CN118064410A - 一种抗病毒蛋白酶cpavm1及其应用 - Google Patents

一种抗病毒蛋白酶cpavm1及其应用 Download PDF

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孟广勋
李娟�
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Abstract

本发明人发现一蛋白酶CPAVM1有望构成抗病毒药物的关键功能成分。该蛋白酶可切割病毒多种重要蛋白，从而使病毒颗粒被破坏。本发明蛋白酶有助于对多种病毒的传播和感染的控制。

Description

一种抗病毒蛋白酶CPAVM1及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和微生物学领域，具体地，本发明涉及一种具有抗病毒活性的蛋白酶及其应用。
背景技术
流感感染是由流感病毒引起的高度传染性急性发热性呼吸道疾病，在全球范围内引起显著的发病率和死亡率。流感每年可感染大约10亿人，可导致290,000至650,000人死亡。
感病毒基因组由八个单链负义病毒RNA(vRNA)的(甲型和乙型流感病毒)片段组成。vRNA片段组装成病毒核糖核蛋白(vRNP)复合物，其中5'和3'末端由病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)结合，其余RNA与寡聚病毒核蛋白(NP)结合，形成双螺旋杆状结构。流感病毒必须在受感染的细胞中表达完整的基因组片段才能具有生产性传染性。
抗病毒药物代表了一种抗流感病毒策略，但耐药性迅速使这些药物无效。而且，多种流感亚型的存在使得开发通用的抗流感病毒策略变得困难。
中医药(TCM)在治疗流感的许多理论和实践方法上占主导地位。临床实践表明，中医药早期干预是提高治愈率、缩短病程、延缓疾病进展、降低病死率的实用医学方法。中草药具有治疗感冒、发烧和抗炎作用，如陈皮(陈皮)。陈皮用于健脾、化痰、止咳等呼吸道疾病的治疗。陈皮是经过陈化处理的植物柑桔的干果皮。但中医药相关细菌的报道较少。
芽孢杆菌属被认为是寻找新的抗菌物质的有希望的来源，因为它们能够产生大量的抗菌肽。一些蛋白酶，如跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)最近被证明对一些人类流感病毒的血凝素切割至关重要。气道蛋白酶抑制代表了一种有吸引力的宿主细胞靶向方法，可以对抗流感等呼吸道病毒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种具有抗病毒活性的蛋白酶及其应用。
在这里，本发明人提供了一个成功的范例，使用来自一种新菌株的CPAVM1蛋白酶对流感病毒进行抗病毒活性研究。本发明人发现该CPAVM1蛋白酶会切割流感病毒的蛋白质、可灭活流感病毒，显示出阻止流感病毒传播和感染的能力。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的多肽，所述的多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有抗病毒活性的由(a)衍生的多肽；
(c)氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的同源性≥85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，并具有抗病毒活性的多肽。
在另一优选例中，所述的多肽为SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸为选自下组的序列：
(A)编码如本发明第一方面所述多肽的核苷酸序列；
(B)编码如SEQ ID NO:11所示多肽的核苷酸序列；
(C)与编码SEQ ID NO:11所示多肽的核苷酸序列的同源性≥85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的核苷酸序列；
(D)在SEQ ID NO:11所示多肽的核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；
(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
在本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述分离的多肽的用途，它被用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于抗病毒。
在另一优选例中，所述的抗病毒包括：(a)抗流感病毒；(b)抗EV71病毒；(c)抗HSV病毒；(d)抗冠状病毒；(e)抗肝炎病毒；(f)抗登革热病毒；(g)抗埃博拉病毒；(h)抗SINV(辛德毕斯病毒)；(i)抗SFV(塞米利奇森林病毒)；(j)ZIKV(寨卡病毒)；和(k)抗疱疹病毒。
在另一优选例中，所述的多肽选自下组：
(a)如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有抗病毒活性的多肽；
(c)氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的同源性≥85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，并具有抗病毒活性的多肽。
在另一优选例中，所述的多肽为氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的多肽。
在另一优选例中，编码所述多肽的核苷酸选自下组：
(A)编码如SEQ ID NO:11所示多肽的多核苷酸；
(B)核苷酸序列与SEQ ID NO:11所示多肽的多核苷序列的同源性≥85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的多核苷酸；
(C)如SEQ ID NO:11所示多肽的多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(D)与(A)-(C)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：(a)如本发明第一方面所述的多肽、或如本发明第二方面所述的多核苷酸、或如本发明第三方面所述的载体、或其组合；和(b)药学上可接受的载体。
在本发明的第六方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：(C1)位于容器内的如本发明第五方面所述的组合物；和(C2)说明书，所述说明书注明所述药盒用于治疗病毒感染。
在本发明的第七方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的细胞为原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为酿酒酵母细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞原核细胞，如大肠杆菌。
在本发明的第八方面，提供了如在本发明第七方面所述的宿主细胞的用途，用于制备本发明本发明第一方面所述多肽、或本发明第五方面所述药物组合物。
在本发明的第九方面，提供了一种体外破坏病毒颗粒、切割病毒相关蛋白的方法，包括步骤：在病毒存在的环境中添加，如本发明第一方面所述多肽、或如本发明第五方面所述药物组合物、或如本发明第七方面所述细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述病毒包括：流感病毒、EV71、HSV、冠状病毒、肝炎病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、SINV(辛德毕斯病毒)、SFV(塞米利奇森林病毒)、ZIKV(寨卡病毒)、和疱疹病毒。
在另一优选例中，所述病毒相关蛋白包括：核蛋白(NP)、血凝素(HA)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、神经氨酸酶(NA)、和/或基质蛋白1(M1)。
在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗性的。
在本发明的第十方面，提供了一种体内抑制病毒的方法，包括步骤：
将如本发明第一方面所述多肽、或如本发明第五方面所述药物组合物、或如本发明第七方面所述细胞、或其组合，施用于感染病毒的受试对象。
在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述受试对象是人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述病毒包括：流感病毒、EV71、HSV、冠状病毒、肝炎病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、SINV(辛德毕斯病毒)、SFV(塞米利奇森林病毒)、ZIKV(寨卡病毒)、和/或疱疹病毒。
在另一优选例中，所述的多肽为具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的活性多肽。
在本发明的第十一方面，提供了一种病毒感染的治疗方法，包括步骤：将安全有效量的，如本发明第一方面所述多肽、或如本发明第五方面所述药物组合物、或如本发明第七方面所述细胞、或其组合，施用于感染病毒的所需对象，总而治疗所述对象的病毒感染。
在另一优选例中，所述受试对象是人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述病毒包括：流感病毒、EV71、HSV、冠状病毒、肝炎病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、SINV(辛德毕斯病毒)、SFV(塞米利奇森林病毒)、ZIKV(寨卡病毒)、和疱疹病毒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1为显示Bacillus subtilis LjM2核基因组圈图。从外到内：编码基因(+，黄色)，编码基因(-，蓝色)，tRNAs(橙色)，rRNAs(紫色)，基因岛(绿色)，GC含量(紫红色)，GC-Skew和测序深度(浅蓝色)。
图2为显示根据Bacillus subtilis LjM2的16S rRNA基因构建的进化树。采用MEGA8中最大似然法基于16S rRNA基因序列的系统发育树。每个节点的两个值代表1,000次重采样的引导百分比(数值>50％被展示)。
图3为显示LjM2菌株的生长曲线。发酵体系为5ml，通过测量菌液的OD600，确定Bacillus subtilis LjM2的生长曲线，每个时间点设有3个重复。
图4为显示滴鼻Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对感染流感病毒小鼠体重和死亡率的影响。流感病毒感染当天为Day 0，在感染之前0.5小时、感染后2小时、感染后12小时、感染后24小时滴鼻Bacillus subtilis LjM2细菌上清液。每天称重并记录小鼠的体重丢失和死亡情况，分析感染后的体重与初始体重(Day 0)的百分比。每天的体重百分比表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验；采用Log-rank(Mantel-Cox)检验分析生存率。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01。
图5为显示Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对MDCK细胞病毒感染载量的影响。在感染MDCK细胞之前0.5小时加入0.5％、0.1％、2％、或4％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，MDCK细胞感染病毒24小时后检测流感病毒PR8的M1基因相对含量。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01。
图6为显示Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对A549细胞病毒感染载量的影响。在感染之前0.5小时加入0.5％、0.1％、2％、或4％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，A549细胞感染病毒24小时后检测流感病毒PR8的M1基因。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05。
图7为显示Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对MDCK细胞毒性的影响。MDCK细胞培养液中加入0.5％、0.1％、2％、或4％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，24小时后使用MTT法检测MDCK细胞存活率。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01。
图8为显示Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对A549细胞毒性的影响。A549细胞培养液中加入0.5％、0.1％、2％、或4％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，24小时后使用MTT法检测A549细胞存活率。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01。
图9为显示Bacillus subtilis LjM2细菌上清液抑制流感感染A549细胞的阶段。感染前A549细胞培养液中加入0.5％、0.1％、或2％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，感染后在4℃感染1小时(结合阶段)、在37℃感染6小时(进入阶段)、或在37℃感染24小时(复制阶段)后测流感病毒PR8的M1基因相对含量。感染后细胞培养基中病毒用于病毒滴定。。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图10为显示Bacillus subtilis LjM2细菌上清液抑制流感感染MDCK细胞的阶段。感染前30分钟在MDCK细胞培养液中加入0.5％、0.1％、或2％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，在4℃感染1小时(结合阶段)、在37℃感染6小时(进入阶段)、或在37℃感染24小时(复制阶段)后测流感病毒PR8的M1基因相对含量。感染后细胞培养基中病毒用于病毒滴定。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图11为显示Bacillus subtilis LjM2细菌上清液在结合阶段抑制流感感染A549细胞。感染前30分钟在A549细胞培养液中加入2％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液或BHI培养基，在4℃感染30分钟。
图12为显示Bacillus subtilis LjM2细菌上清液在结合阶段抑制流感感染MDCK细胞。感染前30分钟在MDCK细胞培养液中加入2％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液或BHI培养基，在4℃感染30分钟。
图13为显示Bacillus subtilis LjM2(2％)处理流感病毒TEM图像。流感病毒PR8与Bacillus subtilis LjM2细菌上清液共孵育12小时后，观察流感病毒颗粒。
图14为显示免疫印迹分析不同浓度Bacillus subtilis LjM2细菌上清液直接破坏病毒颗粒。不同浓度(5μl、10μl、15μl)的LjM2细菌上清液对流感病毒PR8处理12小时后通过免疫印迹分析核蛋白(NP)蛋白。
图15为显示免疫印迹分析短时间内Bacillus subtilis LjM2细菌上清液直接破坏病毒颗粒。LjM2细菌上清液处理流感病毒PR8不同时间(0、2、5、10、5、10、15分钟)，通过免疫印迹分析核蛋白(NP)蛋白。
图16为显示滴鼻CPAVM1对感染流感病毒小鼠体重和死亡率的影响。流感病毒感染当天为Day 0，感染后2小时或感染后12小时滴鼻CPAVM1。感染后2小时后滴鼻不同浓度(0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml)的CPAVM1。每天称重并记录小鼠的体重丢失和死亡情况，分析感染后的体重与初始体重(Day 0)的百分比。每天的体重百分比表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验；采用Log-rank(Mantel-Cox)检验分析生存率。显著性差异：*P<0.05。
图17为显示CPAVM1对A549细胞病毒感染载量的影响。在感染之前0.5小时加入0.125μg、0.25μg、0.5μg、1μg、或2μg的CPAVM1，在4℃感染A549细胞感染病毒1小时后检测流感病毒PR8的M1基因。结果表示为mean±SEM，双尾Student’st检验。显著性差异：*P<0.05。
图18为显示CPAVM1对MDCK细胞病毒感染载量的影响。在感染之前0.5小时加入0.125μg、0.25μg、0.5μg、1μg、或2μg的CPAVM1，在4℃感染MDCK细胞感染病毒1小时后检测流感病毒PR8的M1基因。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05。
图19为显示CPAVM1对A549细胞毒性的影响。A549细胞培养液中加入不同浓度的0.125μg、0.25μg、0.5μg、或1μg的CPAVM1，24小时后使用MTT法检测A549细胞存活率。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。
图20为显示CPAVM1对MDCK细胞毒性的影响。MDCK细胞培养液中加入不同浓度的0.125μg、0.25μg、0.5μg、或1μg的CPAVM1，24小时后使用MTT法检测A549细胞存活率。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。
图21为显示CPAVM1蛋白抑制流感感染A549细胞。感染前30分钟在A549细胞培养液中加入2mg/ml的CPAVM1或PBS，在4℃感染30分钟。
图22为显示CPAVM1蛋白抑制流感感染MDCK细胞。感染前30分钟在MDCK细胞培养液中加入2mg/ml的CPAVM1或PBS，在4℃感染30分钟。
图23为显示免疫印迹分析不同浓度CPAVM1蛋白直接破坏病毒颗粒。不同浓度(0.25μg、0.5μg、1μg、2μg、4μg、8μg)的CPAVM1蛋白和对照组NUS标签蛋白对流感病毒PR8处理12小时后通过免疫印迹分析核蛋白(NP)蛋白。
图24为显示CPAVM1蛋白处理流感病毒TEM图像。流感病毒PR8与CPAVM1蛋白细菌上清液共孵育1小时后，观察流感病毒颗粒。
图25为显示CPAVM1蛋白基因敲除的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对A549细胞病毒感染载量减弱的影响。在感染A549细胞之前0.5小时加入0.25％、0.5％、1％、或2％的CPAVM1蛋白基因敲除前后Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，在4℃感染A549细胞感染病毒1小时后检测流感病毒PR8的M1基因相对含量。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05。
图26为显示CPAVM1蛋白敲除的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液在A549细胞上抗流感病毒感染减弱的作用。感染前30分钟在A549细胞培养液中加入Bacillussubtilis LjM2细菌上清液(2％)，CPAVM1蛋白敲除的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液(2％)或PBS，在4℃感染30分钟。
图27为显示CPAVM1蛋白敲除的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液在MDCK细胞上抗流感病毒感染减弱的作用。感染前30分钟在MDCK细胞培养液中加入Bacillussubtilis LjM2细菌上清液(2％)，CPAVM1蛋白敲除的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液(2％)或PBS，在4℃感染30分钟。
图28为显示免疫印迹分析CPAVM1蛋白敲除后Bacillus subtilis LjM2细菌上清液直接破坏病毒颗粒减弱的作用。不同浓度(5μl、10μl、15μl)的LjM2细菌上清液和CPAVM1蛋白敲除后Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对流感病毒PR8处理1小时后通过免疫印迹分析核蛋白(NP)蛋白。
图29为显示免疫印迹分析CPAVM1蛋白对NP蛋白的直接剪切作用。不同浓度CPAVM1蛋白(0.03μg，0.12μg，0.3μg，1.2μg，1.5μg，3μg，30μg)对流感病毒PR8的NP蛋白处理1小时后通过免疫印迹分析核蛋白(NP)蛋白。
图30为显示免疫印迹分析CPAVM1蛋白对流感病毒WSN的多种蛋白切割作用。不同浓度CPAVM1蛋白(0μg/μl，0.1μg/μl，0.33μg/μl，1μg/μl)对流感病毒293T细胞表达WSN的蛋白(核蛋白(NP)、血凝素(HA)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、神经氨酸酶(NA)、和基质蛋白1(M1)，基质蛋白2(M2)和非结构蛋白1(NS1))处理1小时后通过免疫印迹分析flag标签。
图31为显示UPLC-MS/MS分析CPAVM1切割NP蛋白的切割位点。被纯化的NP蛋白(纯度>97％)与CPAVM1共孵育12小时后，使用UPLC(Acquity UPLC I-Class)(Waters)与XevoG2-XS QTof(Waters)质谱连用法确认NP蛋白被CPAVM1蛋白酶切割的位点。图中峰图为肽段出峰的时间。图中表格为UPLC-MS/MS质谱中的肽段。CPAVM1蛋白酶切割NP蛋白的位点及相对蛋白序列位置在NP序列图中标出。
图32为显示CPAVM1蛋白对流感病毒H1N1 C的抑制作用。
(A)，免疫印迹分析CPAVM1蛋白对流感病毒H1N1 C的NP蛋白切割作用。不同浓度CPAVM1蛋白(0μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl，4μg/μl，8μg/μl)与流感病毒H1N1 C室温共同孵育3小时后通过免疫印迹分析NP蛋白。(B)，不同浓度的CPAVM1蛋白与流感病毒H1N1 C室温共同孵育3小时后通过加入到MDCK细胞培养液中37℃0.5小时后检测MDCK细胞上H1N1 C病毒株的M基因的表达。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图33为显示CPAVM1蛋白对流感病毒H3N2 G的抑制作用。
(A)，免疫印迹分析CPAVM1蛋白对流感病毒H3N2 G的NP蛋白切割作用。不同浓度CPAVM1蛋白(0μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl，4μg/μl，8μg/μl)与流感病毒H3N2 G室温共同孵育3小时后通过免疫印迹分析NP蛋白。(B)，不同浓度的CPAVM1蛋白与流感病毒H3N2 G室温共同孵育3小时后通过加入到MDCK细胞培养液中37℃0.5小时后检测MDCK细胞上H3N2 G病毒株的M基因的表达。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图34为显示CPAVM1蛋白对流感病毒H3N2 H的抑制作用。
(A)，免疫印迹分析CPAVM1蛋白对流感病毒H3N2 H的NP蛋白切割作用。不同浓度CPAVM1蛋白(0μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl，4μg/μl，8μg/μl)与流感病毒H3N2 H室温共同孵育3小时后通过免疫印迹分析NP蛋白。(B)，不同浓度的CPAVM1蛋白与流感病毒H3N2 H室温共同孵育3小时后通过加入到MDCK细胞培养液中37℃0.5小时后检测MDCK细胞上H3N2 H病毒株的M基因的表达。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图35为显示CPAVM1蛋白对流感病毒H9N2 s的抑制作用。
(A)，免疫印迹分析CPAVM1蛋白对流感病毒H9N2 s的NP蛋白切割作用。不同浓度CPAVM1蛋白(0μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl，4μg/μl，8μg/μl)与流感病毒H9N2 s室温共同孵育3小时后通过免疫印迹分析NP蛋白。(B)，不同浓度的CPAVM1蛋白与流感病毒H9N2 s室温共同孵育3小时后通过加入到MDCK细胞培养液中37℃0.5小时后检测MDCK细胞上H9N2 s病毒株的M基因的表达。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图36为显示CPAVM1蛋白对流感病毒H4N2 d的抑制作用。
(A)，免疫印迹分析CPAVM1蛋白对流感病毒H4N2 d的NP蛋白切割作用。不同浓度CPAVM1蛋白(0μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl，4μg/μl，8μg/μl)与流感病毒H4N2 d室温共同孵育3小时后通过免疫印迹分析NP蛋白。(B)，不同浓度的CPAVM1蛋白与流感病毒H4N2 d室温共同孵育3小时后通过加入到MDCK细胞培养液中37℃0.5小时后检测MDCK细胞上H4N2 d病毒株的M基因的表达。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图37为显示LjM2细菌上清液影响新型冠状病毒S蛋白的稳定性。(A)，新冠病毒假病毒颗粒与LjM2细菌上清液(0.5％-8％v/v)共孵育12小时后检测S蛋白的表达。(B)，稳定表达新冠病毒S蛋白质粒的HEK293T细胞裂解液与LjM2细菌上清液共孵育12小时后检测S蛋白的表达。
图38为显示LjM2细菌上清液影响EV-71感染RD细胞。在感染RD细胞之前0.5小时加入0.5％、0.1％、或2％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，RD细胞感染病毒EV-71后检测病毒TCID50含量(图A)或通过QPCR(图B)在感染24小时后检测病毒EV-71基因相对含量。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01。
图39为显示LjM2细菌上清液影响HSV-1感染vero细胞。在感染vero细胞之前0.5小时加入0.5％、0.1％、或2％的Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，vero细胞被感染病毒HSV-1后检测病毒TCID50含量(图A)或通过QPCR(图B)在感染24小时后检测病毒HSV-1基因相对含量。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.010。
图40为显示LjM2细菌上清液与CPAVM1蛋白抑制HCV丙型肝炎病毒感染huh7.5.1细胞。
2％的LjM2细菌上清液或medium与2μg/μl CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与HCV病毒共孵育1小时后作用于huh7.5.1细胞，24小时后检测细胞HCV-E2荧光强度。
图41为显示LjM2细菌上清液与CPAVM1蛋白抑制DENV登革病毒感染vero细胞。
2％的LjM2细菌上清液或medium与2μg/μl CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与DENV病毒共孵育1小时后作用于vero细胞，24小时后检测细胞DENV-E荧光强度。
图42为显示CPAVM1蛋白抑制EBOV埃博拉病毒感染huh7细胞。
2μg/μl CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与EBOV病毒共孵育1小时后作用于huh7细胞，24小时后检测细胞EBOV荧光强度。
图43为显示LjM2细菌上清液与CPAVM1蛋白抑制hadv5腺病毒感染293A细胞。
2％的LjM2细菌上清液或medium与2μg/μl CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与hadv5病毒共孵育1小时后作用于293A细胞，72小时后检测细胞hadv5荧光强度。
图44为显示CPAVM1蛋白抑制SINV辛德比斯病毒感染vero细胞。
2μg/μl CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与SINV病毒共孵育1小时后作用于vero细胞，24小时后检测细胞培养液中的病毒载量(图A)，或不同浓度的CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与SINV病毒共孵育1小时后作用于vero细胞，24小时后通过western(图B)检测SINV蛋白表达量。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.010。
图45为显示CPAVM1蛋白抑制SFV塞姆利基森林病毒感染vero细胞。
不同浓度CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与SINV病毒共孵育1小时后作用于vero细胞，24小时后通过western检测SFV蛋白表达量。
图46为显示LjM2细菌上清液与CPAVM1蛋白抑制ZIKV寨卡病毒感染vero细胞。
2％的LjM2细菌上清液或medium与2μg/μl CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与ZIKV病毒共孵育1小时后作用于vero细胞，24小时后检测细胞培养液中的病毒载量(图A)，或检测vero细胞中检测ZIKV基因表达量(图B)。结果表示为mean±SEM，双尾Student’s t检验。显著性差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.010。
图47为显示LjM2细菌上清液与CPAVM1蛋白抑制MHV68疱疹病毒感染3T12细胞。
2％的LjM2细菌上清液或medium与2μg/μl CPAVM1蛋白或等量H2O在室温下与MHV68病毒共孵育1小时后作用于3T12细胞，72小时后检测细胞MHV68荧光强度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，从陈皮所含微生物中，意外地发现一种具有抗病毒活性的蛋白酶。
具体地，陈皮(Aged dry citrus peels)是一种中药，具有治疗流感的作用，本发明人从陈皮中分离出芽孢杆菌LjM2(Bacillus subtilis LjM2T)菌株，发现芽孢杆菌LjM2菌株的细菌培养上清液具有抗甲型流感病毒的能力。本发明人通过动物实验证明了在小鼠感染流感病毒2和12小时后使用LjM2培养上清液滴鼻仍然对小鼠显示出显着的治疗作用。本发明人发现LjM2代谢的蛋白酶CPAVM1是抗病毒药物的关键功能成分。本发明人证明小鼠被感染流感12小时后CPAVM1依然有抗病毒功能。此外，本发明人证明CPAVM1蛋白破坏流感病毒颗粒，切割核蛋白(NP)、血凝素(HA)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白1(M1)。进一步本发明人的结果清楚地表明蛋白酶CPAVM1切割位点是“RA”、“KE”、“RS”、和“KW”，从而使病毒颗粒被破坏。另外，LjM2培养上清对EV71、HSV-1等病毒也有抑制作用。总之，本发明人的细菌Bacillus subtilisLjM2T和其来源的CPAVM1蛋白酶有助于对多种病毒的传播和感染的控制。在此基础上，完成了本发明。
定义
如本文所用，术语“活性多肽”、“本发明的多肽”、“本发明的酶”、“具有抗病毒活性的酶”、“本发明的CPAVM1蛋白”或“本发明的具有抗病毒活性的酶”可互换使用。
如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。
本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
所述的多肽优选序列为SEQ ID NO:11所示的多肽，该术语还包括具有与所示多肽具有相同功能的、SEQ ID NO:11序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人EGFRvA蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然人EGFRvA多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly–His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表1列出了其中的一些标签及其序列。
表1
为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述多肽的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列对应的核酸的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:11的蛋白质，但与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列对应的核酸的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:11的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:11所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的多肽对应的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码本发明多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
用途
本发明提供了一种体外破坏病毒颗粒、切割病毒相关蛋白的方法，和一种体内抑制病毒、治疗病毒感染的方法。在一些实施方案中，这些方法适用于治疗性目的。在一些实施方案中，这些方法是非诊断性和非治疗性的。
药物组合物
本发明制剂或组合物可以急性地、慢性地、或其组合施用。本发明制剂或组合物可以根据对接受其的受试者在临床和/或治疗上有益的任何给药方案来施用。其可以通过注射、静脉内、气管内、吸入、鼻喷雾、气雾剂递送系统、喷雾器、动脉内、皮下、肌肉内、皮肤涂抹、和/或输注。
本发明制剂或组合物可以包括在任何适合施用于有需要的受试者的剂型或试剂盒中。可接受的剂型包括注射剂、气管内剂型、喷雾剂、局部剂型、透皮剂型、口腔剂型、气溶胶输送系统和喷雾器。这样的剂型表现出一种或多种释放曲线，该释放曲线选自立即释放、快速释放、延长释放、持续释放、控释、肠溶释放、及其任意组合。本发明制剂或组合物可以全身或非全身给药。
本发明的方法可以进一步包括将本发明制剂或组合物和一种或多种抗病毒药物施用于感染病毒的受试者。所述抗病毒药物可以与本发明制剂或组合物联合给药或与本发明制剂或组合物分开给药。本发明制剂或组合物和所述一种或多种抗病毒药物的施用可以是分开的、同时的、重叠的或顺序的。
本发明制剂或组合物具有抗病毒活性。所述病毒可以选自但不限于：正链单链RNA病毒((+)-ss-envRNAV)、负链单链RNA病毒((-)-ss-envRNAV)、双链DNA病毒(ds-DNAV)。
在一些实施方案中，所述病毒所属的科可以选自但不限于：沙粒病毒(Arenaviridae)、动脉病毒(Arterviridae)、布尼亚病毒(Bunyaviridae)、丝状病毒(Filoviridae)、黄病毒(Flaviviridae)、正粘病毒(Orthomyxoviridae)、副粘病毒(Paramyxoviridae)、弹状病毒(Rhabdoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)(特别是三角逆转录病毒(Deltaretroviridae)属)、冠状病毒(Coronaviridae)、披膜病毒(Togaviridae)、疱疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒(Poxviridae)或肝炎病毒(Hepadnaviridae)。
在一些实施方案中，所述(+)-ss-envRNAV可以选自但不限于：冠状病毒科、黄病毒(Flaviviridae)科、披膜病毒(Togaviridae)科和动脉病毒(Arterviridae)科的病毒。在一些实施方案中，所述(+)-ss-envRNAV可以是对人类具有致病性的冠状病毒。
在一些实施方案中，所述(+)-ss-envRNAV可以是选自但不限于：黄病毒(flavivirus)、黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎(Japanese Enchephalitis)病毒、西尼罗河(West Nile)病毒、寨卡病毒(Zikavirus)、蜱传脑炎(Tick-borne Encephalitis)病毒、凯氏(Kyasanur)森林病病毒、Alkhurma病病毒、鄂木斯克出血热(Omsk HemorrhagicFever)病毒、和波瓦桑(Powassan)病毒。
在一些实施方案中，所述(+)-ss-envRNAV可以是披膜病毒科病毒，选自但不限于：木柏病毒(arborvirus)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)、西部马脑脊髓炎病毒(WEEV)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、O'nyong'nvirus(ONNV)、Pogosta病病毒、Sindbis病毒、罗斯河热病毒(RRV)和塞米利奇森林(也译：塞姆利基森林，SemlikiForest)病毒。
在一些实施方案中，所述(-)-(ss)-envRNAV的病毒可以是选自但不限于：沙粒病毒(Arenaviridae)科、布尼亚病毒(Bunyaviridae)科(布尼亚病毒(Bunyavirales)目)、丝状病毒(Filoviridae)科、正粘病毒(Orthomyxoviridae)科、副粘病毒(Paramyxoviridae)科、或弹状病毒(Rhabdoviridae)科。
在一些实施方案中，所述沙粒病毒(Arenaviridae)科病毒可以选自但不限于：拉沙(Lassa)病毒、无菌性脑膜炎病毒(aseptic mengitis)、瓜纳里托(Guanarito)病毒、胡宁(Junin)病毒、卢霍(Lujo)病毒、马丘波(Machupo)病毒、沙比亚(Sabia)病毒和白水阿罗约(Whitewater Arroyo)病毒。
在一些实施方案中，所述布尼亚病毒(Bunyaviridae)科病毒可以选自但不限于：汉坦病毒(Hantavirus)和克里米亚-刚果出血热原内罗病毒(Crimean-Congo hemorrhagicfever orthonairovirus)。
在一些实施方案中，所述副粘病毒(Paramyxoviridae)科病毒可以选自但不限于：腮腺炎(Mumps)病毒、尼帕(Nipah)病毒、亨德拉(Hendra)病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、和NDV。
在一些实施方案中，所述正粘病毒(Orthomyxoviridae)科病毒可以选自但不限于：流感病毒(甲型(A)至丙型(C))、伊萨病毒(Isavirus)、托戈托病毒(Thogotovirus)、夸兰贾病毒(Quaranjavirus)、H1N1病毒、H2N2病毒、H3N2病毒、H1N2病毒、西班牙流感病毒、亚洲流感(Asian flu)病毒、和俄罗斯流感(Russian flu)病毒。
在一些实施方案中，弹状病毒(Rhabdoviridae)科病毒可以选自但不限于：狂犬病病毒、水泡病毒(vesiculovirus)、和细胞棒状病毒(Cytorhabdovirus)。
本发明的主要优点：
(1)对流感病毒有显著的抑制感染作用。
(2)在体外和体内都能高效降低多种病毒的载量和实验动物的病症。
(3)可以识别并切割多种病毒蛋白的特定序列，具有广谱抗病毒作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1Bacillus subtilis LjM2的分离鉴定
LjM2(CGMCC中国微生物保藏管理委员会：24231)被分离的样品采集自中国科学院上海巴斯德研究所陈皮。将2g陈皮加入10mlPBS缓冲液中，振荡30分钟。陈皮悬浮液在无菌蒸馏水中连续稀释至103倍。将100μL的每种稀释剂涂在含有100mg/L放线菌酮的BHI板上，并将板在37℃下孵育7-28天。从平板上挑出细菌菌落，在新鲜培养基上划线，并重新培养。需要时用1.5％的琼脂固化培养基。通常，固体培养基在37℃下孵育，液体培养基在37℃下振荡孵育。
1.1 Bacillus subtilis LjM2菌株的分离与分类地位鉴定
挑取平板上的离散菌落并进行基于16SrRNA基因序列分析的鉴定程序。选择了一个名为LjM2的菌株进行进一步的分类研究。使用细菌特异性引物27f和1492r15通过PCR从纯化的基因组DNA中扩增几乎全长的16SrRNA基因，并使用适当的引物进行测序。该序列以登录号PRJNA796441保存在数据库(GenBank)中。使用MEGA8软件包进行系统发育分析。通过对EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net/)中的基因数据库执行BLAST搜索获得菌株LjM2亲属的16SrRNA基因序列。使用MUSCLE程序比对16SrRNA基因序列。使用邻接(NJ)方法建系统发育树。根据Kimura的NJ树的两参数模型计算进化距离。从数据集中消除了所有包含间隙和缺失数据的位置。重建的系统发育树的可靠性通过1,000次重采样的自举分析进行评估。
本发明人从中药陈皮分离了LjM2菌株。LjM2菌株的全基因组测序显示该细菌含有RNA基因座(tRNA：86条、5SrRNA：10条、16SrRNA：10条、23SrRNA：10条)，具有4056个CDS(图1和表1)。图2B中的系统发育树表明LjM2菌株属于枯草芽孢杆菌物种。基于16SrRNA基因序列的分析表明，菌株LjM2是一株新菌株与所有具有有效公布名称的菌株的序列相似性低于100％。16SrRNA与枯草芽孢杆菌DSM10(GenBank登录号：NR_027552)的相似性值为98.97％-99.94％(图2)。
表1 Bacillus subtilis LjM2的10条16S rRNA基因全长核酸序列
1.2生长曲线测定
生长曲线测定结果发现(图3)，Bacillus subtilis LjM2菌株在BHI培养基中生长24小时到达平台期。
实施例2 Bacillus subtilis LjM2细菌抵御流感病毒感染
2.1 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液抵御流感病毒感染
本发明人使用C57BL/6J的WT小鼠进行流感感染。在感染病毒PR8前30分钟，感染后2小时、12小时、和24小时在鼻内滴鼻LjM2细菌上清液(1OD,25μl)。结果表明与培养基对照组相比在PR8病毒感染前30分钟鼻内滴入LjM2细菌上清液后表明实验小鼠的体重减轻和存活率显着降低(图4)。相同地，在PR8感染后2或12小时使用LjM2细菌上清液仍然对小鼠显示出显着的治疗作用，而在PR8感染后24小时这种治疗没有显示出明显的效果(图4)。这表明Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对流感病毒感染既起到预防作用并且12小时内也起到治疗作用。
本发明人使用MDCK细胞和A549细胞确认Bacillus subtilis LjM2细菌上清液对流感病毒的抑制作用。在感染病毒PR8前30分钟，加入Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，24小时后检测流感病毒PR8的M1基因相对含量。本发明人发现在A549和MDCK细胞中，通过M1基因转录物定量，2％ LjM2细菌上清液有效抑制流感病毒传播(图5，图6)。而MTT测定显示,低于2％的浓度显示出对A549细胞和MDCK细胞无影响，4％ LJM2培养上清液导致部分细胞死亡(图7，图8)。
2.2 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液抵御流感病毒感染机制
病毒感染宿主细胞分为三个阶段，分别是结合细胞、进入细胞，和在细胞中复制。为了弄清楚芽孢杆菌Bacillus subtilis LjM2的细菌上清液的抗病毒机制，本发明人检测了其对PR8病毒感染A549细胞和MDCK细胞不同阶段的影响。有趣的是，发现2％ LjM2培养上清液在A549和MDCK细胞的结合、进入和复制阶段显着抑制PR8病毒感染(图9和图10)。值得注意的是，在病毒结合阶段低剂量如0.5％和1％的LjM2培养上清液也显示出明显的抑制PR8病毒感染A549和MDCK细胞，正如QPCR或病毒滴定结果所揭示的，芽孢杆菌Bacillussubtilis LjM2的细菌上清液可能直接破坏流感病毒颗粒。
为了证明Bacillus subtilis LjM2细菌上清液影响流感病毒感染细胞结合阶段。本发明人将Bacillus subtilis LjM2细菌上清液加入A549或MDCK细胞的培养基中30分钟，然后再将PR8与这些细胞一起孵育30分钟。结果表明，在病毒结合细胞阶段，Bacillussubtilis LjM2细菌上清液处理的A549和MDCK细胞结合的病毒PR8颗粒会大大减少(图11和图12)，证明芽孢杆菌Bacillus subtilis LjM2细菌上清液直接破坏病毒。
本发明人推测Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可以直接破坏病毒。本发明人将流感病毒PR8与Bacillus subtilis LjM2细菌上清液共孵育12小时后，本发明人在透射电子显微镜(TEM)下观察到PR8病毒在孵育12小时后确实被Bacillus subtilis LjM2细菌上清液直接破坏(图13)。
在生化实验方面，本发明人发现，随着增加Bacillus subtilis LjM2细菌上清液的量与PR8病毒共同孵育后，PR8 NP蛋白的切割是明显的增加(图14)。此外，PR8病毒的NP蛋白在与Bacillus subtilis LjM2细菌上清液一起孵育后在很短的时间内被切割(图15)。因此，Bacillus subtilis LjM2细菌上清液通过直接破坏病毒颗粒对流感病毒发挥抗病毒作用。
实施例3 CPAVM1抵御流感病毒感染
3.1 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液中关键成分CPAVM1抵御流感病毒感染
为了找到Bacillus subtilis LjM2细菌上清液中关键成分。本发明人采用了上清液的热变性和紫外线照射等方法，发现候选成分对高温敏感，但对紫外线照射不敏感。并且本发明人通过LC-MS/MS确定了6个候选者。本发明人使用原核表达并纯化了6个候选者，只有关键的CPAVM1具有显著的抗病毒功能。CPAVM1的蛋白序列如表4-1所示。
本发明人使用C57BL/6J的WT小鼠进行了流感感染实验。在感染病毒PR8后2小时和12小时后滴鼻CPAVM1。结果表明与培养基对照组相比在PR8病毒感染后2小时和12小时在鼻内滴入CPAVM1后小鼠的体重减轻和存活率显着降低(图4-1)。PR-8病毒感染2小时和12小时后滴鼻2mg/ml CPAVM1蛋白，与PBS组相比CPAVM1组显示出显着减少的体重减轻和更好的存活率(图16)。感染后2小时，低浓度CPAVM1蛋白(0.5mg/ml)的也可抑制流感病毒的感染(图16)。这表明CPAVM1对流感病毒感染12小时内起到治疗作用。
表2 CPAVM1的蛋白序列
本发明人使用MDCK细胞和A549细胞确认CPAVM1蛋白对流感病毒的抑制作用。在感染病毒PR8前30分钟，加入CPAVM1蛋白，然后在4℃感染1小时后检测流感病毒PR8的M1基因相对含量。本发明人发现在A549和MDCK细胞中，通过QPCR显示CPAVM1蛋白在4℃感染1小时内有效抑制感染PR-8的A549细胞和MDCK细胞中的流感病毒感染(图17和图18)。而MTT测定显示,不同浓度显示出对A549细胞和MDCK细胞无影响，CPAVM1蛋白不会导致细胞死亡(图19，图20)。
本发明人将CPAVM1加入A549或MDCK细胞的培养基中30分钟，然后再将PR8与这些细胞一起孵育30分钟。成像结果显示CPAVM1蛋白抑制PR-8结合A549细胞和MDCK细胞(图21和图22)。
在生化实验方面，本发明人发现，CPAVM1蛋白与流感病毒PR8孵育12小时后，随着增加CPAVM1蛋白的量与PR8病毒共同孵育后，PR8 NP蛋白的切割是明显的增加(图23)。这表明CPAVM1蛋白可能直接破坏流感病毒颗粒。
为了更直观的观察CPAVM1蛋白对流感病毒的作用，本发明人使用透射电子显微镜(TEM)观察CPAVM1蛋白作用下的流感病毒颗粒。本发明人观察到，CPAVM1蛋白与PR-8孵育1小时后，CPAVM1蛋白能够有效破坏PR-8病毒(图24)。这也证明了CPAVM1蛋白能够直接破坏流感病毒PR8颗粒。
为了进一步说明CPAVM1确实是LjM2抗病毒活性的关键成分。本发明人提供了遗传证据，通过同源重组方法使用质粒PKS1，产生了缺乏CPAVM1基因的LjM2菌株。当来自LjM2野生型和CPAVM1缺陷株的等量培养上清液与PR8病毒一起孵育时，病毒抑制CPAVM1缺陷株的能力在很大程度上受到损害，CPAVM1蛋白敲除株培养上清对流感病毒的抑制能力较差(图25)。这表明CPAVM1基因是枯草芽孢杆菌LjM2菌株中抑制流感病毒的关键成分。
此外本发明人通过免疫荧光观察到，与LjM2孵育的样品相比，LjM2株中CPAVM1基因的敲除导致A549或MDCK细胞中更多的流感病毒传播(图26和图27)。因此，CPAVM1基因是枯草芽孢杆菌LjM2菌株中负责抑制流感病毒的关键元件。
在生化实验方面，本发明人使用Bacillus subtilis LjM2细菌上清液，CPAVM1蛋白敲除后Bacillus subtilis LjM2细菌上清液或BHI medium培养基与PR8病毒共同孵育1小时。与野生型相比，CPAVM1缺陷菌株细菌上清液对PR-8NP蛋白的切割能力较弱(图28)。因此，CPAVM1基因是枯草芽孢杆菌LjM2菌株中负责抑制流感病毒的关键元件。
3.2 CPAVM1抵御流感病毒感染机制
为了确认研究CPAVM1蛋白对流感病毒NP蛋白是否有直接的切割作用。本发明人通过不同浓度的CPAVM1蛋白与被纯化的NP蛋白共孵育1小时后，使用免疫印迹分析NP蛋白的被切割情况。结果表明，CPAVM1蛋白有效切割NP蛋白(图29)。
为了进一步研究CPAVM1蛋白对流感病毒的作用机制。本发明人在293T细胞中表达了流感病毒WSN株的不同蛋白，使用CPAVM1蛋白与细胞裂解液相互作用，然后免疫印迹分析流感病毒各蛋白被切割的情况。结果表明，使用CPAVM1蛋白不仅可以切割H1N1流感PR-8病毒核蛋白(NP)，还可以切割H1N1流感WSN病毒的核蛋白(NP)、血凝素(HA)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、神经氨酸酶(NA)、和基质蛋白1(M1)，但不能切割基质蛋白2(M2)和非结构蛋白1(NS1)(图30)。
为了确认CPAVM1蛋白酶的作用机制。本发明人将CPAVM1蛋白酶与被纯化食物NP蛋白共孵育12小时后，通过使用UPLC-MS/MS质谱法确认NP蛋白被CPAVM1蛋白酶切割的位点，从而判断CPAVM1蛋白酶切割底物的位点。结果表明，“RA”、“KE”、“RS”、和“KW”是通过质谱分析确认的切割位点(图31)。这证明了CPAVM1蛋白酶可以切割流感病毒的多种蛋白，从而破坏流感病毒颗粒。本发明人的工作证明了枯草芽孢杆菌LjM2分泌的CPAVM1蛋白酶具有抗流感活性，因此提出了一种治疗流感病毒感染引起的疾病的替代方法。
实施例4 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抵御其它亚型流感病毒感染
实施例3介绍Bacillus subtilis LjM2细菌上清液关键代谢物CPAVM1蛋白可以切割H1N1流感WSN病毒的核蛋白(NP)。后续本发明人证明了CPAVM1蛋白可以其它流感病毒亚型毒株。本发明人通过不同浓度CPAVM1蛋白(0μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl，4μg/μl，8μg/μl)与已知的科学研究中常用的不同亚型的流感病毒H1N1 C、H3N2 G、H3N2H、H9N2 s、H4N2 d室温共同孵育3小时后通过免疫印迹分析NP蛋白。并且通过QPCR方法在MDCK细胞上检测CPAVM1蛋白抑制不同亚型的流感病毒H1N1 C、H3N2 G、H3N2 H、H9N2s、H4N2d抑制作用。结果表明随着CPAVM1浓度的升高，CPAVM1蛋白对其它流感病毒亚型毒株的NP蛋白也有切割作用(图32A、图33A、图34A、图35A、图36A)。体外实验表明，当CPAVM1浓度达到4μg/μl时，可以抑制流感病毒H1N1C、H3N2 G、H3N2 H、H9N2 s、H4N2 d亚型的进入MDCK细胞(图32B、图33B、图34B、图35B、图36B)。
实施例5 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抵御其它病毒感染
5.1 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可降解新冠SARS-COV2病毒的S蛋白
因为前面本发明人证明了中药的共生菌株LjM2的细菌上清液能够在体内和体外实验中显著抑制流感病毒的活性及其引起的小鼠感染，于是本发明人也测定了这种菌来源的产物对新冠病毒可能的影响。如图37所示，新冠病毒假病毒颗粒与LjM2菌株上清液共孵育12小时后，S蛋白几乎完全消失，而且呈现出明显的剂量依赖性：0.5％的条件下S蛋白的降解不明显，但1％及更高浓度细菌上清液孵育的样品中就检测不到S蛋白了(A)。在另外一个实验体系中，本发明人将稳定表达新冠病毒S蛋白质粒的HEK293T细胞裂解液与CPDR-33细菌上清液共孵育12小时后检测S蛋白的表达，同样发现该菌的培养上清液能够显著降解S蛋白，而对照上清液对S蛋白的稳定性没有任何影响(B)。
5.2 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抑制EV-71感染宿主细胞
为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用EV-71病毒研究LjM2细菌上清液的广谱抗病毒作用。通过使用检测病毒含量TCID50和QPCR技术手段，确认了芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有显著的抵抗EV-71的感染作用(图38)。2％和1％条件下的LjM2细菌上清液能够显著的抵抗EV-71感染RD细胞(图38A和图38B)。这证明了LjM2细菌上清液具有抗EV-71病毒作用。
5.3 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抑制HSV-1感染宿主细胞
为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用HSV-1病毒研究LjM2细菌上清液的广谱抗病毒作用。通过使用检测病毒含量TCID50和QPCR技术手段，确认了芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有显著的抵抗HSV-1的感染作用(图39)。2％、1％和0.5％条件下的LjM2细菌上清液能够显著的抵抗HSV-1感染vero细胞(图39A和图39B)。这证明了LjM2细菌上清液具有抗HSV-1病毒作用。
5.4 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抑制HCV(丙型肝炎病毒)感染宿主细胞
HCV是丙型肝炎病毒，病毒呈球形，属于单股正链RNA病毒。为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用HCV病毒研究LjM2细菌上清液和关键代谢成分CPAVM1蛋白的广谱抗病毒作用。通过使用免疫荧光技术手段，确认了2％条件下的LjM2细菌上清液能够显著的抵抗HCV感染huh7.5.1细胞，2μg/μl CPAVM1蛋白也能够显著的抑制HCV感染huh7.5.1细胞(图40)。本发明人证明了芽孢杆菌LjM2细菌上清液和CPAVM1蛋白具有显著的抵抗HCV的感染作用。
5.5 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抑制DENV(登革病毒)感染宿主细胞
DENV是登革病毒，属于黄病毒属，主要通过昆虫为媒介传播，感染可引起登革出血热和登革休克综合症，属于单股RNA病毒。为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用DENV病毒研究LjM2细菌上清液和关键代谢成分CPAVM1蛋白的广谱抗病毒作用。通过使用免疫荧光技术手段，确认了2％条件下的LjM2细菌上清液能够显著的抵抗DENV感染vero细胞，2μg/μl CPAVM1蛋白也能够显著的抑制DENV感染vero细胞(图41)。本发明人证明了芽孢杆菌LjM2细菌上清液和CPAVM1蛋白具有显著的抵抗DENV的感染作用。
5.6 CPAVM1蛋白可抑制EBOV(埃博拉病毒)感染宿主细胞
EBOV为埃博拉病毒，属丝状病毒科，呈长丝状体，单股负链RNA病毒。博拉病毒感染者均是突然出现高烧，最终出现口腔、鼻腔和肛门出血等症状，死亡率高达88％。为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用EBOV病毒研究LjM2细菌上清液关键代谢成分CPAVM1蛋白的广谱抗病毒作用。通过使用免疫荧光技术手段，确认了2μg/μlCPAVM1蛋白也能够显著的抑制EBOV感染huh7细胞(图42)。本发明人证明了芽孢杆菌LjM2细菌上清液关键代谢查无CPAVM1蛋白具有显著的抵抗EBOV的感染作用。
5.7 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抑制hadv5(腺病毒)感染宿主细胞
hadv5是一种腺病毒，为无包膜的双链DNA病毒。为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用hadv5病毒研究LjM2细菌上清液和关键代谢成分CPAVM1蛋白的广谱抗病毒作用。通过使用免疫荧光技术手段，确认了2％条件下的LjM2细菌上清液能够显著的抵抗hadv5感染293A细胞，2μg/μl CPAVM1蛋白也能够显著的抑制hadv5感染293A细胞(图43)。本发明人证明了芽孢杆菌LjM2细菌上清液和CPAVM1蛋白具有显著的抵抗hadv5的感染作用。
5.8 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液关键代谢产物CPAVM1蛋白可抑制SINV(辛德比斯病毒)感染宿主细胞
SINV为辛德比斯病毒属甲病毒属。是一种正链单链RNA病毒。感染者可引起双峰热、皮疹和关节炎。为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用SINV病毒研究LjM2细菌上清液关键代谢成分CPAVM1蛋白的广谱抗病毒作用。通过使用病毒载量滴定手段，确认了2μg/μlCPAVM1蛋白也能够显著的抑制SINV感染vero细胞(图44A)。并且通过western手段证明了当加入2μg/μl和6μg/μl CPAVM1蛋白时宿主vero细胞内病毒含量显著降低，说明CPAVM1可显著抑制SINV病毒感染宿主vero细胞(图44B)。本发明人证明了芽孢杆菌LjM2细菌上清液关键代谢查无CPAVM1蛋白具有显著的抵抗SINV的感染作用。
5.9 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液关键代谢产物CPAVM1蛋白可抑制SFV(塞姆利基森林病毒)感染宿主细胞
SFV为塞姆利基森林病毒，是一种正链的RNA病毒。为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用SFV病毒研究LjM2细菌上清液关键代谢成分CPAVM1蛋白的广谱抗病毒作用。通过western手段证明了当加入2μg/μl和6μg/μlCPAVM1蛋白时宿主vero细胞内SFV病毒含量显著降低，说明CPAVM1可显著抑制SFV病毒感染宿主vero细胞(图45)。本发明人证明了芽孢杆菌LjM2细菌上清液关键代谢查无CPAVM1蛋白具有显著的抵抗SFV的感染作用。
5.10 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抑制ZIKV(寨卡病毒)感染宿主细胞
寨卡病毒属黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒，是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒。为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用ZIKV病毒研究LjM2细菌上清液及关键代谢成分CPAVM1蛋白的广谱抗病毒作用。通过QPCR技术手段，确认了2％芽孢杆菌LjM2细菌上清液及2μg/μl CPAVM1蛋白具有显著的抵抗ZIKV的感染宿主vero细胞作用(图46A)。并且通过使用病毒载量滴定手段，确认了2％条件下的LjM2细菌上清液能够显著的抵抗ZIKV感染vero细胞，2μg/μl CPAVM1蛋白也能够显著的抑制ZIKV感染vero细胞(图44B)。本发明人证明了芽孢杆菌LjM2细菌上清液关键代谢查无CPAVM1蛋白具有显著的抵抗SINV的感染作用。
5.11 Bacillus subtilis LjM2细菌上清液可抑制MHV68(疱疹病毒)感染宿主细胞
MHV68是鼠γ疱疹病毒68，属于疱疹病毒科，双链DNA病毒。为了进一步研究芽孢杆菌LjM2细菌上清液具有较为广谱的抗病毒作用，本发明人使用MHV68病毒研究LjM2细菌上清液和关键代谢成分CPAVM1蛋白的广谱抗病毒作用。通过使用免疫荧光技术手段，确认了2％条件下的LjM2细菌上清液能够显著的抵抗MHV68感染3T12细胞，2μg/μl CPAVM1蛋白也能够显著的抑制MHV68感染3T12细胞(图47)。本发明人证明了芽孢杆菌LjM2细菌上清液和CPAVM1蛋白具有显著的抵抗MHV68的感染作用。
芽孢杆菌LjM2菌株的细菌培养上清液具有抗甲型流感病毒，LjM2培养上清及关键代谢产物CPAVM1对不同亚型的流感病毒(H1N1 C、H3N2 G、H3N2 H、H9N2 s、H4N2 d)及SARS-COV2、EV71、HSV-1、HCV、DENV、EBOV、hadv5、SINV、SFV、ZIKV、和MHV68等病毒也有抑制作用。总之，本发明人的细菌Bacillus subtilis LjM2T和其来源的CPAVM1蛋白酶有助于对多种病毒的传播和感染的控制。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有抗病毒活性的由(a)衍生的多肽；
(c)氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的同源性≥85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，并具有抗病毒活性的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸为选自下组的序列：
(A)编码如权利要求1所述多肽的核苷酸序列；
(B)编码如SEQ ID NO:11所示多肽的核苷酸序列；
(C)与编码SEQ ID NO:11所示多肽的核苷酸序列的同源性≥85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的核苷酸序列；
(D)在SEQ ID NO:11所示多肽的核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；
(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。
3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求2所述的多核苷酸。
4.如权利要求1所述分离的多肽的用途，其特征在于，它被用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于抗病毒。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：(a)如权利要求1所述的多肽、或如权利要求2所述的多核苷酸、或如权利要求3所述的载体、或其组合；和(b)药学上可接受的载体。
6.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：(C1)位于容器内的如权利要求5所述的组合物；和(C2)说明书，所述说明书注明所述药盒用于治疗病毒感染。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
8.如权利要求7所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备本发明权利要求1所述多肽、或权利要求5所述药物组合物。
9.一种体外破坏病毒颗粒、切割病毒相关蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：在病毒存在的环境中添加，如权利要求1所述多肽、或如权利要求5所述药物组合物、或如权利要求7所述细胞、或其组合。
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