KR20210013136A - 미생물 감염의 치료에서 사용을 위한 딜티아젬 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기도 및/또는 장관의 상피에 영향을 미치는 적어도 하나의 병원성 미생물이 관여되는 감염의 예방 및/또는 치료를 위한, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

Description

미생물 감염의 치료에서 사용을 위한 딜티아젬

본 발명은 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 화합물에 관한 것이다.

보다 특히, 본 발명은 기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 화합물에 관한 것이다.

기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물에 의한 감염

급성 호흡기 감염 (ARI)은 전세계적으로 진찰, 입원 및 사망의 주요한 원인 중 하나이고, 특히 년간 거의 2백만명이 사망하는 유아 사망의 주된 원인이다. 해마다, 이들 다양한 호흡기 감염을 치료하려는 노력으로서, 사회 비용이 15억 내지 20억 유로로 추산된다.

ARI의 원인이 되는 병인원 중에는, 바이러스가 압도적으로 우세하다. 그들은 소아 폐렴의 대부분의 사례에서 발견되고 성인의 박테리아성 폐렴의 소인이 된다. 빈도 및 이환율 관점에서 가장 대표적인 바이러스는 또한 재발성 대유행 위험 인자인 인플루엔자 A 및 B 바이러스를 비롯하여, 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV 또는 hVRS), 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV) 및 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV)를 포함한다. 더 나아가서, 코로나바이러스과 (Coronaviridae)의 신규 바이러스, 예컨대 SARS 및 최근 보고된 MERS-CoV 바이러스의 출현은 심각한 신생의 건강 문제가 될 가능성이 높다.

ARI의 원인이 되는 다른 병인원은 박테리아이다. 가장 대표적인 병원성 박테리아는 에스. 뉴모니아 (S. pneumonia), 피. 애루지노사 (P. aeruginosa), 에스. 아우레우스 (S. aureus) 및 에이치. 인플루엔자 (H. influenza)를 포함한다. 이들 병원성 박테리아는 호흡기 동시-감염에서 증가된 동반-이환 및 동반-사망의 원인이 되고 인간과 동물 둘 모두에서 통상의 항생제 치료의 효능에 근본적으로 도전이 되는 항생제-내성 박테리아 균주의 출현 및 점차적인 확산의 원인이 되는 병인원이다.

인플루엔자 바이러스를 제외하고, 현재 이들 다양한 호흡기 병원성 바이러스에 의한 감염을 예방하거나 또는 치료하는데 유효한 백신 또는 항바이러스 분자가 존재하지 않는다. 게다가, 인플루엔자 바이러스의 경우에, 백신접종의 가변적 효능 및 전달 일정을 비롯하여 항바이러스제에 내성인 바이러스의 증가적인 출현이 현재 매우 우려되고 있다.

호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV) 및 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV)에 대해 특이적인 백신이나 또는 치료가 현재 존재하지 않는다. 뉴모바이러스과 (Pneumoviridae)의 이들 바이러스는 절편화되지 않은 단일 가닥 네거티브 RNA 게놈을 갖는, 엔벨로프 바이러스 (150 내지 600 nm)이다. F 및 G 단백질을 코딩하는 유전자의 계통발생적 분석은 hRSV 처럼, hMPV를 각각 2개의 주요 그룹 A 및 B로 분류할 수 있게 하고, 이들 그룹 각각은 2개의 하위 그룹 A1, A2, B1 또는 B2으로 세분가능하다. 이들 뉴모바이러스와 연관된 병상은 주로 소아 모세기관지염, 성인에서 감기 및 독감-유사 질병, 또는 노년층 또는 면역억제 환자에서 중증 폐렴이다.

유사하게, 인간 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV)에 대한 특이적 백신 또는 치료가 현재 존재하지 않는다. 이들 바이러스는 1950년대 후반에 발견된, 엔벨로프 바이러스 (150 내지 250 nm)이고, 단일-가닥 네거티브 RNA 게놈을 가지며, 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae)에 속한다. 그들은 유전적으로 그리고 항원에 따라 4개 유형 (1 내지 4)로 분류된다. hPIV-4의 다른 주요한 아형 (A 및 B) 및 hPIV-1 및 hPIV-3의 서브그룹/유전자형이 기술되었었다. hPIV-1 내지 hPIV-3 바이러스는 유아, 소아, 면역억제 개체, 만성 질환자 및 노령층에서 하기도 감염의 주요 원인이다. 그들은 특히 폐렴을 초래할 수 있다.

중복감염의 원인이 되는 병원성 박테리아의 항생제 내성과 관련하여, 유럽 질병 예방 및 통제 센터 (European Centre for Disease Control)는 유럽에서 년간 25 000명의 사망이 항생제 내성에 의한 것으로 추정하고 있다. 동등한 초과 사망률이 미국에서, 아틀란타의 CDC에 의해 관찰된다. 내성 증가는 2050년까지 항생제 내성의 영향에 대한 J. O'Neil 경의 보고서에서 모델링한 바와 같이 이들 수치의 극적인 증가의 원인으로 여겨진다.

2017년 2월에, WHO는 전세계적 위협을 의미하는 내성 박테리아 목록을 발표하였다: 피. 애루지노사 (P. aeruginosa)는 특히 다수의 항생제에 내성이기 때문에 매우 중요한 비상사태를 의미하고; 에스. 뉴모니아에 (S. pneumoniae) 및 에스. 아우레우스 (S. aureus)는 메티실린 (MRSA)에 내성으로서, 특히 가장 민감한 환자에서 다양한 폐 및 뼈 감염뿐만 아니라 패혈증의 원인이 된다.

이들 박테리아 중에서, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)는 환경에서 발견되는 그람-음성 간균이고 입원 환자의 기도의 50% 초과에서 존재한다. 피. 애루지노사 (P. aeruginosa)는 다수의 환경 조건에서 생존하는 능력을 갖는 편재성 미생물이다. 이러한 미생물은 식물 및 동물뿐만 아니라 인간에서도 질환을 초래하여, 면역억제 암 환자 및 중증 화상 또는 낭성 섬유증을 앓는 환자에서 중증 감염을 야기한다.

슈도모나스 애루지노사 감염에 대한 표준 항생제 요법은 베타-락탐 (세프타지딤, 이미페넴 또는 메로페넴, 피페라실린/타조박탐)을 아미노글리코시드 (토브라마이신, 아미카신) 및/또는 플루오로퀴놀론과 병용한다. 슈도모나스 애루지노사의 다내성 (3가지 주요 부류: 베타-락탐, 아미노글리코시드, 플루오로퀴놀론 중 적어도 2종의 모든 항생제에 대한 내성) 균주의 출현은 치료 무기가 아직 매우 제한적이므로, 항생제 선택의 문제에 놓이게 된다.

따라서, 새로운 예방적 및 치료적 처치의 개발은 주요한 공중 보건 목표이다. 이들 병원체에 의한 감염을 치료하기 위한 새로운 전략의 성공은 대체로 그들 숙주와 그들의 분자적 및 기능적 상호작용 및 그들의 세포 생물학의 더 나은 특징규명을 기반으로 한다.

장관 감염은 또한 입원 및 일부 경우에 사망의 주요 원인이다. 개발 도상국에서, 면역 적격 환자에서 급성 위장염의 가장 일반적인 원인은 노로바이러스 및 로타바이러스를 비롯하여 하기 종 및 속의 박테리아이다: 캄필로박터 (Campylobacter) spp., 살모넬라 (Salmonella) spp., 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 및 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile).

III형 인터페론

람다 (λ) 인터페론으로도 알려진 III형 인터페론은 염증 반응을 촉발시키지 않고, 병원체 전파의 초기 억제에 기여하여 기도 및 장관의 상피에서 항미생물 방어의 제1선을 구성한다 (Andreakos et al., 2017). 이들 III형 인터페론은 Toll-유사 수용체 또는 세포질 이펙터와 같은 숙주의 세포 센서의 병원체 활성화에 반응하여 매우 초기에 효과적으로 생성된다. 이들 III형 인터페론은 예를 들어 바이러스의 세포 진입 (IFITM 유전자) 또는 그들 복제 (OAS, OASL, IFIT1, IFIT2, IFIT13, ISG15 유전자)를 불활성화시켜서, 호흡기 병원체에 대한 억제 활성을 부여하는, 수많은 소위 인터페론-자극된 유전자 (ISG) (JAK/STAT 경로의 활성화를 통함)의 발현을 활성화시킨다.

"III형 인터페론" 반응으로 알려진, 이러한 초기 항병원성 반응은 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 대한 호흡기 상피의 초기 선천성 반응에서 특히 두드러진다 (Galani et al., 2017).

III형 인터페론은 B형 및 C형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 임상 시험에서 이미 평가되었고 I형 인터페론을 사용한 치료와 비교하여 유의한 부작용이 덜하다는 것이 입증되었다 (Chan et al., 2016). 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 비염증성 항바이러스 치료로서 III형 인터페론의 사용이 최근에 제안된 바 있다 (Davidson et al., 2016).

기도 및/또는 장관의 상피의 감염, 특히 이들 상피의 바이러스 감염과 싸우기 위해서 하나 이상의 III형 인터페론의 내생성 생산을 자극시키는 것이 유리할 것이다.

그러나, 현재, 이러한 자극 활성을 갖는 치료 화합물은 알려진 것이 없다. 따라서, 지금까지 외생성 III형 인터페론의 투여만이 시험되었었다.

딜티아젬, 칼슘 채널 차단제

딜티아젬은 CAS 번호 42399-41-7로 포함된, 벤조티아제핀 패밀리의 분자이다. 이 분자는 2종의 거울상이성질체 L-cis 및 D-cis, 또는 라세믹 혼합물의 형태일 수 있다.

딜티아젬은 30년 넘게 알려져 있었고 유럽 및 미국에서 약물 규제 기관에 의해 승인되었다. 딜티아젬 히드로클로라이드의 형태로 투여될 수 있다. Cardizem®, Cartia®, Taztia® 및 Dilacor®가 이의 가장 일반적인 상표명이다.

다수의 제제가 이용가능한데, 특히 지속-방출형 제제가 이용가능하다. 딜티아젬은 다양한 생약 (galenic) 형태, 예컨대 국소 도포용 크림 형태, 경구 투여용 정제 또는 캡슐, 주사 용액의 제조용 분말 형태 또는 흡입용 약학 조제물의 형태로 이용가능하다 (WO 02/094238, US 4,605,552).

이의 기지의 생리 작용은 칼슘 채널의 억제와 그에 따른 세포내 칼슘 흐름의 억제이다. 특히, 딜티아젬은 혈관의 평활근 섬유 및 심근 근섬유로 경막 칼슘의 진입을 억제한다. 이것은 수축성 단백질에 도달하는 세포내 칼슘 농도를 감소시킨다.

인간에서, 딜티아젬의 투여는 심장 활동의 감소를 목표로 하는, 이의 혈관확장 작용을 의미한다. 따라서 심장 및 순환계 장애 예컨대 협심증, 고혈압, 심근 허혈 및 빈맥의 관리에서 사용된다.

딜티아젬의 다른 치료적 용도가 또한 문헌에서 제안되었지만, 이들 새로운 치료적 적용에 대해서는 규제 기관이 약물을 승인하지 않았다.

국제 특허 출원 공개 번호 WO 87/07508은 사이토메갈로바이러스 또는 헤르페스와 관련된 바이러스 감염의 치료를 위한, 세포로 칼슘 유입을 억제하는 치료 화합물, 예컨대 딜티아젬의 용도를 기술한다.

국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/066657은 바이러스 및/또는 박테리아 감염 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한, 칼슘 채널 차단제, 예컨대 베라파밀 또는 딜티아젬의 용도를 기술한다. 우려되는 바이러스는 특히 경구 헤르페스, 생식기 헤르페스 및 헤르페스 조스터이다.

국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/126071은 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스와 관련된 것의 치료를 위한, 세포로 칼슘 유입을 억제하는 화합물, 예컨대 딜티아젬의 용도를 기술한다. 딜티아젬이 바이러스와 칼슘 채널 간 상호작용을 억제하여서, 세포로 바이러스의 진입을 차단한다는 것을 특별히 설명한다.

국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/146836은 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 딜티아젬을 함유하는 약학 또는 수의학 조성물을 개시한다.

특허 EP 1 117 408은 망막 광수용체의 퇴행과 관련된 병상을 치료하기 위한, 칼슘 채널 차단제 화합물로서 딜티아젬의 용도를 기술한다.

그러나, 딜티아젬의 모든 유리한 작용이 아마도 아직 조사되지 않았고, 약물로서 딜티아젬과 연관된 기술적 효과는 현재 모두 알려져 있지 않은 듯 하다.

본 발명의 근본적인 기술적 문제는 기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료를 목적으로, III형 인터페론 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 자극시키기 위한 분자의 확인에 관한 것이다.

실제로, 기도 및/또는 장관의 미생물에 의한 감염 경우에는, 그러나 염증 반응을 유도시키지 않아서, 면역계의 과자극을 피하면서, 이들 병원체에 대한 신체 반응을 자극시키는 것이 유리하다.

그러나, 현재, 이러한 활성을 갖는 치료 화합물은 알려진 바가 없다.

그러므로 인터류킨 29, 인터류킨 28A 및/또는 인터류킨 28B와 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 자극시키는 능력을 갖는 치료 화합물을 활발히 찾고 있다.

놀랍게도, 본 발명자들은 딜티아젬, 칼슘 채널 차단제가 또한 시험관내 및 생체내 둘 모두에서, III형 인터페론 단백질을 코딩하는 이들 유전자의 발현에 대한 자극 작용을 갖는다는 사실을 입증하였다.

게다가, 본 발명자는 딜티아젬이 I형 및 III형 인터페론에 의해 활성화되는 것으로 알려진, 소위 인터페론-자극 유전자 (ISG)의 그룹의 발현을 활성화시킨다는 사실을 입증하였다. ISG에 의해 코딩되는 단백질은 항미생물 작용에 관여하고/하거나 "인터페론" 신호전달에 참여한다.

따라서, 딜티아젬은 다양한 치료적 적용분야에서 사용될 수 있고, 특히 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.

딜티아젬은 하나 이상의 III형 인터페론(들)을 코딩하는 유전자의 발현을 활성화시키는 작용제로서 이의 능력은 바이러스 또는 박테리아 감염뿐만 아니라, 또한 적어도 하나의 바이러스 및 적어도 하나의 박테리아, 또는 적어도 2종의 바이러스, 또는 적어도 2종의 박테리아의 존재와 연관된 동시-감염의 치료에 특히 적합하고, 1차 바이러스 감염에 수반되는 박테리아 중복감염의 치료에 특히 적합하다.

본 발명은 III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

당업자가 알고있는 바와 같이, 주제에 대한 풍부한 과학 문헌을 고려하면, "인터페론 III 경로"의 활성화는 많은 생리적 장애, 특히 병원체에 의한 감염과 관련된 것들을 치료하는 것을 가능하게 만든다.

특히, 본 발명은 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

본 발명은 또한 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서, 적어도 하나의 소위 ISG의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

본 발명은 또한 기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 딜티아젬을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다.

특정 양상에 따라서, 약학 또는 수의학 조성물은 흡입에 의한 투여에 적합한 생약 형태인 것을 특징으로 한다.

도 1: 비측 기원의 재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix)의 3D 모델의 기저측부 딜티아젬 처리에 의한 III형 인터페론 유전자 발현의 유도의 특징규명.
1A- 하기 간의 RNAseq를 통해 결정된 III형 인터페론 IFN-λ1, IFN-λ2 및 IFN-λ3 (각각 IFNL1, IFNL2 및 IFNL3으로 표시)을 코딩하는 유전자의 발현 비율:
- 그들 기저측 극에서 그들의 배양 배지를 통해 딜티아젬 (90 μM, 총 3회 투여)으로 3일 동안 처리된 재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix), 및
- 미처리된 재구성 인간 호흡기 상피 (1의 기본 발현도).
1B- 하기 간의 RNAseq로 결정된 IFI44L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, ISG15, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 및 STAT1을 코딩하는 유전자의 발현 비율:
- 그들 기저측 극에서 그들 배양 배지를 통해 딜티아젬 (90 μM, 총 3회 투여)으로 3일 동안 처리된 재구성 인간 호흡기 상피, 및
- 미처리된 재구성 인간 호흡기 상피 (1의 기본 발현도).
2 이상의 발현 편차, 및 0.05 미만의 보정된 p-값을 나타내는 유전자만이 나머지 분석에서 고려되었다.
1C- 비측 기원의 재구성 인간 호흡기 상피의 3D 모델의 첨단부 딜티아젬 처리에 의해 유도된 IFNL1 유전자의 발현.
재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix)는 D0에 첨극으로 투여된 90 μM 딜티아젬의 단일 용량이 처리 또는 미처리 (모의군)되었다. 처리 후 24시간에, 세포를 용해시켰고 전체 RNA를 추출하였다. 역전사 이후에, IFNL1 유전자의 발현은 RT-qPCR (TaqMan, Thermo Fisher Scientific)로 측정하였다. 데이터는 하우스키핑 유전자 GAPDH를 사용해 정규화시켰다. 발현 비율은 2ΔΔCt 방법 (Livak and Schmittgen, 2001)을 기반으로 하는 계산법을 사용해 계산하였다.
도 2: III형 인터페론 반응과 연관된 8개 유전자의 딜티아젬에 의한 유도의 RT-qPCR을 통한 확인.
하기 간의 IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFI27, IFN-λ1 (IFNL1), IFN-λ2 (IFNL2), IFI44L 및 IFITM1 유전자의 발현 비율:
- 그들 기저측 극을 통해 딜티아젬 (90 μM)으로 3일 처리된 재구성 인간 호흡기 상피 (그래프의 우측 컬럼), 및
- 미처리된 재구성 인간 호흡기 상피 (그래프의 우측 컬럼).
미처리 상피와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001.
도 3: 인터페론 람다 1 (IL-29) 분비의 ELISA 측정.
그들 기저측 극을 통해 딜티아젬 (90 μM, 3 연속일 동안 총 3회 투여)이 처리 및 미처리된 재구성 인간 호흡기 상피의 첨극 및 기저측 극에서 인터페론 람다 1 (IL-29)의 분비 수준 (pg/mL)은 처리 72시간 후에 ELISA를 통해 측정되었다.
미처리 상피와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001.
도 4. 딜티아젬 처리는 챌린지 감염 이후에 감염된 재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix) 및 BALB/c 마우스 모델 (생체내)에서 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 감소시킨다.
4A- 인간 호흡기 상피의 기저측 극을 통한 처리 연대표의 개략도: RSV 감염 (0일) 이후, 재구성 상피는 감염 후 5시간 (5 hpi), 그 이후에 다음 3일 (pi 1일, 2일 및 3일) 동안 매일 딜티아젬으로 처리되거나 또는 그렇지 않았다 (미처리). 바이러스 정량은 pi 6일에 수행된다.
4B- 처리 또는 미처리 상피의 첨극에서, 즉 상피의 배양 상청액 중에서, RNA의 총량에 대한 RSV 바이러스 게놈 카피수의 RT-qPCR에 의한 (F 유전자의 카피수의 정량에 의한) 정량.
4C- 처리 또는 미처리 상피 내에서 RNA의 총량에 대한 RSV 바이러스 게놈 카피수의 RT-qPCR에 의한 (F 유전자의 카피수 정량에 의한) 정량.
4D- 마우스의 감염 및 경구 (p.o.) 처리 연대표의 대표도: RSV 감염 (5.10⁵ PFU/마우스, 0일) 이후에, 마우스는 감염 후 5시간 (5 hpi) 및 그 이후 후속 2일 (pi 1일 및 2일) 동안 매일 리바비린 (40 mg/kg 복강내/마우스)으로 또는 후속 4일 (pi 1일, 2일, 3일 및 4일) 동안 매일 딜티아젬 (50 mg/kg 경구/마우스)으로 처리하였거나 또는 처리하지 않았다 (PBS 대조군). 폐 바이러스 정량은 pi 5일에 수행된다.
4E- 감염 후 (pi 일수) 5일에 리바비린 (RSV RIB) 또는 딜티아젬 (RSV DIL) 처리 및 미처리 (RSV PBS) 마우스의 폐로부터 추출된 RNA의 총량에 대한 RSV 바이러스 게놈 카피수의 RT-qPCR에 의한 (F 유전자의 카피수 정량에 의한) 정량.
도 5. 딜티아젬 처리는 재구성 인간 호흡기 상피 모델 (MucilAir® HAE, Epithelix)에서 인간 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV) 복제를 감소시킨다.
5A- 인간 호흡기 상피의 기저측 극을 통한 처리 연대표의 대표도: 0.1의 MOI로 hPIV-3 바이러스에 의한 감염 (0일) 이후, 재구성 상피는 감염 후 5시간 (5 hpi), 그 이후 다음 4일 (pi 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간) 동안 매일 딜티아젬으로 처리 또는 미처리 (미처리)되었다. 바이러스 정량은 감염 적정 (TCID50/mL)을 통해서 pi 120시간에 수행된다.
5B- 감염 후 96시간 (위) 및 120시간 (아래)에, hPIV-3 바이러스에 의해 유도된 세포변성 효과는 딜티아젬 처리된 것 (우측 이미지)과 달리, 미처리된 재구성 인간 호흡기 상피 (좌측 이미지)에서 현미경 하에서 더 크게 쉽게 볼 수 있다.
5C- 상피의 무결성을 반영하는, TEER (Transepithelial electrical resistance)은 감염 후 48시간 부터 감염 후 120시간 까지 1일 1회 측정되었다. 처리 부재에서, 감염된 재구성 인간 호흡기 상피의 TEER 값은 딜티아젬 처리된 것과 달리, 감염 후 24시간부터, 유의하게 감소되었다.
5D- 상피의 첨극에서 채취된 샘플의 바이러스 역가 (TCID50/mL)는 감염 후 48시간 내지 120 hpi에 채취된 세척액 유래의 LLC-MK2 세포에서 결정하였다. 감염 후 72시간 (대략 10⁶ TCID50/mL) 및 감염 후 96시간 (10⁵ TCID50/mL)에 유의하게 낮은 값을 보여준 딜티아젬 처리된 재구성 인간 호흡기 상피와 달리, 처리 부재에서, 재구성 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면에서 측정된 바이러스 역가는 감염 후 72시간에 대략 10⁸ TCID50/mL의 값 및 감염 후 96시간에 10⁷ TCID50/mL의 값으로 최고였다.
도 6. 딜티아젬 처리는 재구성 인간 호흡기 상피 모델 (MucilAir® HAE, Epithelix)에서 슈도모나스 애루지노사에 의한 박테리아 감염을 감소시킨다.
6A- 인간 호흡기 상피의 처리 연대표의 개략도: 재구성 인간 호흡기 상피는 감염 전 24시간에 그들 기저측부 배지를 통해 90 μM의 딜티아젬으로 또는 대안적으로 그들 첨단부 표면에서 10 μL의 딜티아젬 (90 μM)으로 처리된 후에, 1의 MOI로 슈도모나스 애루지노사 (PAK 균주)로 감염시켰고, 다시 각각 동일 조건 하에서 감염 후 2시간에 딜티아젬으로 처리되었다.
6B- 이들 실험 조건 (n = 2) 하에서, 감염 후 24시간에 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면으로부터 수집된 박테리아의 수는 기저측부 배지 중 딜티아젬으로 처리된 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면에서 수집된 박테리아의 수에 비해서 유의하게 낮았다 (각각 115 및 106 vs 76 및 106 CFU, * p< 0.05).
6C- 딜티아젬으로 첨단부 처리의 경우에, 슈도모나스 애루지노사에 대해 유사한 효과가 감염 후 24시간에 관찰되었는데 (n=2), 미처리와 비교하여 딜티아젬 처리된 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면으로부터 수확된 박테리아가 감소되었다 (각각 87 및 106 대 63.5 및 106 CFU).
도 7. 딜티아젬 처리는 재구성 인간 호흡기 상피 모델 (MucilAir® HAE, Epithelix)에서 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV) 복제를 감소시킨다.
7A- 인간 호흡기 상피의 처리 연대표의 개략도: 0.1의 MOI로 재조합 hMPV-GFP 바이러스 (균주 C-85473)에 의한 감염 이후에, 상피는 감염 후 D0 (5 hpi), D1 및 D3에 90 μM의 딜티아젬의 3 연속 용량으로 처리 (그들 기저측부 배지를 통함)되거나 또는 처리되지 않았다 (조건 당 3 상피). 바이러스 정량은 pi 3일 (상청액) 및 pi 5일 (전체 상피)에 수행된다.
7B- 바이러스 복제에 대한 딜티아젬 처리의 영향을 관찰하기 위해서 감염 후 D4에 에피형광 현미경 관찰을 수행하였다. 처리 부재시에, GFP의 바이러스 발현에 해당하는 형광이 거의 모든 상피 (좌측 이미지)에서 감염 후 D4에 관찰되는 반면, 감염 후 동일 시점에 딜티아젬으로 처리된 감염된 상피에서는 매우 적은 형광 세포만이 존재하였다 (우측 이미지).
7C- 감염 후 3일에, 생산된 바이러스 자손을 수확하기 위해서 딜티아젬 처리 또는 미처리된, 감염된 상피의 첨극에서 세척을 수행하였다. 게놈 바이러스 RNA를 추출하였고 HMPV N 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용해 RT-qPCR (Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green, Thermo Fisher Scientific)을 통해 정량하였다. 결과는 바이러스 N 유전자의 카피수/추출된 총 RNA의 μg으로 표시된다.
7D- 감염 후 5일에, 상피 세포를 수확하였고 용해시켜서 전체 RNA를 추출하였다. hMPV N 바이러스 유전자에 해당하는 전체 RNA는 HMPV N 유전자를 함유하는 플라스미드 어레이를 사용해 RT-qPCR (Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green, Thermo Fisher Scientific)을 통해 정량하였다. 결과는 N 유전자의 카피수/추출된 총 RNA의 μg으로 표시된다.
도 8: BALB/c 마우스에서 비측 점적주입 이후에 생체내에서 IFN-l2 (IFNL2) 유전자 발현의 딜티아젬 유도
8A- BALB/c 마우스의 비내 (i.n.) 점적주입에 의한 처리 연대표의 대표도: 마우스는 0일 (D0)에 처리 (20 mg/kg) 또는 미처리 ("모의-처리" PBS 대조군)된 후에, 후속 2일 (D0, D1 및 D2) 동안 매일 또는 4일까지 (D0, D2 및 D4) 48시간 마다 처리되거나 또는 미처리되었다. D5에, 동물의 안락사 이후 비강을 제거하였다.
8B- IFN-λ2 (IFNL2) 유전자의 발현은 RT-qPCR을 통해 측정하였고 미처리 (모의-처리) 마우스에서 측정된 유전자 발현의 기준 수준 (1과 동일)에 대한 발현의 비율로서 표시된다.

본 발명은 하기 화학식 (1)의, CAS 번호 42399-41-7로 포함된, 벤조티아제핀 패밀리의 분자인, 기지 약물, 딜티아젬의 신규 치료 용도에 관한 것이다:

화학식 (1)

본 발명의 상황에서, 용어 "딜티아젬"은 이의 모든 형태, 특히 염 형태, 및 특히 딜티아젬 히드로클로라이드 형태의 딜티아젬을 의미한다. 이 용어는 그들을 단리할 때 각각의 거울상이성질체를 비롯하여 라세믹 혼합물을 포함한다. 이 용어는 또한 딜티아젬 유도체, 즉 III형 인터페론 단백질의 발현을 자극하는 동일한 생물학적 활성을 갖는, 화학식 (1)에서 유래된 분자를 포함한다.

본 발명은 III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

지금까지, 딜티아젬은 이의 칼슘 채널 억제 작용을 위해 사용되어 왔으며, 이러한 세포내 칼슘 수송의 억제를 통해서, 딜티아젬의 투여는 인간 및 동물 유기체에 대해서 수많은 생리적 효과를 생성시킨다.

본 발명자들은 딜티아젬의 새로운 기술적 효과, 즉 III형 인터페론을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현의 활성화를 입증하였다.

본 발명의 바람직한 양상에 따라서, 그 발현이 활성화되는 유전자(들)는 내생성 유전자, 즉 임의의 유전자 변형을 겪지 않은, 고려 하의 유기체에 천연인 유전자이다.

당업자는 상이한 생리적 상황에서 III형 인터페론의 관여에 친숙하며, 과학 문헌을 통해서 III형 인터페론의 발현을 활성화시키는 이러한 화합물의 치료적 잠재성을 결론내릴 수 있다. 특히, III형 인터페론의 효과에 민감한 세포, 그들 수용체를 발현하는 세포는 문헌에서 확인하였다. 따라서, 딜티아젬의 사용으로 이득을 얻을 수 있는 인간 및 동물 병상은 당업자가 쉽게 결정하게 될 것이다.

보다 상세히, 본 발명은 인터류킨 29, 인터류킨 28A 및 인터류킨 28B를 코딩하는 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

따라서, 최초로, "인터페론 III 경로"를 활성화시키기 위한 치료 화합물, 즉 III형 인터페론을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 활성화시키는 작용제가 확인되었다. 이러한 활성이 확인된 최초 화합물이다.

III형 인터페론

람다 (λ) 인터페론으로도 공지된 III형 인터페론은 병원성 미생물에 의한 감염에 대한 인간 또는 동물 유기체의 방어의 제1선을 구성한다.

이러한 새로운 인터페론 패밀리는 2003년에 최초로 기술되었고, 하기 4종의 단백질이 인간에서 포함된다:

- 인터페론 람다-1 (IFN-λ1) 또는 인터류킨 29 (IL-29),

- 인터페론 람다-2 (IFN-λ2) 또는 인터류킨 28A (IL-28A),

- 인터페론 람다-3 (IFN-λ3) 또는 인터류킨 28B (IL-28B),

- 인터페론 람다-4 (IFN-λ4).

마우스에서는, 이러한 인터페론 III 패밀리에 속하는 오직 2종의 단백질이 지금까지 확인되었다 (IFN-λ2/IL-28A 및 IFN-λ3/IL-28B).

이들 III형 인터페론은 IL-28RA로도 알려진, 그들의 통상의 IFN-λR1 수용체를 통해서 그들 효과를 매개한다. IFN-λ 단량체에 결합하기 위해 IL-10R2 수용체 및 이러한 수용체 간에 이종복합체가 형성된다 (고찰을 위해 [Donnelly & Kotenko, 2010] 참조).

본 발명의 상황에서, "III형 인터페론을 코딩하는 유전자"는 [Kotenko et al., 2003] 및 [O'Brien et al., 2014]의 공개물에 기술된 바와 같이, 하기 유전자 중 하나, 또는 그들 상동체를 의미한다:

- IFN-λ1을 코딩하는 유전자,

- IFN-λ2를 코딩하는 유전자,

- IFN-λ3을 코딩하는 유전자, 및

- IFN-λ4를 코딩하는 유전자.

상기에 인용된 유전자는 인간 유전자이지만, 딜티아젬이 상이한 동물 종에서 사용되면, 그 발현이 딜티아젬에 의해 활성화되는 III형 인터페론을 코딩하는 유전자는 대상 종의 상동성 유전자 중 적어도 하나이게 될 것임을 이해한다.

주요 ISG의 발현 유도

본 출원의 실시예 1은 딜티아젬이 첨단부 또는 기저측부 처리 이후에 몇개의 소위 "인터페론-자극" 유전자 (ISG), 및 특히 "면역력" 유전자의 발현을 유도한다는 것을 입증한다.

특히, 딜티아젬은 IFI44L, IFIT2 OAS1, IRF7, MX1 또는 IFITM1과 같이 문헌에 충분히 기술된 ISG의 발현을 유도한다.

기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물에 의한 감염

IFN-λR1 수용체는 상피-유형 세포에 의해서만 독점적으로 발현되므로, III형 인터페론의 효과는 상피에 제한된다.

외부 병원체에 의한 감염에서, 기도 및 장관의 상피는 각각 흡기된 공기 및 섭취된 물 및 음식물과 그들의 직접 접촉으로 인해서, 영향받는 첫번째 장기이다.

따라서, 본 발명은 특히 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

"기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염"이란 표현은 적어도 하나의 병원성 미생물의 존재에 의해 발생되는 감염으로서 이해하며, 이러한 미생물은 개체 또는 동물을 감염시키거나 또는 개체 또는 동물을 감염시킬 가능성이 있다.

실제로 본 발명은 인간 (또한 "개체"라고도 함)에 영향을 미치는 감염을 비롯하여, 동물, 특히 가축에 영향을 미치는 감염의 예방 및/또는 치료 둘 모두에 관한 것임을 이해한다.

용어 "예방"은 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 인간 또는 동물 유기체에서 감염의 가능성을 예방, 또는 적어도 감소시키는 것을 의미한다. 생산된 III형 인터페론의 작용 하에서, 유기체의 조직, 및 특히 상피는 점점 더 내성이 되어서 상기 미생물에 의한 감염을 더욱 잘 피하고/하거나 제한할 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에 따라서, 딜티아젬은 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용된다.

용어 "치료"는 인간 또는 동물 유기체에서 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염과 싸우는 것을 의미한다. 딜티아젬의 투여를 퉁해서, 체내 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 감염의 비율이 점진적으로 감소되거나 또는 심지어 완전히 사라지게 될 것이다. 용어 "치료"는 또한 감염과 연관된 증상 (발열, 피로 등)의 감소 및/또는 합병증, 특히 중복감염의 위험성의 예방/감소에 관한 것이다.

본 발명의 특정 구현예에 따라서, 딜티아젬은 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염의 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용된다.

바람직한 양상에 따라서, 본 발명은 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 유전자는 인터류킨 29를 코딩하는 유전자, 인터류킨 28A를 코딩하는 유전자 및 인터류킨 28B를 코딩하는 유전자로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

특정 구현예에 따라서, 딜티아젬은 인터류킨 29, 인터류킨 28A 및 인터류킨 28B를 코딩하는 3종 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용된다.

병원성 미생물

본 발명의 상황에서, 표현 "병원성 미생물"은 다른 유기체, 예컨대 인간 또는 동물에서 질환을 발생시킬 수 있는 임의 미생물을 의미한다. 이러한 표현은 특히 바이러스, 박테리아, 진균, 원충, 기생충, 및 다른 병원성 단세포 미생물을 포함한다.

바람직하게, "병원성 미생물"은 "III형 인터페론"의 세포 반응에 민감한 미생물, 즉 그의 세포 감염이 III형 인터페론 단백질의 발현 및 분비에 의해, 완전히 또는 부분적으로 예방 또는 억제될 수 있는 미생물이다.

본 발명의 일 측면에 따라서, 병원성 미생물은 기도의 상피를 특이적으로 감염시키는 미생물이다.

본 발명의 다른 측면에 따라서, 병원성 미생물은 장관의 상피를 특이적으로 감염시키는 미생물이다.

본 발명의 또 다른 양상에 따라서, 병원성 미생물은 모든 유형의 상피, 특히 기도 및 장관의 것을 감염시킬 수 있는 미생물이다.

본 발명의 제1 양상에 따라서, 감염은 바이러스 감염이고, 다시 말해서 기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물은 바이러스이다.

III형 인터페론 패밀리에 속하는 단백질은 바이러스의 표적 상피의 항바이러스 반응에 있어서 필수 플레이어이다. 따라서, 상기 III형 인터페론 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 활성화시키는 작용제는 감염된 상피의 항바이러스 반응을 자극시키고 최적화시킨다.

이러한 양상에 따라서, 본 발명은 기도 및/또는 장관의 상피를 감염시키는 적어도 하나의 바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

본 발명의 상황에서, 용어 "바이러스"는 임의 유형의 바이러스, 보다 특히 척추동물 진핵생물 유기체를 감염시키는 바이러스를 포함한다. 이들은 DNA 또는 RNA 바이러스일 수 있다. 본 발명의 상황에서, 이것은 여기서 보다 특히 기도 및/또는 장관의 상피를 통해 유기체를 감염시키는 바이러스를 의미한다.

본 발명의 특정 양상에 따라서, 감염은 인플루엔자 바이러스 감염이 아니다.

인플루엔자 바이러스 감염을 치료하기 위한 딜티아젬의 치료적 용도는 문헌 WO 2011/126071 및 WO 2016/146836에서 이미 제안하였었다. 그러나, 종래 기술에서 딜티아젬은 III형 인터페론을 코딩하는 유전자의 발현을 활성화시키는 이의 작용에 대해서가 아니라, 칼슘 채널에 대한 이의 작용에 대해 사용된다.

본 발명의 특정 양상에 따라서, 병원성 미생물은 이중 가닥 DNA 게놈을 갖는 I 그룹 바이러스이다. 이 그룹의 바이러스는 특히 헤르페스 (Herpes) 목, 파필로마바이러스과 (Papillomaviridae)를 비롯하여, 폴리오마바이러스과 (Polyomaviridae) 및 폭스바이러스과 (Poxviridae)의 바이러스를 포함한다.

본 발명의 특정 양상에 따라서, 병원성 미생물은 특히 파르보바이러스과 (Parvoviridae)의 바이러스를 포함하는, 단일-가닥 DNA 게놈을 갖는 II 그룹 바이러스이다.

본 발명의 일 양상에 따라서, 병원성 미생물은 특히 로타바이러스와 같이, 레오바이러스과 (Reoviridae)의 바이러스를 포함하여, 이중-가닥 RNA 게놈을 갖는 III 그룹 바이러스이다.

본 발명의 일 양상에 따라서, 병원성 미생물은 양극성 단일-가닥 RNA 게놈을 갖는 IV 그룹 바이러스이다. 이 그룹은 특히 다음을 포함한다:

- 니도바이러스목 (Nidovirales)의 바이러스, 예컨대 코로나바이러스과 (Coronaviridae)의 바이러스;

- 노르워크 바이러스를 포함한, 칼리시바이러스과 (Caliciviridae)의 바이러스;

- 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, C형 간염 바이러스 및 뎅기 바이러스를 포함한, 플라비바이러스과 (Flaviviridae)의 바이러스;

- 폴리오바이러스, 리노바이러스, 및 A형 간염 바이러스를 포함한, 피코르나바이러스과 (Picornaviridae)의 바이러스;

- 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스 및 치쿤구니아 바이러스를 포함한, 토가바이러스과 (Togaviridae)의 바이러스.

본 발명의 일 양상에 따라서, 병원성 미생물은 단일-가닥, 음극성 RNA (ssRNA) 게놈을 갖는 V 그룹 바이러스이다. 이 그룹은 특히 다음과 같은, 모노네가바이러스목 (Mononegavirales)의 바이러스를 포함한다:

- 보르나바이러스과를 포함한, 보르나바이러스과 (Bornaviridae)의 바이러스,

- 에볼라 바이러스 및 마르부르그 바이러스를 포함한, 필로바이러스과 (Filoviridae)의 바이러스,

- 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스 및 헤니파바이러스를 포함한, 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae)의 바이러스,

- 공수병 바이러스를 포함한, 라브도바이러스과 (Rhabdoviridae)의 바이러스,

- 라싸열 바이러스를 포함한, 아레나바이러스과 (Arenaviridae)의 바이러스,

- 한타바이러스 및 콩고-크림 열 바이러스를 포함한, 부니야바이러스과 (Bunyaviridae)의 바이러스,

- 오르쏘믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae)의 바이러스.

본 발명의 특정 양상에 따라서, 병원성 미생물은 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV), 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 니파 바이러스, 노보바이러스, 돼지 열병 바이러스, 아데노바이러스, 코로나바이러스, 지카 바이러스, 황열 바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스, 뎅기 바이러스, 및 웨스트 나일 바이러스로부터 선택된 바이러스이다.

보다 특히, 병원성 미생물은 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV), 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV) 및 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV)로부터 선택된 바이러스이다.

특정 구현예에 따라서, 본 발명은 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV) 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

보다 특히, 본 발명은 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV) 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

다른 구현예에 따라서, 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV) 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화하기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

보다 특히, 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV) 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

특정 구현예에 따라서, 본 발명은 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV) 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

보다 특히, 본 발명은 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV) 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

본 발명의 제2 양상에 따라서, 감염은 비바이러스성 감염이다. 특히, 병원성 미생물은 박테리아, 진균 및 기생충으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 특정 양상에 따라서, 병원성 미생물은 박테리아이다.

병원성 박테리아 중에서, 특히 하기 종의 박테리아를 언급할 수 있다: 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) 및 해모필러스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae).

또한 장관 감염에 특이적인 박테리아 예컨대 캄필로박터 (Campylobacter) spp., 살모넬라 (Salmonella) spp., 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 및 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile)을 언급할 수 있다.

본 발명의 특정 양상에 따라서, 병원성 미생물은 클라미디아에 (Chlamydiae) 속의 박테리아가 아니다.

본 발명의 특정 양상에 따라서, 병원성 미생물은 하기 박테리아 종으로부터 선택된 박테리아이다: 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 해모필러스 인플루엔자에, 캄피로박터 spp., 살모넬라 spp., 시겔라 spp., 여시니아 엔테로콜리티카, 비브리오 콜레라에, 에스케리치아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 세레우스, 및 클로스트리듐 디피실.

특정 구현예에 따라서, 병원성 미생물은 슈도모나스 애루지노사 종의 박테리아이다.

특정 구현예에 따라서, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

보다 특히, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양상에 따라서, 병원성 미생물은 진균이다.

병원성 진균 중에서, 특히 아스퍼질러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 뉴모시스티스 지로베시 (Pneumocystis jiroveci), 푸사리움 솔라리 (Fusarium solari)를 언급할 수 있다.

다른 구현예에 따라서, 본 발명은 하기 군으로부터 선택된 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다: 슈도모나스 애루지노사, 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV), 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV) 및 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV).

보다 특히, 본 발명은 하기 군으로부터 선택된 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다: 슈도모나스 애루지노사, 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV), 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV) 및 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV).

표현 "적어도 하나의 병원성 미생물"은 하나 이상의 병원성 미생물이 감염된 유기체에 존재하여서, 유기체로부터 면역 반응을 생성시키는 것을 의미한다.

특히, 유기체는 바이러스 및 박테리아 둘 모두로 감염될 수 있고, 이것을 유기체의 동시-감염이라고 한다.

특정 양상에 따라서, 본 발명은 감염이 적어도 하나의 바이러스 및 적어도 하나의 박테리아에 의한 동시-감염인 것을 특징으로 하는, 상기 기술된 바와 같이 사용을 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

유리하게, 딜티아젬은 이러한 동시-감염을 앓는 개체 또는 동물에게 투여되는 활성 화합물의 개수를 제한하는, 바이러스 감염 및 박테리아 감염의 병행 치료에 사용된다.

보다 특히, 이러한 동시-감염은 하기로부터 선택되는 병원성 미생물의 조합의 감염된 상피에서의 존재와 연관될 수 있다:

- 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV), 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아.

- 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV), 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 니파 바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 노보바이러스, 및 캄필로박터 spp., 살모넬라 spp., 에스케리치아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 세레우스, 및 클로스트리듐 디피실로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 코로나바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스타필로코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 돼지 열병 바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 아데노바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 지카 바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 황열 바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 레오바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 로타바이러스, 및 캄필로박터 spp., 살모넬라 spp., 에스케리치아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 세레우스, 및 클로스트리듐 디피실로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 뎅기 바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아,

- 웨스트 나일 바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아, 및

- 인플루엔자 바이러스, 및 엔테로코커스 패칼리스, 보렐리아 부르그도르페리, 리스테리아 모노시토게네스, 마이코박테리움 튜버큘로시스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 살모넬라 티피뮤리움, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 해모필러스 인플루엔자에로부터 선택된 종의 적어도 하나의 박테리아.

본 발명의 특정 구현예에 따라서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 딜티아젬은

i) 기도 및/또는 장관의 상피의 바이러스 감염의 치료; 및

ii) 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 다른 병원성 미생물에 의한 동시-감염, 예컨대 박테리아 중복감염의 예방

둘 모두에 대해 사용될 것이다.

본 발명의 다른 특정 구현예에 따라서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 딜티아젬은

i) 기도 및/또는 장관의 상피의 박테리아 감염의 치료; 및

ii) 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 다른 병원성 미생물에 의한 동시-감염, 예컨대 바이러스 중복감염의 예방

둘 모두에 대해 사용될 것이다.

본 발명의 다른 특정 구현예에 따라서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 딜티아젬은

i) 기도 및/또는 장관의 상피의 바이러스 감염의 치료; 및

ii) 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 다른 병원성 미생물과의 동시-감염, 예컨대 박테리아 중복감염의 치료

둘 모두에 대해 사용될 것이다.

치료 병용물

본 발명은 또한 적어도 하나의 다른 활성제, 즉 하나 이상의 활성제와 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 앞서 제시된 바와 같은 치료적 용도를 위한 딜티아젬에 관한 것이다.

바람직하게, 이러한 다른 활성제는 병상의 예방 또는 치료의 목적으로, 인간 또는 동물 유기체에 대한 유리한 작용을 갖는 치료 화합물이다.

특히, 이러한 다른 활성제는 항바이러스성 화합물, 항박테리아성 화합물, 항기생충성 화합물, 항진균 화합물, 및 예방 또는 치료 백신으로부터 선택될 것이다.

바람직하게, 이러한 다른 활성제는 항바이러스성 화합물 및 항박테리아성 화합물로부터 선택된다.

본 발명의 상황에서, "항바이러스성 화합물"은 적어도 하나의 바이러스에 대한 직접 억제 작용 (예를 들어, 이의 복제 억제) 또는 바이러스의 표적 세포에 대한 작용 (예를 들어, 바이러스 감염에 비호의적인 세포 상태를 유도하여서, 바이러스 감염을 예방)을 갖는 화합물을 의미한다.

항바이러스제는 이러한 작용 방식에 따라서 상이한 범주로 분류된다. 특히 다음을 언급할 수 있다:

- DNA 또는 RNA 합성에 관여되는 효소 (헬리카제, 레플리카제)의 억제제를 비롯하여, DNA 또는 RNA 합성을 방해 또는 중지시키는, 뉴클레오티드 유사체;

- 이의 복제 주기 동안 바이러스의 성숙화 단계를 억제하는 화합물;

- 세포막과의 결합, 또는 숙주 세포로 바이러스의 진입을 방해하는 화합물 (융합 또는 진입 억제제);

- 세포 내에서 이의 해체를 차단시켜서, 이의 진입 이후 숙주 세포 내에서 바이러스가 그 자체를 발현시키는 것을 방지하는 작용제;

- 다른 세포로 바이러스의 확산을 제한하는 작용제.

특히, 항바이러스제(들)는 하기로부터 선택된다:

i) 바이러스에 대한 직접 억제 작용을 갖는 바이러스제, 예컨대 예를 들어 리바비린 및 파비피라비르;

ii) 바이러스 감염에 전반적으로 비호의적인 세포 상태를 유도시키는 활성제; 및

iii) 하기 화합물로부터 선택된 화합물:

· 치환된 2-데옥시우리딘 유사체;

· 뉴클레오시드 유사체;

· 파이로포스페이트 유사체;

· 프로테아제 억제제;

· 세포로의 바이러스 침투의 억제제, 예컨대 아르비돌;

· 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 융합 단백질의 A 항원성 부위의 에피토프에 대한 단일클론 항체, 예컨대 팔리비주맙; 및

· 바이러스-억제 작용을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드.

본 발명의 상황에서, "항박테리아성 화합물"은 항박테리아성 활성을 갖는, 다시 말해 박테리아의 복제를 억제 (정균 화합물)하거나 또는 그들을 파괴 (살균 화합물)하거나 또는 그들의 생합성 및/또는 독성 산물 분비를 억제하는 화합물을 의미한다. 특히 이들은 항생제이다.

특히 항박테리아제(들)는 하기로부터 선택된다:

i) 항생제, 및 특히 마크롤리드 패밀리의 것, 특히 록시트로마이신;

ii) 박테리아의 천연 포식자인 박테리오파지.

이러한 항바이러스제 및 항박테리아제는 상업적으로 입수가능하고, 그들의 사용 조건은 Le Dictionnaire Vidal과 같은 참고서에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 양상에 따라서, 딜티아젬과 병용하여 사용되는 다른 활성제는 특히 전신 항진균성 화합물 (암포테리신 B, 아졸, 에키노칸디스) 및 전신 항기생충성 화합물 (예를 들어, 항말라리아제, 항아메바제, 톡소플라스마증, 리슈만편모충증, 뉴모시스티스병, 구충 약물)로부터 선택되는, 항진균성 화합물 또는 항기생충성 화합물이다.

본 발명의 특정 구현예에 따라서, 적어도 하나의 다른 활성제는 백신이다.

본 발명의 상황에서, "백신"은 인간 또는 동물 유기체의 면역계를 특이적으로 자극시키는 화합물 또는 화합물의 병용물을 의미한다. 특히, 백신은 항원, 즉 그 반응의 기억을 유지하게 하는 유기체에서 특이적 면역 반응을 유도시키는 화합물을 포함하게 된다.

이러한 백신은 예방 백신일 수 있는데, 다시 말해서 유기체가 병원성 미생물에 의해 감염되기 이전에 특이적 면역 반응을 자극시키고자 한다.

예에는 제한없이, 그들이 제조되는 항원의 성질에 따라 분류되는, 상이한 유형의 백신이 포함된다. 전통적으로 사용되는 항원은 다음과 같다: 불활성화된 감염원, 생 약독화제, 감염원의 서브유닛, 톡소이드, 병원체로부터 유래된 항원 발현의 바이러스 벡터, 핵산 (DNA 또는 RNA)을 보유하는 벡터, 및 항체.

이러한 백신은 또한 치료 백신일 수 있고, 즉 병원성 미생물에 의한 유기체의 감염에 수반되는 특이적 면역 반응을 자극하고자 한다.

모든 경우에서, 백신은 딜티아젬에 의한 처리 이전, 그 동안, 또는 그 이후에 투여될 수 있다는 것을 이해한다.

마지막으로, 본 발명의 특정 양상에 따라서, 상기에 인용된 모든 활성제는 서로 병용하여 사용될 수 있고, 예를 들어, 하기 유형의 병용물로서 기도 및/또는 장관의 상피의 하나 이상의 병원성 미생물에 의해 감염된 개체 또는 동물에게 순차적으로 또는 동시 발생적으로 투여될 수 있다:

- 딜티아젬, 항바이러스성 화합물 및 항박테리아성 화합물,

- 딜티아젬, 항바이러스성 화합물 및 항기생충성 화합물,

- 딜티아젬, 항박테리아성 화합물 및 항진균성 화합물,

- 딜티아젬 및 예방 백신; 또는

- 딜티아젬 및 치료 백신.

약학 또는 수의학 조성물

본 발명은 또한 III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 딜티아젬을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 딜티아젬을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다.

보다 상세하게, 본 발명에 따른 이러한 조성물은 딜티아젬을 비롯하여 적합한 약학 비히클, 및 임의로 다른 활성제를 포함하게 될 것이다.

용어 "적합한 약학 비히클"은 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 부형제, 즉 개체 또는 동물에게 그의 투여가 유의한 유해 효과를 수반하지 않고 당업자에게 충분히 공지된 비히클 또는 부형제를 의미한다.

본 발명에 따른 이러한 조성물은 임의 유형의 투여, 특히 흡입, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 안구 또는 직장 투여에 의한 경구, 설하, 비측 및/또는 경구 투여를 위해 적합화될 수 있다.

투여의 적합한 생약 형태는 예를 들어 정제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액일 수 있다.

특정 양상에 따라서, 약학 또는 수의학 조성물은 흡입, 즉 비측 및/또는 경구 경로를 통한 투여에 적합한 생약 형태인 것을 특징으로 한다.

흡입은 기도를 통한 흡수를 의미한다. 이것은 가스, 미세액적 또는 분말 현탁액의 형태로 치료 화합물을 흡수하는 방법이다.

흡입에 의한 2가지 유형의 투여를 구별할 수 있다:

· 조성물이 분말 형태일 때 통기에 의한 투여, 및

· 조성물이 에어로졸 (현탁액)의 형태 또는 가압 용액, 예를 들어 수용액의 형태일 때 분무에 의한 투여. 약학 또는 수의학 조성물을 투여하기 위해 네뷸라이저 또는 스프레이의 사용이 권장될 것이다.

흡입을 통한 딜티아젬의 투여에 적합한 생약 형태는 분말, 액적의 수성 현탁액, 또는 가압 용액으로부터 선택된다.

본 발명의 일 양상에 따라서, 약학 또는 수의학 조성물은 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한, 딜티아젬의 유효량을 포함한다.

당업자는 그들의 일반 지식을 통해서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현에 대한 작용을 수득하기 위해 투여되어야 하는 딜티아젬의 유효량을 쉽게 확인할 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한,

- III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 딜티아젬, 및

- 항바이러스성 화합물, 항박테리아성 화합물, 및 병원성 미생물에 의한 감염의 예방을 위한 작용제로부터 선택되는 적어도 하나의 다른 활성제

를 포함하는 병용 산물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의해 감염되거나 또는 그러한 감염에 감수성인 개체에서 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이러한 개체에게 III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위해, 딜티아젬을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의해 감염되거나 또는 그러한 감염에 감수성인 개체에서 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 개체에게 딜티아젬을 투여하는 단계를 포함하고, 딜티아젬은 III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용된다.

본 발명은 또한 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의해 감염되거나 또는 그러한 감염에 감수성인 동물에서 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이러한 동물에게, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 억제하기 위해서, 딜티아젬을 투여하는 단계를 포함한다.

딜티아젬의 이러한 투여는 바람직하게 흡입에 의해 수행될 것이다.

실시예

본 섹션에서 제시되는 실시예는 제한하려는 것이 아니며, 오직 상기 기술된 바와 같은 본 발명을 예시하는 것임을 이해한다.

실시예 1. III형 인터페론 유전자의 발현의 딜티아젬에 의한 유도의 RNAseq 및 RT-qPCR에 의한 특징규명.

A- 재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix)의 기저측 극에 도포된 딜티아젬

공급사 Epithelix의 설명서에 따라서 공기-액체 계면에서 배양액 중에 유지된 재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix)는 그들 기저측 극에서 그들 배양 배지를 통해서 딜티아젬 (90 μM)으로 처리하였거나 또는 처리하지 않았다. 딜티아젬 처리는 3 연속일 동안 반복되었다 (총 3회 투여).

처리 및 미처리 상피는 150 μL의 RLT 완충액 (Qiagen)으로 용해시켰다. 전체 RNA는 공급사의 설명서에 따라서 RNeasy 키트 (Qiagen)를 사용해 추출하였다.

cDNA 라이브러리는 공급사의 설명서에 따라서 ScriptSeq™ Complete Gold Kit-Low Input (SCL6EP, Epicentre)을 사용해 200 ng의 전체 RNA로부터 제조하였다. 각각의 라이브러리는 ScriptSeq™ Index PCR Primers Kit (RSBC10948, Epicentre)에 제공된 프라이머를 사용하여 증폭, 정량 및 색인하였고 시퀀싱하였다. 시퀀싱은 샘플 당 시퀀싱되는 4천만개 "판독치"의 최소 요건으로 Illumina HiSeq 2500 시스템에서 수행하였다.

데이터의 역다중화 및 시퀀싱 결과의 BCL 파일의 FASTQ 파일로의 전환은 1.8.4 버전의 Illumina's bcl2fastq 도구를 사용해 수행하였다. FastQC 소프트웨어 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)를 사용하여 미가공 데이터에 필요한 품질 관리를 수행하였다. "트리밍"은 Q30과 동등한 최소 품질 한계치로, Trimmomatic 도구를 사용해 수행하였다. Kallisto 소프트웨어를 사용한 인간 게놈 (호모 사피엔스: GRCh38.p11)에 대해 트리밍된 판독치의 가성-정렬을 수행한 후에, R 3.3.1 소프트웨어 및 EdgeR 3.14.0 패키지를 사용한 통계 분석을 수행하였다.

딜티아젬으로 처리된 상피 세포 및 대조군 상피 세포 간 유전자 발현의 편차는 벤자민-호흐베르크 (Benjamini-Hochberg) 방법에 의한 p-값 보정과 선형 모델을 사용해 계산하였다.

2 이상의 발현 편차, 및 0.05 미만의 보정된 p-값을 나타내는 유전자만을 나머지 분석에서 고려하였다.

이들 유전자는 DAVID 6.8 도구를 사용한 기능 농축 분석을 비롯하여 STRING 도구를 사용한 연관성 및 상호작용 연구를 수행하였다.

도 1A는 딜티아젬 처리된 인간 호흡기 상피 및 미처리된 대조군 인간 호흡기 상피 간에 관찰된 III형 인터페론 IFN-λ1, IFN-λ2 및 IFN-λ3 유전자의 발현 비율을 도시한다.

도 1B는 딜티아젬-처리된 인간 호흡기 상피 및 미처리된 대조군 인간 호흡기 상피 간에 관찰된 IFI44L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, ISG15, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 및 STAT1과 같은 III형 인터페론 반응 유전자의 발현 비율을 도시한다.

3일 동안 재구성 인간 호흡기 상피의 딜티아젬 처리가 III형 인터페론 IFN-λ1, IFN-λ2 및 IFN-λ3을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 유의하게 변경시켜서, 이것이 유의하게 증가 (미처리 대조군 상피와 비교하여 100배 내지 200배 초과)된다는 것이 명확하다. 또한, 이러한 처리는 또한 IFI44L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, ISG15, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 및 STAT1과 같은 III형 인터페론 반응 유전자의 발현을 유의하게 자극시킨다.

B- 재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix)의 첨극에 도포된 딜티아젬

우리는 기저측부 배지를 통한 상피의 딜티아젬 처리 (마우스 모델 및 인간에서 경구 전달 모방)가 IFN III 경로의 발현을 유도시킨다는 것을 상기에서 확인하였다.

이러한 실험의 목적은 생체내에서 비내 경로를 통한 전달 방식을 모방하는, 상피의 첨극을 통해 분자가 투여될 때 딜티아젬에 의한 이러한 유도가 또한 유효하다는 것을 확인하는 것이었다.

도 1C는 미처리 상피 (대조군)의 내생적 발현과 비교하여, 내생성 IFNL1 (인터페론 람다 I) 유전자의 발현에 대해, 딜티아젬으로 재구성 인간 상피 모델 (MucilAir® HAE, Epithelix)의 첨극 처리 이후 24시간에 수득된 결과를 제시한다. 측정은 RT-qPCR을 통해 수행하였다.

수득된 결과는 그들 첨극을 통한 딜티아젬에 의한 재구성된 인간 호흡기 상피의 처리가 대조군 (미처리) 상피와 비교하여 6:1 보다 더 높은 발현 비율로, IFNL1 유전자의 상당한 과발현을 유도한다는 것을 의미한다.

이들 결과는 재구성 인간 호흡기 상피의 첨극을 통해 투여된 딜티아젬 (이러한 투여 경로는 비내 생체내 투여를 시험관내에서 모방함)을 비롯하여, 경구 생체내 투여를 모방하는, 기저측 극을 통한 처리가 또한 IFN III 경로를 활성화시킨다는 것을 확인 가능하게 한다.

실시예 2. "III형 인터페론" 반응과 연관된 8개 유전자의 발현의 딜티아젬에 의한 유도의 RT-qPCR에 의한 확인.

재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix)는 공급사 Epithelix의 설명서에 따라서 공기-액체 계면에서 배양으로 유지되었고 그들 기저측 극에서 그들 배양 배지를 통해 딜티아젬 (90 μM)으로 처리되었거나 또는 처리되지 않았다. 딜티아젬 처리는 3 연속일 동안 반복되었다 (총 3회 투여).

처리 및 미처리 상피는 150 μL의 RLT 완충액 (Qiagen)을 사용해 용해시켰다. 전체 RNA는 공급사의 설명서에 따라서 RNeasy 키트 (Qiagen)를 사용해 추출하였다. 역전사 단계 이후에, 실시간 정량적 PCR 반응은 96웰 플레이트에서 StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용해 수행하였다.

정량적 PCR 프라이머 (GAPDH: Hs02758991_g1, IFNL1: Hs00601677_g1, IFNL2: Hs00820125_g1, IFIT1: Hs01675197_m1, IFIT2: Hs00533665_m1, IFIT3: Hs00382744_m1, IFI27: Hs01086373_g1, IFI44L: Hs00915292_m1, IFITM1: Hs01652522_g1) 및 프로브 (TaqMan 유전자 발현 어세이)는 Thermo Fisher Scientific가 제공하였다.

각 샘플은 삼중으로 분석하였고 Ct (cycle threshold)는 GAPDH 기준에 대해 정규화하였다.

딜티아젬 처리된 세포 및 미처리된 세포 간 IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFI27, IFN-1, IFN-2, IFI44L 및 IFITM1 유전자의 발현 비율은 2ΔΔCt 방법 (Livak and Schmittgen, 2001)으로 결정하였다.

도 2는 수득된 결과를 제시한다: 딜티아젬으로 처리 이후에, 재구성 상피는 미처리 상피와 비교하여 IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFI27, IFN-λ1, IFN-λ2, IFI44L 및 IFITM1 유전자의 발현의 상당한 증가를 보여준다.

실시예 3. III형 인터페론 람다 1 (IL-29)의 딜티아젬-자극된 분비의 ELISA 측정.

재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix)는 공급사 Epithelix의 설명서에 따라서 공기-액체 계면에서 배양으로 유지시켰고 그들 기저측 극에서 그들 배양 배지를 통해 딜티아젬 (90 μM)으로 처리하였거나 또는 처리하지 않았다. 딜티아젬 처리는 3 연속일 동안 반복되었다 (총 3회 투여).

딜티아젬으로 처리 및 미처리된 인간 호흡기 상피의 첨극 및 기저측 극에서 인터페론 람다 1 (IL-29)의 분비 수준 (pg/mL)은 공급사의 설명서 (#3570-1H, Mabtech, Stockholm, Sweden)에 따라서 처리 72시간 이후에 ELISA를 통해 측정하였다.

도 3은 수득된 결과를 제시한다: IFN-λ1 (IL-29) 분비는 상피 배양 배지를 통한 딜티아젬 처리 이후에 첨극에서 매우 급격하게 증가되며, 유의하지만 덜 두드러진 증가가 또한 처리된 상피의 기저측 극에서 관찰된다.

실시예 4. 딜티아젬 처리는 호흡기 세포융합 바이러스의 복제를 유의하게 감소시킨다.

A - 시험관내 결과

재구성 인간 호흡기 상피 (MucilAir® HAE, Epithelix)는 공급사 Epithelix의 설명서에 따라 공기-액체 계면에서 배양으로 유지되었고 1의 감염 다중도 (MOI)로 호흡기 세포융합 바이러스 (Long 균주, ATCC VR-26)로 감염시킨 후에, 그들 기저측 극에서 그들 배양 배지를 통해 딜티아젬 (90 μM)으로 처리되었거나 또는 처리되지 않았다. 딜티아젬 처리는 감염 후 5시간에 수행하였고 그 다음으로 3 연속일 동안 반복되었다 (총 4회 투여).

감염 후 6일에, 처리 및 미처리의 감염된 상피의 첨극에서의 샘플을 비롯하여, 상피 자체를 150 μL의 RLT 완충액 (Qiagen)으로 용해시켰다. 실험 과정은 도 4A에 개략적으로 표시된다.

전체 RNA는 첨극에서, 즉 상청액 (도 4B)을 비롯하여, 상피 (도 4C)에서 RT-qPCR에 의한 바이러스 게놈 카피수 (F 유전자)의 정량을 위해, 공급사의 설명서에 따라서, RNeasy 키트 (Qiagen)를 사용해 추출하였다.

도 4B 및 4C는 재구성 인간 호흡기 상피가 그들 기저측 극을 통해 딜티아젬 (90 μM)으로 감염 후에 처리되었을 때, 바이러스 게놈의 양이 미처리 상피와 비교하여 배양 상청액 (도 4B) 및 상피 (도 4C) 둘 모두에서 훨씬 더 낮다는 것을 보여준다. 그러므로 딜티아젬은 재구성 인간 호흡기 상피 모델에서 호흡기 세포융합 바이러스에 대해 유의한 항바이러스 효과를 갖는다.

B- 생체내 결과

딜티아젬 (경구) 처리는 챌린지 감염 이후에 BALB/c 마우스 모델에서 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)의 복제를 감소시킨다.

도 4D는 마우스의 감염 및 처리 연대표를 개략적으로 표시한다:

- BALB/c 마우스는 5마리 개체의 3개 그룹으로 임의추출하였고 그 다음으로 5Х10⁵ PFU의 RSV를 함유하는 50 μL의 바이러스 현탁액으로 비내 감염시켰다 (0일). 감염 6시간 전에, 마우스는 40 mg/kg의 복강내 리바비린 (RSV RIB) 또는 50 mg/kg의 경구 딜티아젬 (RSV DIL), 또는 음성 대조군으로서 PBS (RSV PBS)로 처리되었다.

- 동일한 처리를 24시간 마다 반복하여서, 리바비린의 경우 총 3회 처리, 및 딜티아젬 또는 PBS의 경우 총 5회 처리하였다.

- 감염 후 5일 (D5, 최고 바이러스 복제에 상응)에, 각 그룹의 마우스를 안락사시켰고 그들 폐를 무균적으로 회수하여 RTqPCR을 통해 그들의 폐 바이러스 역가 (F 유전자)를 측정하였다.

감염 후 5일에 폐로부터 추출된 RNA의 총량에 대해서 RSV 바이러스 게놈 카피수의 RT-qPCR 정량 (F 유전자의 카피수 정량)을 수행하였고, 그 결과는 도 4E에 제시되어 있다.

딜티아젬으로 처리된 동물 (RSV DIL)은 대조군의 동물 (RSV PBS) 및 리바비린-처리군의 동물 (RSV RIB)과 비교하여 폐 바이러스 역가가 유의하게 감소되었다.

다음의 통계 검정을 사용하였다: 모의 조건 (PBS 처리)와 각 바이러스를 비교하기 위해 본페로니 (Bonferroni) 사후 검정과 단측 ANOVA. * p < 0.05.

그러므로 딜티아젬은 생체내 마우스 모델에서 호흡기 세포융합 바이러스에 대해 유의한 항바이러스 효과를 갖는다.

실시예 5. 딜티아젬 처리는 3형 파라인플루엔자 바이러스의 복제를 유의하게 감소시킨다

실험 설계는 도 5A에 도시되어 있다.

재구성 인간 호흡기 상피는 0.1의 MOI로 3형 인간 파라인플루엔자 바이러스 (균주 C243 ATCC VR-93)로 감염시켰고 90 μM의 딜티아젬으로 기저측부 배지의 처리는 감염 후 2시간에 시작하여서 4 연속일 동안 매일 계속하였다. 상피의 무결성을 반영하는 TEER (Transepithelial electrical resistance)은 감염 후 48시간 부터 감염 후 120시간 까지 1일 1회 측정하였다.

첨단부 감염성 바이러스 역가 (TCID50/mL)는 도 5A에 도시된 바와 같이, 감염 후 48 시간 (hpi)에 시작하여 120 hpi 까지, 수집된 세척액으로부터 LLC-MK2 세포에서 결정하였다.

도 5B는 다음의 실험 이후에 수득된 결과를 도시한다: 96 hpi 및 120 hpi에, 미처리된 재구성 인간 호흡기 상피 (좌측 이미지) 및 딜티아젬-처리된 인간 호흡기 상피 (우측 이미지)를 현미경 하에서 관찰하였다. hPIV-3에 의해 유도된 세포변성 효과는 딜티아젬 처리된 것과 달리, 미처리된 재구성 인간 호흡기 상피에서 더 크고 현미경으로 쉽게 볼 수 있었다.

도 5C는 재구성 인간 호흡기 상피에서 측정된, 감염 후 시간 함수에 따른 TEER 값을 도시한다:

- 미처리, 미감염;

- 미처리, hPIV-3 감염; 및

- 딜티아젬 처리, hPIV-3 감염.

이들 결과는 처리 부재에서, 그 무결성이 보다 잘 보존된 것으로 보이는, 딜티아젬 처리된 재구성 인간 호흡기 상피에서 측정된 값과 달리, 24 hpi로부터, TEER 값이 유의하게 감소된다는 것을 입증한다.

도 5D는 딜티아젬으로 처리 및 미처리된 재구성 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면에서 시간 경과 (48 hpi 내지 120 hpi)에 따라 측정된 바이러스 역가 (LLC-MK2에서 (TCID50/mL))를 도시한다.

감염 후 72시간 (10⁶ TCID50/mL) 및 감염 후 96시간 (10⁵ TCID50/mL)에 유의하게 더 낮은 값을 보이는, 딜티아젬 처리된 재구성 인간 호흡기 상피와 달리, 처리 부재에서, 재구성 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면에서 측정된 감염성 바이러스 역가는 감염 후 72시간에 10⁸ TCID50/mL의 값 및 감염 후 96시간에 10⁷ TCID50/mL의 값으로 최고였다.

전체로, 이들 결과는 딜티아젬 처리가 감염된 재구성 인간 호흡기 상피 모델에서 hPIV-3의 바이러스 복제를 감소시킨다는 것을 의미한다.

실시예 6. 딜티아젬 처리는 박테리아 슈도모나스 애루지노사의 증식을 유의하게 감소시킨다

실험 설계는 도 6A에 도시된다.

재구성 인간 호흡기 상피는 기저측부 배지 중에서 90 μM의 딜티아젬으로 또는 대안적으로 첨단부 표면에서 10 μL의 90 μM 딜티아젬으로 감염 이전 24시간에 전처리되었고, 그 다음으로 1의 MOI로 슈도모나스 애루지노사 (PAK 균주)로 감염되었으며, 감염 후 2시간에 딜티아젬으로 재처리되었다.

결과는 도 6B (기저측부 처리) 및 6C (첨단부 표면 처리)에 제시된다.

기저측부 상황에서 (n = 2), 감염 후 24시간에 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면에서 수집된 박테리아의 수는 기저측부 배지에서 딜티아젬으로 처리된 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면으로부터 수집된 박테리아의 수에 비해서 유의하게 더 낮았다 (각각 115 및 106 vs 76 및 106 CFU, * p<0.05).

딜티아젬으로 첨단부 처리 상황에서, 슈도모나스 애루지노사에 대해 유사한 효과가 감염 후 24시간 (n=2)에 관찰되었는데, 미처리된 것과 비교하여 딜티아젬으로 처리된 인간 호흡기 상피의 첨단부 표면으로부터 수확된 박테리아가 유의하게 감소되었다 (각각 87 및 106 대 63.5 및 106 CFU).

전체로, 이들 결과는 딜티아젬 처리가 인간 호흡기 상피에서 슈도모나스 애루지노사의 복제를 제한한다는 것을 의미한다.

실시예 7. 딜티아젬 처리는 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV)의 증식을 유의하게 감소시킨다.

비측 기원의 재구성 인간 상피 모델 (MucilAir® HAE, Epithelix)에서 바이러스 복제는 딜티아젬을 처리하였거나 또는 처리하지 않은 상피에서 연구하였다. 그러한 목적을 위해서, (i) 형광 광학 현미경 사진을 사용하여 효능 및 감염의 진행을 평가하였고, (ii) RTqPCR에 의한 바이러스 게놈의 정량은, 한편으로는 바이러스 자손의 배출을 정량하기 위해 상피의 첨극 (표면 수확)에서, 그리고 다른 한편으로는 상피 내에서 세포내 바이러스 복제를 정량하기 위해 종료점 (감염 후 5일)에 상피 세포의 전체 용해물에서 수행하였다.

실험의 연대 표시는 도 7A에 제시된다.

인간 호흡기 상피 (Mucilair, Epithelix)는 0.1의 MOI로 재조합 hMPV-GFP 바이러스 (균주 C-85473)로 감염시켰고, 그 다음으로 감염 후 D0, D1 및 D3에 90 μM로 딜티아젬의 3회 연속 용량을 처리 (상피의 기저측부 배지를 통함)하거나 또는 처리하지 않았다 (조건 당 3종 상피).

에피형광 현미경 관찰을 감염 후 D4에 수행하여서 바이러스 복제에 대한 딜티아젬 처리의 영향을 관찰하였다 (도 7B). 처리 부재에서, GFP의 바이러스 발현에 해당하는 형광이 거의 모든 상피에서 감염 후 D4에 관찰되는 반면, 감염 후 동일 시간에 딜티아젬 처리된 감염된 상피에서는 매우 적은 형광 세포가 존재한다.

감염 후 3일에, 처리 또는 미처리된 감염 상피의 첨극에서의 세척이 생성된 바이러스 자손을 수확하기 위해 수행되었다. 게놈 바이러스 RNA를 추출하였고 HMPV N 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용한 RT-qPCR (Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green, Thermo Fisher Scientific)을 통해 정량하였다. 결과는 N 유전자의 카피수/추출된 RNA의 μg으로 표시된다 (도 7C).

qPCR 결과는 미처리된 상피에서 수확된 첨극 상청액에 매우 많은 양의 바이러스 게놈이 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 바이러스 게놈 정량은 상피의 감염 이후에 바이러스 자손 생성 수준을 반영한다. 비교하여, 딜티아젬-처리된 상피로부터 수집된 첨단부 상청액에서 측정된 바이러스 게놈의 양은 유의하게 낮다 (2 log10) (도 7C).

감염 후 5일에, 상피 세포를 수확하였고 용해시켜서 전체 RNA를 추출하였다. hMPV N 바이러스 유전자에 상응하는 전체 RNA는 HMPV N 유전자를 함유하는 플라스미드로부터 만들어진 범위를 사용해, RT-qPCR (Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green, Thermo Fisher Scientific)을 통해 정량하였다. 결과는 N 유전자의 카피수/추출된 RNA의 μg으로 표시된다 (도 7D).

qPCR 결과는 미처리된 상피에 매우 많은 양의 바이러스 게놈이 존재한다는 것을 의미한다. 다른 한편으로, 딜티아젬으로 처리된 상피에서 바이러스 게놈의 양은 4 log10 만큼 더 낮다.

전체로, 이들 결과는 딜티아젬 처리가 hMPV 바이러스 복제를 유의하게 감소시킨다는 것을 의미한다.

실시예 8. RT-qPCR로 측정된 IFN-λ2 (IFNL2) 유전자 발현의 생체내 딜티아젬 유도

도 8A는 BALB/c 마우스의 비내 (i.n.) 점적주입에 의한 치료 연대표를 개략적으로 나타낸다: 마우스는 0일 (D0)에 처리 (20 mg/kg) 또는 미처리 ("모의-처리" PBS 대조군)되었고, 그 다음에 후속 2일 (D0, D1 및 D2) 동안 매일 또는 4일 까지 48시간 마다 (D0, D2 및 D4) 처리되거나 또는 처리되지 않았다. D5에, 동물의 안락사 이후에 비강을 제거하였다.

전체 RNA는 공급사의 설명서에 따라서 RNeasy 키트 (Qiagen)를 사용해 샘플로부터 추출하였다. 역전사 단계 이후에, 실시간 정량적 PCR 반응은 공개물 (Galani et al. Immunity 2017)에 기술된 프로토콜에 따라서, StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용해 수행하였다.

IFN-λ2 유전자 (IFNL2)의 발현은 RT-qPCR로 측정하였고, 도 8B에서 미처리 (모의-처리) 마우스에서 측정된 기준 수준 (1과 동일)에 대비하여 도시된다.

이들 결과는 경구 처리뿐만 아니라, 마우스 모델에서 비내로 투여된 딜티아젬이 또한 IFN III 경로를 활성화시킨다는 것을 확인할 수 있게 해준다.

참조 문헌

특허

WO 02/094238

US 4,605,552

WO 87/07508

WO 2011/066657

WO 2011/126071

WO 2016/146836

EP 1 117 408

서지 참조

Claims (16)

1. III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬.
2. 기도 및/또는 장관의 상피의 적어도 하나의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 사용을 위한 딜티아젬.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 인터류킨 29를 코딩하는 유전자, 인터류킨 28A를 코딩하는 유전자, 및 인터류킨 28B를 코딩하는 유전자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 감염은 인플루엔자 바이러스 감염이 아닌 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 병원성 미생물은 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV), 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 니파 바이러스, 노보바이러스, 코로나바이러스, 돼지 열병 바이러스, 아데노바이러스, 지카 바이러스, 황열 바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스, 뎅기 바이러스, 및 웨스트 나일 바이러스로부터 선택되는 바이러스인 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
6. 제 5 항에 있어서, 병원성 미생물은 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV)인 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
7. 제 5 항에 있어서, 병원성 미생물은 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV)인 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
8. 제 5 항에 있어서, 병원성 미생물은 메타뉴모바이러스 (hMPV)인 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
9. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 병원성 미생물은 박테리아, 진균 및 기생충으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
10. 제 9 항에 있어서, 병원성 미생물은 하기 박테리아 종으로부터 선택되는 박테리아인 것을 특징으로 하는, 딜티아젬: 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella Typhimurium), 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 해모필러스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae), 캄필로박터 (Campylobacter) spp., 살모넬라 (Salmonella) spp., 시겔라 (Shigella) spp., 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 및 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile).
11. 제 10 항에 있어서, 병원성 미생물은 박테리아 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)인 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
12. 제 2 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염은 적어도 하나의 바이러스 및 적어도 하나의 박테리아에 의한 동시-감염인 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 다른 활성제와 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 다른 활성제는 항바이러스성 화합물, 항박테리아성 화합물, 항기생충성 화합물, 항진균성 화합물, 및 예방 또는 치료 백신으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 딜티아젬.
15. 기도 및/또는 장관의 상피의 병원성 미생물에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한, III형 인터페론을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 작용제로서 딜티아젬을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물.
16. 제 15 항에 있어서, 흡입에 의한 투여에 적합한 생약 (galenic) 형태인 것을 특징으로 하는, 약학 또는 수의학 조성물.

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