KR20210013624A - 피라졸로헤테로아릴 유도체의 하이드로클로라이드의 결정 형태 및 제조 방법 - Google Patents

피라졸로헤테로아릴 유도체의 하이드로클로라이드의 결정 형태 및 제조 방법 Download PDF

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KR20210013624A
KR20210013624A KR1020207037306A KR20207037306A KR20210013624A KR 20210013624 A KR20210013624 A KR 20210013624A KR 1020207037306 A KR1020207037306 A KR 1020207037306A KR 20207037306 A KR20207037306 A KR 20207037306A KR 20210013624 A KR20210013624 A KR 20210013624A
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crystal form
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KR1020207037306A
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샤오리 차오
전싱 두
리쿤 왕
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지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드
샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 피라졸로헤테로아릴 유도체의 하이드로클로라이드의 결정 형태 및 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드의 결정 형태 I 및 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드의 결정 형태 A, B 및 C, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 화학식 I의 화합물의 결정 형태는 양호한 결정 안정성을 갖고, 임상 치료에 더 양호하게 사용될 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00028
.

Description

피라졸로헤테로아릴 유도체의 하이드로클로라이드의 결정 형태 및 제조 방법
관련 출원에 대한 상호 참고
본원은 2018년 5월 25일자 출원된 중국 특허출원 제CN 201810512563.7호(이의 전문은 본원에 참고로 혼입됨)를 우선권 주장한다.
기술 분야
본 개시내용은 6-부톡시-1-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 다이하이드로클로라이드의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 및 6-부톡시-1-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 모노하이드로클로라이드의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C, 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
톨-유사 수용체(TLR)는 선천적인 면역에 관여하는 중요한 단백질 분자의 부류이다. TLR은 통상적으로 대식세포 및 수지상 세포와 같은 센티넬 세포 상에서 발현되는 단일 막-스패닝(spanning) 비-촉매 수용체이고, 미생물에 의해 생산된 구조적으로 보존된 분자를 인식할 수 있다. 이러한 미생물이 피부 또는 장관 점막과 같은 물리적 장벽을 통해 분해되면, 이들은 TLR에 의해 인식되어 면역 세포 반응을 활성화시킨다(문헌[Mahla, RS. et al., Front Immunol. 4: 248 (2013)]). 병원성 미생물을 광범위하게 인식하는 면역계의 능력은 부분적으로 톨-유사 면역수용체(TLR)의 광범위한 존재에 기인한다.
10개 이상의 상이한 TLR이 포유동물에 존재한다. 리간드 및 상응하는 신호전달 캐스케이드가 이러한 수용체 중 일부에 대해 동정되었다. TLR7은 비-자가 핵산의 검출을 전문으로 하는 세포의 엔도솜 구획에 국지화된 TLR의 아군(TLR 3, 7, 8 및 9)의 구성원이다. TLR7은 ssRNA의 인식을 통한 항-바이러스 방어에서 핵심 역할을 한다(문헌[Diebold S. S. et al., Science, 2004: 303, 1529-1531]; 및 문헌[Lund J. M. et al., PNAS, 2004: 101, 5598-5603]). TLR7은 인간에서 제한된 발현-프로파일을 갖고, B 세포 및 형질세포양 수지상 세포(pDC)에 의해, 및 덜한 정도로 단핵구에 의해 주로 발현된다. 형질세포양 DC는 림프구-유래 수지상 세포의 독특한 집단[말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 0.2 내지 0.8%]이고, 바이러스 감염에 반응하여 높은 수준의 인터페론-알파(IFNα) 및 인터페론-베타(IFNβ)를 분비하는 1차 유형 I 인터페론-생산 세포이다(문헌[Liu Y-J, Annu. Rev. Immunol., 2005: 23, 275-306]).
많은 질병 및 질환, 예컨대 흑색종, 비소세포 폐암, 간세포 암종, 기저세포 암종, 신세포 암종, 골수종, 알러지 비염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 궤양성 대장염, 간 섬유증, 및 바이러스 감염, 예컨대 HBV, 플라비비리다에(Flaviviridae) 바이러스, HCV, HPV, RSV, SARS, HIV, 또는 인플루엔자 바이러스 감염이 TLR의 비정상에 관련된다. 따라서, 관련 질병을 치료하기 위한 TLR 작용제의 사용은 매우 유망하다.
TLR7 및 TLR8이 매우 상동성이므로, 대부분의 경우에 TLR7의 리간드는 또한 TLR8의 리간드이다. TLR8 자극은 주로 사이토카인, 예컨대 괴사 인자 α(TNF-α) 및 케모카인의 생산을 유도한다. 인터페론 α는 만성 B형 간염 또는 C형 간염을 치료하기 위한 주요 약물 중 하나이지만, TNF-α는 전염증성 사이토카인이고, 이의 과다-분비는 심각한 부작용을 야기할 수 있다. 따라서, TLR7 및 TLR8에 대한 선택성은 바이러스 감염 질병을 치료하기 위한 TLR7 작용제의 개발을 위해 중요하다.
TLR7 작용제는 국제출원 제PCT/CN2017/113007호(출원일: 2017년 11월 27일)에서 제공되고, 이의 화학식은 다음과 같다:
[화학식 I]
Figure pct00001
.
TLR7 작용제와 관련된 국제출원공보 제WO 2005/025583호, 제WO 2007/093901호, 제WO 2008/011406호, 제WO 2009/091032호, 제WO 20100/77613호, 제WO 2010/133882호, 제WO 2011/031965호, 제WO 2012/080730호 등이 현재 존재한다.
활성 약학 성분의 결정 형태 구조는 종종 약물의 화학적 안정성에 영향을 준다. 상이한 결정화 조건 및 저장 조건이 종종 다른 결정 형태의 형성에 의해 수반되는 화합물의 결정 형태 구조의 변화를 야기할 수 있다. 일반적으로, 비정형 약물 제품은 규칙적인 결정 구조를 갖지 않고, 종종 다른 결점, 예컨대 불량한 제품 안정성, 더 미세한 침전물, 어려운 여과, 용이한 응집 및 불량한 유동을 갖는다. 약물의 다형체는 제품 저장, 생산 및 규모확장을 위해 상이한 요건을 갖는다. 따라서, 화학식 I의 화합물의 결정 형태 및 화학식 I의 화합물의 다양한 특성을 개선하기 위한 심도 깊은 연구가 필요하다.
발명의 내용
본 개시내용은 하기 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00002
.
본 개시내용은 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염을 제공한다.
본 개시내용은 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C, 및 이들의 제조 방법을 제공하고, 본 개시내용의 화학식 I의 화합물의 결정 형태는 양호한 결정 형태 안정성을 갖는다.
본 개시내용의 한 양상은 X-선 분말 회절 패턴이 7.182, 8.520, 12.275, 15.057, 15.614, 20.994, 21.804 및 22.934의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I을 제공한다.
바람직한 양태에서, 본 개시내용은 X-선 분말 회절이 7.182, 8.520, 11.152, 12.275, 15.057, 15.614, 15.902, 17.162, 20.384, 20.994, 21.804, 22.934, 24.360, 26.260, 26.630, 27.209 및 29.724의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I을 제공한다.
더욱 바람직한 양태에서, 본 개시내용은 X-선 분말 회절 패턴이 7.182, 7.722, 8.520, 11.152, 12.275, 15.057, 15.614, 15.902, 17.162, 20.384, 20.994, 21.804, 22.934, 24.360, 25.320, 26.260, 26.630, 27.209, 27.920, 29.724, 30.720 및 32.270의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I을 제공한다.
본 개시내용의 한 양상은 X-선 분말 회절 패턴이 9.999, 10.801, 12.461, 15.761, 17.020, 18.680, 20.558, 20.863, 24.541, 26.240 및 26.660의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II를 제공한다.
바람직한 양태에서, 본 개시내용은 X-선 분말 회절 패턴이 8.479, 9.999, 10.801, 12.461, 13.725, 14.120, 15.761, 17.020, 18.680, 20.135, 20.558, 20.863, 21.641, 22.960, 24.202, 24.541, 26.240, 26.660, 28.262 및 28.681의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II를 제공한다.
더욱 바람직한 양태에서, 본 개시내용은 X-선 분말 회절 패턴이 5.002, 7.202, 8.479, 9.999, 10.801, 11.220, 11.995, 12.461, 13.725, 14.120, 15.761, 16.484, 17.020, 18.680, 20.135, 20.558, 20.863, 21.289, 21.641, 22.319, 22.960, 24.202, 24.541, 26.240, 26.660, 27.196, 28.262, 28.681, 29.518, 31.017, 31.355, 32.725, 33.198, 36.810, 37.880, 39.335 및 41.004의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II를 제공한다.
본 개시내용은 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 X-선 분말 회절 패턴이 9.647, 13.306, 13.644, 14.936, 17.533, 18.866, 20.261 및 22.515의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A를 제공한다.
더욱 바람직한 양태에서, 본 개시내용은 X-선 분말 회절 패턴이 9.647, 13.018, 13.306, 13.644, 14.936, 17.533, 18.866, 20.261, 20.836, 21.038, 21.684, 22.515, 24.775, 25.396, 26.306, 27.095, 28.182, 28.742, 29.621 및30.388의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 X-선 분말 회절 패턴이 12.421, 13.937, 17.095, 17.492, 18.647, 19.317, 21.823, 22.183 및 26.321의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B를 제공한다.
더욱 바람직한 양태에서, 본 개시내용은 X-선 분말 회절 패턴이 7.094, 12.421, 13.937, 14.900, 15.837, 17.095, 17.492, 18.647, 19.317, 21.823, 22.183, 23.777, 24.391, 26.321, 26.857, 27.432, 29.918 및 30.946의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 X-선 분말 회절 패턴이 9.641, 10.199, 12.176, 15.950, 17.288, 18.579, 19.859, 20.675, 21.083, 21.838 및 24.628의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C를 제공한다.
더욱 바람직한 양태에서, 본 개시내용은 X-선 분말 회절 패턴이 9.641, 10.199, 12.176, 12.542, 13.302, 15.118, 15.592, 15.950, 17.288, 18.579, 19.547, 19.859, 20.675, 21.083, 21.838, 23.795, 23.963, 24.628, 25.222, 26.914, 28.068, 28.886 및 30.179의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B를 제공한다.
본 개시내용은 화학식 I의 화합물을 염산으로 염화시키는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염의 제조 방법을 제공한다.
본 개시내용은
방법 i) 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 I을 수득하는 방법; 및
방법 ii) 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 I을 수득하는 방법으로부터 선택되는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 제조 방법을 추가로 제공하고,
결정화 방법은 실온에서의 결정화, 냉각에 의한 결정화, 용매의 휘발에 의한 결정화, 및 결정화를 유도하기 위한 종결정의 첨가에 의한 결정화로부터 선택되고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매는 이소프로판올-테트라하이드로퓨란의 혼합 용매를 포함하지 않고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매는 에터 용매, 알코올 용매, 에스터 용매, 케톤 용매, 니트릴 용매 및 할로겐화된 탄화수소 용매로부터 선택되는 하나 이상의 용매이고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 에터 용매는, 비제한적으로, 테트라하이드로퓨란, 다이에틸 에터, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에터, 메틸 tert-부틸 에터, 이소프로필 에터 또는 1,4-다이옥산을 포함하고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 알코올 용매는, 비제한적으로, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 이소펜탄올 또는 트라이플루오로에탄올을 포함하고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 에스터 용매는, 비제한적으로, 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 또는 부틸 아세테이트를 포함하고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 케톤 용매는, 비제한적으로, 아세톤, 아세토페논, 메틸 이소부틸 케톤 또는 메틸 피롤리돈을 포함하고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 니트릴 용매는, 비제한적으로, 아세토니트릴 또는 프로피오니트릴을 포함하고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 할로겐화된 탄화수소 용매는, 비제한적으로, 클로로메탄, 다이클로로메탄, 클로로폼 또는 탄소 테트라클로라이드를 포함하고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 염산의 양은 화학식 I의 화합물의 물질의 양의 2 내지 30배, 바람직하게는 2 내지 15배, 가장 바람직하게는 2 내지 5배이다.
본 개시내용의 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 제조 방법에서, 결정화를 위한 용매가 혼합 용매일 때, 상기 혼합 용매는 이소프로판올-테트라하이드로퓨란이 아니고, 비제한적으로, 이소프로판올-이소프로필 아세테이트, 이소프로판올-이소프로필 에터, 이소프로판올-다이옥산, 에탄올-다이옥산, 에탄올-테트라하이드로퓨란, 에탄올-이소프로필 에터, 에탄올-이소프로필 아세테이트, 에탄올-아세토니트릴, 이소프로판올-아세토니트릴, 메탄올-이소프로필 에터, 메탄올-이소프로필 아세테이트, 메탄올-아세토니트릴, 다이클로로메탄-테트라하이드로퓨란, 이소프로판올-테트라하이드로퓨란, 이소프로판올-에틸 아세테이트 또는 메탄올-에틸 아세테이트를 포함한다.
본 개시내용은 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 II를 수득하는 방법을 포함하는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II의 제조 방법을 추가로 제공하고,
상기 결정화를 위한 용매는 이소프로판올-테트라하이드로퓨란의 혼합 용매이고; 상기 염산의 양은 화학식 I의 화합물의 물질의 양의 2 내지 30배, 바람직하게는 2 내지 15배, 가장 바람직하게는 2 내지 5배이다.
본 개시내용은
방법 i) 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 A를 수득하는 방법; 및
방법 ii) 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 A를 수득하는 방법
으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A의 제조 방법을 추가로 제공하고,
결정화 방법은 실온에서의 결정화, 냉각에 의한 결정화, 용매의 휘발에 의한 결정화, 및 결정화를 유도하기 위한 종결정의 첨가에 의한 결정화로부터 선택되고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매는 니트릴 용매 및 케톤 용매로부터 선택되는 하나 이상의 용매이고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 케톤 용매는 아세톤, 아세토페논, 메틸 이소부틸 케톤 및 메틸 피롤리돈으로부터 선택되고, 바람직하게는 아세톤이고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 니트릴 용매는 아세토니트릴 및 프로피오니트릴로부터 선택되고, 바람직하게는 아세토니트릴이고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 염산의 양은 화학식 I의 화합물의 물질의 양 1 내지 2배(2배는 제외됨)이다.
본 개시내용은
방법 i) 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 B를 수득하는 방법; 및
방법 ii) 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 B를 수득하는 방법
으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B의 제조 방법을 추가로 제공하고,
결정화 방법은 실온에서의 결정화, 냉각에 의한 결정화, 용매의 휘발에 의한 결정화, 및 결정화를 유도하기 위한 종결정의 첨가에 의한 결정화로부터 선택되고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매는 에스터 용매로부터 선택되고, 상기 에스터 용매는 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 및 부틸 아세테이트로부터 선택되고, 바람직하게는 에틸 아세테이트이고;
상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 염산의 양은 화학식 I의 화합물의 양의 1 내지 2배(2배는 제외됨)이다.
본 개시내용은
방법 i) 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 C를 수득하는 방법; 및
방법 ii) 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 C를 수득하는 방법
으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C의 제조 방법을 추가로 제공하고,
결정화 방법은 실온에서의 결정화, 냉각에 의한 결정화, 용매의 휘발에 의한 결정화, 및 결정화를 유도하기 위한 종결정의 첨가에 의한 결정화로부터 선택되고; 상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매는 에터 용매로부터 선택되고, 상기 에터 용매는 테트라하이드로퓨란, 다이에틸 에터, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에터, 메틸 tert-부틸 에터, 이소프로필 에터 및 1,4-다이옥산, 바람직하게는 1,4-다이옥산이고; 상기 염산의 양은 화학식 I의 화합물의 물질의 양의 1 내지 2배(2배는 제외됨)이다.
화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 및 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C의 제조 방법에서, 화학식 I의 화합물이 결정화를 위한 용매에서 정화되고 염산이 첨가되는 온도는 구체적으로 한정되지 않고, 반응 온도는 용매의 변화에 따라 변할 수 있고, 특정 반응 온도는 -20 내지 100℃, 바람직하게는 0 내지 80℃, 더욱 바람직하게는 15 내지 60℃일 수 있고, 가열이 수행될 때, 결정화 방법은 냉각에 의한 결정화일 수 있다.
본 개시내용의 하이드로클로라이드 염의 제조 방법(예컨대, 하이드로클로라이드 염 및 결정 형태의 제조 방법)에 관여하는 염산은 농축 염산, 수소 클로라이드 기체, 결정화를 위한 용매 중 수소 클로라이드의 용액, 또는 결정화를 위한 용매에 의해 희석된 농축 염산일 수 있다.
본 개시내용에 제공된 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염의 결정 형태는 임의적으로 화학량론적인 물 또는 비-화학량론적인 물을 함유하고, XPRD 패턴의 피크 위치가 본 개시내용의 각각의 결정 형태의 위치와 동일한 경우, 본 개시내용의 보호범위에 속한다.
본 개시내용은 또한 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C, 및 임의적으로 하나 이상의 약학 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 임의의 약학적으로 허용되는 제제로 제조될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C, 또는 약학 제제는 정제, 캡슐, 환제, 과립, 용액, 현탁액, 시럽, 주사(예컨대 주사, 주사용 멸균 분말 및 주사용 농축 용액), 좌제, 흡입제 또는 비말로서 제형화될 수 있다.
또한, 본 개시내용의 약학 조성물은 임의의 적합한 투여 방식으로, 예컨대 경구, 비경구, 직장, 폐 또는 국소 투여로 이러한 치료를 필요로 하는 환자 또는 대상에게 투여될 수도 있다. 경구 투여를 위해 사용되는 경우, 약학 조성물은 경구 제제, 예컨대 경구 고체 제제, 예컨대 정제, 캡슐, 환제, 과립 등; 또는 경구 액체 제제, 예컨대 경구 용액, 경구 현탁액, 시럽 등으로 제조될 수 있다. 경구 제제로 제조될 때, 약학 제제는 또한 적합한 충전제, 결합제, 붕해제, 윤활제 등을 함유할 수 있다. 비경구 투여를 위해 사용될 때, 약학 제제는 주사, 예컨대 주사용 용액, 주사용 멸균 분말 및 주사용 농축 용액으로 제조될 수 있다. 주사로 제조될 때, 약학 조성물은 약학 분야에 존재하는 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 주사를 제조할 때, 약학 제제는 첨가제가 첨가되지 않을 수 있거나, 적절한 첨가제가 약물의 성질에 따라 첨가될 수 있다. 직장 투여를 위해 사용될 때, 약학 제제는 좌제 등으로 제조될 수 있다. 폐 투여를 위해 사용될 때, 약학 제제는 흡입제 또는 비말로 제조될 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 본 개시내용의 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C는 치료 및/또는 예방 효과량으로 약학 조성물 또는 약제에 존재한다. 일부 바람직한 양태에서, 본 개시내용의 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C는 단위 투약량의 형태로 약학 조성물 또는 약제에 존재한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 및 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C로부터 선택되는 하나 이상의 결정 형태를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 뎅기 바이러스, 플라비바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 쿤진(Kunjin) 바이러스, 머레이 밸리(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 세인트 루이스(Saint Louis) 뇌염 바이러스, 옴스크(Omsk) 출혈 열 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, HIV, HBV, HCV, HPV, RSV, SARS 및/또는 인플루엔자 바이러스로부터 선택되는 바이러스에 의해 유발된 바이러스 감염의 치료용 약제의 제조에 있어서, 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 흑색종, 비소세포 폐암, 간세포 암종, 기저세포 암종, 신세포 암종, 방광암, 골수종, 알러지 비염, 천식, COPD, 궤양성 대장염 및/또는 간 섬유증의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용에 의해 제공되는 제조 방법에서 "가열하는"은 가열 온도가 사용된 용매에 상응하는 비등점 온도를 초과하지 않음을 지칭하고; 본 개시내용에 의해 제공되는 제조 방법에서 "온도를 낮추는", "냉각하는"은 시스템의 내부 온도가 가열 온도보다 낮은 임의의 온도로 저하됨을 지칭한다. 상기 온도는 포인트 값 또는 구간 값일 수 있다. "온도를 낮추는" 및 "냉각하는" 공정은 프로그램화되거나 비-프로그램화될 수 있다. 또한, 교반 조작이 임의적으로 온도를 낮추는 또는 냉각하는 공정에서 사용될 수 있음이 당업자에게 공지된다.
화학식 I의 화합물의 결정 형태의 측정 및 연구는 X-선 분말 회절 패턴(XRPD) 및 시차 주사 열량법(DSC)에 의해 수행되었다.
발명의 상세한 설명
본원의 명세서 및 청구범위에서, 달리 특정되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 그러나, 본 개시내용을 더 잘 이해하도록, 일부 관련 용어의 정의 및 설명이 하기 제공된다. 또한, 본원에 제공된 용어의 정의 및 해석이 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미와 불일치할 때, 본원에 제공된 용어의 정의 및 해석이 우선되어야 한다.
본 개시내용에 사용된 용어 "에터 용매"는 에터 결합 -O- 및 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 쇄 화합물 또는 환형 화합물을 지칭하고, 특정 예는, 비제한적으로, 테트라하이드로퓨란, 다이에틸 에터, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에터, 메틸 tert-부틸 에터 또는 1,4-다이옥산을 포함한다.
본 개시내용에 사용된 용어 "알코올 용매"는 "C1-6 알킬" 상의 하나 이상의 수소 원자를 하나 이상의 "하이드록실" 기로 치환함으로써 유도된 용매를 지칭하고, 상기 "하이드록실" 및 "C1-6 알킬"은 상기 정의된 바와 같고, 특정 예는, 비제한적으로, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 이소펜탄올 또는 트라이플루오로에탄올을 포함한다.
본 개시내용에 사용된 용어 "에스터 용매"는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 저급 유기 산 및 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알코올의 조합을 지칭한다. 이의 특정 예는, 비제한적으로, 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 또는 부틸 아세테이트를 포함한다.
본 개시내용에 사용된 용어 "케톤 용매"는 카보닐 기(-C(O)-)가 2개의 탄화수소 기에 결합된 화합물을 지칭한다. 케톤은 분자의 탄화수소 기에 따라서 지방족 케톤, 지환족 케톤, 방향족 케톤, 포화 케톤 및 불포화 케톤으로 분류될 수 있다. 이의 특정 예는, 비제한적으로, 아세톤, 아세토페논, 메틸 이소부틸 케톤 또는 메틸 피롤리돈을 포함한다.
본 개시내용에 사용된 용어 "니트릴 용매"는 "C1-6 알킬" 상의 하나 이상의 수소 원자를 하나 이상의 "시아노" 기로 치환함으로써 유도된 용매를 지칭하고, 상기 "시아노" 및 "C1-6 알킬"은 상기 정의된 바와 같고, 특정 예는, 비제한적으로, 아세토니트릴 또는 프로피오니트릴을 포함한다.
본 개시내용에 사용된 용어 "지방족 탄화수소 용매"는 지방족 화합물의 기본 특성을 갖고 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖되, 분자의 탄소 원자가 2개의 단부가 개방되고 고리를 형성하지 않는 쇄-형 탄소 프레임에 연결된 탄화수소, 예를 들어 포화 지방족 탄화수소, 예컨대 알칸 용매를 지칭한다. 이의 특정 예는, 비제한적으로, n-부탄, n-펜탄, n-헥산 또는 n-헵탄을 포함한다.
본 개시내용에 사용된 용어 "할로겐화된 탄화수소 용매"는 "C1-6 알킬" 상의 하나 이상의 수소 원자를 하나 이상의 "할로겐 원자"로 치환함으로써 유도된 용매를 지칭하고, 상기 "할로겐 원자" 및 "C1-6 알킬"은 상기 정의된 바와 같고, 특정 예는, 비제한적으로, 메틸 클로라이드, 다이클로로메탄, 클로로폼 또는 탄소 테트라클로라이드를 포함한다.
본 개시내용에 사용된 "X-선 분말 회절 패턴 또는 XRPD"는 브래그(Bragg) 공식 2d sin θ = nλ(공식에서, λ는 X-선의 파장이고, λ = 1.54056 Å, 회절 차수의 수 n은 임의의 양의 정수이고, 일반적으로 제1차 회절 피크를 취함, n=1)에 따른 패턴이고, X-선이 지표 각 θ로 결정 샘플의 결정 또는 부분의 d 격자면 이격을 갖는 원자면에 입사될 때(입사각의 나머지 각은 또한 브래그 각으로 공지됨), 브래그 방정식을 만족시킬 수 있고, 이에 따라 X-선 분말 회절 패턴의 이러한 기가 측정될 수 있다.
본 개시내용에 사용된 "X-선 분말 회절 패턴 또는 XRPD"는 X-선 분말 회절계에서 Cu-Kα 방사선을 사용함으로써 수득된다.
본 개시내용에 사용된 "시차 주사 열량법 분석 또는 DSC"는 샘플의 가열 또는 일정 온도의 공정에서 샘플과 기준 물질 사이의 온도 차이 및 열류 차이를 측정하여 열 효과와 관련된 모든 물리적 및 화학적 변화를 특성규명하고 샘플의 상 변화 정보를 수득하는 것을 지칭한다.
본 개시내용에 사용된 "2θ 또는 2θ 각"은 회절 각을 지칭하고, θ는 브래그 각이고, 단위는 ° 또는 도이고, 2θ의 오차 범위는 ±0.1 내지 ±0.5, 바람직하게는 ±0.1 내지 ±0.3, 더욱 바람직하게는 ±0.2이다.
본 개시내용에 사용된 "결정면 이격 또는 결정면 이격(d 값)"은 격자를 병치된 평행육면체 단위로 분류하는 평행하지 않고 2개의 인접한 격자점을 연결하는 공간 격자로부터 선택되는 3개의 단위 벡터 a, b 및 c(결정면 이격으로 지칭됨)를 지칭한다. 공간 격자는 측정된 평행육면체 단위 선에 따라 선형 격자의 집합(공간 격자 또는 격자로 지칭됨)으로 분류된다. 점 매트릭스 및 격자는 각각 기하 점 및 선을 갖는 결정 구조의 주기성을 반영하고, 상이한 결정면은 상이한 표면 이격(즉, 2개의 인접한 평행 결정면 사이의 거리)을 갖고; 단위는 Å 또는 옹스트롬이다.
연구는 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C가 양호한 안정성 및 높은 순도를 갖고, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 단일 결정이 수득되고; 본 개시내용의 기술적 해법에서 수득된 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 및 결정 형태 II, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 결정 형태 B 및 결정 형태 C가 생산, 운반 및 저장에 대한 약학적인 요건을 만족시킬 수 있고, 안정하고 반복가능하고 제어가능한 생산 공정을 가지고, 산업적인 생산에 적용될 수 있음을 나타냈다.
도 1은 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 XPRD 패턴이다.
도 2는 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 DSC 패턴이다.
도 3은 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 TGA 패턴이다.
도 4는 DSC(150℃)에서 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 XPRD 패턴이다.
도 5는 DSC(175℃)에서 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 XPRD 패턴이다.
도 6은 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 DVS-제1 사이클 패턴이다.
도 7은 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 DVS-제2 사이클 패턴이다.
도 8은 DVS 전 및 후의 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 XPRD 패턴이다.
도 9는 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II의 XPRD 패턴이다.
도 10은 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II의 DSC 패턴이다.
도 11은 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II의 TGA 패턴이다.
도 12는 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A의 XPRD 패턴이다.
도 13은 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A의 DSC 패턴이다.
도 14는 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B의 XPRD 패턴이다.
도 15는 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B의 DSC 패턴이다.
도 16은 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C의 XPRD 패턴이다.
양태의 상세한 설명
하기 실시예는 본 개시내용을 추가로 설명하지만, 본 개시내용은 이로 제한되지 않는다.
실험에 사용된 장비의 시험 조건:
화합물의 구조는 핵 자기 공명(NMR) 및/또는 질량 분광법(MS)에 의해 측정되었다. NMR 쉬프트(δ)는 10-6(ppm)의 단위로 제공된다. NMR은 브루커(Bruker) 어밴스(AVANCE)-400 핵 자기 공명 분광계에 의해 측정되고, 용매는 중수소처리된 다이메틸 설폭사이드(DMSO-d 6), 중수소처리된 클로로폼(CDCl3), 중수소처리된 메탄올(CD3OD)이고, 내부 표준은 테트라메틸실란(TMS)였다.
MS는 핀니간(FINNIGAN) LCQAd(ESI) 질량 분광계[제조사: 써모(Thermo), 모델: 핀니간 LCQ 어드밴티지 맥스(MAX)]로 측정되었다.
HPLC 측정은 아길런트(Agilent) 1200DAD 고압 액체 크로마토그래피[선파이어(Sunfire) C18 150 x 4.6 mm 컬럼] 및 워터스(Waters) 2695-2996 고압 액체 크로마토그래피[지미니(Gimini) C18 150 x 4.6 mm 컬럼]를 사용한다.
XRPD는 X-선 분말 회절 검출이다: 측정은 리가쿠 울티마(Rigaku Ultima)IV 모델 컴바인디드 멀티-펑션(model combined multi-fucntion)을 사용한다.
X-선 회절계, 특정 정보 수집됨: Cu 애노드(40 kV, 40 mA), Cu-Kα1 선 λ 라인(Kα1 라인), 주사 속도: 20 스캔 분, 주사 범위: (2q 범위): 3-45 스캔, 주사 단계 크기: 0.02 및 슬릿 너비: 0.01.
DSC는 시차 주사 열량법이다: TA Q2000이 측정을 위해 사용되고, 가열 속도는 10 ℃/분이고(30 내지 300℃), 질소 퍼지 속도는 50 mL/분이다.
TGA는 열중량 분석이다: TAQ500이 측정을 위해 사용되고, 가열 속도는 10℃/분이고, 특정 온도 범위는 상응하는 패턴을 나타내고, 질소 퍼지 속도는 60 mL/분이다.
DVS는 역학적 증기 수착이다: 서피스 메져먼트 시스템즈 어드밴티지(Surface Measurement Systems advantage) 2가 사용되고, 습도는 50%에서 시작하고, 습도 범위는 0 내지 95%이고, 단계 크기는 10%이다. 판단 표준은 질량 변화가 10,000분 내에 0.01% 미만이고, 2회 사이클이 수행된다.
양태의 반응 진행은 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링된다. 전개 시약이 반응에 사용되고, 컬럼 크로마토그래피의 용리 시스템이 화합물의 정제에 사용되고, 전개 시약 시스템은 A) 다이클로로메탄/메탄올 시스템을 포함하고, 용매의 부피 비는 화합물의 극성에 따라 조정되고, 소량의 염기성 또는 산성 시약, 예컨대 트라이에틸아민 및 아세트산이 또한 조정을 위해 첨가될 수 있다.
비교 실시예 1(국제출원 제PCT/CN2017/113007호의 실시예 1의 제조 방법)
6-부톡시-1-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민
[화학식 I]
Figure pct00003
.
Figure pct00004
단계 1
6-클로로-N-(4-메톡시벤질)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 1c
4,6-다이클로로-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘 1a(120 mg, 0.63 mmol), 4-메톡시벤질아민 1b(87.1 mg, 0.63 mmol) 및 트라이에틸아민(64.13 mg, 0.63 mmol)을 2 mL의 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, 반응 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응을 중단시키고, 반응 용액을 감압 하에 농축하였다. 잔사를 용리 시스템 A에 의한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 1c를 수득하였다(140 mg, 수율: 76.1%).
MS m/z (ESI): 290.2 [M+1].
단계 2
6-클로로-N-(4-메톡시벤질)-1-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 1e
화합물 1c(140 mg, 0.48 mmol), 1-(4-(클로로메틸)벤질)피롤리딘 1d(101.34 mg, 0.48 mmol, "국제 출원공보 제WO 2002/012224호"에 개시된 방법에 따라 제조됨) 및 칼륨 카보네이트(66.79 mg, 0.48 mmol)를 2 mL의 N,N-다이메틸폼아미드에 용해시켰다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응을 중단시켰다. 반응 용액을 감압 하에 농축하고, 잔사를 용리 시스템 A에 의한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 1e를 수득하였다(70 mg, 수율: 31.3%).
MS m/z (ESI): 463.2 [M+1].
단계 3
6-부톡시-N-(4-메톡시벤질)-1-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 1f
화합물 1e(70 mg, 0.15 mmol), 나트륨 n-부톡사이드(0.3 mL, 0.60 mmol) 및 1 mL의 n-부탄올을 마이크로파 튜브에 연속적으로 첨가하고, 160℃까지 가열하고, 1.5시간 동안 교반하였다. 반응을 중단시키고, 반응 용액을 감압 하에 농축하였다. 잔사를 용리 시스템 A에 의한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 1f를 수득하였다(40 mg, 수율: 52.8%).
MS m/z (ESI): 501.2 [M+1].
단계 4
6-부톡시-1-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 1
화합물 1f(40 mg, 0.08 mmol) 및 2 mL의 트라이플루오로아세트산을 반응 플라스크에 첨가하고, 가열 환류하고, 24시간 동안 교반하였다. 반응을 중단시키고, 반응 용액을 감압 하에 농축하고, 1 mL의 메탄올 중 암모니아를 첨가하였다. 잔사를 전개 용매 시스템 A에 의한 박막 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 1을 수득하였다(15 mg, 수율: 46.0%).
MS m/z (ESI): 381.2 [M+1].
1H NMR (400MHz, CD3OD) 7.98 (s, 1H), 7.41 (d, 2H), 7.36 (d, 2H), 5.48 (s, 2H), 4.39 (t, 2H), 4.13 (s, 2H), 3.12-3.08 (m, 4H), 2.02-1.98 (m, 4H), 1.80-1.76 (m, 2H), 1.55-1.49 (m, 2H), 1.01 (t, 3H).
실시예 1: 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 제조
화학식 I의 화합물(300 mg, 0.788 mmol)을 5 mL의 에탄올 및 에틸 아세테이트의 혼합 용매(V/V = 1:1)에 용해시키고, 용해가 완료될 때까지 교반하고, 30℃까지 가열하였다. 이소프로판올 중 4 M 수소 클로라이드(0.415 mL, 1.66 mmol)를 적가하고, 반응 용액을 실온까지 냉각하고, 16시간 동안 교반하였고, 이러는 중에 대량의 백색 고체가 침전되었다. 반응 용액을 여과하고, 필터 케이크를 수집하고, 진공 하에 건조하여 생성물을 수득하였다(335 mg, 수율: 93%).
1H NMR (400 MHz, CD3OD) 8.23 (s, 1 H), 7.55 (m, 2 H), 7.44 (m, 2 H), 5.55 (s, 2 H), 4.60 (t, 2 H), 4.37 (s, 2 H), 3.40 - 3.57 (m, 2 H), 3.06 - 3.24 (m, 2 H), 2.08 - 2.26 (m, 2 H), 1.91 - 2.08 (m, 2 H), 1.80 - 1.91 (m, 2 H), 1.44 - 1.62 (m, 2 H), 1.01 (t, 3 H).
X-선 분말 회절 검출에 따라서, 결정 형태는 결정 형태 I이고, 이의 XRPD 패턴은 도 1에 도시된다. 이의 DSC 패턴은 도 2에 도시되고; 이의 TGA 패턴은 도 3에 도시되고; DSC 검출 공정 중에, 온도가 150℃까지 상승될 때, 샘플을 취하고, XRPD 검출을 수행하였고, 패턴은 도 4에 도시되고, 결정 형태가 온도 상승 전 및 후에 변하지 않았음을 나타내고; DSC 검출 공정 중에, 온도가 175℃까지 상승될 때, 샘플을 취하고, XRPD 검출을 수행하였고, 패턴은 도 5에 도시되고, 결정 형태가 온도 상승 전 및 후에 변하지 않았음을 나타내고; DVS 수분 흡착 곡선은 도 6 및 도 7에 도시되고, DVS 검출 전 및 후의 XRPD 패턴은 도 8에 도시되고, 결정 형태가 변하지 않음을 나타낸다.
[표 1]
결정 형태 I의 특징적인 피크
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 2: 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 제조
화학식 I의 화합물(40 mg, 0.105 mmol)을 0.5 mL의 아세톤에 용해시키고, 완전히 용해될 때까지 교반하고, 50℃까지 가열하였다. 이소프로판올 중 4 M 수소 클로라이드(0.055 mL, 0.22 mmol)를 적가하고, 반응 혼합물을 실온까지 냉각하고, 72시간 동안 교반하고, 이러는 중에 대량의 백색 고체가 침전되었다. 반응 용액을 여과하고, 필터 케이크를 수집하고, 진공 하에 건조하여 생성물을 수득하였다(20 mg, 수율: 45.6%). X-선 분말 회절 검출에 따라서, 생성물은 결정 형태 I이다.
실시예 3: 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II의 제조
화학식 I의 화합물(40 mg, 0.105 mmol)을 0.5 mL의 이소프로판올 및 테트라하이드로퓨란의 혼합 용매에 용해시키고(V/V = 1:1), 용해가 완료될 때까지 교반하고, 50℃까지 가열하였다. 이소프로판올 중 4 M 수소 클로라이드(0.055 mL, 0.22 mmol)를 적가하고, 반응 용액을 실온까지 냉각하고, 16시간 동안 교반하고, 이러는 중에 백색 고체가 침전되었다. 반응 용액을 여과하고, 필터 케이크를 수집하고, 진공 하에 건조하여 생성물을 수득하였다(25 mg, 수율: 52.5%).
생성물은 X-선 분말 회절 검출에 의해 결정 형태 II로 정의되었고, XRPD 패턴은 도 9에 도시된다. DSC 패턴은 도 10에 도시되고; TGA 패턴은 도 11에 도시된다.
[표 2]
결정 형태 II의 특징적인 피크
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 4: 본 개시내용의 결정 형태 I의 용해도의 측정
본 개시내용에서 수득된 화학식 I의 화합물의 비정형 샘플 및 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I 샘플을 PBS 7.4 및 FaSSIF 용액에서 용해도에 대해 추가로 평가하였다.
시험 결과
[표 3]
화학식 I의 화합물 및 이의 다이하이드로클로라이드의 결정 형태 I의 용해도 시험 결과
Figure pct00009
실시예 5: 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 흡습성의 연구
서피스 메져먼트 시스템즈 어드밴티지 2를 사용하고, 실험을 25℃에서 50%로부터 출발하는 습도에 의해 수행하고, 관찰된 습도 범위는 0 내지 95%이고, 단계 크기는 10%이고, 판단 표준은 질량 변화가 10,000분 내에 0.01% 미만인 것이고, 2회 사이클을 수행하였다.
실험 결과
[표 4]
화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 흡습성의 연구 결과
Figure pct00010
실험 결론
25℃의 조건 하에, 본 개시내용의 화학식 I의 화합물의 결정 형태 I 샘플이 10 내지 90.0% RH의 습도의 증가, 및 6.628%의 중량 변화(15% 미만이지만 2% 이상임)의 증가된 수 흡착을 가짐을 표 4로부터 볼 수 있고, 이는 샘플이 약간 흡습성임을 나타내고; 샘플의 탈착 공정은 기본적으로 10 내지 90.0%의 습도 변화 중의 흡착 공정과 일치하고; DVS 패턴은 도 8에 도시되고, DVS 전 및 후의 X-선 분말 회절 패턴 비교는 결정 형태가 DVS 전 및 후에 변하지 않음을 나타낸다(도 8 참고).
실시예 6: 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I(실시예 1)을 펼치고 도포하지 않고, 샘플의 안정성을 20일의 기간에 걸쳐 가열(40℃, 60℃), 광 조명(4,500 룩스) 및 고 습도(RH 75%, RH 90%) 하에 평가하였다.
실험 결과
[표 5]
영향 인자의 실험 결과
Figure pct00011
표 5의 영향 인자의 실험 결과는 결정 형태 I의 물리적 및 화학적 안정성이 40℃ 및 60℃의 고온, 광 조명 및 75% 및 90%의 고 습도의 조건 하에 양호함을 나타낸다.
실시예 7: 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A의 제조
500 mg의 화학식 I의 화합물을 정확히 칭량하고, 12.5 mL의 아세토니트릴을 첨가하고, 용해될 때까지 교반하고, 이어서 50℃까지 가열하였다. 53.1 mg의 농축 염산을 신속하게 첨가하고, 혼탁성이 즉시 나타났다. 수득된 혼합물을 50℃에서 유지하고, 2시간 동안 밀봉된 상태에서 교반하고, 자연적으로 실온까지 냉각하고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 수득된 침전물을 50℃에서 건조하였다. 이온 크로마토그래피의 결과에 따라, 생성물은 8.4%의 Cl- 수를 가지고, 이는 계산을 통해 1개의 클로라이드 이온을 가짐을 의미한다. X-분말 회절 검출을 통해, 결정 형태는 결정 형태 A이고, XRPD 패턴은 도 12에 도시된다. DSC 패턴은 도 13에 도시된다.
[표 6]
결정 형태 A의 특징적인 피크
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 8: 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B의 제조
500 mg의 화학식 I의 화합물을 정확히 칭량하고, 12.5 mL의 에틸 아세테이트를 첨가하고, 용해될 때까지 교반하고, 이어서 50℃까지 가열하였다. 53.1 mg의 농축 염산을 신속하게 첨가하고, 혼탁성이 즉시 나타났다. 수득된 혼합물을 50℃에서 유지하고, 2시간 동안 밀봉된 상태에서 교반하고, 자연적으로 실온까지 냉각하고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 수득된 침전물을 50℃에서 건조하였다. 이온 크로마토그래피의 결과에 따라, 생성물은 8.4%의 Cl- 수를 가지고, 이는 계산을 통해 1개의 클로라이드 이온을 가짐을 의미한다. X-분말 회절 검출을 통해, 결정 형태는 결정 형태 B이고, XRPD 패턴은 도 14에 도시된다. DSC 패턴은 도 15에 도시된다.
[표 7]
결정 형태 B의 특징적인 피크
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 9: 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C의 제조
500 mg의 화학식 I의 화합물을 정확히 칭량하고, 12.5 mL의 1,4-다이옥산을 첨가하고, 용해될 때까지 교반하고, 이어서 50℃까지 가열하였다. 53.1 mg의 농축 염산을 신속하게 첨가하고, 혼탁성이 즉시 나타났다. 수득된 혼합물을 50℃에서 유지하고, 2시간 동안 밀봉된 상태에서 교반하고, 자연적으로 실온까지 냉각하고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 수득된 침전물을 50℃에서 건조하였다.
이온 크로마토그래피의 결과에 따라, 생성물은 8.4%의 Cl- 수를 가지고, 이는 계산을 통해 1개의 클로라이드 이온을 가짐을 의미한다. X-분말 회절 검출을 통해, 결정 형태는 결정 형태 C이고, XRPD 패턴은 도 16에 도시된다.
[표 8]
결정 형태 C의 특징적인 피크
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 10: 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A(실시예 7)를 펼치고 도포하지 않고, 샘플의 안정성을 20일의 기간에 걸쳐 가열(40℃, 60℃), 광 조명(4,500 룩스), 고 습도(RH 75%, RH 90%) 조건 하에 평가하였다.
실험 결과
[표 9]
영향 인자의 실험 결과
Figure pct00018
결과는 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A가 상기 조건 하에 양호한 화학적 안정성을 갖고, 불순물의 유의한 증가가 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 11: 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B(실시예 8)를 펼치고 도포하지 않고, 샘플의 안정성을 20일의 기간에 걸쳐 가열(40℃, 60℃), 광 조명(4,500 룩스), 고 습도(RH 75%, RH 90%) 조건 하에 평가하였다.
실험 결과
[표 10]
영향 인자의 실험 결과
Figure pct00019
결과는 모노하이드로클로라이드의 결정 형태 B가 상기 조건 하에 양호한 화학적 안정성을 갖고, 불순물의 유의한 증가가 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 12: 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C(실시예 9)를 펼치고 도포하지 않고, 샘플의 안정성을 20일의 기간에 걸쳐 가열(40℃, 60℃), 광 조명(4,500 룩스), 고 습도(RH 75%, RH 90%) 조건 하에 평가하였다.
실험 결과
[표 11]
영향 인자의 실험 결과
Figure pct00020
결과는 모노하이드로클로라이드의 결정 형태 C가 상기 조건 하에 양호한 화학적 안정성을 갖고, 불순물의 유의한 증가가 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 13: 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 3개의 회분을 25℃ ±2℃, 60% RH ±5% RH의 조건 하에 9개월 동안 장기 안정성에 대해 조사하였다. 결과는 표 12에 제시된다.
[표 12]
화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 장기 안정성의 조사
Figure pct00021
표 12의 장기 안정성 시험 결과는 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I이 9개월 동안 25℃, 60% RH의 안정성 조건 하에 양호한 물리적 및 화학적 안정성을 가짐을 나타낸다.
시험 실시예:
생물학적 평가
시험 실시예 1: 인간 TLR7에 대한 화학식 I의 화합물의 작용성 효과의 측정
HEK-블루(Blue, 상표) hTLR7 안정적으로 형질감염된 세포에서 발현된 hTLR7 단백질에 대한 화학식 I의 화합물의 작용성 효과를 하기 실험 방법에 의해 측정하였다:
I. 실험 재료 및 기기
1. DMEM[깁코(Gibco), 10564-029],
2. 소 태아 혈청(깁코, 10099),
3. 페니실린-스트렙토마이신(깁코, 15140-122),
4. 노르모신[인비보겐(Invivogen), ant-nr-1],
5. 블라스티신딘(인비보겐, ant-bl-1),
6. 제오신(인비보겐, ant-zn-1),
7. 플렉스스테이션 3 다작용 마이크로플레이트 판독기[몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices)],
8. HEK-블루(상표) hTLR7 세포주(인비보겐, hkb-hTLR7),
9. HEK-블루 검출 시약(인비보겐, hb-det3).
II. 실험 과정
HEK-블루 검출 무수 분말의 백을 엔도톡신이 부재하는 50 mL의 물에 용해시키고, 이어서 용액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이터에 위치시키고, 이어서, 멸균 여과하여 HEK-블루 검출 매질을 제조하였다. 화합물을 먼저 20 mM 저장 용액으로 제형화시키고, 이어서 순수한 DMSO로 6 x 106 nM의 최대 농도까지 희석하고, 총 10 포인트를 3-배 구배 희석에 의해 수득하였다.
상기 제형화된 화합물을 먼저 상기 매질로 20-배 희석하고, 이어서 20 μL의 희석된 화합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 상청액을 HEK-블루(상표) hTLR7 세포로부터 제거하고, 이어서 2 내지 5 mL의 예비-가온된 PBS를 첨가하였다. 세포를 인큐베이터에 1 내지 2분 동안 위치시키고, 적절히 피펫팅하고, 트리판 블루 염색에 의해 계수하였다. 세포를 HEK-블루 검출 매질에 재현탁시키고, 농도를 2.2 x 105개 세포/mL로 조정하였다. 180 μL의 세포를 20 μL의 화합물이 첨가된 상기 96-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 6 내지 16시간 동안 항온처리하였다.
상기 플레이트를 620 nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. 상응하는 OD 값을 수득하고, 상기 화합물의 EC50 값을 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)에 의해 계산하였다.
인간 TLR7에 대한 화학식 I의 화합물의 자용성 효과를 상기 시험에 의해 측정하고, 측정된 EC50 값은 28 nM였다.
결론: 화학식 I의 화합물은 인간 TLR7에 대한 유의한 작용성 효과를 가진다.
시험 실시예 2: 인간 TLR8에 대한 화학식 I의 화합물의 작용성 효과의 측정
HEK-블루(상표) hTLR8 안정적으로 형질감염된 세포 hTLR8 단백질에 대한 화학식 I의 화합물의 작용성 효과를 하기 실험 방법에 의해 측정하였다:
I. 실험 재료 및 기기
1. DMEM(깁코, 10564-029),
2. 소 태아 혈청(깁코, 10099),
3. 페니실린-스트렙토마이신(깁코, 15140-122),
4. 노르모신(인비보겐, ant-nr-1),
5. 블라스티신딘(인비보겐, ant-bl-1),
6. 제오신(인비보겐, ant-zn-1),
7. 플렉스스테이션 3 다작용 마이크로플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시스),
8. HEK-블루(상표) hTLR8 세포주(인비보겐, hkb-hTLR7),
9. HEK-블루 검출 시약(인비보겐, hb-det3),
II. 실험 과정
HEK-블루 검출 무수 분말의 백을 엔도톡신이 없는 50 mL의 물에 용해시키고, 이어서 용액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이터에 위치시키고, 이어서, 멸균 여과하여 HEK-블루 검출 매질을 제조하였다. 화합물을 먼저 20 mM 저장 용액으로 제형화시키고, 이어서 순수한 DMSO로 6 x 106 nM의 최대 농도까지 희석하고, 총 10 포인트를 3-배 구배 희석에 의해 수득하였다. 화합물을 먼저 상기 매질로 20-배 희석하고, 이어서 20 μL의 희석된 화합물을 각각의 웰에 첨가하였다.
상청액을 HEK-블루 hTLR8 세포로부터 제거하고, 이어서 2 내지 5 mL의 사전-가온된 PBS를 첨가하였다. 세포를 인큐베이터에 1 내지 2분 동안 위치시키고, 적절히 피펫팅하고, 트리판 블루 염색에 의해 계수하였다. 세포를 HEK-블루 검출 매질에 재현탁하고, 농도를 2.2 x 105개 세포/mL로 조정하였다. 180 μL의 세포를 20 μL의 화합물이 첨가된 상기 96-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 6 내지 16시간 동안 항온처리하였다.
상기 플레이트를 620 nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. 상응하는 OD 값을 수득하고, 화합물의 EC50 값을 그래프패드 프리즘에 의해 계산하였다.
인간 TLR8에 대한 화학식 I의 화합물의 작용성 효과를 상기 시험에 의해 측정하고, 측정된 EC50 값은 30,000 nM 초과, Emax 8%였다.
결론: 화학식 I의 화합물은 인간 TLR8에 대한 작용성 효과를 갖지 않았고, 화학식 I의 화합물이 TLR7에 대한 고도의 선택성을 가짐을 나타낸다.
시험 실시예 3: 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 IFN-α의 분비를 자극하는 본 개시내용의 화합물의 능력의 측정
PBMC로부터 IFN-α의 분비를 자극하는 본 개시내용의 화합물의 능력을 하기 하기 실험 방법에 의해 측정하였다:
I. 실험 재료 및 기기
1. RPMI 1640[인비트로겐(Invitrogen), 11875],
2. FBS(깁코, 10099-141),
3. 페니실린-스트렙토마이신(깁코, 15140-122),
4. 피콜-페이크 프리미엄(Ficoll-Paque PREMIUM)[지이(GE), 17-5442-02],
5. 트리판 블루 용액[시그마(Sigma), T8154-100ML],
6. 셉메이트(SepMate, 상표)-50[스템셀(Stemcell), 15460],
7. 브라이트-라인(Bright-Line, 상표) 혈액 세포 계수기(시그마, Z359629-1EA),
8. 96-웰 평저 플레이트[코닝(Corning), 3599],
9. 96-웰 v 바닥 플레이트(코닝, 3894),
10. 인간 IFN-α 키트[시스바이오(cisbio), 6FHIFPEB],
11. 페라스타(PHERAStar) 다작용 마이크로플레이트 판독기[비엠쥐(BMG), 페라스타].
II. 실험 과정
화합물을 순수한 DMSO로 5 mM의 최대 농도까지 희석하고, 총 9 포인트를 4-배 구배 희석에 의해 수득하였다. 이어서, 4 μL의 화합물을 10% FBS를 함유하는 196 μL의 RMPI 1640 매질에 첨가하고, 웰을 혼합하였다. 50 μL의 혼합물을 각각의 웰로부터 취하고, 새로운 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하였다.
모든 시약을 실온까지 평형화시켰다. 60 mL의 혈액 및 PBS + 2% FBS를 250 mL 배양 플라스크에 첨가하고, 적절히 피펫팅하고, 웰을 혼합하고, 희석하였다. 15 mL의 림프구 분리 용액 피콜-페이크 프리미엄 및 이어서 30 mL의 희석된 혈액을 50 mL PBMC 원심분리 튜브 셉메이트(상표)-50에 첨가하였다. 혼합물을 1,200 g로 10분 동안 실온에서 원심분리하였다. 상청액을 취하고, 이어서 300 g로 8분 동안 원심분리하였다. 세포를 10% FBS를 함유하는 RMPI 1640 매질에 재현탁하고, 계수하고, PBMC의 수를 3.33 x 106개 세포/mL로 조정하였다. 150 μL의 세포 용액을 화합물이 첨가된 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5.0% CO2에서 24시간 동안 인큐베이터에서 항온처리하였다.
세포 배양 플레이트를 원심분리기에 위치시키고, 1,200 rpm으로 10분 동안 실온에서 원심분리하였다. 150 μL의 상청액을 각각의 웰에서 취하였다. 인간 IFN-α 키트의 시약을 정상 온도로 먼저 평형화시켰다. 항-IFN-α-Eu3+-크립테이트 접합체 및 항-IFN-α-d2-접합체를 키트 설명서에 따라 어둠에서 제형화시키고, 이들 둘 다 1:40의 비로 접합체 완충액과 잘 혼합하였다. 이어서, 원심분리에 의해 수득된 16 μL의 상청액을 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 2 μL의 제조된 항-IFN-α-Eu3+-크립테이트 접합체 및 항-IFN-α-d2-접합체를 각각의 웰에 첨가하고, 진탕에 의해 잘 혼합하였다. 세포를 실온에서 3시간 동안 어둠에서 항온처리하였다.
플레이트를 HTRF 방식으로 페라스타로 판독하였다. 최소 검출 한계보다 3배 이상 큰 사이토카인 수준을 자극하는 최저 화합물 농도를 사이토카인 자극 시험에서 화합물의 최소 효과 농도(MEC) 값으로 정의하였다.
PBMC로부터 IFN-α의 분비를 자극하는 화학식 I의 화합물의 능력을 상기 시험에 의해 측정하였고, 측정된 MEC 값은 6 nM였다.
결론: PBMC로부터 IFN-α의 분비를 자극하는 활성의 데이터에 기초하여, 화학식 I의 화합물이 더 낮은 효과 농도의 이점을 가짐을 볼 수 있다.
시험 실시예 4: 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 미다졸람 대사 부위의 효소 활성에 대한 화학식 I의 화합물의 억제 효과
인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 미다졸람 대사 부위의 효소 활성에 대한 화학식 I의 화합물의 효과를 하기 실험 방법에 의해 측정하였다:
I. 실험 재료 및 기기
1. 포스페이트 완충액(PBS),
2. NADPH(시그마 N-1630),
3. 인간 간 간 마이크로솜[코닝 젠테스트(Corning Gentest)],
4. ABI QTrap 4000 액체 크로마토그래피/질량 분광계[에이비 사이엑스(AB Sciex)],
5. 이너트실(Inertsil) C8-3 컬럼, 4.6 x 50 mm, 5 μm[디크마 테크놀로지스 인코포레이티드(Dikma Technologies Inc.), 미국 소재],
6. CYP 프로브 기질(미다졸람/10 μM) 및 양성 대조군 억제제(케토코나졸).
II. 실험 과정
100 mM PBS 완충액을 제형화시키고, 이어서 이를 사용하여 2.5 mg/mL 마이크로솜 용액 및 5 mM NADPH 용액을 제형화시켰다. 5X 농도의 화합물 작업 용액을 PBS 구배(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM)로 희석하였다. 5X 농도의 케토코나졸 작업 용액을 PBS 구배(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM)로 희석하였다. 덱스트로메토판 작업 용액을 PBS로 50 μM의 농도까지 희석하였다.
20 μL의 2.5 mg/mL 마이크로솜 용액, 20 μL의 50 μM 테스토스테론 작업 용액, 20 μL의 MgCl2 용액 및 20 μL의 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM, 각각의 농도에 대해 상이한 반응 시스템)을 각각 취하고, 잘 혼합하였다. 양성 대조군의 경우, 화합물을 동일한 농도의 케토코나졸로 대체하였다. 혼합물을 5 mM NADPH 용액과 함께 37℃에서 5분 동안 사전-항온처리하였다. 5분 후, 20 μL의 NADPH를 각각의 웰에 첨가하고, 반응을 개시시키고, 30분 동안 항온처리하였다. 모든 항온처리된 샘플을 이중으로 제공하였다. 30분 후, 내부 표준을 함유하는 250 μL의 아세토니트릴을 모든 샘플에 첨가하고, 잘 혼합하고, 800 rpm으로 10분 동안 진탕하고, 이어서 3,700 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 80 μL의 상청액을 취하고, LC-MS/MS에 의해 분석하였다.
데이터를 그래프패드 프리즘에 의해 계산하여 CYP3A4의 미다졸람 대사 부위에 대한 화합물의 IC50 값을 수득하였다.
화학식 I의 화합물은 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 미다졸람 대사 부위에 대한 억제 효과를 갖지 않고, 측정된 IC50 값은 14 μM였다.
결론: 화학식 I의 화합물은 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 미다졸람 대사 부위에 대한 억제 효과를 갖지 않고 양호한 안전성을 나타내고, 미다졸람 대사 부위에 기초한 대사 약물 상호작용이 발생하지 않을 것을 시사한다.
시험 실시예 5: 인간 간 마이크로솜에서 CYP2D6의 효소 활성에 대한 화학식 I의 화합물의 억제 효과
인간 간 마이크로솜에서 CYP2D6의 효소 활성에 대한 화학식 I의 화합물의 효과를 하기 실험 방법에 의해 측정하였다:
I. 실험 재료 및 기기
1. 포스페이트 완충액(PBS),
2. NADPH(시그마 N-1630),
3. 인간 간 마이크로솜(코닝 젠테스트),
4. ABI QTrap 4000 액체 크로마토그래피/질량 분광계(에이비 사이엑스),
5. 이너트실 C8-3 컬럼, 4.6 x 50 mm, 5 μm(디크마 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 소재),
6. CYP 프로브 기질(덱스트로메토판/10 μM), 및 양성 대조군 억제제(퀴니딘).
II. 실험 과정
100 mM PBS 완충액을 제형화시키고, 이어서 이를 사용하여 2.5 mg/mL 마이크로솜 용액 및 5 mM NADPH 용액을 제형화시켰다. 5X 농도의 화합물 작업 용액을 PBS 구배(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM)로 희석하였다. 5X 농도의 퀴니딘 작업 용액을 PBS 구배(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM)로 희석하였다. 덱스트로메토판 작업 용액을 PBS로 50 μM의 농도까지 희석하였다.
20 μL의 2.5 mg/mL 마이크로솜 용액, 20 μL의 50 μM 테스토스테론 작업 용액, 20 μL의 MgCl2 용액 및 20 μL의 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM, 각각의 농도에 대해 상이한 반응 시스템)을 각각 취하고, 잘 혼합하였다. 양성 대조군의 경우, 화합물을 동일한 농도의 퀴니딘으로 대체하였다. 혼합물을 5 mM NADPH 용액과 함께 37℃에서 5분 동안 사전-항온처리하였다. 5분 후, 20 μL의 NADPH를 각각의 웰에 첨가하고, 반응을 개시시키고, 30분 동안 항온처리하였다. 모든 항온처리된 샘플을 이중으로 제공하였다. 30분 후, 내부 표준을 함유하는 250 μL의 아세토니트릴을 모든 샘플에 첨가하고, 잘 혼합하고, 800 rpm으로 10분 동안 진탕하고, 이어서 3,700 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 80 μL의 상청액을 취하고, LC-MS/MS에 의해 분석하였다.
데이터를 그래프패드 프리즘에 의해 계산하여 CYP2D6의 대사 부위에 대한 화합물의 IC50 값을 수득하였다.
화학식 I의 화합물은 CYP2D6에 대한 억제 효과를 갖지 않고, 측정된 IC50 값은 30 μM 초과였다.
결론: 화학식 I의 화합물은 인간 간 마이크로솜에서 CYP2D6의 효소 활성에 대한 억제 효과를 갖지 않고, CYP2D6에 기초한 대사 약물 상호작용이 발생하지 않을 것임을 시사한다.
시험 실시예 6: 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 테스토스테론 대사 부위의 효소 활성에 대한 화학식 I의 화합물의 억제 효과
인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 테스토스테론 대사 부위의 효소 활성에 대한 화학식 I의 화합물의 효과를 하기 실험 방법에 의해 측정하였다:
I. 실험 재료 및 기기
1. 포스페이트 완충액(PBS),
2. NADPH(시그마 N-1630),
3. 인간 간 마이크로솜(코닝 젠테스트),
4. ABI QTrap 4000 액체 크로마토그래피/질량 분광계(에이비 사이엑스),
5. 이너트실 C8-3 컬럼, 4.6 x 50 mm, 5 μm(디크마 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 소재),
6. CYP 프로브 기질(테스토스테론/100 μM), 및 양성 대조군 억제제(케토코나졸).
II. 실험 과정
100 mM PBS 완충액을 제형화시키고, 이어서 이를 사용하여 2.5 mg/mL 마이크로솜 용액 및 5 mM NADPH 용액을 제형화시켰다. 5X 농도의 화합물 작업 용액을 PBS 구배(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM)로 희석하였다. 5X 농도의 케토코나졸 작업 용액을 PBS 구배(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM)로 희석하였다. 덱스트로메토판 작업 용액을 PBS로 50 μM의 농도까지 희석하였다.
20 μL의 2.5 mg/mL 마이크로솜 용액, 20 μL의 50 μM 테스토스테론 작업 용액, 20 μL의 MgCl2 용액 및 20 μL의 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0 μM, 각각의 농도에 대한 상이한 반응 시스템)을 각각 취하고, 잘 혼합하였다. 양성 대조군의 경우, 화합물을 동일한 농도의 케토코나졸로 대체하였다. 혼합물을 5 mM NADPH 용액과 함께 37℃에서 5분 동안 사전-항온처리하였다. 5분 후, 20 μL의 NADPH를 각각의 웰에 첨가하고, 반응을 개시시키고, 30분 동안 항온처리하였다. 모든 항온처리된 샘플을 이중으로 제공하였다. 30분 후, 내부 표준을 함유하는 250 μL의 아세토니트릴을 모든 샘플에 첨가하고, 잘 혼합하고, 800 rpm으로 10분 동안 진탕하고, 이어서 3,700 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 80 μL의 상청액을 취하고, LC-MS/MS로 분석하였다.
데이터를 그래프패드 프리즘에 의해 계산하여 CYP3A4의 테스토스테론 대사 부위에 대한 화합물의 IC50 값을 수득하였다.
인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 테스토스테론 대사 부위에 대한 화학식 I의 화합물의 측정된 IC50 값(실시예 1)은 4 μM였다.
결론: 화학식 I의 화합물은 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 테스토스테론 대사 부위에 대한 약한 억제 효과를 가지고, 더 양호한 안전성을 나타낸다.

Claims (25)

  1. 하기 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염:
    [화학식 I]
    Figure pct00022
    .
  2. 제1항에 있어서,
    하이드로클로라이드 염이 다이하이드로클로라이드 염 또는 모노하이드로클로라이드 염인, 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염.
  3. X-선 분말 회절 패턴이 7.182, 8.520, 12.275, 15.057, 15.614, 20.994, 21.804 및 22.934의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 하기 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I:
    [화학식 I]
    Figure pct00023
    .
  4. 제3항에 있어서,
    7.182, 8.520, 11.152, 12.275, 15.057, 15.614, 15.902, 17.162, 20.384, 20.994, 21.804, 22.934, 24.360, 26.260, 26.630, 27.209 및 29.724의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I.
  5. 제4항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴이 7.182, 7.722, 8.520, 11.152, 12.275, 15.057, 15.614, 15.902, 17.162, 20.384, 20.994, 21.804, 22.934, 24.360, 25.320, 26.260, 26.630, 27.209, 27.920, 29.724, 30.720 및 32.270의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I.
  6. X-선 분말 회절 패턴이 8.479, 9.999, 10.801, 12.461, 13.725, 14.120, 15.761, 17.020, 18.680, 20.135, 20.558, 20.863, 21.641, 22.960, 24.202, 24.541, 26.240, 26.660, 28.262 및 28.681의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 하기 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II:
    [화학식 I]
    Figure pct00024
    .
  7. 제6항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴이 5.002, 7.202, 8.479, 9.999, 10.801, 11.220, 11.995, 12.461, 13.725, 14.120, 15.761, 16.484, 17.020, 18.680, 20.135, 20.558, 20.863, 21.289, 21.641, 22.319, 22.960, 24.202, 24.541, 26.240, 26.660, 27.196, 28.262, 28.681, 29.518, 31.017, 31.355, 32.725, 33.198, 36.810, 37.880, 39.335 및 41.004의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II.
  8. X-선 분말 회절 패턴이 9.647, 13.306, 13.644, 14.936, 17.533, 18.866, 20.261 및 22.515의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 하기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A:
    [화학식 I]
    Figure pct00025
    .
  9. 제8항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴이 9.647, 13.018, 13.306, 13.644, 14.936, 17.533, 18.866, 20.261, 20.836, 21.038, 21.684, 22.515, 24.775, 25.396, 26.306, 27.095, 28.182, 28.742, 29.621 및 30.388의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A.
  10. X-선 분말 회절 패턴이 12.421, 13.937, 17.095, 17.492, 18.647, 19.317, 21.823, 22.183 및 26.321의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 하기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B:
    [화학식 I]
    Figure pct00026
    .
  11. 제10항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴이 7.094, 12.421, 13.937, 14.900, 15.837, 17.095, 17.492, 18.647, 19.317, 21.823, 22.183, 23.777, 24.391, 26.321, 26.857, 27.432, 29.918 및 30.946의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B.
  12. X-선 분말 회절 패턴이 9.641, 10.199, 12.176, 15.950, 17.288, 18.579, 19.859, 20.675, 21.083, 21.838 및 24.628의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 하기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C:
    [화학식 I]
    Figure pct00027
    .
  13. 제12항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴이 9.641, 10.199, 12.176, 12.542, 13.302, 15.118, 15.592, 15.950, 17.288, 18.579, 19.547, 19.859, 20.675, 21.083, 21.838, 23.795, 23.963, 24.628, 25.222, 26.914, 28.068, 28.886 및 30.179의 2θ 각에서 특징적인 피크를 갖는, 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C.
  14. 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    2θ 각의 오차 범위가 ±0.2인, 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드의 결정 형태.
  15. 제1항에 정의된 화학식 I의 화합물을 염산으로 염화시키기는 단계를 포함하는, 제1항에 정의된 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염의 제조 방법.
  16. 방법 i) 제3항 내지 제5항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 I을 수득하는 방법; 및
    방법 ii) 상기 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 I을 수득하는 방법
    으로부터 선택되는, 상기 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I의 제조 방법으로서,
    결정화 방법이 실온에서의 결정화, 냉각에 의한 결정화, 용매의 휘발에 의한 결정화, 및 결정화를 유도하기 위한 종결정의 첨가에 의한 결정화로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매가 이소프로판올-테트라하이드로퓨란의 혼합 용매를 포함하지 않고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매가 에터 용매, 알코올 용매, 에스터 용매, 케톤 용매, 니트릴 용매 및 할로겐화된 탄화수소 용매로부터 선택되는 하나 이상의 용매이고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 에터 용매가 테트라하이드로퓨란, 다이에틸 에터, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에터, 메틸 tert-부틸 에터, 이소프로필 에터 및 1,4-다이옥산으로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 알코올 용매가 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 이소펜탄올 및 트라이플루오로에탄올로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 에스터 용매가 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 및 부틸 아세테이트로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 케톤 용매가 아세톤, 아세토페논, 이소부틸 메틸 케톤 및 메틸 피롤리돈으로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 니트릴 용매가 아세토니트릴 및 프로피오니트릴로부터 선택되고; 상기 할로겐화된 탄화수소 용매가 클로로메탄, 다이클로로메탄, 클로로폼 및 탄소 테트라클로라이드로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 염산의 양이 상기 화학식 I의 화합물의 물질의 양의 2 내지 30배, 바람직하게는 2 내지 15배, 가장 바람직하게는 2 내지 5배인,
    제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    방법 i) 또는 방법 ii)에서, 결정화를 위한 용매가 테트라하이드로퓨란, 이소프로필 에터, 1,4-다이옥산, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 다이클로로메탄, 이소프로판올-이소프로필 아세테이트, 이소프로판올-이소프로필 에터, 이소프로판올-다이옥산, 에탄올-다이옥산, 에탄올-테트라하이드로퓨란, 에탄올-이소프로필 에터, 에탄올-이소프로필 아세테이트, 에탄올-아세토니트릴, 이소프로판올-아세토니트릴, 메탄올-이소프로필 에터, 메탄올-이소프로필 아세테이트, 메탄올-아세토니트릴, 다이클로로메탄-테트라하이드로퓨란, 이소프로판올-테트라하이드로퓨란, 이소프로판올-에틸 아세테이트 및 메탄올-에틸 아세테이트로부터 선택되는, 제조 방법.
  18. 제6항, 제7항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 II를 수득하는 방법을 포함하는, 상기 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II의 제조 방법으로서,
    상기 결정화를 위한 용매가 이소프로판올-테트라하이드로퓨란의 혼합 용매이고; 상기 염산의 양이 상기 화학식 I의 화합물의 물질의 양의 2 내지 30배, 바람직하게는 2 내지 15배, 가장 바람직하게는 2 내지 5배인, 제조 방법.
  19. 방법 i) 제8항, 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 A를 수득하는 방법; 및
    방법 ii) 상기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 A를 수득하는 방법으로부터 선택되는, 상기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A의 제조 방법으로서,
    결정화 방법이 실온에서의 결정화, 냉각에 의한 결정화, 용매의 휘발에 의한 결정화, 및 결정화를 유도하기 위한 종결정의 첨가에 의한 결정화로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매가 니트릴 용매 및 케톤 용매로부터 선택되는 하나 이상의 용매이고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 케톤 용매가 아세톤, 아세토페논, 메틸 이소부틸 케톤 및 메틸 피롤리돈으로부터 선택되고, 바람직하게는 아세톤이고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 니트릴 용매가 아세토니트릴 및 프로피오니트릴로부터 선택되고, 바람직하게는 아세토니트릴이고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 염산의 양이 상기 화학식 I의 화합물의 물질의 양의 1 내지 2배인,
    제조 방법.
  20. 방법 i) 제10항, 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 B를 수득하는 방법; 및
    방법 ii) 상기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 B를 수득하는 방법으로부터 선택되는, 상기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B의 제조 방법으로서,
    결정화 방법이 실온에서의 결정화, 냉각에 의한 결정화, 용매의 휘발에 의한 결정화, 및 결정화를 유도하기 위한 종결정의 첨가에 의한 결정화로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매가 에스터 용매로부터 선택되고, 상기 에스터 용매가 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 및 부틸 아세테이트로부터 선택되고, 바람직하게는 에틸 아세테이트이고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 염산의 양이 상기 화학식 I의 화합물의 물질의 양의 1 내지 2배인,
    제조 방법.
  21. 방법 i) 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 정화시키고, 염산을 첨가하고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 C를 수득하는 방법; 및
    방법 ii) 상기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염을 결정화를 위한 용매에 위치시키고, 결정화시키고, 여과하고, 건조하여 목표 결정 형태 C를 수득하는 방법
    으로부터 선택되는, 상기 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C의 제조 방법으로서,
    결정화 방법이 실온에서의 결정화, 냉각에 의한 결정화, 용매의 휘발에 의한 결정화, 및 결정화를 유도하기 위한 종결정의 첨가에 의한 결정화로부터 선택되고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 결정화를 위한 용매가 에터 용매, 테트라하이드로퓨란, 다이에틸 에터, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에터, 메틸 tert-부틸 에터, 이소프로필 에터 및 1,4-다이옥산으로부터 선택되고, 바람직하게는 1,4-다이옥산이고;
    상기 방법 i) 또는 방법 ii)에서, 상기 염산의 양이 화학식 I의 화합물의 물질의 양의 1 내지 2배인,
    제조 방법.
  22. 하나 이상의 제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 제3항 내지 제5항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I, 제6항, 제7항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II, 제8항, 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 제10항, 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B, 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C; 및
    하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제
    를 포함하는 약학 조성물.
  23. 성분을 혼합하는 단계를 포함하는, 제22항에 따른 약학 조성물의 제조 방법.
  24. 뎅기 바이러스, 플라비바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 쿤진(Kunjin) 바이러스, 머레이 밸리(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 세인트 루이스(Saint Louis) 뇌염 바이러스, 옴스크(Omsk) 출혈 열 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, HIV, HBV, HCV, HPV, RSV, SARS 및/또는 인플루엔자 바이러스로부터 선택되는 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염의 치료용 약제의 제조에 있어서, 제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 제3항 내지 제5항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I, 제6항, 제7항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II, 제8항, 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 제10항, 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B, 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C의 용도.
  25. 흑색종, 비소세포 폐암, 간세포 암종, 기저세포 암종, 신세포 암종, 방광암, 골수종, 알러지 비염, 천식, COPD, 궤양성 대장염 및/또는 간 섬유증의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 I의 화합물의 하이드로클로라이드 염, 제3항 내지 제5항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 I, 제6항, 제7항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 다이하이드로클로라이드 염의 결정 형태 II, 제8항, 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 A, 제10항, 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 B, 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 화합물의 모노하이드로클로라이드 염의 결정 형태 C의 용도.
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