(Eddy，2011)进行。
4.如果找不到匹配，请标记为“假设蛋白”。
然后将这些数据与孢子形成能力和干制剂生存性一起制表(参见表6)以建立DPA合酶与生存力之间的相关性。然后使用Clustal Omega(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行DpaA和DpaB基因的比对，并使用Seaview 4(Gouy等Mol.Biol.Evol.27:221-224,2010)计算氨基酸组成和频率统计。然后使用软件包Biostrings和seqinr将DpaA和DpaB氨基酸比对用于计算R中的共有序列和概率矩阵(Pages等,2016；Charif andLobry,Structural Approaches to Sequence Evolution,pp.207-232,2007；R CoreTeam,2016)。
表6.能够形成孢子并产生DPA的菌株的摘要
细菌菌株 形成孢子能力 DPA合酶基因的存在 DPA产生
巴氏醋杆菌 N NF ND
棕色固氮菌 Y NF ND
解淀粉芽孢杆菌 Y Y Y
弯曲芽孢杆菌 Y Y Y
地衣芽孢杆菌 Y Y Y
巨大芽孢杆菌 Y Y Y
枯草芽孢杆菌 Y Y Y
芽孢杆菌属物种 Y Y Y
拜氏梭菌 Y NF Y
巴氏梭菌 Y NF ND
布氏乳杆菌 N NF ND
干酪乳杆菌/类干酪乳杆菌 N NF ND
德氏乳杆菌 N NF ND
酒乳杆菌 N NF ND
小鳟鱼大洋芽孢杆菌 Y Y ND
千叶类芽孢杆菌 Y Y Y
库氏类芽孢杆菌 Y Y Y
灿烂类芽孢杆菌 Y Y Y
恶臭假单胞菌 N NF ND
假单胞菌属物种 N NF ND
灰色链霉菌 Y NF ND
嗜盐枝芽孢杆菌 Y Y ND
委内瑞拉链霉菌 Y NF ND
草生链霉菌 Y NF ND
氮还原类芽孢杆菌 Y Y Y
坚强芽孢杆菌 Y Y Y
Y：是；N：否；NF：未发现；ND：未检测到
在菌群生存性测定中的细菌
液体共配制物样品制备：对于每个保质期时间点，在无菌蛋白胨水中将1mL的共配制物(农用化学品/细菌聚生体)从10-1连续稀释到10-5。
干制剂样品制备：对于每个保质期时间点，将0.03-1g干制剂(农用运载体/细菌聚生体)悬浮在最多3mL的培养液例如蛋白胨水或其他合适的培养基中并在室温温育最多1小时。在某些情况下，使用水浴超声仪(VWR超声清洁器)轻柔超声(35khz)以从干燥基质中释放细菌。随后将悬浮液在无菌蛋白胨水或其他类型的培养液中从10-1连续稀释到10-5。在其他情况下，将干物质直接添加到液体培养基中进行生长。
生存性测定：接受过处理的细菌菌株有繁殖机会。为了最大化每个菌株在聚生体中的生长潜力，使用了几种不同的琼脂培养基，例如chA(半干甲壳质，5g/L；K2HPO4，0.7g/L；KH2PO4，0.3g/L；MgSO4.5H2O，0.5g/L；FeSO4.7H2O，0.01g/L；ZnSO4，0.001g/L；MnCl2，0.001g/L和琼脂，15g/L)、RCM、NA、MP、YPD、RhX、AMAS和/或BHIS。在某些情况下，将上面产生的每种系列稀释液一式两份地铺板接种在一或多种琼脂培养基上。在其他情况下，将上面生产的干物质一式六份悬浮在一或多种液体培养基中。对于板培养，将板在静态培养箱中孵育，一组在30℃有氧设置，另一组在35℃厌氧设置，共3天。对于液体培养，将试管在30℃有氧振荡或在35℃厌氧静态孵育7天。在处理后存活的细菌通过形成菌落或在液体培养物中繁殖而生长，然后对该生长进行采样并使用液滴数字PCR(ddPCR)进行鉴定。
使用DNeasy PowerLyzer PowerSoil试剂盒(Qiagen，Inc.，Germantown，MD USA)，根据制造商的建议，从收获的细胞中提取基因组DNA。然后使用Quantas荧光计和QuantiFluor dsDNA(Promega Corporation，Madison，WI USA)对DNA进行定量并使用菌株特异性探针结合ddPCR对其进行鉴定和定量(Dreo et al,Anal.Bioanal.Chem.406:6513-6528,2014；Yin,et al,Journal of Microbiological Methods 65:21-31,2006)。简言之，通过组合DNA样品、引物和探针与Bio-Rad的ddPCR Supermix for Probes，按照制造商的建议来制备ddPCR反应(使用WO 2018/045004(通过引用并入本文)先前描述的方法，使用来自16S基因的独特序列和/或从WGS基因组装物鉴定的独特编码基因序列进行设计)。然后根据制造商的建议使用QX200TM液滴发生器或AutoDGTM仪器产生液滴。使用Eppendorf关联梯度并使用Bio-Rad的ddPCR Supermix for Probes的推荐热循环条件进行聚合酶链反应(PCR)。按照PCR方案，使用QX200液滴读取器读取反应。最后，用QuantaSoftTM软件分析浓度。
在与液体或干燥的农用运载体共配制后鉴定单个菌株生存性的情况下，使用最适合给定菌株的琼脂培养基进行简单铺板，如表2所述。
实施例2
在选定的细菌菌株中鉴定DPA合酶编码序列
吡啶二羧酸合酶亚基A(DpaA)：来自细菌菌株的DpaA的氨基酸比对表明它是趋异化的，仅有28.4％的保守氨基酸。结果总结在表7-9和图1中。与大多数其他菌株相比，小鳟鱼大洋芽孢杆菌似乎更趋异化。通过计算与定义为匹配位点的标准(denominator)的相同性百分比，使用BLOSUM62，小鳟鱼大洋芽孢杆菌与共有序列具有58％的百分比相同性。另外，对于大多数分析菌株，这些氨基酸变化似乎位于保守区域。DpaA的氨基酸比对结果还表明，嗜盐枝芽孢杆菌具有该基因的两个拷贝，可能是由于该基因复制所致。第一个拷贝具有高度差异性(使用上述相同的方法，与共有序列具有51％的相同性)，第二个拷贝除明显的氨基酸变化外，还被截短29个氨基酸。此外，虽然DpaA的所有其他实例都与DpaB作为操纵子的一部分相继定位，但在嗜盐枝芽孢杆菌中，这两个基因被539个其他基因隔开。
表7.DpaA基因拷贝数
表8.DpaA基因的序列多样性
所选位点: 303 100.0％
全部(无缺口，无X): 262 86.5％
可变: 208 68.6％
有信息: 176 58.1％
缺口或X: 41 13.5％
相同: 54 17.8％
保守，不相同: 32 10.6％
总的保守数量: 86 28.4％
表9.DpaA基因的氨基酸组成
吡啶二羧酸合酶B亚基(DpaB)：来自细菌菌株的DpaB的氨基酸比对揭示了其比DpaA更为保守，具有45.5％的保守氨基酸。结果总结在表10-12和图2中。未检测到复制或重大截短。如上所述，DpaB的所有拷贝都与DpaA作为操纵子的一部分相继定位，除了嗜盐枝芽孢杆菌，其DpaB位于距DpaA的539个基因上游。
表10.DpaB基因拷贝数
具有DPA基因的菌株 DpaB基因拷贝数
巨大芽孢杆菌 1
枯草芽孢杆菌 1
库氏类芽孢杆菌 1
地衣芽孢杆菌 1
灿烂类芽孢杆菌 1
小鳟鱼大洋芽孢杆菌 1
解淀粉芽孢杆菌 1
芽孢杆菌属物种 1
千叶类芽孢杆菌 1
弯曲芽孢杆菌 1
坚强芽孢杆菌 1
嗜盐枝芽孢杆菌 1
氮还原类芽孢杆菌 1
表11.DpaB序列多样性
所选位点: 202 100.0％
全部(无缺口，无X): 196 97.0％
可变: 133 65.8％
有信息: 104 51.5％
缺口或X: 6 3.0％
相同: 63 31.2％
保守，不相同: 29 14.4％
总的保守数量: 92 45.5％
表12.DpaB基因的氨基酸组成
DPA的产生(在上述测定中)与DPA基因的存在之间的相关性：如表6所示，通过铽-DPA荧光测定将拜氏梭菌检测为DPA产生菌株，但在其基因组中DpaA或DpaB均无法被识别。我们发现拜氏梭菌拥有与EtfA在结构上相关的铁硫黄素蛋白(Isf)，其以前与DPA生产有关(Orsburn等,Mol.Microbiol.75:178-186,2010)。在拜氏梭菌基因组中检测到六个拷贝的铁硫黄素蛋白。然后将这些序列与来自如下四种不同细菌的isf序列进行比对：闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)，詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)，嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)和艰难消化梭菌(Peptoclostridiumdifficile)(图3)。巴氏梭菌中不存在此Isf蛋白，在巴氏梭菌中未检测到DPA的产生。实施例12中提供了对Isf在DPA生产中的作用的其他支持。
实施例3
运载体上所选单株的存活
在用单个菌株浸渍的中进行了细菌生存性的评估。根据它们在实验室测定中产生DPA的能力和/或DPA基因鉴定的结果选择四种菌株。将浸渍过的材料干燥保存5天，然后评估细菌生存性。结果如表13所示。100％的具有可检测的DPA产生(2/2)的菌株保持存活5天。对于不可检测到DPA产生的菌株，50％(1/2株)存活5天。
表13.与干燥共配制的单个细菌存活与DPA产生
微生物 DPA产生 5天存活性
委内瑞拉链霉菌 0 1
草生链霉菌 0 0
坚强芽孢杆菌 1 1
氮还原类芽孢杆菌 1 1
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测到DPA产生呈阳性的菌株。
在第二个实验中，菌株数量增加了。浸渍后，1个月内对中细菌生存性进行了评估。简言之，将浸入各个等基因菌株，干燥，并在第3、7、14、21和28天取样以进行细菌生存力分析。结果如表14所示，表明100％(4/4)的具有鉴定出DPA基因并产生DPA的细菌保持存活1个月。对于没有鉴定出DPA基因且不可检测到DPA产生的菌株，40％(2/5菌株)存活1个月。
表14.与干共配制的单个细菌的存活与DPA基因鉴定和DPA产生
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测到DPA生产呈阳性的那些菌株。
然后测试了第二种农用运载体(珍珠岩)。如前所述使用的情况，在1个月内进行了微生物生存性评估。结果如表15所示，表明100％(4/4)的具有鉴定出DPA基因并产生DPA的细菌保持存活1个月。对于没有检测到DPA基因且不可检测到DPA产生的菌株，60％(3/5菌株)保持存活1个月。
表15.与干珍珠岩共配制的单个细菌的存活与DPA基因鉴定和DPA产生
微生物 DPA基因 DPA产生 3天 7天 14天 21天 28天
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1 1 1 1
恶臭类芽孢杆菌 0 0 1 1 1 1 0
假单胞菌属物种 0 0 1 1 1 1 0
灰色链霉菌 0 0 1 1 1 1 0
委内瑞拉链霉菌 0 0 0 0 0 0 0
草生链霉菌 0 0 0 0 0 0 0
坚强芽孢杆菌 1 1 1 1 1 1 1
氮还原类芽孢杆菌 1 1 1 1 1 1 1
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。
实施例4
微生物聚生体在运载体上的存活
在以下实验中，如上所述使22种细菌单独生长，然后混合以产生聚生体。球状形式的干用0.23-0.4mL的聚生体浸渍(以保持团粒的完整性)，干燥并保存两周，然后使用用于测定来自聚生体的微生物生存力的测定法(实施例1)分析哪些细菌存活。进行了两项独立试验，结果总结在表16。我们观察到，83％和92％的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌菌株在上浸渍后2周保持存活。在两个试验中似乎没有显示出一致生存力的菌株是小鳟鱼大洋芽孢杆菌。如上所述，小鳟鱼大洋芽孢杆菌DPA合酶亚基A似乎比大多数其他检测的菌株更趋异化，与使用BLOSUM62的共有序列具有58％百分比相同性。对于没有鉴定出DPA基因且没有可检测DPA产生的菌株，在相同时期内保持存活的细菌的结果在60％到70％之间变化。两项试验之间的重复性低，可能是由于浸渍时这组微生物的代谢状态不同。
表16.与干燥共配制的各个细菌的存活
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。
类似于上述使用的实验，使22种细菌单独生长，然后混合以产生聚生体。将珍珠岩用2-6mL的聚生体浸渍，干燥并保存2周，然后使用用于测定来自聚生体的微生物生存力的测定法(实施例1)分析哪些细菌存活。进行了两项独立试验，结果总结在表17。我们观察到，58％和100％的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌菌株在珍珠岩上浸渍后2周保持存活。对于没有鉴定出DPA基因且没有可检测DPA产生的菌株，在相同时期内存活的细菌的结果在60％到80％之间变化。与实验相比，即使使用不同的浸渍基材，具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌也显示出良好的重现性。在我们的测定中，它们也优于那些没有鉴定出DPA基因或没有可检测DPA产生的细菌。
表17.与珍珠岩共配制的聚生体中各体细菌的存活
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。
实施例4
与液体粉尘控制剂共配制的微生物聚生体的存活
在下面的实验中，使用如上所述的培养基在半固体琼脂平板上生长感兴趣的细菌菌株(见表2)。通过将从琼脂平板上刮下的1μL菌环量悬浮在200μL无菌蛋白胨水中、然后以5％v/v的比例与粉尘控制化学品混合来生成粉尘控制化学品/细菌共配制物。然后，通过用具有细菌/农用化学混合物接种新鲜培养基(表3)并评估生长迹象来确定每种菌株在共配制物中的生存性。
与MDC-200共配制的细菌的生存性：在一个月的时间内对与粉尘控制剂MDC-200(ArrMaz，FL，USA)共配制后的细菌生存力进行了评估。结果如表18所示。我们观察到92％(11/12)的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活1个月。对于没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，0％(0/10株)保持存活1个月。
与3275共配制的细菌的生存性：在1个月的时间内对与3275(ArrMaz，FL，USA)共配制后的细菌生存力进行了评估。结果如表18所示。我们观察到100％(12/12)的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活1个月。对于没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，0％(0/10株)保持存活1个月。
与3133共配制的细菌的生存性：在1个月的时间内对与3133(ArrMaz，FL，USA)共配制后的细菌生存力进行了评估。结果如表18所示。我们观察到100％(12/12)具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活1个月。对于没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，0％(0/10株)保持存活1个月。
与3139共配制的细菌的生存性：在1个月的时间内对与3139(ArrMaz，FL，USA)共配制后的细菌生存力进行了评估。结果如表18所示。我们观察到92％(11/12)具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活1个月。对于没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，0％(0/10株)保持存活1个月。
与3001共配制的细菌的生存性：在1个月的时间内对与3001(ArrMaz，FL，USA)共配制的细菌的生存力进行了评估。结果如表18所示。我们观察到33％(4/12)具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活1个月。没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，0％(0/10株)保持存活1个月。该实验中存活降低可能是由于微生物(无论它们是否产生DPA)与3001的一或多种组分不相容所致。
与3010共配制的细菌的生存性：在1个月的时间内对与3010(ArrMaz，FL，USA)共配制的细菌的生存力进行了评估。结果如表18所示。我们观察到75％(9/12)具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活1个月。对于没有鉴定出DPA基因和不可检测DPA产生的菌株，20％(2/10株)保持存活1个月。
表18.与液态粉尘控制化学品共配制的聚生体中各个细菌的一个月存活
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。接下来的六栏(MDC-200，3275、3133、3139、3001和3010)代表每种共配制物中1个月生存力。最后一栏总结了以下任一组菌株的生存性：A)拥有已知DPA基因，产生DPA，或两者，以及B)既不拥有已知DPA基因也不产生DPA。
实施例5
与液体UAN肥料共配制的微生物聚生体的存活
与液体UAN肥料共配制后，在1个月内多个时间点上对细菌生存力进行了评估。简言之，每种等基因菌株在需氧或厌氧下在液体培养基(如上所述)中生长。然后将培养物以相等比例混合，然后将混合物与UAN32以1：180(微生物：UAN)的比例混合。在第0、7、14和28天评估了微生物的生存性，并总结在表19中。对于第0天时间点(共配制后～1小时)，83％(10/12)的具有鉴定出DPA基因和/或生产DPA的细菌菌株保持存活。对于不可检测DPA产生的细菌，只有20％(2/10株)在第0天时间点保持存活。到第7天时间点，67％(8/12)的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌菌株保持存活。第7天后，这组菌株的生存力没有改变。对于不可检测DPA产生的细菌，在第7天时间点仅10％(1/10株)保持存活。
表19.与UAN肥料共配制的细菌在一个月内的生存性
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。接下来的4栏代表使用上述测定法测试共配制物的生存力的时间点。*在第30天，首次检测到巴氏醋杆菌(一种不能产生DPA的菌株)存活，表明在0、7和14天时间点的假阴性。
实施例6
与生物炭共配制的微生物聚生体的存活
在该实验中，如上所述使表4中所示的22种细菌单独生长，随后混合以产生聚生体。将一克生物炭(CoolCool Planet Energy system,CO,USA)用～0.5mL聚生体浸渍，干燥并保存7天，然后使用上述生存性测定方法分析哪些细菌存活。结果总结在表20中。在生物炭上浸渍7天后，66.7％(7/12株)的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活。没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，在同一时间范围内有30％(3/10株)保持存活。
表20. 7天后生物炭中聚生体的细菌存活
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。
实施例7
与干肥颗粒共配制的微生物聚生体的存活
在该实验中，如上所述使表4中所示的22种细菌单独生长，随后混合以产生聚生体，并以35μL/g的速率浸渍在MOP(0-0-60)干肥上。然后将肥料储存在室温并定期取样以如前所述评估微生物的生存性。结果总结在表21中。66.7％(8/12株)的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活至7天。没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，在同一时间范围内有30％(3/10株)保持存活。
表21.7天后MOP中聚生体的细菌存活
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。
如上所述，表4中所示的22种细菌也单独生长，随后混合以产生聚生体，并以35μL/g的速率浸渍在MAP(11-52-0)上。然后将肥料储存在室温，并定期取样以如前所述评估微生物的生存性。结果总结在表22中。在这种情况下，58.3％(7/12株)的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活至7天。没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，在同一时间范围内有40％(4/10株)保持存活。
表22. 7天后，来自菌群的细菌在MAP中的存活
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。
实施例9
来自聚生体的微生物的存活与DPA表达/产生的比较
在该实验中，如上所述，使表4中所示的22种细菌分别生长，然后混合以产生聚生体。然后将聚生体储存在室温，定期取样以如前所述评估微生物的生存性。结果总结在表23中。
在第2周，83％(10/12株)的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活。没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，在同一时间范围内有60％(6/10株)保持存活。7.5周后，58％(7/12株)的具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的细菌保持存活。没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，在同一时间范围内有50％(5/10株)保持存活。
表23.用过的废培养基中来自聚生体的细菌的存活
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。DPA基因栏代表具有DpaA和DpaB基因二者的那些菌株。DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。
实施例10
微生物存活总结
在所测试的所有情况下，就与农用运载体共配制的菌株随着时间的生存性而言，具有鉴定出DPA基因和/或产生DPA的孢子形成菌的表现优于没有鉴定出DPA基因且不可检测DPA产生的菌株，无论是液体制剂还是干制剂(表24和图4)。因此，在具有选定植物/土壤有益性状的微生物菌群用于与农用运载体(湿和/或干)共配制或作为种子处理剂的合理设计时，选择孢子形成和产生DPA的微生物可以帮助提供所需的微生物功能性(例如但不限于氮代谢、硫代谢、盐耐受性、矿物盐溶解、纤维素降解、几丁质降解、植物激素生成、铁代谢、有机物去磷酸化)保留在存活的微生物中。在某些情况下，这可以确保合理设计的聚生体中存在的微生物功能性有足够的冗余，以符合目标作物、土壤和应用实践需求以及地理和法规要求。
表24.与农用化学品/运载体共配制的微生物菌株的存活
实施例11
评价植物生长促进活性
将购自The Seed Kingdom(Lubbock，TX)的黄瓜种子在22-24℃在浸渍有液体肥料稀释混合物(25ppm NPK于水)的卷发发芽纸(Anchor Paper，Saint Paul，MN)中预发芽4天。用Hoagland溶液(Hoagland,Calif.Agric.Exp.Stn.Bull.347:36-39,1938)预处理盆栽培养基(Sunshine Mix)，将其改良为含有P，30.97ppm；K，39.1ppm；Ca，40.0ppm；Mg，14.59ppm；S，20.143ppm；Fe，1.010ppm；Cu，0.019ppm；Co，0.012ppm；B，2.44ppm；Mn，0.494ppm；Mo，0.001ppm和Zn，0.056ppm。使用1L/磅盆栽培养基的比率。向每个盆中添加1mL的10％w/v尿素溶液，然后再移植具有相似长度的预发芽黄瓜幼苗。对于每种处理(包括对照)，将17-18株植物在规定的生长条件下随机置于平面内，控制温度(16-24℃)和12小时光周期。对照盆含有2g未处理的珍珠岩。用浸渍了2mL表4所示22种细菌的珍珠岩处理实验盆。在用于该测定之前，将浸渍的珍珠岩干燥保存两周。这些平面用改良的Hoagland溶液每周浇水3次。28至32天后，将芽干燥，并记录每株植物的重量。通过单向ANOVA(方差分析)和post-hocTukey检验对数据进行分析，以比较实验中的样品。尽管未达到统计学显著性，但在用微生物浸渍的珍珠岩处理的植物中，苗干重增加。如实施例4(表17)中所述，主要是具有鉴定出DPA基因和/或可检测DPA产生的微生物在浸渍的珍珠岩上存活，其为起始聚生体的一个子集。
实施例12
产生DPA的聚生体
为了鉴定用于设计另外的产生DPA的聚生体的合适菌株，筛选了内部微生物集合。在适当培养基上从细菌甘油储液中回收已知形成孢子的菌属的菌株，并使其生长长达三天。然后选择单个菌落并传代至少三次以确保纯度。如实施例1中所述使用铽-DPA荧光测定测试菌株的DPA产生。选择显示出产生DPA的菌株用于全基因组测序。使用IlluminaNovaSeq 6000测序系统(Illumina，Inc.，San Diego，CA USA)按照制造商推荐的序列文库制备和测序方法进行生物纯分离物的全基因组测序。从微生物分离物中产生了平均5,133,928条的平均长度为87bp的读段。使用SPAdes 3.12.0(Nurk等,J.Comput.Biol.20:714-737,2013)进行从头基因组组装。然后用PROKKA注释组装的重叠群(Seemann,Bioinformatics 30(l4):2068-2069,2014)。然后评估注释的基因组中是否存在吡啶二羧酸合酶亚基A(DpaA)和吡啶二羧酸合酶亚基B(DpaB)以及铁硫黄素蛋白(ISF，表25)。在大多数情况下，产生DPA的菌株具有DpaA和DpaB基因二者，而缺少Isf基因。所有产生DPA且缺乏DpaA和DpaB的菌株都具有一或多个Isf基因拷贝。在三种情况下，菌株拥有所有三个(DpaA，DpaB和Isf)基因。因此，通过铽-DPA荧光测定检测DPA产生与DpaA、DpaB和/或Isf基因的存在完全相关。
表25.全基因组分类学分类，DPA产生以及DpaA、DpaB和Isf的基因拷贝数
DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的菌株。1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。
对于DPA产生测试呈阳性的菌株，使用如WO 2018/045004和实施例1中所述的实验室测定法评估潜在的微生物代谢活性(例如但不限于氮代谢、硫代谢、盐耐受性、矿物盐增溶、纤维素降解、几丁质降解、植物激素产生、铁代谢、有机物去磷酸化)。选择具有最大代谢活性数的菌株用于与5种缺乏DPA产生的菌株(因其代谢活性而被选择)(参见实施例1)的微生物聚生体中的共同发酵。选择那些证明适合在聚生体中共同发酵的菌株(参见表26)，在本文中也称为干配方聚生体(DFC)，用于与运载体如膨润土、珍珠岩和/或尿素共配制。
该实施例中包括的所有聚生体如下发酵。好氧和厌氧细菌菌株均在含有2-10％糖源的培养基上培养。氨基酸、氮和肽以以下一或多种形式提供：食品级乳清粉(0.1-0.5％w/v)，酵母提取物(0.1-0.5％w/v)，酶法生产的非-GMO大豆提取物(0.1-0.5％w/v；Ferti-Nitro Plus Plant N；Ferti-Organic,Brownsville,TX USA)，螺旋藻(0.1-0.5％w/v)和/或蛋白胨(0.1-0.5％w/v)。需要时，海带提取物(0.1-0.5％w/v)、纯化的B-维生素(Sigma)和/或Wolfe微量金属溶液可提供其他维生素和微量营养素。需要时，添加其他盐作为磷酸盐缓冲盐溶液和/或添加氯化钠(0-4％w/v)。将来自AMC1的菌株(如上所述)接种到工作容积为1.5升的2L DASGIP生物反应器(Eppendorf North America Hauppauge，NY)中。发酵期间的pH保持在5.0至7.0之间。通过改变搅拌、气体成分(空气和/或氮气)和气体流量来控制发酵过程中的通气条件，以获得目标氧气传输速率(使用kLa估算)，范围为kLa(每小时)为0至110。温度控制在28℃至35℃之间。
表26.设计用于与运载体共配制的共培养聚生体(“DFC”)或用作种子处理
分类 DPA-产生
解淀粉芽孢杆菌 1
坚强芽孢杆菌 1
弯曲芽孢杆菌 1
地衣芽孢杆菌 1
巨大芽孢杆菌 1
短小芽孢杆菌 1
韩国芽孢杆菌 1
钻特省芽孢杆菌 1
枯草芽孢杆菌 1
双酶梭菌 1
拜氏梭菌 1
巴氏梭菌 0
类干酪乳杆菌 0
溪苔芽孢杆菌属物种(panacisegetis) 1
小鳟鱼大洋芽孢杆菌 0
灿烂类芽孢杆菌 1
氮还原类芽孢杆菌 1
千叶类芽孢杆菌 1
库氏类芽孢杆菌 1
类芽孢杆菌属物种(解几丁质类芽孢杆菌) 1
类芽孢杆菌属物种(P1XP2) 1
假单胞菌属物种 0
灰色链霉菌 0
DPA产生栏代表通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。
为了产生共配制物，将DFC发酵物施加到膨润土或珍珠岩上，然后干燥约24小时。在某些情况下，发酵物在施用前通过离心浓缩。然后测试共配制物的生存力。另外，在植物生长室试验中测试了某些共配制物以验证植物有益特性。
DFC和AMC1在运载体上的生存力：在准备进行包括DFC液体、AMC1液体、DFC浸渍的珍珠岩、AMC1浸渍的珍珠岩、DFC浸渍的膨润土和AMC1浸渍的膨润土的田间试验时，DFC和AMC1分别共发酵并分别以2mL/g或1mL/g浸渍珍珠岩或膨润土运载体。将浸渍的珍珠岩和膨润土干燥保存一到三周，然后进行生存力测定以确定在施用时存活的菌株数量。另外，将液体储存一周，然后进行生存力测定以确定在施用时存活的菌株数量。在液体中，一周后23种DFC菌株中的16种存活，而22种AMC1菌株中的14种存活(表27)。
表27.老化后液体中DFC和AMC1聚生体的生存力
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。
在浸渍的珍珠岩上，23种DFC菌株中的17种和22种AMC1菌株中的14种在多达三周后存活(表28)。
表28.老化后浸渍在珍珠岩上的DFC和AMC1聚生体的生存力。
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。
在浸渍的膨润土上，23种DFC菌株中的17种和22种AMC1菌株中的14种在多达三周后存活(表28)。这说明了产生DPA的菌株在储存在液体中以及在诸如珍珠岩或膨润土的运载体上干燥时如何保持改善的生存力。
表29.老化后浸渍在膨润土上的DFC和AMC1聚生体的生存力
1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。
老化3个月后，DFC浸渍的珍珠岩显示15株是存活的，而AMC1浸渍的珍珠岩仅显示11株是存活的，其中只有一株不产生DPA(表30和31)。
表30.随着时间，在珍珠岩和膨润土上浸渍的AMC1的生存力
DPA栏表示通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。
在同样3个月老化之后，DFC浸渍的膨润土显示出19株是存活的，而AMC1浸渍的珍珠岩在13株中显示是存活的，其中只有3株不产生DPA(表30和31)。
表31.随着时间，在珍珠岩和膨润土上浸渍的DFC的生存力
DPA栏表示通过铽-DPA荧光测定检测DPA生产呈阳性的那些菌株。1＝检测到，0＝未检测到或低于检测限。
DFC植物有益活性的评价：将购自The Seed Kingdom(Lubbock，TX)的黄瓜种子在22℃在浸渍有液体肥料稀释混合物(25ppm NPK于水)的卷发发芽纸(Anchor Paper，SaintPaul，MN)中预发芽4天。在准备种子时，用67.60kg磷酸三钙(TCP)ha-1和改良的Hoagland溶液(Hoagland,Calif.Agric.Exp.Stn.Bull.347:36-39,1938)预处理以制备盆栽培养基(Sunshine Mix)。对于该Hoagland溶液，NK+被改良为含有N，56.03ppm；P，0ppm；K，39.1ppm；Ca，40.0ppm；Mg，14.59ppm；S，20.143ppm；Fe，1.010ppm；Cu，0.019ppm；Co，0.012ppm；B，2.44ppm；Mn，0.494ppm；Mo，0.001ppm和Zn，0.056ppm，使用1L/磅盆栽培养基的比率。对照处理还含有10g未处理的珍珠岩或20g未处理的膨润土/磅盆栽培养基。相比之下，实验盆的珍珠岩或膨润土的量与对照盆相同，但是这些运载体分别浸渍有2mL/g的DFC或1mL/g的DFC。浸渍的珍珠岩和膨润土在用于本测定之前已干燥保存了两周，此时进行了生存力测定以确定在施用时来自DFC的存活菌株数。绝大多数菌株(23株中的15-18株存活)在共配制和老化过程中存活。
在黄瓜种子预发芽之后，选择了相似长度的苗并将其移植到每个盆中。对于每种处理(包括对照)，在确定的生长条件下，将18株植物随机分配到平面内，控制温度(16-24℃)和12小时光周期。在移植的三天后，使用改良的Hoagland溶液，PK+第一次为平面浇水，其含有N，0ppm；P，14.49ppm；K，19.55ppm；Ca，20.0ppm；Mg，14.59ppm；S，20.143ppm；Fe，1.010ppm；Cu，0.019ppm；Co，0.012ppm；B，2.44ppm；Mn，0.494ppm；Mo，0.001ppm和Zn，0.056ppm。然后每周用NK+Hoagland溶液浇水3次。32天后，收获幼枝(shoot)，并记录每种植物的干重。通过单向ANOVA(方差分析)和post-hoc Tukey检验对数据进行分析，以比较实验中的样品。这些试验分别在两个不同的场合进行了两次。
初始试验的结果表明，与对照相比，DFC浸渍的珍珠岩和DFC浸渍的膨润土的幼枝重量显著增加(图6)。第二项试验的结果还显示，对于DFC液体处理和DFC浸渍的珍珠岩，幼枝重量显著增加，虽然DFC浸渍的珍珠岩比DFC液体处理的表现更好，但它们没有显著差异(图7)。因此，与新鲜液体产品相比，与运载体共配制不会影响功效。
实施例13
微生物种子处理
使用批处理机SGS(SGS North America，Brookings，SD USA)对玉米和大豆种子进行微生物种子处理。每次处理一公斤种子。在单独的种子处理中，将微生物直接施用到未处理的种子上，或者作为外涂层施用到预先用杀虫剂/杀真菌剂包装处理过的种子上，或者在施用种子之前将其与杀虫剂/杀真菌剂浆液混合。对于玉米，杀虫剂/杀真菌剂处理由Acceleron混合物或CrusierMaxx混合物组成，Acceleron混合物包含甲霜灵、肟菌酯、种菌唑和噻虫胺，CrusierMaxx混合物包含Cruiser(噻虫嗪)、咯菌腈、精甲霜灵、嘧菌酯和噻苯达唑。对于大豆，杀虫剂/杀真菌剂处理由Acceleron混合物或CrusierMaxx混合物组成，Acceleron混合物包含甲霜灵、唑菌胺酯，吡虫啉和氟唑菌酰胺，CrusierMaxx混合物包含Cruiser(噻虫嗪)、精甲霜灵、咯菌腈和sedexane。
种子处理后，在48小时内和三周后测试生存力(如实施例1)。绝大多数菌株(23株中的19-20株存活)在最初的共配制过程中存活。三周后，仅观察到生存力的轻微降低(23株中17-18株存活；图8)。这表明选择产生DPA的菌株不仅对膨润土和珍珠岩等干燥肥料有效，而且对种子处理也有效。另外，测试种子的发芽以确定种子处理对发芽潜力的影响。进行了冷活力测试，其中进行4次100粒种子发芽的重复测试。将每100粒种子种植在潮湿的皱纹纤维素纸上并在10℃冷冻过夜。然后将种子用湿润至70％持水量的1英寸非灭菌沙覆盖，并在无光照的情况下恢复至10℃，7天。然后将种子移入25℃，四天。对从沙子中出来的苗进行了评估。结果以百分比表示，该百分比表示根据AOSA规则分类为正常的苗数量。根据爱荷华州种子实验室和SGS，82％或更高的分数被认为是玉米种子上市的最低可接受标准。所有处理的发芽百分比为至少83.8％或更高(表32)。这说明，除了以种子处理的形式表现良好之外，产生DPA的菌株对所述种子的发芽没有负面影响。
表32.使用冷活力发芽试验，DFC处理的玉米和大豆种子的平均发芽率
鉴于可以将本公开的原理应用许多可能的实施方案，应当认识到，示出的实施方案仅是实例，并且不应被视为限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明。

Claims (33)

1.一种用于选择微生物用于与运载体或种子共配制的方法，包括：
鉴定包含一或多种吡啶二羧酸(DPA)合酶基因的微生物、表达一或多种DPA合酶蛋白的微生物和/或产生DPA的微生物；以及
选择所述微生物用于与运载体或种子共配制。
2.权利要求1的方法，其进一步包括将所选微生物与所述运载体或所述种子共配制。
3.权利要求1或2的方法，其中所述一或多种DPA合酶基因包含DPA合酶亚基A(DpaA)基因和/或DPA合酶亚基B(DpaB)基因。
4.权利要求3的方法，其中所述DpaA基因编码与SEQ ID NO：26-41的任一氨基酸序列具有至少20％序列相同性的DpaA蛋白，或其中所述DpaB基因编码与SEQ IDNO：42-56的任一氨基酸序列具有至少20％序列相同性的DpaB蛋白。
5.权利要求4的方法，其中所述DpaA基因编码与SEQ ID NO：26-41的任一氨基酸序列具有至少60％序列相同性的DpaA蛋白，或其中所述DpaB基因编码与SEQ IDNO：42-56的任一氨基酸序列具有至少60％序列相同性的DpaB蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述DpaA基因编码包含SEQ ID NO：26-41的任一氨基酸序列的DpaA蛋白或由SEQ ID NO：26-41的任一氨基酸序列组成的DpaA蛋白，或其中所述DpaB基因编码包含SEQ ID NO：42-56的任一氨基酸序列的DpaB蛋白或由SEQ ID NO：42-56的任一氨基酸序列组成的DpaB蛋白。
7.权利要求1或2的方法，其中所述一或多种DPA蛋白包含DPA合酶亚基A(DpaA)蛋白和/或DPA合酶亚基B(DpaB)蛋白。
8.权利要求7的方法，其中所述DpaA蛋白与SEQ ID NO：26-41的任一氨基酸序列包含至少20％的序列相同性，或其中所述DpaB蛋白与SEQ ID NO：42-56的任一氨基酸序列包含至少20％的序列相同性。
9.权利要求8的方法，其中所述DpaA蛋白与SEQ ID NO：26-41的任一氨基酸序列包含至少60％的序列相同性，或其中所述DpaB蛋白与SEQ ID NO：42-56的任一氨基酸序列包含至少60％的序列相同性。
10.权利要求9的方法，其中所述DpaA蛋白包含SEQ ID NO：26-41的任一氨基酸序列或由SEQ ID NO：26-41的任一氨基酸序列组成，或其中所述DpaB蛋白包含SEQ ID NO：42-56的任一氨基酸序列或由SEQ ID NO：42-56的任一氨基酸序列组成。
11.权利要求1或2的方法，其中鉴定包含一或多种吡啶二羧酸(DPA)合酶基因的微生物包括检测编码所述一或多种DPA合酶基因的核酸或核酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述核酸是DNA、mRNA或cDNA。
13.权利要求11的方法，其中检测所述核酸包括核酸测序、核酸扩增、核酸杂交和微阵列分析中的一或多种。
14.权利要求1或2的方法，其中鉴定表达一或多种DPA合酶蛋白的微生物包括免疫测定或质谱。
15.权利要求14的方法，其中所述免疫测定包括Western印迹、ELISA、流式细胞术或免疫组织化学。
16.权利要求1或2的方法，其中鉴定产生DPA的微生物包括检测所述微生物或包含所述微生物的培养基中的DPA。
17.权利要求16的方法，其中检测DPA包括荧光测定。
18.权利要求17的方法，其中所述荧光测定包括铽-DPA荧光测定。
19.权利要求1或2的方法，其中鉴定产生DPA的微生物包括鉴定包含一或多种EtfA或Isf基因和/或表达一或多种EtfA或Isf蛋白的微生物。
20.权利要求19的方法，其中所述Isf蛋白与SEQ ID NO：57-66的任一氨基酸序列包含至少20％的序列相同性。
21.权利要求20的方法，其中所述Isf蛋白与SEQ ID NO：57-66的任一氨基酸序列包含至少60％的序列相同性。
22.权利要求21的方法，其中所述Isf蛋白包含SEQ ID NO：57-66的任一氨基酸序列或由SEQ ID NO：57-66的任一氨基酸序列组成。
23.权利要求1或2的方法，其中与不包含一或多种吡啶二羧酸(DPA)合酶基因、不表达一或多种DPA合酶蛋白和/或不产生DPA的微生物相比，所选微生物与运载体或种子共配制时具有增加的生存力。
24.权利要求2的方法，其中将所选微生物与所述运载体或种子共配制包括使一或多种所选微生物与所述运载体或种子接触。
25.权利要求24的方法，其中所述一或多种所选微生物在液体培养基中。
26.权利要求25的方法，其中所述一或多种所选微生物为固体或干燥形式。
27.权利要求24至26中任一项的方法，其进一步包括使所述运载体或种子与不包含一或多种DPA合酶基因、不表达一或多种DPA蛋白和/或不产生DPA的一或多种微生物接触。
28.权利要求2的方法，其中所述运载体包括干燥或固体运载体或液体运载体。
29.权利要求28的方法，其中所述干燥或固体运载体包括干燥肥料、源自土壤的物质、有机物质、惰性材料或其两种或更多种的混合物。
30.权利要求29的方法，其中所述干燥肥料包括尿素、钾碱、磷酸铵和/或硝酸铵；所述源自土壤的物质包括粘土、泥炭、煤或无机土壤；所述有机物质包括木炭、锯末、小麦/大豆/燕麦麸、堆肥或椰壳纤维；或者所述惰性材料包括珍珠岩、蛭石、膨润土、
Figure FDA0003904575930000021
高岭土、硅酸盐、浮石或滑石。
31.权利要求28的方法，其中所述液体运载体包括液体肥料或液体粉尘控制化学品。
32.权利要求2的方法，其中所述种子包括玉米种子、向日葵种子、油菜种子、小麦种子、黄瓜种子、番茄种子、水稻种子和/或棉花种子。
33.权利要求32的方法，其中经处理的种子进一步包含一或多种杀昆虫剂和/或杀真菌剂。
CN202211302440.3A 2018-06-06 2019-06-05 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法 Pending CN116004439A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862681469P 2018-06-06 2018-06-06
US62/681,469 2018-06-06
CN201980052489.8A CN113166713A (zh) 2018-06-06 2019-06-05 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法
PCT/US2019/035530 WO2019236672A1 (en) 2018-06-06 2019-06-05 Microbial consortia producing dipicolinic acid and methods for selecting microbes for co-formulation with carriers

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980052489.8A Division CN113166713A (zh) 2018-06-06 2019-06-05 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116004439A true CN116004439A (zh) 2023-04-25

Family

ID=68770546

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211302440.3A Pending CN116004439A (zh) 2018-06-06 2019-06-05 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法
CN201980052489.8A Pending CN113166713A (zh) 2018-06-06 2019-06-05 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980052489.8A Pending CN113166713A (zh) 2018-06-06 2019-06-05 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20210321621A1 (zh)
EP (2) EP4209581A1 (zh)
JP (2) JP2021526855A (zh)
KR (1) KR20210018916A (zh)
CN (2) CN116004439A (zh)
AR (1) AR115482A1 (zh)
AU (1) AU2019282673A1 (zh)
BR (1) BR112020024402A2 (zh)
CA (1) CA3102599A1 (zh)
CO (1) CO2020016636A2 (zh)
CR (1) CR20200628A (zh)
MX (1) MX2020013203A (zh)
NI (1) NI202000094A (zh)
WO (1) WO2019236672A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114507645A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 艾博锐克生物科技(山东)有限公司 一类新型黄酮还原酶及其应用
CN114703097B (zh) * 2022-04-01 2023-05-23 广西壮族自治区农业科学院 芽孢杆菌及其应用和多菌种发酵复合发酵植物酵素
NL2031759B1 (en) * 2022-05-02 2023-11-13 Guangxi Academy Agricultural Sciences Bacillus and its Application and Multi-strain Fermentation Compound Fermentation Plant Enzyme
WO2024015944A1 (en) * 2022-07-13 2024-01-18 Indigo Ag, Inc. Endophyte compositions and methods for improved plant health

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU230555B1 (hu) * 2001-08-13 2016-12-28 Biofil Kft. Környezetbarát mikroorganizmus-készítmény és annak előállítása
US20120084886A1 (en) * 2010-06-16 2012-04-05 Agrinos AS Microbial process and composition for agricultural use
US8906668B2 (en) * 2012-11-23 2014-12-09 Seres Health, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
MA41020A (fr) * 2014-11-25 2017-10-03 Evelo Biosciences Inc Compositions probiotiques et prébiotiques, et leurs procédés d'utilisation pour la modulation du microbiome
AU2016389840B2 (en) * 2016-01-29 2021-04-22 Amvac Chemical Corporation Microbial consortia
NZ750627A (en) * 2016-08-30 2023-06-30 Amvac Chemical Corp Defined microbial compositions
US10221107B1 (en) * 2017-10-17 2019-03-05 Cisbay Global Inc. Microbial humic soil enhancements
CN108017447A (zh) * 2017-12-11 2018-05-11 河南邑鸿善成生物技术有限公司 制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法及其肥料的应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019236672A1 (en) 2019-12-12
MX2020013203A (es) 2021-04-28
AU2019282673A1 (en) 2021-01-28
CO2020016636A2 (es) 2021-01-18
EP4209581A1 (en) 2023-07-12
NI202000094A (es) 2021-05-28
CR20200628A (es) 2021-02-11
EP3802786A1 (en) 2021-04-14
JP2021526855A (ja) 2021-10-11
EP3802786A4 (en) 2022-06-29
JP2023144034A (ja) 2023-10-06
BR112020024402A2 (pt) 2021-03-02
AR115482A1 (es) 2021-01-27
CA3102599A1 (en) 2019-12-12
US20210321621A1 (en) 2021-10-21
WO2019236672A8 (en) 2020-09-10
CN113166713A (zh) 2021-07-23
KR20210018916A (ko) 2021-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Singh et al. Diversity of nitrogen-fixing rhizobacteria associated with sugarcane: a comprehensive study of plant-microbe interactions for growth enhancement in Saccharum spp.
Niu et al. Drought-tolerant plant growth-promoting rhizobacteria associated with foxtail millet in a semi-arid agroecosystem and their potential in alleviating drought stress
US11591274B2 (en) Defined microbial compositions
Breedt et al. Seed treatment with selected plant growth‐promoting rhizobacteria increases maize yield in the field
CN116004439A (zh) 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法
Piromyou et al. Preferential association of endophytic bradyrhizobia with different rice cultivars and its implications for rice endophyte evolution
CN117757706A (zh) 靶向改良植物性状的固氮的基因靶标
Fischer et al. Survival of native Pseudomonas in soil and wheat rhizosphere and antagonist activity against plant pathogenic fungi
CN112867784A (zh) 用于改善磷酸盐增溶的方法和组合物
US10954173B2 (en) Microbial coating of controlled-release fertilizers
Chinnadurai et al. Characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase producing methylobacteria from phyllosphere of rice and their role in ethylene regulation
Hayat et al. Characterization and identification of compost bacteria based on 16S rRNA gene sequencing
Susilowati et al. Indole-3-acetic acid producing bacteria and its application on the growth of rice
Ruangsanka Identification of phosphate-solubilizing bacteria from the bamboo rhizosphere
US10752877B2 (en) Facultative endophytic plant growth promoting bacteria
Qin et al. Bacillus circulans GN03 alters the microbiota, promotes cotton seedling growth and disease resistance, and increases the expression of phytohormone synthesis and disease resistance-related genes
Nievas et al. Unraveling Azospirillum’s colonization ability through microbiological and molecular evidence
RU2793460C2 (ru) Способ отбора микроорганизмов для объединения в композицию с носителями
Bandeppa et al. Isolation, identification and characterization of efficient free-living nitrogen-fixing bacteria from rice rhizosphere ecosystem
Overbeek Viable microbial inoculation of granular fertilizer to improve row crop productivity in Southern Quebec
MX2010014426A (es) Composiciones biofertilizantes novedosas fijadoras de nitrogeno.
Mona et al. Halotolerant microresidents of mangrove swamps are among the pillars of barley development in salt-affected environments
Rassem et al. In-Vitroe evaluates antagonism strains of actinomycetes on growth strains of Rhizobium
Robert ISOLATION, SCREENING AND CHARACTERIZATION OF PLANT GROWTH PROMOTING BACTERIA FROM RHIZOSPHERE ASSOCIATED WITH IXORA COCCINEA
Maya Studies on biochemical and molecular characterization of isolated nodule-associated bacteria from Mimosa pudica L. and their plant growth promoting activities on Vigna radiata L.(Wilczek)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination