FR2866031A1 - Chimere de virus pathogene emergent, medicament la contenant et utilisation en therapie antivirale - Google Patents

Abstract

Nouvelle méthode de thérapie antivirale. La présente invention concerne de nouvelles compositions pour la thérapie contre les maladies virales et leur utilisation. Elle concerne notamment des chimères virales caractérisées par la présence a) d'une capside et/ou d'une enveloppe lipidique intégrant tous les constituants d'un virus pathogène impliqués dans son tropisme cellulaire, et dans la pénétration de son génome, b) d'un génome phylogéniquement proche de celui du virus pathogène, et défectif de telle manière qu'il rend la chimère seule incapable d'engendrer la synthèse des polypeptides issus de son génome, c) d'un génome tel que le virus pathogène associé ait la capacité de servir de virus helper in vivo ou ex vivo pour la dite chimère, et tel que la présence du virus pathogène associé catalyse les dites synthèses issues du génomes de la chimère mentionnées en b), une fois les mêmes cellules coinfectées par le virus pathogène et la chimère, d) d'un génome renfermant une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour un ou plusieurs polypeptides impliqués dans l'antigénicité du virus pathogène et contenant un ou plusieurs épitopes identiques à ceux contre lesquels un ou plusieurs vaccins connus dirigent l'immunité, et/ou codant pour un ou plusieurs polypeptides ayant une activité antivirale. L'invention est particulièrement destinée au domaine thérapeutique, pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées à être administrées aux malades souffrant d'une maladie virale.

Description

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La présente invention concerne de nouvelles compositions et méthodes pour la thérapie contre les maladies virales. Elle concerne notamment des chimères virales, employées dans le dessein de modifier l'information génétique virale pathogène codant pour les déterminants antigéniques viraux présente dans les cellules infectées. Les chimères virales selon l'invention sont préférentiellement caractérisées par la présence a) d'une capside et/ou d'une enveloppe lipidique intégrant les constituants du virus pathogène responsables de la reconnaissance spécifique des récepteurs membranaires des cellules infectées, ainsi que tous les autres constituants viraux indispensables à la pénétration du génome viral pathogène dans les cellules infectées, ou ceux d'un virus d'une souche apparentée au virus pathogène, développant le même tropisme cellulaire, b) d'un génome défectif phylogéniquement proche de celui du virus pathogène, issu d'une construction génétique telle qu'il rend la chimère seule incapable d'engendrer la synthèse des polypeptides issus de son génome, c) d'un génome issu d'une construction génétique telle que le virus pathogène ait la capacité de servir de virus helper in vivo ou ex vivo pour la dite chimère, et tel que la présence du virus pathogène catalyse les dites synthèses mentionnées en b), une fois les mêmes cellules coinfectées par le virus pathogène et la chimère, d) d'un génome issu d'une construction génétique telle qu'il renferme une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour un ou plusieurs polypeptides impliqués dans l'antigénicité du virus pathogène et contenant un ou plusieurs épitopes identiques à ceux contre lesquels un ou plusieurs vaccins connus dirigent l'immunité.

L'invention concerne par ailleurs l'utilisation des chimères définies cidessus au sein d'une préparation pharmaceutique adéquate, pour traiter les maladies virales humaines ou les pathologies virales atteignant tout autre organisme dont l'immunité est stimulable par un vaccin. L'invention couvre également un procédé de diagnostic des infections virales.

L'invention peut être utilisée notamment dans le domaine thérapeutique, pour la 25 préparation de compositions pharmaceutiques et de médicaments destinées à être administrées aux malades souffrant d'une maladie virale.

Les virus sont à l'origine de maladies contre lesquelles il n'existe que peu de techniques médicales curatives et en particulier que peu de médicaments curatifs. La chimiothérapie antivirale, essentiellement fondée sur l'usage des analogues nucléosidiques, qui perturbent la synthèse des acides nucléiques viraux par les polymérases virales ou les transcriptases inverses, est peu efficace, et n'est active que contre un petit nombre de virus. Et cela, étant donné que la réplication virale est un processus si intimement lié à la machinerie cellulaire, que les composés chimiques inhibant la réplication virale engendrent rapidement une toxicité pour les cellules, et entraînent des effets secondaires limitant leur utilisation, dès lors que l'on utilise de tels composés à des doses assez suffisantes pour obtenir des effets significatifs contre les agents viraux pathogènes.

2866031 2 En outre, les virus peuvent développer une résistance contre de tels traitements, qui sont prompts à sélectionner des souches virales insensibles.

Les traitements les plus efficaces procèdent de ce fait d'une association médicamenteuse, combinant plusieurs substances contre lesquelles les virus possèdent une capacité globale 5 d'évolution insuffisante.

Néanmoins, il faut disposer de plusieurs médicaments dont l'effet est synergique, ce qui est rarement le cas, et même à ce stade, les multithérapies sont des traitements lourds, comme dans le cas des trithérapies dirigées contre le VIH (nécessité de prendre de nombreux médicaments dans la journée, le traitement est à vie et un nombre non négligeable de malades ne supportent pas les trithérapies).

De même, l'usage des interférons n'est que d'un rare secours, étant donné qu'à la réponse cellulaire contre l'infection virale, les virus ont codéveloppés au cours de leur évolution des mécanismes permettant d'inhiber soit la synthèse des interférons, soit les événements biochimiques qu'ils induisent; de ce fait, ils ne confèrent un réel bénéfice que dans le traitement de certaines hépatites chroniques.

Pour toutes ces raisons, les mesures les plus efficaces mises en oeuvre contre les maladies virales reposent surtout sur les politiques de prophylaxie.

L'arme cardinale pour limiter l'impact des maladies virales est constituée par les 20 campagnes de vaccination, lorsque cela est possible, c'est à dire lorsque l'on dispose de vaccins, sur des sujets sains.

Néanmoins, la protection conférée par les vaccins est circonscrite aux seules souches virales dont les déterminants atitigéniques sont identiques ou peu différents de ceux appartenant à la souche, ou aux souches vaccinales qui ont été utilisées pour la fabrication des dits vaccins.

L'apparition d'une souche virale émergeante provenant de l'évolution naturelle des virus, ou engendrée par un acte de malveillance, et caractérisée par un remaniement majeur de ses déterminants antigèniques telle qu'elle échappe à l'immunité conférée par un vaccin dirigé contre un virus parent, limite le pouvoir prophylaxique global des vaccins.

Il subsiste donc toujours le danger d'apparition d'une pandémie liée à un réarrangement 30 majeur des antigènes d'une souche virale pathogène contre laquelle la protection conférée par un vaccin antérieur n'est plus efficace.

Dans un tel cas, en l'absence de vaccins, la médecine conventionnelle reste en général plutôt démunie, elle devient souvent symptomatique, et prophylactique, et se limite essentiellement à contrôler les modes de contamination, afin d'éviter la propagation de l'épidémie (mises en quarantaine, désinfections, campagnes d'information du public, recherche d'un réservoir animal éventuel susceptible de régénérer l'épidémie), selon des méthodes peu différentes de celles qui étaient appliquées au début du XXème siècle.

Un premier objet de la présente invention concerne le principe actif d'un médicament curatif et/ou prophylactique efficace axé spécifiquement contre un virus émergeant pathogène issus phylogéniquement d'un virus contre lequel il existait un ou plusieurs vaccins, et présentant un réarrangement antigénique, grâce auquel il échappe aux défenses immunitaires induites par les dits vaccins connus disponibles, ainsi qu'aux défenses immunitaires naturelles préexistant dans les populations.

Au sens de l'invention, le terme chimère désigne un virus obtenu artificiellement 10 renfermant des séquences nucléotidiques exogènes dans son génome, et/ou des délétions dans son génome, et/ou incorporant des molécules étrangères choisies par l'homme de l'art.

Au sens de l'invention, le terme gène désigne, de manière générale, toute séquence nucléotidique susceptible d'engendrer la formation d'un polypeptide. Il peut s'agir notamment 15 d'un ARN de polarité positive ou négative, d'un ADN, d'un ADN ou d'un ARN synthétique, etc. Au sens de l'invention, le terme virus émergeant désigne un virus issu phylogéniquement d'un virus parent contre lequel il existait un ou plusieurs vaccins, et caractérisé par un réarrangement antigénique, grâce auquel il échappe aux défenses immunitaires induites par les dits vaccins connus disponibles.

D'un point de vue génétique, et au regard de la vaccinologie, ce qui confer de prime abord sa dangerosité à un virus émergent est la cassure antigénique, c'est à dire l'absence d'information génétique au sein du génome du nouveau virus, codant pour les protéines antigéniques virales circulant auparavant dans la population, ou présente dans les souches virales ayant servi à la fabrication du ou des vaccins alors disponibles.

Un premier objet de la présente invention concerne la création d'une chimère apparentée à un virus émergeant, à partir des procédés conventionnels issus de la virologie moléculaire, de la microbiologie et des techniques du génie génétique connues par l'homme de l'art, développant le même tropisme cellulaire que le virus pathogène, de telle manière à ce que la dite chimère puisse servir de vecteur spécifique contre les cellules infectées, tout en surajoutant à l'information virale présente dans les cellules infectées une information génétique supplémentaire provenant de son génome, codant pour les polypeptides responsables de l'antigénicité du virus pathogène, et emprunté à une ou plusieurs souches vaccinales utilisées pour la fabrication d'un vaccin contre un virus parent du virus émergeant.

La coinfection des mêmes cellules cibles par la chimère selon l'invention et le virus pathogène est susceptible d'engendrer une modification in vivo du phénotype du virus pathogène, impliquant une ou plusieurs altérations morphologiques du dit virus, fonction d'un ou de plusieurs vaccins connus, parmi lesquelles une ou plusieurs modifications de l'antigénicité du dit virus infectant, de telle manière à ce que la coinfection in vivo ou ex vivo des cellules cibles par la chimère et le virus responsable de la maladie engendre un glissement antigénique de la souche virale pathogène vers une ou plusieurs des souches vaccinales ayant servi à la fabrication du ou des dits vaccins connus disponibles.

Une telle chimère, ou plusieurs chimères différentes dont l'action conjointe est complémentaire, constituent le principe actif d'un médicament spécifique à l'infection virale dont 10 les dites chimères sont apparentées.

La vaccination générale de la population avec le vaccin disponible, puis parmi la population, l'administration aux personnes atteintes postérieurement par la maladie, d'une préparation pharmaceutique adéquate contenant la chimère ici décrite, elle-même fonction du dit vaccin, aura pour effet de transformer in vivo le nouveau virus en un virus exprimant les antigènes ou les épitopes vaccinaux de la souche, ou des souches ayant servi à la fabrication du vaccin disponible, suscitant une forte réaction immunitaire chez les sujets vaccinés avec le dit vaccin, contre le virus issu des cellules coinfectées par la chimère et le virus responsable de la maladie. Une telle réaction immunitaire est susceptible d'enrayer la propagation extracellulaire de l'infection.

La présente invention concerne donc aussi les préparations pharmaceutiques adéquates contenant une telle chimère, destinées à une thérapie antivirale suscitant une forte réponse immunitaire de l'hôte contre les nouveaux virus issus des cellules coinfectée par le virus pathogène et la chimère.

Une telle préparation pharmaceutique contenant la chimère ainsi construite, qui peut être fabriquée conjointement à la production du vaccin disponible, représente un médicament antiviral spécifique particulièrement utile contre un virus émergeant responsable d'une épidémie.

Un avantage de ce procédé est qu'il permet d'adjoindre à la fabrication du vaccin disponible la fabrication parallèle d'un principe actif fonction du dit vaccin contre un virus émergeant pandémique inconnu, et d'offrir une thérapie immédiatement disponible lors d'une éventuelle éruption d'une épidémie non vaccinale engendrée par un tel virus.

Une telle fabrication étant réalisable antérieurement à l'émergence virale, la thérapie ad hoc qui en découle permet de réduire la dangerosité d'une pandémie, et ce, jusqu'à la création d'un 35 nouveau vaccin efficace contre la souche responsable de la pandémie.

En outre, le glissement antigénique du virus pathogène vers la ou les souches vaccinales réduit ou annihile la contagiosité des malades vis à vis des autres personnes, si elles sont vaccinées 2866031 5 avec le vaccin dirigé contre le virus parent, ce qui contribue à restreindre le pouvoir de développement de la pandémie et à soulager les malades et les structures sanitaires des mesures d'isolement.

L'invention couvre également un procédé de diagnostic des infections virales, fondé sur la 5 mesure du taux des anticorps vaccinaux dans les liquides biologiques, après administration d'une composition pharmaceutique adéquate contenant la chimère selon l'invention.

Comme invoqué précédemment, un objectif de la présente invention est de pallier aux inconvénients des techniques médicales et du manque de médicaments contre les épidémies virales non vaccinales causées par un virus émergeant connus dans l'art antérieur, et de fournir des méthodes et des principes actifs de médicaments efficaces axés spécifiquement contre ces dits virus.

Un premier objet de l'invention réside dans la création d'une chimère apparentée au virus émergeant pathogène, fonction d'un ou de plusieurs vaccins connus, dans le dessein de lutter 15 contre la maladie causée par celui-ci, et dont la structure est typiquement caractérisée par: 1) une capside et/ou une enveloppe lipidique intégrant les constituants du virus pathogène responsables de la reconnaissance spécifique des récepteurs membranaires des cellules infectées, ainsi que tous les autres constituants viraux indispensables à la pénétration du génome viral pathogène dans les cellules infectées, ou ceux d'un virus d'une souche apparentée au virus pathogène, développant le même tropisme cellulaire.

2) un génome défectif phylogéniquement proche de celui du virus pathogène, issu d'une construction génétique telle qu'il rend la chimère seule incapable, après pénétration dans les cellules cibles, d'engendrer la synthèse des polypeptides issus de son génome, 3) un génome issu d'une construction génétique telle que le virus pathogène ait la capacité de servir de virus helper in vivo ou ex vivo pour la dite chimère, et tel que la présence du virus pathogène catalyse les dites synthèses mentionnée en 2), une fois les mêmes cellules coinfectées par le virus pathogène et la chimère, 4) un génome issu d'une construction génétique telle qu'il renferme une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour un ou plusieurs polypeptides impliqués dans l'antigénicité du virus pathogène et contenant un ou plusieurs épitopes identiques à ceux contre lesquels un ou plusieurs vaccins connus dirigent l'immunité.

Il est aussi possible de remplacer les constituants évoqués en 1) par ceux d'une souche virale distincte et non apparentée au virus infectant, pour la création d'une chimère, dès lors que cette souche comporte des constituants lui conférant un tropisme cellulaire proche de celui du virus pathogène. l'on peut construire un virus incorporant tout ou partie des constituants responsables du tropisme cellulaire de l'infection. En outre, l'invention concerne aussi l'utilisation d'une chimère comportant des polypeptides synthétiques construits par fusion de plusieurs parties de gènes différents codant pour des protéines virales appartenant à des espèces virales distinctes, et qui confèrent à la chimère le même tropisme cellulaire que celui du virus pathogène.

Arrière plan technologique de l'invention L'ingénierie génétique des génomes viraux est connue. Elle a permis d'obtenir des chimères virales, c'est à dire d'obtenir des virions défectifs, renfermant des séquences nucléotidiques exogènes, ou incorporant des molécules étrangères choisies par l'homme de l'art, et a été réalisée sur de nombreuses souches de virus appartenant à des espèces très différentes.

Les techniques et les stratégies utilisées pour l'obtention de chimères virales sont nombreuses et variées. Les virus à ADN, tel que le virus SV40, furent les premiers virus dont le génome put être cloné et manipulé par génie génétique. La séquence, la structure, le mode de réplication et de transcription du génome de SV40 une fois connue, et la carte de restriction du génome établie, la stratégie pour l'obtention de virions recombinants fut de fabriquer une ADN copie du génome viral (ADNc), puis de manipuler l'ADNc selon les techniques de routine du génie génétique, techniques qui permirent d'engendrer des virus infectieux après transfection de l'ADNc dans des cellules adéquates, incorporant des mutations définies (Goff, S. P. & Berg, P. (1976) Cell 9, pp. 695-705). SV40 fut dès lors utilisé opportunément comme un outil de clonage dans les cellules eucaryotes.

Une stratégie de recombinaison homologue concernant les virus à ADN de plus grand génome fut ensuite développée dans le même dessein. La technique consista à cotransfecter dans des cellules un génome viral intact (tel celui du virus de l'herpès) et un ADNc du génome viral dans lequel un gène exogène avait été intégré. Des recombinaisons intracellulaires homologues spontanées peuvent alors survenir entre l'ADNc cloné et l'ADN viral, conduisant à la formation de mutants qu'il est possible de sélectionner dans certaines conditions. Ainsi, des virus de l'herpès recombinants contenant le gène de la thymidine kynase peuvent être sélectionnés sur certaines lignées cellulaires et dans certains milieux, et les virus ne contenant pas le gène de la thymidine kynase peuvent être isolés en présence d'analogues de la thymine (Post, L. E. & Roizman, B. R. (1981) Gel! 25, pp. 227-232).

Des techniques identiques furent développées pour les adénovirus (Jones, N. & Shenk, T. (1978) Cell 13, pp. 181-188), les parvovirus (Samulski, R. J., Chang, L. & Shenk, T. (1989) J. Virol. 63, pp. 3822-3828), et les poxvirus (Mackett, M., Smith, G. L. & Moss, B. (1982) Froc. Natl. Acad.Sci. USA 79, pp. 7415-7419).

2866031 7 Par extension de cette technique, il fut développé une stratégie pour intégrer des cosmides de génomes viraux contenant des gènes exogènes chevauchant les gènes viraux dans les cellules, permettant de se dispenser de la transfection d'ADN cloné. Cette technique est par exemple utilisée pour la formation de recombinants des virus de l'herpès simplex (Cunningham, C. & Davison, A. J. (1993) Virology 197, pp. 116-124) , des cytomégalovirus (Kemble, G., Duite, G., Winter, R., Spaete, R. & Mocarski, E. S. (1996) J. Virol. 70, pp 2044-2048), et du virus d'Epstein- Barr (Cohen, J. I., Wang, F., Mannick, J. & Kieff, E. (1989) Froc. Natl. Acad. Sci. USA 86, pp. 9558-9562).

Parmi les virus dont le génome est constitué d'un ou de plusieurs brins d'ARN positif, la recherche concernant les rétrovirus, dont la particularité est d'avoir un cycle de réplication passant obligatoirement par une phase d'ADN double brin, a permit le développement de techniques de génie génétique inverse, grâce à l'usage des rétrotranscriptases virales. La technique pour l'obtention d'un virus recombinant consiste à fabriquer par rétrotranscription un ADN de l'ARN viral, qui est ensuite aisément manipulable par les procédés classiques du génie génétique. La transfection de l'ADN manipulé dans les cellules conduit à son intégration dans les chromosomes cellulaires et à la formation de virions intégrant des séquences nucléotidiques choisies (Wei, C.-M., Gibson, M., Spear, P. G. & Scolnick, E. M. (1981) J. Virol. 39, pp. 935-944). Des lignées cellulaires d'encapsidation de génomes viraux remaniés au sein de virus tels que le VIII sont maintenant couramment utilisées. Il s'agit de cellules ayant été transduites avec des consts uctions génétiques engendrant l'expression constitutive des protéines nécessaires à la fabrication d'une particule rétrovirale et à son infectiosité. (Miller, A. D. 1990, Hum. Gene Ther. 1, pp. 5-14; Carroll, et al, 1994, Journal of Virology, 68, pp. 6047-6051; Corbeau et al, 1996, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 93, pp. 14070-14075; Srinivasakumar et al, Journal of Virology, 71, pp. 5841-5848; Yu et al, 1996, Journal of Virology, 70, pp. 4530-4537) Les virus à ARN positif autre que les rétrovirus, dont le génome sert d'ARNm, peuvent aussi être complémentés par un ADNc obtenu par génie génétique inverse, et l'ADNc seul transfecté dans les cellules induit la formation de virions, comme dans le cas du virus de la poliomyélite (Racaniello, V. R. & Baltimore, D. (1981) Science 214, pp. 916-918). Il fut démontré par la suite que le virus de la poliomyélite pouvait exprimer n'importe quelle protéine étrangère si les acides aminés en position N et C terminales n'interférait pas dans les mécanismes de clivage viraux intracellulaires (Donna C. Porter et al, Casey D. Morrow, Journal of vrology, Mar. 1995 et avril 1996).

Les virus dont le génome est constitué d'un ou de plusieurs brins d'ARN négatif, c'est à dire les membres des familles Rhabclo-, Paramyxo-, Filo-, Borna-, Qrthomyxo-, Bunya- et Arenaviridae, sont aussi manipulables pour l'obtention de chimères virales. Etant donné que l'ARN viral seul transfecté dans une cellule n'est pas infectieux, et que l'initiation de la transcription et de la réplication virales nécessite la présence du complexe de la polymérase virale lié avec le génome, à partir de 1994 furent développées des techniques de génie génétique inverse qui permirent de générer des virions à partir d'ADNc cloné, et qui révolutionnèrent la recherche sur ces virus.

En 1989 fut développé le premier système pour modifier le génome du virus de la grippe (Luytjes et al., 1989; Enami et al., 1990; repris par GarciaSastre & Palese, 1993; Garcia-Sastre et al., 1994b; Palese, 1995; Palese et al., 1996; Neumann & Kawaoka, 1999).

Le virus de la grippe est un virus au génome segmenté, contenant huit brins d'ARN-. Le gène de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT) put être introduit dans le génome viral. Il fut cloné entre les séquences virales non codantes 5' et 3' dans un ADNc d'un segment d'ARN viral, contenant un promoteur pour l'ARN polymérase T7 et un site de restriction pour un enzyme de clivage permettant la formation d'extrémités 3' identiques à celles des brins viraux. La transcription in vitro, engendrant un ARN- synthétique modifié, puis le mélange avec les protéines de la polymérase virale et de la nucléocapside purifiées permirent de reconstituer le complexe ribonucléoprotéique du virus par autoassemblage. La transfection du complexe ribonucléoprotéique dans des cellules préinfectées avec un virus de la grippe servant de virus helper, délivrant l'information génétique manquante, engendre la formation de virions dont le génome est réarrangé spécifiquement par la présence du gène CAT, (Luytjes et al., 1989).

Pour éviter d'avoir a passer par l'étape de synthèse in vitro du complexe ribonucléoprotéique, qui nécessite la purification des protéines virales, une stratégie fondée sur la transfection de plasmides a été élaborée. Cette technique consiste à transfecter dans des cellules infectées par un virus de la grippe (servant de virus helper), cinq plasmides construit par génie génétique inverse; quatre contiennent respectivement les gènes codant pour les protéines du complexe ribonucléoprotéique (PA, NP, PBI et P132), dans des plasmides où ils sont sous la dépendance d'un promoteur de la polymérase H, et un plasmide obtenu par génie génétique inverse de l'un des brins choisis pertinemment parmi ceux du virus (par exemple le brin contenant le gène HA), manipulé et tel que le gène soit sous la dépendance d'un promoteur de la polymérase I, et contienne une séquence autocatalityque (dérivée par exemple du ribozyme du virus de l'hépatite A) .

Les quatre polypeptides synthétisés et l'ARN obtenu par l'activé de synthèse de la pol Il et l'activité de clivage du ribozyme s'autoassemblent et conduisent à la formation de virions par complémentation avec le virus helper.

L'insertion de gènes à l'intérieur du génome du virus de la grippe, par manipulation du gène HA, a permis de construire selon cette méthode des chimères virales exprimant des séquences antigèniques telles que celles présentes sur les protéines de l'enveloppe du virus du sida, d'autre souches grippales, ainsi que de nombreux autres épitopes exogènes, dans le dessein de synthétiser de nouveaux vaccins.

L'approfondissement de la technique de transfection des plasmides permit de dépasser la seule formation de virions recombinant dans un arrière fond de virus helper, et il fût possible d'engendrer des virus à partir de la seule présence d'ADN.

En 1994, le virus de la rage fut engendré uniquement à partir de fragments d'ADNc. Des virus de la rage recombinants furent construit à partir de la transfection d'un plasmide contenant le promoteur de la polymérase T7 et l'ADNc du génome viral manipulé, (transcrit en ARNm dans la cellule), dans des cellules infectées par un virus recombinant contenant le gène de la polymérase T7, et cotransfectées par des plasmides exprimant les gènes L, P, et N du virus de la rage, codant pour les constituants protéiques de la nucléocapside, sous le contrôle d'un promoteur T7 (Schnell, M. J., Mebatsion, T.&Conzelmann, K.-K. (1994) EMBOJ. 13, pp. 4195-4203).

Des chimères au tropisme cellulaire modifié vers les lymphocytes CD4 furent ainsi obtenues par fusion des séquences nucléotidiques de la protéine G et d'une protéine de l'enveloppe du VIH responsable de la reconnaissance des lymphocytes CD4, dans le dessein d'approfondir les possibilités de thérapie génique pour ces mêmes lymphocytes et les possibilités de synthèse de vaccins (TESHOME MEBATSION et KARL-KLAUS CONZELMANN, Froc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 11366-11370, Octobre 1996). Peu après, le gène de la chloramphénicol acétyltransférase était intégré avec succès dans le génome de particules virales de la rage (STEFAN FINKE et KARL-KLAUS CONZELMANN, Journal of virology, Oct. 1997, pp. 7281-7288).

La génération de nombreux autres virus appartenant aux familles paramyxoet Rhabdovirus ont suivi, tel le virus de la rougeole (Radecke et al. 1995, Schneider et al. 1997, Takeda et al. 2000), le virus RPV (Baron & Barrett, 1997), SeV (Garcin et al. 1995, Kato et al. 1996), hPIV3 (Durbin et al. 1997, Hoâman & Banerjee 1997), SV5 ( He et al. 1997), NDV (Peeters et al. 1999, Romer-Oberdorfer et al. 1999, Krishnamurthy et al. 2000), bPIV3 (Haller et al. 2000), CDV (Gassen et al. 2000), hPIV2 (Kawano et al. 2001), et le virus des oreillons (Clarke et al. 2000).

Le virus de la fièvre Ebola (appartenant à la famille Filoviridae) fut aussi engendré récemment à partir d'ADNc (Volchkov et al. 2001, Neumann et al. 2002), ainsi que des virus appartenant à la familles des orthomyxovirus, tel que le virus de la grippe A (Neumann et al. 1999, Fodor et al. 1999) et le virus Thogoto (Wagner et al. 2001).

L'ensemble de ces techniques a été utilisé essentiellement dans le dessein de clarifier la compréhension des cycles de vie des virus, d'élucider les raisons de leur pathogénicité, et de 2866031 10 pourvoir à la fabrication de vaccins atténués. La vaccinologie, bien qu'ayant largement tiré parti de ces techniques, n'a pourtant pas connu d'évolution majeure quant à l'efficacité des vaccins sur le fond, et aucun procédé spécifique de fabrication de principes actifs curatifs et/ou prophylactiques fonction d'un vaccin et axés contre un virus pathogène n'en a émergé.

La présente invention remédie à ce problème et consiste en la fabrication d'une chimère virale apparentée à un virus pathogène, fonction d'un ou de plusieurs vaccins connus, dans le dessein de fabriquer un principe actif agissant spécifiquement contre le dit virus. Une variante de l'invention consiste par ailleurs à fabriquer une chimère virale apparentée à un virus pathogène, contre lequel il n'existe pas de vaccins efficaces utilisables selon l'invention, et incorporant au sein IO de son génome des séquencesnucléotidiques ayant directement ou indirectement une activité antivirale.

Description de la chimère selon l'invention

Pour tout virus pathogène défini, de préférence issu phylogéniquement d'un virus parent contre lequel il existe un vaccin, un premier objet de l'invention réside dans la création d'une chimère apparentée au dit virus pathogène, dans le dessein: 1) de servir de vecteur envers toutes les cellules infectées et toutes les lignées ou populations cellulaires pouvant éventuellement servit de réservoir au virus pathogène in vivo ou ex vivo, 2) de délivrer une information génétique dans les dites cellules se superposant à l'information génétique virale pathogène, et codant pour les polypeptides responsables de l'antigénicité du virus pathogène, modifiée de telle manière à ce qu'ils contiennent des épitopes contre lesquels un vaccin connu dirige l'immunité, 3) d'engendrer la synthèse des dits polypeptides dès lors qu'une cellule est coinfectée par la chimère et le virus pathogène.

La chimère selon l'invention est typiquement caractérisée par: A) une capside et/ou une enveloppe lipidique intégrant les constituants du virus pathogène responsables de la reconnaissance spécifique des récepteurs membranaires des cellules infectées, ainsi que tous les autres constituants viraux indispensables à la pénétration du génome viral dans les cellules infectées, typiquement, il s'agira de la capside et/ou de l'enveloppe du virus pathogène ou de celles d'un virus parent du virus pathogène, la chimère étant obtenue par création à partir de plasmides, de cosmides, de milieu cell-free, ou de tout autre procédé connu par l'homme de l'art.

B) Un génome défectif phylogéniquement proche de celui du virus pathogène, issu d'une construction génétique telle qu'il rend la chimère seule incapable d'engendrer la synthèse des polypeptides issus de son génome, 2866031 11 C) Un génome issu d'une construction génétique telle que le virus pathogène ait la capacité de servir de virus helper, et tel que sa présence catalyse les dites synthèses évoqué précédemment en B), une fois les mêmes cellules coinfectées par le virus pathogène et la chimère, D) Un génome issu d'une construction génétique telle que qu'il renferme une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour un ou plusieurs polypeptides impliqués dans l'antigénicité du virus pathogène et contenant un ou plusieurs épitopes identiques à ceux contre lesquels un ou plusieurs vaccins connus dirigent l'immunité.

Selon une variante de l'invention, la dite chimère pourra aussi être avantageusement constituée en A) par une capside et/ou une enveloppe lipidique appartenant à une souche distincte et non apparentée au virus pathogène, ayant le même tropisme cellulaire, ou encore, selon une autre variante de l'invention, elle pourra être constituée par les composants de la membrane et/ou de la capside d'une souche virale comportant des polypeptides synthétiques construits par fusion de plusieurs parties de gènes différents codant pour des protéines virales appartenant à des espèces virales distinctes, et conférant à la chimère le même tropisme cellulaire que celui du virus pathogène.

Le génome de la chimère est construit selon les techniques connues du génie génétique et de la virologie moléculaire. Typiquement, dans le contexte des maladies virales humaines ou animales, les gènes codant le cas échéant pour la polymérase virale au sein du génome de la chimère seront défectifs, de telle manière à ce qu'aucune synthèse polypeptidique ne soit possible du seul fait de la présence intracellulaire du génome de la chimère. La polymérase virale apporté par le virus pathogène sert de catalyseur pour les dites synthèses. En revanche, la polymérase virale peut n'être défective que pour la synthèse des ARNn1, et non pour la réplication du génome, si la dite réplication n'engendre pas en aval de synthèses polypeptidiques.

Dans le cas des virus n'ayant pas d'activités polymérasiques propres, et dont le génome est directement traduit par les constituants cellulaires, le génome de la chimère contiendra des délétions et/ou des insertions chevauchant les séquences indispensables à sa traduction, choisies avantageusement, et de telle manière à ce que des recombinaisons spontanées puissent s'opérer entre le génome de la chimère et le génome du virus pathogène. Ces recombinaisons assurent la traduction du génome de la chimère.

Pour les virus possédant un génome codant pour une ou plusieurs enzymes ayant une activité de nucléosynthèse, afin de déterminer les souches défectives pour la polymérase virale les plus utiles à la construction de la chimère, il convient, le cas échéant, d'identifier les similitudes de séquences et notamment les aminoacides les plus conservés dans la ou les séquences polypeptidiques constituant la polymèrase virale ou ses sousunités, examen mené entre les différentes souches ou espèces virales phylogéniquement proches de celle choisie pour la construction de la chimère. Des expériences de mutagenèse systématique sur les gènes codant pour ces polypeptides, préalablement clonés dans des plasmides, concernant les codons apparentés aux acides aminés précédemment identifiés, permettent de fabriquer des mutants d'intérêt pour la polymérase, par exemple par remplacement systématique de ses dits codons par un codon d'alanine. La caractérisation phénotypique des souches obtenues incorporant ces gènes modifiés, et l'examen de leur activité de réplication et éventuellement de traduction de leur génome in vitro et in vivo, permet de sélectionner les gènes de la polymérase les plus intéressants pour la construction de la chimère selon l'invention.

La présente invention concerne aussi la création et l'utilisation d'une chimère à des fins thérapeutiques, dont le génome à été modifié par les procédés du génie génétique, et/ou par mutagenèse dirigée, afin que le génome de la dite chimère contienne l'un ou plusieurs des éléments suivant, en plus de ceux décrits comme caractéristiques: a) un ou plusieurs gènes du virus pathogène dont la séquence nucléotidique a été modifiée, de telle manière à ce que le ou les polypeptides issus de la traduction des dits gènes aient perdu tout ou partie des caractéristiques fonctionnelles des polypeptides du virus sauvage, et induisent la formation de virions altérés dans leur morphologie par un effet de compétition avec les protéines sauvages, ou, s'il ne s'agit pas de protéines structurelles, perturbent le cycle de vie du virus pathogène, b) un ou plusieurs gènes ayant une activité antivirale, tel que les gènes codant pour les interférons, ou pour des composés qui en activent la synthèse, ou bien les gènes qui sont activés par les interférons, tels que par exemple les gènes des protéines Mx IFN-inductibles, de la protéine kinase dsARN dépendante (PKR), des 2'-5' oligoadénylates synthétases, de l'endoribonucléase L, des caspases, de l'adénosine déaminase dsARN dépendante (ADAR), etc. c) un ou plusieurs gènes ayant une activité antiproliférative, qui inhibent la réplication virale en inhibant la croissance cellulaire, d) un ou plusieurs gènes qui induisent ou régulent l'apoptose, e) un ou plusieurs gènes dont l'activité est immunorégulatrice, f) une ou plusieurs séquences polynucléotidiques antisens de l'un des ARNm présent dans les cellules infectées, ou d'un fragment d'ADN ou d'ARN présent dans la dite cellule, g) une ou plusieurs séquences polynucléotidiques identiques à celle du génome du virus pathogène, tels qu'elles agissent par compétition avec les dites séquences vis à vis d'une polymérase virale ou de toute autre protéine impliquée dans le cycle de vie du virus, h) une séquence polynucléotidique permettant d'engendrer un ARN ayant une activité catalytique (ribozyme), ou un ARN d'interférence (defective interfering RNA).

La présente invention concerne aussi une préparation pharmaceutique thérapeutique et/ou prophylactique contre les maladies virales, caractérisée en ce qu'elle contient une ou plusieurs chimères différentes selon l'invention, et éventuellement un adjuvant, et/ou un diluant, et/ou un excipient, et/ou un véhicule pharmaceutique acceptable, ainsi que son éventuelle utilisation couplée avec un ou plusieurs vaccins.

Par ailleurs, la présente invention concerne aussi une méthode de diagnostic, de détection et de quantification des infections virales, fondée sur les modifications morphologiques et antigéniques engendrées par la chimère selon l'invention sur le virus pathogène associé.

Cette méthode consiste, dans un premier temps, 1) à administrer une préparation pharmaceutique adéquate contenant la chimère, à un humain ou à un animal suspectés d'être atteint par la maladie causé par le virus pathogène associé, dès lors qu'ils ont étés préalablement vaccinés avec un vaccin dirigé contre les polypeptides antigéniques modifiés du virus pathogène codés par le génome de la chimère. Ensuite, 2) on prélève un échantillon biologique humain ou animal, tel qu'un liquide biologique, sur le patient, puis 3) on détecte dans cet échantillon les anticorps dirigés contre les antigènes codés par le génome de la ou des chimères composant la dite préparation pharmaceutique utilisée lors de l'étape 1). II peut s'agir par exemple d'un test ELISA, ou d'un test utilisant les techniques d'immunoblotting, ou d'autres tests similaires; enfin, 4) si souhaité on quantifie les anticorps de l'étape 3) par rapport à une concentration de référence.

Par ailleurs, l'étape 3) peut être remplacé par la mise en évidence directe des antigènes viraux codés par le génome de la chimère, à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques, soit directement sur le prélèvement de l'étape 2), soit sur une culture cellulaire ensemencée avec le prélèvement du malade après quelques heures à quelques jours de culture.

La détection des anticorps ci-dessus mentionnés est proportionnelle à la quantité du virus pathogène associé.

Un deuxième objet de l'invention réside la création d'une chimère apparentée à un virus pathogène non nécessairement émergeant, c'est à dire d'une chimère apparentée à n'importe quel virus pathogène quel qu'il soit, à partir des procédés conventionnels issus de la virologie moléculaire, de la microbiologie et des techniques du génie génétique connues par l'homme de l'art, et caractérisée selon les critères définis plus haut en A), B), et C), mais telle que le critère caractéristique D) soit remplacé par le critère E): E) Un génome issu d'une construction génétique telle qu'il renferme l'un ou plusieurs des éléments mentionnés selon les critères supplémentaires a) à h).

Une telle chimère, qui sera nommée ici chimère non vaccinale , pour la différencier de celles précédement décrites, développe le même tropisme cellulaire que le dit virus pathogène auquel elle est associée, et peut servir de vecteur spécifique contre les cellules infectées par ce virus, tout en surajoutant à l'information virale présente dans les cellules infectées une information génétique supplémentaire provenant de son génome, incarné soit par le fait que le dit génome code pour des polypeptides ou des polynucléotides ayant une activité antivirale, soit par le fait que le dit génome posséde une activité catalytique propre (rybozyme).

De même que pour la chimère décrite en premier lieu, la présence du virus pathogène est indispensable à la synthèse des polypeptides issus de son génome L'avantage de la construction d'une chimère non vaccinale est qu'elle constitue le principe actif d'un médicament spécifique dirigé contre un virus pathogène contre lequel il n'existe pas de vaccin, ni contre lui, ni contre une souche parente.

L'invention concerne aussi les préparations pharmaceutiques adéquates contenant une telle chimère non vaccinale, ainsi qu'éventuellement un excipient, et/ou un adjuvant, et/ou un véhicule pharmaceutique acceptable pour la thérapie des maladies virales.

Pour illustrer la présente invention, un exemple d'application détaillée est exposé ci-dessous. Un exemple supplémentaire d'application mettra par la suite en lumière la création et l'utilisation d'une chimère non vaccinale. Les exemples qui suivent doivent être considérés comme strictement illustratifs et non limitatifs.

Exemple 1

Création du principe actif d'un médicament spécifique pour lutter contre une 20 pandémie de grippe non vaccinale.

Les pandémies de grippe sont causées par l'apparition d'un nouveau soustype du virus influenza de type A, incorporant des antigènes HA (hémagglutinine) et NA (neuraminidase) différents de ceux qui appartenaient aux souches qui circulaient antérieurement dans la population.

La cassure antigénique du virus, c'est à dire l'avènement d'un réarrangement majeur de ses antigènes de surface, lui confer la capacité d'échapper aux défenses immunitaires spécifiques qui préexistaient dans les populations humaines, qui ne possèdent pas d'anticorps contre le nouveau virus; c'est alors un virus qui est potentiellement capable de provoquer une épidémie majeure ou pandémie au niveau mondial.

Les pandémies d'influenza dues à la propagation rapide d'un tel virus surviennent en moyenne trois fois par siècle. L'infection virale qui se manifeste alors peut être hautement létale. Les moyens thérapeutiques sont très limités: la prophylaxie vaccinale est quasi inexistante, jusqu'à la fabrication d'un nouveau vaccin, qui peut prendre, dans le meilleur des cas, 22 semaines, alors que les moyens de communication modernes permettent à l'épidémie de s'étendre très rapidement; et les antiviraux de la grippe sont d'une efficacité non documentée dans un tel contexte.

Par ailleurs, la médiatisation de ces infections virales peut engendrer un climat de panique et de perturbations sociales que les autorités devront gérer, créant le cas échéant des conditions d'état d'urgence.

Le présent exemple a pour objet la mise au point du principe actif d'un médicament spécifique contre un nouveau virus influenza pandémique apparaissant dans un tel contexte.

Il est implicitement supposé qu'il existe dans de telles circonstances un vaccin contre la grippe disponible en pharmacie, dirigé contre des souches grippales A non responsables de la pandémie et inefficace pour protéger la population contre le nouveau virus. Dans la suite, un tel vaccin sera noté vaccin a.

D'un point de vue génétique, ce qui confer de prime abord sa dangerosité au virus est la cassure antigénique, c'est à dire l'absence d'information génétique au sein du génome du nouveau virus codant pour les protéines de surface virales (hémagglutinine et neuraminidase) circulant auparavant dans la population, ou présente dans les souches virales ayant servi à la fabrication du vaccin a alors disponible.

Le présent exemple consiste en la création d'une chimère du virus influenza selon les critères définis plus haut, ayant des protéines de surface échappant à l'immunité humaine du moment, telles que celles du virus pandémique ou d'une autre souche d'influenza A échappant à l'immunité, et encapsidant trois brins d'ARN- codant respectivement pour la protéine M2, et les molécules de neuraminidase et d'hémagglutinine issues de la traduction du génome de la souche, ou de l'une ou plusieurs des souches, ayant servi à la fabrication du vaccin disponible (vaccin a).

La vaccination générale de la population avec le vaccin a, puis parmi la population, l'administration aux personnes atteintes postérieurement par la maladie, d'une préparation pharmaceutique adéquate contenant la chimère ici décrite, aura pour effet de transformer in vivo le nouveau virus en un virus exprimant les antigènes HA et NA de la souche ayant servi à la fabrication du vaccin a, suscitant une forte réaction immunitaire chez les sujets vaccinés avec le vaccin a contre le virus issu des cellules coinfectées par la chimère et le virus influenza A responsable de la pandémie. Une telle réaction immunitaire est susceptible d'enrayer la propagation extracellulaire de l'infection.

Une telle préparation pharmaceutique contenant la chimère ainsi construite, qui peut être 30 fabriquée conjointement à la production du vaccin a, représente un médicament antiviral spécifique contre le virus influenza A responsable de la pandémie.

Un avantage de ce procédé est qu'il permet d'adjoindre à la fabrication du vaccin a la fabrication parallèle d'un principe actif fonction de a contre un virus influenza A émergeant pandémique inconnu, et d'offrir une thérapie immédiatement disponible lors d'une éventuelle éruption d'une épidémie non vaccinale engendrée par un tel virus.

Une telle fabrication étant réalisable antérieurement à l'émergence virale, la thérapie ad oc qui en découle permet de réduire la dangerosité d'une pandémie, et ce, jusqu'à la création d'un nouveau vaccin efficace contre la souche responsable de la pandémie.

Construction de la chimère influenza Act Le virus influenza A est un virus enveloppé d'un diamètre de 80 à 120 nm appartenant à la famille des orthomyxoviridae. Il contient un génome segmenté constitué par huit brins simples d'ARN de polarité négative. Le génome viral code pour dix protéines, dont neuf sont incorporées dans les particules virales.

Trois protéines sont insérées dans la bicouche lipidique de l'enveloppe virale, HA (l'hémagglutinine), NA (la neuraminidase) impliquées respectivement dans la reconnaissance et la sortie des cellules cibles, et une protéine peu abondante, M2, qui joue le rôle d'un tunnel ionique, impliqué dans le désassemblage intracellulaire de la capside et la maturation de HA. HA et NA sont les protéines qui régentent pour l'essentiel l'antigénicité du virus.

Sous l'enveloppe virale, chacun des huit brins d'ARN- est associé avec les protéines NP, PA, PB1 et PB2 au sein d'un complexe ribonucléoprotéique (cRNP). La protéine NP ou nucléoprotéine, est le constituant protéique majeur du cRNP, dans une proportion stoechiométrique de une protéine NP pour 24 nucléotides. L'ARN viral est entorsadé autour des unités NP successives dans une conformation particulière, tandis que les protéines PA, PB1 et PB2 sont associées avec l'extrémité 5' de l'ARN viral, et constituent la polymérase virale ARN dépendante, responsable de la transcription et de la réplication du génome. Aucune activité de ribonucléosynthèse ne peut être catalysée in vivo sans la présence conjointe de NP, PA, PBi et PB2 complexées à l'ARN viral.

Le constituant protéique majeur du virus est la protéine Mt, qui relie l'enveloppe aux cRNP, et qui semble jouer un rôle important dans l'export nucléaire des cRNP, ainsi que dans l'assemblage viral intracellulaire qui précède le bourgeonnement des virions depuis la membrane des cellules infectées.

Enfin, on trouve aussi dans le virus de petites quantités d'une protéine NS2, impliquée avec M1 dans l'export nucléaire des cRNP.

Le génome viral encode l'information pour un facteur de régulation transcriptionnel et post-transcriptionnel NS 1, synthétisé dans les cellules infectées et non encapsidé dans les virions, qui semble capable d'inhiber l'expression des gènes cellulaires et d'activer la synthèse des protéines virales, mais les données récentes sont contradictoires (Salvatore et al, Journal of virology 76, 2002).

Le virus influenza A pénètre par endocytose dans les cellules cibles, après que l'hémagglutinine se soit liée avec des oligosacharides membranaires renfermant de l'acide sialique. Après internalisation, le pH basique des endosomes engendre une modification conformationnelle de l'hémagglutinine, qui favorise la fusion des membranes endosomales et virales. Les cRNP et la protéine M1 sont alors libérés dans le cytoplasme, puis les cRNP sont transportés dans le noyau cellulaire où se déroule la transcription de l'ARN viral. L'ARN viral est tout d'abord transcrit en ARNm, polyadénylés à l'extrémité 3' et dotés d'une structure en cap à l'extrémité 5'. La structure en cap provient des ARNm cellulaires, dont l'extrémité 5' est clivée par la polymérase virale, pour laquelle ils servent d'amorce pour la ribonucléosynthèse.

Après un premier cycle de synthèse des ARNm viraux, les protéines NP, PA, PB1 et PB2 pénètrent dans le noyau, le génome viral est alors transcrit en brins d'ARN+ par la polymérase virale. Les brins d'ARN+, servent de matrice pour la synthèse des brins d'ARN-, qui seront encapsidés ultérieurement dans les nouveaux virions. Les cRNP nouvellement synthétisés par assemblage des brins d'ARN- et des protéines virales amplifient le mécanisme de ribonucléosynthèse, puis sont exportés vers le cytoplasme, selon un mécanisme qui implique les protéines NS2 et Ml Les nouveaux virions s'autoassemblent en périphérie de la cellule et bourgeonnent depuis la surface apicale de la membrane cellulaire.

A ce stade, la neuraminidase joue un rôle important, en catalysant l'hydrolyse des liaisons entre les résidus d'acide sialique et les oligosaccharides membranaires, ce qui permet aux virions de se libérer de la cellule en évitant un phénomène d'autoaggrégation.

La chimère Aa construite dans le présent exemple est fonction du vaccin a. Le vaccin a ici considéré est notamment un vaccin fabriqué selon les recommandations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) l'année de construction de la chimère. L'OMS a recommandé que le vaccin influenza pour l'hémisphère nord en 2003-2004 soit composé de virus similaires à : A/New Caledonia/20/99 (H1N1) A/Moscow/l 0/99 (H3N2) B/Hong-Kong/330/2001 La chimère Aa pour le présent exemple sera construite de telle manière à incorporer les gènes codant pour les protéines HA, NA et M2 de la souche A/New Caledonia/20/99 (HINI).

La chimère Aa pour le présent exemple sera construite pour posséder une morphologie 35 membranaire emprunté à une souche virale influenza A échappant à l'immunité humaine du moment, ici la souche A/South Carolinall/l 8 (HlN1) pour la protéine HA (GenBank N AF117241) et la souche A/Brevig Mission/I/18 (HiN1) pour les protéines NA (GenBank N AF250356-AF250365) et M2 (GenBank N AY130766), ces trois protéines provenant de la souche ayant causé la pandémie grippale de 1918. Le génome encodant ces trois protéines peut provenir d'un virus recombinant (Tumpey et al, PNAS, 99, 2002, p13849-13854). Ces deux souches n'ont été retenues que pour les besoins du présent exemple, d'autres souches auraient pu être retenues, dès lors qu'il est possible de construire à partir de ces dites souches un trio HA-NAM2 n'ayant pas circulé dans les populations humaines menacées.

La diversité des souches d'influenza (15 sous-types HA et 9 NA, ainsi que leurs variantes) offre l'opportunité de construire plusieurs chimères différentes ayant la même capacité que la chimère Aa à surmonter une réponse immunologique, ce qui offre une disponibilité pour administrer successivement des préparations pharmaceutiques contenant de telles chimères identiques par ailleurs à Aa, dans le dessein de conserver l'effet thérapeutique contre une immunorésistance induite.

Idéalement, Aa serait construite pour posséder la morphologie membranaire (HA, NA et M2) de la souche pandémique émergente.

La chimère Aa sera en outre construite pour posséder une morphologie sousmembranaire empruntée à la souche A/WSN/33, dont il a été identifié récemment l'existence d'un mutant H510A, renfermant une mutation sur le gène codant pour la protéine PA, conduisant au remplacement d'un résidu d'histidine par un résidu d'alanine en position 510 de la chaîne polypeptidique, mutation qui a pour effet d'induire une efficacité différentielle entre la transcription et la réplication du génome (Fodor et al, journal of virology, pp. 8989-9001, septembre 2002). Le mutant H510A possède la particularité de pouvoir répliquer le génome viral (ARNv transcrit en ARNc eux même transcrit en ARNv) mais possède une capacité de ribonucléosynthèse des ARNm négligeable.

Ici encore, la mutation 11510A n'est retenue que pour les besoins de l'exemple. Une autre mutation (ou plusieurs mutations dont l'effet conjoint est synergique) au sein d'une souche d'influenza engendrant le même phénotype aurait pu être retenue, telle que la mutation décrite par Fechter et al, (Journal of biol. Chem., vol. 278, pp 20381-20388, mai 2003), affectant la sous-unité PB2 par remplacement d'un résidu de phénylalanine en un résidu d'alanine en position 363 de la chaîne polypeptidique. Le mutant F363A est incapable de catalyser la synthèse des ARNm, mais est capable de répliquer son génome.

Le génome encapsidé dans la chimère Aa pour le présent exemple est constitué par les gènes suivant, encodés par les brins d'ARN- viraux: le gène codant pour la protéine HA de la souche A/New Caledonia/20/99 (H1N1), le gène codant pour la protéine NA de la souche A/New Caledonia/20/99 (HiN1), 2866031 19 le gène codant pour la protéine M2 de la souche A/New Caledonia/20/99 (H1N1), le gène codant pour la protéine NS1 de la souche A/WSN/33, le gène codant pour la protéine Ml de la souche A/New Caledonia/20/99 (HIN1), le gène codant pour la protéine PB1 de la souche A/WSN/33, le gène codant pour la protéine PB2 de la souche A/WSN/33, le gène codant pour la protéine NP de la souche A/WSN/33, le gène codant pour la protéine NS2 de la souche A/WSN/33.

Le génome de la chimère sera encapsidé et enveloppé à partir des protéines suivantes: 10 la protéine HA de la souche A/South Carolina/l/18 (H1N1), la protéine NA de la souche AlBrevig Mission/ 1/18 (HINI), la protéine M2 de la souche A/Brevig Mission/ 1/18 (HIN1), - la protéine Mt de la souche A/ Brevig Mission/ 1/18 (HINI), la protéine PA de la souche A/WSN/33 portant la mutation H510A, la protéine PB1 de la souche A/WSN/33, la protéine PB2 de la souche A/WSN/33, la protéine NP de la souche A/WSN/33, - la protéine NS2 de la souche A/WSN/33 La chimère Aa possède les caractéristiques suivantes. La chimère Aa est incapable de s'autoreproduire sans virus helper, étant donné que le génome de la chimère ne renferme pas le gène PA dont le produit est indispensable pour la transcription de l'ARN viral, c'est à dire qu'elle est défective pour la polymérase virale. Les cRNP contenus dans la chimère peuvent néanmoins autocatalyser intracellulairement la formation de brins d'ARN viraux identiques à ceux présent dans les cRNP (ARN-), mais ne peuvent pas autocatalyser la synthèse des ARNm viraux, étant donné que la protéine PA(H510A) présente dans les cRNP provient d'un mutant dont il a été montré que cette protéine permettait la synthèse des ARN génomiques viraux mais non des ARNm viraux. Pour ces différentes raisons, la chimère ne peut pas engendrer de virions infectieux.

Par ailleurs, l'absence d'intégration du génome d'influenza A dans les chromosomes de I'hôte assure la biosécurité de Aa.

La chimère administrée in vivo à des patient préalablement vaccinés coinfecte les cellules cibles du virus influenza responsable de la pandémie, sans rencontrer de réaction immunitaire majeure, étant donné qu'elle est construite sur la base d'une enveloppe renfermant les seules protéines HA provenant de la souche A/South Carolinall/18 (H1N1), ainsi que NA et M2 provenant de la souche A/Brevig Mission/I/18 (HINI), ne circulant pas dans les populations humaines.

Le génome de la chimère encode les gènes HA, NA et M2 de la souche A/New Caledonia/20/99 (HINI), qui après administration in vivo sont reproduit intracellulairement avec les autres gènes viraux par la polymérase de lachimère sous la forme de nouveaux brins d'ARN-.

Le virus responsable de la pandémie peut servir de virus helper pour la chimère. La coinfection des cellules cibles par la chimère et le virus pathogène engendre la formation de cRNP par complémentation, étant donné que le génome du virus sauvage engendre la synthèse intracellulaire des protéines NP, PA, PB1 et PB2, capable de s'autoassembler avec les brins d'ARN viraux synthétisées par les cRNP de la chimère. La formation de ces nouveaux cRNP engendre la transcription, puis la traduction des gènes HA, NA et M2 issus de la souche A/New Caledonia/20/99 (H1N1). Les nouveaux virions bourgeonnant depuis la membrane de la cellule coinfectée sont de ce fait susceptible de contenir d'une part les antigènes HA, NA et M2 issus de la souche A/New Caledonia/20/99 (H1NI), en mélange avec les mêmes antigènes du virus pandémique, et d'autre part les cRNP codant pour les gènes HA, NA et M2 issus de la souche A/New Caledonia/20/99 (H1N1).

De tels virus sont alors susceptibles de s'attirer une forte réponse immunitaire, s'ils possèdent les antigènes désignés ci-dessus dans leur enveloppe, et/ou d'amplifier la fabrication des protéines HA, NA et M2 issus de la souche A/New Caledonia/20/99 (H1NI), dès lors qu'ils contiennent les cRNP désignés ci-dessus lors de l'extension extracellulaire de l'infection.

Globalement, la coinfection in vivo des cellules cibles par la chimère Aa et le virus responsable de la pandémie engendre un glissement antigénique de la souche virale pandémique vers la souche vaccinale A/New Caledonia/20/99 (H1N1), permettant au système immunitaire du malade d'éliminer le virus responsable de la maladie, en attendant le développement d'une réponse immune spécifique dirigé contre les antigènes HA, NA et M2 du virus pandémique.

Par ailleurs, le glissement antigénique du virus réduit ou annihile la contagiosité des malades vis à vis des autres personnes, si elles sont vaccinées avec le vaccin a, ce qui contribue à restreindre le pouvoir de développement de la pandémie et à soulager les malades et les structures sanitaires des mesures d'isolement.

La construction de la chimère Aa se fait selon les procédés classiques de la virologie moléculaire, de la microbiologie et du génie génétique. La création de la chimère Aa peut notamment être réalisée par transcription in vitro d'ADNc du génome viral des souches ici impliquées renfermant un promoteur de l'ARN polymérase T3 ou T7, et par autoassemblage in vitro des cRNP à partir des protéines virales mentionnées ci-dessus purifiées. La transfection des cRNP ainsi synthétisés dans des cultures cellulaires adéquates peut engendrer la formation de la chimère, selon la méthode de Luytjes et al., 1989; Enami et a1.,1990; Li et al., 1999. Une telle chimère peut aussi être synthétisée par transfection de plasmides d'ADNc des génomes viraux ici impliqués, renfermant un promoteur pour la polymérase I des cellules eucaryotes, selon la méthode de Zobel et al., 1993; Neumann et al., 1994; Pleschka et al., 1996, Fodor et al, 1999, ou par d'autres méthodes connues.

Dans le dessein de simplifier le protocole, c'est à dire de disposer d'un choix transcriptionnel différentiel entre ARNm et ARN génomiques tout en limitant le nombre de plasmides transfectés, le présent exemple empruntera pour la création de certains plasmides la méthode développée par Erich Hoffmann et Robert G. Webster pour la création d'un virus influenza (PNAS, 97, 2000), et pour d'autre la méthode de G. Neumann et al, (PNAS, 96, 1999) modifiées sur le détail. Les méthodes citées ici le sont à titres d'exemple et ne constituent pas une liste exhaustive.

Les méthodes développées par Hoffman (PNAS, 97, 2000) et Neumann (PNAS, 96, 1999) sont considérées être connue par l'homme de l'art. Elles permettent la création d'un virus influnza grâce à un système de transfection de plasmides encodant l'information génétique virale, dans des cellules adéquates. Brièvement, chaque plasmide est sous la dépendance d'un promoteur de la polymérase I et/ou d'un promoteur de la polymérase 11, permettant le cas échéant une transcription bidirectionnelle in vivo du génome viral.

PROTOCOLE DE CONSTRUCTION DE Act 1. Cultures cellulaires, souches virales et construction des plasmides.

Toutes les opérations de clonage et les réactions de polymérisation en chaîne sont effectuées selon les protocoles classiques, en suivant la méthode de Hoffman et Webster (virology 267, p 310-317; et PNAS, 97, pp. 6108-6113) et celle de Neumann et al. (PNAS, 96, 1999, pp. 9345-9350) pour la création d'un virus influenza. A. La manipulation de souches virales d'influenza ne circulant pas dans les populations humaines impose que la construction de la chimère Mc prenne place dans un laboratoire vérifiant les normes de sécurité biologique de niveau 3. Les souches virales influenza A/New Caledonia/20/99 (H IN1), et A/WSN/33 (HIN1), sont multipliées sur des oeufs embryonnés de dix jours. Les protéines HA de A/South Carolina/1/18 (H1N1), NA et M2 de A/Brevig Mission! 1/18 (HIN1) sont issus d'une souche d'influenza A recombinante contenant ces protéines, telles que celles décrites par Tumpey et al, PNAS, 99, 2002, p13849-13854, multipliée dans des conditions optimales.

Des cellules embryonnaires de rein humain 293T, bien adaptées pour l'expression de plasmides contenant un promoteur de l'ARN polymérase 1 humaine sont utilisées pour la transfection des plasmides. Ces cellules sont préalablement cultivées dans un milieu Opti-MEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) additionné de 10% de sérum foetal bovin, et maintenues à 37 C sous 5% de CO2.

Le RNA viral des souches influenza est isolé des particules virales avec RNeasy-Kit (Qiagen, Valencia, CA), selon les instruction du fabricant, puis amplifié par RT-PCR pour chacun des brins viraux (brin HA de la souche A/South Carolina/1/18 (HIN1); brins NA et M de AlBrevig Mission/ 1/18 (H1N1); brins NS, NP, PA, PB1 et PB2 de AIWSN/33; et brins NA, HA et M de A/New Caledonia/20/99 (HiN1)) selon les opérations décrites ci-après.

Clonage des brins NS, NP, PBI et PB, de AIWSN/33.

La production de Aa nécessitant à la fois la synthèse in vivo des ARNm et des ARN(-) génomiques des brins NS, NP, PBI et PB2 de AIWSN/33, le plasmide pHW2000 est utilisé pour le clonage des brins d'ARN viraux encodant les gènes viraux NSI, NS2, P13;, PB2, et NP de la souche A/WSN/33, selon la méthode de Hoffnlan et Webster (voir virology 267, pp. 310-317; et PNAS, 97, pp. 6108-6113). PHW2000 est dérivé du plasmide pHW12 construit lui- même à partir du plasmide pcDNA3 (Invitrogen).

Le plasmide pHW2000 contient un promoteur pour l'ARN polymérase 1 humaine de 226 paires de bases, et une séquence terminale de 33 paires de bases séparées par deux sites pour l'enzyme de restriction BsmBI, où seront insérés les brins d'ADNc viraux. Les sites promoteur et terminateur pol 1 sont eux-mêmes encadrés d'une part par un promoteur du cytomégalovirus humain pour l'ARN polymérase II, et d'autre part par une séquence de polyadénylation provenant du gène de l'hormone de croissance bovine, de telle manière à ce que l'ADNc viral soit positionné 'dans le sens positif vis à vis de l'unité de transcription de l'ARN polymérase II, et dans le sens négatif vis à vis de l'unité de transcription de l'ARN polymérase I. Les système de transcription de l'ARN pol 1 et de l'ARN pol II sont, en résumé, positionné en tête-bêche, et le plasmide contenant un ADNc viral cloné autorise à la fois la transcription de l'ADNc viral en ARNm, et par ailleurs la transcription en ARN(-) génomiques viraux identiques aux brins originels utilisés pour la RT-PCR.

Le plasmide pHW2000 contient en outre une origine de réplication pour la multiplication 30 avec E.coli, et le gène de la 13-lactamase pour la sélection bactérienne dans un milieu contenant de l'ampicilline.

L'ADNc double brin d'amplification est obtenu par RT-PCR des brins NS, NP, PB1 et PB2 de A/WSN/33, en utilisant des amorces contenant toutes un site de restriction pour BsmBI à leur extrémités 5'. L'ADNe obtenu doit être séquencé avec un autoséquenceur pour s'assurer qu'il ne contient pas de mutations indésirables; il est ensuite digéré par BsmBl et cloné dans le plasmide pHW2000 digéré lui aussi par BsmBl.

On obtient ainsi quatre plasmides contenant l'ADNc viral des brins NS, NP, PB1 et PB2 de AIWSN/33, permettant une synthèse bidirectionnelle de l'ARN viral.

Clonage des brins HA, NA, et M de A/New Caledonia/20/99 (HIN1).

La production de Aa nécessite par ailleurs la synthèse in vivo des ARN(-) génomiques des brins HA, NA, et M de A/New Caledonia/20/99 (HIN 1), mais pas des ARNm correspondant. Le plasmide pHH21 est utilisé pour le clonage des brins d'ARN viraux encodant les gènes viraux HA, NA, et M de A/New Caledonia/20/99 (HIN1), selon la méthode de Neumann et al, (PNAS, 96, 1999, p 9345-9350). PHH21 est un plasmide contenant un site de restriction pour BsmBI, encadré par les séquences promoteur de l'ARN polymérase 1 humaine et terminateur de l'ARN polymérase I de souris.

L'ADNc double brin d'amplification est obtenu par RT-PCR des brins HA, NA, et M de A/New Caledonia/20/99 (HIN1), en utilisant des amorces contenant toutes un site de restriction pour BsmBI à leurs extrémités 5'. L'ADNc obtenu doit être séquencé avec un autoséquenceur pour s'assurer qu'il ne contient pas de mutations indésirables; il est ensuite digéré par BsmBI et cloné dans le plasmide p11121 digéré lui aussi par BsmBl.

On obtient ainsi trois plasmides contenant l'ADNc viral des brins HA, NA, et M de A/New Caledonia/20/99 (HIN1).

Clonage des brins NA et M de A/Brevig Mission/ 1/18 (H1N1), du brin HA de A/SouthCarolina/1/18 (HINI), et du brin PA de AIWSN/33.

La production de Aa nécessite enfin la synthèse in vivo des ARNm des brins NA et M de 25 A/Brevig Mission/ 1/18 (HINI), du brin HA de A/SouthCarolina/1/18 (HINI), et du brin PA(H510A) de A/WSN/33, mais pas des ARN(-) génomiques correspondant.

Le plasmide pCAGGS/MCS est utilisé pour le clonage des brins d'ARN viraux encodant les gènes NA et M de A/Brevig Mission/ 1/18 (HINI), HA de A/SouthCarolinall/18 (HINI), et PA de AIWSN/33, selon la méthode de Neumann et al, (PNAS, 96, 1999, pp. 9345-9350) en utilisant néanmoins l'ADNc d'amplification obtenu par RT-PCR des brins viraux correspondant. pCAGGS/MCS est un plasmide permettant d'exprimer des protéines dans les cellules eucaryotes, grâce à la présence d'un promoteur de la (3-actine de poulet (Niwa, H., Yamamura, K. & Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200) .

L'ADNc double brin d'amplification est obtenu par RT-PCR des brins NA et M de 35 A/Brevig Mission/ 1/18 (HIN1), du brin HA de A/SouthCarolina/1/18 (H1N1), et du brin PA de AIWSN/33 issus des souches possédant ces dit brins d'ARN. Pour introduire spécifiquement la mutation H510A dans le gène PA, on utilise différents oligonucléotides pour la RT-PCR, de manière à effectuer une mutagénèse dirigée sur le codon codant pour l'histidine 510. L'ADNc obtenu doit être séquencé avec un autoséquenceur pour s'assurer qu'il ne contient pas de mutations indésirables; il est ensuite cloné dans le plasmide pCAGGS/MCS.

On obtient ainsi quatre plasmides contenant l'ADNe viral des brins NA et M de ABrevig Mission/ 1/18 (H1N1), du brin HA de A/SouthCarolina/1/18 (HIN1), et du brin PA(H510A) de AIWSN/33.

2. Transfection des plasmides et récupération de la chimère Aa.

Les cellules 293T sont cotransfectées avec les 11 plasmides construits cidessus en utilisant du Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, WI), selon les instructions du fabricant. Un mélange des plasmides contenant 2 ml de Trans IT LT-1 par mg d'ADN est incubé à température ambiante pendant 45 minutes, puis ajouté aux cellules, dans la proportion de 1 g de chaque plasmide pour 106 cellules 293T, excepté pour les plasmides pCAGGS/MCS-PA (H510A), dont la proportion doit être de 0,1 g pour 106 cellules 293T, et pCAGGS/MCS-M dont la proportion doit être de 2 g pour 106 cellules 293T.

6 heures après, le milieu de transfection est remplacé par le milieu OptiMEM I. La chimère Aa est alors recueillie dans le nouveau milieu après une durée supérieure à 36 heures. 20 La chimère Aa ainsi construite est le principe actif d'un médicament spécifique contre le virus influenza A pandémique émergent.

La figure 1 représente schématiquement les étapes du procédé d'obtention de la chimère Aa.

(1) Particules virales A/New Caledonia/20/99 (HINI), A/WSN/33 (HIN1), et particules de la ou des souches contenant HA de A/South Carolina/1/l8 (H1NI), NA et M2 de ABrevig Mission/ 1/18 (H1N1) subissant séparément le procédé, (2) Extraction, purification et 11 RT-PCR des ARN viraux, mutagénèse dirigé par RT-PCR pour le gène PA, (3) ADNc viral amplifié, (4) Clonage dans pHW2000, (5) Clonage dans pH1I2I, (6) Clonage dans pCAGGS/MCS, (7) Plasmides pHW2000-NS, pHW2000-NP, pHW2000-PB1, pHW2000-PB2, origine de l'ADNc: 35 A/WSN/33 (H1N1), (8) Plasmides pHH21-HA, pHH21-NA, pHH21-M, origine de l'ADNc: A/New Caledonia/20/99 (HINI), (9) Plasmides pCAGGS/MCS-NA, pCAGGS/MCS-M, pCAGGS/MCS-HA, pCAGGS/MCSPA/H510A, origine de IADNc: A/Brevig Mission/1/18 (HINI), A/SouthCarolina/I/18 5 (H1N1), A/WSN/33 (HINI), (10) Total de I l plasmides, (Il) Cotransfection des I 1 plasmides dans des cellules 293T, (12) Expression intracellulaire de pHH21-HA, NA, et M, (13) Expression intracellulaire de pHW2000-NS, NP, PB1, et PB2, (14) Expression intracellulaire de pCAGGS/MCS-NA, M, HA, et PAJH510A,

(15) Transcription,

(16) Traduction, (17) Protéines virales, (18) ARN(-) viral, (19) Assemblage, (20) Bourgeonnement, (21) Chimère Aa. Caractéristiques antigéniques de la chimère Aa: NA A/Brevig Mission/1/18 (HINI), HA A/South Carolina/1/18 (HINI), M2 A/Brevig Mission! 1/18 (HINI) Génome: 7 ARN- dont 3 codant pour les protéines HA, NA, et M de A/New Caledonia/20/99 20 (HINI).

En référence au dessin, les particules des souches virales A/New Caledonia/20/99 (H IN1), A/WSN/33 (HINI), et les particules de la ou des souches contenant HA de A/South Carolina/1/18 (H1Nl), NA et M2 de AfBrevig Mission/ 1/18 (HINI) (1) sont utilisées pour l'extraction et la purification de leurs ARN viraux respectifs. Les I 1 brins HA de la souche A/South Carolina/1/18 (HIN1); NA et M de A/Brevig Mission/ 1/18 (HIN1); NS, NP, PA, PB1 et PB2 de AJWSN/33; et les brins NA, HA et M de A/New Caledonia/20/99 (HINI)) sont amplifiés par RT-PCR; la mutation H510A est introduite à cet égard dans le gène PA par mutagénèse dirigée (2). L'ADNc viral amplifié (3) correspondant aux brins NS, NP, PB1 et PB2 de AJWSN/33 est ensuite cloné respectivement dans quatre plasmides pHW2000 (4), celui des brins HA, NA, et M de A/New Caledonia/20/99 (HINI) est cloné respectivement dans 3 plasmides pHH21 (5), et celui des brins NA et M de A/Brevig Mission/ 1/18 (HIN1), du brin HA de A/SouthCarolina/1/18 (HINI), et du brin PA portant la mutation H510A de AJWSN/33 est cloné respectivement dans quatre plasmides pCAGGS/MCS (6). Chaque plasmide (7), (8) et (9), contient une copie de l'ADNc viral; les 11 plasmides (10) sont ensuite cotransfectés dans des cellules 293T (11). L'expression intracellulaire des plasmides (12), (13), (14), engendre la synthèse des constituants viraux de la chimère Aa, (15), (16), (17), (18), qui bourgeonne après assemblage (19) à la surface de la membrane cellulaire (20). La chimère Aa possède les caractéristiques suivantes (21): caractéristiques antigéniques de la chimère Aa: NA ABrevig Mission/1/18 (H1N1), HA A/South Carolinall/18 (H1N1), M2 ABrevig Mission/1/18 (H1N1); Génome: 7 brins d'ARN-, dont 3 codant pour les protéines HA, NA, et M de A/New Caledonia/20/99 (H1N1).

La présente méthode illustrée dans cet exemple n'est pas limitée dans sa porté par les incarnations spécifiques décrites dans le choix du virus influenza A. En effet, La méthode décrite ci-dessus de création d'une chimère d'un virus pathogène encapsidant les gènes d'une souche vaccinale et présentant un phénotype non vaccinal est applicable pour la thérapie antivirale contre d'autres virus que influenza A, en particulier contre tous les virus émergeants pour lesquels il est possible de fabriquer une chimère apparentée, et pour lesquels un vaccin peut être mis au point, notamment contre une souche phylogéniquement proche.

Par ailleurs, cette méthode est également utilisable contre une souche virale quelconque si la chimère peut encapsider des gènes synthétiques obtenus par fusion, d'une part, d'une ou de plusieurs séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides renfermant un ou plusieurs épitopes contre lesquels un vaccin connu dirige l'immunité, avec, d'autre part, une ou plusieurs séquences nucléotidiques issus des gènes viraux pathogènes codant pour les antigènes viraux du virus pathogène.

L'usage de cette méthode de thérapie antivirale contre une souche virale distincte de influenza A est destiné à tomber dans les limites des revendications de la présente invention.

Par ailleurs, les modifications diverses de cet exemple de l'invention en plus de.celles décrites, telles que la modification de la nature des souches utilisées, de la quantité des plasmides transfectés, des plasmides utilisés, ainsi que de l'usage d'anticorps ou d'autres composés pour inhiber la post-infection des cellules 293T par la chimère Aa, y compris l'utilisatiôn de composés pour cliver les molécules d'acide sialique de la membrane cellulaire, dans le dessein d'en améliorer la production, ou l'utilisation d'anticorps pour purifier la chimère Aa d'un arrière fond restreint de chimères possédant les antigènes de la souche vaccinale apparaîtront évidentes aux hommes de l'art. De telles modifications sont destinées à tomber dans les limites des

revendications de la présente invention.

Exemple 1 bis.

Création d'une chimère non vaccinale principe actif d'un médicament spécifique contre un virus influenza A Cet exemple décrit la création d'une chimère A non vaccinale dirigée contre un virus influenza A. Le contexte est celui de l'exemple 1. Dans le présent exemple, la chimère A n'est pas construite pour engendrer un glissement antigénique du virus influenza pathogène, après coinfection des mêmes cellules cibles, car elle ne contient pas les gènes codant pour les déterminants antigéniques d'une souche vaccinale; elle est construite pour posséder plusieurs gènes du virus pathogène dont les séquences nucléotidiques ont été modifiées, de telle manière à ce que le ou les polypeptides issus de la traduction des dits gènes aient perdu tout ou partie des caractéristiques fonctionnelles des polypeptides du virus sauvage, et induisent la formation de virions altérés dans leur morphologie par un effet de compétition avec les protéines sauvages, tout en perturbant le cycle de vie intracellulaire du virus pathogène.

La chimère sera construite selon le même protocole que dans l'exemple 1, mais avec les modifications suivantes: Le génome encapsidé dans la chimère A pour le présent exemple est constitué par les gènes suivant, encodés par les brins d'ARN- viraux: le gène codant pour la protéine PB1 de la souche A/WSN/33 (HINI), - le gène codant pour la protéine PB2 de la souche AIWSN/33 (HIN1), portant la mutation F621 A, le gène codant pour la protéine PA de la souche A/WSN/33 (HIN1), portant la mutation 20 G502A, le gène codant pour la protéine NP de la souche A/WSN/33 (HINl), portant les 5 mutations S467A, S473A, S478A, S482A, et S486A, le gène codant pour la protéine NS1 de la souche AIWSN/33( HINI), le gène codant pour la protéine NS2 de la souche A/WSN/33 (H1NI).

Le génome de la chimère A sera encapsidé et enveloppé, comme dans l'exemple 1, à partir des protéines suivantes: la protéine HA de la souche A/South Carolina/I/18 (H1N1), la protéine NA de la souche A/Brevig Mission/ 1/18 (HIN1), la protéine M2 de la souche A/Brevig Mission/ 1/18 (H1N1), la protéine MI de la souche Al Brevig Mission/ 1/18 (HINI), - la protéine PA de la souche A/WSN/33 (HINI), portant la mutation H510A, la protéine PB1 de la souche A/WSN/33 (HINI), - la protéine PB2 de la souche A/WSN/33 (H1N1), la protéine NP de la souche A/WSN/33 (H1NI), la protéine NS2 de la souche A/WSN/33 (HIN1).

2866031 28 Le gène codant pour la protéine PB2 de la souche AJWSN/33 (H1N1), portant la mutation F621A est un gène viral dont la traduction engendre une protéine PB2 possédant un résidu d'alanine en position 621 à la place d'un résidu de phénylalanine. La présence de la protéine PB2F621A comme constituant d'un complexe ribonucléoprotéique viral empêche toute synthèse d'ARN (ARNm, ARNc, ARNv) à partir du brin complexé avec la polymérase dont elle fait parti (Pierre Fechter et al, J. Biol. Chem., Vol. 278, 22, pp. 20381-20388, 30 Mai 2003).

Le gène codant pour la protéine PA de la souche A/WSN/33 (H1N1), portant la mutation G502A, dont la traduction engendre une protéine PA-G502A possédant un résidu d'alanine en position 502 à la place d'un résidu de glycocolle, conduit à un mutant de même phénotype que le précédent (Ervin Fodor et al, JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2002, pp. 8989-9001).

De même, le gène codant pour la protéine NP de la souche A/WSN/33 (H1N1), portant les 5 mutations S467A, S473A, S478A, S482A, et S486A, dont la traduction engendre une protéine NP-SA dans laquelle les résidus de sérine en position 467, 473, 478, 482 et 486 sont remplacé par des résidus d'alanine, conduit à un mutant présentant encore le même phénotype ( SIDDHARTHA K. BISWAS, JOURNAL OF VIROLOGY, juillet 1998, pp. 5493-5501).

La morphologie de la chimère A est identique à celle de Aa, excepté pour les constituants de son génome. La chimère A encapside l'information de 5 brins d'ARN, et possède les caractéristiques suivantes: La chimère A est incapable de s'autoreproduire sans virus helper, d'une part parce que le génome de la chimère renferme des gènes PA, PB2 et NP modifiés, engendrant des protéines ayant perdu les qualités biologiques de catalyse de la biosynthèse d'ARN des protéines sauvages, et d'autre part, parce que les gènes HA, NA, Mi et M2 sont absent du génome de la chimère.

Les cRNP contenus dans la chimère peuvent néanmoins autocatalyser intracellulairement la formation de leur brin d'ARN, mais ne peuvent pas autocatalyser la synthèse des ARNm viraux. Pour ces différentes raisons, la chimère ne peut pas engendrer de virions infectieux.

Ces caractéristiques, ainsi que l'absence d'intégration du génome de la chimère dans les chromosomes de l'hôte, assure la biosécurité de A. La chimère administrée in vivo à des patient atteint par une grippe causée par un virus influenza A coinfecte les cellules cibles du virus influenza responsable de la maladie, sans rencontrer de réaction immunitaire majeure, étant donné qu'elle est construite sur la base d'une enveloppe renfermant les. seules protéines HA provenant de la souche A/South Carolinall/18 (HIN1), ainsi que NA et M2 provenant de la souche A/Brevig Mission/1/18 (H1NI), ne circulant pas dans les populations humaines.

Le génome de la chimère encode les gènes PA-G502A, PB2 -F621A et NP-SA de la souche AIWSN/33 (HINl), qui après administration in vivo sont reproduit intracellulairement 2866031 29 avec les autres gènes viraux par la polymérase de la chimère sous la forme de nouveaux brins d'ARN-.

Le virus responsable de la maladie peut servir de virus helper pour la chimère. La coinfection des cellules cibles par la chimère et le virus pathogène engendre la formation de cRNP par complémentation, étant donné que le génome du virus sauvage engendre la synthèse intracellulaire des protéines NP, PA, PB1 et PB2, capable de s'autoassembler avec les brins d'ARN viraux synthétisées par les cRNP de la chimère. La formation de ces nouveaux cRNP engendre la transcription puis la traduction des gènes PAG502A, PB2-F621A et NP-SA. Les nouveaux virions bourgeonnant depuis la membrane de la cellule coinfectée sont de ce fait susceptibles de contenir d'une part les brins d'ARN viraux codant pour les gènes PA-G502A, PB2-F621A et NP-SA, éventuellement complexé, comme les autres brins d'ARN, avec les protéines PA-G502A, PB2-F621A et NP-SA issues de la traduction de ces même gènes.

De tels virus sont alors incapables de s'autoreproduire, étant donné que les gènes PAG502A, PB2-F621A et NP-SA engendrent des protéines qui bloquent la ribonucléosynthèse virale.

Globalement, le génome de la chimère délivre une information codant pour des protéines se Iiant spécifiquement à l'ARN du virus influenza A et inhibant son expression intracellulaire. En particulier, la présence de la protéine NP-SA., NP étant le constituant majeur du cRNP, engendre une forte probabilité pour que les cRNP néosynthétisés intracellulairement soient porteurs d'au moins une protéine qui perturbe leur traduction_

PROTOCOLE DE CONSTRUCTION DE A

1. Cultures cellulaires, souches virales et construction des plasmides.

Toutes les opérations de clonage et les réactions de polymérisation en chaîne sont effectuées selon les protocoles classiques, en suivant la méthode de Hoffinan et Webster (viralogy 267, pp. 310-317; et PNAS, 97, pp. 6108-6113) et celle de Neumann et al. (PNAS, 96, 1999, pp. 9345-9350) pour la création d'un virus influenza A, comme dans l'exemple 1. La manipulation de souches virales d'influenza ne circulant pas dans les populations humaines impose que la construction de la chimère A prenne place dans un laboratoire vérifiant les normes de sécurité biologique de niveau 3.

La souche virale influenza A/WSN/33 (HIN1), est multipliée sur des oeufs embryonnés de dix jours. Les protéines HA de A/South Carolina/1/l8 (HfN1), NA et M2 de A/Brevig Mission/ 1/18 (H1N1) sont issus d'une souche d'influenza A recombinante contenant ces protéines, telles que celles décrites par Tumpey et al, (PNAS, 99, 2002, p13849-13854), multipliée dans des conditions optimales.

2866031 30 Des cellules embryonnaires de rein humain 293T, bien adaptées pour l'expression de plasmides contenant un promoteur de l'ARN polymérase 1 humaine sont utilisées pour la transfection des plasmides. Ces cellules sont préalablement cultivées dans un milieu Opti-MEM I (Life Technologies, Gaithersburg, MD) additionné de 10% de sérum foetal bovin, et maintenues à 37 C sous 5% de CO2.

Le RNA viral des souches influenza est isolé des particules virales avec RNeasy-Kit (Qiagen, Valencia, CA), selon les instruction du fabricant, puis amplifié par RT-PCR pour chacun des brins viraux (brin HA de la souche A/South Carolinall/l8 (HIN1); brins NA et M de AlBrevig Mission/ 1/18 (H1N1); brins NS, NP, PA, PB1 et PB2 de A/WSN/33 (HINI)) et cloné selon les opérations décrites ci-après.

Clonage des brins NS et PB1 de A/WSN/33.

La production de A nécessitant à la fois la synthèse in vivo des ARNm et des ARN(-) génomiques des brins NS et PB1 de A/WSN/33, le plasmide pHW2000 est utilisé pour le clonage des brins d'ARN viraux encodant les gènes viraux NS et PB1 de la souche A/WSN/33, selon la méthode de Ho1Lnan et Webster (virology 267, pp. 310-317; et PNAS, 97, pp. 6108-6113), comme dans l'exemple 1.

L'ADNc double brin d'amplification est obtenu par RT-PCR des brins NS et PB1 de A/WSN/33 (HINI), en utilisant des amorces contenant toutes un site de restriction pour BsmBI à leurs extrémités 5'. L'ADNc obtenu doit être séquencé avec un autoséquenceur pour s'assurer qu'il ne contient pas de mutations indésirables; il est ensuite digéré par BsmBl et cloné dans le plasmide pHW2000 digéré lui aussi par &sml I. On obtient ainsi deux plasmides contenant l'ADNc viral des brins NS, et PB1 de 25 A/WSN/33, permettant une synthèse bidirectionnelle de l'ARN viral.

Clonage des brins PB2 PA, et NP de A/WSN/33 La production de A nécessite par ailleurs la synthèse in vivo des ARN(-)

génomiques des brins PB2, PA, et NP de A/WSN/33 (HIN1), mais pas des ARNm correspondant. Le plasmide pHH21 est utilisé pour le clonage des brins d'ARN viraux encodant les gènes viraux PB2, PA, et NP de A/WSN/33, selon la méthode de Neumann et al, (PNAS, 96, 1999, pp. 9345-9350), comme dans l'exemple 1.

L'ADNc double brin d'amplification est obtenu par RT-PCR des brins PB2, PA, et NP de 35 A/WSN/33 (HIN1), en utilisant des amorces contenant toutes un site de restriction pour BsmBI à leurs extrémités 5'. Par ailleurs, pour introduire spécifiquement les mutations F621A dans le gène PB2, G502A dans le gène PA, et les cinq mutations S467A, S473A, S478A, S482A, et S486A dans 2866031 31 le gène NP, on utilise différents oligonucléotides pour chaque RT-PCR, de manière à effectuer une mutagénèse dirigée sur les codons à modifier impliqués respectivement dans les trois gènes. L'ADNc obtenu doit être ensuite séquencé avec un autoséquenceur pour s'assurer qu'il ne contient pas de mutations indésirables; il est. ensuite digéré par BsmBI et cloné dans le plasmide pHH21 digéré lui aussi par BsmBI.

On obtient ainsi trois plasmides contenant l'ADNe viral des brins PB2, PA, et NP de A/WSN/33 (HlN1) Clonage des brins NA et M de A/Brevig Mission/ 1/18 (H1N1), du brin HA de 10 A/SouthCarolina/1/18 (HiN1), du brin PA portant la mutation H510A de A/WSN/33 (H1N1), et des brins NP et PB2 de A/WSN/33 (H1N1).

La production de A nécessite enfin la synthèse in vivo des ARNm des brins NA et M de A/Brevig Mission/1/18 (HIN1), du brin HA de A/SouthCarolina/1/18 (H1NI), du brin PA(H510A) de A/WSN/33 (H1N1), et des brins NP et P132 de A/WSN/33 (H1N1), mais pas des ARN(-) génomiques correspondant.

Le plasmide pCAGGS/MCS est utilisé, comme dans l'exemple 1, pour le clonage des brins d'ARN viraux encodant les gènes NA et M de A/Brevig Mission/1/18 (H1N1), HA de A/SouthCarolina/1/18 (H1N1), PA portant la mutation H510A de A/WSN/33 (HIN1), et NP et PB2 de A/WSN/33 (HIN1) selon la méthode de Neumann et al, (PNAS, 96, 1999, pp. 9345-9350) en utilisant néanmoins l'ADNc d'amplification obtenu par RT-PCR des brins viraux correspondant.

L'ADNc double brin d'amplification est obtenu par RT-PCR des brins NA' et M de A/Brevig Mission/ 1/18 (H1N1), du brin HA de AlSouthCarolina/l/18 (H1N1), et des brins PA, NP et PB2 de A/WSN/33 (H1N1), issus des souches possédant ces dit brins d'ARN. Pour introduire spécifiquement la mutation H510A dans le gène PA, on utilise différents oligonucléotides pour la RT PCR, de manière à effectuer une mutagénèse dirigée sur le codon codant pour l'histidine 510. L'ADNc obtenu doit être séquencé avec un autoséquenceur pour s'assurer qu'il ne contient pas de mutations indésirables; il est ensuite cloné dans le plasmide pCAGGS/MCS.

On obtient ainsi six plasmides contenant l'ADNc viral des brins NA et M de A/Brevig Mission/1/18 (HINI), du brin HA de A/SouthCarolina/1/18 (HINI) , et des brins PA(H510A), NP et PB2 de A/WSN/33 (HiNl).

2. Transfection des plasmides et récupération de la chimère Act.

Les cellules 293T sont cotransfectées avec les 11 plasmides construits cidessus en utilisant du Trans TT LT-1 (Panvera, Madison, WT), selon les instructions du fabricant. Un mélange des plasmides contenant 2 ml de Trans IT LT-1 par mg d'ADN est incubé à température ambiante pendant 45 minutes, puis ajouté aux cellules, dans la proportion de 1 g de chaque plasmide pour 106 cellules 293T, excepté pour les plasmides pCAGGS/MCS PA (H510A), dont la proportion doit être de 0,1 g pour 106 cellules 293T, et pCAGGS/MCS-M dont la proportion doit être de 21.tg pour 106 cellules 293T.

6 heures après, le milieu de transfection est remplacé par le milieu OptiMEM I. La chimère Aa est alors recueillie dans le nouveau milieu après une durée supérieure à 36 heures.

10 La chimère A ainsi construite est le principe actif d'un médicament spécifique contre un virus influenza A.

Claims (1)

1. 33 REVENDICATIONS

   1. Chimère virale caractérisée par: a) une capside et/ou une enveloppe lipidique intégrant les constituants d'un virus pathogène responsables de la reconnaissance spécifique des récepteurs membranaires des cellules infectées par ce dit virus, ainsi que tous les autres constituants viraux du virus pathogène indispensables à la pénétration du génome viral pathogène dans les cellules infectées, b) un génome défectif phylogéniquement proche de celui du dit virus pathogène, issu d'une construction génétique telle qu'il rend la chimère seule incapable, après pénétration dans les cellules cibles, d'engendrer la synthèse intracellulaire des polypeptides issus de son génome, c) un génome issu d'une construction génétique telle que le virus pathogène ait la capacité de servir de virus helper in vivo ou ex vivo pour la dite chimère, et tel que la présence du virus pathogène catalyse les dites synthèses intracellulaires issues du génome de la chimère mentionnées en b), une fois les mêmes cellules coinfectées par le virus pathogène et la chimère, d) un génome issu d'une construction génétique telle qu'il renferme une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour un ou plusieurs polypeptides impliqués dans l'antigénicité du virus pathogène, et telle que ces dit polypeptides contiennent un ou plusieurs épitoges identiques à ceux contre lesquels un ou plusieurs vaccins connus dirigent l'immunité.

   2. Chimère virale selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'ensemble des constituants décrit en a) sont remplacées par ceux issus d'un virus d'une souche apparentée au virus pathogène, développant le même tropisme cellulaire, 3. Chimère virale selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'ensemble des constituants décrit en a) sont remplacés par ceux appartenant à une souche distincte et non apparentée au virus pathogène, développant le même tropisme cellulaire, 4. Chimère virale selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'ensemble des constituants décrit en a) sont remplacés par ceux appartenant à une souche dont les constituants de la membrane et/ou de la capside comportent des polypeptides synthétiques construits par fusion de plusieurs parties de gènes différents codant pour des protéines virales appartenant à des espèces virales distinctes, et qui confèrent à la chimère le même tropisme cellulaire que celui du virus pathogène, 5. Chimère virale selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'ensemble des constituants décrit en a) est une combinaison quelconque de ceux selon l'une des revendications 2 à 4 et 1 a).

   6. Chimère virale selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée par la présence supplémentaire dans son génome d'un ou de plusieurs des gènes du virus pathogène associé possédant des délétions ou des insertions nucléotidiques, et/ou caractérisée par la présence supplémentaire dans son génome d'un ou de plusieurs gènes absents du génome du virus pathogène sauvage associé.

   7. Chimère virale selon la revendication 6 caractérisée en ce que le ou les gènes absents du génome du virus pathogène sauvage associé sont un ou plusieurs gènes ayant une activité antivirale, tel que les gènes codant pour les interférons, ou pour des composés qui en activent la synthèse, ou bien les gènes qui sont activés par les interférons, tels que par exemple les gènes des protéines Mx 1FN-inductibles, de la protéine kinase dsARN dépendante (PKR), des 2'-5' oligoadénylates synthétases, de l'endoribonucléase L, des caspases, de l'adénosine déaminase dsARN dépendante (ADAR), etc. 8. Chimère virale selon la revendication 6 caractérisée en ce que le ou les gènes absents du génome du virus pathogène sauvage associé sont un ou plusieurs gènes ayant une activité antiproliférative, qui inhibent la réplication virale en inhibant la croissance cellulaire, et/ou sont un ou plusieurs gènes qui induisent ou régulent l'apoptose, et/ou sont un ou plusieurs gènes dont l'activité est immunorégulatrice.

   9. Chimère virale selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée par la présence supplémentaire dans son génome d'une ou de plusieurs séquences polynucléotidiques codant pour un ou plusieurs ARN antisens de l'un des ARNm présent dans les cellules infectées, et/ou pour un ou plusieurs ARN ayant une activité catalytique (ribozyme) et/ou pour un ou plusieurs ARN d'interférence (interfering defective RNA), et/ou pour un ou plusieurs fragment d'ARN ou d'ADN présent dans la dite cellule, et/ou pour une ou de plusieurs séquences polynucléotidiques identiques à celle du génome du virus pathogène, tels que ces dernières agissent par compétition avec les dites séquences vis à vis d'une polymérase virale ou de toute autre protéine impliquée dans le cycle de vie du virus.

   10. Chimère virale selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée par la présence supplémentaire dans son génome d'une combinaison quelconque de deux ou plusieurs des

   éléments selon les revendications 6 à 9.

   11. Utilisation d'une ou de plusieurs chimères différentes selon l'une quelconque ou plusieurs des revendications précédentes pour engendrer ex vivo la transformation antigénique d'un virus.

   12. Préparation pharmaceutique thérapeutique et/ou prophylactique contre les maladies virales caractérisée en ce qu'elle contient une ou plusieurs chimères différentes selon l'une quelconque ou plusieurs des revendications 1 à 10, et éventuellement un adjuvant, et/ou un diluant, et/ou un excipient, et/ou un véhicule pharmaceutique acceptable.

   13. Utilisation d'une ou de plusieurs préparations pharmaceutiques synergiques selon la revendication 12 pour engendrer ex vivo la transformation antigénique d'un virus.

   14. Procédé de détection et/ou de quantification d'une infection virale selon lequel a) on détecte dans un échantillon biologique humain ou animal préalablement prélevé, tel qu'un liquide biologique, le dit humain ou animal ayant été préalablement vacciné avec un vaccin selon la revendication 1 et ayant préalablement reçu l'administration d'une préparation pharmaceutique selon la revendication 12, les anticorps dirigés contre les antigènes codés par le génome de la ou des chimères composant la dite préparation pharmaceutique, b) si souhaité on quantifie les anticorps de l'étape a) par rapport à une concentration de référence.

   15. Utilisation d'une préparation pharmaceutique selon la revendication 12 pour détecter et/ou diagnostiquer et/ou quantifier une infection virale par titration dans les liquides biologiques du taux des anticorps dirigés contre l'un ou plusieurs des antigènes codés par le génome de l'une ou de plusieurs des chimères composant une telle préparation.

   16. Chimère virale selon l'une des revendications 1 à 5 sans la caractéristique décrite en 1.d), et 30 caractérisée par la présence dans son génome de l'un ou d'une combinaison quelconque des éléments supplémentaires selon les revendications 6 à 10.

   17. Préparation pharmaceutique thérapeutique et/ou prophylactique contre les maladies virales caractérisée en ce qu'elle contient une ou plusieurs chimères différentes selon la revendication 35 16, et éventuellement une ou plusieurs des chimères parmis celles utilisées selon la revendication 12, et éventuellement un adjuvant, et/ou un diluant, et/ou un excipient, et/ou un véhicule pharmaceutique acceptable.

   18. Utilisation d'une composition thérapeutique ou d'une combinaison des compositions thérapeutiques selon les revendications 12 et/ou 17, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention d'une maladie virale.

   19. Utilisation d'une ou de plusieurs préparations pharmaceutiques selon les revendications 12 et 17, et/ou d'un ou plusieurs médicaments selon la revendication 18, couplée avec l'utilisation d'un vaccin.

   20. Virus chimérique de la grippe A caractérisé en ce qu'il comprend les constituants suivant a) des protéines de l'enveloppe M2, HA et NA ayant peu ou pas circulé au sein d'une population humaine, et n'engendrant de ce fait qu'une faible réaction immunitaire, in vivo, au sein de la dite population, b) des protéines PA, et/ou NP, et/ou PB', et/ou PB2 dont la séquence des acides aminés a été modifiée de telle manière à ce que I'ARN polymérase virale constitutive des cRNP du dit virus chimérique ait perdu ses propriétés de catalyse des ARNm, ou que la synthèse de ces dit ARNm soit négligeable, mais qu'elle ait conservé ses propriétés de réplication du génome, c) un génome comportant l'un ou une combinaison quelconque de plusieurs des éléments selon les revendications 1)d) et 6 à 9.

   21. Préparation pharmaceutique thérapeutique et/ou prophylactique contre la grippe caractérisée en ce qu'elle contient une ou plusieurs chimères différentes selon la revendication 20, et éventuellement un adjuvant, et/ou un diluant, et/ou un excipient, et/ou un véhicule pharmaceutique acceptable.

   22. Utilisation d'une composition thérapeutique ou d'une combinaison de compositions thérapeutiques selon la revendication 21, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement et/ou la prévention de la grippe.

   23. Utilisation d'une ou de plusieurs préparations pharmaceutiques selon la revendication 21, et/ou d'un ou plusieurs médicaments selon la revendication 22, couplée avec l'utilisation d'un vaccin, notamment d'un vaccin dirigé contre ta grippe.