WO2019224489A1 - Diltiazem pour son utilisation dans le traitement des infections microbiennes - Google Patents

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WO2019224489A1
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diltiazem
virus
infection
epithelia
expression
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PCT/FR2019/051186
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Manuel Rosa-Calatrava
Olivier Terrier
Claire NICOLAS DE LAMBALLERIE
Guy Boivin
Mario Andres PIZZORNO
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Universite Claude Bernard Lyon 1
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Ecole Normale Superieure De Lyon
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Universite Laval
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Definitions

  • the present invention relates to a compound for use in preventing and / or treating infections with pathogenic microorganisms.
  • the present invention relates to a compound for use in the prevention and / or treatment of infections by pathogenic microorganisms of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • Acute respiratory infections are one of the leading causes of consultations, hospitalizations and deaths worldwide, including the leading cause of death among young children with nearly 2 million deaths per year. Each year, in an attempt to treat these various respiratory infections, the cost to companies is estimated at between 1, 5 and 2 billion euros.
  • viruses occupy a prominent place. They are found in most cases of childhood pneumonia and are a predisposing factor for bacterial pneumonia in adults. Among the most representative viruses in terms of frequency and morbidity, influenza viruses type A and B, which are also a recurrent pandemic risk factor, as well as respiratory syncytial virus (hRSV or hVRS), viruses parainfluenza (hPIV) and the human metapneumovirus (hMPV).
  • hRSV or hVRS respiratory syncytial virus
  • hPIV viruses parainfluenza
  • hMPV human metapneumovirus
  • influenza viruses With the exception of influenza viruses, there is currently no vaccine or antiviral molecule effective to prevent or treat infections with these different pathogenic respiratory viruses. In addition, in the case of influenza viruses, delays and the variable effectiveness of vaccination, as well as the increasing emergence of antiviral-resistant viruses, are of great concern today.
  • hVRS respiratory syncytial virus
  • hMPV human metapneumovirus
  • hPIV human parainfluenza virus
  • Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative bacillus found in the environment and in more than 50% of the respiratory tract in hospitalized patients.
  • P. aeruginosa is a ubiquitous microorganism that has the ability to survive under multiple environmental conditions. This microorganism causes not only diseases in plants and animals, but also in humans, causing serious infections in immunocompromised patients with cancer and patients with severe burns or cystic fibrosis.
  • Standard antibiotic therapy for Pseudomonas aeruginosa infections combines a beta-lactam (ceftazidime, imipenem or meropenem, piperacillin / tazobactam) with aminoside (tobramycin, amikacin) and / or fluoroquinolone.
  • beta-lactam ceftazidime, imipenem or meropenem, piperacillin / tazobactam
  • aminoside tobramycin, amikacin
  • fluoroquinolone fluoroquinolone
  • Intestinal infections are also an important cause of hospitalization and in some cases of death.
  • the most common causes of acute gastroenteritis in immunocompetent adults are noroviruses and rotaviruses, as well as the following species and genera of bacteria: Campylobacter spp., Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus , Bacillus cereus, and Clostridium difficile.
  • Type III interferons also known as lambda interferons (1), constitute the first line of antimicrobial defense in the epithelium of the respiratory and intestinal tracts, contributing to the initial inhibition of the spread of pathogens, without, however, triggering inflammatory response (Andreakos et al., 2017). These type III interferons are actually produced very early in response to pathogen activation of host cell sensors, Toll-like receptors or cytoplasmic effectors.
  • ISGs Interferon - stimulated genes
  • IFITM gene the cell entry of viruses
  • OAS gene OASL, IFIT1, IFIT2, IFIT13, ISG15
  • type III interferon type This early anti-pathogenic response, called “type III interferon type", is particularly prevalent in the initial innate response of the respiratory epithelium to influenza virus infection (Galani et al., 2017).
  • Type III interferons have been previously evaluated in clinical trials to treat hepatitis B and C infections, and have demonstrated lower side effects compared to type I interferon therapy (Chan et al., 2016).
  • the use of type III interferons as a non-inflammatory antiviral treatment against influenza virus infections has recently been proposed (Davidson et al., 2016).
  • Diltiazem is a molecule member of the benzothiazepine family, registered under the number CAS 42399-41-7. This molecule may be in the form of two cis- and cis-cis enantiomers, or a racemic mixture.
  • Diltiazem has been known for over 30 years and is approved in Europe and the United States by regulatory authorities for the drug. It can be administered as diltiazem hydrochloride. Cardizem®, Cartia®, Taztia® and Dilacor® are its most common brand names.
  • Diltiazem is available in various dosage forms, such as in the form of cream for topical application, in the form of tablets or capsules for oral administration, in powder form for preparation of solution for injection or in the form of pharmaceutical preparations for inhalation (WO 02 / 094238, US 4,605,552). Its known physiological action is the inhibition of calcium channels, and thus the inhibition of intracellular calcium fluxes. In particular, diltiazem inhibits the entry of transmembrane calcium into the myocardial muscle fiber and the smooth muscle fiber of the vessels. This makes it possible to reduce the intracellular calcium concentration reaching the contractile proteins.
  • diltiazem In humans, administration of diltiazem is indicated for its vasodilator action, in order to reduce cardiac work. It is thus used in the management of cardiac and circulatory disorders such as angina pectoris, arterial hypertension, myocardial ischemia and tachycardia.
  • WO 201 1/066657 describes the use of a calcium channel blocker, such as verapamil or diltiazem, for the treatment or prevention of viral and / or bacterial infections, or autoimmune diseases .
  • the viruses concerned include those of oral herpes, genital herpes and shingles.
  • diltiazem inhibits the interaction between the virus and the calcium channels, and thus blocks the entry of the virus into the cells.
  • EP 1 1 17 408 describes the use of diltiazem, as a calcium channel blocker compound, to treat pathologies related to the degeneration of photo receptors in the retina.
  • diltiazem as a calcium channel blocker compound
  • the technical problem underlying the present invention relates to the identification of molecules for stimulating the expression of genes encoding interferon III type proteins, for the purpose of preventing and / or treating infections by pathogenic microorganisms of the epithelia respiratory and / or intestinal tracts.
  • Therapeutic compounds having the ability to stimulate the expression of genes encoding proteins such as interleukin 29, interleukin 28A and / or interleukin 28B are therefore actively sought.
  • diltiazem a calcium channel blocker
  • diltiazem also stimulates the expression of these genes encoding interferon III type proteins, both in vitro and in vitro. vivo.
  • ISG genes Interferon-stimulated genes
  • the proteins encoded by the ISG genes participate in the antimicrobial action and / or participate in "interferon” signaling.
  • diltiazem can be used for various therapeutic applications, and in particular for preventing and / or treating infections with at least one pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • Diltiazem as an activating agent for the expression of genes encoding one or more interferon (s) type III, is particularly suitable for the treatment of viral or bacterial infections, but also co-infections related to the presence of at least one virus and at least one bacterium, or at least two viruses, or at least two bacteria, and in particular is suitable for the treatment of bacterial superinfections concomitant with viral primo-infection.
  • interferon (s) type III is particularly suitable for the treatment of viral or bacterial infections, but also co-infections related to the presence of at least one virus and at least one bacterium, or at least two viruses, or at least two bacteria, and in particular is suitable for the treatment of bacterial superinfections concomitant with viral primo-infection.
  • the present invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon.
  • the present invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections by at least one pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • the present invention also relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene called "ISG", in the prevention and / or treatment of infections with at least one pathogenic microorganism of the epithelia of respiratory and / or intestinal tracts.
  • ISG diltiazem
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition
  • a pharmaceutical or veterinary composition comprising diltiazem as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, for its use in the prevention and / or treatment of infections by pathogenic microorganisms of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • the pharmaceutical or veterinary composition is characterized in that it is in a dosage form suitable for administration by inhalation.
  • Figure 1 Characterization of the induction of expression of type III interferon genes by basolateral treatment with diltiazem of the 3D model of reconstituted human respiratory epithelium of nasal origin (MucilAir® HAE, Epithelix).
  • Reconstituted human respiratory epithelia (MucilAir® HAE, Epithelix) were treated or not (mock) with a single dose of 90 ⁇ M diltiazem administered by the apical pole on day 0.
  • the cells were lysed and the total RNA was extracted.
  • RT-qPCR TaqMan, Thermo Fisher Scientific. Data were normalized via the household GAPDH gene. The expression ratios were made by calculations based on the 2AACt method (Livak and Schmittgen, 2001).
  • FIG. 4 Diltiazem treatment reduces respiratory syncytial virus (RSV) replication in infected reconstituted human respiratory epithelia (MucilAir® HAE, Epithelix) and BALB / c mouse model after infectious challenge (in vivo).
  • RSV respiratory syncytial virus
  • 4A Schematic representation of the chronology of treatments via the basolateral pole of human respiratory epithelia: after infection with RSV Court 0), the reconstituted epithelia are treated or not (untreated) at 5h post-infection (5hpi) and daily the next three days (1, 2 and 3 days pi) diltiazem. Viral quantification is performed at 6 days pi.
  • 5A- Schematic representation of the chronology of treatments via the basolateral pole of human respiratory epithelia: after infection with the hPIV-3 virus at a MOI of 0, 1 Court 0), the reconstituted epithelia are treated or not (untreated) at 5h post-infection (5hpi), then daily the following four days (24, 48, 72 and 96 hours pi) diltiazem.
  • the viral quantification is carried out at 120 hours pi by infectious titration (TCID50 / mL).
  • TEER transepithelial electrical resistance
  • the viral titres (DITC50 / mL) of samples taken at the apical pole of the epithelia were determined in LLC-MK2 cells from washings taken from 48 h post-infection and up to 120 hpi.
  • viral titers measured at the apical surface of reconstituted human respiratory epithelia peaked at 72 h post-infection at a value of approximately 10 8 TCID50 / mL and at 96 h post-infection at a value of 10 7 TCID50 / mL, unlike diltiazem-treated reconstituted human respiratory epithelia, which show significantly lower values at 72 hours post-infection (approximately 10 6 TCID50 / mL) and 96 hours post-infection (10 5 TCID50 / mL ).
  • FIG. 6A Schematic representation of the chronology of treatment of human respiratory epithelia: reconstituted human respiratory epithelia were treated 24 hours before infection with 90 ⁇ M diltiazem via their basolateral medium or alternatively with 10 ⁇ L of diltiazem (90 ⁇ M) at their apical surface, then infected with Pseudomonas aeruginosa (PAK strain) at an MOI of 1 and again treated with diltiazem 2 hours after infection under the same conditions, respectively.
  • PAK strain Pseudomonas aeruginosa
  • FIG. 7A Schematic representation of the chronology of treatments for human respiratory epithelia: after infection with a recombinant hMPV-GFP virus (strain C-85473) at an MOI of 0.1, the epithelia were treated (via their basolateral medium) or not (3 epithelia per condition), with 3 successive doses of diltiazem at 90 ⁇ M at day (5 hpi), D1 and D3 post-infection. Viral quantification is performed at 3 days pi (supernatant) and at 5 days pi (total epithelium).
  • RNAs corresponding to the viral N gene of hMPV were quantified by RT-qPCR (Biosystems TM PowerUp TM SYBR TM Green, Thermo Fisher Scientific), using a range made from a plasmid containing the N gene. of HMPV. The results are expressed as copies of the N / pg gene of total RNA extracted.
  • mice are treated (20 mg / kg) or not (PBS control group "mock-treated") at day 0 (OJ), then treated or not, either daily on the following two days (OJ, D1 and D2) or every 48 hours until day 4 (OJ, D2 and D4).
  • OJ intranasal instillation
  • IFNk2 The expression of the IFNk2 gene (IFNL2) was measured by RT-qPCR and is represented as the ratio of expression relative to the basal level (equal to 1) of the expression of the gene measured in untreated mice (Mock -treaty).
  • the present invention relates to a new therapeutic use of a known drug, diltiazem, a molecule member of the benzothiazepine family referenced under the CAS number 42399-41-7, of formula (1):
  • the term "diltiazem” means diltiazem in all its forms, especially in the form of salts and in particular in the form of diltiazem hydrochloride. This term includes the racemic mixture as well as each of the enantiomers when these are isolated. This term also includes diltiazem derivatives, ie molecules derived from formula (1), having the same biological activity for stimulating the expression of type III interferon proteins.
  • the present invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon.
  • diltiazem has been used for its calcium channel inhibitory action; by this inhibition of intracellular calcium transport, the administration of diltiazem generates many physiological effects on the organisms of humans and animals.
  • the inventors have demonstrated a new technical effect of diltiazem, namely the activation of the expression of one or more genes coding for type III interferons.
  • the gene or genes whose expression is activated are endogenous genes, that is to say the native genes of the organism considered, which have not undergone any genetic modification.
  • the present invention relates to diltiazem for use as an activating agent for the expression of genes encoding interleukin 29, interleukin 28A and interleukin 28B.
  • a therapeutic compound for activating the "interferon III pathway” that is to say an activating agent for the expression of one or more genes coding for type interferons. III. This is the first compound with this activity to be identified.
  • Type III interferons also known as lambda interferons (1), constitute the first line of defense of a human or animal organism against infection by pathogenic microorganisms.
  • This new family of interferons described for the first time in 2003, includes the following four proteins in humans:
  • Interferon lambda-1 IFN-11
  • interleukin 29 IL-29
  • Interferon lambda-2 IFN-72
  • interleukin 28A IL-28A
  • Interferon lambda-3 IFN-73
  • interleukin 28B IL-28B
  • Interferon lambda-4 (IFN-74).
  • mice In mice, only two proteins belonging to this interferon III family have so far been identified (IFN-A2 / IL-28A and IFN-A3 / IL-28B).
  • IFN-7R1 receptor also known as IL-28RA.
  • a heteromeric complex is formed between this receptor and the IL-10R2 receptor to bind FN-1 monomers (see Donnelly & Kotenko, 2010, for review).
  • gene encoding a type III interferon means one of the following genes, or their homologs:
  • genes mentioned above are the human genes, but that if diltiazem is used in a different animal species, the genes encoding the interferons type
  • Example 1 of the present application demonstrates that diltiazem induces the expression of several so-called “interferon-stimulated” (ISG) genes, and in particular the “immunity” genes, following an apical or basolateral treatment.
  • ISG interferon-stimulated
  • diltiazem induces the expression of ISG well described in the literature such as IFI44L, IFIT2 OAS1, IRF7, MX1 or IFITM1.
  • IFN-RI receptor Infections by pathogenic microorganisms of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts
  • the IFN-RI receptor is exclusively expressed by epithelial cells, thus limiting the effects of type III interferons to epithelia.
  • the epithelia of the respiratory and intestinal tracts are the first affected organs, due to their direct contact, respectively, with the air drawn in, and the water and food ingested.
  • the present invention particularly relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections with at least one a pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • infection by at least one pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts must be understood as being an infection generated by the presence of at least one pathogenic microorganism, this microorganism having infected the individual or the animal, or likely to infect the individual or animal.
  • the present invention relates both to the prevention and / or treatment of infections affecting humans (also referred to as "individuals”), as infections affecting animals, including livestock.
  • prevention refers to preventing, or at least decreasing the probability of occurrence, an infection in a human or animal body by at least one pathogenic microorganism. Under the action of type III interferons produced, the tissues of the body and especially the epithelia become more resistant and are more likely not to be infected and / or to limit infection by said microorganism.
  • diltiazem is used as an activating agent for the expression of at least one gene coding for a type III interferon, in the prevention of infections by at least one pathogenic microorganism. epithelia from the respiratory and / or intestinal tracts
  • treatment refers to fighting infection with at least one pathogenic microorganism in a human or animal organism. Thanks to the administration of diltiazem, the rate of viral, bacterial, fungal or parasitic infection in the body will gradually decrease or even disappear completely.
  • treatment also means attenuating the symptoms associated with the infection (fever, fatigue, etc.) and / or preventing / reducing the risk of complications, especially superinfection.
  • diltiazem is used as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, in the treatment of infections with at least one pathogenic microorganism. epithelia from the respiratory and / or intestinal tracts.
  • the present invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections with less a pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts, characterized in that the said at least one gene is chosen from the gene coding for interleukin 29, the gene coding for interleukin 28A and the gene coding for interleukin 28B.
  • diltiazem is used as an activating agent for the expression of the three genes coding for interleukin 29, for interleukin 28A and for interleukin 28B.
  • pathogenic microorganisms denotes any microorganism capable of creating a disease in other organisms, such as in humans or animals. This term includes viruses, bacteria, fungi, protozoa, worms, and other unicellular pathogenic microorganisms.
  • the "pathogenic microorganism” is a microorganism sensitive to the cellular response of "interferon III” type, that is to say a microorganism whose cell infection will be prevented or inhibited, totally or partially, by the expression and secretion of interferon III-like proteins.
  • the pathogenic microorganism is a microorganism that specifically infects the epithelia of the respiratory tract.
  • the pathogenic microorganism is a microorganism that specifically infects the epithelia of the intestinal tracts.
  • the pathogenic microorganism is a microorganism capable of infecting all types of epitheliums and in particular those of the respiratory and intestinal tracts.
  • the infection is a viral infection, that is to say that the pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts is a virus.
  • Proteins belonging to the type III interferon family are essential players in the anti-viral response of virus target epithelia.
  • an activating agent for the expression of the genes coding for said type III interferon proteins makes it possible to stimulate and optimize the anti-viral response of the infected epithelia.
  • the invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections by at least one a virus infecting the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • virus includes any type of virus but more particularly the viruses infecting vertebrate eukaryotic organisms. These may be DNA viruses or
  • RNA infecting organisms via the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • the infection is not an infection with an influenza virus.
  • diltiazem for treating influenza virus infections has already been proposed in WO 2011/126071 and WO 2016/146836.
  • diltiazem is used in the prior art for its action on calcium channels, and not for its activating action of the expression of genes encoding type III interferons.
  • the pathogenic microorganism is a group I virus having a double-stranded DNA genome.
  • This group of viruses includes viruses of the order of Herpes, those of the family of papillomaviruses, as well as polyomaviruses and poxviridae.
  • the pathogenic microorganism is a group II virus having a single-stranded DNA genome, in particular comprising viruses of the parvoviridae family.
  • the pathogenic microorganism is a group III virus having a double-stranded RNA genome, including in particular viruses of the rheoviridae family, such as rotaviruses.
  • the pathogenic microorganism is a Group IV virus having a positive-strand single-stranded RNA genome.
  • This group includes:
  • viruses of the order Nidovirales such as those of the coronaviridae family
  • viruses of the family Caliciviridae including the Norwalk virus
  • viruses of the Flaviviridae family including, but not limited to, yellow fever virus, West Nile virus, hepatitis C virus and dengue virus;
  • viruses of the family Picornaviridae including poliovirus, rhinovirus, and hepatitis A virus;
  • viruses of the family Togaviridae including rubella virus, Ross River virus, Sindbis virus and Chikungunya virus.
  • the pathogenic microorganism is a group V virus having a negative-strand single-stranded RNA genome (ssRNA).
  • This group includes viruses of the order Mononegavirales, such as:
  • viruses of the Filoviridae family including Ebola virus and Marburg virus, viruses of the family Paramyxoviridae, including measles virus, mumps virus and Flenipaviruses,
  • viruses of the family Rhabdoviridae including the rabies virus
  • viruses of the family Arenaviridae including the Lassa fever virus
  • viruses of the family Bunyaviridae including Flantavirus and fever virus
  • the pathogenic microorganism is a virus chosen from human respiratory syncytial virus (hVRS), parainfluenza virus (hPIV), human metapneumovirus (hMPV), Nipah virus, novovirus, Swine virus. fever, adenovirus, coronavirus, Zika virus, yellow fever virus, rheovirus, rotavirus, Dengue virus, and West Nile virus.
  • hVRS human respiratory syncytial virus
  • hPIV parainfluenza virus
  • hMPV human metapneumovirus
  • Nipah virus novovirus
  • Swine virus fever, adenovirus, coronavirus, Zika virus, yellow fever virus, rheovirus, rotavirus, Dengue virus, and West Nile virus.
  • the pathogenic microorganism is a virus selected from human respiratory syncytial virus (hVRS), parainfluenza viruses (hPIV) and human metapneumovirus (hMPV).
  • hVRS human respiratory syncytial virus
  • hPIV parainfluenza viruses
  • hMPV human metapneumovirus
  • the invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene coding for a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections. by human respiratory syncytial virus (hRSV).
  • hRSV human respiratory syncytial virus
  • the invention relates to diltiazem for use in the prevention and / or treatment of human respiratory syncytial virus (hRSV) infections.
  • the invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene coding for a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections. by human parainfluenza virus (hPIV).
  • hPIV human parainfluenza virus
  • the invention relates to diltiazem for use in preventing and / or treating infections with human parainfluenza virus (hPIV).
  • hPIV human parainfluenza virus
  • the invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene coding for a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections. by the human metapneumovirus (hMPV).
  • hMPV human metapneumovirus
  • the invention relates to diltiazem for use in the prevention and / or treatment of human metapneumovirus (hMPV) infections.
  • hMPV human metapneumovirus
  • the infection is a non-viral infection.
  • the pathogenic microorganism may be selected from a bacterium, a fungus and a parasite.
  • the pathogenic microorganism is a bacterium.
  • bacteria of the following species Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes,
  • Mycobacterium tuberculosis Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae
  • bacteria specific for intestinal infections such as Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, and Clostridium difficile.
  • the pathogenic microorganism is not a bacterium of the genus Chlamydiae.
  • the pathogenic microorganism is a bacterium chosen from the following bacterial species: Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Campylobacter spp., Salmonella spp. , Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, and Clostridium difficile.
  • the pathogenic microorganism is a bacterium of the species Pseudomonas aeruginosa.
  • the invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene coding for a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections. by Pseudomonas aeruginosa.
  • the invention relates to diltiazem for use in the prevention and / or treatment of Pseudomonas aeruginosa infections.
  • the pathogenic microorganism is a fungus.
  • Aspergillus fumigatus Candida albicans and Pneumocystis jiroveci, Fusarium solari.
  • the invention relates to diltiazem for its use as an activating agent for the expression of at least one gene coding for a type III interferon, in the prevention and / or treatment of infections.
  • a pathogenic microorganism selected from the following group: Pseudomonas aeruginosa, human respiratory syncytial virus (hVRS), parainfluenza viruses (hPIV) and human metapneumovirus (hMPV).
  • the invention relates to diltiazem for its use in the prevention and / or treatment of infections by a pathogenic microorganism selected from the following group: Pseudomonas aeruginosa, human respiratory syncytial virus (hVRS), parainfluenza viruses (hPIV) and the human metapneumovirus (hMPV).
  • a pathogenic microorganism selected from the following group: Pseudomonas aeruginosa, human respiratory syncytial virus (hVRS), parainfluenza viruses (hPIV) and the human metapneumovirus (hMPV).
  • At least one pathogenic microorganism means that one or more pathogenic microorganisms are present in the infected organism, thus generating an immune response of the organism.
  • the body may have been infected with both a virus and a bacterium, which is referred to as a co-infection of the body.
  • the invention relates to diltiazem for its use as described above, characterized in that the infection is a co-infection with at least one virus and at least one bacterium.
  • diltiazem is then used for the concomitant treatment of a viral infection and a bacterial infection, which makes it possible to limit the number of active compounds administered to an individual or an animal suffering from this co-infection.
  • this co-infection may be related to the presence in the infected epithelia of a combination of pathogenic microorganisms chosen from the following:
  • a human respiratory syncytial virus and at least one bacterium of a species selected from Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae.
  • hRSV human respiratory syncytial virus
  • hPIV parainfluenza virus
  • bacterium of a species selected from Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae,
  • human metapneumovirus and at least one bacterium of a species selected from Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae,
  • West Nile virus and at least one bacterium of a species selected from Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae, and Influenza virus and at least one bacterium of a species selected from Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae.
  • Influenza virus and at least one bacterium of a species selected from
  • ii) Prevent co-infection by at least one other pathogenic microorganism of epithelia from the respiratory and / or intestinal tracts, such as bacterial superinfection.
  • diltiazem as an activating agent for the expression of at least one gene coding for a type III interferon will be used for both:
  • diltiazem as an activating agent for the expression of at least one gene coding for a type III interferon will be used for both:
  • the present invention also relates to diltiazem for its therapeutic use as presented above, characterized in that it is used in combination with at least one other active agent, that is to say with one or more active agents.
  • this other active agent is a therapeutic compound having a beneficial action on a human or animal body, for the purpose of preventing or treating a pathology.
  • This other active agent will be chosen in particular from an anti-viral compound, an antibacterial compound, an anti-parasitic compound, an anti-fungal compound, and a preventive or therapeutic vaccine.
  • this other active agent is chosen from an antiviral compound and an anti-bacterial compound.
  • antiviral compound means a compound having either a direct inhibitory action on at least one virus (for example, inhibiting its replication) or an action on a target cell of the virus (for example, in inducing a cellular state unfavorable to a viral infection, thus preventing the viral infection).
  • Anti-viral agents are classified into different categories according to their mode of action. We can mention in particular:
  • nucleotide analogues which interfere with or stop the synthesis of DNA or RNA; as well as inhibitors of the enzymes involved in the synthesis of DNA or RNA (helicase, replicase);
  • antiviral agent (s) is (are) chosen from:
  • viral agents having a direct inhibitory action on viruses, such as for example ribavirin and favipiravir;
  • Inhibitors of the penetration of a virus into the cells such as, for example, arbidol; Monoclonal antibodies, such as, for example, palivizumab, directed against an epitope of the antigenic site A of the respiratory syncytial virus (RSV) fusion protein; and
  • RSV respiratory syncytial virus
  • Antisense oligonucleotides having a virus inhibitory action are provided.
  • anti-bacterial compound means a compound having an anti-bacterial activity, that is to say, inhibiting the replication of bacteria (bacteriostatic compounds) or destroying them (bactericidal compounds) or by inhibiting their biosynthesis and / or secretion of toxic products. These are in particular antibiotics.
  • anti-bacterial agent (s) is (are) chosen from:
  • antibiotics especially those of the macrolide family, and especially roxithromycin
  • the other active agent used in combination with diltiazem is an anti-fungal compound or an anti-parasitic compound, especially chosen from systemic anti-fungal compounds (amphotericin B, azoles, echinocandins). and systemic anti-parasitic compounds (e.g., anti-malarial, antiamibian, toxoplasmosis, leishmaniasis, pneumocytosis, anthelmintic).
  • systemic anti-fungal compounds amphotericin B, azoles, echinocandins
  • systemic anti-parasitic compounds e.g., anti-malarial, antiamibian, toxoplasmosis, leishmaniasis, pneumocytosis, anthelmintic.
  • the at least one other active agent is a vaccine.
  • the term "vaccine” means a compound or a combination of compounds that specifically stimulate the immune system of a human or animal organism.
  • a vaccine will include in particular an antigen, ie a compound inducing a specific immune response in the body, which will keep the memory.
  • Such a vaccine may be preventive vaccine type, that is to say, intended to stimulate a specific immune response before infection of an organism by a pathogenic microorganism.
  • Nonlimiting examples that may be mentioned as examples are different types of vaccines, classified according to the nature of the antigens from which they are prepared.
  • the antigens conventionally used are the following: inactivated infectious agents, agents live attenuated subunits of infectious agents, toxoids, viral vectors expressing antigens from pathogens, vectors carrying nucleic acids (DNA or RNA), and antibodies.
  • Such a vaccine may also be therapeutic vaccine type, that is to say, intended to stimulate a specific immune response concomitantly with the infection of an organism with a pathogenic microorganism.
  • this vaccine may be administered before, during or after treatment with diltiazem.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition
  • a pharmaceutical or veterinary composition comprising diltiazem as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition
  • a pharmaceutical or veterinary composition comprising diltiazem as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, for its use in the prevention and / or treatment of infections by pathogenic microorganisms of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • composition according to the invention will comprise diltiazem as well as a suitable pharmaceutical vehicle, and optionally another active agent.
  • suitable pharmaceutical carrier means pharmaceutically acceptable vehicles or excipients, ie vehicles or excipients whose administration to an individual or animal is not accompanied by significant deleterious effects, which are well known to those skilled in the art.
  • composition according to the invention can be adapted for any type of administration and in particular for oral, sublingual, nasal and / or oral administration by inhalation, subcutaneous, intramuscular, intravenous, transdermal, ocular or rectal administration.
  • Suitable dosage forms of administration may for example be tablets, capsules, powders, granules and solutions or suspensions.
  • the pharmaceutical or veterinary composition is characterized in that it is in a dosage form suitable for administration by inhalation, that is to say by the nasal and / or oral routes.
  • Inhalation refers to absorption through the respiratory tract. It is a method of absorbing therapeutic compounds in the form of gas, microdroplets or powder in suspension.
  • compositions are in the form of aerosols (suspensions) or in the form of solutions, for example of aqueous solutions, put under pressure.
  • a nebulizer or a sprayer will then be recommended for administering the pharmaceutical or veterinary composition.
  • the dosage form suitable for administration of diltiazem by inhalation is selected from: a powder, an aqueous suspension of droplets or a solution under pressure.
  • the pharmaceutical or veterinary composition comprises an effective amount of diltiazem, for its use as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, in the prevention of and / or treating infections with at least one pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts.
  • the present invention also relates to a combination product comprising: diltiazem as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon, and
  • At least one other active agent selected from an anti-viral compound, an anti-bacterial compound, and an agent for preventing infections by pathogenic microorganisms,
  • the present invention also relates to a method for preventing and / or treating an infection in an individual infected or susceptible to infection by at least one pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts, including the administration of diltiazem to this individual, to activate the expression of at least one gene encoding a type III interferon.
  • the present invention also relates to a method for preventing and / or treating an infection in an individual infected or susceptible to infection by at least one pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts, including the administration of diltiazem to this individual, diltiazem being used as an activating agent for the expression of at least one gene encoding a type III interferon.
  • the present invention also relates to a method for preventing and / or treating an infection in an animal infected or susceptible to infection by at least one pathogenic microorganism of the epithelia of the respiratory and / or intestinal tracts, comprising the administration of diltiazem to this animal, to activate the expression of at least one gene encoding a type III interferon.
  • This administration of diltiazem will be carried out, preferably, by inhalation.
  • Reconstituted human respiratory epithelia (MucilAir® HAE, Epithelix) and maintained in culture at the air-liquid interface according to the instructions of the supplier Epithelix were treated or not with diltiazem (90 ⁇ M) via their culture medium at their basolateral pole .
  • Diltiazem treatment was repeated for 3 consecutive days (3 administrations in total).
  • CDNA libraries were prepared from 200 ng of total RNA using the Scriptseq TM kit supplemented with Gold kit-Low Input (SCL6EP, Epicenter) according to the supplier's instructions. Each library was amplified, quantified and indexed with primers provided in the ScriptSeq TM PCR Kit Primers kit (RSBC10948, Epicenter) and sequenced. Sequencing was conducted on an Illumina HiSeq 2500 system with a minimum requirement of 40 million sequenced reads per sample.
  • the demultiplexing of the data and the conversion of the BCL files resulting from sequencing into FASTQ files were carried out using the Illumina tool bcl2fastq, version 1.8.4.
  • the FastQC software http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) provided the necessary quality controls on the raw data. Trimming was done with the Trimmomatic tool, with a minimum quality threshold equal to Q30.
  • a pseudo-alignment of the reads trimmers on the human genome (Homo Sapiens: GRCh38.p1 1) by the software Kallisto was realized, followed by a statistical analysis using the software R 3.3.1 and the package EdgeR 3.14.0.
  • FIG. 1A shows the expression ratios of the IFN-II, IRN-12 and IFN-10 type III interferon genes observed between diltiazem-treated human respiratory epithelia and untreated human respiratory epithelia.
  • FIG. 1B shows the expression ratios of the type III interferon response genes such as IFI44L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, ISG15, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 and STAT1 observed between diltiazem-treated human respiratory epithelia and untreated control human respiratory epithelia.
  • diltiazem treatment of reconstituted human respiratory epithelia for 3 days significantly alters the level of expression of genes encoding type III IFN-11, IRN-12 and IRN-13 increasing significantly (from 100 to more than 200 fold in comparison with untreated control epithelia).
  • this treatment also very significantly stimulates the expression of type III interferon response genes such as IFI44L, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, ISG15, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 and STAT1. .
  • Figure 1C presents the results obtained 24 hours after the apical pole treatment of reconstituted human epithelial models (MucilAir® HAE, Epithelix) with diltiazem, on endogenous IFNL1 (interferon lambda I) gene expression, in comparison endogenous untreated epithelium (control). The measurement was performed by RT-qPCR.
  • results indicate that the treatment of diltiazem-reconstituted human respiratory epithelia via their apical pole induces significant overexpression of the IFNL1 gene, with an expression ratio greater than 6: 1 compared to control epithelia (untreated).
  • Reconstituted human respiratory epithelia (MucilAir® HAE, Epithelix) were maintained in culture at the air-liquid interface according to the instructions of the Epithelix supplier, and were treated or not diltiazem (90 ⁇ M) via their culture medium at their temperature. basolateral pole. Diltiazem treatment was repeated for 3 consecutive days (3 administrations in total).
  • Quantitative PCR primers (GAPDH: Hs02758991_g1, IFNL1: Hs00601677_g1, IFNL2: Hs00820125_g1, IFIT1: Hs01675197_m1, IFIT2: Hs00533665_m1, IFIT3: Hs00382744_m1, IFI27: Hs01086373_g1, IFI44L: Hs00915292_m1, IFITM1: Hs01652522_g1) and probes (TaqMan gene assays term ) were provided by Thermo Fisher Scientific.
  • the expression ratios of the IFIT1, IFIT2, IFIT3, IF127, IFN-II, IFN-72 IFI44L and IFITM1 genes between the diltiazem treated and untreated cells were determined by the 2AACt method (Livak Schmittgen, 2001).
  • Figure 2 presents the results obtained: after treatment with diltiazem, the reconstituted epithelia show a significant increase in the expression of IFIT1, IFIT2, IFIT3, IF127, IFN-II, IFN-72, IFI44L and IFITM1 genes compared to untreated epithelia
  • Example 3 ELISA assay of diltiazem-stimulated secretion of type III lambda interferon (IL-29).
  • Reconstituted human respiratory epithelia (MucilAir® HAE, Epithelix) were maintained in culture at the air-liquid interface according to the instructions of the Epithelix supplier, and were treated or not diltiazem (90 ⁇ M) via their culture medium at their temperature. basolateral pole. Diltiazem treatment was repeated for 3 consecutive days (3 administrations in total).
  • Figure 3 shows the results obtained: the secretion of IFN-II (IL-29) is very clearly increased at the apical pole following treatment with diltiazem via the epithelial culture medium; a significant but less marked increase is also observed at the basolateral pole of treated epithelia.
  • Example 4 Diltiazem treatment significantly reduces replication of respiratory syncytial virus.
  • Reconstituted human respiratory epithelia (MucilAir® HAE, Epithelix) were maintained in culture at the air-liquid interface according to the instructions of the Epithelix supplier, and were infected with respiratory syncytial virus (Long strain, ATCC VR-26) at a multiplicity of infection (MOI) 1, then treated or not with diltiazem (90 ⁇ M) via their culture medium at their basolateral pole. Diltiazem treatment was performed at 5 hours post-infection and repeated for 3 consecutive days (4 administrations in total).
  • Figures 4B and 4C show that when reconstituted human respiratory epithelia were treated post-infection with diltiazem (90 ⁇ M) via their basolateral pole, the amount of viral genome is much lower both in the culture supernatant (FIG. 4B) and in the epithelium ( Figure 4C) with respect to untreated epithelia.
  • the diltiazem therefore has an effect significant antiviral against respiratory syncytial virus in model of reconstituted human respiratory epithelia.
  • Diltiazem (oral) treatment reduces the replication of respiratory syncytial virus (RSV) in the BALB / c mouse model after infectious challenge.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • Figure 4D schematically shows the chronology of infection and treatment of mice:
  • mice BALB / c mice were randomized into 3 groups of 5 individuals and then infected intranasally with 50 ⁇ l of a virus suspension containing 5 ⁇ 10 5 PFU of RSV (Day 0). Six hours before infection, the mice were treated with either 40 mg / kg of intraperitoneal Ribavirin (RSV RIB) or 50 mg / kg of oral diltiazem (RSV DIL), or PBS (RSV PBS) as a negative control.
  • RSV RIB intraperitoneal Ribavirin
  • RSV DIL oral diltiazem
  • PBS PBS
  • mice of each group were euthanized and their lungs were recovered aseptically to measure their pulmonary viral titers by RTqPCR (F gene).
  • RSV DIL Diltiazem-treated animals
  • RV PBS mice in the control group
  • RV IBR ribavirin-treated group
  • Diltiazem therefore has a significant antiviral effect against respiratory syncytial virus in murine model in vivo.
  • Example 5 Diltiazem treatment significantly reduces parainfluenza virus type 3 replication
  • the experimental scheme is shown in Figure 5A.
  • Reconstituted human respiratory epithelia were infected with human parainfluenza virus type 3 (strain C243 ATCC VR-93) at an MOI of 0, 1, and treatment of basolateral medium with 90 ⁇ M diltiazem was started 2 hours post-infection and continued daily for 4 consecutive days.
  • the transepithelial electrical resistance (TEER) which reflects the integrity of the epithelium, was measured once daily from 48 hours post-infection up to 120 hours post-infection.
  • Apical infectious viral titers were determined in LLC-MK2 cells from washings taken as early as 48 h post-infection (hpi), and up to 120 hpi, as shown in Figure 5A.
  • FIG. 5B shows the results obtained after carrying out the following experiment: at 96 and 120 hpi, the untreated reconstituted human respiratory epithelia (images on the left) and treated with diltiazem (right images) were observed under a microscope.
  • the cytopathic effects induced by hPIV-3 were larger and easily visible under the microscope in untreated reconstituted human respiratory epithelia, unlike those treated with diltiazem.
  • Figure 5C shows TEER values as a function of post-infection time, measured on reconstituted human respiratory epithelia:
  • Figure 5D shows the measured viral titers (in LLC-MK2 (DITC50 / mL) over time (48 to 120 hpi) at the apical surface of diltiazem-treated, diluted, reconstituted human respiratory epithelia.
  • infectious viral titres measured at the apical surface of reconstituted human respiratory epithelia peaked at 72 hours post-infection at a value of 10 8 TCID50 / mL) and 96 hours post-infection at a value of 10 7 TCID50 / mL, unlike diltiazem-treated reconstituted human respiratory epithelia, which show significantly lower values at 72 hours post-infection (10 6 TCID50 / mL) and 96 hours post-infection (10 5 TCID50 / mL) . Overall, these results indicate that diltiazem treatment reduces the viral replication of hPIV-3 in the model of infected reconstituted human respiratory epithelium.
  • Example 6 Diltiazem treatment significantly reduces the multiplication of the bacterium Pseudomonas aeruginosa
  • Reconstituted human respiratory epithelia were pretreated 24 hours before infection with 90 ⁇ M diltiazem in basolateral medium or alternatively with 10 ⁇ L of 90 ⁇ M diltiazem at the apical surface, then infected with Pseudomonas aeruginosa (PAK strain) at an MOI of 1 and treated again. by diltiazem 2 hours after infection.
  • Pseudomonas aeruginosa PAK strain
  • dilitiazem treatment limits the replication of Pseudomonas aeruginosa in the human respiratory epithelium.
  • Diltiazem treatment significantly reduces the multiplication of human metapneumovirus (hMPV).
  • Viral replication in reconstituted human epithelial (MucilAir® FIAE, Epithelix) models of nasal origin has been studied in diltiazem-treated or non-dilated epithelia.
  • fluorescence optical microscopy photos were used to evaluate the efficacy and progression of the infection and
  • viral genome quantification by RTqPCR was performed, on the one hand at the apical pole of the epithelium (harvest at the surface) to quantify the excretion of the viral offspring, and secondly in the lysates Epithelial cell totals end-point Cour 5 post-infection) to quantify intracellular viral replication within the epithelium.
  • the human respiratory epithelia (Mucilair, Epithelix) were infected with a recombinant hMPV-GFP virus (strain C-85473) at a MOI of 0.1, then treated (via the basolateral epithelium medium) or not with 3 successive doses of diltiazem at 90pM at OJ, D1 and D3 post-infection (3 epithelia per condition).
  • RNA samples were harvested and lysed to extract total RNA.
  • the total RNAs corresponding to the viral N gene of hMPV were quantified by Rt-qPCR (Biosystems TM PowerUp TM SYBR TM Green, Thermo Fisher Scientific), using a range made from a plasmid containing the N gene. of HMPV.
  • the results are expressed as copies of the N / pg gene of extracted RNA ( Figure 7D).
  • Example 8 In vivo diltiazem induction of IRN-12 gene expression (IFNL2) measured by RT-qPCR
  • FIG. 8A schematically represents the chronology of intranasal instillation (in) treatment of BALB / c mice: the mice were treated (20 mg / kg) or not (PBS control group "mock-treated") at day 0 (OJ) , then treated or not, either daily on the following two days (OJ, D1 and D2), or every 48 hours until day 4 (OJ, D2 and D4). At day 5, the nasal cavities were removed after euthanasia of the animals.
  • IRN-12 gene (IFNL2) was measured by RT-qPCR, and is represented with respect to the basal level (equal to 1) measured on untreated (Mock-treated) mice in Figure 8B.
  • Galani IE Triantafyllia V, Eleminiadou EE, Koltsida O, Stavropoulos A, Manioudaki M, Thanos D, Doyle SE, Kotenko SV, Thanopoulou K, Andreakos E. Interferon-l Medias Non-redundant Front-Line Antiviral Protection against Influenza Virus Infection without Compromising Host Fitness. Immunity. 2017 May 16; 46 (5): 875-890.e6.
  • IFNA is a potent anti-influenza therapeutic with the inflammatory side effects of IFNa treatment. EMBO Mol Med. 2016 Sep 1; 8 (9): 1099-1 12.

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Abstract

La présente invention concerne le diltiazempour son utilisation en tant qu'agent activateur de l'expression d'au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.

Description

DILTIAZEM POUR SON UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DES INFECTIONS
MICROBIENNES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un composé pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’infections par des microorganismes pathogènes.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un composé pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux
Les infections respiratoires aigües (IRA) représentent une des causes principales de consultations, d’hospitalisations et de décès dans le monde, en étant notamment la première cause de mortalité chez les jeunes enfants avec près de 2 millions de décès par an. Chaque année, pour tenter de traiter ces diverses infections respiratoires, le coût pour les sociétés est estimé entre 1 ,5 à 2 milliards d'euros.
Parmi les agents étiologiques responsables des IRA, les virus occupent une place prépondérante. Ils sont en effet retrouvés dans la majorité des cas de pneumonies infantiles et sont un facteur prédisposant des pneumonies bactériennes chez l’adulte. Parmi les virus les plus représentatifs dans la fréquence et la morbidité, on dénombre notamment les virus influenza de type A et B, qui constituent de plus un facteur de risque pandémique récurrent, ainsi que le virus respiratoire syncytial (hRSV ou hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le métapneumovirus humain (hMPV). De plus, l’émergence de nouveaux virus de la famille des Coronaviridae tels que le SRAS et le virus MERS-CoV récemment décrit, constitue très probablement un grave problème sanitaire en devenir.
D’autres agents responsables des IRA sont les bactéries. Parmi les bactéries pathogènes les plus représentatives, on dénombre notamment S. pneumonia, P. aeruginosa, S. aureus et H. influenza. Ces bactéries pathogènes sont des agents étiologiques contribuant à une co- morbidité et une co-mortalité accrues dans le cas des co-infections respiratoires, et elles sont responsables de l'émergence et de la diffusion croissante de souches de bactéries résistantes aux antibiotiques qui remettent fondamentalement en question l’efficacité des traitements antibiotiques classiques tant chez l’Homme que chez l’animal.
A l’exception des virus influenza, il n’existe pour l’heure aucun vaccin, ni molécule antivirale efficace pour prévenir ou traiter les infections par ces différents virus respiratoires pathogènes. En outre, dans le cas des virus influenza, les délais et l’efficacité variable de la vaccination, ainsi que l’émergence croissante de virus résistants aux antiviraux, sont aujourd’hui très préoccupants.
Il n’existe actuellement aucun vaccin ou traitement spécifique contre le virus respiratoire syncytial (hVRS, également désigné dans la présente demande sous son abréviation anglaise hRSV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Ces virus appartenant à la famille des Pneumoviridae sont des virus enveloppés (150 à 600 nm), qui possèdent un génome à ARN négatif simple brin et non segmenté. L’analyse phylogénétique des gènes codant pour les protéines F et G permet de diviser les virus hMPV, tout comme les virus hVRS, en deux groupes principaux A et B respectifs, et de subdiviser chacun de ces groupes en deux sous- groupes A1 , A2, B1 ou B2. Les pathologies associées à ces pneumovirus sont principalement la bronchiolite pédiatrique, le syndrome grippal ou rhume chez l’adulte, ou encore la pneumonie grave chez les patients âgés ou immunodéprimés.
De même, il n'existe actuellement aucun vaccin ou traitement spécifique contre les virus parainfluenza humains (hPIV). Ces virus, découverts à la fin des années 1950, sont des virus enveloppés (150 à 250 nm), qui possèdent un génome ARN négatif simple brin, appartenant à la famille des Paramyxoviridae. Ils sont génétiquement et antigéniquement divisés en 4 types (1 à 4). D'autres sous-types majeurs de hPIV-4 (A et B) et des sous-groupes/génotypes de hPIV-1 et hPIV-3 ont été décrits. Les virus hPIV-1 à hPIV-3 constituent des causes majeures d'infections respiratoires inférieures chez les nourrissons, les jeunes enfants, les personnes immunodéprimées, les malades chroniques, ainsi que chez les personnes âgées. Ils peuvent notamment causer des pneumonies.
En ce qui concerne la résistance aux antibiotiques des bactéries pathogènes responsables de surinfections, le Centre européen de contrôle des maladies évalue à 25 000 le nombre de décès par an en Europe résultant de la résistance aux antibiotiques. Une surmortalité équivalente est observée aux États-Unis par le CDC d'Atlanta. L’augmentation de la résistance sera responsable d’une augmentation dramatique de ces chiffres comme cela a été modélisé dans le rapport de Lord J. O'Neil sur l’impact de la résistance aux antibiotiques d’ici 2050. En février 2017, l'OMS a publié une liste de bactéries résistantes représentant une menace à l'échelle mondiale : P. aeruginosa représente entre autres une urgence critique car elle résiste à un grand nombre d'antibiotiques ; S. pneumoniae et S. aureus, résistantes à la méticilline (SARM), sont responsables d’infections diverses, pulmonaires et osseuses, ainsi que de septicémies, en particulier chez les patients les plus sensibles.
Parmi ces bactéries, Pseudomonas aeruginosa est un bacille gram négatif que l'on trouve dans l'environnement et dans plus de 50 % des voies respiratoires des patients hospitalisés. P. aeruginosa est un microorganisme ubiquitaire qui a la capacité de survivre dans de multiples conditions environnementales. Ce microorganisme cause non seulement des maladies chez les plantes et les animaux, mais aussi chez les humains, causant de graves infections chez les patients immunodéprimés atteints de cancer et les patients souffrant de brûlures graves ou de mucoviscidose.
L'antibiothérapie standard contre les infections à Pseudomonas aeruginosa associe un bêta- lactame (ceftazidime, imipénem ou méropénem, pipéracilline/tazobactam) avec un aminoside (tobramycine, amikacine) et/ou une fluoroquinolone. L'émergence de souches multi- résistantes de Pseudomonas aeruginosa (résistance à tous les antibiotiques d'au moins deux des trois classes principales : bêta-lactamines, aminoglycosides, fluoroquinolones) pose le problème du choix des antibiotiques, l’arsenal thérapeutique restant très limité.
Ainsi, le développement de nouveaux traitements prophylactiques et thérapeutiques constitue un objectif majeur de santé publique. Le succès des nouvelles stratégies de traitement des infections par ces pathogènes repose en grande partie sur une meilleure caractérisation de leur biologie cellulaire et de leurs interactions moléculaires et fonctionnelles avec leur hôte.
Les infections intestinales sont également une cause importante d’hospitalisations et dans certains cas de décès. Dans les pays développés, les causes les plus fréquentes de gastro- entérite aiguë chez l’adulte immunocompétent sont les norovirus et les rotavirus, ainsi que les espèces et genres de bactéries suivants : Campylobacter spp., Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Interférons de type III
Les Interférons de type III, aussi désignés interférons lambda (l), constituent la première ligne de défense antimicrobienne au niveau de l’épithélium des tractus respiratoire et intestinal, en contribuant à l’inhibition initiale de la dissémination des pathogènes, sans toutefois déclencher de réponse inflammatoire (Andreakos et al., 2017). Ces interférons de type III sont effectivement produits très tôt en réponse à l’activation par les pathogènes des senseurs cellulaires de l’hôte, de type récepteurs Toll-like ou effecteurs cytoplasmiques. Ces interférons de type III activent l’expression de nombreux gènes dits « ISGs ( Interferon - stimulated genes) » (via l’activation des voies JAK/STAT), qui confèrent une activité inhibitrice contre les pathogènes respiratoires, en inactivant par exemple l’entrée cellulaire des virus (gène IFITM), ou leur réplication (gène OAS, OASL, IFIT1 , IFIT2, IFIT13, ISG15).
Cette réponse anti-pathogène précoce, dite « de type interféron de type III », est notamment prédominante dans la réponse initiale innée de l’épithélium respiratoire à l’infection par les virus influenza (Galani ét al., 2017).
Les interférons de type III ont déjà été évalués en essai clinique pour traiter les infections à hépatite B et C, et ont démontré des effets secondaires moins importants en comparaison aux traitements par les interférons de type I (Chan et al., 2016). L’utilisation des interférons de type III comme traitement antiviral non inflammatoire contre les infections à virus influenza a été récemment proposée (Davidson ét al., 2016).
II serait avantageux de stimuler la production endogène d’un ou plusieurs interférons de type
III pour lutter contre les infections des épithéliums respiratoires et/ou intestinaux, notamment contre les infections virales de ces épithéliums.
Toutefois, à l’heure actuelle, aucun composé thérapeutique ayant cette activité stimulatrice n’est connu. Ainsi, seule l’administration d’interféron de type III exogène a pu être testée jusqu’à présent.
Le diltiazem, un agent inhibiteur des canaux calciques
Le diltiazem est une molécule membre de la famille des benzothiazépines, référencée sous le numéro CAS 42399-41-7. Cette molécule peut être sous la forme de deux énantiomères L- cis et D-cis, ou d’un mélange racémique.
Le diltiazem est connu depuis plus de 30 ans et est approuvé, en Europe et aux Etats-Unis, par les autorités règlementaires du médicament. Il peut être administré sous forme d’hydrochloride de diltiazem. Cardizem®, Cartia®, Taztia® et Dilacor® sont ses dénominations commerciales les plus courantes.
De nombreuses formulations sont disponibles, en particulier des formulations à libération prolongée. Le diltiazem est disponible sous différentes formes galéniques, telles que sous forme de crème pour application topique, sous forme de comprimés ou capsules pour administration orale, sous forme de poudre pour préparation de solution injectable ou sous forme de préparations pharmaceutiques pour inhalation (WO 02/094238, US 4,605,552). Son action physiologique connue est l’inhibition des canaux calciques, et donc l’inhibition des flux de calcium intracellulaires. Le diltiazem freine notamment l'entrée du calcium transmembranaire au niveau de la fibre musculaire myocardique et de la fibre musculaire lisse des vaisseaux. Ceci permet de diminuer la concentration intracellulaire calcique atteignant les protéines contractiles.
Chez l'homme, l’administration de diltiazem est indiquée pour son action vasodilatatrice, dans le but de réduire le travail cardiaque. Il est ainsi utilisé dans la prise en charge des désordres cardiaques et circulatoires tels que les angines de poitrine, l’hypertension artérielle, les ischémies myocardiques et la tachycardie.
D’autres utilisations thérapeutiques du diltiazem ont également été proposées dans la littérature, sans toutefois que des médicaments soient déjà approuvés par les autorités règlementaires pour ces nouvelles applications thérapeutiques.
La demande internationale WO 87/07508 décrit l’utilisation de composés thérapeutiques inhibant les influx de calcium dans la cellule, tels que le diltiazem, pour le traitement d’infections virales liées au cytomégalovirus ou à l’herpès.
La demande internationale WO 201 1/066657 décrit l’utilisation d’un inhibiteur des canaux calciques, tel que le vérapamil ou le diltiazem, pour le traitement ou la prévention d’infections virales et/ou bactériennes, ou encore de maladies auto-immunes. Les virus concernés sont notamment ceux de l’herpès buccal, de l’herpès génital et du zona.
La demande internationale WO 2011/126071 décrit l’utilisation de composés inhibant les influx de calcium dans la cellule, tel que le diltiazem, pour le traitement d’infections virales, notamment celles liées aux virus influenza. Il est spécifiquement expliqué que le diltiazem inhibe l’interaction entre le virus et les canaux calciques, et ainsi bloque l’entrée du virus dans les cellules.
La demande internationale WO 2016/146836 divulgue des compositions pharmaceutiques ou vétérinaires comprenant du diltiazem pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection par les virus influenza.
Le brevet EP 1 1 17 408 décrit l’utilisation de diltiazem, en tant que composé inhibiteur des canaux calciques, pour traiter des pathologies liées à la dégénérescence des photo récepteurs de la rétine. Toutefois, toutes les actions bénéfiques du diltiazem n’ont probablement pas encore été explorées, et les effets techniques associés au diltiazem utilisé comme médicament ne sont vraisemblablement pas encore tous connus à ce jour.
EXPOSE DE L'INVENTION
Le problème technique sous-jacent à la présente invention concerne l’identification de molécules permettant de stimuler l’expression des gènes codant pour des protéines de type interféron III, dans le but de prévenir et/ou traiter des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
En effet, en cas d’infection par des microorganismes des tractus respiratoires et/ou intestinaux, il est avantageux de stimuler la réponse de l’organisme contre ces pathogènes, sans toutefois induire une réponse inflammatoire, et ainsi éviter la sur-stimulation du système immunitaire.
Or, à l’heure actuelle, aucun composé thérapeutique présentant cette activité n’est connu.
Des composés thérapeutiques ayant la capacité de stimuler l’expression des gènes codant pour des protéines telles que l’interleukine 29, l’interleukine 28A et/ou l’interleukine 28B sont donc activement recherchés.
De façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence le fait que le diltiazem, un inhibiteur des canaux calciques, a également une action stimulatrice de l’expression de ces gènes codant pour des protéines de type interféron III, à la fois in vitro et in vivo.
De plus, les inventeurs ont mis en évidence le fait que le diltiazem active l’expression d’un groupe de gènes désigné « gènes ISG ( Interferon-stimulated genes) », connus pour être activés par les interférons de type I et III. Les protéines codées par les gènes ISG prennent part à l’action antimicrobienne et/ou participent à la signalisation « interféron ».
Ainsi, le diltiazem peut être utilisé pour différentes applications thérapeutiques, et en particulier pour prévenir et/ou traiter des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Le diltiazem, en sa qualité d’agent activateur de l’expression des gènes codant pour un ou plusieurs interféron(s) de type III, est particulièrement adapté pour le traitement des infections virales ou bactériennes, mais également des co-infections liées à la présence d’au moins un virus et d’au moins une bactérie, ou d’au moins deux virus, ou d’au moins deux bactéries, et en particulier est adapté pour le traitement des surinfections bactériennes concomitantes à une primo-infection virale.
La présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Comme l’Homme du métier le sait, au regard de l’abondante littérature scientifique sur le sujet, l’activation de la « voie de l’interféron III » permet de traiter de nombreux désordres physiologiques, et en particulier ceux liés à des infections par des pathogènes.
En particulier, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène dit « ISG », dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect particulier, la composition pharmaceutique ou vétérinaire est caractérisée en ce qu’elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. Caractérisation de l’induction de l’expression des gènes de l’interféron de type III par le traitement basolatéral au diltiazem du modèle 3D d’épithélium respiratoire humain reconstitué d’origine nasale (MucilAir® HAE, Epithelix).
1A- Ratios d'expression des gènes codant pour les interférons de type III IFN-lI , IRN-l2 et IRN-l3 (désignés respectivement par IFNL1 , IFNL2 et IFNL3) déterminés par RNAseq entre : - des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) traités 3 jours par le diltiazem (90 pM, 3 administrations au total) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral et
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (niveau basal d’expression de 1 )·
1 B- Ratios d'expression des gènes codant pour IFI44L, IFIT1 , IFIT2, IFIT3, IFITM1 , ISG15, MX1 , MX2, OAS1 , OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 et STAT1 déterminés par RNAseq entre :
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités 3 jours par le diltiazem (90 pM, 3 administrations au total) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral et
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (niveau basal d’expression de 1 )·
Seuls les gènes arborant un différentiel d'expression supérieur ou égal à 2, et une p valeur corrigée inférieure à 0.05, ont été considérés dans la suite de l'analyse.
1C- Expression du gène IFNL1 induite par un traitement apical au diltiazem du modèle 3D d’épithélium respiratoire humain reconstitué d’origine nasale.
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) ont été traités ou non (mock) par une dose unique de diltiazem à 90pM administrée par le pôle apical à J0. A 24 heures post traitement, les cellules ont été lysées puis l’ARN total en a été extrait. Après réverse transcription, l’expression du gène IFNL1 a été mesurée en RT-qPCR (TaqMan, Thermo Fisher Scientific). Les données ont été normalisées via le gène de ménage GAPDH. Les ratios d’expression ont été réalisés par des calculs basés sur la méthode 2AACt method (Livak and Schmittgen, 2001 ).
Figure 2. Confirmation par Rt-qPCR de l’induction par le diltiazem de 8 gènes associés à la réponse Interféron de type III.
Ratios d’expression des gènes IFIT1 , IFIT2, IFIT3, IFI27, IFN-lI (IFNL1 ), IFN-72 (IFNL2), IFI44L et IFITM1 entre :
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités 3 jours par le diltiazem via leur pôle basolatéral (90 pM) (colonne de droite sur les graphes) et
- les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (colonne de droite sur les graphes).
*P<0.05, **P<0.01 , ***P<0.001 and ****P<0.0001 par rapport aux épithéliums non traités. Figure 3. Mesure par dosage ELISA de la sécrétion d’interféron lambda 1 (IL-29).
Les niveaux de sécrétion (pg/mL) d’interféron lambda 1 (IL-29) aux pôles apical et basolatéral des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités et non traités au diltiazem via leur pôle basolatéral (90 pM, 3 administrations au total pendant 3 jours consécutifs), ont été mesurés par ELISA après 72h de traitement.
*P<0.05, **P<0.01 , ***P<0.001 and ****P<0.0001 par rapport aux épithéliums non traités.
Figure 4. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du virus syncytial respiratoire (VRS) au sein des épithéliums respiratoires humains reconstitués infectés (MucilAir® HAE, Epithelix) et en modèle de souris BALB/c après challenge infectieux (in vivo).
4A- Représentation schématique de la chronologie des traitements via le pôle basolatéral des épithéliums respiratoires humains : après l’infection par le VRS Cour 0), les épithéliums reconstitués sont traités ou non (non traités) à 5h post-infection (5hpi) puis quotidiennement les trois jours suivants (1 , 2 et 3 jours pi) au diltiazem. La quantification virale est effectuée à 6 jours pi.
4B- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d’ARN, au pôle apical des épithéliums traités ou non traités, c’est-à-dire dans le surnageant de culture des épithéliums.
4C- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d’ARN au sein des épithéliums traités ou non traités.
4D- Représentation schématique de la chronologie de l’infection et des traitements per os (p.o) des souris: après l’infection par le VRS (5.105 PFU/souris, jour 0), les souris ont été traitées ou non (groupe contrôle PBS) à 5h post-infection (5hpi) puis quotidiennement les deux jours suivants (1 et 2 jours pi) à la ribavirine (40 mg/kg en intra-péritonéale/souris) ou quotidiennement les quatre jours suivants (1 , 2, 3 et 4 jours pi) au diltiazem (50 mg/Kg per os/souris). La quantification virale pulmonaire est effectuée à 5 jours pi.
4E- Quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d’ARN extrait des poumons de souris traitées à la ribavirine (VRS RIB) ou au diltiazem (VRS DIL) et non traitées (VRS PBS) à 5 jours après l’infection (jours pi). Figure 5. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du virus parainfluenza humain (hPIV) dans le modèle d’épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir® HAE, Epithelix).
5A- Représentation schématique de la chronologie des traitements via le pôle basolatéral des épithéliums respiratoires humains : après l’infection par le virus hPIV-3 à une MOI de 0, 1 Cour 0), les épithéliums reconstitués sont traités ou non (non traités) à 5h post-infection (5hpi), puis quotidiennement les quatre jours suivants (24, 48, 72 et 96 heures pi) au diltiazem. La quantification virale est effectuée à 120 heures pi par titrage infectieux (TCID50/mL).
5B- A 96h (en haut) et 120 h (en bas) post-infection, les effets cytopathiques induits par le virus hPIV-3 sont plus importants et facilement visibles au microscope dans les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (images de gauche), contrairement à ceux traités par le diltiazem (images de droite).
5C-La résistance électrique trans-épithéliale (TEER), qui reflète l'intégrité de l'épithélium, a été mesurée une fois par jour à partir de 48 h post-infection, et jusqu’à 120 heures post- infection. En l'absence de traitement, les valeurs de TEER des épithéliums respiratoires humains reconstitués infectés ont fortement diminuées, à partir de 24 h post-infection, contrairement à ceux traités au diltiazem.
5D- Les titres viraux (DITC50/mL) des prélèvements réalisés au pôle apical des épithéliums ont été déterminés dans des cellules LLC-MK2 à partir de lavages prélevés dès 48 h post- infection et jusqu’à 120 hpi. En l'absence de traitement, les titres viraux mesurés à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués ont culminé à 72 h post-infection à une valeur d’environ 108 DICT50/mL et à 96h post-infection à une valeur de 107 DICT50/mL, contrairement à ceux des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, qui présentent des valeurs significativement plus réduites à 72 h post-infection (environ 106 DICT50/mL) et à 96h post-infection (105 DICT50/mL).
Figure 6. Le traitement au diltiazem réduit l’infection bactérienne par Pseudomonas aeruginosa en modèle d’épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir® HAE, Epithelix).
6A- Représentation schématique de la chronologie des traitements des épithéliums respiratoires humains : les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été traités 24 heures avant l'infection avec 90pM diltiazem via leur milieu basolatéral ou alternativement avec 10pL de diltiazem (90pM) à leur surface apicale, puis infectés par Pseudomonas aeruginosa (souche PAK) à une MOI de 1 et de nouveau traités par le diltiazem 2 heures après l'infection dans les même conditions, respectivement.
6B- Dans ces conditions expérimentales (n = 2), le nombre de bactéries recueillies à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains à 24 heures post-infection, était significativement plus faible que celui des bactéries recueillies à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en milieu basolatéral (1 15 et 106 vs 76 et 106 UFC, respectivement, * p< 0,05).
6C- Dans le contexte du traitement apical au diltiazem, un effet similaire sur Pseudomonas aeruginosa a été observé à 24 heures post-infection (n=2), avec une diminution des bactéries récoltées à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en comparaison de ceux non traités (87 et 106 contre 63,5 et 106 UFC, respectivement).
Figure 7. Le traitement au diltiazem réduit la réplication du métapneumovirus humain (hMPV) en modèle d’épithélium respiratoire humain reconstitué (MucilAir® HAE, Epithelix).
7A- Représentation schématique de la chronologie des traitements des épithéliums respiratoires humains : après infection par un virus recombinant hMPV-GFP (souche C- 85473) à une MOI de 0,1 , les épithéliums ont été traités (via leur milieu basolatéral) ou non (3 épithéliums par condition), par 3 doses successives de diltiazem à 90pM à J0 (5 hpi), J1 et J3 post-infection. La quantification virale est effectuée à 3 jours pi (surnageant) et à 5 jours pi (épithélium total).
7B- Des observations en microscopie à épifluorescence ont été réalisées à J4 post-infection afin d’observer l’impact du traitement par le diltiazem sur la réplication virale. En l’absence de traitement, une fluorescence correspondant à l’expression virale de la GFP, est observée à J4 post-infection dans la quasi-totalité de l’épithélium (image de gauche), alors qu’il n’y a que de très rares cellules fluorescentes dans les épithélium infectés et traités par le diltiazem à ce même temps post-infection (image de droite).
7C- Au Jour 3 post-infection, un lavage au pôle apical des épithéliums infectés traités ou non au diltiazem, a été réalisé afin de récolter la progéniture virale produite. L’ARN viral génomique a été extrait et quantifié par RT-qPCR (Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green, Thermo Fisher Scientific) à l’aide d’une gamme réalisée à partir d’un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène viral N/pg d’ARN total extrait 7D- Au Jour 5 post-infection, les cellules des épithéliums ont été récoltées et lysées pour en extraire IARN total. Les ARN totaux correspondants au gène viral N de hMPV ont été quantifiés par RT-qPCR (Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green, Thermo Fisher Scientific), à l’aide d’une gamme réalisée à partir d’un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d’ARN total extrait.
Figure 8. Induction par le diltiazem de l’expression du gène IFN-12 (IFNL2) in vivo après instillation nasale de souris BALB/c
8A- Représentation schématique de la chronologie des traitements par instillation intranasale (i.n.) des souris BALB/c : les souris sont traitées (20 mg/kg) ou non (groupe contrôle PBS « mock-traité ») au jour 0 (JO), puis traitées ou non soit quotidiennement les deux jours suivants (JO, J1 et J2), soit toutes les 48 heures jusqu’au jour 4 (JO, J2 et J4). A J5, les cavités nasales ont été prélevées après euthanasie des animaux.
8B- L’expression du gène IFNk2 (IFNL2) a été mesurée par RT-qPCR et est représentée en ratio d’expression par rapport au niveau basal (égal à 1 ) de l’expression du gène mesurée chez des souris non traitées (Mock-traité).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une nouvelle utilisation thérapeutique d’un médicament connu, le diltiazem, une molécule membre de la famille des benzothiazépines référencée sous le numéro CAS 42399-41-7, de formule (1 ) :
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Formule (1 )
Au sens de la présente invention, le terme « diltiazem » signifie le diltiazem sous toutes ses formes, notamment sous forme de sels et en particulier sous forme d’hydrochlorure de diltiazem. Ce terme inclut le mélange racémique ainsi que chacun des énantiomères lorsque ceux-ci sont isolés. Ce terme inclut également les dérivés de diltiazem c’est à dire les molécules dérivées de la formule (1 ), présentant la même activité biologique de stimulation de l’expression des protéines interférons de type III.
La présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Jusqu’à présent, le diltiazem était utilisé pour son action inhibitrice des canaux calcium ; par cette inhibition du transport intracellulaire de calcium, l’administration de diltiazem génère de nombreux effets physiologiques sur les organismes des humains et des animaux.
Les inventeurs ont mis en évidence un nouvel effet technique du diltiazem, à savoir l’activation de l’expression d’un ou plusieurs gènes codant pour des interférons de type III.
Selon un aspect préféré de l’invention, le ou les gènes dont l’expression est activée sont des gènes endogènes, c’est-à-dire les gènes natifs de l’organisme considéré, qui n’ont subi aucune modification génétique.
L’Homme du métier connaît l’implication des interférons de type III dans différentes situations physiologiques, et peut conclure, au regard de la littérature scientifique, du potentiel thérapeutique d’un tel composé activateur de l’expression de ces interférons de type III. En particulier, les cellules sensibles aux effets des interférons III, c’est-à-dire les cellules exprimant leurs récepteurs, ont été répertoriées dans la littérature. Ainsi, les pathologies humaines et animales pouvant profiter d’une utilisation de diltiazem seront aisément déterminées par les hommes de l’art.
Plus précisément, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression des gènes codant pour l’interleukine 29, l’interleukine 28A et l’interleukine 28B.
Ainsi, pour la première fois, un composé thérapeutique permettant d’activer la « voie de l’interféron III », c’est-à-dire un agent activateur de l’expression d’un ou plusieurs gènes codants pour des interférons de type III, est identifié. Il s’agit du premier composé présentant cette activité à être identifié.
Interférons de type III
Les Interférons de type III, aussi désignés interférons lambda (l), constituent la première ligne de défense d’un organisme humain ou animal face à une infection par des microorganismes pathogènes. Cette nouvelle famille d’interférons, décrite pour la première fois en 2003, comprend chez l’Homme les quatre protéines suivantes :
Interféron lambda-1 (IFN-lI ) ou interleukine 29 (IL-29),
Interféron lambda-2 (IFN-72) ou interleukine 28A (IL-28A),
Interféron lambda-3 (IFN-73) ou interleukine 28B (IL-28B),
Interféron lambda-4 (IFN-74).
Chez la souris, seules deux protéines appartenant à cette famille d’interférons III ont été jusqu’à présent identifiées (IFN-A2/IL-28A et IFN-A3/IL-28B).
Ces interférons de type III médient leurs effets via leur récepteur commun IFN-7R1 , aussi connu sous la dénomination IL-28RA. Un complexe hétéromérique se forme entre ce récepteur et le récepteur IL-10R2 pour lier des monomères d‘l FN-l (voir Donnelly & Kotenko, 2010, pour revue).
Au sens de la présente invention, on entend par « gène codant pour un interféron de type III » l’un des gènes suivants, ou leurs homologues :
Le gène codant pour IFN-lI ,
Le gène codant pour IRN-l2,
Le gène codant pour IRN-l3, et
Le gène codant pour IRN-l4,
tels que décrits dans les publications de Kotenko et al., 2003 et O’Brien et al., 2014.
II est entendu que les gènes cités ci-dessus sont les gènes humains, mais que si le diltiazem est utilisé dans une espèce animale différente, les gènes codant pour les interférons de type
III dont l’expression est activée par le diltiazem seront au moins un des gènes homologues de l’espèce en question.
Induction de l’expression de gènes ISG majeurs
L’exemple 1 de la présente demande démontre que le diltiazem induit l’expression de plusieurs gènes dits « interferon-stimulated » (ISG), et notamment les gènes « de l’immunité », suite à un traitement par voie apicale ou basolatérale.
Notamment, le diltiazem induit l’expression d’ISG bien décrites dans la littérature telles que IFI44L, IFIT2 OAS1 , IRF7, MX1 ou IFITM1.
Infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux Le récepteur IFN^RI est exclusivement exprimé par les cellules de type épithélial, limitant ainsi les effets des interférons de type III aux épithéliums.
Lors d’infections par des pathogènes externes, les épithéliums des tractus respiratoires et intestinaux sont les premiers organes touchés, du fait de leur contact direct, respectivement, avec l’air aspiré, et l’eau et la nourriture ingérés.
Ainsi, la présente invention concerne tout particulièrement le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
L’expression « infection par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux » doit se comprendre comme étant une infection générée par la présence d’au moins un microorganisme pathogène, ce microorganisme ayant infecté l’individu ou l’animal, ou étant susceptible d’infecter l’individu ou l’animal.
Il est en effet entendu que la présente invention concerne aussi bien la prévention et/ou le traitement des infections touchant les êtres humains (aussi désignés comme étant des « individus »), que des infections touchant des animaux, notamment des animaux d’élevage.
Le terme « prévention » désigne le fait d’empêcher, ou du moins de diminuer la probabilité d’apparition, d’une infection dans un organisme humain ou animal par au moins un microorganisme pathogène. Sous l’action des interférons de type III produits, les tissus de l’organisme et notamment les épithéliums deviennent plus résistants et sont plus à même de ne pas être infectées et/ou de limiter l’infection par ledit microorganisme.
Selon une mise en oeuvre particulière de l’invention, le diltiazem est utilisé en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux
Le terme « traitement » désigne le fait de combattre l’infection par au moins un microorganisme pathogène dans un organisme humain ou animal. Grâce à l’administration de diltiazem, le taux d’infection virale, bactérienne, fongique ou parasitaire dans l’organisme va peu à peu diminuer voire même disparaître complètement. Le terme « traitement » désigne aussi le fait d’atténuer les symptômes associés à l’infection (fièvre, fatigue...) et/ou le fait de prévenir/diminuer les risques de complications, notamment de surinfection. Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, le diltiazem est utilisé en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, caractérisée en ce que ledit au moins un gène est choisi parmi le gène codant pour l’interleukine 29, le gène codant pour l’interleukine 28A et le gène codant pour l’interleukine 28B.
Selon une mise en œuvre particulière, le diltiazem est utilisé en tant qu’agent activateur de l’expression des trois gènes codant pour l’interleukine 29, pour l’interleukine 28A et pour l’interleukine 28B.
Microorganismes pathogènes
Au sens de l’invention, l’expression « microorganismes pathogènes » désigne tout microorganisme apte à créer une maladie chez d'autres organismes, tel que chez l’homme ou les animaux. Cette expression inclut notamment les virus, bactéries, champignons, protozoaires, vers, et autres microorganismes unicellulaires pathogènes.
De façon préférée, le « microorganisme pathogène » est un microorganisme sensible à la réponse cellulaire de type « interféron III », c’est-à-dire un microorganisme dont l’infection cellulaire sera prévenue ou inhibée, totalement ou partiellement, par l’expression et la sécrétion de protéines de type interféron III.
Selon un aspect de l’invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme qui infecte spécifiquement les épithéliums des tractus respiratoires.
Selon un autre aspect de l’invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme qui infecte spécifiquement les épithéliums des tractus intestinaux.
Selon encore un autre aspect de l’invention, le microorganisme pathogène est un microorganisme capable d’infecter tout type d’épithéliums et notamment ceux des tractus respiratoires et intestinaux.
Selon un premier aspect de l’invention, l’infection est une infection virale, c’est-à-dire que le microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux est un virus. Les protéines appartenant à la famille des interférons de type III sont des acteurs essentiels dans la réponse anti-virale des épithéliums cibles des virus. Ainsi, un agent activateur de l’expression des gènes codant pour lesdites protéines interférons de type III permet de stimuler et d’optimiser la réponse anti-virale des épithéliums infectés.
Selon cet aspect, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un virus infectant les épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Au sens de l’invention, le terme « virus » inclut tout type de virus mais plus particulièrement les virus infectant les organismes eucaryotes vertébrés. Il peut s’agir de virus à ADN ou à
ARN. Dans le cadre de la présente invention, il s’agit plus particulièrement ici des virus infectant des organismes via les épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Selon un aspect particulier de l’invention, l’infection n’est pas une infection par un virus influenza.
L’utilisation thérapeutique de diltiazem pour traiter les infections par virus influenza a déjà été proposée dans les documents WO 2011/126071 et WO 2016/146836. Toutefois, le diltiazem est utilisé dans l’art antérieur pour son action sur les canaux calcium, et non pour son action activatrice de l’expression de gènes codant pour des interférons de type III.
Selon un aspect particulier de l’invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe I ayant un génome à ADN double brin. Ce groupe de virus comprend notamment les virus de l’ordre des Herpes, ceux de la famille des papillomavirus, ainsi que les polyomavirus et les poxviridae.
Selon un aspect particulier de l’invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe II ayant un génome à ADN simple brin, comprenant en particulier les virus de la famille des parvoviridae.
Selon un aspect de l’invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe III ayant un génome à ARN bicaténaire, comprenant en particulier les virus de la famille des rhéoviridae , tels que les rotavirus.
Selon un aspect de l’invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe IV présentant un génome à ARN monocaténaire à polarité positive. Ce groupe comprend notamment :
les virus de l’ordre des Nidovirales, tels que ceux de la famille des coronaviridae ; les virus de la famille des Caliciviridae, dont le virus de Norwalk ;
les virus de la famille des Flaviviridae, dont notamment le virus de la fièvre jaune, le virus du Nil occidental, le virus de l'hépatite C et le virus de la dengue ;
les virus de la famille des Picornaviridae, dont les poliovirus, les rhinovirus, et le virus de l'hépatite A ;
les virus de la famille des Togaviridae, dont le virus de la rubéole, le virus de la Ross River, le virus de Sindbis et le virus du Chikungunya.
Selon un aspect de l’invention, le microorganisme pathogène est un virus du groupe V ayant un génome à ARN monocaténaire à polarité négative (ssRNA). Ce groupe inclut notamment les virus de l’ordre des Mononegavirales, tels que :
les virus de la famille des Bornaviridae, dont les Bornaviridae,
les virus de la famille des Filoviridae , dont le virus Ebola et le virus Marburg, les virus de la famille des Paramyxoviridae , dont le virus de la rougeole, le virus ourlien des oreillons et les Flenipavirus,
les virus de la famille des Rhabdoviridae, dont le virus de la rage,
les virus de la famille des Arenaviridae, dont le virus de la fièvre de Lassa,
les virus de la famille des Bunyaviridae, dont les Flantavirus et le virus de la fièvre
Congo-Crimée,
les virus de la famille des Orthomyxoviridae.
Selon un aspect particulier de l’invention, le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV), le metapneumovirus humain (hMPV), le virus Nipah, les novovirus, le virus Swine fever, les adenovirus, les coronavirus, le virus Zika, le virus de la fièvre jaune, les rhéovirus, les rotavirus, le virus de la Dengue, et le virus West Nile.
Plus particulièrement, le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le metapneumovirus humain (hMPV).
Selon une mise en oeuvre particulière, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).
Plus particulièrement, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus respiratoire syncytial humain (hRSV). Selon une autre mise en œuvre, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus parainfluenza humain (hPIV).
Plus particulièrement, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le virus parainfluenza humain (hPIV).
Selon une mise en œuvre particulière, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par le métapneumovirus humain (hMPV).
Plus particulièrement, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par le métapneumovirus humain (hMPV).
Selon un deuxième aspect de l’invention, l’infection est une infection non virale. En particulier, le microorganisme pathogène peut être choisi parmi une bactérie, un champignon et un parasite.
Selon un aspect particulier de l’invention, le microorganisme pathogène est une bactérie.
Parmi les bactéries pathogènes, on peut citer notamment les bactéries des espèces suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes,
Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae
On peut citer également les bactéries spécifiques des infections intestinales telles que Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Selon un aspect particulier de l’invention, le microorganisme pathogène n’est pas une bactérie du genre Chlamydiae.
Selon un aspect particulier de l’invention, le microorganisme pathogène est une bactérie choisie parmi les espèces bactériennes suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Campylobacter spp., Salmonella spp. ,Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
Selon une mise en œuvre particulière, le microorganisme pathogène est une bactérie de l’espèce Pseudomonas aeruginosa.
Selon une mise en œuvre particulière, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par Pseudomonas aeruginosa.
Plus particulièrement, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par Pseudomonas aeruginosa.
Selon un aspect particulier de l’invention, le microorganisme pathogène est un champignon.
Parmi les champignons pathogènes on peut citer notamment Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Pneumocystis jiroveci, Fusarium solari.
Selon une autre mise en œuvre, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par un microorganisme pathogène choisi parmi le groupe suivant : Pseudomonas aeruginosa , le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le metapneumovirus humain (hMPV).
Plus particulièrement, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par un microorganisme pathogène choisi parmi le groupe suivant : Pseudomonas aeruginosa, le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), les virus parainfluenza (hPIV) et le metapneumovirus humain (hMPV).
L’expression « au moins un microorganisme pathogène » signifie qu’un ou plusieurs microorganismes pathogènes sont présents dans l’organisme infecté, générant ainsi une réponse immunitaire de l’organisme.
En particulier, l’organisme peut avoir été infecté par à la fois un virus et une bactérie, ce qui est désigné comme étant une co-infection de l’organisme.
Selon un aspect particulier, l’invention concerne le diltiazem pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, caractérisé en ce que l’infection est une co-infection par au moins un virus et au moins une bactérie. Avantageusement, le diltiazem est alors utilisé pour le traitement concomitant d’une infection virale et d’une infection bactérienne, ce qui permet de limiter le nombre de composés actifs administrés à un individu ou un animal atteint de cette co-infection.
Plus particulièrement, cette co-infection pourra être liée à la présence dans les épithéliums infectés d’une combinaison de microorganismes pathogènes choisie parmi les suivantes :
Un virus respiratoire syncytial humain (hRSV) et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.
un virus parainfluenza (hPIV) et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae,
un metapneumovirus humain (hMPV) et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae,
un virus Nipah et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, un novovirus et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Campylobacter spp. Salmonella spp, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile,
un coronavirus et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, le virus Swine fever et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae,
un adenovirus et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, le virus Zika et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, le virus de la fièvre jaune et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae,
un rhéovirus et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, un rotavirus et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Campylobacter spp. Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile,
le virus de la Dengue et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae,
le virus West Nile et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, et Un virus influenza et au moins une bactérie d’une espèce choisie parmi Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae. Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, le diltiazem en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III sera utilisé pour à la fois :
i) Traiter une infection virale des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux; et
ii) Prévenir une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu’une surinfection bactérienne.
Selon une autre mise en œuvre particulière de l’invention, le diltiazem en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III sera utilisé pour à la fois :
i) Traiter une infection bactérienne des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux ; et
ii) Prévenir une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu’une surinfection virale.
Selon une autre mise en œuvre particulière de l’invention, le diltiazem en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III sera utilisé pour à la fois :
i) Traiter une infection virale des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux; et
ii) Traiter une co-infection par au moins un autre microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, telle qu’une surinfection bactérienne.
Combinaisons thérapeutiques
La présente invention concerne également le diltiazem pour son utilisation thérapeutique telle que présentée précédemment, caractérisé en ce qu’il est utilisé en combinaison avec au moins un autre agent actif, c’est-à-dire avec un ou plusieurs agents actifs.
De préférence, cet autre agent actif est un composé thérapeutique ayant une action bénéfique sur un organisme humain ou animal, dans le but de prévenir ou traiter une pathologie. Cet autre agent actif sera en particulier choisi parmi un composé anti-viral, un composé anti- bactérien, un composé anti-parasitaire, un composé anti-fongique, et un vaccin préventif ou thérapeutique.
De manière préférée, cet autre agent actif est choisi parmi un composé antiviral et un composé anti-bactérien.
Au sens de l’invention, on entend par « composé antiviral » un composé ayant soit une action inhibitrice directe sur au moins un virus (par exemple, inhibant sa réplication), soit une action sur une cellule cible du virus (par exemple, en induisant un état cellulaire défavorable à une infection virale, prévenant ainsi l’infection virale).
Les agents anti-viraux sont classifiés en différentes catégories en fonction de leur mode d'action. On peut citer notamment :
- les analogues de nucléotides, qui interfèrent ou stoppent la synthèse d'ADN ou d'ARN ; ainsi que les inhibiteurs des enzymes impliquées dans la synthèse d’ADN ou d’ARN (hélicase, réplicase) ;
- les composés qui inhibent les étapes de maturation du virus au cours de son cycle de réplication ;
- les composés qui interfèrent avec la liaison à la membrane cellulaire, ou à l’entrée des virus dans des cellules hôtes (Inhibiteurs de fusion ou d'entrée) ;
- les agents qui empêchent le virus de s’exprimer au sein de la cellule hôte après son entrée, en bloquant son désassemblage au sein de la cellule ;
- les agents qui restreignent la propagation des virus vers d’autres cellules.
En particulier, le ou les agent(s) antiviral(aux) est(sont) choisi(s) parmi :
i) des agents viraux ayant une action inhibitrice directe sur les virus, tels que par exemple la ribavirine et le favipiravir ;
ii) des agents actifs induisant des états cellulaires globalement défavorables à une infection virale ; et
iii) des composés choisis parmi les composés suivants:
• des analogues de 2-desoxyuridine substituée ;
• des analogues de nucléosides ;
• des analogues de pyrophosphate ;
• des inhibiteurs de protéases ;
• des inhibiteurs de la pénétration d’un virus dans les cellules, tel que par exemple l’arbidol ; • des anticorps monoclonaux, comme par exemple le palivizumab, dirigé contre un épitope du site antigénique A de la protéine de fusion du virus respiratoire syncytial (VRS) ; et
• des oligonucléotides antisens ayant une action inhibitrice des virus.
Au sens de l’invention, on entend par « composé anti-bactérien » un composé ayant une activité anti-bactérienne, c’est-à-dire inhibant la réplication des bactéries (composés bactériostatiques) ou les détruisant (composés bactéricides) ou encore en inhibant leur biosynthèse et/ou sécrétion de produits toxiques. Il s’agit en particulier des antibiotiques.
En particulier, le ou les agent(s) anti-bactérien(s) est(sont) choisi(s) parmi :
i) les antibiotiques, et notamment ceux de la famille des macrolides, et tout particulièrement la roxythromycine ;
ii) les bactériophages, prédateurs naturels des bactéries.
De tels agents anti-viraux et anti-bactériens sont disponibles dans le commerce, et leurs conditions d’utilisation sont décrites dans des ouvrages de référence comme Le Dictionnaire Vidal.
Selon un autre aspect de l’invention, l’autre agent actif utilisé en combinaison avec le diltiazem est un composé anti-fongique ou un composé anti-parasitaire, notamment choisis parmi les composés anti-fongiques systémiques (amphotéricine B, azolés, echinocandines) et les composés anti-parasitaires systémiques (par exemples les antipaléudéens, antiamibiens, toxoplasmose, leishmaniose, pneumocytose, antihelminthique).
Selon une mise en oeuvre particulière de l’invention, l’au moins autre agent actif est un vaccin.
Au sens de l’invention, on entend par « vaccin » un composé ou une combinaison de composés permettant de stimuler de manière spécifique le système immunitaire d’un organisme humain ou animal. Un vaccin comprendra en particulier un antigène, c’est à dire un composé induisant une réponse immunitaire spécifique dans l’organisme, qui en conservera la mémoire.
Un tel vaccin pourra être de type vaccin préventif, c’est-à-dire destiné à stimuler une réponse immunitaire spécifique avant l’infection d’un organisme par un microorganisme pathogène.
De manière non limitative, on peut citer à titre d’exemples différents types de vaccins, classifiés selon la nature des antigènes à partir desquels ils sont préparés. Les antigènes utilisés de manière classique sont les suivants : les agents infectieux inactivés, les agents vivants atténués, les sous-unités d’agents infectieux, les anatoxines, les vecteurs viraux exprimant des antigènes issus des pathogènes, des vecteurs portant des acides nucléiques (ADN ou ARN), et des anticorps.
Un tel vaccin pourra également être de type vaccin thérapeutique, c’est-à-dire destiné à stimuler une réponse immunitaire spécifique de manière concomitante avec l’infection d’un organisme par un microorganisme pathogène.
Dans tous les cas, il est entendu que ce vaccin pourra être administré avant, pendant ou après le traitement avec du diltiazem.
Enfin, selon un aspect particulier de l’invention, tous les agents actifs cités ci-dessus pourront être utilisés en combinaison les uns avec les autres, par exemple des combinaisons de type :
diltiazem, composé anti-viral et composé anti-bactérien,
diltiazem, composé anti-viral et composé anti-parasitaire,
dilitiazem, composé anti-bactérien et composé anti-fongique,
diltiazem et vaccin préventif ; ou encore
- diltiazem et vaccin thérapeutique,
pourront être administrées de manière concomitante ou séquentielle à un individu ou un animal présentant une infection, par un ou plusieurs microorganismes pathogènes, des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Composition pharmaceutique ou vétérinaire
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
Plus précisément, cette composition selon l’invention comprendra du diltiazem ainsi qu’un véhicule pharmaceutique approprié, et optionnellement un autre agent actif.
Le terme « véhicule pharmaceutique approprié » désigne des véhicules ou des excipients pharmaceutiquement acceptables, c'est à dire des véhicules ou des excipients dont l'administration à un individu ou un animal ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs, et qui sont bien connus de l'homme du métier.
Cette composition selon l’invention pourra être adaptée pour tout type d’administration et notamment pour une administration orale, sublinguale, nasale et/ou buccale par inhalation, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, oculaire ou rectale.
Les formes galéniques d'administration appropriées pourront par exemple être les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou les suspensions.
Selon un aspect particulier, la composition pharmaceutique ou vétérinaire est caractérisée en ce qu’elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation, c’est-à-dire par les voies nasale et/ou buccale.
L’inhalation désigne l'absorption par les voies respiratoires. Il s’agit une méthode d'absorption de composés thérapeutiques sous forme de gaz, de micro-gouttelettes ou de poudre en suspension.
On distingue deux types d’administration par inhalation :
• l'administration par insufflation lorsque les compositions sont sous la forme de poudres, et
• l'administration par nébulisation lorsque les compositions sont sous la forme d'aérosols (suspensions) ou sous la forme de solutions, par exemple de solutions aqueuses, mises sous pression. L’utilisation d’un nébuliseur ou d’un pulvérisateur sera alors recommandée pour administrer la composition pharmaceutique ou vétérinaire.
La forme galénique appropriée pour une administration de diltiazem par inhalation est choisie parmi : une poudre, une suspension aqueuse de gouttelettes ou une solution sous pression.
Selon un aspect de l’invention, la composition pharmaceutique ou vétérinaire comprend une quantité efficace de diltiazem, pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
L’Homme du métier saura, de par ses connaissances générales, aisément identifier la quantité efficace de diltiazem qui devra être administrée pour obtenir une action sur l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également un produit de combinaison comprenant : du diltiazem en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, et
au moins un autre agent actif choisi parmi un composé anti-viral, un composé anti-bactérien, et un agent de prévention des infections par des microorganismes pathogènes,
pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle pour prévenir et/ou traiter une infection par des microorganismes pathogènes des épithéliums respiratoires et/ou intestinaux.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d’une infection chez un individu infecté ou susceptible d’être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l’administration de diltiazem à cet individu, pour activer l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d’une infection chez un individu infecté ou susceptible d’être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l’administration de diltiazem à cet individu, le diltiazem étant utilisé en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III.
La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d’une infection chez un animal infecté ou susceptible d’être infecté par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux, comprenant l’administration de diltiazem à cet animal, pour activer l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III.
Cette administration de diltiazem sera réalisée, de façon préférée, par inhalation.
EXEMPLES
Il est entendu que les exemples présentés dans cette section ne sont en aucun cas limitatifs, et qu’ils ne font qu’illustrer l’invention telle que décrite précédemment.
Exemple 1. Caractérisation par RNAseq et RT-qPCR de l’induction par le diltiazem de l’expression des gènes de l’interféron de type III.
A- Diltiazem appliqué au pôle basolatéral des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) et maintenus en culture à l’interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, ont été traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral. Le traitement au diltiazem a été répété pendant 3 jours consécutifs (3 administrations au total).
Les épithéliums traités et non traités ont ensuite été lysés avec 150 pL de tampon RLT (Qiagen). L’ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur.
Des banques d’ADNc ont été préparées à partir de 200 ng d’ARN total en utilisant le kit Scriptseq™ complété Gold kit-Low Input (SCL6EP, Epicentre) selon les instructions du fournisseur. Chaque banque a été amplifiée, quantifiée et indexée avec des amorces fournies dans le kit ScriptSeq™ Index PCR Primers kit (RSBC10948, Epicentre) et séquencée. Le séquençage a été mené sur un système Illumina HiSeq 2500 avec un minimum requis de 40 millions de « reads » séquencés par échantillons.
Le démultiplexage des données et la conversion des fichiers BCL issus du séquençage en fichiers FASTQ ont été réalisés à l'aide de l'outil d'Illumina bcl2fastq, dans sa version 1.8.4. Le logiciel FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) a permis d'effectuer les contrôles qualité nécessaires sur les données brutes. Le « trimming » a été réalisé avec l'outil Trimmomatic, avec un seuil de qualité minimum égal à Q30. Un pseudo- alignement des reads trimmés sur le génome humain (Homo Sapiens : GRCh38.p1 1 ) par le logiciel Kallisto a été réalisé, suivi d'une analyse statistique utilisant le logiciel R 3.3.1 et le package EdgeR 3.14.0.
Le différentiel d'expression des gènes entre les cellules des épithéliums traités par le diltiazem et les cellules des épithéliums témoins, a été calculé à l'aide d'un modèle linéaire avec une correction de la p valeur par la méthode Benjamini-Hochberg.
Seuls les gènes arborant un différentiel d'expression supérieur ou égal à 2, et une p valeur corrigée inférieure à 0.05, ont été considérés dans la suite de l'analyse.
Ces gènes ont été soumis à des analyses d'enrichissement fonctionnel par l'outil DAVID 6.8 ainsi qu'à des études d'association et d'interaction par l'outil STRING.
Sont représentés en figure 1A les ratios d'expression des gènes interféron de type III IFN-lI , IRN-l2 et IFN-lO observés entre les épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem et les épithéliums respiratoires humains témoins non traités. Sont représentés en figure 1 B les ratios d'expression des gènes de réponse à l’interféron de type III tels que IFI44L, IFIT1 , IFIT2, IFIT3, IFITM1 , ISG15, MX1 , MX2, OAS1 , OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 et STAT1 observés entre les épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem et les épithéliums respiratoires humains témoins non traités.
Il apparaît clairement que le traitement par le diltiazem d’épithéliums respiratoires humains reconstitués, pendant 3 jours, modifie significativement le niveau d’expression des gènes codant pour les interférons de type III IFN— l1 , IRN-l2 et IRN-l3, en l’augmentant significativement (de 100 à plus de 200 fois en comparaison avec les épithéliums témoins non traités). De plus, ce traitement stimule également très significativement l’expression de gènes de réponse aux interférons de type III tels que IFI44L, IFIT1 , IFIT2, IFIT3, IFITM1 , ISG15, MX1 , MX2, OAS1 , OAS2, OAS3, OASL, RSAD2 et STAT1 .
B- Diltiazem appliqué au pôle apical des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix)
Nous avons démontré ci-dessus qu’un traitement au diltiazem des épithéliums via le milieu basolatéral (mimant la délivrance per os en modèle murin et chez l’homme) induit l’expression de la voie IFN III.
L’objectif de cette expérience était de confirmer que cette induction par le diltiazem est également effective lorsque l’administration de la molécule se fait via le pôle apical des épithéliums, mimant le mode de délivrance via la voie intranasale in vivo.
La figure 1 C présente les résultats obtenus 24 heures après le traitement au pôle apical des modèles d’épithélium humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) avec du diltiazem, sur l’expression du gène IFNL1 (Interféron lambda I) endogène, en comparaison de celle endogène des épithéliums non traités (contrôle). La mesure a été réalisée par RT-qPCR.
Les résultats obtenus indiquent que le traitement des épithéliums respiratoires humains reconstitués par le diltiazem via leur pôle apical, induit une surexpression significative du gène IFNL1 , avec un ratio d’expression supérieur à 6 : 1 par rapport aux épithéliums contrôle (non traités).
Ces résultats nous permettent de confirmer que le diltiazem administré par le pôle apical des épithéliums respiratoires humains reconstitués (cette voie d’administration mimant in vitro une administration intranasale in vivo), active également la voie IFN III, de même que le traitement via le pôle basolatéral, qui reproduit l’administration per os in vivo. Exemple 2. Confirmation par Rt-qPCR de l’induction par le diltiazem de l’expression de 8 gènes associés à la réponse « Interféron de type III ».
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) ont été maintenus en culture à l’interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral. Le traitement au diltiazem a été répété pendant 3 jours consécutifs (3 administrations au total).
Les épithéliums traités et non traités ont ensuite été lysés avec 150 pL de tampon RLT (Qiagen). L’ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur. Après une étape de transcription inverse, une réaction de PCR quantitative en temps réel a été menée en utilisant le système StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) en plaque 96 puits.
Les amorces de PCR quantitative (GAPDH: Hs02758991_g1 , IFNL1 : Hs00601677_g1 , IFNL2: Hs00820125_g1 , IFIT1 : Hs01675197_m1 , IFIT2: Hs00533665_m1 , IFIT3: Hs00382744_m1 , IFI27: Hs01086373_g1 , IFI44L: Hs00915292_m1 , IFITM1 : Hs01652522_g1 ) et les sondes (TaqMan gene expression assays) ont été fournies par Thermo Fisher Scientific.
Chaque échantillon a été analysé en triplicat et les « cycle threshold » (Ct) ont été normalisés par rapport à la référence GAPDH.
Les ratios d’expression des gènes IFIT1 , IFIT2, IFIT3, IFI27, IFN-lI , IFN-72„ IFI44L et IFITM1 entre les cellules traitées par le diltiazem et les cellules non traitées, ont été déterminés par la méthode 2AACt method (Livak and Schmittgen, 2001 ).
La figure 2 présente les résultats obtenus : après le traitement par le diltiazem, les épithéliums reconstitués présentent une augmentation significative de l’expression des gènes IFIT1 , IFIT2, IFIT3, IFI27, IFN-lI , IFN-72, IFI44L et IFITM1 en comparaison des épithéliums non traités.
Exemple 3. Mesure par dosage ELISA de la sécrétion, stimulée par le diltiazem, de l’Interféron de type III lambda 1 (IL-29).
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) ont été maintenus en culture à l’interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral. Le traitement au diltiazem a été répété pendant 3 jours consécutifs (3 administrations au total).
Les niveaux de sécrétion (pg/mL) d’interféron lambda 1 (IL-29) aux pôles apical et basolatéral des épithéliums respiratoires humains traités et non traités au diltiazem, ont été mesurés par ELISA après 72h de traitement selon les instructions du fournisseur (#3570-1 H, Mabtech, Stockhom, Sweden).
La figure 3 présente les résultats obtenus : la sécrétion d’IFN-lI (IL-29) est très nettement augmentée au pôle apical suite à un traitement par le diltiazem via le milieu de culture des épithéliums ; une augmentation significative, mais moins marquée, est également observée au pôle basolatéral des épithéliums traités.
Exemple 4. Le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication du virus syncytial respiratoire.
A- Résultats in vitro
Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) ont été maintenus en culture à l’interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, et ont été infecté par du virus syncytial respiratoire (souche Long, ATCC VR-26) à une multiplicité d’infection (MOI) 1 , puis traités ou non au diltiazem (90 pM) via leur milieu de culture à leur pôle basolatéral. Le traitement au diltiazem a été effectué à 5 heures post- infection, puis répété pendant 3 jours consécutifs (4 administrations au total).
A 6 jours post-infection, les prélèvements au pôle apical des épithéliums infectés traités et non traités, ainsi que les épithéliums en tant que tel, ont été lysés avec 150 pL de tampon RLT (Qiagen). Le processus de l’expérimentation est schématiquement représenté en figure 4A.
L’ARN total a été extrait par utilisation du kit RNeasy (Qiagen), selon les instructions du fournisseur, pour une quantification du nombre de copie de génome viral (gène F) par RT- qPCR au pôle apical, c’est-à-dire dans le surnageant (Figure 4B), ainsi que dans les épithéliums (Figure 4C).
Les figures 4B et 4C montrent que lorsque les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été traités en post-infection avec du diltiazem (90 pM) via leur pôle basolatéral, la quantité de génome viral est bien inférieure à la fois dans le surnageant de culture (figure 4B) et dans l’épithélium (figure 4C) par rapport aux épithéliums non traités. Le diltiazem a donc un effet antiviral significatif contre le virus syncytial respiratoire en modèle d’épithéliums respiratoires humains reconstitués.
B- Résultats in vivo
Le traitement au diltiazem (per os) réduit la réplication du virus syncytial respiratoire (VRS) en modèle de souris BALB/c après challenge infectieux.
La figure 4D représente schématiquement la chronologie de l’infection et des traitements des souris :
des souris BALB/c ont été randomisées en 3 groupes de 5 individus puis infectées par voie intranasale avec 50 pL d’une suspension virale contenant 5x105 PFU de VRS (Jour 0). Six heures avant infection, les souris ont été traitées avec soit 40 mg/kg de Ribavirine intra-péritonéale (VRS RIB), soit 50mg/kg de diltiazem per os (VRS DIL), ou PBS (VRS PBS) comme contrôle négatif.
Les mêmes traitements ont été répétés toutes les 24h, avec un total de 3 traitements pour la Ribavirine et 5 traitements pour le diltiazem ou le PBS.
- Au jour 5 post-infection (J5, correspondant au pic de réplication virale), les souris de chaque groupe ont été euthanasiées et leurs poumons ont été récupérés aseptiquement pour mesurer leurs titres viraux pulmonaires par RTqPCR (gène F).
La quantification par RT-qPCR du nombre de copie de génome viral VRS (en quantifiant les copies du gène F) par rapport à la quantité totale d’ARN extrait des poumons à 5 jours après l’infection a été réalisée, et les résultats sont présentés en figure 4E.
Les animaux traités par le diltiazem (VRS DIL) présentent des titres viraux pulmonaires significativement réduits en comparaison à ceux des animaux du groupe contrôle (VRS PBS) et ceux des animaux du groupe traité à la ribavirine (VRS RIB).
Les tests statistiques suivants ont été utilisés : One-way ANOVA avec Bonferroni post-test pour comparer chaque virus à la condition mock (traitement PBS). * p < 0.05.
Le diltiazem a donc un effet antiviral significatif contre le virus syncytial respiratoire en modèle murin in vivo. Exemple 5. Le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication du virus parainfluenza de type 3
Le schéma expérimental est présenté en figure 5A. Les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été infectés par le virus parainfluenza humain de type 3 (souche C243 ATCC VR-93) à une MOI de 0, 1 , et le traitement du milieu basolatéral avec 90 pM diltiazem a été démarré 2 heures post-infection et poursuivi quotidiennement pendant 4 jours consécutifs. La résistance électrique trans-épithéliale (TEER), qui reflète l'intégrité de l'épithélium, a été mesurée une fois par jour à partir de 48 h post-infection jusqu’à 120 heures post-infection.
Des titres viraux infectieux apicaux (DITC50/mL) ont été déterminés dans des cellules LLC- MK2 à partir de lavages prélevés dès 48 h post-infection (hpi), et jusqu’à 120 hpi, comme cela est montré en figure 5A.
La figure 5B montre les résultats obtenus après réalisation de l’expérience suivante : à 96 et 120 hpi, les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités (images à gauche) et traités au diltiazem (images à doite) ont été observés au microscope. Les effets cytopathiques induits par le hPIV-3 étaient plus importants et facilement visibles au microscope dans les épithéliums respiratoires humains reconstitués non traités, contrairement à ceux traités par le diltiazem.
La figure 5C représente les valeurs de TEER en fonction du temps post-infection, mesurés sur des épithéliums respiratoires humains reconstitués :
non traités, non infectés ;
non traités, infectés par hPIV-3 ; et
- traités au diltiazem, infectés par hPIV-3.
Ces résultats démontrent qu’en l'absence de traitement, les valeurs de TEER diminuent fortement, à partir de 24 hpi, contrairement aux valeurs mesurées sur les épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, dont l’intégrité apparaît être d’avantage préservée.
La figure 5D présente les titres viraux mesurés (en LLC-MK2 (DITC50/mL) au cours du temps (de 48 à 120 hpi) à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités et non traités au diltiazem.
En l'absence de traitement, les titres viraux infectieux mesurés à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains reconstitués ont culminé à 72 h post-infection à une valeur de 108 DICT50/mL) et à 96h post-infection à une valeur de 107 DICT50/mL, contrairement à ceux des épithéliums respiratoires humains reconstitués traités au diltiazem, qui présentent des valeurs significativement plus réduites à 72 h post-infection (106 DICT50/mL) et à 96h post-infection (105 DICT50/mL). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au diltiazem réduit la réplication virale du hPIV-3 dans le modèle d’épithélium respiratoire humain reconstitué infecté.
Exemple 6. Le traitement au diltiazem réduit significativement la multiplication de la bactérie Pseudomonas aeruginosa
Le schéma expérimental est présenté en figure 6A.
Les épithéliums respiratoires humains reconstitués ont été prétraités 24 heures avant l'infection avec 90pM diltiazem en milieu basolatéral ou alternativement avec 10pL de 90pM diltiazem à la surface apicale, puis infectés par Pseudomonas aeruginosa (souche PAK) à une MOI de 1 et de nouveau traités par le diltiazem 2 heures après l'infection.
Les résultats sont présentés en figure 6B (pour le traitement baso-latéral) et 6C (pour le traitement à la surface apicale).
Dans le contexte du baso-latéral (n = 2), le nombre de bactéries recueillies à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains à 24 heures post-infection, était significativement plus faible que celui des bactéries recueillies à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en milieu baso-latéral (1 15 et 106 vs 76 et 106 UFC, respectivement, * p< 0,05).
Dans le contexte du traitement apical au diltiazem, un effet similaire sur Pseudomonas aeruginosa a été observé à 24 heures post-infection (n=2), avec une diminution significative des bactéries récoltées à la surface apicale des épithéliums respiratoires humains traités par le diltiazem en comparaison de ceux non traités (87 et 106 contre 63,5 et 106 UFC, respectivement).
Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au dilitiazem limite la réplication de Pseudomonas aeruginosa dans l’épithélium respiratoire humain. Exemple 7. Le traitement au diltiazem réduit significativement la multiplication du métapneumovirus humain (hMPV).
La réplication virale en modèles d’épithéliums humains reconstitués (MucilAir® FIAE, Epithelix) d’origine nasale a été étudiée, sur des épithéliums traités ou non par le diltiazem. Pour cela, (i) des photos de microscopie optique à fluorescence ont permis d’évaluer l’efficacité et la progression de l’infection et (ii) des quantifications du génome viral par RTqPCR ont été réalisées, d’une part au niveau du pôle apicale des épithélium (récolte à la surface) pour quantifier l’excrétion de la progéniture virale, et d’autre part dans les lysats totaux des cellules des épithéliums en point final Cour 5 post-infection) pour quantifier la réplication virale intracellulaire au sein de l’épithélium.
Le chronogramme de l’expérimentation est présenté dans la figure 7A.
Les épithéliums respiratoires humains (Mucilair, Epithelix) ont été infectés par un virus recombinant hMPV-GFP (souche C-85473) à une MOI de 0,1 , puis traités (via le milieu basolatéral des épithélium) ou non par 3 doses successives de diltiazem à 90pM à JO, J1 et J3 post-infection (3 épithéliums par condition).
Des observations en microscopie à épifluorescence ont été réalisées à J4 post-infection afin d’observer l’impact du traitement par le diltiazem sur la réplication virale (Figure 7B). En l’absence de traitement, une fluorescence correspondant à l’expression virale de la GFP, est observée à J4 post-infection dans la quasi-totalité de l’épithélium, alors qu’il n’y a que de très rares cellules fluorescentes dans les épithélium infectés et traités par le diltiazem à ce même temps post-infection.
Au jour 3 post-infection, un lavage au pôle apical des épithélium infectés traités ou non, a été réalisé afin de récolter la progéniture virale produite. L’ARN viral génomique a été extrait et quantifié par RT-qPCR (Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green, Thermo Fisher Scientific) à l’aide d’une gamme réalisée à partir d’un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d’ARN extrait (Figure 7C).
Les résultats de qPCR indiquent qu’une quantité très importante de génome viral est présente dans les surnageants au pôle apical récoltés à partir des épithéliums non traités. Cette quantification de génome virale reflète le niveau de production de progéniture virale suite à l’infection des épithéliums. En comparaison, la quantité de génome viral mesurée dans les surnageants au pôle apical récoltés à partir des épithéliums traités par le diltiazem est significativement inférieure (2 Iog10 ) (Figure 7C).
Au jour 5 post-infection, les cellules des épithéliums ont été récoltées et lysées pour en extraire l’ARN total. Les ARN totaux correspondants au gène viral N de hMPV ont été quantifiés par Rt-qPCR (Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green, Thermo Fisher Scientific), à l’aide d’une gamme réalisée à partir d’un plasmide contenant le gène N de HMPV. Les résultats sont exprimés en copies du gène N/pg d’ARN extrait (Figure 7D).
Les résultats de qPCR indiquent qu’une quantité très importante de génome viral est présente dans les épithéliums non traités. En revanche, la quantité de génome virale est de 4log10 inférieure dans les épithéliums traités avec le diltiazem. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le traitement au diltiazem réduit significativement la réplication virale de hMPV.
Exemple 8. Induction in vivo par le diltiazem de l’expression du gène IRN-l2 (IFNL2) mesurée par RT -qPCR
La figure 8A représente schématiquement la chronologie des traitements par instillation intranasale (i.n.) des souris BALB/c : les souris ont été traitées (20 mg/kg) ou non (groupe contrôle PBS « mock-traité ») au jour 0 (JO), puis traitées ou non soit quotidiennement les deux jours suivants (JO, J1 et J2), soit toutes les 48 heures jusqu’au jour 4 (JO, J2 et J4). A J5, les cavités nasales ont été prélevées après euthanasie des animaux.
L’ARN total a été extrait à partir des prélèvements par utilisation du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur. Après une étape de transcription inverse, une réaction de PCR quantitative en temps réel a été menée en utilisant le système StepOnePlus™ Real- Time PCR System (Applied Biosystems), selon le protocole décrit dans la publication (Galani et al. Immunity 2017).
L’expression du gène IRN-l2 (IFNL2) a été mesurée par RT-qPCR, et est représentée par rapport au niveau basal (égal à 1 ) mesure sur des souris non traitées (Mock-traité) en figure 8B.
Ces résultats nous permettent de confirmer que le diltiazem administré par voie intranasale en modèle murin active également la voie IFN III, tout comme le traitement per os.
REFERENCES
BREVETS
WO 02/094238
US 4,605,552
WO 87/07508
WO 201 1/066657
WO 201 1/126071
WO 2016/146836
EP 1 117 408
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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10.1016/j.immuni.2017.04.025.

Claims

REVENDICATIONS
1. Diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III.
2. Diltiazem pour son utilisation en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, dans la prévention et/ou le traitement des infections par au moins un microorganisme pathogène des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
3. Diltiazem pour son utilisation selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit au moins un gène est choisi parmi le gène codant pour l’interleukine 29, le gène codant pour l’interleukine 28A et le gène codant pour l’interleukine 28B.
4. Diltiazem pour son utilisation selon l’une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l’infection n’est pas une infection par un virus influenza.
5. Diltiazem pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est un virus choisi parmi le virus respiratoire syncytial humain (hRSV), les virus parainfluenza (hPIV), le metapneumovirus humain (hMPV), le virus Nipah, les novovirus, les coronavirus, le virus Swine fever, les adenovirus, le virus Zika, le virus de la fièvre jaune, les rhéovirus, les rotavirus, le virus de la Dengue, et le virus West Nile.
6. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).
7. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est un virus parainfluenza (hPIV).
8. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est un metapneumovirus (hMPV).
9. Diltiazem pour son utilisation selon l’une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est choisi parmi une bactérie, un champignon et un parasite.
10. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 9 caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est une bactérie choisie parmi les espèces bactériennes suivantes : Enterococcus faecalis, Borrelia burgdorferi, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium difficile.
1 1 . Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 10, caractérisé en ce que le microorganisme pathogène est la bactérie Pseudomonas aeruginosa.
12. Diltiazem pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 1 1 , caractérisé en ce que l’infection est une co-infection par au moins un virus et au moins une bactérie.
13. Diltiazem pour son utilisation selon l’une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu’il est utilisé en combinaison avec au moins un autre agent actif.
14. Diltiazem pour son utilisation selon la revendication 13, caractérisé en ce que cet autre agent actif est choisi parmi un composé anti-viral, un composé anti- bactérien, un composé anti-parasitaire, un composé anti-fongique, et un vaccin préventif ou thérapeutique.
15. Composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant du diltiazem en tant qu’agent activateur de l’expression d’au moins un gène codant pour un interféron de type III, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des infections par des microorganismes pathogènes des épithéliums des tractus respiratoires et/ou intestinaux.
16. Composition pharmaceutique ou vétérinaire pour son utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce qu’elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration par inhalation.
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