CA3101006A1 - Diltiazem pour son utilisation dans le traitement des infections microbiennes - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne le diltiazempour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Description
DILTIAZEM POUR SON UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DES INFECTIONS
MICROBIENNES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un composé pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'infections par des microorganismes pathogènes.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un composé pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux Les infections respiratoires aigües (IRA) représentent une des causes principales de consultations, d'hospitalisations et de décès dans le monde, en étant notamment la première cause de mortalité chez les jeunes enfants avec près de 2 millions de décès par an. Chaque année, pour tenter de traiter ces diverses infections respiratoires, le coût pour les sociétés est estimé entre 1,5 à 2 milliards d'euros.
Parmi les agents étiologiques responsables des IRA, les virus occupent une place prépondérante. Ils sont en effet retrouvés dans la majorité des cas de pneumonies infantiles et sont un facteur prédisposant des pneumonies bactériennes chez l'adulte.
Parmi les virus les plus représentatifs dans la fréquence et la morbidité, on dénombre notamment les virus influenza de type A et B, qui constituent de plus un facteur de risque pandémique récurrent, ainsi que le virus respiratoire syncytial (hRSV ou hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le métapneumovirus humain (hMPV). De plus, l'émergence de nouveaux virus de la famille des Coronaviridae tels que le SRAS et le virus MERS-CoV récemment décrit, constitue très probablement un grave problème sanitaire en devenir.
D'autres agents responsables des IRA sont les bactéries. Parmi les bactéries pathogènes les plus représentatives, on dénombre notamment S. pneumonia, P. aeruginosa, S.
aureus et H.
influenza. Ces bactéries pathogènes sont des agents étiologiques contribuant à
une co-morbidité et une co-mortalité accrues dans le cas des co-infections respiratoires, et elles sont responsables de l'émergence et de la diffusion croissante de souches de bactéries
MICROBIENNES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un composé pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'infections par des microorganismes pathogènes.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un composé pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux Les infections respiratoires aigües (IRA) représentent une des causes principales de consultations, d'hospitalisations et de décès dans le monde, en étant notamment la première cause de mortalité chez les jeunes enfants avec près de 2 millions de décès par an. Chaque année, pour tenter de traiter ces diverses infections respiratoires, le coût pour les sociétés est estimé entre 1,5 à 2 milliards d'euros.
Parmi les agents étiologiques responsables des IRA, les virus occupent une place prépondérante. Ils sont en effet retrouvés dans la majorité des cas de pneumonies infantiles et sont un facteur prédisposant des pneumonies bactériennes chez l'adulte.
Parmi les virus les plus représentatifs dans la fréquence et la morbidité, on dénombre notamment les virus influenza de type A et B, qui constituent de plus un facteur de risque pandémique récurrent, ainsi que le virus respiratoire syncytial (hRSV ou hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le métapneumovirus humain (hMPV). De plus, l'émergence de nouveaux virus de la famille des Coronaviridae tels que le SRAS et le virus MERS-CoV récemment décrit, constitue très probablement un grave problème sanitaire en devenir.
D'autres agents responsables des IRA sont les bactéries. Parmi les bactéries pathogènes les plus représentatives, on dénombre notamment S. pneumonia, P. aeruginosa, S.
aureus et H.
influenza. Ces bactéries pathogènes sont des agents étiologiques contribuant à
une co-morbidité et une co-mortalité accrues dans le cas des co-infections respiratoires, et elles sont responsables de l'émergence et de la diffusion croissante de souches de bactéries
2 résistantes aux antibiotiques qui remettent fondamentalement en question l'efficacité des traitements antibiotiques classiques tant chez l'Homme que chez l'animal.
A l'exception des virus influenza, il n'existe pour l'heure aucun vaccin, ni molécule antivirale efficace pour prévenir ou traiter les infections par ces différents virus respiratoires pathogènes. En outre, dans le cas des virus influenza, les délais et l'efficacité variable de la vaccination, ainsi que l'émergence croissante de virus résistants aux antiviraux, sont aujourd'hui très préoccupants.
Il n'existe actuellement aucun vaccin ou traitement spécifique contre le virus respiratoire syncytial (hVRS, également désigné dans la présente demande sous son abréviation anglaise hRSV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Ces virus appartenant à la famille des Pneumoviridae sont des virus enveloppés (150 à 600 nm), qui possèdent un génome à
ARN négatif simple brin et non segmenté. L'analyse phylogénétique des gènes codant pour les protéines F et G permet de diviser les virus hMPV, tout comme les virus hVRS, en deux groupes principaux A et B respectifs, et de subdiviser chacun de ces groupes en deux sous-groupes AI, A2, B1 ou B2. Les pathologies associées à ces pneumovirus sont principalement la bronchiolite pédiatrique, le syndrome grippal ou rhume chez l'adulte, ou encore la pneumonie grave chez les patients âgés ou immunodéprimés.
De même, il n'existe actuellement aucun vaccin ou traitement spécifique contre les virus parainfluenza humains (hPIV). Ces virus, découverts à la fin des années 1950, sont des virus enveloppés (150 à 250 nm), qui possèdent un génome ARN négatif simple brin, appartenant à la famille des Paramyxoviridae. Ils sont génétiquement et antigéniquement divisés en 4 types (1 à 4). D'autres sous-types majeurs de hPIV-4 (A et B) et des sous-groupes/génotypes de hPIV-1 et hPIV-3 ont été décrits. Les virus hPIV-1 à hPIV-3 constituent des causes majeures d'infections respiratoires inférieures chez les nourrissons, les jeunes enfants, les personnes immunodéprimées, les malades chroniques, ainsi que chez les personnes âgées.
Ils peuvent notamment causer des pneumonies.
En ce qui concerne la résistance aux antibiotiques des bactéries pathogènes responsables de surinfections, le Centre européen de contrôle des maladies évalue à 25 000 le nombre de décès par an en Europe résultant de la résistance aux antibiotiques. Une surmortalité
équivalente est observée aux États-Unis par le CDC d'Atlanta. L'augmentation de la résistance sera responsable d'une augmentation dramatique de ces chiffres comme cela a été modélisé dans le rapport de Lord J. O'Neil sur l'impact de la résistance aux antibiotiques d'ici 2050.
A l'exception des virus influenza, il n'existe pour l'heure aucun vaccin, ni molécule antivirale efficace pour prévenir ou traiter les infections par ces différents virus respiratoires pathogènes. En outre, dans le cas des virus influenza, les délais et l'efficacité variable de la vaccination, ainsi que l'émergence croissante de virus résistants aux antiviraux, sont aujourd'hui très préoccupants.
Il n'existe actuellement aucun vaccin ou traitement spécifique contre le virus respiratoire syncytial (hVRS, également désigné dans la présente demande sous son abréviation anglaise hRSV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Ces virus appartenant à la famille des Pneumoviridae sont des virus enveloppés (150 à 600 nm), qui possèdent un génome à
ARN négatif simple brin et non segmenté. L'analyse phylogénétique des gènes codant pour les protéines F et G permet de diviser les virus hMPV, tout comme les virus hVRS, en deux groupes principaux A et B respectifs, et de subdiviser chacun de ces groupes en deux sous-groupes AI, A2, B1 ou B2. Les pathologies associées à ces pneumovirus sont principalement la bronchiolite pédiatrique, le syndrome grippal ou rhume chez l'adulte, ou encore la pneumonie grave chez les patients âgés ou immunodéprimés.
De même, il n'existe actuellement aucun vaccin ou traitement spécifique contre les virus parainfluenza humains (hPIV). Ces virus, découverts à la fin des années 1950, sont des virus enveloppés (150 à 250 nm), qui possèdent un génome ARN négatif simple brin, appartenant à la famille des Paramyxoviridae. Ils sont génétiquement et antigéniquement divisés en 4 types (1 à 4). D'autres sous-types majeurs de hPIV-4 (A et B) et des sous-groupes/génotypes de hPIV-1 et hPIV-3 ont été décrits. Les virus hPIV-1 à hPIV-3 constituent des causes majeures d'infections respiratoires inférieures chez les nourrissons, les jeunes enfants, les personnes immunodéprimées, les malades chroniques, ainsi que chez les personnes âgées.
Ils peuvent notamment causer des pneumonies.
En ce qui concerne la résistance aux antibiotiques des bactéries pathogènes responsables de surinfections, le Centre européen de contrôle des maladies évalue à 25 000 le nombre de décès par an en Europe résultant de la résistance aux antibiotiques. Une surmortalité
équivalente est observée aux États-Unis par le CDC d'Atlanta. L'augmentation de la résistance sera responsable d'une augmentation dramatique de ces chiffres comme cela a été modélisé dans le rapport de Lord J. O'Neil sur l'impact de la résistance aux antibiotiques d'ici 2050.
3 En février 2017, l'OMS a publié une liste de bactéries résistantes représentant une menace à
l'échelle mondiale : P. aeruginosa représente entre autres une urgence critique car elle résiste à un grand nombre d'antibiotiques ; S. pneumoniae et S. aureus, résistantes à la méticilline (SARM), sont responsables d'infections diverses, pulmonaires et osseuses, ainsi que de septicémies, en particulier chez les patients les plus sensibles.
Parmi ces bactéries, Pseudomonas aeruginosa est un bacille gram négatif que l'on trouve dans l'environnement et dans plus de 50 (:)/0 des voies respiratoires des patients hospitalisés.
P. aeruginosa est un microorganisme ubiquitaire qui a la capacité de survivre dans de multiples conditions environnementales. Ce microorganisme cause non seulement des maladies chez les plantes et les animaux, mais aussi chez les humains, causant de graves infections chez les patients immunodéprimés atteints de cancer et les patients souffrant de brûlures graves ou de mucoviscidose.
L'antibiothérapie standard contre les infections à Pseudomonas aeruginosa associe un bêta-lactame (ceftazidime, imipénem ou méropénem, pipéracilline/tazobactam) avec un aminoside (tobramycine, amikacine) et/ou une fluoroquinolone. L'émergence de souches multi-résistantes de Pseudomonas aeruginosa (résistance à tous les antibiotiques d'au moins deux des trois classes principales : bêta-lactamines, aminoglycosides, fluoroquinolones) pose le problème du choix des antibiotiques, l'arsenal thérapeutique restant très limité.
Ainsi, le développement de nouveaux traitements prophylactiques et thérapeutiques constitue un objectif majeur de santé publique. Le succès des nouvelles stratégies de traitement des infections par ces pathogènes repose en grande partie sur une meilleure caractérisation de leur biologie cellulaire et de leurs interactions moléculaires et fonctionnelles avec leur hôte.
Les infections intestinales sont également une cause importante d'hospitalisations et dans certains cas de décès. Dans les pays développés, les causes les plus fréquentes de gastro-entérite aiguë chez l'adulte immunocompétent sont les norovirus et les rotavirus, ainsi que les espèces et genres de bactéries suivants : Campylobacterspp., Salmonella spp., Escherichia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Interférons de type III
Les Interférons de type III, aussi désignés interférons lambda W, constituent la première ligne de défense antimicrobienne au niveau de l'épithélium des tractus respiratoire et intestinal, en contribuant à l'inhibition initiale de la dissémination des pathogènes, sans toutefois déclencher de réponse inflammatoire (Andreakos et al., 2017). Ces interférons de type III sont effectivement produits très tôt en réponse à l'activation par les pathogènes des
l'échelle mondiale : P. aeruginosa représente entre autres une urgence critique car elle résiste à un grand nombre d'antibiotiques ; S. pneumoniae et S. aureus, résistantes à la méticilline (SARM), sont responsables d'infections diverses, pulmonaires et osseuses, ainsi que de septicémies, en particulier chez les patients les plus sensibles.
Parmi ces bactéries, Pseudomonas aeruginosa est un bacille gram négatif que l'on trouve dans l'environnement et dans plus de 50 (:)/0 des voies respiratoires des patients hospitalisés.
P. aeruginosa est un microorganisme ubiquitaire qui a la capacité de survivre dans de multiples conditions environnementales. Ce microorganisme cause non seulement des maladies chez les plantes et les animaux, mais aussi chez les humains, causant de graves infections chez les patients immunodéprimés atteints de cancer et les patients souffrant de brûlures graves ou de mucoviscidose.
L'antibiothérapie standard contre les infections à Pseudomonas aeruginosa associe un bêta-lactame (ceftazidime, imipénem ou méropénem, pipéracilline/tazobactam) avec un aminoside (tobramycine, amikacine) et/ou une fluoroquinolone. L'émergence de souches multi-résistantes de Pseudomonas aeruginosa (résistance à tous les antibiotiques d'au moins deux des trois classes principales : bêta-lactamines, aminoglycosides, fluoroquinolones) pose le problème du choix des antibiotiques, l'arsenal thérapeutique restant très limité.
Ainsi, le développement de nouveaux traitements prophylactiques et thérapeutiques constitue un objectif majeur de santé publique. Le succès des nouvelles stratégies de traitement des infections par ces pathogènes repose en grande partie sur une meilleure caractérisation de leur biologie cellulaire et de leurs interactions moléculaires et fonctionnelles avec leur hôte.
Les infections intestinales sont également une cause importante d'hospitalisations et dans certains cas de décès. Dans les pays développés, les causes les plus fréquentes de gastro-entérite aiguë chez l'adulte immunocompétent sont les norovirus et les rotavirus, ainsi que les espèces et genres de bactéries suivants : Campylobacterspp., Salmonella spp., Escherichia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Interférons de type III
Les Interférons de type III, aussi désignés interférons lambda W, constituent la première ligne de défense antimicrobienne au niveau de l'épithélium des tractus respiratoire et intestinal, en contribuant à l'inhibition initiale de la dissémination des pathogènes, sans toutefois déclencher de réponse inflammatoire (Andreakos et al., 2017). Ces interférons de type III sont effectivement produits très tôt en réponse à l'activation par les pathogènes des
4 senseurs cellulaires de l'hôte, de type récepteurs Toll-like ou effecteurs cytoplasmiques. Ces interférons de type III activent l'expression de nombreux gènes dits ISGs (Interferon-stimulated genes) (via l'activation des voies JAK/STAT), qui confèrent une activité
inhibitrice contre les pathogènes respiratoires, en inactivant par exemple l'entrée cellulaire des virus (gène IFITM), ou leur réplication (gène OAS, OASL, IFIT1, IFIT2, IFIT13, ISG15).
Cette réponse anti-pathogène précoce, dite de type interféron de type III , est notamment prédominante dans la réponse initiale innée de l'épithélium respiratoire à
l'infection par les virus influenza (Galani et al., 2017).
Les interférons de type III ont déjà été évalués en essai clinique pour traiter les infections à
hépatite B et C, et ont démontré des effets secondaires moins importants en comparaison aux traitements par les interférons de type I (Chan et al., 2016).
L'utilisation des interférons de type III comme traitement antiviral non inflammatoire contre les infections à virus influenza a été récemment proposée (Davidson et al., 2016).
Il serait avantageux de stimuler la production endogène d'un ou plusieurs interférons de type III pour lutter contre les infections des épithéliums respiratoires et/ou intestinaux, notamment contre les infections virales de ces épithéliums.
Toutefois, à l'heure actuelle, aucun composé thérapeutique ayant cette activité stimulatrice n'est connu. Ainsi, seule l'administration d'interféron de type III exogène a pu être testée jusqu'à présent.
Le diltiazem, un agent inhibiteur des canaux calciques Le diltiazem est une molécule membre de la famille des benzothiazépines, référencée sous le numéro CAS 42399-41-7. Cette molécule peut être sous la forme de deux énantiomères L-cis et D-cis, ou d'un mélange racémique.
Le diltiazem est connu depuis plus de 30 ans et est approuvé, en Europe et aux Etats-Unis, par les autorités réglementaires du médicament. Il peut être administré sous forme d'hydrochloride de diltiazem. Cardizem0, Cartia0, Taztia0 et Dilacor sont ses dénominations commerciales les plus courantes.
De nombreuses formulations sont disponibles, en particulier des formulations à
libération prolongée. Le diltiazem est disponible sous différentes formes galéniques, telles que sous forme de crème pour application topique, sous forme de comprimés ou capsules pour administration orale, sous forme de poudre pour préparation de solution injectable ou sous forme de préparations pharmaceutiques pour inhalation (WO 02/094238, US
4,605,552).
Son action physiologique connue est l'inhibition des canaux calciques, et donc l'inhibition des flux de calcium intracellulaires. Le diltiazem freine notamment l'entrée du calcium transmembranaire au niveau de la fibre musculaire myocardique et de la fibre musculaire lisse des vaisseaux. Ceci permet de diminuer la concentration intracellulaire
inhibitrice contre les pathogènes respiratoires, en inactivant par exemple l'entrée cellulaire des virus (gène IFITM), ou leur réplication (gène OAS, OASL, IFIT1, IFIT2, IFIT13, ISG15).
Cette réponse anti-pathogène précoce, dite de type interféron de type III , est notamment prédominante dans la réponse initiale innée de l'épithélium respiratoire à
l'infection par les virus influenza (Galani et al., 2017).
Les interférons de type III ont déjà été évalués en essai clinique pour traiter les infections à
hépatite B et C, et ont démontré des effets secondaires moins importants en comparaison aux traitements par les interférons de type I (Chan et al., 2016).
L'utilisation des interférons de type III comme traitement antiviral non inflammatoire contre les infections à virus influenza a été récemment proposée (Davidson et al., 2016).
Il serait avantageux de stimuler la production endogène d'un ou plusieurs interférons de type III pour lutter contre les infections des épithéliums respiratoires et/ou intestinaux, notamment contre les infections virales de ces épithéliums.
Toutefois, à l'heure actuelle, aucun composé thérapeutique ayant cette activité stimulatrice n'est connu. Ainsi, seule l'administration d'interféron de type III exogène a pu être testée jusqu'à présent.
Le diltiazem, un agent inhibiteur des canaux calciques Le diltiazem est une molécule membre de la famille des benzothiazépines, référencée sous le numéro CAS 42399-41-7. Cette molécule peut être sous la forme de deux énantiomères L-cis et D-cis, ou d'un mélange racémique.
Le diltiazem est connu depuis plus de 30 ans et est approuvé, en Europe et aux Etats-Unis, par les autorités réglementaires du médicament. Il peut être administré sous forme d'hydrochloride de diltiazem. Cardizem0, Cartia0, Taztia0 et Dilacor sont ses dénominations commerciales les plus courantes.
De nombreuses formulations sont disponibles, en particulier des formulations à
libération prolongée. Le diltiazem est disponible sous différentes formes galéniques, telles que sous forme de crème pour application topique, sous forme de comprimés ou capsules pour administration orale, sous forme de poudre pour préparation de solution injectable ou sous forme de préparations pharmaceutiques pour inhalation (WO 02/094238, US
4,605,552).
Son action physiologique connue est l'inhibition des canaux calciques, et donc l'inhibition des flux de calcium intracellulaires. Le diltiazem freine notamment l'entrée du calcium transmembranaire au niveau de la fibre musculaire myocardique et de la fibre musculaire lisse des vaisseaux. Ceci permet de diminuer la concentration intracellulaire
5 calcique atteignant les protéines contractiles.
Chez l'homme, l'administration de diltiazem est indiquée pour son action vasodilatatrice, dans le but de réduire le travail cardiaque. Il est ainsi utilisé dans la prise en charge des désordres cardiaques et circulatoires tels que les angines de poitrine, l'hypertension artérielle, les ischémies myocardiques et la tachycardie.
D'autres utilisations thérapeutiques du diltiazem ont également été proposées dans la littérature, sans toutefois que des médicaments soient déjà approuvés par les autorités réglementaires pour ces nouvelles applications thérapeutiques.
La demande internationale WO 87/07508 décrit l'utilisation de composés thérapeutiques inhibant les influx de calcium dans la cellule, tels que le diltiazem, pour le traitement d'infections virales liées au cytomégalovirus ou à l'herpès.
La demande internationale WO 2011/066657 décrit l'utilisation d'un inhibiteur des canaux calciques, tel que le vérapamil ou le diltiazem, pour le traitement ou la prévention d'infections virales et/ou bactériennes, ou encore de maladies auto-immunes. Les virus concernés sont notamment ceux de l'herpès buccal, de l'herpès génital et du zona.
La demande internationale WO 2011/126071 décrit l'utilisation de composés inhibant les influx de calcium dans la cellule, tel que le diltiazem, pour le traitement d'infections virales, notamment celles liées aux virus influenza. Il est spécifiquement expliqué que le diltiazem inhibe l'interaction entre le virus et les canaux calciques, et ainsi bloque l'entrée du virus dans les cellules.
La demande internationale WO 2016/146836 divulgue des compositions pharmaceutiques ou vétérinaires comprenant du diltiazem pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une infection par les virus influenza.
Le brevet EP 1 117 408 décrit l'utilisation de diltiazem, en tant que composé
inhibiteur des canaux calciques, pour traiter des pathologies liées à la dégénérescence des photorécepteurs de la rétine.
Chez l'homme, l'administration de diltiazem est indiquée pour son action vasodilatatrice, dans le but de réduire le travail cardiaque. Il est ainsi utilisé dans la prise en charge des désordres cardiaques et circulatoires tels que les angines de poitrine, l'hypertension artérielle, les ischémies myocardiques et la tachycardie.
D'autres utilisations thérapeutiques du diltiazem ont également été proposées dans la littérature, sans toutefois que des médicaments soient déjà approuvés par les autorités réglementaires pour ces nouvelles applications thérapeutiques.
La demande internationale WO 87/07508 décrit l'utilisation de composés thérapeutiques inhibant les influx de calcium dans la cellule, tels que le diltiazem, pour le traitement d'infections virales liées au cytomégalovirus ou à l'herpès.
La demande internationale WO 2011/066657 décrit l'utilisation d'un inhibiteur des canaux calciques, tel que le vérapamil ou le diltiazem, pour le traitement ou la prévention d'infections virales et/ou bactériennes, ou encore de maladies auto-immunes. Les virus concernés sont notamment ceux de l'herpès buccal, de l'herpès génital et du zona.
La demande internationale WO 2011/126071 décrit l'utilisation de composés inhibant les influx de calcium dans la cellule, tel que le diltiazem, pour le traitement d'infections virales, notamment celles liées aux virus influenza. Il est spécifiquement expliqué que le diltiazem inhibe l'interaction entre le virus et les canaux calciques, et ainsi bloque l'entrée du virus dans les cellules.
La demande internationale WO 2016/146836 divulgue des compositions pharmaceutiques ou vétérinaires comprenant du diltiazem pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une infection par les virus influenza.
Le brevet EP 1 117 408 décrit l'utilisation de diltiazem, en tant que composé
inhibiteur des canaux calciques, pour traiter des pathologies liées à la dégénérescence des photorécepteurs de la rétine.
6 Toutefois, toutes les actions bénéfiques du diltiazem n'ont probablement pas encore été
explorées, et les effets techniques associés au diltiazem utilisé comme médicament ne sont vraisemblablement pas encore tous connus à ce jour.
EXPOSE DE L'INVENTION
Le problème technique sous-jacent à la présente invention concerne l'identification de molécules permettant de stimuler l'expression des gènes codant pour des protéines de type interféron III, dans le but de prévenir et/ou traiter des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
En effet, en cas d'infection par des microorganismes des tractus respiratoires et/ou intestinaux, il est avantageux de stimuler la réponse de l'organisme contre ces pathogènes, sans toutefois induire une réponse inflammatoire, et ainsi éviter la sur-stimulation du système immunitaire.
Or, à l'heure actuelle, aucun composé thérapeutique présentant cette activité
n'est connu.
Des composés thérapeutiques ayant la capacité de stimuler l'expression des gènes codant pour des protéines telles que l'interleukine 29, l'interleukine 28A et/ou l'interleukine 28B sont donc activement recherchés.
De façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence le fait que le diltiazem, un inhibiteur des canaux calciques, a également une action stimulatrice de l'expression de ces gènes codant pour des protéines de type interféron III, à la fois in vitro et in vivo.
De plus, les inventeurs ont mis en évidence le fait que le diltiazem active l'expression d'un groupe de gènes désigné gènes ISG (interferon-stimulated genes) , connus pour être activés par les interférons de type I et III. Les protéines codées par les gènes ISG prennent part à l'action antimicrobienne et/ou participent à la signalisation interféron .
Ainsi, le diltiazem peut être utilisé pour différentes applications thérapeutiques, et en particulier pour prévenir et/ou traiter des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Le diltiazem, en sa qualité d'agent activateur de l'expression des gènes codant pour un ou plusieurs interféron(s) de type III, est particulièrement adapté pour le traitement des infections virales ou bactériennes, mais également des co-infections liées à la présence d'au moins un virus et d'au moins une bactérie, ou d'au moins deux virus, ou d'au moins deux bactéries, et
explorées, et les effets techniques associés au diltiazem utilisé comme médicament ne sont vraisemblablement pas encore tous connus à ce jour.
EXPOSE DE L'INVENTION
Le problème technique sous-jacent à la présente invention concerne l'identification de molécules permettant de stimuler l'expression des gènes codant pour des protéines de type interféron III, dans le but de prévenir et/ou traiter des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
En effet, en cas d'infection par des microorganismes des tractus respiratoires et/ou intestinaux, il est avantageux de stimuler la réponse de l'organisme contre ces pathogènes, sans toutefois induire une réponse inflammatoire, et ainsi éviter la sur-stimulation du système immunitaire.
Or, à l'heure actuelle, aucun composé thérapeutique présentant cette activité
n'est connu.
Des composés thérapeutiques ayant la capacité de stimuler l'expression des gènes codant pour des protéines telles que l'interleukine 29, l'interleukine 28A et/ou l'interleukine 28B sont donc activement recherchés.
De façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence le fait que le diltiazem, un inhibiteur des canaux calciques, a également une action stimulatrice de l'expression de ces gènes codant pour des protéines de type interféron III, à la fois in vitro et in vivo.
De plus, les inventeurs ont mis en évidence le fait que le diltiazem active l'expression d'un groupe de gènes désigné gènes ISG (interferon-stimulated genes) , connus pour être activés par les interférons de type I et III. Les protéines codées par les gènes ISG prennent part à l'action antimicrobienne et/ou participent à la signalisation interféron .
Ainsi, le diltiazem peut être utilisé pour différentes applications thérapeutiques, et en particulier pour prévenir et/ou traiter des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Le diltiazem, en sa qualité d'agent activateur de l'expression des gènes codant pour un ou plusieurs interféron(s) de type III, est particulièrement adapté pour le traitement des infections virales ou bactériennes, mais également des co-infections liées à la présence d'au moins un virus et d'au moins une bactérie, ou d'au moins deux virus, ou d'au moins deux bactéries, et
7 en particulier est adapté pour le traitement des surinfections bactériennes concomitantes à
une primo-infection virale.
La présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Comme l'Homme du métier le sait, au regard de l'abondante littérature scientifique sur le sujet, l'activation de la voie de l'interféron III permet de traiter de nombreux désordres physiologiques, et en particulier ceux liés à des infections par des pathogènes.
En particulier, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène dit ISG , dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus .. respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect particulier, la composition pharmaceutique ou vétérinaire est caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. Caractérisation de l'induction de l'expression des gènes de l'interféron de type III par le traitement basolatéral au diltiazem du modèle 3D d'épithélium respiratoire humain reconstitué d'origine nasale (MucilAir0 HAE, Epithelix).
1A- Ratios d'expression des gènes codant pour les interférons de type III IFN-M , IFN-2 et IFN-U (désignés respectivement par IFNL1, IFNL2 et IFNL3) déterminés par RNAseq entre :
une primo-infection virale.
La présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Comme l'Homme du métier le sait, au regard de l'abondante littérature scientifique sur le sujet, l'activation de la voie de l'interféron III permet de traiter de nombreux désordres physiologiques, et en particulier ceux liés à des infections par des pathogènes.
En particulier, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène dit ISG , dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus .. respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect particulier, la composition pharmaceutique ou vétérinaire est caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. Caractérisation de l'induction de l'expression des gènes de l'interféron de type III par le traitement basolatéral au diltiazem du modèle 3D d'épithélium respiratoire humain reconstitué d'origine nasale (MucilAir0 HAE, Epithelix).
1A- Ratios d'expression des gènes codant pour les interférons de type III IFN-M , IFN-2 et IFN-U (désignés respectivement par IFNL1, IFNL2 et IFNL3) déterminés par RNAseq entre :
8 - des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) traités 3 jours par le diltiazem (90 pM, 3 administrations au total) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral et - les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (niveau basal d'expression de 1).
1B- Ratios d'expression des gènes codant pour IF144L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, ISG15, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 et STAT1 déterminés par RNAseq entre :
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités 3 jours par le diltiazem (90 pM, 3 administrations au total) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral et - les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (niveau basal d'expression de 1).
Seuls les gènes arborant un différentiel d'expression supérieur ou égal à 2, et une p valeur corrigée inférieure à 0.05, ont été considérés dans la suite de l'analyse.
1C- Expression du gène IFNL1 induite par un traitement apical au diltiazem du modèle 3D
d'épithélium respiratoire humain reconstitué d'origine nasale.
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été traités ou non (mock) par une dose unique de diltiazem à 90pM administrée par le pôle apical à JO.
A 24 heures post traitement, les cellules ont été lysées puis l'ARN total en a été extrait. Après réverse transcription, l'expression du gène IFNL1 a été mesurée en RT-qPCR
(TagMan, Thermo Fisher Scientific). Les données ont été normalisées via le gène de ménage GAPDH.
Les ratios d'expression ont été réalisés par des calculs basés sur la méthode 2AACt method (Livak and Schmittgen, 2001).
Figure 2. Confirmation par Rt-qPCR de l'induction par le diltiazem de 8 gènes associés à la réponse Interféron de type III.
Ratios d'expression des gènes IFIT1, IFIT2, IFIT3, IF127, IFN-M (IFNL1), (IFNL2), IF144L et IFITM1 entre :
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités 3 jours par le diltiazem via leur pôle basolatéral (90 pM) (colonne de droite sur les graphes) et - les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (colonne de droite sur les graphes).
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 and ****P<0.0001 par rapport aux épithéliums non traités.
1B- Ratios d'expression des gènes codant pour IF144L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, ISG15, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 et STAT1 déterminés par RNAseq entre :
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités 3 jours par le diltiazem (90 pM, 3 administrations au total) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral et - les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (niveau basal d'expression de 1).
Seuls les gènes arborant un différentiel d'expression supérieur ou égal à 2, et une p valeur corrigée inférieure à 0.05, ont été considérés dans la suite de l'analyse.
1C- Expression du gène IFNL1 induite par un traitement apical au diltiazem du modèle 3D
d'épithélium respiratoire humain reconstitué d'origine nasale.
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été traités ou non (mock) par une dose unique de diltiazem à 90pM administrée par le pôle apical à JO.
A 24 heures post traitement, les cellules ont été lysées puis l'ARN total en a été extrait. Après réverse transcription, l'expression du gène IFNL1 a été mesurée en RT-qPCR
(TagMan, Thermo Fisher Scientific). Les données ont été normalisées via le gène de ménage GAPDH.
Les ratios d'expression ont été réalisés par des calculs basés sur la méthode 2AACt method (Livak and Schmittgen, 2001).
Figure 2. Confirmation par Rt-qPCR de l'induction par le diltiazem de 8 gènes associés à la réponse Interféron de type III.
Ratios d'expression des gènes IFIT1, IFIT2, IFIT3, IF127, IFN-M (IFNL1), (IFNL2), IF144L et IFITM1 entre :
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités 3 jours par le diltiazem via leur pôle basolatéral (90 pM) (colonne de droite sur les graphes) et - les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (colonne de droite sur les graphes).
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 and ****P<0.0001 par rapport aux épithéliums non traités.
9 PCT/FR2019/051186 Figure 3. Mesure par dosage ELISA de la sécrétion d'interféron lambda 1 (IL-29).
Les niveaux de sécrétion (pg/mL) d'interféron lambda 1 (IL-29) aux pôles apical et basolatéral des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités et non traités au diltiazem via leur pôle basolatéral (90 pM, 3 administrations au total pendant 3 jours consécutifs), ont été
mesurés par ELISA après 72h de traitement.
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 and ****P<0.0001 par rapport aux épithéliums non traités.
Figure 4. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du virus syncytial respiratoire (VRS) au sein des épithéliums respiratoires humains reconstitués infectés (MucilAir0 HAE, Epithelix) et en modèle de souris BALB/c après challenge infectieux (in vivo).
4A- Représentation schématique de la chronologie des traitements via le pôle basolatéral des épithéliums respiratoires humains : après l'infection par le VRS (jour 0), les épithéliums reconstitués sont traités ou non (non traités) à 5h post-infection (5hpi) puis quotidiennement les trois jours suivants (1, 2 et 3 jours pi) au diltiazem. La quantification virale est effectuée à
6 jours pi.
4B- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d'ARN, au pôle apical des épithéliums traités ou non traités, c'est-à-dire dans le surnageant de culture des épithéliums.
4C- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d'ARN au sein des épithéliums traités ou non traités.
4D- Représentation schématique de la chronologie de l'infection et des traitements per os (p.o) des souris: après l'infection par le VRS (5.105 PFU/souris, jour 0), les souris ont été
traitées ou non (groupe contrôle PBS) à 5h post-infection (5hpi) puis quotidiennement les deux jours suivants (1 et 2 jours pi) à la ribavirine (40 mg/kg en intra-péritonéale/souris) ou quotidiennement les quatre jours suivants (1, 2, 3 et 4 jours pi) au diltiazem (50 mg/Kg per os/souris). La quantification virale pulmonaire est effectuée à 5 jours pi.
4E- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d'ARN extrait des poumons de souris traitées à la ribavirine (VRS RIB) ou au diltiazem (VRS DIL) et non traitées (VRS PBS) à 5 jours après l'infection (jours pi).
Figure 5. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du virus parainfluenza humain (hPIV) dans le modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir0 HAE, Epithelix).
5A- Représentation schématique de la chronologie des traitements via le pôle basolatéral 5 .. des épithéliums respiratoires humains : après l'infection par le virus hPIV-3 à une MOI de 0,1 (jour 0), les épithéliums reconstitués sont traités ou non (non traités) à 5h post-infection (5hpi), puis quotidiennement les quatre jours suivants (24, 48, 72 et 96 heures pi) au diltiazem. La quantification virale est effectuée à 120 heures pi par titrage infectieux (TC I D50/mL).
Les niveaux de sécrétion (pg/mL) d'interféron lambda 1 (IL-29) aux pôles apical et basolatéral des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités et non traités au diltiazem via leur pôle basolatéral (90 pM, 3 administrations au total pendant 3 jours consécutifs), ont été
mesurés par ELISA après 72h de traitement.
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 and ****P<0.0001 par rapport aux épithéliums non traités.
Figure 4. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du virus syncytial respiratoire (VRS) au sein des épithéliums respiratoires humains reconstitués infectés (MucilAir0 HAE, Epithelix) et en modèle de souris BALB/c après challenge infectieux (in vivo).
4A- Représentation schématique de la chronologie des traitements via le pôle basolatéral des épithéliums respiratoires humains : après l'infection par le VRS (jour 0), les épithéliums reconstitués sont traités ou non (non traités) à 5h post-infection (5hpi) puis quotidiennement les trois jours suivants (1, 2 et 3 jours pi) au diltiazem. La quantification virale est effectuée à
6 jours pi.
4B- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d'ARN, au pôle apical des épithéliums traités ou non traités, c'est-à-dire dans le surnageant de culture des épithéliums.
4C- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d'ARN au sein des épithéliums traités ou non traités.
4D- Représentation schématique de la chronologie de l'infection et des traitements per os (p.o) des souris: après l'infection par le VRS (5.105 PFU/souris, jour 0), les souris ont été
traitées ou non (groupe contrôle PBS) à 5h post-infection (5hpi) puis quotidiennement les deux jours suivants (1 et 2 jours pi) à la ribavirine (40 mg/kg en intra-péritonéale/souris) ou quotidiennement les quatre jours suivants (1, 2, 3 et 4 jours pi) au diltiazem (50 mg/Kg per os/souris). La quantification virale pulmonaire est effectuée à 5 jours pi.
4E- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d'ARN extrait des poumons de souris traitées à la ribavirine (VRS RIB) ou au diltiazem (VRS DIL) et non traitées (VRS PBS) à 5 jours après l'infection (jours pi).
Figure 5. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du virus parainfluenza humain (hPIV) dans le modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir0 HAE, Epithelix).
5A- Représentation schématique de la chronologie des traitements via le pôle basolatéral 5 .. des épithéliums respiratoires humains : après l'infection par le virus hPIV-3 à une MOI de 0,1 (jour 0), les épithéliums reconstitués sont traités ou non (non traités) à 5h post-infection (5hpi), puis quotidiennement les quatre jours suivants (24, 48, 72 et 96 heures pi) au diltiazem. La quantification virale est effectuée à 120 heures pi par titrage infectieux (TC I D50/mL).
10 .. 5B- A 96h (en haut) et 120 h (en bas) post-infection, les effets cytopathiques induits par le virus hPIV-3 sont plus importants et facilement visibles au microscope dans les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (images de gauche), contrairement à ceux traités par le diltiazem (images de droite).
5C-La résistance électrique trans-épithéliale (TEER), qui reflète l'intégrité
de l'épithélium, a .. été mesurée une fois par jour à partir de 48 h post-infection, et jusqu'à
120 heures post-infection. En l'absence de traitement, les valeurs de TEER des épithéliums respiratoires humains reconstitués infectés ont fortement diminuées, à partir de 24 h post-infection, contrairement à ceux traités au diltiazem.
5D- Les titres viraux (DITC50/mL) des prélèvements réalisés au pôle apical des épithéliums ont été déterminés dans des cellules LLC-MK2 à partir de lavages prélevés dès 48 h post-infection et jusqu'à 120 hpi. En l'absence de traitement, les titres viraux mesurés à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués ont culminé à 72 h post-infection à
une valeur d'environ 108 DICT50/mL et à 96h post-infection à une valeur de 107 DICT50/mL, contrairement à ceux des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, qui présentent des valeurs significativement plus réduites à 72 h post-infection (environ 106 DICT50/mL) et à 96h post-infection (105 DICT50/mL).
Figure 6. Le traitement au diltiazem réduit l'infection bactérienne par Pseudomonas aeruginosa en modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir0 HAE, Epithelix).
.. 6A- Représentation schématique de la chronologie des traitements des épithéliums respiratoires humains : les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été traités 24 heures avant l'infection avec 90pM diltiazem via leur milieu basolatéral ou alternativement avec 10pL de diltiazem (90pM) à leur surface apicale, puis infectés par Pseudomonas
5C-La résistance électrique trans-épithéliale (TEER), qui reflète l'intégrité
de l'épithélium, a .. été mesurée une fois par jour à partir de 48 h post-infection, et jusqu'à
120 heures post-infection. En l'absence de traitement, les valeurs de TEER des épithéliums respiratoires humains reconstitués infectés ont fortement diminuées, à partir de 24 h post-infection, contrairement à ceux traités au diltiazem.
5D- Les titres viraux (DITC50/mL) des prélèvements réalisés au pôle apical des épithéliums ont été déterminés dans des cellules LLC-MK2 à partir de lavages prélevés dès 48 h post-infection et jusqu'à 120 hpi. En l'absence de traitement, les titres viraux mesurés à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués ont culminé à 72 h post-infection à
une valeur d'environ 108 DICT50/mL et à 96h post-infection à une valeur de 107 DICT50/mL, contrairement à ceux des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, qui présentent des valeurs significativement plus réduites à 72 h post-infection (environ 106 DICT50/mL) et à 96h post-infection (105 DICT50/mL).
Figure 6. Le traitement au diltiazem réduit l'infection bactérienne par Pseudomonas aeruginosa en modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir0 HAE, Epithelix).
.. 6A- Représentation schématique de la chronologie des traitements des épithéliums respiratoires humains : les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été traités 24 heures avant l'infection avec 90pM diltiazem via leur milieu basolatéral ou alternativement avec 10pL de diltiazem (90pM) à leur surface apicale, puis infectés par Pseudomonas
11 aeruginosa (souche PAK) à une MOI de 1 et de nouveau traités par le diltiazem 2 heures après l'infection dans les même conditions, respectivement.
6B- Dans ces conditions expérimentales (n = 2), le nombre de bactéries recueillies à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains à 24 heures post-infection, était significativement plus faible que celui des bactéries recueillies à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en milieu basolatéral (115 et 106 vs 76 et 106 UFC, respectivement, * p< 0,05).
6C- Dans le contexte du traitement apical au diltiazem, un effet similaire sur Pseudomonas aeruginosa a été observé à 24 heures post-infection (n=2), avec une diminution des bactéries récoltées à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en comparaison de ceux non traités (87 et 106 contre 63,5 et 106 UFC, respectivement).
Figure 7. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du métapneumovirus humain (hMPV) en modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir0 HAE, Epithelix).
7A- Représentation schématique de la chronologie des traitements des épithéliums respiratoires humains : après infection par un virus recombinant hMPV-GFP
(souche C-85473) à une MOI de 0,1, les épithéliums ont été traités (via leur milieu basolatéral) ou non (3 épithéliums par condition), par 3 doses successives de diltiazem à 90pM à JO
(5 hpi), J1 et J3 post-infection. La quantification virale est effectuée à 3 jours pi (surnageant) et à 5 jours pi (épithélium total).
7B- Des observations en microscopie à épifluorescence ont été réalisées à J4 post-infection afin d'observer l'impact du traitement par le diltiazem sur la réplication virale. En l'absence de traitement, une fluorescence correspondant à l'expression virale de la GFP, est observée à
J4 post-infection dans la quasi-totalité de l'épithélium (image de gauche), alors qu'il n'y a que de très rares cellules fluorescentes dans les épithélium infectés et traités par le diltiazem à ce même temps post-infection (image de droite).
7C- Au Jour 3 post-infection, un lavage au pôle apical des épithéliums infectés traités ou non au diltiazem, a été réalisé afin de récolter la progéniture virale produite.
L'ARN viral génomique a été extrait et quantifié par RT-qPCR (Biosystems TM PowerUp TM
SYBRTM Green, Thermo Fisher Scientific) à l'aide d'une gamme réalisée à partir d'un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène viral N/pg d'ARN
total extrait
6B- Dans ces conditions expérimentales (n = 2), le nombre de bactéries recueillies à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains à 24 heures post-infection, était significativement plus faible que celui des bactéries recueillies à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en milieu basolatéral (115 et 106 vs 76 et 106 UFC, respectivement, * p< 0,05).
6C- Dans le contexte du traitement apical au diltiazem, un effet similaire sur Pseudomonas aeruginosa a été observé à 24 heures post-infection (n=2), avec une diminution des bactéries récoltées à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en comparaison de ceux non traités (87 et 106 contre 63,5 et 106 UFC, respectivement).
Figure 7. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du métapneumovirus humain (hMPV) en modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir0 HAE, Epithelix).
7A- Représentation schématique de la chronologie des traitements des épithéliums respiratoires humains : après infection par un virus recombinant hMPV-GFP
(souche C-85473) à une MOI de 0,1, les épithéliums ont été traités (via leur milieu basolatéral) ou non (3 épithéliums par condition), par 3 doses successives de diltiazem à 90pM à JO
(5 hpi), J1 et J3 post-infection. La quantification virale est effectuée à 3 jours pi (surnageant) et à 5 jours pi (épithélium total).
7B- Des observations en microscopie à épifluorescence ont été réalisées à J4 post-infection afin d'observer l'impact du traitement par le diltiazem sur la réplication virale. En l'absence de traitement, une fluorescence correspondant à l'expression virale de la GFP, est observée à
J4 post-infection dans la quasi-totalité de l'épithélium (image de gauche), alors qu'il n'y a que de très rares cellules fluorescentes dans les épithélium infectés et traités par le diltiazem à ce même temps post-infection (image de droite).
7C- Au Jour 3 post-infection, un lavage au pôle apical des épithéliums infectés traités ou non au diltiazem, a été réalisé afin de récolter la progéniture virale produite.
L'ARN viral génomique a été extrait et quantifié par RT-qPCR (Biosystems TM PowerUp TM
SYBRTM Green, Thermo Fisher Scientific) à l'aide d'une gamme réalisée à partir d'un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène viral N/pg d'ARN
total extrait
12 7D- Au Jour 5 post-infection, les cellules des épithéliums ont été récoltées et lysées pour en extraire l'ARN total. Les ARN totaux correspondants au gène viral N de hMPV
ont été
quantifiés par RT-qPCR (BiosystemsTM PowerUpTM SYBRTM Green, Thermo Fisher Scientific), à l'aide d'une gamme réalisée à partir d'un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d'ARN total extrait.
Figure 8. Induction par le diltiazem de l'expression du gène IFN-12 (IFNL2) in vivo après instillation nasale de souris BALB/c 8A- Représentation schématique de la chronologie des traitements par instillation intranasale (i.n.) des souris BALB/c : les souris sont traitées (20 mg/kg) ou non (groupe contrôle PBS
mock-traité ) au jour 0 (JO), puis traitées ou non soit quotidiennement les deux jours suivants (JO, J1 et J2), soit toutes les 48 heures jusqu'au jour 4 (JO, J2 et J4). A J5, les cavités nasales ont été prélevées après euthanasie des animaux.
8B- L'expression du gène IFN-2 (IFNL2) a été mesurée par RT-qPCR et est représentée en ratio d'expression par rapport au niveau basal (égal à 1) de l'expression du gène mesurée chez des souris non traitées (Mock-traité).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une nouvelle utilisation thérapeutique d'un médicament connu, le diltiazem, une molécule membre de la famille des benzothiazépines référencée sous le numéro CAS 42399-41-7, de formule (1) :
h0 \\--õ
\ CH3 ) 0¨CH-3 Formule (1) Au sens de la présente invention, le terme diltiazem signifie le diltiazem sous toutes ses formes, notamment sous forme de sels et en particulier sous forme d'hydrochlorure de diltiazem. Ce terme inclut le mélange racémique ainsi que chacun des énantiomères lorsque
ont été
quantifiés par RT-qPCR (BiosystemsTM PowerUpTM SYBRTM Green, Thermo Fisher Scientific), à l'aide d'une gamme réalisée à partir d'un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d'ARN total extrait.
Figure 8. Induction par le diltiazem de l'expression du gène IFN-12 (IFNL2) in vivo après instillation nasale de souris BALB/c 8A- Représentation schématique de la chronologie des traitements par instillation intranasale (i.n.) des souris BALB/c : les souris sont traitées (20 mg/kg) ou non (groupe contrôle PBS
mock-traité ) au jour 0 (JO), puis traitées ou non soit quotidiennement les deux jours suivants (JO, J1 et J2), soit toutes les 48 heures jusqu'au jour 4 (JO, J2 et J4). A J5, les cavités nasales ont été prélevées après euthanasie des animaux.
8B- L'expression du gène IFN-2 (IFNL2) a été mesurée par RT-qPCR et est représentée en ratio d'expression par rapport au niveau basal (égal à 1) de l'expression du gène mesurée chez des souris non traitées (Mock-traité).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une nouvelle utilisation thérapeutique d'un médicament connu, le diltiazem, une molécule membre de la famille des benzothiazépines référencée sous le numéro CAS 42399-41-7, de formule (1) :
h0 \\--õ
\ CH3 ) 0¨CH-3 Formule (1) Au sens de la présente invention, le terme diltiazem signifie le diltiazem sous toutes ses formes, notamment sous forme de sels et en particulier sous forme d'hydrochlorure de diltiazem. Ce terme inclut le mélange racémique ainsi que chacun des énantiomères lorsque
13 ceux-ci sont isolés. Ce terme inclut également les dérivés de diltiazem c'est à dire les molécules dérivées de la formule (1), présentant la même activité biologique de stimulation de l'expression des protéines interférons de type III.
La présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Jusqu'à présent, le diltiazem était utilisé pour son action inhibitrice des canaux calcium ; par cette inhibition du transport intracellulaire de calcium, l'administration de diltiazem génère de nombreux effets physiologiques sur les organismes des humains et des animaux.
Les inventeurs ont mis en évidence un nouvel effet technique du diltiazem, à
savoir l'activation de l'expression d'un ou plusieurs gènes codant pour des interférons de type III.
Selon un aspect préféré de l'invention, le ou les gènes dont l'expression est activée sont des gènes endogènes, c'est-à-dire les gènes natifs de l'organisme considéré, qui n'ont subi aucune modification génétique.
L'Homme du métier connait l'implication des interférons de type III dans différentes situations physiologiques, et peut conclure, au regard de la littérature scientifique, du potentiel thérapeutique d'un tel composé activateur de l'expression de ces interférons de type III. En particulier, les cellules sensibles aux effets des interférons III, c'est-à-dire les cellules exprimant leurs récepteurs, ont été répertoriées dans la littérature. Ainsi, les pathologies humaines et animales pouvant profiter d'une utilisation de diltiazem seront aisément déterminées par les hommes de l'art.
Plus précisément, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression des gènes codant pour l'interleukine 29, l'interleukine 28A
et l'interleukine 28B.
Ainsi, pour la première fois, un composé thérapeutique permettant d'activer la voie de l'interféron III , c'est-à-dire un agent activateur de l'expression d'un ou plusieurs gènes codants pour des interférons de type III, est identifié. Il s'agit du premier composé présentant cette activité à être identifié.
Interférons de type III
Les Interférons de type III, aussi désignés interférons lambda W, constituent la première ligne de défense d'un organisme humain ou animal face à une infection par des microorganismes pathogènes.
La présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Jusqu'à présent, le diltiazem était utilisé pour son action inhibitrice des canaux calcium ; par cette inhibition du transport intracellulaire de calcium, l'administration de diltiazem génère de nombreux effets physiologiques sur les organismes des humains et des animaux.
Les inventeurs ont mis en évidence un nouvel effet technique du diltiazem, à
savoir l'activation de l'expression d'un ou plusieurs gènes codant pour des interférons de type III.
Selon un aspect préféré de l'invention, le ou les gènes dont l'expression est activée sont des gènes endogènes, c'est-à-dire les gènes natifs de l'organisme considéré, qui n'ont subi aucune modification génétique.
L'Homme du métier connait l'implication des interférons de type III dans différentes situations physiologiques, et peut conclure, au regard de la littérature scientifique, du potentiel thérapeutique d'un tel composé activateur de l'expression de ces interférons de type III. En particulier, les cellules sensibles aux effets des interférons III, c'est-à-dire les cellules exprimant leurs récepteurs, ont été répertoriées dans la littérature. Ainsi, les pathologies humaines et animales pouvant profiter d'une utilisation de diltiazem seront aisément déterminées par les hommes de l'art.
Plus précisément, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression des gènes codant pour l'interleukine 29, l'interleukine 28A
et l'interleukine 28B.
Ainsi, pour la première fois, un composé thérapeutique permettant d'activer la voie de l'interféron III , c'est-à-dire un agent activateur de l'expression d'un ou plusieurs gènes codants pour des interférons de type III, est identifié. Il s'agit du premier composé présentant cette activité à être identifié.
Interférons de type III
Les Interférons de type III, aussi désignés interférons lambda W, constituent la première ligne de défense d'un organisme humain ou animal face à une infection par des microorganismes pathogènes.
14 Cette nouvelle famille d'interférons, décrite pour la première fois en 2003, comprend chez l'Homme les quatre protéines suivantes :
- Interféron lambda-1 (IFN-M ) ou interleukine 29 (IL-29), - Interféron lambda-2 (IFN-2) ou interleukine 28A (IL-28A), - Interféron lambda-3 (IFN-U) ou interleukine 28B (1L-28B), - Interféron lambda-4 (IFN-M-).
Chez la souris, seules deux protéines appartenant à cette famille d'interférons III ont été
jusqu'à présent identifiées (IFN-A2/IL-28A et I FN-A3/IL-28B).
Ces interférons de type III médient leurs effets via leur récepteur commun IFN-R1, aussi connu sous la dénomination IL-28RA. Un complexe hétéromérique se forme entre ce récepteur et le récepteur IL-10R2 pour lier des monomères (voir Donnelly &
Kotenko, 2010, pour revue).
Au sens de la présente invention, on entend par gène codant pour un interféron de type III l'un des gènes suivants, ou leurs homologues :
- Le gène codant pour I FN-M , - Le gène codant pour I FN-2, - Le gène codant pour I FN-U, et - Le gène codant pour I FN-M-, tels que décrits dans les publications de Kotenko et al., 2003 et O'Brien et al., 2014.
II est entendu que les gènes cités ci-dessus sont les gènes humains, mais que si le diltiazem est utilisé dans une espèce animale différente, les gènes codant pour les interférons de type III dont l'expression est activée par le diltiazem seront au moins un des gènes homologues de l'espèce en question.
Induction de l'expression de gènes ISG majeurs L'exemple 1 de la présente demande démontre que le diltiazem induit l'expression de plusieurs gènes dits interferon-stimulated (ISG), et notamment les gènes de l'immunité , suite à un traitement par voie apicale ou basolatérale.
Notamment, le diltiazem induit l'expression d'ISG bien décrites dans la littérature telles que IF144L, IFIT2 OAS1, IRF7, MX1 ou IFITM1.
Infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux Le récepteur IFN-,R1 est exclusivement exprimé par les cellules de type épithélial, limitant ainsi les effets des interférons de type III aux épithéliums.
Lors d'infections par des pathogènes externes, les épithéliums des tractus respiratoires et intestinaux sont les premiers organes touchés, du fait de leur contact direct, respectivement, 5 avec l'air aspiré, et l'eau et la nourriture ingérés.
Ainsi, la présente invention concerne tout particulièrement le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
10 L'expression infection par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux doit se comprendre comme étant une infection générée par la présence d'au moins un microorganisme pathogène, ce microorganisme ayant infecté l'individu ou l'animal, ou étant susceptible d'infecter l'individu ou l'animal.
Il est en effet entendu que la présente invention concerne aussi bien la prévention et/ou le
- Interféron lambda-1 (IFN-M ) ou interleukine 29 (IL-29), - Interféron lambda-2 (IFN-2) ou interleukine 28A (IL-28A), - Interféron lambda-3 (IFN-U) ou interleukine 28B (1L-28B), - Interféron lambda-4 (IFN-M-).
Chez la souris, seules deux protéines appartenant à cette famille d'interférons III ont été
jusqu'à présent identifiées (IFN-A2/IL-28A et I FN-A3/IL-28B).
Ces interférons de type III médient leurs effets via leur récepteur commun IFN-R1, aussi connu sous la dénomination IL-28RA. Un complexe hétéromérique se forme entre ce récepteur et le récepteur IL-10R2 pour lier des monomères (voir Donnelly &
Kotenko, 2010, pour revue).
Au sens de la présente invention, on entend par gène codant pour un interféron de type III l'un des gènes suivants, ou leurs homologues :
- Le gène codant pour I FN-M , - Le gène codant pour I FN-2, - Le gène codant pour I FN-U, et - Le gène codant pour I FN-M-, tels que décrits dans les publications de Kotenko et al., 2003 et O'Brien et al., 2014.
II est entendu que les gènes cités ci-dessus sont les gènes humains, mais que si le diltiazem est utilisé dans une espèce animale différente, les gènes codant pour les interférons de type III dont l'expression est activée par le diltiazem seront au moins un des gènes homologues de l'espèce en question.
Induction de l'expression de gènes ISG majeurs L'exemple 1 de la présente demande démontre que le diltiazem induit l'expression de plusieurs gènes dits interferon-stimulated (ISG), et notamment les gènes de l'immunité , suite à un traitement par voie apicale ou basolatérale.
Notamment, le diltiazem induit l'expression d'ISG bien décrites dans la littérature telles que IF144L, IFIT2 OAS1, IRF7, MX1 ou IFITM1.
Infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux Le récepteur IFN-,R1 est exclusivement exprimé par les cellules de type épithélial, limitant ainsi les effets des interférons de type III aux épithéliums.
Lors d'infections par des pathogènes externes, les épithéliums des tractus respiratoires et intestinaux sont les premiers organes touchés, du fait de leur contact direct, respectivement, 5 avec l'air aspiré, et l'eau et la nourriture ingérés.
Ainsi, la présente invention concerne tout particulièrement le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
10 L'expression infection par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux doit se comprendre comme étant une infection générée par la présence d'au moins un microorganisme pathogène, ce microorganisme ayant infecté l'individu ou l'animal, ou étant susceptible d'infecter l'individu ou l'animal.
Il est en effet entendu que la présente invention concerne aussi bien la prévention et/ou le
15 traitement des infections touchant les êtres humains (aussi désignés comme étant des individus ), que des infections touchant des animaux, notamment des animaux d'élevage.
Le terme prévention désigne le fait d'empêcher, ou du moins de diminuer la probabilité
d'apparition, d'une infection dans un organisme humain ou animal par au moins un microorganisme pathogène. Sous l'action des interférons de type III produits, les tissus de l'organisme et notamment les épithéliums deviennent plus résistants et sont plus à même de ne pas être infectées et/ou de limiter l'infection par ledit microorganisme.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le diltiazem est utilisé
en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux Le terme traitement désigne le fait de combattre l'infection par au moins un microorganisme pathogène dans un organisme humain ou animal. Grâce à
l'administration de diltiazem, le taux d'infection virale, bactérienne, fongique ou parasitaire dans l'organisme va peu à peu diminuer voire même disparaitre complètement. Le terme traitement désigne aussi le fait d'atténuer les symptômes associés à l'infection (fièvre, fatigue...) et/ou le fait de prévenir/diminuer les risques de complications, notamment de surinfection.
Le terme prévention désigne le fait d'empêcher, ou du moins de diminuer la probabilité
d'apparition, d'une infection dans un organisme humain ou animal par au moins un microorganisme pathogène. Sous l'action des interférons de type III produits, les tissus de l'organisme et notamment les épithéliums deviennent plus résistants et sont plus à même de ne pas être infectées et/ou de limiter l'infection par ledit microorganisme.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le diltiazem est utilisé
en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux Le terme traitement désigne le fait de combattre l'infection par au moins un microorganisme pathogène dans un organisme humain ou animal. Grâce à
l'administration de diltiazem, le taux d'infection virale, bactérienne, fongique ou parasitaire dans l'organisme va peu à peu diminuer voire même disparaitre complètement. Le terme traitement désigne aussi le fait d'atténuer les symptômes associés à l'infection (fièvre, fatigue...) et/ou le fait de prévenir/diminuer les risques de complications, notamment de surinfection.
16 Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le diltiazem est utilisé
en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, caractérisée en ce que ledit au moins un gène est choisi parmi le gène codant pour l'interleukine 29, le gène codant pour l'interleukine 28A et le gène codant pour l'interleukine 28B.
Selon une mise en oeuvre particulière, le diltiazem est utilisé en tant qu'agent activateur de l'expression des trois gènes codant pour l'interleukine 29, pour l'interleukine 28A et pour l'interleukine 28B.
Microorganismes pathogènes .. Au sens de l'invention, l'expression microorganismes pathogènes désigne tout microorganisme apte à créer une maladie chez d'autres organismes, tel que chez l'homme ou les animaux. Cette expression inclut notamment les virus, bactéries, champignons, protozoaires, vers, et autres microorganismes unicellulaires pathogènes.
De façon préférée, le microorganisme pathogène est un microorganisme sensible à la réponse cellulaire de type interféron III , c'est-à-dire un microorganisme dont l'infection cellulaire sera prévenue ou inhibée, totalement ou partiellement, par l'expression et la sécrétion de protéines de type interféron III.
Selon un aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme qui infecte spécifiquement les épithéliums des tractus respiratoires.
Selon un autre aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme qui infecte spécifiquement les épithéliums des tractus intestinaux.
Selon encore un autre aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme capable d'infecter tout type d'épithéliums et notamment ceux des tractus respiratoires et intestinaux.
Selon un premier aspect de l'invention, l'infection est une infection virale, c'est-à-dire que le microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux est un virus.
en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, caractérisée en ce que ledit au moins un gène est choisi parmi le gène codant pour l'interleukine 29, le gène codant pour l'interleukine 28A et le gène codant pour l'interleukine 28B.
Selon une mise en oeuvre particulière, le diltiazem est utilisé en tant qu'agent activateur de l'expression des trois gènes codant pour l'interleukine 29, pour l'interleukine 28A et pour l'interleukine 28B.
Microorganismes pathogènes .. Au sens de l'invention, l'expression microorganismes pathogènes désigne tout microorganisme apte à créer une maladie chez d'autres organismes, tel que chez l'homme ou les animaux. Cette expression inclut notamment les virus, bactéries, champignons, protozoaires, vers, et autres microorganismes unicellulaires pathogènes.
De façon préférée, le microorganisme pathogène est un microorganisme sensible à la réponse cellulaire de type interféron III , c'est-à-dire un microorganisme dont l'infection cellulaire sera prévenue ou inhibée, totalement ou partiellement, par l'expression et la sécrétion de protéines de type interféron III.
Selon un aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme qui infecte spécifiquement les épithéliums des tractus respiratoires.
Selon un autre aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme qui infecte spécifiquement les épithéliums des tractus intestinaux.
Selon encore un autre aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme capable d'infecter tout type d'épithéliums et notamment ceux des tractus respiratoires et intestinaux.
Selon un premier aspect de l'invention, l'infection est une infection virale, c'est-à-dire que le microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux est un virus.
17 Les protéines appartenant à la famille des interférons de type III sont des acteurs essentiels dans la réponse anti-virale des épithéliums cibles des virus. Ainsi, un agent activateur de l'expression des gènes codant pour lesdites protéines interférons de type III
permet de stimuler et d'optimiser la réponse anti-virale des épithéliums infectés.
Selon cet aspect, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un virus infectant les épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Au sens de l'invention, le terme virus inclut tout type de virus mais plus particulièrement .. les virus infectant les organismes eucaryotes vertébrés. Il peut s'agir de virus à ADN ou à
ARN. Dans le cadre de la présente invention, il s'agit plus particulièrement ici des virus infectant des organismes via les épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect particulier de l'invention, l'infection n'est pas une infection par un virus influenza.
L'utilisation thérapeutique de diltiazem pour traiter les infections par virus influenza a déjà été
proposée dans les documents WO 2011/126071 et WO 2016/146836. Toutefois, le diltiazem est utilisé dans l'art antérieur pour son action sur les canaux calcium, et non pour son action activatrice de l'expression de gènes codant pour des interférons de type III.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe I ayant un génome à ADN double brin. Ce groupe de virus comprend notamment les virus de l'ordre des Herpes, ceux de la famille des papillomavirus, ainsi que les polyomavirus et les poxviridae.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe II ayant un génome à ADN simple brin, comprenant en particulier les virus de la famille des parvoviridae.
Selon un aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe III ayant un génome à ARN bicaténaire, comprenant en particulier les virus de la famille des rhéoviridae, tels que les rotavirus.
Selon un aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe IV
présentant un génome à ARN monocaténaire à polarité positive. Ce groupe comprend notamment :
- les virus de l'ordre des Nidovirales, tels que ceux de la famille des coronaviridae ;
permet de stimuler et d'optimiser la réponse anti-virale des épithéliums infectés.
Selon cet aspect, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un virus infectant les épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Au sens de l'invention, le terme virus inclut tout type de virus mais plus particulièrement .. les virus infectant les organismes eucaryotes vertébrés. Il peut s'agir de virus à ADN ou à
ARN. Dans le cadre de la présente invention, il s'agit plus particulièrement ici des virus infectant des organismes via les épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect particulier de l'invention, l'infection n'est pas une infection par un virus influenza.
L'utilisation thérapeutique de diltiazem pour traiter les infections par virus influenza a déjà été
proposée dans les documents WO 2011/126071 et WO 2016/146836. Toutefois, le diltiazem est utilisé dans l'art antérieur pour son action sur les canaux calcium, et non pour son action activatrice de l'expression de gènes codant pour des interférons de type III.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe I ayant un génome à ADN double brin. Ce groupe de virus comprend notamment les virus de l'ordre des Herpes, ceux de la famille des papillomavirus, ainsi que les polyomavirus et les poxviridae.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe II ayant un génome à ADN simple brin, comprenant en particulier les virus de la famille des parvoviridae.
Selon un aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe III ayant un génome à ARN bicaténaire, comprenant en particulier les virus de la famille des rhéoviridae, tels que les rotavirus.
Selon un aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe IV
présentant un génome à ARN monocaténaire à polarité positive. Ce groupe comprend notamment :
- les virus de l'ordre des Nidovirales, tels que ceux de la famille des coronaviridae ;
18 - les virus de la famille des Caliciviridae, dont le virus de Norwalk ;
- les virus de la famille des Flaviviridae, dont notamment le virus de la fièvre jaune, le virus du Nil occidental, le virus de l'hépatite C et le virus de la dengue ;
- les virus de la famille des Picomaviridae, dont les poliovirus, les rhinovirus, et le virus de l'hépatite A;
- les virus de la famille des Togaviridae, dont le virus de la rubéole, le virus de la Ross River, le virus de Sindbis et le virus du Chikungunya.
Selon un aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe V ayant un génome à ARN monocaténaire à polarité négative (ssRNA). Ce groupe inclut notamment les virus de l'ordre des Mononegavirales, tels que:
- les virus de la famille des Bomaviridae, dont les Bomaviridae, - les virus de la famille des Filoviridae, dont le virus Ebola et le virus Marburg, - les virus de la famille des Paramyxoviridae, dont le virus de la rougeole, le virus ourlien des oreillons et les Henipavirus, - les virus de la famille des Rhabdoviridae, dont le virus de la rage, - les virus de la famille des Arenaviridae, dont le virus de la fièvre de Lassa, - les virus de la famille des Bunyaviridae, dont les Hantavirus et le virus de la fièvre Congo-Crimée, - les virus de la famille des Orthomyxoviridae.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV), le metapneumovirus humain (hMPV), le virus Nipah, les novovirus, le virus Swine fever, les adenovirus, les coronavirus, le virus Zika, le virus de la fièvre jaune, les rhéovirus, les rotavirus, le virus de la Dengue, et le virus West Mie.
Plus particulièrement, le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le metapneumovirus humain (hMPV).
Selon une mise en oeuvre particulière, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).
- les virus de la famille des Flaviviridae, dont notamment le virus de la fièvre jaune, le virus du Nil occidental, le virus de l'hépatite C et le virus de la dengue ;
- les virus de la famille des Picomaviridae, dont les poliovirus, les rhinovirus, et le virus de l'hépatite A;
- les virus de la famille des Togaviridae, dont le virus de la rubéole, le virus de la Ross River, le virus de Sindbis et le virus du Chikungunya.
Selon un aspect de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe V ayant un génome à ARN monocaténaire à polarité négative (ssRNA). Ce groupe inclut notamment les virus de l'ordre des Mononegavirales, tels que:
- les virus de la famille des Bomaviridae, dont les Bomaviridae, - les virus de la famille des Filoviridae, dont le virus Ebola et le virus Marburg, - les virus de la famille des Paramyxoviridae, dont le virus de la rougeole, le virus ourlien des oreillons et les Henipavirus, - les virus de la famille des Rhabdoviridae, dont le virus de la rage, - les virus de la famille des Arenaviridae, dont le virus de la fièvre de Lassa, - les virus de la famille des Bunyaviridae, dont les Hantavirus et le virus de la fièvre Congo-Crimée, - les virus de la famille des Orthomyxoviridae.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV), le metapneumovirus humain (hMPV), le virus Nipah, les novovirus, le virus Swine fever, les adenovirus, les coronavirus, le virus Zika, le virus de la fièvre jaune, les rhéovirus, les rotavirus, le virus de la Dengue, et le virus West Mie.
Plus particulièrement, le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le metapneumovirus humain (hMPV).
Selon une mise en oeuvre particulière, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).
19 Selon une autre mise en oeuvre, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus parainfluenza humain (hPIV).
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus parainfluenza humain (hPIV).
Selon une mise en oeuvre particulière, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par le métapneumovirus humain (hMPV).
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le métapneumovirus humain (hMPV).
Selon un deuxième aspect de l'invention, l'infection est une infection non virale. En particulier, le microorganisme pathogène peut être choisi parmi une bactérie, un champignon et un parasite.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est une bactérie.
Parmi les bactéries pathogènes, on peut citer notamment les bactéries des espèces suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tube rculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae On peut citer également les bactéries spécifiques des infections intestinales telles que Campylobacterspp., Salmonella spp.,Shigella spp.,Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène n'est pas une bactérie du genre Chlamydiae.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est une bactérie choisie parmi les espèces bactériennes suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tube rculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Campylobacterspp., Salmonella spp.,Shigella spp.,Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Esche richia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Selon une mise en oeuvre particulière, le microorganisme pathogène est une bactérie de l'espèce Pseudomonas aeruginosa.
5 Selon une mise en oeuvre particulière, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par Pseudomonas aeruginosa.
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par Pseudomonas aeruginosa.
10 Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est un champignon.
Parmi les champignons pathogènes on peut citer notamment Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Pneumocystis jiroveci, Fusarium solari.
Selon une autre mise en oeuvre, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, 15 dans la prévention et/ou le traitement des infections par un microorganisme pathogène choisi parmi le groupe suivant : Pseudomonas aeruginosa, le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le metapneumovirus humain (hMPV).
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par un microorganisme pathogène choisi parmi le groupe
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus parainfluenza humain (hPIV).
Selon une mise en oeuvre particulière, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par le métapneumovirus humain (hMPV).
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le métapneumovirus humain (hMPV).
Selon un deuxième aspect de l'invention, l'infection est une infection non virale. En particulier, le microorganisme pathogène peut être choisi parmi une bactérie, un champignon et un parasite.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est une bactérie.
Parmi les bactéries pathogènes, on peut citer notamment les bactéries des espèces suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tube rculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae On peut citer également les bactéries spécifiques des infections intestinales telles que Campylobacterspp., Salmonella spp.,Shigella spp.,Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène n'est pas une bactérie du genre Chlamydiae.
Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est une bactérie choisie parmi les espèces bactériennes suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tube rculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Campylobacterspp., Salmonella spp.,Shigella spp.,Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Esche richia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Selon une mise en oeuvre particulière, le microorganisme pathogène est une bactérie de l'espèce Pseudomonas aeruginosa.
5 Selon une mise en oeuvre particulière, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par Pseudomonas aeruginosa.
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par Pseudomonas aeruginosa.
10 Selon un aspect particulier de l'invention, le microorganisme pathogène est un champignon.
Parmi les champignons pathogènes on peut citer notamment Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Pneumocystis jiroveci, Fusarium solari.
Selon une autre mise en oeuvre, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, 15 dans la prévention et/ou le traitement des infections par un microorganisme pathogène choisi parmi le groupe suivant : Pseudomonas aeruginosa, le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le metapneumovirus humain (hMPV).
Plus particulièrement, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par un microorganisme pathogène choisi parmi le groupe
20 suivant : Pseudomonas aeruginosa, le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le metapneumovirus humain (hMPV).
L'expression au moins un microorganisme pathogène signifie qu'un ou plusieurs microorganismes pathogènes sont présents dans l'organisme infecté, générant ainsi une réponse immunitaire de l'organisme.
En particulier, l'organisme peut avoir été infecté par à la fois un virus et une bactérie, ce qui est désigné comme étant une co-infection de l'organisme.
Selon un aspect particulier, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, caractérisé en ce que l'infection est une co-infection par au moins un virus et au moins une bactérie.
L'expression au moins un microorganisme pathogène signifie qu'un ou plusieurs microorganismes pathogènes sont présents dans l'organisme infecté, générant ainsi une réponse immunitaire de l'organisme.
En particulier, l'organisme peut avoir été infecté par à la fois un virus et une bactérie, ce qui est désigné comme étant une co-infection de l'organisme.
Selon un aspect particulier, l'invention concerne le diltiazem pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, caractérisé en ce que l'infection est une co-infection par au moins un virus et au moins une bactérie.
21 Avantageusement, le diltiazem est alors utilisé pour le traitement concomitant d'une infection virale et d'une infection bactérienne, ce qui permet de limiter le nombre de composés actifs administrés à un individu ou un animal atteint de cette co-infection.
Plus particulièrement, cette co-infection pourra être liée à la présence dans les épithéliums infectés d'une combinaison de microorganismes pathogènes choisie parmi les suivantes :
- Un virus respiratoire syncytial humain (hRSV) et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.
- un virus parainfluenza (hPIV) et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un metapneumovirus humain (hMPV) et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un virus Nipah et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un novovirus et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Campylobacterspp. Salmonella spp, Esche richia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile, - un coronavirus et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - le virus Swine fever et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
Plus particulièrement, cette co-infection pourra être liée à la présence dans les épithéliums infectés d'une combinaison de microorganismes pathogènes choisie parmi les suivantes :
- Un virus respiratoire syncytial humain (hRSV) et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.
- un virus parainfluenza (hPIV) et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un metapneumovirus humain (hMPV) et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un virus Nipah et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un novovirus et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Campylobacterspp. Salmonella spp, Esche richia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile, - un coronavirus et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - le virus Swine fever et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
22 epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un adenovirus et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - le virus Zika et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - le virus de la fièvre jaune et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un rhéovirus et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - un rotavirus et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Campylobacterspp.
Salmonella spp., Esche richia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile, - le virus de la Dengue et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - le virus West Nile et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, et - Un virus influenza et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.
Salmonella spp., Esche richia cou, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile, - le virus de la Dengue et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, - le virus West Nile et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, et - Un virus influenza et au moins une bactérie d'une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.
23 Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III sera utilisé pour à la fois :
i) Traiter une infection virale des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux; et ii) Prévenir une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu'une surinfection bactérienne.
Selon une autre mise en oeuvre particulière de l'invention, le diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III sera utilisé pour à la fois :
i) Traiter une infection bactérienne des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux ; et ii) Prévenir une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu'une surinfection virale.
Selon une autre mise en oeuvre particulière de l'invention, le diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III sera utilisé pour à la fois :
i) Traiter une infection virale des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux; et ii) Traiter une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu'une surinfection bactérienne.
Combinaisons thérapeutiques La présente invention concerne également le diltiazem pour son utilisation thérapeutique telle que présentée précédemment, caractérisé en ce qu'il est utilisé en combinaison avec au moins un autre agent actif, c'est-à-dire avec un ou plusieurs agents actifs.
De préférence, cet autre agent actif est un composé thérapeutique ayant une action bénéfique sur un organisme humain ou animal, dans le but de prévenir ou traiter une pathologie.
i) Traiter une infection virale des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux; et ii) Prévenir une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu'une surinfection bactérienne.
Selon une autre mise en oeuvre particulière de l'invention, le diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III sera utilisé pour à la fois :
i) Traiter une infection bactérienne des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux ; et ii) Prévenir une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu'une surinfection virale.
Selon une autre mise en oeuvre particulière de l'invention, le diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III sera utilisé pour à la fois :
i) Traiter une infection virale des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux; et ii) Traiter une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu'une surinfection bactérienne.
Combinaisons thérapeutiques La présente invention concerne également le diltiazem pour son utilisation thérapeutique telle que présentée précédemment, caractérisé en ce qu'il est utilisé en combinaison avec au moins un autre agent actif, c'est-à-dire avec un ou plusieurs agents actifs.
De préférence, cet autre agent actif est un composé thérapeutique ayant une action bénéfique sur un organisme humain ou animal, dans le but de prévenir ou traiter une pathologie.
24 Cet autre agent actif sera en particulier choisi parmi un composé anti-viral, un composé anti-bactérien, un composé anti-parasitaire, un composé anti-fongique, et un vaccin préventif ou thérapeutique.
De manière préférée, cet autre agent actif est choisi parmi un composé
antiviral et un .. composé anti-bactérien.
Au sens de l'invention, on entend par composé antiviral un composé ayant soit une action inhibitrice directe sur au moins un virus (par exemple, inhibant sa réplication), soit une action sur une cellule cible du virus (par exemple, en induisant un état cellulaire défavorable à une infection virale, prévenant ainsi l'infection virale).
Les agents anti-viraux sont classifiés en différentes catégories en fonction de leur mode d'action. On peut citer notamment :
- les analogues de nucléotides, qui interfèrent ou stoppent la synthèse d'ADN ou d'ARN ; ainsi que les inhibiteurs des enzymes impliquées dans la synthèse d'ADN ou d'ARN (hélicase, réplicase) ;
- les composés qui inhibent les étapes de maturation du virus au cours de son cycle de réplication ;
- les composés qui interfèrent avec la liaison à la membrane cellulaire, ou à
l'entrée des virus dans des cellules hôtes (Inhibiteurs de fusion ou d'entrée) ;
- les agents qui empêchent le virus de s'exprimer au sein de la cellule hôte après son entrée, en bloquant son désassemblage au sein de la cellule ;
- les agents qui restreignent la propagation des virus vers d'autres cellules.
En particulier, le ou les agent(s) antiviral(aux) est(sont) choisi(s) parmi :
i) des agents viraux ayant une action inhibitrice directe sur les virus, tels que par exemple la ribavirine et le favipiravir ;
ii) des agents actifs induisant des états cellulaires globalement défavorables à une infection virale ; et iii) des composés choisis parmi les composés suivants:
= des analogues de 2-desoxyuridine substituée ;
= des analogues de nucléosides ;
= des analogues de pyrophosphate ;
= des inhibiteurs de protéases ;
= des inhibiteurs de la pénétration d'un virus dans les cellules, tel que par exemple l'arbidol ;
= des anticorps monoclonaux, comme par exemple le palivizumab, dirigé
contre un épitope du site antigénique A de la protéine de fusion du virus respiratoire syncytial (VRS) ; et = des oligonucléotides antisens ayant une action inhibitrice des virus.
5 Au sens de l'invention, on entend par composé anti-bactérien un composé ayant une activité anti-bactérienne, c'est-à-dire inhibant la réplication des bactéries (composés bactériostatiques) ou les détruisant (composés bactéricides) ou encore en inhibant leur biosynthèse et/ou sécrétion de produits toxiques. Il s'agit en particulier des antibiotiques.
En particulier, le ou les agent(s) anti-bactérien(s) est(sont) choisi(s) parmi :
10 i) les antibiotiques, et notamment ceux de la famille des macrolides, et tout particulièrement la roxythromycine ;
ii) les bactériophages, prédateurs naturels des bactéries.
De tels agents anti-viraux et anti-bactériens sont disponibles dans le commerce, et leurs conditions d'utilisation sont décrites dans des ouvrages de référence comme Le Dictionnaire 15 Vidal.
Selon un autre aspect de l'invention, l'autre agent actif utilisé en combinaison avec le diltiazem est un composé anti-fongique ou un composé anti-parasitaire, notamment choisis parmi les composés anti-fongiques systémiques (amphotéricine B, azolés, echinocandines) et les composés anti-parasitaires systémiques (par exemples les antipaléudéens, 20 antiamibiens, toxoplasmose, leishmaniose, pneumocytose, antihelminthique).
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, l'au moins autre agent actif est un vaccin.
Au sens de l'invention, on entend par vaccin un composé ou une combinaison de composés permettant de stimuler de manière spécifique le système immunitaire d'un
De manière préférée, cet autre agent actif est choisi parmi un composé
antiviral et un .. composé anti-bactérien.
Au sens de l'invention, on entend par composé antiviral un composé ayant soit une action inhibitrice directe sur au moins un virus (par exemple, inhibant sa réplication), soit une action sur une cellule cible du virus (par exemple, en induisant un état cellulaire défavorable à une infection virale, prévenant ainsi l'infection virale).
Les agents anti-viraux sont classifiés en différentes catégories en fonction de leur mode d'action. On peut citer notamment :
- les analogues de nucléotides, qui interfèrent ou stoppent la synthèse d'ADN ou d'ARN ; ainsi que les inhibiteurs des enzymes impliquées dans la synthèse d'ADN ou d'ARN (hélicase, réplicase) ;
- les composés qui inhibent les étapes de maturation du virus au cours de son cycle de réplication ;
- les composés qui interfèrent avec la liaison à la membrane cellulaire, ou à
l'entrée des virus dans des cellules hôtes (Inhibiteurs de fusion ou d'entrée) ;
- les agents qui empêchent le virus de s'exprimer au sein de la cellule hôte après son entrée, en bloquant son désassemblage au sein de la cellule ;
- les agents qui restreignent la propagation des virus vers d'autres cellules.
En particulier, le ou les agent(s) antiviral(aux) est(sont) choisi(s) parmi :
i) des agents viraux ayant une action inhibitrice directe sur les virus, tels que par exemple la ribavirine et le favipiravir ;
ii) des agents actifs induisant des états cellulaires globalement défavorables à une infection virale ; et iii) des composés choisis parmi les composés suivants:
= des analogues de 2-desoxyuridine substituée ;
= des analogues de nucléosides ;
= des analogues de pyrophosphate ;
= des inhibiteurs de protéases ;
= des inhibiteurs de la pénétration d'un virus dans les cellules, tel que par exemple l'arbidol ;
= des anticorps monoclonaux, comme par exemple le palivizumab, dirigé
contre un épitope du site antigénique A de la protéine de fusion du virus respiratoire syncytial (VRS) ; et = des oligonucléotides antisens ayant une action inhibitrice des virus.
5 Au sens de l'invention, on entend par composé anti-bactérien un composé ayant une activité anti-bactérienne, c'est-à-dire inhibant la réplication des bactéries (composés bactériostatiques) ou les détruisant (composés bactéricides) ou encore en inhibant leur biosynthèse et/ou sécrétion de produits toxiques. Il s'agit en particulier des antibiotiques.
En particulier, le ou les agent(s) anti-bactérien(s) est(sont) choisi(s) parmi :
10 i) les antibiotiques, et notamment ceux de la famille des macrolides, et tout particulièrement la roxythromycine ;
ii) les bactériophages, prédateurs naturels des bactéries.
De tels agents anti-viraux et anti-bactériens sont disponibles dans le commerce, et leurs conditions d'utilisation sont décrites dans des ouvrages de référence comme Le Dictionnaire 15 Vidal.
Selon un autre aspect de l'invention, l'autre agent actif utilisé en combinaison avec le diltiazem est un composé anti-fongique ou un composé anti-parasitaire, notamment choisis parmi les composés anti-fongiques systémiques (amphotéricine B, azolés, echinocandines) et les composés anti-parasitaires systémiques (par exemples les antipaléudéens, 20 antiamibiens, toxoplasmose, leishmaniose, pneumocytose, antihelminthique).
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, l'au moins autre agent actif est un vaccin.
Au sens de l'invention, on entend par vaccin un composé ou une combinaison de composés permettant de stimuler de manière spécifique le système immunitaire d'un
25 organisme humain ou animal. Un vaccin comprendra en particulier un antigène, c'est à dire un composé induisant une réponse immunitaire spécifique dans l'organisme, qui en conservera la mémoire.
Un tel vaccin pourra être de type vaccin préventif, c'est-à-dire destiné à
stimuler une réponse immunitaire spécifique avant l'infection d'un organisme par un microorganisme pathogène.
.. De manière non limitative, on peut citer à titre d'exemples différents types de vaccins, classifiés selon la nature des antigènes à partir desquels ils sont préparés.
Les antigènes utilisés de manière classique sont les suivants : les agents infectieux inactivés, les agents
Un tel vaccin pourra être de type vaccin préventif, c'est-à-dire destiné à
stimuler une réponse immunitaire spécifique avant l'infection d'un organisme par un microorganisme pathogène.
.. De manière non limitative, on peut citer à titre d'exemples différents types de vaccins, classifiés selon la nature des antigènes à partir desquels ils sont préparés.
Les antigènes utilisés de manière classique sont les suivants : les agents infectieux inactivés, les agents
26 vivants atténués, les sous-unités d'agents infectieux, les anatoxines, les vecteurs viraux exprimant des antigènes issus des pathogènes, des vecteurs portant des acides nucléiques (ADN ou ARN), et des anticorps.
Un tel vaccin pourra également être de type vaccin thérapeutique, c'est-à-dire destiné à
stimuler une réponse immunitaire spécifique de manière concomitante avec l'infection d'un organisme par un microorganisme pathogène.
Dans tous les cas, il est entendu que ce vaccin pourra être administré avant, pendant ou après le traitement avec du diltiazem.
Enfin, selon un aspect particulier de l'invention, tous les agents actifs cités ci-dessus pourront être utilisés en combinaison les uns avec les autres, par exemple des combinaisons de type :
- diltiazem, composé anti-viral et composé anti-bactérien, - diltiazem, composé anti-viral et composé anti-parasitaire, - dilitiazem, composé anti-bactérien et composé anti-fongique, - diltiazem et vaccin préventif ; ou encore diltiazem et vaccin thérapeutique, pourront être administrées de manière concomitante ou séquentielle à un individu ou un animal présentant une infection, par un ou plusieurs microorganismes pathogènes, des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Composition pharmaceutique ou vétérinaire La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Plus précisément, cette composition selon l'invention comprendra du diltiazem ainsi qu'un véhicule pharmaceutique approprié, et optionnellement un autre agent actif.
Le terme véhicule pharmaceutique approprié désigne des véhicules ou des excipients pharmaceutiquement acceptables, c'est à dire des véhicules ou des excipients dont
Un tel vaccin pourra également être de type vaccin thérapeutique, c'est-à-dire destiné à
stimuler une réponse immunitaire spécifique de manière concomitante avec l'infection d'un organisme par un microorganisme pathogène.
Dans tous les cas, il est entendu que ce vaccin pourra être administré avant, pendant ou après le traitement avec du diltiazem.
Enfin, selon un aspect particulier de l'invention, tous les agents actifs cités ci-dessus pourront être utilisés en combinaison les uns avec les autres, par exemple des combinaisons de type :
- diltiazem, composé anti-viral et composé anti-bactérien, - diltiazem, composé anti-viral et composé anti-parasitaire, - dilitiazem, composé anti-bactérien et composé anti-fongique, - diltiazem et vaccin préventif ; ou encore diltiazem et vaccin thérapeutique, pourront être administrées de manière concomitante ou séquentielle à un individu ou un animal présentant une infection, par un ou plusieurs microorganismes pathogènes, des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Composition pharmaceutique ou vétérinaire La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Plus précisément, cette composition selon l'invention comprendra du diltiazem ainsi qu'un véhicule pharmaceutique approprié, et optionnellement un autre agent actif.
Le terme véhicule pharmaceutique approprié désigne des véhicules ou des excipients pharmaceutiquement acceptables, c'est à dire des véhicules ou des excipients dont
27 l'administration à un individu ou un animal ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs, et qui sont bien connus de l'homme du métier.
Cette composition selon l'invention pourra être adaptée pour tout type d'administration et notamment pour une administration orale, sublinguale, nasale et/ou buccale par inhalation, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, oculaire ou rectale.
Les formes galéniques d'administration appropriées pourront par exemple être les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou les suspensions.
Selon un aspect particulier, la composition pharmaceutique ou vétérinaire est caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation, c'est-à-dire par les voies nasale et/ou buccale.
L'inhalation désigne l'absorption par les voies respiratoires. Il s'agit une méthode d'absorption de composés thérapeutiques sous forme de gaz, de micro-gouttelettes ou de poudre en suspension.
On distingue deux types d'administration par inhalation :
= l'administration par insufflation lorsque les compositions sont sous la forme de poudres, et = l'administration par nébulisation lorsque les compositions sont sous la forme d'aérosols (suspensions) ou sous la forme de solutions, par exemple de solutions aqueuses, mises sous pression. L'utilisation d'un nébuliseur ou d'un pulvérisateur sera alors recommandée pour administrer la composition pharmaceutique ou vétérinaire.
La forme galénique appropriée pour une administration de diltiazem par inhalation est choisie parmi : une poudre, une suspension aqueuse de gouttelettes ou une solution sous pression.
Selon un aspect de l'invention, la composition pharmaceutique ou vétérinaire comprend une quantité efficace de diltiazem, pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
L'Homme du métier saura, de par ses connaissances générales, aisément identifier la quantité efficace de diltiazem qui devra être administrée pour obtenir une action sur l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également un produit de combinaison comprenant :
Cette composition selon l'invention pourra être adaptée pour tout type d'administration et notamment pour une administration orale, sublinguale, nasale et/ou buccale par inhalation, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, oculaire ou rectale.
Les formes galéniques d'administration appropriées pourront par exemple être les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou les suspensions.
Selon un aspect particulier, la composition pharmaceutique ou vétérinaire est caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation, c'est-à-dire par les voies nasale et/ou buccale.
L'inhalation désigne l'absorption par les voies respiratoires. Il s'agit une méthode d'absorption de composés thérapeutiques sous forme de gaz, de micro-gouttelettes ou de poudre en suspension.
On distingue deux types d'administration par inhalation :
= l'administration par insufflation lorsque les compositions sont sous la forme de poudres, et = l'administration par nébulisation lorsque les compositions sont sous la forme d'aérosols (suspensions) ou sous la forme de solutions, par exemple de solutions aqueuses, mises sous pression. L'utilisation d'un nébuliseur ou d'un pulvérisateur sera alors recommandée pour administrer la composition pharmaceutique ou vétérinaire.
La forme galénique appropriée pour une administration de diltiazem par inhalation est choisie parmi : une poudre, une suspension aqueuse de gouttelettes ou une solution sous pression.
Selon un aspect de l'invention, la composition pharmaceutique ou vétérinaire comprend une quantité efficace de diltiazem, pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
L'Homme du métier saura, de par ses connaissances générales, aisément identifier la quantité efficace de diltiazem qui devra être administrée pour obtenir une action sur l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également un produit de combinaison comprenant :
28 - du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, et - au moins un autre agent actif choisi parmi un composé anti-viral, un composé
anti-bactérien, et un agent de prévention des infections par des microorganismes pathogènes, pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle pour prévenir et/ou traiter une infection par des microorganismes pathogènes des épithéliums respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection chez un individu infecté ou susceptible d'être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l'administration de diltiazem à cet individu, pour activer l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection chez un individu infecté ou susceptible d'être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l'administration de diltiazem à cet individu, le diltiazem étant utilisé en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection chez un animal infecté ou susceptible d'être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l'administration de diltiazem à cet animal, pour activer l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Cette administration de diltiazem sera réalisée, de façon préférée, par inhalation.
EXEMPLES
Il est entendu que les exemples présentés dans cette section ne sont en aucun cas limitatifs, et qu'ils ne font qu'illustrer l'invention telle que décrite précédemment.
Exemple 1. Caractérisation par RNAseq et RT-qPCR de l'induction par le diltiazem de l'expression des gènes de l'interféron de type III.
A- Diltiazem appliqué au pôle basolatéral des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix)
anti-bactérien, et un agent de prévention des infections par des microorganismes pathogènes, pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle pour prévenir et/ou traiter une infection par des microorganismes pathogènes des épithéliums respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection chez un individu infecté ou susceptible d'être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l'administration de diltiazem à cet individu, pour activer l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection chez un individu infecté ou susceptible d'être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l'administration de diltiazem à cet individu, le diltiazem étant utilisé en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection chez un animal infecté ou susceptible d'être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l'administration de diltiazem à cet animal, pour activer l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Cette administration de diltiazem sera réalisée, de façon préférée, par inhalation.
EXEMPLES
Il est entendu que les exemples présentés dans cette section ne sont en aucun cas limitatifs, et qu'ils ne font qu'illustrer l'invention telle que décrite précédemment.
Exemple 1. Caractérisation par RNAseq et RT-qPCR de l'induction par le diltiazem de l'expression des gènes de l'interféron de type III.
A- Diltiazem appliqué au pôle basolatéral des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix)
29 Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) et maintenus en culture à l'interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, ont été traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral. Le traitement au diltiazem a été répété pendant 3 jours consécutifs (3 administrations au total).
Les épithéliums traités et non traités ont ensuite été lysés avec 150 pL de tampon RLT
(Qiagen). L'ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur.
Des banques d'ADNc ont été préparées à partir de 200 ng d'ARN total en utilisant le kit ScriptseqTM complete Gold kit-Low Input (SCL6EP, Epicentre) selon les instructions du fournisseur. Chaque banque a été amplifiée, quantifiée et indexée avec des amorces fournies dans le kit ScriptSeqTM Index PCR Primers kit (RSBC10948, Epicentre) et séquencée. Le séquençage a été mené sur un système Illumina HiSeq 2500 avec un minimum requis de 40 millions de reads séquencés par échantillons.
Le démultiplexage des données et la conversion des fichiers BCL issus du séquençage en fichiers FASTQ ont été réalisés à l'aide de l'outil d'Illumina bc12fastq, dans sa version 1.8.4.
Le logiciel FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) a permis d'effectuer les contrôles qualité nécessaires sur les données brutes. Le trimming a été
réalisé avec l'outil Trimmomatic, avec un seuil de qualité minimum égal à Q30.
Un pseudo-alignement des reads trimmés sur le génome humain (Homo Sapiens : GRCh38.p11) par le logiciel Kallisto a été réalisé, suivi d'une analyse statistique utilisant le logiciel R 3.3.1 et le package EdgeR 3.14Ø
Le différentiel d'expression des gènes entre les cellules des épithéliums traités par le diltiazem et les cellules des épithéliums témoins, a été calculé à l'aide d'un modèle linéaire avec une correction de la p valeur par la méthode Benjamini-Hochberg.
Seuls les gènes arborant un différentiel d'expression supérieur ou égal à 2, et une p valeur corrigée inférieure à 0.05, ont été considérés dans la suite de l'analyse.
Ces gènes ont été soumis à des analyses d'enrichissement fonctionnel par l'outil DAVID 6.8 ainsi qu'à des études d'association et d'interaction par l'outil STRING.
Sont représentés en figure 1A les ratios d'expression des gènes interféron de type III IFN¨M , IFN-2 et IFN-U observés entre les épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem et les épithéliums respiratoires humains témoins non traités.
Sont représentés en figure 1B les ratios d'expression des gènes de réponse à
l'interféron de type III tels que IF144L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, I5G15, MX1, MX2, OAS1, 0A52, 0A53, OASL, RSAD2 et STAT1 observés entre les épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem et les épithéliums respiratoires humains témoins non traités.
5 II apparait clairement que le traitement par le diltiazem d'épithéliums respiratoires humains reconstitués, pendant 3 jours, modifie significativement le niveau d'expression des gènes codant pour les interférons de type III IFN¨M , IFN-2 et IFN-U, en l'augmentant significativement (de 100 à plus de 200 fois en comparaison avec les épithéliums témoins non traités). De plus, ce traitement stimule également très significativement l'expression de 10 gènes de réponse aux interférons de type III tels que IF144L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, I5G15, MX1, MX2, OAS1, 0A52, 0A53, OASL, RSAD2 et STAT1.
B- Diltiazem appliqué au pôle apical des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) Nous avons démontré ci-dessus qu'un traitement au diltiazem des épithéliums via le milieu 15 basolatéral (mimant la délivrance per os en modèle murin et chez l'homme) induit l'expression de la voie IFN III.
L'objectif de cette expérience était de confirmer que cette induction par le diltiazem est également effective lorsque l'administration de la molécule se fait via le pôle apical des épithéliums, mimant le mode de délivrance via la voie intranasale in vivo.
20 La figure 10 présente les résultats obtenus 24 heures après le traitement au pôle apical des modèles d'épithélium humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) avec du diltiazem, sur l'expression du gène IFNL1 (Interféron lambda I) endogène, en comparaison de celle endogène des épithéliums non traités (contrôle). La mesure a été réalisée par RT-qPCR.
Les résultats obtenus indiquent que le traitement des épithéliums respiratoires humains 25 reconstitués par le diltiazem via leur pôle apical, induit une surexpression significative du gène IFNL1, avec un ratio d'expression supérieur à 6:1 par rapport aux épithéliums contrôle (non traités).
Ces résultats nous permettent de confirmer que le diltiazem administré par le pôle apical des épithéliums respiratoires humains reconstitués (cette voie d'administration mimant in vitro
Les épithéliums traités et non traités ont ensuite été lysés avec 150 pL de tampon RLT
(Qiagen). L'ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur.
Des banques d'ADNc ont été préparées à partir de 200 ng d'ARN total en utilisant le kit ScriptseqTM complete Gold kit-Low Input (SCL6EP, Epicentre) selon les instructions du fournisseur. Chaque banque a été amplifiée, quantifiée et indexée avec des amorces fournies dans le kit ScriptSeqTM Index PCR Primers kit (RSBC10948, Epicentre) et séquencée. Le séquençage a été mené sur un système Illumina HiSeq 2500 avec un minimum requis de 40 millions de reads séquencés par échantillons.
Le démultiplexage des données et la conversion des fichiers BCL issus du séquençage en fichiers FASTQ ont été réalisés à l'aide de l'outil d'Illumina bc12fastq, dans sa version 1.8.4.
Le logiciel FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) a permis d'effectuer les contrôles qualité nécessaires sur les données brutes. Le trimming a été
réalisé avec l'outil Trimmomatic, avec un seuil de qualité minimum égal à Q30.
Un pseudo-alignement des reads trimmés sur le génome humain (Homo Sapiens : GRCh38.p11) par le logiciel Kallisto a été réalisé, suivi d'une analyse statistique utilisant le logiciel R 3.3.1 et le package EdgeR 3.14Ø
Le différentiel d'expression des gènes entre les cellules des épithéliums traités par le diltiazem et les cellules des épithéliums témoins, a été calculé à l'aide d'un modèle linéaire avec une correction de la p valeur par la méthode Benjamini-Hochberg.
Seuls les gènes arborant un différentiel d'expression supérieur ou égal à 2, et une p valeur corrigée inférieure à 0.05, ont été considérés dans la suite de l'analyse.
Ces gènes ont été soumis à des analyses d'enrichissement fonctionnel par l'outil DAVID 6.8 ainsi qu'à des études d'association et d'interaction par l'outil STRING.
Sont représentés en figure 1A les ratios d'expression des gènes interféron de type III IFN¨M , IFN-2 et IFN-U observés entre les épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem et les épithéliums respiratoires humains témoins non traités.
Sont représentés en figure 1B les ratios d'expression des gènes de réponse à
l'interféron de type III tels que IF144L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, I5G15, MX1, MX2, OAS1, 0A52, 0A53, OASL, RSAD2 et STAT1 observés entre les épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem et les épithéliums respiratoires humains témoins non traités.
5 II apparait clairement que le traitement par le diltiazem d'épithéliums respiratoires humains reconstitués, pendant 3 jours, modifie significativement le niveau d'expression des gènes codant pour les interférons de type III IFN¨M , IFN-2 et IFN-U, en l'augmentant significativement (de 100 à plus de 200 fois en comparaison avec les épithéliums témoins non traités). De plus, ce traitement stimule également très significativement l'expression de 10 gènes de réponse aux interférons de type III tels que IF144L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, I5G15, MX1, MX2, OAS1, 0A52, 0A53, OASL, RSAD2 et STAT1.
B- Diltiazem appliqué au pôle apical des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) Nous avons démontré ci-dessus qu'un traitement au diltiazem des épithéliums via le milieu 15 basolatéral (mimant la délivrance per os en modèle murin et chez l'homme) induit l'expression de la voie IFN III.
L'objectif de cette expérience était de confirmer que cette induction par le diltiazem est également effective lorsque l'administration de la molécule se fait via le pôle apical des épithéliums, mimant le mode de délivrance via la voie intranasale in vivo.
20 La figure 10 présente les résultats obtenus 24 heures après le traitement au pôle apical des modèles d'épithélium humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) avec du diltiazem, sur l'expression du gène IFNL1 (Interféron lambda I) endogène, en comparaison de celle endogène des épithéliums non traités (contrôle). La mesure a été réalisée par RT-qPCR.
Les résultats obtenus indiquent que le traitement des épithéliums respiratoires humains 25 reconstitués par le diltiazem via leur pôle apical, induit une surexpression significative du gène IFNL1, avec un ratio d'expression supérieur à 6:1 par rapport aux épithéliums contrôle (non traités).
Ces résultats nous permettent de confirmer que le diltiazem administré par le pôle apical des épithéliums respiratoires humains reconstitués (cette voie d'administration mimant in vitro
30 une administration intranasale in vivo), active également la voie IFN
III, de même que le traitement via le pôle basolatéral, qui reproduit l'administration per os in vivo.
III, de même que le traitement via le pôle basolatéral, qui reproduit l'administration per os in vivo.
31 Exemple 2. Confirmation par Rt-qPCR de l'induction par le diltiazem de l'expression de 8 gènes associés à la réponse Interféron de type III .
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été
maintenus en culture à l'interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral.
Le traitement au diltiazem a été répété pendant 3 jours consécutifs (3 administrations au total).
Les épithéliums traités et non traités ont ensuite été lysés avec 150 pL de tampon RLT
(Qiagen). L'ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur. Après une étape de transcription inverse, une réaction de FOR
quantitative en temps réel a été menée en utilisant le système StepOnePlusTM Real-Time FOR
System (Applied Biosystems) en plaque 96 puits.
Les amorces de FOR quantitative (GAPDH: Hs02758991_g1, IFNL1: Hs00601677_g1, IFNL2: Hs00820125_g1, IFIT1: Hs01675197_m1, IFIT2: Hs00533665_m1, IFIT3:
Hs00382744_m1, 1F127: Hs01086373_g 1, I FI44L:
Hs00915292_m1, I FITM1:
Hs01652522_g1) et les sondes (TaqMan gene expression assays) ont été fournies par Thermo Fisher Scientific.
Chaque échantillon a été analysé en triplicat et les cycle threshold (Ct) ont été normalisés par rapport à la référence GAPDH.
Les ratios d'expression des gènes IFIT1, IFIT2, IFIT3, IF127, IF144L et IFITM1 entre les cellules traitées par le diltiazem et les cellules non traitées, ont été
déterminés par la méthode 2,8,ACt method (Livak and Schmittgen, 2001).
La figure 2 présente les résultats obtenus : après le traitement par le diltiazem, les épithéliums reconstitués présentent une augmentation significative de l'expression des gènes IFIT1, IFIT2, IFIT3, IF127, IF144L et IFITM1 en comparaison des épithéliums non traités.
Exemple 3. Mesure par dosage ELISA de la sécrétion, stimulée par le diltiazem, de l'Interféron de type III lambda 1 (IL-29).
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été
maintenus en culture à l'interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral.
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été
maintenus en culture à l'interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral.
Le traitement au diltiazem a été répété pendant 3 jours consécutifs (3 administrations au total).
Les épithéliums traités et non traités ont ensuite été lysés avec 150 pL de tampon RLT
(Qiagen). L'ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur. Après une étape de transcription inverse, une réaction de FOR
quantitative en temps réel a été menée en utilisant le système StepOnePlusTM Real-Time FOR
System (Applied Biosystems) en plaque 96 puits.
Les amorces de FOR quantitative (GAPDH: Hs02758991_g1, IFNL1: Hs00601677_g1, IFNL2: Hs00820125_g1, IFIT1: Hs01675197_m1, IFIT2: Hs00533665_m1, IFIT3:
Hs00382744_m1, 1F127: Hs01086373_g 1, I FI44L:
Hs00915292_m1, I FITM1:
Hs01652522_g1) et les sondes (TaqMan gene expression assays) ont été fournies par Thermo Fisher Scientific.
Chaque échantillon a été analysé en triplicat et les cycle threshold (Ct) ont été normalisés par rapport à la référence GAPDH.
Les ratios d'expression des gènes IFIT1, IFIT2, IFIT3, IF127, IF144L et IFITM1 entre les cellules traitées par le diltiazem et les cellules non traitées, ont été
déterminés par la méthode 2,8,ACt method (Livak and Schmittgen, 2001).
La figure 2 présente les résultats obtenus : après le traitement par le diltiazem, les épithéliums reconstitués présentent une augmentation significative de l'expression des gènes IFIT1, IFIT2, IFIT3, IF127, IF144L et IFITM1 en comparaison des épithéliums non traités.
Exemple 3. Mesure par dosage ELISA de la sécrétion, stimulée par le diltiazem, de l'Interféron de type III lambda 1 (IL-29).
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été
maintenus en culture à l'interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral.
32 Le traitement au diltiazem a été répété pendant 3 jours consécutifs (3 administrations au total).
Les niveaux de sécrétion (pg/mL) d'interféron lambda 1 (IL-29) aux pôles apical et basolatéral des épithéliums respiratoires humains traités et non traités au diltiazem, ont été mesurés par ELISA après 72h de traitement selon les instructions du fournisseur (#3570-1H, Mabtech, Stockhom, Sweden).
La figure 3 présente les résultats obtenus : la sécrétion d'IFN-M (IL-29) est très nettement augmentée au pôle apical suite à un traitement par le diltiazem via le milieu de culture des épithéliums ; une augmentation significative, mais moins marquée, est également observée au pôle basolatéral des épithéliums traités.
Exemple 4. Le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication du virus syncytial respiratoire.
A- Résultats in vitro Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été
maintenus en culture à l'interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été infecté par du virus syncytial respiratoire (souche Long, ATCC VR-26) à une multiplicité d'infection (M01) 1, puis traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral. Le traitement au diltiazem a été effectué à 5 heures post-infection, puis répété pendant 3 jours consécutifs (4 administrations au total).
A 6 jours post-infection, les prélèvements au pôle apical des épithéliums infectés traités et non traités, ainsi que les épithéliums en tant que tel, ont été lysés avec 150 pL de tampon RLT (Qiagen). Le processus de l'expérimentation est schématiquement représenté
en figure 4A.
L'ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen), selon les instructions du fournisseur, pour une quantification du nombre de copie de génome viral (gène F) par RT-qPCR au pôle apical, c'est-à-dire dans le surnageant (Figure 4B), ainsi que dans les épithéliums (Figure 40).
Les figures 4B et 40 montrent que lorsque les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été traités en post-infection avec du diltiazem (90 pM) via leur pôle basolatéral, la quantité
de génome viral est bien inférieure à la fois dans le surnageant de culture (figure 4B) et dans l'épithélium (figure 40) par rapport aux épithéliums non traités. Le diltiazem a donc un effet
Les niveaux de sécrétion (pg/mL) d'interféron lambda 1 (IL-29) aux pôles apical et basolatéral des épithéliums respiratoires humains traités et non traités au diltiazem, ont été mesurés par ELISA après 72h de traitement selon les instructions du fournisseur (#3570-1H, Mabtech, Stockhom, Sweden).
La figure 3 présente les résultats obtenus : la sécrétion d'IFN-M (IL-29) est très nettement augmentée au pôle apical suite à un traitement par le diltiazem via le milieu de culture des épithéliums ; une augmentation significative, mais moins marquée, est également observée au pôle basolatéral des épithéliums traités.
Exemple 4. Le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication du virus syncytial respiratoire.
A- Résultats in vitro Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été
maintenus en culture à l'interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été infecté par du virus syncytial respiratoire (souche Long, ATCC VR-26) à une multiplicité d'infection (M01) 1, puis traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral. Le traitement au diltiazem a été effectué à 5 heures post-infection, puis répété pendant 3 jours consécutifs (4 administrations au total).
A 6 jours post-infection, les prélèvements au pôle apical des épithéliums infectés traités et non traités, ainsi que les épithéliums en tant que tel, ont été lysés avec 150 pL de tampon RLT (Qiagen). Le processus de l'expérimentation est schématiquement représenté
en figure 4A.
L'ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen), selon les instructions du fournisseur, pour une quantification du nombre de copie de génome viral (gène F) par RT-qPCR au pôle apical, c'est-à-dire dans le surnageant (Figure 4B), ainsi que dans les épithéliums (Figure 40).
Les figures 4B et 40 montrent que lorsque les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été traités en post-infection avec du diltiazem (90 pM) via leur pôle basolatéral, la quantité
de génome viral est bien inférieure à la fois dans le surnageant de culture (figure 4B) et dans l'épithélium (figure 40) par rapport aux épithéliums non traités. Le diltiazem a donc un effet
33 antiviral significatif contre le virus syncytial respiratoire en modèle d'épithéliums respiratoires humains reconstitués.
B- Résultats in vivo Le traitement au diltiazem (per os) réduit la réplication du virus syncytial respiratoire (VRS) en modèle de souris BALB/c après challenge infectieux.
La figure 4D représente schématiquement la chronologie de l'infection et des traitements des souris :
- des souris BALB/c ont été randomisées en 3 groupes de 5 individus puis infectées par voie intranasale avec 50 pL d'une suspension virale contenant 5x105 PFU de VRS (Jour 0). Six heures avant infection, les souris ont été
traitées avec soit 40 mg/kg de Ribavirine intra-péritonéale (VRS RIB), soit 50mg/kg de diltiazem per os (VRS DIL), ou PBS (VRS PBS) comme contrôle négatif.
- Les mêmes traitements ont été répétés toutes les 24h, avec un total de 3 traitements pour la Ribavirine et 5 traitements pour le diltiazem ou le PBS.
- Au jour 5 post-infection (J5, correspondant au pic de réplication virale), les souris de chaque groupe ont été euthanasiées et leurs poumons ont été récupérés aseptiquement pour mesurer leurs titres viraux pulmonaires par RTqPCR (gène F).
La quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d'ARN extrait des poumons à
5 jours après l'infection a été réalisée, et les résultats sont présentés en figure 4E.
Les animaux traités par le diltiazem (VRS DIL) présentent des titres viraux pulmonaires significativement réduits en comparaison à ceux des animaux du groupe contrôle (VRS PBS) et ceux des animaux du groupe traité à la ribavirine (VRS RIB).
Les tests statistiques suivants ont été utilisés : One-way ANOVA avec Bonferroni post-test pour comparer chaque virus à la condition mock (traitement PBS). * p < 0.05.
Le diltiazem a donc un effet antiviral significatif contre le virus syncytial respiratoire en modèle murin in vivo.
Exemple 5. Le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication du virus parainfluenza de type 3 Le schéma expérimental est présenté en figure 5A.
B- Résultats in vivo Le traitement au diltiazem (per os) réduit la réplication du virus syncytial respiratoire (VRS) en modèle de souris BALB/c après challenge infectieux.
La figure 4D représente schématiquement la chronologie de l'infection et des traitements des souris :
- des souris BALB/c ont été randomisées en 3 groupes de 5 individus puis infectées par voie intranasale avec 50 pL d'une suspension virale contenant 5x105 PFU de VRS (Jour 0). Six heures avant infection, les souris ont été
traitées avec soit 40 mg/kg de Ribavirine intra-péritonéale (VRS RIB), soit 50mg/kg de diltiazem per os (VRS DIL), ou PBS (VRS PBS) comme contrôle négatif.
- Les mêmes traitements ont été répétés toutes les 24h, avec un total de 3 traitements pour la Ribavirine et 5 traitements pour le diltiazem ou le PBS.
- Au jour 5 post-infection (J5, correspondant au pic de réplication virale), les souris de chaque groupe ont été euthanasiées et leurs poumons ont été récupérés aseptiquement pour mesurer leurs titres viraux pulmonaires par RTqPCR (gène F).
La quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d'ARN extrait des poumons à
5 jours après l'infection a été réalisée, et les résultats sont présentés en figure 4E.
Les animaux traités par le diltiazem (VRS DIL) présentent des titres viraux pulmonaires significativement réduits en comparaison à ceux des animaux du groupe contrôle (VRS PBS) et ceux des animaux du groupe traité à la ribavirine (VRS RIB).
Les tests statistiques suivants ont été utilisés : One-way ANOVA avec Bonferroni post-test pour comparer chaque virus à la condition mock (traitement PBS). * p < 0.05.
Le diltiazem a donc un effet antiviral significatif contre le virus syncytial respiratoire en modèle murin in vivo.
Exemple 5. Le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication du virus parainfluenza de type 3 Le schéma expérimental est présenté en figure 5A.
34 Les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été infectés par le virus parainfluenza humain de type 3 (souche 0243 ATCC VR-93) à une MOI de 0,1, et le traitement du milieu basolatéral avec 90 pM diltiazem a été démarré 2 heures post-infection et poursuivi quotidiennement pendant 4 jours consécutifs. La résistance électrique trans-épithéliale (TEER), qui reflète l'intégrité de l'épithélium, a été mesurée une fois par jour à partir de 48 h post-infection jusqu'à 120 heures post-infection.
Des titres viraux infectieux apicaux (DITC50/mL) ont été déterminés dans des cellules LLC-MK2 à partir de lavages prélevés dès 48 h post-infection (hpi), et jusqu'à 120 hpi, comme cela est montré en figure 5A.
La figure 5B montre les résultats obtenus après réalisation de l'expérience suivante : à 96 et 120 hpi, les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (images à gauche) et traités au diltiazem (images à doite) ont été observés au microscope. Les effets cytopathiques induits par le hPIV-3 étaient plus importants et facilement visibles au microscope dans les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités, contrairement à ceux traités par le diltiazem.
La figure 50 représente les valeurs de TEER en fonction du temps post-infection, mesurés sur des épithéliums respiratoires humains reconstitués :
non traités, non infectés ;
non traités, infectés par hPIV-3 ; et traités au diltiazem, infectés par hPIV-3.
Ces résultats démontrent qu'en l'absence de traitement, les valeurs de TEER
diminuent fortement, à partir de 24 hpi, contrairement aux valeurs mesurées sur les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, dont l'intégrité
apparaît être d'avantage préservée.
La figure 5D présente les titres viraux mesurés (en LLC-MK2 (DITC50/mL) au cours du temps (de 48 à 120 hpi) à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités et non traités au diltiazem.
En l'absence de traitement, les titres viraux infectieux mesurés à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués ont culminé à 72 h post-infection à une valeur de 108 DICT50/mL) et à 96h post-infection à une valeur de 107 DICT50/mL, contrairement à
ceux des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, qui présentent des valeurs significativement plus réduites à 72 h post-infection (106 DICT50/mL) et à 96h post-infection (105 DICT50/mL).
Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au diltiazem réduit la réplication virale du hPIV-3 dans le modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué
infecté.
Exemple 6. Le traitement au diltiazem réduit significativement la multiplication de la bactérie Pseudomonas aeruginosa 5 Le schéma expérimental est présenté en figure 6A.
Les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été prétraités 24 heures avant l'infection avec 90pM diltiazem en milieu basolatéral ou alternativement avec 10pL de 90pM
diltiazem à la surface apicale, puis infectés par Pseudomonas aeruginosa (souche PAK) à
une MOI de 1 et de nouveau traités par le diltiazem 2 heures après l'infection.
10 Les résultats sont présentés en figure 6B (pour le traitement baso-latéral) et 60 (pour le traitement à la surface apicale).
Dans le contexte du baso-latéral (n = 2), le nombre de bactéries recueillies à
la surface apicale des épithéliums respiratoires humains à 24 heures post-infection, était significativement plus faible que celui des bactéries recueillies à la surface apicale des 15 épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en milieu baso-latéral (115 et 106 vs 76 et 106 UFC, respectivement, * p< 0,05).
Dans le contexte du traitement apical au diltiazem, un effet similaire sur Pseudomonas aeruginosa a été observé à 24 heures post-infection (n=2), avec une diminution significative des bactéries récoltées à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par 20 le diltiazem en comparaison de ceux non traités (87 et 106 contre 63,5 et 106 UFC, respectivement).
Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au dilitiazem limite la réplication de Pseudomonas aeruginosa dans l'épithélium respiratoire humain.
25 Exemple 7. Le traitement au diltiazem réduit significativement la multiplication du métapneumovirus humain (hMPV).
La réplication virale en modèles d'épithéliums humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) d'origine nasale a été étudiée, sur des épithéliums traités ou non par le diltiazem.
Pour cela, (i) des photos de microscopie optique à fluorescence ont permis d'évaluer 30 l'efficacité et la progression de l'infection et (ii) des quantifications du génome viral par RTqPCR ont été réalisées, d'une part au niveau du pôle apicale des épithélium (récolte à la surface) pour quantifier l'excrétion de la progéniture virale, et d'autre part dans les lysats totaux des cellules des épithéliums en point final (jour 5 post-infection) pour quantifier la réplication virale intracellulaire au sein de l'épithélium.
Le chronogramme de l'expérimentation est présenté dans la figure 7A.
Les épithéliums respiratoires humains (Mucilair, Epithelix) ont été infectés par un virus recombinant hMPV-GFP (souche C-85473) à une MOI de 0,1, puis traités (via le milieu basolatéral des épithélium) ou non par 3 doses successives de diltiazem à 90pM
à JO, J1 et J3 post-infection (3 épithéliums par condition).
Des observations en microscopie à épifluorescence ont été réalisées à J4 post-infection afin d'observer l'impact du traitement par le diltiazem sur la réplication virale (Figure 7B). En l'absence de traitement, une fluorescence correspondant à l'expression virale de la GFP, est observée à J4 post-infection dans la quasi-totalité de l'épithélium, alors qu'il n'y a que de très rares cellules fluorescentes dans les épithélium infectés et traités par le diltiazem à ce même temps post-infection.
Au jour 3 post-infection, un lavage au pôle apical des épithélium infectés traités ou non, a été
réalisé afin de récolter la progéniture virale produite. L'ARN viral génomique a été extrait et quantifié par RT-qPCR (BiosystemsTM PowerUp TM SYBRTM Green, Thermo Fisher Scientific) à l'aide d'une gamme réalisée à partir d'un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d'ARN extrait (Figure 7C).
Les résultats de qPCR indiquent qu'une quantité très importante de génome viral est présente dans les surnageants au pôle apical récoltés à partir des épithéliums non traités.
Cette quantification de génome virale reflète le niveau de production de progéniture virale suite à l'infection des épithéliums. En comparaison, la quantité de génome viral mesurée dans les surnageants au pôle apical récoltés à partir des épithéliums traités par le diltiazem est significativement inférieure (2 log10 ) (Figure 7C).
Au jour 5 post-infection, les cellules des épithéliums ont été récoltées et lysées pour en extraire l'ARN total. Les ARN totaux correspondants au gène viral N de hMPV
ont été
quantifiés par Rt-qPCR (BiosystemsTM PowerUp TM SYBRTM Green, Thermo Fisher Scientific), à l'aide d'une gamme réalisée à partir d'un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d'ARN extrait (Figure 7D).
Les résultats de qPCR indiquent qu'une quantité très importante de génome viral est présente dans les épithéliums non traités. En revanche, la quantité de génome virale est de 410g10 inférieure dans les épithéliums traités avec le diltiazem.
Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication virale de hMPV.
Exemple 8. Induction in vivo par le diltiazem de l'expression du gène IFN-U
(IFNL2) mesurée par RT-qPCR
La figure 8A représente schématiquement la chronologie des traitements par instillation intranasale (i.n.) des souris BALB/c : les souris ont été traitées (20 mg/kg) ou non (groupe contrôle PBS mock-traité ) au jour 0 (JO), puis traitées ou non soit quotidiennement les deux jours suivants (JO, J1 et J2), soit toutes les 48 heures jusqu'au jour 4 (JO, J2 et J4). A
J5, les cavités nasales ont été prélevées après euthanasie des animaux.
L'ARN total a été extrait à partir des prélèvements par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur. Après une étape de transcription inverse, une réaction de FOR quantitative en temps réel a été menée en utilisant le système StepOnePlus TM Real-Time FOR System (Applied Biosystems), selon le protocole décrit dans la publication (Galani et al. Immunity 2017).
L'expression du gène IFN-2 (IFNL2) a été mesurée par RT-qPCR, et est représentée par rapport au niveau basal (égal à 1) mesure sur des souris non traitées (Mock-traité) en figure 8B.
Ces résultats nous permettent de confirmer que le diltiazem administré par voie intranasale en modèle murin active également la voie IFN III, tout comme le traitement per os.
REFERENCES
BREVETS
US 4,605,552 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Mediates Non-redundant Front-Line Antiviral Protection against Influenza Virus Infection without Compromising Host Fitness. lmmunity. 2017 May 16;46(5):875-890.e6. doi:
10.1016/j.immuni.2017.04.025.
Des titres viraux infectieux apicaux (DITC50/mL) ont été déterminés dans des cellules LLC-MK2 à partir de lavages prélevés dès 48 h post-infection (hpi), et jusqu'à 120 hpi, comme cela est montré en figure 5A.
La figure 5B montre les résultats obtenus après réalisation de l'expérience suivante : à 96 et 120 hpi, les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (images à gauche) et traités au diltiazem (images à doite) ont été observés au microscope. Les effets cytopathiques induits par le hPIV-3 étaient plus importants et facilement visibles au microscope dans les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités, contrairement à ceux traités par le diltiazem.
La figure 50 représente les valeurs de TEER en fonction du temps post-infection, mesurés sur des épithéliums respiratoires humains reconstitués :
non traités, non infectés ;
non traités, infectés par hPIV-3 ; et traités au diltiazem, infectés par hPIV-3.
Ces résultats démontrent qu'en l'absence de traitement, les valeurs de TEER
diminuent fortement, à partir de 24 hpi, contrairement aux valeurs mesurées sur les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, dont l'intégrité
apparaît être d'avantage préservée.
La figure 5D présente les titres viraux mesurés (en LLC-MK2 (DITC50/mL) au cours du temps (de 48 à 120 hpi) à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités et non traités au diltiazem.
En l'absence de traitement, les titres viraux infectieux mesurés à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués ont culminé à 72 h post-infection à une valeur de 108 DICT50/mL) et à 96h post-infection à une valeur de 107 DICT50/mL, contrairement à
ceux des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, qui présentent des valeurs significativement plus réduites à 72 h post-infection (106 DICT50/mL) et à 96h post-infection (105 DICT50/mL).
Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au diltiazem réduit la réplication virale du hPIV-3 dans le modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué
infecté.
Exemple 6. Le traitement au diltiazem réduit significativement la multiplication de la bactérie Pseudomonas aeruginosa 5 Le schéma expérimental est présenté en figure 6A.
Les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été prétraités 24 heures avant l'infection avec 90pM diltiazem en milieu basolatéral ou alternativement avec 10pL de 90pM
diltiazem à la surface apicale, puis infectés par Pseudomonas aeruginosa (souche PAK) à
une MOI de 1 et de nouveau traités par le diltiazem 2 heures après l'infection.
10 Les résultats sont présentés en figure 6B (pour le traitement baso-latéral) et 60 (pour le traitement à la surface apicale).
Dans le contexte du baso-latéral (n = 2), le nombre de bactéries recueillies à
la surface apicale des épithéliums respiratoires humains à 24 heures post-infection, était significativement plus faible que celui des bactéries recueillies à la surface apicale des 15 épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en milieu baso-latéral (115 et 106 vs 76 et 106 UFC, respectivement, * p< 0,05).
Dans le contexte du traitement apical au diltiazem, un effet similaire sur Pseudomonas aeruginosa a été observé à 24 heures post-infection (n=2), avec une diminution significative des bactéries récoltées à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par 20 le diltiazem en comparaison de ceux non traités (87 et 106 contre 63,5 et 106 UFC, respectivement).
Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au dilitiazem limite la réplication de Pseudomonas aeruginosa dans l'épithélium respiratoire humain.
25 Exemple 7. Le traitement au diltiazem réduit significativement la multiplication du métapneumovirus humain (hMPV).
La réplication virale en modèles d'épithéliums humains reconstitués (MucilAir0 HAE, Epithelix) d'origine nasale a été étudiée, sur des épithéliums traités ou non par le diltiazem.
Pour cela, (i) des photos de microscopie optique à fluorescence ont permis d'évaluer 30 l'efficacité et la progression de l'infection et (ii) des quantifications du génome viral par RTqPCR ont été réalisées, d'une part au niveau du pôle apicale des épithélium (récolte à la surface) pour quantifier l'excrétion de la progéniture virale, et d'autre part dans les lysats totaux des cellules des épithéliums en point final (jour 5 post-infection) pour quantifier la réplication virale intracellulaire au sein de l'épithélium.
Le chronogramme de l'expérimentation est présenté dans la figure 7A.
Les épithéliums respiratoires humains (Mucilair, Epithelix) ont été infectés par un virus recombinant hMPV-GFP (souche C-85473) à une MOI de 0,1, puis traités (via le milieu basolatéral des épithélium) ou non par 3 doses successives de diltiazem à 90pM
à JO, J1 et J3 post-infection (3 épithéliums par condition).
Des observations en microscopie à épifluorescence ont été réalisées à J4 post-infection afin d'observer l'impact du traitement par le diltiazem sur la réplication virale (Figure 7B). En l'absence de traitement, une fluorescence correspondant à l'expression virale de la GFP, est observée à J4 post-infection dans la quasi-totalité de l'épithélium, alors qu'il n'y a que de très rares cellules fluorescentes dans les épithélium infectés et traités par le diltiazem à ce même temps post-infection.
Au jour 3 post-infection, un lavage au pôle apical des épithélium infectés traités ou non, a été
réalisé afin de récolter la progéniture virale produite. L'ARN viral génomique a été extrait et quantifié par RT-qPCR (BiosystemsTM PowerUp TM SYBRTM Green, Thermo Fisher Scientific) à l'aide d'une gamme réalisée à partir d'un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d'ARN extrait (Figure 7C).
Les résultats de qPCR indiquent qu'une quantité très importante de génome viral est présente dans les surnageants au pôle apical récoltés à partir des épithéliums non traités.
Cette quantification de génome virale reflète le niveau de production de progéniture virale suite à l'infection des épithéliums. En comparaison, la quantité de génome viral mesurée dans les surnageants au pôle apical récoltés à partir des épithéliums traités par le diltiazem est significativement inférieure (2 log10 ) (Figure 7C).
Au jour 5 post-infection, les cellules des épithéliums ont été récoltées et lysées pour en extraire l'ARN total. Les ARN totaux correspondants au gène viral N de hMPV
ont été
quantifiés par Rt-qPCR (BiosystemsTM PowerUp TM SYBRTM Green, Thermo Fisher Scientific), à l'aide d'une gamme réalisée à partir d'un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d'ARN extrait (Figure 7D).
Les résultats de qPCR indiquent qu'une quantité très importante de génome viral est présente dans les épithéliums non traités. En revanche, la quantité de génome virale est de 410g10 inférieure dans les épithéliums traités avec le diltiazem.
Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication virale de hMPV.
Exemple 8. Induction in vivo par le diltiazem de l'expression du gène IFN-U
(IFNL2) mesurée par RT-qPCR
La figure 8A représente schématiquement la chronologie des traitements par instillation intranasale (i.n.) des souris BALB/c : les souris ont été traitées (20 mg/kg) ou non (groupe contrôle PBS mock-traité ) au jour 0 (JO), puis traitées ou non soit quotidiennement les deux jours suivants (JO, J1 et J2), soit toutes les 48 heures jusqu'au jour 4 (JO, J2 et J4). A
J5, les cavités nasales ont été prélevées après euthanasie des animaux.
L'ARN total a été extrait à partir des prélèvements par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur. Après une étape de transcription inverse, une réaction de FOR quantitative en temps réel a été menée en utilisant le système StepOnePlus TM Real-Time FOR System (Applied Biosystems), selon le protocole décrit dans la publication (Galani et al. Immunity 2017).
L'expression du gène IFN-2 (IFNL2) a été mesurée par RT-qPCR, et est représentée par rapport au niveau basal (égal à 1) mesure sur des souris non traitées (Mock-traité) en figure 8B.
Ces résultats nous permettent de confirmer que le diltiazem administré par voie intranasale en modèle murin active également la voie IFN III, tout comme le traitement per os.
REFERENCES
BREVETS
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Claims
REVENDICATIONS
1. Diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type Ill.
5 2. Diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type Ill, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épitheliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
3. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé
10 en ce que ledit au moins un gène est choisi parmi le gène codant pour l'interleukine 29, le gène codant pour l'interleukine 28A et le gène codant pour l'interleukine 28B.
4. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé
en ce que l'infection n'est pas une infection par un virus influenza.
15 5. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 2 à
4, caractérisé
en ce que le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hRSV), les virus parainfluenza (hPIV), le metapneumovirus humain (hMPV), le virus Nipah, les novovirus, les coronavirus, le virus Swine fever, les adenovirus, le virus Zika, le virus de la 20 fièvre jaune, les rhéovirus, les rotavirus, le virus de la Dengue, et le virus West Nile.
6. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).
7. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le 25 microorganisme pathogène est un virus parainfluenza (hPIV).
8. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est un metapneumovirus (hMPV).
9. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé
en ce que le microorganisme pathogène est choisi parmi une bactérie, un 30 champignon et un parasite.
10. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 9 caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est une bactérie choisie parmi les espèces bactériennes suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, 35 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Campylobacterspp., Salmonella spp.,Shigella spp.,Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
11. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 10, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est la bactérie Pseudomonas aeruginosa.
12. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 2 à 11, caractérisé
en ce que l'infection est une co-infection par au moins un virus et au moins une bactérie.
13. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé
en ce qu'il est utilisé en combinaison avec au moins un autre agent actif.
14. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 13, caractérisé en ce que cet autre agent actif est choisi parmi un composé anti-viral, un composé anti-bactérien, un composé anti-parasitaire, un composé anti-fongique, et un vaccin préventif ou thérapeutique.
15. Composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type Ill, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
16. Composition pharmaceutique ou vétérinaire pour son utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation.
1. Diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type Ill.
5 2. Diltiazem pour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type Ill, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épitheliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
3. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé
10 en ce que ledit au moins un gène est choisi parmi le gène codant pour l'interleukine 29, le gène codant pour l'interleukine 28A et le gène codant pour l'interleukine 28B.
4. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé
en ce que l'infection n'est pas une infection par un virus influenza.
15 5. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 2 à
4, caractérisé
en ce que le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hRSV), les virus parainfluenza (hPIV), le metapneumovirus humain (hMPV), le virus Nipah, les novovirus, les coronavirus, le virus Swine fever, les adenovirus, le virus Zika, le virus de la 20 fièvre jaune, les rhéovirus, les rotavirus, le virus de la Dengue, et le virus West Nile.
6. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).
7. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le 25 microorganisme pathogène est un virus parainfluenza (hPIV).
8. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est un metapneumovirus (hMPV).
9. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé
en ce que le microorganisme pathogène est choisi parmi une bactérie, un 30 champignon et un parasite.
10. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 9 caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est une bactérie choisie parmi les espèces bactériennes suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, 35 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Campylobacterspp., Salmonella spp.,Shigella spp.,Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
11. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 10, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est la bactérie Pseudomonas aeruginosa.
12. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 2 à 11, caractérisé
en ce que l'infection est une co-infection par au moins un virus et au moins une bactérie.
13. Diltiazem pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé
en ce qu'il est utilisé en combinaison avec au moins un autre agent actif.
14. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 13, caractérisé en ce que cet autre agent actif est choisi parmi un composé anti-viral, un composé anti-bactérien, un composé anti-parasitaire, un composé anti-fongique, et un vaccin préventif ou thérapeutique.
15. Composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type Ill, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
16. Composition pharmaceutique ou vétérinaire pour son utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request |
Effective date: 20240325 |
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Effective date: 20240325 |