CA2517375A1 - Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation - Google Patents
Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation Download PDFInfo
- Publication number
- CA2517375A1 CA2517375A1 CA002517375A CA2517375A CA2517375A1 CA 2517375 A1 CA2517375 A1 CA 2517375A1 CA 002517375 A CA002517375 A CA 002517375A CA 2517375 A CA2517375 A CA 2517375A CA 2517375 A1 CA2517375 A1 CA 2517375A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- recombinant
- virus
- sequence
- polynucleotide
- influenza
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 48
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 36
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 36
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 70
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 27
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 24
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 23
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 7
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 3
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 claims description 2
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 claims description 2
- 241001533467 Rubulavirus Species 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 claims 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 28
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 27
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 11
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 6
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 6
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 6
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 6
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005096 28S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 101100101428 Drosophila melanogaster heix gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 108700005089 MHC Class I Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- 241001122315 Polites Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un nouveau polynucléotide possédant une activité promotrice de transcription, des vecteurs contenant ce polynucléoti de et leur utilisation pour la transcription de séquences d'intérêt, telle que pour la production de virus ARN non coiffé. La présente invention concerne également les cellules hôtes, préférablement d'origine aviaire, contenant un polynucléotide ou un vecteur de l'invention.
Description
2 PCT/FR2004/000460 PROMOTEUR DE L'ARN POLYMÉRASE I DE POULET
ET S~1~~ UTILISATI~1~~
La présente invention concerne un nouveau p~lynucléotide possédant une activité promotrice de transcription, des vecteurs contenant ce polynucléotide et leur utilisation pour la transcription de séquences d'intérét, telle que pour la production de virus ARN non coiffé. La présente invention concerne également les cellules h~tes, préférablement d'origine aviaire, contenant un polynucléotide ou un vecteur de l'invention.
La prévention de la grippe repose essentiellement sur la vaccination, qui est fortement recommandée. Elle est par exemple prise en charge à 100 % en France par la . Caisse Nationale d'Assurance Maladie, chez les sujets à risques :
essentiellement les personnes âgées de 65 ans et plus, et les sujets atteints d'affections chroniques (respiratoires, cardiovasculaires, rénales, ou métaboliques). L'immunité post-vaccinale est conférée par la production d'anticorps dirigés contre les glycoprotéines de surface, notamment contre fhémagglutinine (HA) mais aussi contre la neuraminidase (NA).
I- Les méthodes actuelles : production sur neuf de poule embryonné, et inactivation Les vaccins antigrippaux sont composés de trois souches de virus différentes, fane de type A(H3N2), une autre de type A(H1N1) et la troisième de type B. Le choix des souches vaccinales est reconsidéré chaque année en fonction des données de la surveillance des variants en circulation, et fait l'objet d'une recommandation émise par fOMS vers la mi-février pour l'hémisphère nord. Les vaccins couramment utilisés depuis une trentaine d'années sont composés de virus multipliés sur neuf de poule embryonné et inactivés (Manuguerra, 2001, Repères sur les infections bronchopulmonaires, pp. 32~-342. Edited by P. Léophonte ~ ~'. Mouton: PIL).
Pour les virus de type A, des virus réassortants à haut pouvoir de multiplication sur neuf embryonné et possédant les HA et les NA des variants indiqués par f~MS sont préparés et fournis aux producteurs industriels de vaccins. Il faut compter un à deux neufs embryonnés pour fabriquer une dose de vaccin trivalent. La purification est réalisée de manière différente selon la société de fabrication, mais en suivant le même principe : le liquide allantoïque est prélevé et les virus sont inactivés par traitement au formaldéhyde ou à la 13-propiolactone, avant d'être purifiés par ultracentrifugation. Ils peuvent éventuellement étre fragmentés à l'aide de solvants de lipides et/ou de détergents tels que le T°v~een 80. Les virus entiers ou fragmentés sont ensuite ajustés à la dose habituelle de 15 ~.g de HA par dose de vaccin, pour chacune des souches.
LJne étape de purification en présence de détergent dialysable permet de produire un vaccin sous-unitaire, qui ne contient plus essentiellement que les glycoprotéines d'enveloppe (HA et IVA) du virus. IW fait de la plus forte réactogénicité du vaccin à base de virus entier, ce sont surtout les vaccins fragmentés et sous-unitaires qui sont désormais commercialisés. Le délai nécessaire à la production et au contrôle de la qualité du vaccin avant sa mise sur le marché en conformité avec les normes européennes est de l'ordre de 6 mois.
Composés de virus inactivés, les vaccins antigrippaux sont généralement très bien tolérés, et ne provoquent que de très faibles effets indésirables :
réactions locales au point d'injection, réactions fébriles et céphalées dans les deux jours suivant l'injection. Les contre-indications de la vaccination antigrippale se limitent aux allergies aux protéines de foeuf, principalement l'ovalbumine, et aux allergies à des résidus de fabrication ou au mercuro-thiolate. En l'absence d'information sur l'effet qu'elle peut avoir sur le développement foetal, la vaccination antigrippale est déconseillée chez la femme enceinte au premier trimestre de la grossesse.
L'efficacité avec laquelle les vaccins composés de virus inactivés protègent confire une infection grippale subséquente est difficile à évaluer, car elle peut varier énormément d'une saison à l'autre, en particulier en fonction du degré de parenté
antigénique entre les virus circulants et ceux inclus dans le vaccin, et elle dépend également du statut immunitaire du vacciné. En France, l'amélioration de la couverture vaccinale entre 1979 et 1999 s'est accompagnée d'une diminution de la mortalité liée à
la grippe (environ 20 000 morts par an en 1979, 2 500 morts par an depuis 1985), ce qui suggéra, sans pour autant le démontrer, un impact positif de la politique vaccinale. Par ailleurs, la compilation de nombreuses études a permis d'estimer que la vaccination chez les personnes ~.gées permet de diminuer de l'ordre de 50 % le nombre de pneumonies virales et d'hospitalisations, et de (ordre de 70 % le nombre de cas de grippe mortelle (cross et al., 1995, Annals of Internal Medecine, 123, 518-527).
ET S~1~~ UTILISATI~1~~
La présente invention concerne un nouveau p~lynucléotide possédant une activité promotrice de transcription, des vecteurs contenant ce polynucléotide et leur utilisation pour la transcription de séquences d'intérét, telle que pour la production de virus ARN non coiffé. La présente invention concerne également les cellules h~tes, préférablement d'origine aviaire, contenant un polynucléotide ou un vecteur de l'invention.
La prévention de la grippe repose essentiellement sur la vaccination, qui est fortement recommandée. Elle est par exemple prise en charge à 100 % en France par la . Caisse Nationale d'Assurance Maladie, chez les sujets à risques :
essentiellement les personnes âgées de 65 ans et plus, et les sujets atteints d'affections chroniques (respiratoires, cardiovasculaires, rénales, ou métaboliques). L'immunité post-vaccinale est conférée par la production d'anticorps dirigés contre les glycoprotéines de surface, notamment contre fhémagglutinine (HA) mais aussi contre la neuraminidase (NA).
I- Les méthodes actuelles : production sur neuf de poule embryonné, et inactivation Les vaccins antigrippaux sont composés de trois souches de virus différentes, fane de type A(H3N2), une autre de type A(H1N1) et la troisième de type B. Le choix des souches vaccinales est reconsidéré chaque année en fonction des données de la surveillance des variants en circulation, et fait l'objet d'une recommandation émise par fOMS vers la mi-février pour l'hémisphère nord. Les vaccins couramment utilisés depuis une trentaine d'années sont composés de virus multipliés sur neuf de poule embryonné et inactivés (Manuguerra, 2001, Repères sur les infections bronchopulmonaires, pp. 32~-342. Edited by P. Léophonte ~ ~'. Mouton: PIL).
Pour les virus de type A, des virus réassortants à haut pouvoir de multiplication sur neuf embryonné et possédant les HA et les NA des variants indiqués par f~MS sont préparés et fournis aux producteurs industriels de vaccins. Il faut compter un à deux neufs embryonnés pour fabriquer une dose de vaccin trivalent. La purification est réalisée de manière différente selon la société de fabrication, mais en suivant le même principe : le liquide allantoïque est prélevé et les virus sont inactivés par traitement au formaldéhyde ou à la 13-propiolactone, avant d'être purifiés par ultracentrifugation. Ils peuvent éventuellement étre fragmentés à l'aide de solvants de lipides et/ou de détergents tels que le T°v~een 80. Les virus entiers ou fragmentés sont ensuite ajustés à la dose habituelle de 15 ~.g de HA par dose de vaccin, pour chacune des souches.
LJne étape de purification en présence de détergent dialysable permet de produire un vaccin sous-unitaire, qui ne contient plus essentiellement que les glycoprotéines d'enveloppe (HA et IVA) du virus. IW fait de la plus forte réactogénicité du vaccin à base de virus entier, ce sont surtout les vaccins fragmentés et sous-unitaires qui sont désormais commercialisés. Le délai nécessaire à la production et au contrôle de la qualité du vaccin avant sa mise sur le marché en conformité avec les normes européennes est de l'ordre de 6 mois.
Composés de virus inactivés, les vaccins antigrippaux sont généralement très bien tolérés, et ne provoquent que de très faibles effets indésirables :
réactions locales au point d'injection, réactions fébriles et céphalées dans les deux jours suivant l'injection. Les contre-indications de la vaccination antigrippale se limitent aux allergies aux protéines de foeuf, principalement l'ovalbumine, et aux allergies à des résidus de fabrication ou au mercuro-thiolate. En l'absence d'information sur l'effet qu'elle peut avoir sur le développement foetal, la vaccination antigrippale est déconseillée chez la femme enceinte au premier trimestre de la grossesse.
L'efficacité avec laquelle les vaccins composés de virus inactivés protègent confire une infection grippale subséquente est difficile à évaluer, car elle peut varier énormément d'une saison à l'autre, en particulier en fonction du degré de parenté
antigénique entre les virus circulants et ceux inclus dans le vaccin, et elle dépend également du statut immunitaire du vacciné. En France, l'amélioration de la couverture vaccinale entre 1979 et 1999 s'est accompagnée d'une diminution de la mortalité liée à
la grippe (environ 20 000 morts par an en 1979, 2 500 morts par an depuis 1985), ce qui suggéra, sans pour autant le démontrer, un impact positif de la politique vaccinale. Par ailleurs, la compilation de nombreuses études a permis d'estimer que la vaccination chez les personnes ~.gées permet de diminuer de l'ordre de 50 % le nombre de pneumonies virales et d'hospitalisations, et de (ordre de 70 % le nombre de cas de grippe mortelle (cross et al., 1995, Annals of Internal Medecine, 123, 518-527).
3 II- Les perspectives d'évolution des vaccins antigrippaux Plusieurs voies de recherche sont actuellement explorées dans le but 1) d'améliorer l'intensité, la qualité, et la durée des réponses induites pai le vaccin antigrippal, et d'élargir leur spécificité ; et 2) de permettre une réponse rapide en cas d'émergence d'un virus de sous-type nouveau potentiellement pandémique. Les travaux concernant la production de vaccins vivants, d'une part, et la production de virus vaccinaux sur culture de cellules, d'autre part, sont résumés ci-dessous.
Parmi les autres voies de recherche explorées, on peut citer également l'utilisation d' adjuvants, de vaccins sous-unitaires recombinants ou de vaccins polynucléotidiques.
- Pr oduction de vaccins vivants Un vaccin antigrippal vivant est susceptible d'induire une immunité plus large et plus durable, en particulier du fait de la stimulation de l'immunité à
médiation cellulaire, et d'être mieux accepté par la population générale, parce qu'administré par voie nasale et non par voie parentérale. Deux types de vaccins vivants peuvent aujourd'hui être envisagés : les vaccins vivants atténués et les vaccins vivants recombinants.
Tlaccifzs vivants atténues Les souches atténuées sont obtenues par réassortiment des souches sauvages circulantes avec une souche donneuse atténuée par adaptation au froid, dont le génotype est bien caractérisé, sans toutefois que les relations entre les mutations observées et le phénotype (d'atténuation, d'adaptation au froid, de thermo sensibilité) ne soient parfaitement établies (Keitel et al., 1998, Textbook of Influenza, pp. 373-390. Edited by I~. G. Nicholson, R. G. Webster ~ A. J. Hay. Oxford, England: Blackwell Science, Ltd.).
Le procédé de production des vaccins atténués sur aeuf de poule embryonné est analogue à celui décrit ci-dessus, l'étape d'inactivation du virus étant bien entendu supprimée. Les résultats d'essais clinques menés récemment par des laboratoires américains indiquent que des vaccins trivalents composés de souches atténuées administrés par voie intranasale sont inoffensifs chez (adulte, les personnes àgées et les â0 enfants, avec comme seuls effets secondaires l'irritation de la, gorge et un écoulement nasal pendant les deux jours suivant la vaccination. Ils pourraient avoir une efficacité
protectrice supérieure à celle des vaccins inactivés, du fait en particulier de l'induction
Parmi les autres voies de recherche explorées, on peut citer également l'utilisation d' adjuvants, de vaccins sous-unitaires recombinants ou de vaccins polynucléotidiques.
- Pr oduction de vaccins vivants Un vaccin antigrippal vivant est susceptible d'induire une immunité plus large et plus durable, en particulier du fait de la stimulation de l'immunité à
médiation cellulaire, et d'être mieux accepté par la population générale, parce qu'administré par voie nasale et non par voie parentérale. Deux types de vaccins vivants peuvent aujourd'hui être envisagés : les vaccins vivants atténués et les vaccins vivants recombinants.
Tlaccifzs vivants atténues Les souches atténuées sont obtenues par réassortiment des souches sauvages circulantes avec une souche donneuse atténuée par adaptation au froid, dont le génotype est bien caractérisé, sans toutefois que les relations entre les mutations observées et le phénotype (d'atténuation, d'adaptation au froid, de thermo sensibilité) ne soient parfaitement établies (Keitel et al., 1998, Textbook of Influenza, pp. 373-390. Edited by I~. G. Nicholson, R. G. Webster ~ A. J. Hay. Oxford, England: Blackwell Science, Ltd.).
Le procédé de production des vaccins atténués sur aeuf de poule embryonné est analogue à celui décrit ci-dessus, l'étape d'inactivation du virus étant bien entendu supprimée. Les résultats d'essais clinques menés récemment par des laboratoires américains indiquent que des vaccins trivalents composés de souches atténuées administrés par voie intranasale sont inoffensifs chez (adulte, les personnes àgées et les â0 enfants, avec comme seuls effets secondaires l'irritation de la, gorge et un écoulement nasal pendant les deux jours suivant la vaccination. Ils pourraient avoir une efficacité
protectrice supérieure à celle des vaccins inactivés, du fait en particulier de l'induction
4 d'une réponse mucosale en anticorps de type IgA, mais leur potentiel de transmission et de réversion reste à documenter. La vaccination à (aide de virus vivants atténués est pratiquée à large échelle en Russie depuis plusieurs di~.ain es d'années, mais il est difficile d'en tirer des résultats globaux convaincants à cause d'une très grande dispersion des conditions employées.
Tlaccins vinants s°ec~rnbincznts La. mise au point récente de systèmes de génétique inverse pour les virus grippaux (Neumann et al., 2001, Virology 2~7, 243-50) permet d'envisager la production de virus recombinants dans le génome desquels des modiâxcations génétiques auraient été introduites spécifiquement afin de leur conférer des propriétés d'atténuation et d'immunogénicité adéquates. Cette approche présenterait une sécurité accrue (du fait de l'absence d'agents contaminants du type de ceux pouvant être présents dans les prélèvements à l'origine des souches virales, et de la possibilité de minimiser et contrôler plus aisément les risques de réversion du virus vaccinal) et permettrait de répondre de manière plus spécifique à des situations épidémiques variées. Les systèmes de génétique inverse existant à ce jour reposent sur l'utilisation du système de transcription de l'ARN polymérase I humaine. Du fait de la spécificité
d'espèce étroite de l'ARN polymérase I, leur utilisation est restreinte à des cellules d'origine humaine ou de primates. Ils pourraient s'appliquer à la production de virus vaccinaux recombinants sur culture de cellules, mais non sur neuf embryonné de poule.
- Production de virus vaccinaux sur culture de cellules Les principaux avantages des neufs embryonnés de poule comme support de la production de virus grippaux vaccinaux sont : i) un rendement de virus très élevé ; et ü) le moindre risque de contamination par des agents pathogènes pour l'homme, qui est tout particulièrement à prendre en compte dans la perspective de la production de vaccins non inactivés. La possibilité de produire des virus vaccinaux sur des cellules cultivées en milieu dépourvu de sérum est aussi explorée. Les industriels ~axter et Solvay ont récennnent fait homologuer des banques de cellules dérivées des lignées ~ero et IVIDCI~, respectivement, pour la production de virus vaccinaux. LTn vaccin ~0 produit sur ~DCI~ et inactivé a obtenu l'autorisation de mise sur le marché
en 2001, mais n'est pas encore commercialisé.
Le futur verra probablement co-exister sur le marché plusieurs types de vaccins anti-grippaux, inactivés ou vivants, produits sur neuf embryonné de poule ou sur cellules en culture, parmi lesquels certains se révèleront peut-âtre particuliérement indiqués pour la vaccination d'une certaine catégorie de sujets, et moins indiqués pour une autre. En
Tlaccins vinants s°ec~rnbincznts La. mise au point récente de systèmes de génétique inverse pour les virus grippaux (Neumann et al., 2001, Virology 2~7, 243-50) permet d'envisager la production de virus recombinants dans le génome desquels des modiâxcations génétiques auraient été introduites spécifiquement afin de leur conférer des propriétés d'atténuation et d'immunogénicité adéquates. Cette approche présenterait une sécurité accrue (du fait de l'absence d'agents contaminants du type de ceux pouvant être présents dans les prélèvements à l'origine des souches virales, et de la possibilité de minimiser et contrôler plus aisément les risques de réversion du virus vaccinal) et permettrait de répondre de manière plus spécifique à des situations épidémiques variées. Les systèmes de génétique inverse existant à ce jour reposent sur l'utilisation du système de transcription de l'ARN polymérase I humaine. Du fait de la spécificité
d'espèce étroite de l'ARN polymérase I, leur utilisation est restreinte à des cellules d'origine humaine ou de primates. Ils pourraient s'appliquer à la production de virus vaccinaux recombinants sur culture de cellules, mais non sur neuf embryonné de poule.
- Production de virus vaccinaux sur culture de cellules Les principaux avantages des neufs embryonnés de poule comme support de la production de virus grippaux vaccinaux sont : i) un rendement de virus très élevé ; et ü) le moindre risque de contamination par des agents pathogènes pour l'homme, qui est tout particulièrement à prendre en compte dans la perspective de la production de vaccins non inactivés. La possibilité de produire des virus vaccinaux sur des cellules cultivées en milieu dépourvu de sérum est aussi explorée. Les industriels ~axter et Solvay ont récennnent fait homologuer des banques de cellules dérivées des lignées ~ero et IVIDCI~, respectivement, pour la production de virus vaccinaux. LTn vaccin ~0 produit sur ~DCI~ et inactivé a obtenu l'autorisation de mise sur le marché
en 2001, mais n'est pas encore commercialisé.
Le futur verra probablement co-exister sur le marché plusieurs types de vaccins anti-grippaux, inactivés ou vivants, produits sur neuf embryonné de poule ou sur cellules en culture, parmi lesquels certains se révèleront peut-âtre particuliérement indiqués pour la vaccination d'une certaine catégorie de sujets, et moins indiqués pour une autre. En
5 cas de pandémie, tous les moyens de production disponibles, sur neufs embryonnés et sur cellules en culture, devront âtre mobilisés.
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention.
La présente invention concerne un polynucléotide, des ADN recombinants contenant ce polynucléotide et leur utilisation, préférablement pour la production de virus à ARN non coiffé pour fin de vaccination.
Plus spécifiquement, la présente invention a pour objet un polynucléotide isolé
ou purifié qui comprend la séquence SEQ ID NO: 1, présentée à la figure 1, ou un fragment de celui-ci, et qui possède préférablement une activité promotrice de transcription.
La présente invention concerne également un polynucléotide isolé ou purifié
comprenant la séquence SEQ ID NO: 2, présentée à la figure 2, ou un fragment de celui-ci, et possédant préférablement une activité promotrice de transcription.
L'invention concerne en outre un ADN recombinant comprenant un des polynucléotides de l'invention ou un fragment de celui-ci ; un vecteur comprenant un des polynucléotides de l'invention ou un ADN recombinant ou un fragment de ceux-ci ;
une cellule hôte et un neuf embryonné d'origine aviaire contenant un polynucléotide et/ou un ADN recombinant selon l'invention.
L'invention porte également sur l'utilisation d'au moins un des éléments suivants pour la production d'une séquence d'intérêt telle que par exemple un virus à
AIN non coiffé recombinant - un polynucléotide selon l'invention ;
~0 - un ADN reGO111b111a11t selon l'invention ;
- un vecteur selon l'invention ;
- une cellule hôte selon l'invention ; et
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention.
La présente invention concerne un polynucléotide, des ADN recombinants contenant ce polynucléotide et leur utilisation, préférablement pour la production de virus à ARN non coiffé pour fin de vaccination.
Plus spécifiquement, la présente invention a pour objet un polynucléotide isolé
ou purifié qui comprend la séquence SEQ ID NO: 1, présentée à la figure 1, ou un fragment de celui-ci, et qui possède préférablement une activité promotrice de transcription.
La présente invention concerne également un polynucléotide isolé ou purifié
comprenant la séquence SEQ ID NO: 2, présentée à la figure 2, ou un fragment de celui-ci, et possédant préférablement une activité promotrice de transcription.
L'invention concerne en outre un ADN recombinant comprenant un des polynucléotides de l'invention ou un fragment de celui-ci ; un vecteur comprenant un des polynucléotides de l'invention ou un ADN recombinant ou un fragment de ceux-ci ;
une cellule hôte et un neuf embryonné d'origine aviaire contenant un polynucléotide et/ou un ADN recombinant selon l'invention.
L'invention porte également sur l'utilisation d'au moins un des éléments suivants pour la production d'une séquence d'intérêt telle que par exemple un virus à
AIN non coiffé recombinant - un polynucléotide selon l'invention ;
~0 - un ADN reGO111b111a11t selon l'invention ;
- un vecteur selon l'invention ;
- une cellule hôte selon l'invention ; et
6 - un neuf embryonné d'origine aviaire selon l'invention.
D~.ns une mise en ouvre particuliére, l'invention concerne une méthode de production de virus non coiffés recombinants par génétique inverse, caractérise en ce qu'elle comprend les étapes suivantes a) introduction dans une cellule ou dans un neuf embryonné d'origine aviaire d'un ou de plusieurs vecteurs, ledit ou lesdits vecteurs comprenant un ADN
recombinant selon l'invention et les ADN exprimant les protéines nécessaires à la transcription/réplication de l'AIN viral ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus recombinants ; et c) récupération des virus recombinants obtenus en b).
Dans une mise en oeuvre préférée, la présente invention propose une méthode de production de virus grippaux recombinants par génétique inverse, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes a) introduction dans une cellule aviaire ou dans un neuf embryonné de poule d'au moins un vecteur comprenant un ADN recombinant selon un mode préféré de l'invention et de vecteurs exprimant les protéines PA, PB1, PB2 et NP d'un virus grippal ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus grippaux recombinants ; et c) récupération des virus grippaux recombinants obtenus en b).
L'invention vise une composition comprenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un virus recombinant produit par une méthode selon la présente invention.
L'invention vise particuliérement une composition antigrippale comprenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un virus grippal recombinant produit par une méthode de production selon la présente invention.
La présente invention concerne aussi une composition thérapeutique comprenant en outre une séquence transcrite par un polynucléotide de l'invention.
D~.ns une mise en ouvre particuliére, l'invention concerne une méthode de production de virus non coiffés recombinants par génétique inverse, caractérise en ce qu'elle comprend les étapes suivantes a) introduction dans une cellule ou dans un neuf embryonné d'origine aviaire d'un ou de plusieurs vecteurs, ledit ou lesdits vecteurs comprenant un ADN
recombinant selon l'invention et les ADN exprimant les protéines nécessaires à la transcription/réplication de l'AIN viral ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus recombinants ; et c) récupération des virus recombinants obtenus en b).
Dans une mise en oeuvre préférée, la présente invention propose une méthode de production de virus grippaux recombinants par génétique inverse, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes a) introduction dans une cellule aviaire ou dans un neuf embryonné de poule d'au moins un vecteur comprenant un ADN recombinant selon un mode préféré de l'invention et de vecteurs exprimant les protéines PA, PB1, PB2 et NP d'un virus grippal ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus grippaux recombinants ; et c) récupération des virus grippaux recombinants obtenus en b).
L'invention vise une composition comprenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un virus recombinant produit par une méthode selon la présente invention.
L'invention vise particuliérement une composition antigrippale comprenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un virus grippal recombinant produit par une méthode de production selon la présente invention.
La présente invention concerne aussi une composition thérapeutique comprenant en outre une séquence transcrite par un polynucléotide de l'invention.
7 Le clonage du promoteur de l'ARN polymérase I de poulet permet avantageusement de mettre au point un système de génétique inverse adapté à la production de virus vaccinaux recombinants sur ouf embryonné de poule, qui pourrait s'avérer particuliérement adaptée à la production de vaccins vivants.
BR~VE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 montre une séquence (SEQ ID NO: 1) correspondant au fragment AgeI-SacI de l'ADN génomique de poulet contenant le promoteur de l'ARN
polymérase I de poulet.
La Figure 2 montre un second fragment d'ADN génomique de poulet (BsaI-SacI) de séquence SEQ ID NO: 2 contenant le promoteur de l'ARN polymérase I de poulet.
La Figure 3 montre le protocole utilisé pour analyser l'efficacité de transcription de la séquence CAT à partir des séquences dérivées du cosmide C13-18.
La Figure 4 montre les résultats de l'analyse itérative de fragments de restriction dérivés du fragment PacI/NotI dérivé du cosmide C13-18.
La Figure 5 montre le résultat de réactions de séquençage et d'extension d'amorce menée en parallèle, qui mettent en évidence, au sein du fragment AgeI/SacI, décrit à la figure 1, le principal site d'initiation de la transcription par l'ARN
polymérase I de poulet.
La Figure 6 est un schéma montrant les niveaux de CAT mesurés dans les extraits cytoplasmiques de cellules transfectées avec des plasmides codant pour des pseudo ARN grippaux sous contrôle des promoteurs Poli humain ou de poulet (en ng/106 cellules transfectées et à 24 h post-transfection).
L'originalité de la présente invention porte sur une séquence polynucléotidique qui possède préférablement une activité promotrice de transcription, principalement dans les cellules aviaires. Les inventeurs ont identifié cette séquence promotrice comme étant le promoteur de l'ARN polymérase I de poulet.
L'111ventlon ~~llCeâlle aussi l'implication de ce polynucléotide dans la production de séquences d'intérêts, telles que par exemple des virus grippaux recombinants selon le système de génétique inverse.
BR~VE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 montre une séquence (SEQ ID NO: 1) correspondant au fragment AgeI-SacI de l'ADN génomique de poulet contenant le promoteur de l'ARN
polymérase I de poulet.
La Figure 2 montre un second fragment d'ADN génomique de poulet (BsaI-SacI) de séquence SEQ ID NO: 2 contenant le promoteur de l'ARN polymérase I de poulet.
La Figure 3 montre le protocole utilisé pour analyser l'efficacité de transcription de la séquence CAT à partir des séquences dérivées du cosmide C13-18.
La Figure 4 montre les résultats de l'analyse itérative de fragments de restriction dérivés du fragment PacI/NotI dérivé du cosmide C13-18.
La Figure 5 montre le résultat de réactions de séquençage et d'extension d'amorce menée en parallèle, qui mettent en évidence, au sein du fragment AgeI/SacI, décrit à la figure 1, le principal site d'initiation de la transcription par l'ARN
polymérase I de poulet.
La Figure 6 est un schéma montrant les niveaux de CAT mesurés dans les extraits cytoplasmiques de cellules transfectées avec des plasmides codant pour des pseudo ARN grippaux sous contrôle des promoteurs Poli humain ou de poulet (en ng/106 cellules transfectées et à 24 h post-transfection).
L'originalité de la présente invention porte sur une séquence polynucléotidique qui possède préférablement une activité promotrice de transcription, principalement dans les cellules aviaires. Les inventeurs ont identifié cette séquence promotrice comme étant le promoteur de l'ARN polymérase I de poulet.
L'111ventlon ~~llCeâlle aussi l'implication de ce polynucléotide dans la production de séquences d'intérêts, telles que par exemple des virus grippaux recombinants selon le système de génétique inverse.
8 1. Polynucléotide et ADN recombinant Selon un premier aspect, (invention vise un polynucléotide isolé ou purifié
comprenant la séquence SEQ ID N~: 1 présente à la figure 1 ou la séquence SE(~
~
N~: 2 présentée à la figure 2, ou un fragment de celles-ci. Préférablement, ce polynucléotide, ou l'un de ses fragments, posséda une activité promotrice de transcription.
Par fragments, on préféra les fragments dont la séquence comprend au moins 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 4~0, 45, 50, 60, 75 ou 100 nucléotides consécutifs de la séquence SE(~ ID N~: 1 ou SEQ ID N~: 2 et possédant une activité promotrice de transcription.
Bien que le polynucléotide ou le promoteur de l'invention se caractérise préférablement par le fait qu'il possède une activité promotrice de transcription dans les cellules aviaires, ce promoteur possède particulièrement la capacité de promouvoir la transcription dans les cellules de volaille, et encore plus particulièrement dans les cellules de poulet.
Par séquence nucléotidique, acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, séquence polynucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente demande, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un polynucléotide, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin ou à un ADN simple brin. Ceci inclut également les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. Il va de soi que les définitions "dérivé", "variant" et "muté" s'appliquent également aux polynucléotides selon la présente invention. Tout polynucléotide qui a été modifié chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement mais qui a conservé les propriétés du polynucléotide d'origine, c'est-à-dire, l'activité promotrice de transcription dans les cellules aviaires, est inclus dans la portée de la présente invention.
Il doit êtxe compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à
l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par clonage, amplification
comprenant la séquence SEQ ID N~: 1 présente à la figure 1 ou la séquence SE(~
~
N~: 2 présentée à la figure 2, ou un fragment de celles-ci. Préférablement, ce polynucléotide, ou l'un de ses fragments, posséda une activité promotrice de transcription.
Par fragments, on préféra les fragments dont la séquence comprend au moins 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 4~0, 45, 50, 60, 75 ou 100 nucléotides consécutifs de la séquence SE(~ ID N~: 1 ou SEQ ID N~: 2 et possédant une activité promotrice de transcription.
Bien que le polynucléotide ou le promoteur de l'invention se caractérise préférablement par le fait qu'il possède une activité promotrice de transcription dans les cellules aviaires, ce promoteur possède particulièrement la capacité de promouvoir la transcription dans les cellules de volaille, et encore plus particulièrement dans les cellules de poulet.
Par séquence nucléotidique, acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, séquence polynucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente demande, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un polynucléotide, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin ou à un ADN simple brin. Ceci inclut également les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. Il va de soi que les définitions "dérivé", "variant" et "muté" s'appliquent également aux polynucléotides selon la présente invention. Tout polynucléotide qui a été modifié chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement mais qui a conservé les propriétés du polynucléotide d'origine, c'est-à-dire, l'activité promotrice de transcription dans les cellules aviaires, est inclus dans la portée de la présente invention.
Il doit êtxe compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à
l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par clonage, amplification
9 et/ou synthèse chimique, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié.
Il doit âtre compris qu'un polynucléotide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de recombinaison est "isolé" méme si il est présent dans ledit organisme.
Les séquences promotrices selon l'invention possèdent préférablement une séquence d'ADN présentant un pourcentage d'identité de plus de 70 % avec l'une ou l'autTe des séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 décrites au~~ figures 1 et 2. Plus particulièrement, les séquences promotrices de l'invention présentent un pourcentage d'identité de plus de 80 %, et encore plus préférablement de 90 °/~
avec l'une ou l'autre des séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 décrites aux figures 1 et 2, ou un fragment de celles-ci. Par « pourcentage d'identité », on entend un pourcentage qui indique le degré d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques le long des séquences dans leur entier. Si les séquences considérées sont de taille différente, le pourcentage d'identité est exprimé en fonction de la longueur totale de la plus courte séquence. Pour calculer le pourcentage d'identité, les deux séquences sont superposées de façon à maximiser le nombre de bases identiques en autorisant des intervalles, puis le nombre de bases identiques est divisé par le nombre total de bases de la plus courte séquence.
Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus.
Cet ADN recombinant peut contenir, par exemple la séquence promotrice SEQ
ID NO: 1 présentée à la figure 1 ou SEQ ID NO: 2 présentée à la figure 2, ou un dérivé
de celles-ci, dans laquelle est inséré un site de clonage, facilitant ainsi l'utilisation de cette séquence cornlne promoteur « portable ». Selon un mode préféré, l'ADN
recombinant de la présente invention contient en outre une séquence à
transcrire. Par « séquence à transcrire » ou <e séquence d'intérêt », on entend une séquence pouvant servir de matrice pour synthétiser des molécules d'A1~N, telle des APvNv.
Préférablement, la séquence à transcrire est un ADNc de virus à A1~N non coiffé, c'est-à-dire que les extrémités du produit de transcription ne doivent pas contenir de â0 nucléotides supplémentaires. Plus préférablement, la séquence à transcrire est un ADNc de virus à ARN de polarité négative, tel un orthomyxovirus ou un paramyxovirus. A
titre d'exemple, l'orthomyxovirus est un Influenza, préférablement de type A, tandis que le paramyxovirus est préférablement choisi parmi le genre des Rubulavirus (préférablement le virus des oreillons ou le virus de la maladie de Newcastle), le genre des Morbilivi~-us (préférablement le virdas de l~, rougeole), le genre des Pneumovirus (préférablement le virus respiratoire syncitial) ou le genre des Métapneumovirus. Selon 5 un mode préféré de l'invention, l'ADN recombinant est caractérisé en ce qu'il exprime un ARNv d'un orthomyxovirus, tel un virus grippal et préférablement un ARNv choisi parmi les segments d'ARNv 1 à 8 du virus de l'influera. La e< séquence à
transcrire ~>
ou la <e séquence d'intérêt » peut également servir pour la production d'ARN
anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible (par exemple
Il doit âtre compris qu'un polynucléotide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de recombinaison est "isolé" méme si il est présent dans ledit organisme.
Les séquences promotrices selon l'invention possèdent préférablement une séquence d'ADN présentant un pourcentage d'identité de plus de 70 % avec l'une ou l'autTe des séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 décrites au~~ figures 1 et 2. Plus particulièrement, les séquences promotrices de l'invention présentent un pourcentage d'identité de plus de 80 %, et encore plus préférablement de 90 °/~
avec l'une ou l'autre des séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 décrites aux figures 1 et 2, ou un fragment de celles-ci. Par « pourcentage d'identité », on entend un pourcentage qui indique le degré d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques le long des séquences dans leur entier. Si les séquences considérées sont de taille différente, le pourcentage d'identité est exprimé en fonction de la longueur totale de la plus courte séquence. Pour calculer le pourcentage d'identité, les deux séquences sont superposées de façon à maximiser le nombre de bases identiques en autorisant des intervalles, puis le nombre de bases identiques est divisé par le nombre total de bases de la plus courte séquence.
Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus.
Cet ADN recombinant peut contenir, par exemple la séquence promotrice SEQ
ID NO: 1 présentée à la figure 1 ou SEQ ID NO: 2 présentée à la figure 2, ou un dérivé
de celles-ci, dans laquelle est inséré un site de clonage, facilitant ainsi l'utilisation de cette séquence cornlne promoteur « portable ». Selon un mode préféré, l'ADN
recombinant de la présente invention contient en outre une séquence à
transcrire. Par « séquence à transcrire » ou <e séquence d'intérêt », on entend une séquence pouvant servir de matrice pour synthétiser des molécules d'A1~N, telle des APvNv.
Préférablement, la séquence à transcrire est un ADNc de virus à A1~N non coiffé, c'est-à-dire que les extrémités du produit de transcription ne doivent pas contenir de â0 nucléotides supplémentaires. Plus préférablement, la séquence à transcrire est un ADNc de virus à ARN de polarité négative, tel un orthomyxovirus ou un paramyxovirus. A
titre d'exemple, l'orthomyxovirus est un Influenza, préférablement de type A, tandis que le paramyxovirus est préférablement choisi parmi le genre des Rubulavirus (préférablement le virus des oreillons ou le virus de la maladie de Newcastle), le genre des Morbilivi~-us (préférablement le virdas de l~, rougeole), le genre des Pneumovirus (préférablement le virus respiratoire syncitial) ou le genre des Métapneumovirus. Selon 5 un mode préféré de l'invention, l'ADN recombinant est caractérisé en ce qu'il exprime un ARNv d'un orthomyxovirus, tel un virus grippal et préférablement un ARNv choisi parmi les segments d'ARNv 1 à 8 du virus de l'influera. La e< séquence à
transcrire ~>
ou la <e séquence d'intérêt » peut également servir pour la production d'ARN
anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible (par exemple
10 un virus à ARN de polarité négative) une inhibition de la réplication ou transcription d'un ARN viral ou une inhibition de l'expression d'un produit protéique correspondant.
La présente invention concerne également des vecteurs contenant des ADN
recombinants comme décrits précédemment. Ces vecteurs permettent l'introduction et éventuellement l'expression de la séquence à transcrire dans une cellule hôte.
Comme exemple de vecteurs, on peut citer les vecteurs d'expression plasmidiques, les vecteurs viraux, les vecteurs intégratifs et les vecteurs autosomaux. Plus particulièrement, un vecteur selon la présente invention est le plasmide pGEM-ChPolI-C15. Ce plasmide est contenu dans la souche pGEM-ChPolI-C15-E.Coli 1305 déposée selon le traité de Budapest à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) Institut Pasteur 28, rue du Dr. Roux, 75724 PARIS (France) le 24 Février 2003 sous le numéro I-2976. Le plasmide pGEM-ChPolI-C15 est dérivé du plasmide pGEM52F+ (Promega).
Un fragment de restriction EaeI de 524 pb dérivé de la séquence codant la chloramphénicol acétyle transférase bactérienne (CAT) a été clonée au site NotI de pGEM52F+. Un fragment de restriction AgeI-SacI dérivé du cosmide C13-18 a été
cloné au niveau du site EcoRI de pGEMSF+, en amont de l'insert CAT. Ce fragment de 1260 pb contient le promoteur minimal de l'ARN polymérise I de poulet de la présente invention.
L'invention concerne aussi la production d'oiseaux transgéniques, exprimant sous contrôle du promoteur Poli des ARNs conférant une résistance contre des infections par des microorganismes pathogén es, en particulier confire les virus grippaux aviaires.
La présente invention concerne également des vecteurs contenant des ADN
recombinants comme décrits précédemment. Ces vecteurs permettent l'introduction et éventuellement l'expression de la séquence à transcrire dans une cellule hôte.
Comme exemple de vecteurs, on peut citer les vecteurs d'expression plasmidiques, les vecteurs viraux, les vecteurs intégratifs et les vecteurs autosomaux. Plus particulièrement, un vecteur selon la présente invention est le plasmide pGEM-ChPolI-C15. Ce plasmide est contenu dans la souche pGEM-ChPolI-C15-E.Coli 1305 déposée selon le traité de Budapest à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) Institut Pasteur 28, rue du Dr. Roux, 75724 PARIS (France) le 24 Février 2003 sous le numéro I-2976. Le plasmide pGEM-ChPolI-C15 est dérivé du plasmide pGEM52F+ (Promega).
Un fragment de restriction EaeI de 524 pb dérivé de la séquence codant la chloramphénicol acétyle transférase bactérienne (CAT) a été clonée au site NotI de pGEM52F+. Un fragment de restriction AgeI-SacI dérivé du cosmide C13-18 a été
cloné au niveau du site EcoRI de pGEMSF+, en amont de l'insert CAT. Ce fragment de 1260 pb contient le promoteur minimal de l'ARN polymérise I de poulet de la présente invention.
L'invention concerne aussi la production d'oiseaux transgéniques, exprimant sous contrôle du promoteur Poli des ARNs conférant une résistance contre des infections par des microorganismes pathogén es, en particulier confire les virus grippaux aviaires.
11 2. Cellule et neuf embryonné d'origine aviaire Selon un autre aspect, (invention concerne des cellules transformées par un polynucléotide, et/ou par un ADN recombinant et/ou par un vecteur tel que décrit précédemment. Préférablement, la cellule hôte ainsi transformée est d'origine aviaire.
Selon une variante préférée de l'invention, la cellule hôte est une cellule de volaille, et encore plus préférablement une cellule de poulet. Il est entendu qu'au sens de la présente invention les cellules hôtes transformées le sont préférablement de manière stable. Toutefois, il est envisageable de fournir des cellules transformées de manière transitoire.
Selon un aspect connexe, la présente invention concerne également des aeufs embryonnés « transfectés » d'origine aviaire (préférablement de poule). Plus particulièrement, les neufs embryonnés de la présente invention comprennent un polynucléotide, et/oû un ADN recombinant et/ou un vecteur tel que décrit précédemment.
Les procédés employés pour introduire un polynucléotide, et/ou un ADN
recombinant et/ou un vecteur tel que décrit précédemment dans une cellule hôte ou dans un neuf embryonné selon la présente invention reposent sur les connaissances générales d'une personne du métier en matière de transfection cellulaire et d'incubation d'oeuf, et ne seront donc pas décrits plus en détails.
3. Méthodes et procédé d'utilisation Selon un autre aspect, l'invention concerne la production de séquences d'intérêts telles que par exemple de virus vaccinaux recombinants, et plus particulièrement la production d'un virus à ARN non coiffé recombinant. Dans un aspect supplémentaire, l'invention vise l'utilisation d'au moins un des éléments suivants pour la production d'une séquence d'intérêt, par exemple d'un virus à ARN non coiffé recombinant - un polynucléotide selon l'invention ;
- un ADN recombinant selon l'invention ;
- un vecteur selon l'invention ;
â0 - une cellule hôte selon l'invention ; et - un neuf embryonné d'origine aviaire selon l'invention.
Selon une variante préférée de l'invention, la cellule hôte est une cellule de volaille, et encore plus préférablement une cellule de poulet. Il est entendu qu'au sens de la présente invention les cellules hôtes transformées le sont préférablement de manière stable. Toutefois, il est envisageable de fournir des cellules transformées de manière transitoire.
Selon un aspect connexe, la présente invention concerne également des aeufs embryonnés « transfectés » d'origine aviaire (préférablement de poule). Plus particulièrement, les neufs embryonnés de la présente invention comprennent un polynucléotide, et/oû un ADN recombinant et/ou un vecteur tel que décrit précédemment.
Les procédés employés pour introduire un polynucléotide, et/ou un ADN
recombinant et/ou un vecteur tel que décrit précédemment dans une cellule hôte ou dans un neuf embryonné selon la présente invention reposent sur les connaissances générales d'une personne du métier en matière de transfection cellulaire et d'incubation d'oeuf, et ne seront donc pas décrits plus en détails.
3. Méthodes et procédé d'utilisation Selon un autre aspect, l'invention concerne la production de séquences d'intérêts telles que par exemple de virus vaccinaux recombinants, et plus particulièrement la production d'un virus à ARN non coiffé recombinant. Dans un aspect supplémentaire, l'invention vise l'utilisation d'au moins un des éléments suivants pour la production d'une séquence d'intérêt, par exemple d'un virus à ARN non coiffé recombinant - un polynucléotide selon l'invention ;
- un ADN recombinant selon l'invention ;
- un vecteur selon l'invention ;
â0 - une cellule hôte selon l'invention ; et - un neuf embryonné d'origine aviaire selon l'invention.
12 PCT/FR2004/000460 Dans un aspect connexe, la présente invention propose une méthode de production de virus non coiffés recombinants. ZJne telle production se base sur le systéme de production de virus recombinants par génétique inverse tel que décrit précédemment. Plus particuliérement, la méthode selon la présente invention comprend les étapes suivantes a) introduction dans une cellule ou dans un ouf embryonné d'origine aviaire d'un ou de plusieurs vecteurs, ledit ou lesdits vecteurs comprenant un ADN
recombinant selon l'invention et les ADN exprimant les protéines nécessaires à la transcription/réplication de l'A1ZN viral (comme par exemple les protéines PA, PB 1, PB2 et NP d'un virus grippal) ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus recombinants ; et c) récupération des virus recombinants obtenus en b).
On comprendra qu'à l'étape a), tous les ADN (ADN recombinant selon l'invention et les ÄDN exprimant les protéines nécessaires à la transcription/réplication de l'ARN viral) peuvent être portés par un seul vecteur ou par deux vecteurs ou plus.
Selon une mise en oeuvre préférée, la présente invention propose également une méthode de production de virus grippaux recombinants, laquelle comprend les étapes suivantes a) introduction dans une cellule aviaire ou dans un neuf embryonné de poule d' au moins un vecteur comprenant préférentiellement un ADN recombinant exprimant un ARNv d'un virus grippal et de vecteurs exprimant les protéines PA, PB1, PB2 et NP d'un virus grippal tel l'influenza, préférablement de typeA;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus grippaux recombinants ; et c) récupération des virus grippaux recombinants obtenus en b).
On comprendra que l'étape c) des méthodes de l'invention, soit la récupération des virus recombinants, peut avoir lieu directement sur les cellules, après lyse cellulaire, ~0 ou bien à partir du surnageant. Dans le cas oû des veufs embryonnés sont utilisés, une personne versée dans le domaine saura les méthodes à utiliser afin de récupérer les virus recombinants ainsi produits.
recombinant selon l'invention et les ADN exprimant les protéines nécessaires à la transcription/réplication de l'A1ZN viral (comme par exemple les protéines PA, PB 1, PB2 et NP d'un virus grippal) ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus recombinants ; et c) récupération des virus recombinants obtenus en b).
On comprendra qu'à l'étape a), tous les ADN (ADN recombinant selon l'invention et les ÄDN exprimant les protéines nécessaires à la transcription/réplication de l'ARN viral) peuvent être portés par un seul vecteur ou par deux vecteurs ou plus.
Selon une mise en oeuvre préférée, la présente invention propose également une méthode de production de virus grippaux recombinants, laquelle comprend les étapes suivantes a) introduction dans une cellule aviaire ou dans un neuf embryonné de poule d' au moins un vecteur comprenant préférentiellement un ADN recombinant exprimant un ARNv d'un virus grippal et de vecteurs exprimant les protéines PA, PB1, PB2 et NP d'un virus grippal tel l'influenza, préférablement de typeA;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus grippaux recombinants ; et c) récupération des virus grippaux recombinants obtenus en b).
On comprendra que l'étape c) des méthodes de l'invention, soit la récupération des virus recombinants, peut avoir lieu directement sur les cellules, après lyse cellulaire, ~0 ou bien à partir du surnageant. Dans le cas oû des veufs embryonnés sont utilisés, une personne versée dans le domaine saura les méthodes à utiliser afin de récupérer les virus recombinants ainsi produits.
13 4. Compositions La présente invention porte également sur l'utilisation de ces polynucléotides et ~hT recornbinants et/ou vecteurs les contenant pour la préparation de composition pour fins de vaccination. Plus spécifiquement, une composition selon la présente invention comprend en outre une séquence transcrite par un polynucléotide précédemment décrit. Selon une mise en oruvre préférée, la présente invention porte sur l'utilisation de virus recombinants pour la préparation de compositions vaccinales.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de la présente invention contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et un virus recombinant obtenu grâce à une méthode de production de la présente invention.
Les compositions selon la présente invention peuvent se présenter sous une forme solide ou liquide quelconque habituelle pour (administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout autre support permettant par exemple la libération contrôlée. Parmi les compositions utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables plus particulièrement destinées aux injections dans la circulation sanguine chez (humain.
Une personne versée dans le domaine saura préparer des compositions pharmaceutiquement acceptables et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, le mode d'administration privilégié et 1a quantité devant être administrée. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix fon retrouve: la nature exacte des ingrédients, actifs ou non, entrant dans la composition, le type de maladie virale, la condition, (âge et le poids du patient, etc.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer (étendue de (utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modii~cations et variations peuvent y être effectues sans que fon échappe à l'esprit et à la portée de (invention.
Bien que l'on â0 puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que fon retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de la présente invention contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et un virus recombinant obtenu grâce à une méthode de production de la présente invention.
Les compositions selon la présente invention peuvent se présenter sous une forme solide ou liquide quelconque habituelle pour (administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout autre support permettant par exemple la libération contrôlée. Parmi les compositions utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables plus particulièrement destinées aux injections dans la circulation sanguine chez (humain.
Une personne versée dans le domaine saura préparer des compositions pharmaceutiquement acceptables et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, le mode d'administration privilégié et 1a quantité devant être administrée. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix fon retrouve: la nature exacte des ingrédients, actifs ou non, entrant dans la composition, le type de maladie virale, la condition, (âge et le poids du patient, etc.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer (étendue de (utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modii~cations et variations peuvent y être effectues sans que fon échappe à l'esprit et à la portée de (invention.
Bien que l'on â0 puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que fon retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
14 Les systèmes de génétique inverse utilisés afin d'obtenir des virus grippaux recombinants à partir d'ADNc clonés reposent tous sur la transfection de plasmides codant pour le.s AIT viraux (A~Nv) sous le contr~le du promoteur de l'UT
polymérase I humaine (Neumann et al., PNAS 96:9345-50, 1999 ; Fodor et al., J.
5jirol.
73:9679-82, 1999 ; Hoffman et al., PNAS 97:6108-13, 2000). L'utilisation de ce promoteur se justifie par le fait que les extrémités du produit de transcription ne doivent pas contenir de nucléotides supplémentaires (si c'est le cas, les signaux de transcription/réplication localisés au niveau des extrémités 5' et 3' non codantes des Al~Nv ne sont plus fonctionnels).
L'utilisation du promoteur de l'ARN polymérase I humaine assure l'initiation de la transcription à un site très précis, et donc l'exactitude de l'extrémité 5' des ARNv synthétisés dans les cellules transfectées. Mais ce type de système ne peut être appliqué
que sur des cellules d'origine humaine ou simienne, du fait de la très étroite spécificité
d'espèce des promoteurs des ARN polymérase I (Heix and Grummt, Curr. Op. Gent.
Dev. 5:652-56, 1995).
Or, disposer d'un système de génétique inverse applicable sur des cellules aviaires pourrait ouvrir la voie à la production de vaccins grippaux recombinants sur des Tufs de poule embryonnés, seul support actuellement autorisé pour la production du vaccin grippal aux Etats-Unis. La vaccination constitue à ce jour l'unique moyen de prévention contre la grippe, et elle est fortement reconunandée chez certaines catégories de sujets à risque. La fabrication du vaccin repose sur la multiplication de souches vaccinales sur neufs embryonnés, et nécessite, à chaque réactualisation de la composition vaccinale, de sélectionner des virus réassortants possédant les segments HA et NA représentatifs des souches circulantes, les autres segments dérivant d'une souche donneuse adaptée à la croissance sur neuf. Il pourrait étre avantageux de remplacer ce processus long et aléatoire par la production de virus réassortants par génétique inverse sur neuf embryonné.
Ainsi, dans la perspective de mettre au point un système de production de virus grippaux recombinants par génétique inverse sur cellules aviaires, les inventeurs ont entrepris de cloner le promoteur de l'A1~N polynérase I de poulet. Un clonage par PCI~
basé sur les homologies entre séquences nucléotidiques des promoteurs Poli clonés à ce jour n'était pas envisageable, car les systèmes de transcription PoII sont extrémement divergents d'une espèce à l'autre. Ils ont donc procédé à un criblage de tout ou partie du génome de poulet.
~b~t~~atn~xn du ~o~de C~~3-~~
La cartographie du génome du poulet indiquait que les gènes codant les ARN
5 ribosomaux (locus NOR) étaient situés sur le chromosome 16, à proximité du locus des gènes du complexe d'histocompatibilité (Schmid et al., Cytogenet. Cell Genet., 90:169 218, 2000). Le laboratoire du Pr. H. Auffray, dont une partie des travaux à
(Institut Gustave Roussy de Villejuif portent sur le complexe majeur d'histocompatibilité, a publié en 1988 des données concernant un cosmide recombinant (C13-18) contenant 10 30kb d'ADN génomique de poulet, parmi lesquelles les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité, mais aussi plusieurs unités de transcription du locus NOR, et par conséquent au moins un exemplaire du promoteur Poli (Guillemot et al., EMBO
J., 7:2775-85, 1988). Ce cosmide a été aimablement fourni par R. Zoorob.
2) Analyse du cosmide C13-18 par Southern blot
polymérase I humaine (Neumann et al., PNAS 96:9345-50, 1999 ; Fodor et al., J.
5jirol.
73:9679-82, 1999 ; Hoffman et al., PNAS 97:6108-13, 2000). L'utilisation de ce promoteur se justifie par le fait que les extrémités du produit de transcription ne doivent pas contenir de nucléotides supplémentaires (si c'est le cas, les signaux de transcription/réplication localisés au niveau des extrémités 5' et 3' non codantes des Al~Nv ne sont plus fonctionnels).
L'utilisation du promoteur de l'ARN polymérase I humaine assure l'initiation de la transcription à un site très précis, et donc l'exactitude de l'extrémité 5' des ARNv synthétisés dans les cellules transfectées. Mais ce type de système ne peut être appliqué
que sur des cellules d'origine humaine ou simienne, du fait de la très étroite spécificité
d'espèce des promoteurs des ARN polymérase I (Heix and Grummt, Curr. Op. Gent.
Dev. 5:652-56, 1995).
Or, disposer d'un système de génétique inverse applicable sur des cellules aviaires pourrait ouvrir la voie à la production de vaccins grippaux recombinants sur des Tufs de poule embryonnés, seul support actuellement autorisé pour la production du vaccin grippal aux Etats-Unis. La vaccination constitue à ce jour l'unique moyen de prévention contre la grippe, et elle est fortement reconunandée chez certaines catégories de sujets à risque. La fabrication du vaccin repose sur la multiplication de souches vaccinales sur neufs embryonnés, et nécessite, à chaque réactualisation de la composition vaccinale, de sélectionner des virus réassortants possédant les segments HA et NA représentatifs des souches circulantes, les autres segments dérivant d'une souche donneuse adaptée à la croissance sur neuf. Il pourrait étre avantageux de remplacer ce processus long et aléatoire par la production de virus réassortants par génétique inverse sur neuf embryonné.
Ainsi, dans la perspective de mettre au point un système de production de virus grippaux recombinants par génétique inverse sur cellules aviaires, les inventeurs ont entrepris de cloner le promoteur de l'A1~N polynérase I de poulet. Un clonage par PCI~
basé sur les homologies entre séquences nucléotidiques des promoteurs Poli clonés à ce jour n'était pas envisageable, car les systèmes de transcription PoII sont extrémement divergents d'une espèce à l'autre. Ils ont donc procédé à un criblage de tout ou partie du génome de poulet.
~b~t~~atn~xn du ~o~de C~~3-~~
La cartographie du génome du poulet indiquait que les gènes codant les ARN
5 ribosomaux (locus NOR) étaient situés sur le chromosome 16, à proximité du locus des gènes du complexe d'histocompatibilité (Schmid et al., Cytogenet. Cell Genet., 90:169 218, 2000). Le laboratoire du Pr. H. Auffray, dont une partie des travaux à
(Institut Gustave Roussy de Villejuif portent sur le complexe majeur d'histocompatibilité, a publié en 1988 des données concernant un cosmide recombinant (C13-18) contenant 10 30kb d'ADN génomique de poulet, parmi lesquelles les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité, mais aussi plusieurs unités de transcription du locus NOR, et par conséquent au moins un exemplaire du promoteur Poli (Guillemot et al., EMBO
J., 7:2775-85, 1988). Ce cosmide a été aimablement fourni par R. Zoorob.
2) Analyse du cosmide C13-18 par Southern blot
15 Le cosmide C13-18 a été analysé par Southern blot après digestion par les enzymes de restriction NotI, PacI, et SfiI, isolément ou en combinaison, et en utilisant comme sonde des oligonucléotides choisis sur la base des données de séquençage partiel des ARN ribosomaux de poulet disponibles dans les banques oligonucléotide 28S/+/2 : 5'-GAGTCAGCCCTCGACACAAGCTTTTG-3' (SEQ ID
NO: 3) ;
oligonucléotide 18S/-/1.5 : 5'-CTACTGGCAGGATCAACCAGGT-3' (SEQ ID NO:
4) ; et oligonucléotide 18S/-/4 : 5'-TAGAGGAGAACGCGACCTCGAGAC-3' (SEQ ID NO:
5).
Cette analyse a permis de reconstituer une carte de restriction grossière du cosmide C13-18, et de positionner les ARN ribosomaux 18S et 28S par rapport aux divers sites de restriction localisés sur le cosmide. Elle a débouché sur l'identification d'un fragment PacI-NotI de 16 kb environ, correspondant à la majeure partie d'une région intergénique, et par conséquent très susceptible de contenir une copie de la â0 séquence du promoteur Poli.
NO: 3) ;
oligonucléotide 18S/-/1.5 : 5'-CTACTGGCAGGATCAACCAGGT-3' (SEQ ID NO:
4) ; et oligonucléotide 18S/-/4 : 5'-TAGAGGAGAACGCGACCTCGAGAC-3' (SEQ ID NO:
5).
Cette analyse a permis de reconstituer une carte de restriction grossière du cosmide C13-18, et de positionner les ARN ribosomaux 18S et 28S par rapport aux divers sites de restriction localisés sur le cosmide. Elle a débouché sur l'identification d'un fragment PacI-NotI de 16 kb environ, correspondant à la majeure partie d'une région intergénique, et par conséquent très susceptible de contenir une copie de la â0 séquence du promoteur Poli.
16 3) Clonage du fragment de restriction PacI-NotI dans un vecteur '~rapp~rteur9~, et mise en évidence de la présence d9un promoteur trarn~c~ripti~n~ael a~n seiaa du fragnae~at I~'acTl-I'Jotl Afin dc tester la présence dc la séquence du promoteur PoII au sein du fragment de restriction PacI-NotI, les inventeurs ont cherché à cloner ec dernier en amont d'une séquence rapporteur.
Dans ce but, le cosmide pTCF (Grosvcld ct al., 192, Nucleic Acids Res., 10, 6715-32), qui possède un unique site de clonage Sali, a été modifié, par insertion d'une séquence synthétique contenant des sites dc clonages multiples (StuI-PacI-NotI-PmeI) au niveau du site SaII.
Le fragment PacI-NotI de 16 kb dérivé de C13-1~ a été cloné dans le cosmide pTCF modifié, au niveau des sites PacI et NotI nouvellément introduits. Deux clones de cosmides recombinants pTCF-(PacI-NotI) ont été sélectionnés (n° 2.5 et 2.7). Puis un fragment de restriction EaeI de SOOpb, dérivé du gène bactérien de la chloramphénicol acétyle transférase (CAT) a été cloné au niveau du site NotI des cosmides pTCF-(PacI-NotI), dans l'une et l'autre orientation. Quatre clones de cosmides recombinants ont été
sélectionnés : n° 2.5.3 et n° 2.7.13 (CAT en orientation +), n° 2.5.4 et n° 2.7.16 (CAT
en orientation -).
Afin de tester la présence de la séquence du promoteur PoII au sein du fragment de restriction PacI-NotI, des cellules de la lignée QT6 (fibrosarcome de caille) ont été
transfectées avec les cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(+) et pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-).
Les ARNs ont été extraits des cellules 24 heures après transfection à l'aide du réactif "TriZol" (Gibco-BRL) et traités à la DNase (RNase-free DNase, Ambion) afin d'éliminer les molécules de cosmide contaminant les préparations d'ARN. Les ARNs ont été déposés sur une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham) à raison de 5 ~,g par point, et hybridés avec une ribosonde marquée au 32P, correspondant à la séquence CAT(+). Des signaux positifs ont été obtenus avec les ARNs préparés à partir des cellules transfcctécs avec les cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-) n°
2.5.4 ct 2.7.16, suggérant la présence d'un promoteur transcriptionnel dans le fragment de restriction PacI-NotI. Dans ces premières expériences, lc rapport signal/Uruit de fond était néanmoins assez faible. Il a été amélioré dans les expériences suivantes après optimisation des conditions de traitement des ARNs à la DNase (durant 2 fois 1 heure à
Dans ce but, le cosmide pTCF (Grosvcld ct al., 192, Nucleic Acids Res., 10, 6715-32), qui possède un unique site de clonage Sali, a été modifié, par insertion d'une séquence synthétique contenant des sites dc clonages multiples (StuI-PacI-NotI-PmeI) au niveau du site SaII.
Le fragment PacI-NotI de 16 kb dérivé de C13-1~ a été cloné dans le cosmide pTCF modifié, au niveau des sites PacI et NotI nouvellément introduits. Deux clones de cosmides recombinants pTCF-(PacI-NotI) ont été sélectionnés (n° 2.5 et 2.7). Puis un fragment de restriction EaeI de SOOpb, dérivé du gène bactérien de la chloramphénicol acétyle transférase (CAT) a été cloné au niveau du site NotI des cosmides pTCF-(PacI-NotI), dans l'une et l'autre orientation. Quatre clones de cosmides recombinants ont été
sélectionnés : n° 2.5.3 et n° 2.7.13 (CAT en orientation +), n° 2.5.4 et n° 2.7.16 (CAT
en orientation -).
Afin de tester la présence de la séquence du promoteur PoII au sein du fragment de restriction PacI-NotI, des cellules de la lignée QT6 (fibrosarcome de caille) ont été
transfectées avec les cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(+) et pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-).
Les ARNs ont été extraits des cellules 24 heures après transfection à l'aide du réactif "TriZol" (Gibco-BRL) et traités à la DNase (RNase-free DNase, Ambion) afin d'éliminer les molécules de cosmide contaminant les préparations d'ARN. Les ARNs ont été déposés sur une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham) à raison de 5 ~,g par point, et hybridés avec une ribosonde marquée au 32P, correspondant à la séquence CAT(+). Des signaux positifs ont été obtenus avec les ARNs préparés à partir des cellules transfcctécs avec les cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-) n°
2.5.4 ct 2.7.16, suggérant la présence d'un promoteur transcriptionnel dans le fragment de restriction PacI-NotI. Dans ces premières expériences, lc rapport signal/Uruit de fond était néanmoins assez faible. Il a été amélioré dans les expériences suivantes après optimisation des conditions de traitement des ARNs à la DNase (durant 2 fois 1 heure à
17 37°C en présence de 8 unités d'enzyme) et des conditions d'hybridation et de lavage des membranes (hybridation durant la nuit à 65°C dans un tampon formamide 50 ~/o, SSC
5~, Denhart 5~, SDS 0,5 ~/~ 9 2 lavages de 10 mn à température ambiante dans un tampon SSC '?~, SDS 0,1 °f~, suivis de 2 lavages de 10 nm à 65°C
dans un tampon SSC
0,2~, SDS 0,1 °/~). La méthodologie, qui a été appliquée ensuite de maniére itérative pour examiner la présence d'un promoteur transcriptionnel dans des fragments de restriction dérivés du fragment PacI-NotI, est récapitulée à la figure 3. Les résultats obtenus sont détaillés ci-dessous, et récapitulés à la figure 4~.
4) ~réatnon de délétions partielles au ~cin du fragment dc restriction Pacl-l~otl cloné dans le vecteur r apporteur, et mise en évidence de la présence d'un promoteur transcriptionnel dans un fragment SfiI-NotI d'environ 6 kb Afin d'identifier plus précisément la région du fragment PacI-NotI contenant le promoteur, des délétions partielles du fragment PacI-NotI ont été obtenues par digestion des cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-) n° 2.7.16 et pTCF-(PacI-Notl)-CAT(+) n° 2.7.13 avec les combinaisons d'enzymes PacI-SfiI ou SfiI-NotI (le site SfiI étant situé au sein du fragment PacI-NotI), remplissage des extrémités à l'aide de la sous-unité I~leenow de l'ADN Poli d'E. Coli, et religation des molécules obtenues sur elles-mêmes. La présence d'un promoteur transcriptionnel au sein des cosmides délétés a été
testée en utilisant la méthodologie décrite ci-dessus (transfection de cellules QT6 et analyse des ARN extraits des cellules transfectées par hybridation avec une sonde CAT). Les résultats obtenus ont suggéré qu'un promoteur transcriptionnel était présent dans les cosmides ayant retenu la portion SfiI-NotI (de 6 kb environ) du fragment PacI-NotI.
5) Analyse itérative de fragments de restriction dérivés du fragment Siii-NotI, et mise en évidence de la présence d'un promoteur transcriptionnel dans un fragment AgeI-SacI de 1200 pb A cette étape, et afin de poursuivre l'analyse de fragments de restriction dérivés du fragment SfiI-NotI selon la même méthodologie, un nouveau vecteur rapporteur a été
construit. En effet, les fragments de restriction analysés avaient désormais une taille â0 suffisamment réduite pour pouvoir étre clou és dans un plasmide.
Ce nouveau vecteur rapporteur a été construit à partir du plasmide pGEM-5-zf+
(Promega), dans lequel le fragment EaeI de SOOpb dérivé du gène bactérien CAT
a été
5~, Denhart 5~, SDS 0,5 ~/~ 9 2 lavages de 10 mn à température ambiante dans un tampon SSC '?~, SDS 0,1 °f~, suivis de 2 lavages de 10 nm à 65°C
dans un tampon SSC
0,2~, SDS 0,1 °/~). La méthodologie, qui a été appliquée ensuite de maniére itérative pour examiner la présence d'un promoteur transcriptionnel dans des fragments de restriction dérivés du fragment PacI-NotI, est récapitulée à la figure 3. Les résultats obtenus sont détaillés ci-dessous, et récapitulés à la figure 4~.
4) ~réatnon de délétions partielles au ~cin du fragment dc restriction Pacl-l~otl cloné dans le vecteur r apporteur, et mise en évidence de la présence d'un promoteur transcriptionnel dans un fragment SfiI-NotI d'environ 6 kb Afin d'identifier plus précisément la région du fragment PacI-NotI contenant le promoteur, des délétions partielles du fragment PacI-NotI ont été obtenues par digestion des cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-) n° 2.7.16 et pTCF-(PacI-Notl)-CAT(+) n° 2.7.13 avec les combinaisons d'enzymes PacI-SfiI ou SfiI-NotI (le site SfiI étant situé au sein du fragment PacI-NotI), remplissage des extrémités à l'aide de la sous-unité I~leenow de l'ADN Poli d'E. Coli, et religation des molécules obtenues sur elles-mêmes. La présence d'un promoteur transcriptionnel au sein des cosmides délétés a été
testée en utilisant la méthodologie décrite ci-dessus (transfection de cellules QT6 et analyse des ARN extraits des cellules transfectées par hybridation avec une sonde CAT). Les résultats obtenus ont suggéré qu'un promoteur transcriptionnel était présent dans les cosmides ayant retenu la portion SfiI-NotI (de 6 kb environ) du fragment PacI-NotI.
5) Analyse itérative de fragments de restriction dérivés du fragment Siii-NotI, et mise en évidence de la présence d'un promoteur transcriptionnel dans un fragment AgeI-SacI de 1200 pb A cette étape, et afin de poursuivre l'analyse de fragments de restriction dérivés du fragment SfiI-NotI selon la même méthodologie, un nouveau vecteur rapporteur a été
construit. En effet, les fragments de restriction analysés avaient désormais une taille â0 suffisamment réduite pour pouvoir étre clou és dans un plasmide.
Ce nouveau vecteur rapporteur a été construit à partir du plasmide pGEM-5-zf+
(Promega), dans lequel le fragment EaeI de SOOpb dérivé du gène bactérien CAT
a été
18 cloné en orientation (+) au niveau du site unique NotI. Seule cette orientation de la séquence CAT dans le vecteur rapporteur a été utilisée, car les expériences précédentes avaient indiqué que le couple séquence rapporteur CAT (+) / ribosonde C.AT (-) donnait des résultats plus spécifiques et reproductibles que le couple séquence rapporteur CAT
(-) / ribosonde CAT (+).
Les fragments de restriction SfiI-SacI (dans la pratique, un fragment StuI-SacI
incluant le fragment SfxI-SacI) et SacI-NotI dérivés du fragment SfiI-NotI ont été sous-clonés au niveau du site EcoRV du vecteur pGEM-CAT(+) (clone n° 9), situé en amont de la séquence rapporteur CAT. Par la méthodologie décrite ci-dessus, la présence d'un promoteur transcriptionnel a été mise en évidence dans le fragment StuI-SacI, cloné
dans le plasmide pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) (clone n° 12).
Uné carte de restriction du fragment StuI-SacI, reposant sur des digestions du plasmide pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) n° 12 avec les enzymes de restriction SmaI et AgeI, a été établie. Deux fragments de restriction SmaI-SmaI, un fragment de restriction AgeI-AgeI, et le fragment StuI-SacI délété de ce fragment de restriction AgeI-AgeI, ont été sous-clonés dans le vecteur pGEM-CAT(+) n° 9 au niveau du site EcoRV. La présence d'un promoteur transcriptionnel a été mise en évidence dans le fragment StuI-SacI délété du fragment AgeI-AgeI, cloné dans le plasmide appelé par commodité
AgeI (clone n° 29).
Le fragment StuI-SacI délété a été découpé en deux fragments StuI-AgeI et AgeI-SacI, obtenus par digestion du plasmide V12-AgeI n° 29 par les enzymes de restriction NcoI + AgeI d'une part (pour le fragment StuI-AgeI), et AgeI +
NotI d'autre part (pour le fragment AgeI-SacI). Chacun des deux fragments a été sous-cloné
dans le vecteur pGEM-CAT(+) au niveau du site EcoRV. La présence d'un promoteur transcriptionnel a été mise en évidence dans le fragment AgeI-SacI de 1200 pb, cloné
dans le plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (clone n° 15).
6) Séquen~agc clu fr~grtmnt Agef-Sac~~ et eléte~aninati~n du p~int d9inntiati0n de lai t~an~~rilati~xa ~pa~ Ia tcehniquc d~e~~ten~i~n ci'aa~r~~g~c Le fragment AgeI-SacI cloné dans le plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n°
15 a été
séquencé. La séquence est représentée ~ la figure 1 (SES ID N~: 1).
Les 800 pb distales de cette séquence contiennent 8 répétitions d'une séquence d'environ 90 nucléotides, ce qui est caractéristique des promoteurs Poli : en effet la
(-) / ribosonde CAT (+).
Les fragments de restriction SfiI-SacI (dans la pratique, un fragment StuI-SacI
incluant le fragment SfxI-SacI) et SacI-NotI dérivés du fragment SfiI-NotI ont été sous-clonés au niveau du site EcoRV du vecteur pGEM-CAT(+) (clone n° 9), situé en amont de la séquence rapporteur CAT. Par la méthodologie décrite ci-dessus, la présence d'un promoteur transcriptionnel a été mise en évidence dans le fragment StuI-SacI, cloné
dans le plasmide pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) (clone n° 12).
Uné carte de restriction du fragment StuI-SacI, reposant sur des digestions du plasmide pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) n° 12 avec les enzymes de restriction SmaI et AgeI, a été établie. Deux fragments de restriction SmaI-SmaI, un fragment de restriction AgeI-AgeI, et le fragment StuI-SacI délété de ce fragment de restriction AgeI-AgeI, ont été sous-clonés dans le vecteur pGEM-CAT(+) n° 9 au niveau du site EcoRV. La présence d'un promoteur transcriptionnel a été mise en évidence dans le fragment StuI-SacI délété du fragment AgeI-AgeI, cloné dans le plasmide appelé par commodité
AgeI (clone n° 29).
Le fragment StuI-SacI délété a été découpé en deux fragments StuI-AgeI et AgeI-SacI, obtenus par digestion du plasmide V12-AgeI n° 29 par les enzymes de restriction NcoI + AgeI d'une part (pour le fragment StuI-AgeI), et AgeI +
NotI d'autre part (pour le fragment AgeI-SacI). Chacun des deux fragments a été sous-cloné
dans le vecteur pGEM-CAT(+) au niveau du site EcoRV. La présence d'un promoteur transcriptionnel a été mise en évidence dans le fragment AgeI-SacI de 1200 pb, cloné
dans le plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (clone n° 15).
6) Séquen~agc clu fr~grtmnt Agef-Sac~~ et eléte~aninati~n du p~int d9inntiati0n de lai t~an~~rilati~xa ~pa~ Ia tcehniquc d~e~~ten~i~n ci'aa~r~~g~c Le fragment AgeI-SacI cloné dans le plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n°
15 a été
séquencé. La séquence est représentée ~ la figure 1 (SES ID N~: 1).
Les 800 pb distales de cette séquence contiennent 8 répétitions d'une séquence d'environ 90 nucléotides, ce qui est caractéristique des promoteurs Poli : en effet la
19 présence de séquences activatrices répétées en amont du site d'initiation de la transcription a été décrite pour plusieurs promoteurs Poli dérivés d'autres espèces (Paule M., 1995, Promoter Structure of Class I Genes. In Tr°~!rrs~f°~~a~~~gT ~f IZâb~s~yrcc~l I~I~~1 CBe~es by E~cl~;~ray~ti~ ~~1 h~lyrazef~czse l: Edited by I~1. R. Paule:
Springer-élerlag and IZ.G. Landes Company).
Le site précis de l'initiation de la transcription du promoteur PoII de poulet a donc été recherché dans les 400 pb proximales du fragment AgeI-SacI, par la technique d'extension d'amorce. Un oligonucléotide complémentaire de la séquence CAT
transcrite à partir du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (séquence SEQ ID N~: 6 5'-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG-3') a été marqué avec du 32P à son extrémité
5' à l'aide de la polynucléotide kinase du phage T4 (Biolabs) et utilisé dans deux réactions en parallèle : 1) comme amorce pour l'extension d'un ADN
complémentaire des ARN CAT extraits de cellules QT6 transfectées avec le plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n° 15, en présence de transcriptase inverse (SuperScript II, Invitrogen), et 2) comme amorce pour le séquençage du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n° 15, à
l'aide du kit « T7 Sequencing I~it » (Pharmacie Biotech). Un produit de transcription unique a été détecté dans la réaction d'extension d'amorce, confirmant l'existence d'un site très précis d'initiation de la transcription. Ce dernier a été localisé
dans une région riche en A et T, en accord avec les données disponibles pour les promoteurs PoII dérivés d'autres espèces, située à environ 200 pb de l'oligonucléotide utilisé comme amorce.
En parallèle, l'analyse de fragments de restriction dérivés du fragment AgeI-SacI
a été poursuivie afin de délimiter le promoteur minimal (qui correspond à une région de l'ordre de 250 pb pour les promoteurs Poli d'autres espèces) (voir figure 5).
Le fragment AgeI-SacI a été découpé en trois fragments AgeI-BsaI, BsaI-BsaI et BsaI-SacI, obtenus par digestion du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n° 15 par les enzymes de restriction NcoI + BsaI d'une part (pour les fragment AgeI-BsaI et BsaI-BsaI), et BsaI + NotI d'autre part (pour le frag~.nent BsaI-SacI). Chacun des deux fragments a été sous-cloné dans le vecteur pGEM-CAT(+) au niveau du site EcoIZéj.
Seul le fragment BsaI-SacI d'environ 600 pb (figure 2), cloné dans le plasmide pGEM-(BsaI-SacI)-CAT(+) (clone n° 16), permet la transcription de la séquence rapporteur CAT, ce qui est parfaitement cohérent avec le fait qu'il s'agit du fragment proximal dans lequel a été localisé le site d'initiation de la transcription.
Le nucléotide +1 au site d'initiation de la transcription a été déterminé par la technique d'extension d'amorce, en utilisant un oligonucléotide situé à une cinquantaine de paires de bases en aval de la région d'initiation (voir figure 5). Cet oligonucléotide de séquence SEQ ID NO: 7 (5'-GGCCGGTCAACCCTGCTC-3') a été marqué avec du 5 32P à son extrémité 5' à l'aide de la polynucléotide kinase du phage T4 (Biolabs) et utilisé dans deux réactions en paralléle : 1) comme amorce pour l'extension d'un ADN
complémentaire des ARN CAT extraits de cellules QT6 transfectées avec le plasmide pGEIVI-(AgeI-SacI)-CAT(+) n°15, en présence de transcriptase inverse (SuperScript II, Invitrogen), et 2) comme amorce pour le séquençage du plasmide pGEIVI-(AgeI-SacI)-10 CAT(+) n° 15, à l'aide du kit « T7 Sequencing Kit » (Pharmacie Biotech). Un produit de transcription majoritaire a été détecté, correspondant à un site d'initiation qui possède un environnement nucléotidique caractéristique (nucléotides soulignés ci-dessous) de la séquence consensus établie d'après les séquence de promoteurs Poli d'autres espèces 15 +1 TTATATGTTCGTC T G T* A G G A G C G A G T G A G* G* ACTCGGCT (SEQ
ID NO: 8).
Il faut noter cependant que trois autres types de produits de transcription, minoritaires, ont été détectés dans cette expérience d'extension d'amorce, correspondant
Springer-élerlag and IZ.G. Landes Company).
Le site précis de l'initiation de la transcription du promoteur PoII de poulet a donc été recherché dans les 400 pb proximales du fragment AgeI-SacI, par la technique d'extension d'amorce. Un oligonucléotide complémentaire de la séquence CAT
transcrite à partir du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (séquence SEQ ID N~: 6 5'-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG-3') a été marqué avec du 32P à son extrémité
5' à l'aide de la polynucléotide kinase du phage T4 (Biolabs) et utilisé dans deux réactions en parallèle : 1) comme amorce pour l'extension d'un ADN
complémentaire des ARN CAT extraits de cellules QT6 transfectées avec le plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n° 15, en présence de transcriptase inverse (SuperScript II, Invitrogen), et 2) comme amorce pour le séquençage du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n° 15, à
l'aide du kit « T7 Sequencing I~it » (Pharmacie Biotech). Un produit de transcription unique a été détecté dans la réaction d'extension d'amorce, confirmant l'existence d'un site très précis d'initiation de la transcription. Ce dernier a été localisé
dans une région riche en A et T, en accord avec les données disponibles pour les promoteurs PoII dérivés d'autres espèces, située à environ 200 pb de l'oligonucléotide utilisé comme amorce.
En parallèle, l'analyse de fragments de restriction dérivés du fragment AgeI-SacI
a été poursuivie afin de délimiter le promoteur minimal (qui correspond à une région de l'ordre de 250 pb pour les promoteurs Poli d'autres espèces) (voir figure 5).
Le fragment AgeI-SacI a été découpé en trois fragments AgeI-BsaI, BsaI-BsaI et BsaI-SacI, obtenus par digestion du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n° 15 par les enzymes de restriction NcoI + BsaI d'une part (pour les fragment AgeI-BsaI et BsaI-BsaI), et BsaI + NotI d'autre part (pour le frag~.nent BsaI-SacI). Chacun des deux fragments a été sous-cloné dans le vecteur pGEM-CAT(+) au niveau du site EcoIZéj.
Seul le fragment BsaI-SacI d'environ 600 pb (figure 2), cloné dans le plasmide pGEM-(BsaI-SacI)-CAT(+) (clone n° 16), permet la transcription de la séquence rapporteur CAT, ce qui est parfaitement cohérent avec le fait qu'il s'agit du fragment proximal dans lequel a été localisé le site d'initiation de la transcription.
Le nucléotide +1 au site d'initiation de la transcription a été déterminé par la technique d'extension d'amorce, en utilisant un oligonucléotide situé à une cinquantaine de paires de bases en aval de la région d'initiation (voir figure 5). Cet oligonucléotide de séquence SEQ ID NO: 7 (5'-GGCCGGTCAACCCTGCTC-3') a été marqué avec du 5 32P à son extrémité 5' à l'aide de la polynucléotide kinase du phage T4 (Biolabs) et utilisé dans deux réactions en paralléle : 1) comme amorce pour l'extension d'un ADN
complémentaire des ARN CAT extraits de cellules QT6 transfectées avec le plasmide pGEIVI-(AgeI-SacI)-CAT(+) n°15, en présence de transcriptase inverse (SuperScript II, Invitrogen), et 2) comme amorce pour le séquençage du plasmide pGEIVI-(AgeI-SacI)-10 CAT(+) n° 15, à l'aide du kit « T7 Sequencing Kit » (Pharmacie Biotech). Un produit de transcription majoritaire a été détecté, correspondant à un site d'initiation qui possède un environnement nucléotidique caractéristique (nucléotides soulignés ci-dessous) de la séquence consensus établie d'après les séquence de promoteurs Poli d'autres espèces 15 +1 TTATATGTTCGTC T G T* A G G A G C G A G T G A G* G* ACTCGGCT (SEQ
ID NO: 8).
Il faut noter cependant que trois autres types de produits de transcription, minoritaires, ont été détectés dans cette expérience d'extension d'amorce, correspondant
20 à une initiation aux nucléotides -1, +13 et +14 (nucléotides marqués par une étoile ci-dessus).
Des plasmides destinés à exprimer un ARN pseudo-grippal porteur de la séquence du gène rapporteur CAT sous contrôle du promoteur PoII de poulet ont été
construits sur le modèle du plasmide pPolI-CAT-Rz conçu par Pleschka et al. à
l'aide du promoteur PoII humain (1996, J. Virol., 70:4188-92) : ces plasmides (pPR7-CAT-Rz et pPR7-OC16-CAT-Rz) contiennent les séquences codant pour le gène CAT, clonées en anti-sens, et flanquées des séquences 5' et 3' non codantes dérivées du segment génomique NS d'un virus grippal humain de type A ; le positionnement de l'extrémité 5' non codante exactement en aval du nucléotide -1 du promoteur Poli de ~0 poulet, d'une part, et l'insertion de la séquence ribo~yme du virus de (hépatite b à
(extrémité 3' non codante, d'autre part, sont destinés à assurer l'exactitude des extrémités du produit de transcription. Le plasmide pPR7-C16-CAT-Rz contient les nt -
Des plasmides destinés à exprimer un ARN pseudo-grippal porteur de la séquence du gène rapporteur CAT sous contrôle du promoteur PoII de poulet ont été
construits sur le modèle du plasmide pPolI-CAT-Rz conçu par Pleschka et al. à
l'aide du promoteur PoII humain (1996, J. Virol., 70:4188-92) : ces plasmides (pPR7-CAT-Rz et pPR7-OC16-CAT-Rz) contiennent les séquences codant pour le gène CAT, clonées en anti-sens, et flanquées des séquences 5' et 3' non codantes dérivées du segment génomique NS d'un virus grippal humain de type A ; le positionnement de l'extrémité 5' non codante exactement en aval du nucléotide -1 du promoteur Poli de ~0 poulet, d'une part, et l'insertion de la séquence ribo~yme du virus de (hépatite b à
(extrémité 3' non codante, d'autre part, sont destinés à assurer l'exactitude des extrémités du produit de transcription. Le plasmide pPR7-C16-CAT-Rz contient les nt -
21 1 à - 425 du promoteur Poli de poulet, alors que le plasmide pPR7-~C16-CAT-Rz ne contient que les rat - 1 à - 246 (pour d'autres espéces, la taille du promoteur PoII
minimal a été estimée à 250 rat environ).
Les plasmides pPolI-CAT-R~ (promoteur Poli humain), pPR7-C16-CAT-R~ ou pPR7-~C16-CAT-R~ (promoteur Poli aviaire) ont été transfectés dans des cellules aviaires QT6 ou dans les cellules de primate C~S-1, simultanément avec des plasmides codant pour les protéines PE 1, PE2, PA et NP d'un virus grippal. Si les cellules transfectées expriment des ARN pseudo-grippaux corrects au niveau des extrémités 5' et 3' non codantes, et simultanément les protéines PE 1, PE2, PA et NP, les ARN
pseudo-grippaux peuvent être transcrits et répliqués, et l'efficacité du processus de transcription/réplication peut être estimée par la mesure du niveau de protéine CAT
dans les cellules transfectées. Les niveaux de protéine CAT ont donc été
mesurés par ELISA dans les extraits cytoplasmiques des cellules transfectées, préparés à
24 heures post-transfection.
Les niveaux de CAT mesurés en présence du plasmide pPolI-CAT-Rz étaient de l'ordre de 200ng/106 cellules transfectées lorsqu'il s'agissait de cellules C~S-1, alors qu'ils étaient très faibles (<0,06ng/106 cellules transfectées) lorsqu'il s'agissait de cellules QT6 (figure 6).
A l'inverse, les niveaux de CAT mesurés en présence des plasmides pPR7-C16-CAT-Rz et pPR7-~C16-CAT-Rz étaient très faibles (<0,06ng/106 cellules transfectées) dans les cellules COS-1, mais ils étaient de l'ordre de 200 et 100ng/106 cellules, respectivement, dans les cellules QT6 (figure 6).
Ces résultats établissent que les séquences du promoteur PoII de poulet clonées dans les plasmides pPR7-C16-CAT-Rz et pPR7-OC16-CAT-Rz permettent, après transfection dans des cellules d'origine aviaire, la transcription ifa vivo de mirai-réplicons comportant les signaux de réplication d'un virus grippal de type A. Ils ouvrent donc la voie au développement de systémes de génétique inverse permettant d'obtenir des virus grippaux recombinants sur des cellules aviaires en culture, ou directement sur o~ufs embryonnés de poule.
LISTE DE SÉQUENCES
<110> INSTITUT PASTEUR
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) UNIVERSITÉ DE PARIS 7 <120> PROMOTEUR DE L'ARN POLYMERASE I DE POULET ET SON UTILISATION
<130> D21975 <150> CA 2 421 086 <151> 2003-02-28 <160> 8 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 1261 <212> ADN
<213> Gallus gallus <220>
<223> Séquence promotrice de l'ARN polymerase I de poulet <400>
ccggtggtcccggccccgtccgactcggtcgcttcgcggaggtggctggaggtcgctgcc60 gtggcggctggggcacggcggaacggtctaaccggctccggcgggccccgtccgcctcgg120 tcgctgctcggcggctgctaggggtcgctgccggggtggctggggcacggcggaacggtc180 tacccgggtccggcgggcgccgtccggctcggtcgctccgcggaggaggctaggggtcgc240 tgccggggcgtctcggaaacggcggaacggtctacccggctccggcgggccccgtccgcc300 tcggtcgctccgcgccggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcgg360 aacggtctacccggctccgacgggcgccgtccggctcggtagctccgcggcggcggctag420 aggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacccggctccggcgggcgcc480 gtccggctcggtctctccgcggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacg540 gcggaacggtctacccgggtccgacgggcgccgtccggctcggtctctccgcggcggcgg600 ctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacccggctccgacggg660 ccccgtccggctcggtcgctccgcggcggcggctaggggtcgctgccggggcgtctcgga720 aacggcggaacggtctacccgggtgctaccgactcgcgctctccgcggcggcggctagag780 gtcgctgccggggcggcttgcgatccgcgtccaggtctacccggtttcggattgtcttgg840 ccgctctggctgtgggggggggcgctacagctccggagctgccagaggcgtcgctgtaat900 tttgtacctccagttacgtcgaggtaaacctcggctgccgtcggagccgctgccggtagt960 cggcgcctatggggCtagaacgtttttttcggatgccttatatgttcgtctgtaggagcg1020 agtgaggactcggctccggtagtggcggtgagcgggcgctcgcgagcagggttgaccggc1080 cggccgcctagagaggggatcggcggcggcggcggcggctttctcgggcatcggttcgtt1140 cgatcggtccggtcgcttcggtttgtccgtcgctcctcatcccgcagctctgtcctgggc1200 taaggcggttttgcaggcgagcagcgaaaaaaagccggagaaggcgatcactagtgcggc1260 c 1261 <210> 2 <211> 674 <212> ADN
<213> Gallus gallus <220>
<223> Séquence promotrice de 1°ARDI polymerase I de poulet <400> 2 WO 2004/078912 ~ PCT/FR2004/000460 tccgcggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacc60 cggctccgacgggccccgtccggctcggtcgctccgcggcggcggctaggggtcgctgcc120 ggggcgtctcggaaacggcggaacggtctacccgggtgctaccgactcgcgctctccgcg180 gcggcggctagaggtcgctgccggggcggcttgcgatccgcgtccaggtctacccggttt240 cggattgtcttggccgctctggctgtgggggggggcgctacagctccggagctgccagag300 gcgtcgctgtaattttgtacctccagttacgtcgaggtaaacctcggctgccgtcggagc360 cgctgccggtagtcggcgcctatggggctagaacgtttttttcggatgccttatatgttc420 gtctgtaggagcgagtgaggactcggctccggtagtggcggtgagcgggcgctcgcgagc480 agggttgaccggccggccgcctagagaggggatcggcggcggcggcggcggctttctcgg540 gcatcggttcgttcgatcggtccggtcgcttcggtttgtccgtcgctcctcatcccgcag600 ctctgtcctgggctaaggcggttttgcaggcgagcagcgaaaaaaagccggagaaggcga660 tcactagtgcggcc 674 <210> 3 <211> 26 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Oligonucléotide dérivé d'ARN ribosomal de poulet <400> 3 gagtcagccc tcgacacaag cttttg 26 <210> 4 <211> 22 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> 0ligonucléotide dérivé d'ARN ribosomal de poulet <400> 4 ctactggcag gatcaaccag gt , 22 <210> 5 <211> 24 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> 0ligonucléotide dérivé d'ARN rilaosomal de poulet <400> 5 tagaggagaa cgcgacctcg agac 24 <210> 6 <211> 23 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> 0ligonucléotide complémentaire de la séquence CAT transcrite à partir du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-OAT(+) <400> 6 atgttcttta cgatgcgatt ggg 23 <210> 7 <211> 18 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Amorce dérivée du promoteur de l'ARN pol~rmérase I de poulet <400> 7 ggccggtcaa ccctgctc 18 <210> 8 <211> 38 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Oligonucléotide dérivé d'un produit de transcription correspondant à un site ,d'initiation du promoteur de l'ARN polymérase I de poulet <400> 8 ttatatgttc gtctgtagga gcgagtgagg actcggct 38
minimal a été estimée à 250 rat environ).
Les plasmides pPolI-CAT-R~ (promoteur Poli humain), pPR7-C16-CAT-R~ ou pPR7-~C16-CAT-R~ (promoteur Poli aviaire) ont été transfectés dans des cellules aviaires QT6 ou dans les cellules de primate C~S-1, simultanément avec des plasmides codant pour les protéines PE 1, PE2, PA et NP d'un virus grippal. Si les cellules transfectées expriment des ARN pseudo-grippaux corrects au niveau des extrémités 5' et 3' non codantes, et simultanément les protéines PE 1, PE2, PA et NP, les ARN
pseudo-grippaux peuvent être transcrits et répliqués, et l'efficacité du processus de transcription/réplication peut être estimée par la mesure du niveau de protéine CAT
dans les cellules transfectées. Les niveaux de protéine CAT ont donc été
mesurés par ELISA dans les extraits cytoplasmiques des cellules transfectées, préparés à
24 heures post-transfection.
Les niveaux de CAT mesurés en présence du plasmide pPolI-CAT-Rz étaient de l'ordre de 200ng/106 cellules transfectées lorsqu'il s'agissait de cellules C~S-1, alors qu'ils étaient très faibles (<0,06ng/106 cellules transfectées) lorsqu'il s'agissait de cellules QT6 (figure 6).
A l'inverse, les niveaux de CAT mesurés en présence des plasmides pPR7-C16-CAT-Rz et pPR7-~C16-CAT-Rz étaient très faibles (<0,06ng/106 cellules transfectées) dans les cellules COS-1, mais ils étaient de l'ordre de 200 et 100ng/106 cellules, respectivement, dans les cellules QT6 (figure 6).
Ces résultats établissent que les séquences du promoteur PoII de poulet clonées dans les plasmides pPR7-C16-CAT-Rz et pPR7-OC16-CAT-Rz permettent, après transfection dans des cellules d'origine aviaire, la transcription ifa vivo de mirai-réplicons comportant les signaux de réplication d'un virus grippal de type A. Ils ouvrent donc la voie au développement de systémes de génétique inverse permettant d'obtenir des virus grippaux recombinants sur des cellules aviaires en culture, ou directement sur o~ufs embryonnés de poule.
LISTE DE SÉQUENCES
<110> INSTITUT PASTEUR
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) UNIVERSITÉ DE PARIS 7 <120> PROMOTEUR DE L'ARN POLYMERASE I DE POULET ET SON UTILISATION
<130> D21975 <150> CA 2 421 086 <151> 2003-02-28 <160> 8 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 1261 <212> ADN
<213> Gallus gallus <220>
<223> Séquence promotrice de l'ARN polymerase I de poulet <400>
ccggtggtcccggccccgtccgactcggtcgcttcgcggaggtggctggaggtcgctgcc60 gtggcggctggggcacggcggaacggtctaaccggctccggcgggccccgtccgcctcgg120 tcgctgctcggcggctgctaggggtcgctgccggggtggctggggcacggcggaacggtc180 tacccgggtccggcgggcgccgtccggctcggtcgctccgcggaggaggctaggggtcgc240 tgccggggcgtctcggaaacggcggaacggtctacccggctccggcgggccccgtccgcc300 tcggtcgctccgcgccggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcgg360 aacggtctacccggctccgacgggcgccgtccggctcggtagctccgcggcggcggctag420 aggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacccggctccggcgggcgcc480 gtccggctcggtctctccgcggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacg540 gcggaacggtctacccgggtccgacgggcgccgtccggctcggtctctccgcggcggcgg600 ctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacccggctccgacggg660 ccccgtccggctcggtcgctccgcggcggcggctaggggtcgctgccggggcgtctcgga720 aacggcggaacggtctacccgggtgctaccgactcgcgctctccgcggcggcggctagag780 gtcgctgccggggcggcttgcgatccgcgtccaggtctacccggtttcggattgtcttgg840 ccgctctggctgtgggggggggcgctacagctccggagctgccagaggcgtcgctgtaat900 tttgtacctccagttacgtcgaggtaaacctcggctgccgtcggagccgctgccggtagt960 cggcgcctatggggCtagaacgtttttttcggatgccttatatgttcgtctgtaggagcg1020 agtgaggactcggctccggtagtggcggtgagcgggcgctcgcgagcagggttgaccggc1080 cggccgcctagagaggggatcggcggcggcggcggcggctttctcgggcatcggttcgtt1140 cgatcggtccggtcgcttcggtttgtccgtcgctcctcatcccgcagctctgtcctgggc1200 taaggcggttttgcaggcgagcagcgaaaaaaagccggagaaggcgatcactagtgcggc1260 c 1261 <210> 2 <211> 674 <212> ADN
<213> Gallus gallus <220>
<223> Séquence promotrice de 1°ARDI polymerase I de poulet <400> 2 WO 2004/078912 ~ PCT/FR2004/000460 tccgcggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacc60 cggctccgacgggccccgtccggctcggtcgctccgcggcggcggctaggggtcgctgcc120 ggggcgtctcggaaacggcggaacggtctacccgggtgctaccgactcgcgctctccgcg180 gcggcggctagaggtcgctgccggggcggcttgcgatccgcgtccaggtctacccggttt240 cggattgtcttggccgctctggctgtgggggggggcgctacagctccggagctgccagag300 gcgtcgctgtaattttgtacctccagttacgtcgaggtaaacctcggctgccgtcggagc360 cgctgccggtagtcggcgcctatggggctagaacgtttttttcggatgccttatatgttc420 gtctgtaggagcgagtgaggactcggctccggtagtggcggtgagcgggcgctcgcgagc480 agggttgaccggccggccgcctagagaggggatcggcggcggcggcggcggctttctcgg540 gcatcggttcgttcgatcggtccggtcgcttcggtttgtccgtcgctcctcatcccgcag600 ctctgtcctgggctaaggcggttttgcaggcgagcagcgaaaaaaagccggagaaggcga660 tcactagtgcggcc 674 <210> 3 <211> 26 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Oligonucléotide dérivé d'ARN ribosomal de poulet <400> 3 gagtcagccc tcgacacaag cttttg 26 <210> 4 <211> 22 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> 0ligonucléotide dérivé d'ARN ribosomal de poulet <400> 4 ctactggcag gatcaaccag gt , 22 <210> 5 <211> 24 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> 0ligonucléotide dérivé d'ARN rilaosomal de poulet <400> 5 tagaggagaa cgcgacctcg agac 24 <210> 6 <211> 23 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> 0ligonucléotide complémentaire de la séquence CAT transcrite à partir du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-OAT(+) <400> 6 atgttcttta cgatgcgatt ggg 23 <210> 7 <211> 18 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Amorce dérivée du promoteur de l'ARN pol~rmérase I de poulet <400> 7 ggccggtcaa ccctgctc 18 <210> 8 <211> 38 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Oligonucléotide dérivé d'un produit de transcription correspondant à un site ,d'initiation du promoteur de l'ARN polymérase I de poulet <400> 8 ttatatgttc gtctgtagga gcgagtgagg actcggct 38
Claims (25)
1. Polynucléotide isolé ou purifié comprenant la séquence SEQ ID NO: 1 ou un fragment de celui-ci constitué d'au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 1 et possédant une activité promotrice de transcription.
2. Polynucléotide isolé ou purifié comprenant la séquence SEQ ID NO: 2 ou un fragment de celui-ci constitué d'au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO:2 et possédant une activité promotrice de transcription.
3. Polynucléotide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il possède une activité promotrice de transcription.
4. Polynucléotide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il possède une activité promotrice de transcription dans les cellules aviaires, préférentiellement dans les cellules de volaille, et plus particulièrement dans les cellules de poulet.
5. ADN recombinant comprenant un des polynucléotides définis aux revendications 1 à 4.
6. ADN recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence à transcrire.
7. ADN recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence à
transcrire est un ADNc de virus à ARN non coiffé.
transcrire est un ADNc de virus à ARN non coiffé.
8. ADN recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence à
transcrire est un ADNc de virus à ARN de polarité négative.
transcrire est un ADNc de virus à ARN de polarité négative.
9. ADN recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce que le virus à
ARN
de polarité négative est un orthomyxovirus ou un paramyxovirus.
ARN
de polarité négative est un orthomyxovirus ou un paramyxovirus.
10. ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'orthomyxovirus est un virus de l'influenza, préférablement de type A.
11. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il exprime un ARNv d'un virus grippal tel un orthomyxovirus, et préférentiellement un ARNv choisi parmi les segments d'ARNv 1 à 8 du virus de l'influenza.
12. ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que le paramyxovirus est choisi parmi le genre des Rubulavirus tel le virus des oreillons et le virus de la maladie de Newcastle, le genre des Morbilivirus tel le virus de la rougeole, le genre Pneumovirus tel le virus respiratoire syncitial et le genre des Métapneumovirus.
13. Vecteur comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 12.
14. Cellule hôte comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 12 et/ou un vecteur selon la revendication 13.
15. Cellule hôte selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est d'origine aviaire.
16. Cellule hôte selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est une cellule de volaille, et plus particulièrement de poulet.
17. tuf embryonné comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 12 et/ou un vecteur selon la revendication 13.
18. Utilisation d'au moins un des éléments suivants pour la production d'un virus à
ARN de polarité négative recombinant - un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ;
- un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 12 ;
- un vecteur selon la revendication 13 ;
- une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 ; et - un neuf embryonné selon la revendication 17.
ARN de polarité négative recombinant - un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ;
- un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 12 ;
- un vecteur selon la revendication 13 ;
- une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 ; et - un neuf embryonné selon la revendication 17.
19. Méthode de production de virus grippaux recombinants par génétique inverse, caractérisée en ce qu' elle comprend les étapes suivantes:
a) introduction dans une cellule aviaire ou dans un neuf embryonné d'au moins un vecteur comprenant un ADN recombinant tel que défini à la revendication et de vecteurs exprimant les protéines PA, PB1, PB2 et NP d'un virus grippal;
b) application à la cellule ou à loeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus grippaux recombinants ; et c) récupération des virus grippaux recombinants obtenus en b).
a) introduction dans une cellule aviaire ou dans un neuf embryonné d'au moins un vecteur comprenant un ADN recombinant tel que défini à la revendication et de vecteurs exprimant les protéines PA, PB1, PB2 et NP d'un virus grippal;
b) application à la cellule ou à loeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus grippaux recombinants ; et c) récupération des virus grippaux recombinants obtenus en b).
20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que la cellule est une cellule de volaille, et plus particulièrement de poulet.
21. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que le virus grippal est l'influenza, préférablement de type A.
22. Méthode de production de virus non coiffés recombinants par génétique inverse, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes:
a) introduction dans une cellule ou dans un oeuf embryonné d'origine aviaire d'un ou de plusieurs vecteurs, ledit ou lesdits vecteurs comprenant un ADN
recombinant selon l'invention et les ADN exprimant les protéines nécessaires à la transcription/réplication de l'ARN viral ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus recombinants ; et c) récupération des virus recombinants obtenus en b).
a) introduction dans une cellule ou dans un oeuf embryonné d'origine aviaire d'un ou de plusieurs vecteurs, ledit ou lesdits vecteurs comprenant un ADN
recombinant selon l'invention et les ADN exprimant les protéines nécessaires à la transcription/réplication de l'ARN viral ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant l'expression de virus recombinants ; et c) récupération des virus recombinants obtenus en b).
23. Composition comprenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un virus recombinant produit par la méthode de production telle que définie selon l'une quelconque des revendications 19 à 22.
24. Composition thérapeutique comprenant une séquence transcrite par un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
25. Polynucléotide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est contenu dans la souche pGEM-ChPoII-C15-E.Coli 1305 déposée à la CNCM le 24 février sous le numéro I-2976.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA002517375A CA2517375A1 (fr) | 2003-02-28 | 2004-02-27 | Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA002421086A CA2421086A1 (fr) | 2003-02-28 | 2003-02-28 | Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation |
| CA2,421,086 | 2003-02-28 | ||
| CA002517375A CA2517375A1 (fr) | 2003-02-28 | 2004-02-27 | Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation |
| PCT/FR2004/000460 WO2004078912A2 (fr) | 2003-02-28 | 2004-02-27 | Promoteur de l’arn polymerase i de poulet et son utilisation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2517375A1 true CA2517375A1 (fr) | 2004-09-16 |
Family
ID=35452103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002517375A Abandoned CA2517375A1 (fr) | 2003-02-28 | 2004-02-27 | Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CA (1) | CA2517375A1 (fr) |
-
2004
- 2004-02-27 CA CA002517375A patent/CA2517375A1/fr not_active Abandoned
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0914442B1 (fr) | Formule de vaccin polynucleotidique aviaire | |
| KR101272487B1 (ko) | 인플루엔자 바이러스의 구제 | |
| EP2635302B1 (fr) | Procede pour ameliorer la production de virus et semences vaccinales influenza | |
| EP1893228B1 (fr) | Polypeptides chimeriques et leurs applications thérapeutiques contre une infection à flaviviridae | |
| JP2008543331A (ja) | イヌ細胞中でウイルスのネガティブセンスｒｎａを発現する方法および組成物 | |
| CN103540613A (zh) | 制备流感病毒的多质粒系统 | |
| MX2007005818A (es) | Vectores recombinantes de la influenza con unidades de transcripcion en tandem. | |
| KR19990022335A (ko) | 인플루엔자의 신규한 재조합 감온성 돌연변이체 | |
| JP2000509962A (ja) | 弱毒化ワクチン接種および遺伝子伝達ウイルス、そのウイルスの作出方法およびそのウイルスを含む製薬学的組成物 | |
| CN101528941A (zh) | 在犬细胞中表达负义病毒rna的方法和组合物 | |
| US20230174975A1 (en) | Systems and methods for viral genome targeting | |
| EP1974035B1 (fr) | Arn interferents ciblant le gene de la nucleoproteine de morbillivirus | |
| EP1597376B1 (fr) | Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation | |
| CN113631187A (zh) | 嵌合RSV和hMPV F蛋白、免疫原性组合物和使用方法 | |
| CA2804121C (fr) | Souches virales modifiees et procede pour ameliorer la production de semences vaccinales de virus influenza | |
| CA2517375A1 (fr) | Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation | |
| WO2003097090A1 (fr) | Utilisation de novirhabdovirus modifies pour l'obtention de vaccins. | |
| CN1451038A (zh) | 可用作疫苗的减毒流感病毒 | |
| EP0377349B1 (fr) | Polypeptides recombinants du virus de la septicemie hemorragique du poisson | |
| CN101243189A (zh) | 用于在犬细胞内表达反义病毒rna的方法和组合物 | |
| FR2866031A1 (fr) | Chimere de virus pathogene emergent, medicament la contenant et utilisation en therapie antivirale | |
| US20180147274A1 (en) | IPN Virus Genome Mutations and Codon Interactions | |
| WO2004001026A1 (fr) | Procede de preparation de mononegavirus recombinants et leurs applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| FZDE | Discontinued |
Effective date: 20131112 |