WO2004001026A1 - Procede de preparation de mononegavirus recombinants et leurs applications - Google Patents

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WO2004001026A1
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Joseph Curran
Dominique Garcin
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Pierre Fabre Medicament
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    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a method of preparation, construction and / or generation of recombinant Mononegaviruses in a cellular host capable of disseminating, as well as a method of production of recombinant peptides using such recombinant Mononegaviruses.
  • the invention also includes cDNA compositions, host cells or kits comprising the elements necessary for this construction.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions, in particular vaccine compositions, comprising such recombinant Mononegaviruses, and the use of these recombinant Mononegaviruses as a vector for gene therapy.
  • RNA viruses are classified into three groups, double-stranded RNA viruses, positive polarity RNA viruses and negative polarity RNA viruses.
  • the group of double-stranded RNA viruses includes reoviruses, rotavus, phytoreoviruses, etc. They have a segmented multi-filamentous double-stranded RNA genome.
  • RNA viruses include polioviruses, Sindbis virus, "Semliki forest” virus, and Japanese encephalitis B virus; they have a positive-sense single-stranded RNA genome.
  • the RNA of the genome can thus function like an mRNA and is capable of producing the proteins necessary for the replication of the RNA and for the formation of particles according to the translation functions of the host cells.
  • the RNA in the genome itself a positive strand RNA virus, is infectious.
  • adeno-associated viruses classified in the parvovirus family, have the capacity for infectivity but not the capacity for dissemination (mixed infection of adenoviruses is necessary for the formation of viral particles).
  • the positive single-stranded RNA derived from the Sindbis virus which is artificially transcribed in vitro is capable of infection, that is to say of forming viral particles when it is transfected into cells.
  • the positive strand of Sendai viral RNA artificially transcribed in vitro is not infectious, i.e. does not form infectious viral particles when it is transfected into cells.
  • viral vectors have been used as a vehicle for gene therapy.
  • it is necessary to establish techniques for reconstituting viral particles that is to say the formation artificial viral genome and the production of recombinant virus in vitro or intracellularly.
  • to transfer foreign genes into such viral vectors it is necessary to reconstitute the viral particles with foreign genes introduced by genetic manipulation into the genome of the virus.
  • the reconstitution of DNA viruses having DNA as the genomic nucleic acid is known. It can be carried out by introducing the purified genome itself, such as for example for SV40, into monkey cells (J. Exp. Cell Res., 43: 415-425, 1983). RNA virus containing an RNA genome was first reconstituted for a positive-strand RNA virus, since genomic RNA also functions as mRNA. For example, in the case of poliovirus, the capacity for dissemination of purified genomic RNA had already been demonstrated in 1959 (Journal of Experimental Medicine, 110: 65-89, 1959).
  • Sendai virus is also called “hemagglutinating virus of Japan (VHJ)", and is classified as a murine parainfluenza virus type I, belonging to the family of Paramyxoviridae and to the super family of Mononegavirals (Mononegavirus).
  • the Sendai virus particles are pleomorphic enveloped viruses 150-200 nm in diameter and have an RNA genome of unsegmented negative polarity greater than 15 Kb.
  • the Sendai virus has been considered as a virus with high industrial potential, being widely used, particularly for the production of heterokaryons and hybrid cells, because of its cell-virus fusion capacity.
  • the Sendai virus is also used as an inducer of many interferons.
  • RNA virus a negative polarity RNA virus or its complementary RNA (cRNA) into host cells does not allow the generation of negative polarity RNA viruses. This is quite different in the case of RNA viruses of positive polarity.
  • Negative polarity RNA virus reconstitution systems have been presented for the influenza virus (Annu. Rev. Microbiol., 47: 765-790, 1993; Curr. Opin. Genêt. Dev., 2: 77-81, 1992 ).
  • the influenza virus is a negative polarity RNA virus with a genome segmented into eight.
  • RNA transcribed from a cDNA of all eight segments was assembled with the protein.
  • NP of the virus to form RNPs (“RNP” for RiboNucleoProtein).
  • RNP RiboNucleoProtein
  • the viral reconstitution is carried out using in host cells these RNPs and an RNA-dependent RNA polymerase. More recently, the reconstitution of a negative-stranded RNA virus of negative polarity from a cDNA has been developed for rabies viruses belonging to the Rhabdovirus family (J. Virol., 68: 713-719, 1994 ).
  • RNA viruses Unlike positive RNA viruses, neither the genomes (-) nor the antigenomes (+) of single-stranded RNA viruses of negative polarity are infectious, since none of these matrices can be used as mRNA to express the essential elements of the mechanism. of replication (i.e. proteins N, P and L).
  • the approach used to solve this problem was based on the capacity of expression in the cytoplasm of mammalian cells of the bacteriophage T7 RNA polymerase using the recombinant vaccinia virus (vTF-7).
  • This very effective means for transiently expressing cDNA clones in mammalian cells consists in placing the clones under the control of the T7 RNA polymerase promoter and in transfecting these DNAs (generally in the form of plasmids) in cells infected with a virus. recombinant vaccinia which expresses T7 RNA polymerase. The vaccinia, in addition to supplying the polymerase, also replicates and thereby amplifies the plasmids and recombines them at high frequency if they contain homologies.
  • a cDNA clone representing the whole (hereinafter “full length” cDNA) of the genome of a Mononegavirus (virus belonging to the super family of Mononegavirals) of approximately 15 Kb can be cloned downstream of a T7 promoter (in plasmids such as pBluescript or pGEM). Additional non-viral nucleotides are then lost during subsequent amplification of the genome.
  • the 3 'end of the genome transcription is precisely defined by the positioning of the hepatic delta virus (VHD) ribozyme downstream of the insertion (Pattnaik et al., Cell, 69: 1011-20, 1992).
  • VHD hepatic delta virus
  • the fundamental trans-acting viral proteins are supplied via the T7 plasmids co-transfected into the cell infected with vTF-7 and containing a clone of the full length genome cDNA (Pattnaik et al., 1992; Cakaub et al., Virology, 191: 62-71, 1992). Infectious viruses can then be recovered either after "plating” from extracts of cells transfected on cell lines, or as in the case of SeV, after inoculation of cells transfected into the amniotic cavity of embryonic hens' eggs (Garcin and al., EMBO J., 14: 6087-94, 1995).
  • Patent application EP 0 702 085 discloses such a process for the preparation of infectious viruses replicative with non-segmented RNA of negative polarity comprising the steps of introduction into a host cell expressing an RNA polymerase of DNA molecules coding for N proteins, P and L of the virus, or their analogs and a DNA molecule comprising the non-segmented genomic cDNA of the negative-polarity RNA virus.
  • Garcin et al. (EMBO J., 14 (24): 6087-6094, 1995) also describe a Sendai full length cDNA virus transfected with pGEM plasmids expressing the nucleocapsid protein (N), the phosphoprotein (P) and the large proteins (L ) in cells infected with a vaccinia virus expressing T7 RNA polymerase.
  • the recombinant Sendai viruses are prepared so that their proteins C and / or C cannot be expressed because of a mutation of their start codons respectively.
  • One of the Sendai virus cDNAs used in this article contains a deletion of part of the N and P genes, corresponding to approximately 2.4 kb of the whole cDNA greater than 15 kb of the Sendai virus, i.e. that the deletion represents 16% of the genome. This deletion was introduced into the full length cDNA to avoid the generation of a recombinant Sendai virus by recombination between the support plasmids N and P with the deleted full length cDNA.
  • Patent application WO 00/70070 describes viral particles defective in F and / or HN generated using a genomic cDNA of the Sendai virus having a deletion of the F gene and / or of the HN gene.
  • the viral particles defective in F and / or HN were recovered in helper cells expressing F and HN.
  • RNPs functional were extracted from cloned SeV from cDNA deleted from the F gene (fusion envelope protein), in the presence of plasmids expressing the nucleocapsid protein and the viral RNA polymerase. These RNPs were transfected into cells caused to express protein F. This defective vector was specifically amplified in a cell line expressing protein F in a trypsin-dependent manner but did not amplify in cells not expressing F. This vector is infectious and expresses a reporter gene, GFP ("Green Fluorescent Protein").
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the major technical problem in this approach is the generation and maintenance of the stability of the genomic cDNA clone greater than 15 Kb, without counting the size for the plasmid or vector itself, in bacterial cell lines.
  • This problem becomes all the more complex when the objective is to introduce foreign transgenes into the cDNA clone in order to express them via recombinant viruses.
  • Genetic stability is crucial for efficient viral production due in large part to the "rule of six" (Calain and Roux, Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, p.4822-4830, 1993) which states that practically all Mononegavirus genomes are effectively amplified only if the length of the genome is a multiple of six.
  • the aim of the present invention is to establish an efficient system for reconstituting a Mononegavirus, preferably for a virus of the family of Paramyxoviridae, in particular of the subfamily of Paramyxovirinae such as the Sendai virus, allowing the genetic manipulation of such Mononegavirus reconstituted, and providing recombinant viral vectors, useful for example in the field of gene therapy or as vaccines.
  • the present inventors have surprisingly established that this problem can to a large extent be solved by cutting the genome into two overlapping parts which can then be brought together in the cell infected with the vaccinia virus by homologous recombination.
  • the main advantages of this method compared to previous approaches, in which full length or practically full length genomic cDNA clones were introduced into host cells, are twofold:
  • the present invention relates to a method of constructing, preparing or generating recombinant Mononegaviruses, preferably for a virus of the family of Paramyxoviridae, in particular the Sendai virus, comprising the following steps:
  • said host cell is capable of exerting a recombinase type activity.
  • This activity may be a constitutive activity of said host cell, such as that which can be observed in B or T lymphocytes, or may preferably result from the expression of a heterologous gene coding for a protein with recombinase activity, such as for example the recombinase activity provided via the vaccinia virus used in a preferred embodiment for express the RNA polymerase of said host cell in step (i) of the method according to the invention (see below).
  • misfection capacity for a virus is meant a virus having both the ability to infect a cell and the ability to replicate within that cell and, preferably, giving rise to replicative progenitors.
  • the method of construction, preparation or generation of the recombinant Mononegaviruses comprises the following steps:
  • the method of construction, preparation or generation of the recombinant Mononegaviruses comprises the following steps: (i) the introduction, into a host cell expressing the proteins N, P and L d a Mononegavirus and expressing an RNA polymerase, of a first cDNA comprising 80% or less of the genome of said Mononegavirus, said first cDNA comprising at least one region homologous to the N and / or P and / or L gene; (ii) homologous recombination:
  • said second cDNA and, where appropriate, said other cDNAs can or can be introduced into said host cell before or after the introduction of said first cDNA, in an even more preferred embodiment of the invention, said second cDNA and, where appropriate, said other cDNAs, are (are) introduced into the host cell simultaneously with the introduction of said first cDNA.
  • said host cell expressing the N, P and L genes of a Mononegavirus and expressing an RNA polymerase is a host cell comprising vectors allowing the expression of said proteins N, P and L and said RNA polymerase.
  • Mononegaviruses viruses belonging to the super family of Mononegavirals
  • Mononegavirals are defined as envelope viruses whose genome is composed of single stranded RNA of negative polarity, that is to say whose transcription does not result in mRNA capable of being translated into protein. They include the viral families "Paramyxoviridae”, “Rhabdoviridae” and “Filoviridae”. This classification is derived from the International Committee on the Taxonomy of Viruses (ICTV), and appears in the book “Virus Taxonomy: The Classification and Nomenclature of Viruses. The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (book). M.H.V.
  • Paramyxoviridae include Sendai virus (SeV), human parainfluenza virus types 1, 2, 3, 4A, 4b (PIV1, 2, 3, 4A / B), bovine parainfluenza virus type 3, measles virus, mumps virus, human and bovine respiratory syncytial virus (RSV), rinderpest virus, dog distemper virus, Nipah virus, Hendra virus, Newcastle disease virus, simian virus 5, simian virus 41, dolphin morbillivirus, peste desproductive ruminants virus, distemper virus "phocine", murine pneumonia virus, goose rhinotracheitis virus, human metapneumovirus.
  • the cDNAs encoding the Mononegavirus genome are already described in the prior art; more particularly, the cDNAs encoding the Sendai virus, the virus measles, mumps virus, rinderpest virus, Newcastle disease virus, Dog distemper virus, Nipah virus, human parainfluenza virus types 2 and 3, bovine parainfluenza virus type 3, human and bovine respiratory syncytial virus (RSV) are described in the literature.
  • the cDNAs of the Sendai virus used in the present invention can be derived from viral strains, such as for example the Z or Fushimi strains.
  • the genomes of defective and interfering particles (called the "Dl" genome - viral particles containing a deleted viral gemome which needs a native virus for its dissemination and whose replication interferes with the replication of the native virus) or the minigenomes of the Sendai virus (ref .: Defective interfering particle in EMBO J., 10: 3079-3085, 1991) can also be used.
  • the cDNAs used correspond to the clones FL4 or FL3.
  • the latter correspond to a full length cDNA clone (that is to say coding for the whole genome) of the Z strain of the Sendai virus which has been inserted into a plasmid vector pBluescript under the control of the T7 promoter, and of which viruses infectious and disseminative have been isolated.
  • They contain the three additional G nucleotides at the 5 'end and the VHD ribozyme, as defined above.
  • the recombinant vaccinia virus expressing T7 RNA polymerase is preferably used as vector. Infection with the vaccinia virus makes it possible to obtain high rates of recombination between the plasmids because the double-stranded cDNAs are replicated by the viral replication mechanism.
  • An alternative source of T7 polymerase corresponds to the lines which express this enzyme stably (integrated into the chromosomal DNA of cells).
  • the proteins N also known under the name NP
  • P and L of the Mononegaviruses expressed in the host in step (i) of the method according to the invention are expressed using helper plasmids, such as those described in Curran et al., EMBO J., 10: 3079-3085, 1991.
  • helper plasmids such as those described in Curran et al., EMBO J., 10: 3079-3085, 1991.
  • the cloned cDNA is positioned downstream of the T7 promoter in plasmids such as pGEM or pBluescript.
  • said first cDNA comprising 80% or less of the genome of a Mononegavirus is prepared from the clone FL4 full length, when it is the Sendai virus.
  • the deletion is carried out using the appropriate enzymatic restriction sites inside said cloned cDNA (eg Spel; see below).
  • said first cDNA comprises from 25% to 80%, and preferably from 40% to 70% of the genome of said Mononegavirus.
  • said first cDNA comprises a deletion in the L gene coding for the large protein (“L” for Large protein).
  • the L gene represents, for example in the clone FL4, approximately half of the whole genome. This sequence is in fact duplicated in the host cell, since it is also present in the vector used to express the L protein of the viral polymerase. A large internal portion of the L gene can thus be deleted from FL4, a deletion which will subsequently be repaired in the cell transfected by homologous recombination (double cross-over) with the vector used to express the L protein (see FIG. 1B). Inside the SeV-FL4 clone, this can be done by removing a Spel restriction fragment of 4,759 nucleotides (position 9,368 to 14,127) from the body of the L gene, thereby reducing the clone's size by almost a third. infectious.
  • a second deletion approach inside the FL4 clone may consist in deleting one or more genes.
  • said second cDNA and, where appropriate, said other cDNAs comprising at least part of the genome of said Mononegavirus not included in said first cDNA, and further comprising at least one region homologous to said first cDNA. This is done by deleting in said first cDNA a portion of the genome comprising one or more genes.
  • the genome is subsequently completed intracellularly in the host cells infected for example by vaccinia by providing one or more helper plasmids (corresponding to said second cDNA and, where appropriate, to said other cDNAs) containing in total the deleted region and for each of them. 'between them the flanking sequences thus allowing recombination inside the genome.
  • the genome of said Mononegavirus is divided into two plasmids (corresponding to said first and said second cDNA of the method according to the invention), a first plasmid coding for the 3 'half of the genome and a second plasmid encoding the 5 'half of the genome (or vice versa), each comprising the central region of the genome so as to allow homologous recombination (see example in FIG. 1A).
  • the first and, where appropriate, the second cDNA and / or, where appropriate, said other cDNAs used in the method of the invention are Plasmid clones much smaller than those of the prior art and thus they can be manipulated more easily, while being more stable.
  • the term "stable” refers to the genetic stability of the cDNA clones during amplification in a bacterium such as the E. Coli bacterium. It is a mandatory step during the manipulation and cloning procedure.
  • large cDNAs in plasmids tend to be poorly tolerated in a bacterium such as E. Coli, and this creates conditions under which deletions or rearrangements of the cDNA can be selected during bacterial growth. Such problems are encountered regularly during the manipulation of the Sendai virus full length cDNA clone.
  • the first and, where appropriate, the second cDNA and, where appropriate, the said other cDNAs used in the method of the invention simply because of their smaller size, will carry a smaller number of restriction sites but above all more unique restriction sites compared to the plasmids used in the prior art. It is extremely advantageous to introduce unique enzyme restriction sites flanking each intergenic region of the genes since:
  • this facilitates the genetic manipulation of each gene of the virus since these genes can be separated into subclones or genetic cassettes, for example for the introduction of mutations inside a defined gene; (b) this facilitates the substitution of genes, for example the replacement of the genes of a Mononegavirus, such as the F / HN genes of the Sendai virus, by those of another Mononegavirus;
  • Homologous recombination can be defined as a recombination requiring a single cross-over or a double cross-over.
  • a recombination requiring a simple cross-over occurs when two segments are contiguous, one representing the 3 'genomic end, and the second the 5' genomic end (see FIG. 1A).
  • the Mononegaviruses in particular the Paramyxoviridae such as the SeV, recombinants preserve their capacity of dissemination, that is to say they amplify their genome in the transfected cell and release viruses infectious in the extra cellular environment of the cell. These viruses are genetically stable and can be passaged to prepare viral stocks.
  • the harvesting of the resulting recombinant Mononegaviruses can be carried out by repeated passages of the cell medium in cell culture lines, or by infection of the allantoic cavity of the eggs of embryonated hens.
  • the method of construction, preparation or generation of recombinant Mononegaviruses according to the invention is characterized in that said first and / or second cDNAs and / or, where appropriate, one of said others CDNA includes at least one unique enzyme restriction site.
  • said first or second cDNA or, where appropriate, one of said other cDNAs comprises at least one exogenous DNA sequence coding for a gene heterologous to said Mononegavirus.
  • said exogenous DNA sequence is flanked by a functional transcription stop and start signal specific for said Mononegavirus.
  • said exogenous DNA sequence is monocistronic, bicistronic or polycistronic and the cistrons are separated by an internal ribosomal entry site so that the viral transcription results in a monocistronic, bicistronic or polycistronic mRNA encoding one or more heterologous proteins.
  • said exogenous DNA sequence coding for a heterologous gene is positioned in a 3 'untranslated region of a gene of said Mononegavirus or within the leader and / or terminal regions which contain the promoters of replication of the viral genome, and is preceded by an internal site ribosomal input so that viral transcription results in a bicistronic or polycistronic mRNA encoding the viral protein and the heterologous protein.
  • said exogenous DNA sequence coding for a heterologous gene is positioned in a 5 'untranslated region of a gene of said Mononegavirus or within the leader and / or terminal regions which contain the promoters of replication of the viral genome and is followed by an internal ribosomal entry site so that the viral transcription results in a bicistronic or polycistronic mRNA encoding the viral protein and the heterologous protein.
  • the first and / or second cDNA molecules can carry an exogenous DNA sequence coding for a heterologous gene capable of being expressed in host cells.
  • the present invention relates to the use of recombinant Mononegaviruses obtained by a method of construction, preparation or generation of the recombinant Mononegaviruses according to the invention and in which method said first and / or said second cDNA and / or, if necessary , one of said other cDNAs carries (s) an exogenous DNA sequence coding for a heterologous gene capable of being expressed in host cells for the production of recombinant proteins.
  • the present invention also comprises a method for producing recombinant proteins, characterized in that it comprises the following steps: a) the culture of host cells infected with a recombinant Mononegavirus obtained by a method of construction, preparation or generation of the recombinant Mononegaviruses according to the invention, said Mononegavirus comprising a heterologous gene coding for said recombinant protein; and b) recovering said recombinant proteins expressed from the culture medium of said host cells and / or from said cultured host cells.
  • the present invention also comprises a method for producing recombinant proteins, characterized in that it comprises the following stages: a) infection of the allantoic cavity of bird eggs, in particular of hens, embryonated by a recombinant Mononegavirus obtained by a method of constructing, preparing or generating the recombinant Mononegaviruses according to the invention, said Mononegavirus comprising a heterologous gene coding for said recombinant protein; and b) recovering said recombinant proteins expressed from the chorioallantoic fluid of said bird eggs from said cultured host cells.
  • Any heterologous gene also called a transgene, can be introduced into any site of any cDNA of any recombinant Mononegavirus.
  • the heterologous genes, intended to be introduced can be exemplified, without however constituting a limiting list, by genes coding for compounds of interest, such as in particular compounds exhibiting or being able to exhibit a therapeutic or preventive activity of disease such as, for example, cytokines, peptide hormones, or any peptides which can be expressed within a host cell.
  • the heterologous genes the genes from which RNA molecules with intrinsic biological activity, such as a ribozyme, can be transcribed are preferred.
  • heterologous genes preference will also be given to the genes coding for a peptide, polypeptide or protein (terms interchangeably used here) which, when expressed or administered in humans or in animals, produces a therapeutic effect or protective immunity. , for example against a pathogenic organism or a disease associated with the presence of an antigen or caused by this antigen.
  • a pathogenic organism or a disease associated with the presence of an antigen or caused by this antigen may be encoded by the exogenous nucleic acid sequences, they may be antigens or epitopes from a single pathogen or antigens or epitopes from of different pathogens. In one of the preferred embodiments, such a pathogen is a pathogenic microorganism.
  • a heterologous antigen can originate from bacteria, parasites, viruses or fungi which are causative agents of diseases or disorders. Epitopes of allergens, sperm or cancer cells can also be used.
  • a tumor specific antigen referred to as "TAA" for Tumor associated Antigen
  • TAA Tumor associated Antigen
  • Any sequence coding for a TAA can be introduced into the recombinant Mononegaviruses of the invention. The entire TAA, without it being necessary, can be introduced.
  • TAA for example, an epitope and particularly an epitope recognized by a cytotoxic T lymphocyte (“CTL”) or by another component of the immune system and having prophylactic or therapeutic capacities
  • TAA or fragments containing TAA epitopes
  • Mononegaviruses of the invention include, without being limiting, MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, antigen High molecular weight melanoma-associated MAA, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated OV-TL3 and MOV18 antigens, TUAN, alpha-foeto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50 , CA-19-9, G250 antigen associated with kidney tumor, EGP-40 (also known as EpCAM), S100 (antigen associated with malignant melanoma), p53, antigen associated with prostate tumor (e.g.
  • sequences of genes encoding a heterologous protein intended to be expressed by the recombinant Mononegavirus according to the invention can be obtained by techniques known in the prior art, such as for example and without being limiting, chemical and enzymatic syntheses , purification from genomic DNA of microorganisms, by purification or isolation from cDNA coding for a TAA, by synthesis of cDNA from RNA of microorganism, or by methods of Recombinant DNA.
  • the transgene can be inserted either into the first or the second cDNA representing the 3 'or 5' part of the genome of the Mononegavirus (segment 1 or 2 of FIG. 1A), or alternatively either in both cDNAs.
  • the transgene can be inserted either in the defective genome (generally corresponding to said first cDNA) and / or either in the second cDNA and / or, if appropriate, in one of said others CDNA, if said second and, if applicable, several other cDNAs are used.
  • the gene coding for said desired protein is inserted.
  • a base sequence of a number multiple of 6 for example for the SeV between the sequences R1 (5'-AGGGTCAAAGT-3 ') (SEQ ID N ° 1) and R2 (5'GTAAGAAAAA-3') (SEQ ID N ° 2) (Journal of Virology, Vol. 67 , No. 8, p.4822-4830, 1993). Insertions of transgenes of nucleotide sequences not multiple of six are possible. However, in this case the genomic sequence must be compensated for by the addition or deletion of nucleotides so that the entire recombinant genome is a multiple of six nucleotides.
  • heterologous nucleic acid can be carried out according to standard techniques of molecular biology, such as those described in numerous texts of standard protocols, including for example, “Current Protocols in Molecular Biology ”, (FM Ausubel et al., Eds. 1987, and updates). The examples provide more information on how particular inserts were made. Using these guidelines, any variety of exogenous nucleic acids can be inserted into the Mononegavirus genome.
  • the heterologous gene can be expressed, for example, according to one of two possibilities, that is to say:
  • this approach requires an introduction of the transgene into a transcriptional junction.
  • the gene itself must carry the initiation codons and the stop codons necessary for the RNA-RNA-dependent viral RNA polymerase (this has been widely described for many Mononegaviruses) in order to guarantee that a mRNA correctly polyadenylated at 3 ′ and capcher in 5 'is generated. Because of the transcription gradient that exists within this family of viruses (the genes located at the 3 'end of the genome are expressed at a higher level than those located towards the 5' end), the positioning of the transgene will also dictate much of his level of expression;
  • transgene as a second open reading frame within a preexisting viral gene: this is done by inserting the transgene into the 3 'or 5' untranslated region (UTR) of the viral gene.
  • the transgene will carry an internal ribosomal site upstream or downstream (IRES- International Ribosomal Entry Site), such as, for example TIRES from EMCV, Polio or HCV. This effectively generates a bicistronic transcription in which the transgene comprises the first or the second cistron.
  • the expression levels of a foreign gene inserted into a vector can be regulated by the advantages of the gene insertion site and the flanking sequences of the foreign gene.
  • the advantages of the gene insertion site and the flanking sequences of the foreign gene For example, in the case of the Sendai virus, it is known that there are increasing levels of expression of the introduced gene as a function of a decreasing distance of said gene from the N gene.
  • the desired heterologous gene is inserted so that the recombinant Mononegaviruses according to the invention retain their disseminative capacity.
  • Preferred hosts for protein expression can be any cells susceptible to infection by recombinant Mononegaviruses, such as, for example, mammalian cells and chicken eggs. It is possible to efficiently produce the foreign gene product by infecting these hosts with a recombinant Mononegavirus obtained by the method according to the invention comprising a expressible heterologous gene and recovering the product of the expressed foreign gene. For example, the proteins thus expressed can then be harvested by a standard method from the culture medium or from cells when the hosts are cells, and from the chorioallantoic fluid when the hosts are chicken eggs.
  • one or more genes of the Mononegavirus genome in the first and / or second cDNA molecule can be mutated, that is to say any gene of the Mononegavirus genome can be deleted or modified. Mutations include deletions, modification of nucleic acid (s) or addition of nucleic acid (s).
  • the sequences of the genes linked to RNA replication of the Mononegavirus can be modified.
  • the P / C and L proteins can be modified to increase or reduce the capacities of transcription and replication.
  • the protein HN one of the constitutional proteins, has a dual activity of hemagglutinin and neuraminidase. For example, modification of the latter activity may allow regulation of viral infectivity.
  • modification of protein F a membrane fusion protein, can be useful for improving the membrane fusion ribosomes constructed by fusing the recombinant Mononegaviruses formed with artificial liposomes containing the desired drug or gene.
  • the invention also relates to the recombinant Mononegaviruses, mutated or not and / or carrying or not a transgene, obtained by the implementation of the method according to the invention.
  • the invention further relates to a host for the construction, preparation or generation of recombinant Mononegaviruses, comprising vectors allowing the expression of NP, P / C and L proteins of said Mononegavirus and of RNA polymerase, in that '' it further comprises: - a cDNA molecule comprising 80% or less of the genome of said
  • Mononegavirus with at least one region homologous to the NP and / or P / C and / or L gene, or,
  • a first cDNA molecule comprising 80% or less of the genome of said Mononegavirus and, a second cDNA molecule, and, where appropriate, several other cDNAs, comprising at least part of said Mononegavirus not included in said first cDNA molecule, and said second cDNA, and, where appropriate, said other cDNAs, further comprising at least one region homologous to said first cDNA.
  • the invention also relates to a host for the generation of recombinant peptide encoded by a heterologous gene (also called transgene here again), comprising vectors allowing the expression of NP, P and L proteins of Mononegavirus and of RNA polymerase, characterized in that it further contains:
  • a cDNA molecule comprising 80% or less of the genome of said Mononegavirus with at least one region homologous to the NP and / or P and / or L gene, in which a transgene is inserted into said cDNA, or
  • a first cDNA molecule comprising 80% or less of the genome of said Mononegavirus and a second cDNA, and, where appropriate, several other cDNAs, comprising at least part of the genome of said Mononegavirus not included in said first cDNA, and said second CDNA, and, where appropriate, said other cDNAs further comprising at least one homologous region of said first cDNA; a transgene being introduced into at least one of said cDNAs.
  • the hosts can be any cells susceptible to infection by recombinant Mononegaviruses, illustrated by mammalian or chicken egg cells. It is possible to efficiently produce recombinant Mononegaviruses or the product of foreign genes by infecting these hosts with recombinant Mononegaviruses and by harvesting the recombinant Mononegaviruses or the expressed product of foreign genes.
  • the proteins thus expressed can be harvested by standard method from the culture medium or from cells when the hosts are cells, or also from the chorioallantoic fluid when the hosts are birds' eggs, in particular of hen.
  • the recombinant Mononegavirus is used and harvested by passage through the embryonated eggs.
  • the egg is a system susceptible to viral infection and produces type 1 interferons. Viruses carrying mutations in the genes neutralizing this anti-viral response, particularly the C gene, will be difficult to collect by passage through the eggs.
  • the recombinant viruses can be plated on defective interferon cell lines.
  • the viral load of vaccinia becomes an important trait which can seriously interfere with the isolation of the infectious virus. This can be reduced by the use of a product that inhibits the replication of the helper virus, such as the cytosine arabinoside, and or by the filtration of supernatants from transfected cells.
  • MVA-T7 strain of vaccinia which was adapted to growth in the egg.
  • This strain is less cytopathic in most mammalian cell lines.
  • it has been found that the growth of the MVA-T7 strain is particularly retarded in human Hep-2 cells (no cytopathic effect (“cpe”) visible before 6 days of post infection), this suggesting that this can be a "background” in which one can selectively isolate plaques of Mononegaviruses generated during the initial transfection (these are generally visible as plaques between the 3 rd and 5 th day of post infection). Consequently, the selection of plaques appearing before 5 th post-infection day should allow selective harvesting recombinant Mononegavirales.
  • a culture medium, a cell extract or a chorioallantoic fluid containing the expressed heterologous protein obtained by following the method of the invention for the production of a heterologous protein is another aspect of the invention.
  • the invention is also directed to a kit comprising at least vectors allowing the expression of the N, P and L proteins of a Mononegavirus and of the RNA polymerase, and:
  • a cDNA molecule (corresponding to the first cDNA of the method for preparing recombinant Mononegaviruses according to the invention) comprising at least 80% of the genome of said Mononegavirus with at least one region homologous to the NP and / or P and / or L gene , or
  • a composition comprising a first cDNA comprising 80% or less of the genome of a Mononegavirus and at least a second cDNA comprising at least a part of the genome of said Mononegavirus not included in said first cDNA, and said at least second cDNA comprising at least one region homolog of said first cDNA of said Mononegavirus also forms part of the present invention.
  • This first cDNA and second cDNA entering into this composition are preferably those described for the preferred methods for preparing recombinant Mononegaviruses according to the invention.
  • composition further comprising cDNAs encoding, preferably separately, for the N, P and L proteins of said Mononegavirus and, where appropriate, for an RNA polymerase, is particularly preferred.
  • the kit or the composition according to the invention contains first and / or second cDNAs comprising at least one unique enzyme restriction site.
  • the kit according to the present invention can also comprise a host susceptible to infection by said Mononegavirus, such as those described above.
  • the subject of the present invention is a composition, in particular a pharmaceutical composition, comprising recombinant Mononegaviruses obtained by the method of the invention.
  • Said compositions comprising the recombinant Mononegaviruses of the invention can include a buffer or a stabilizing agent, which is selected in accordance with the desired use of the Mononegaviruses or of the heterologous protein which it is desired to express, and can also include other substances suitable for the use for which these compositions are intended.
  • a buffer or a stabilizing agent which is selected in accordance with the desired use of the Mononegaviruses or of the heterologous protein which it is desired to express, and can also include other substances suitable for the use for which these compositions are intended.
  • Those skilled in the art can readily select an appropriate buffer or stabilizer suitable for the desired use, of which a wide variety is known in the art.
  • the compound may include a pharmaceutically acceptable carrier, a wide variety of which is known in the art, and which need not be discussed in detail here.
  • Pharmaceutically acceptable excipients have been widely described in numerous publications, including, for example, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19th Ed. (1995) Mack Publishing Co.
  • compositions can be prepared in many forms, such as granules, tablets, pills, suppositories, capsules, suspensions, sprays, transdermal applications (eg patches, etc.), balms, lotions and products of the same order.
  • Pharmaceutical grade organic or inorganic carriers and / or diluents suitable for oral and topical use can be used to form compounds containing the therapeutically active agent.
  • the diluents known in the field include the aqueous medium, oils and animal or vegetable fats.
  • the agents stabilizers, humidifying or emulsifying agents, salts to vary the osmotic pressure or buffers to guarantee an adequate pH level, and dermal penetration stimulants can be used as auxiliary agents.
  • the invention also relates to the vaccines which comprise the recombinant Mononegaviruses obtained by the preparation method of the invention.
  • the recombinant Mononegaviruses contain a heterologous gene, such as those defined below.
  • Vaccines can be used to treat human or veterinary diseases.
  • the vaccine of the invention is formulated in accordance with the methods well known in this field, using the carrier (s) and / or the appropriate pharmaceutical vehicle (s). .
  • An isotonic solution of sterile alkaline salt (s) is a suitable vehicle.
  • Other aqueous or non-aqueous sterile isotonic injectable solutions and aqueous or non-aqueous sterile suspensions known to be pharmaceutically acceptable carriers and well known to experts in the field, could be used for this purpose.
  • the information thus obtained can be applied to negative strand viruses with a high demand for live vaccines, such as measles virus and mumps virus.
  • a vaccine composition of the invention can be formulated to contain other components, including for example adjuvants, stabilizers, pH adjusters, preservatives and the like.
  • adjuvants include, but are not limited to, saline aluminum adjuvants (Nicklas, Res. Immunol.
  • the present invention provides methods of inducing an immune response to an antigen comprising administering to a mammalian subject a recombinant Mononegavirus of the invention containing a heterologous gene encoding said given antigen.
  • a recombinant Mononegavirus of the invention containing a heterologous gene encoding said given antigen.
  • the Mononegaviruses infect and enter a cell of said mammal, the antigenic polypeptide is released, in particular by proteolytic cleavage, and an immune response against said heterologous polypeptide is provoked.
  • the recombinant Mononegaviruses of the present invention are administered to an individual using known methods. They will generally be administered by the same routes by which conventional vaccines (currently available) are administered and / or by routes that mimic the route used by the pathogen of interest for infection. They can be administered in a vaccine composition which includes a physiologically acceptable carrier, in addition to the recombinant Mononegavirus according to the invention, preferably replication-competent.
  • the composition may also include an immunostimulating agent or an adjuvant, a flavoring agent, or a stabilizer.
  • routes of administration include intranasal, intramuscular, intratracheal, intratumoral, subcutaneous, intradermal, vaginal, intrapulmonary, intravenous, rectal, oral and other parenteral routes of administration.
  • the routes of administration can be combined, if desired, or adjusted according to the antigenic peptide or the disease.
  • the vaccine composition can be administered in a single dose or in multiple doses, and can include the administration of booster doses to induce and / or maintain immunity.
  • the vaccine comprising the recombinant Mononegaviruses comprises a sufficient quantity of said recombinant Mononegaviruses and is administered by a route of administration selected to provoke an effective immune response in order to facilitate the protection of the host against infection, or the symptoms associated with the infection, caused by the pathogenic organism, or else to provoke an effective immune reaction against a tumor associated with an antigen, pathogen or tumor against which the vaccine is directed.
  • a route of administration selected to provoke an effective immune response in order to facilitate the protection of the host against infection, or the symptoms associated with the infection, caused by the pathogenic organism, or else to provoke an effective immune reaction against a tumor associated with an antigen, pathogen or tumor against which the vaccine is directed.
  • the number of recombinant Mononegaviruses in each dose of vaccine is selected as a number which induces an immunoprotective or other immunotherapeutic response, without significant side effects generally associated with standard vaccines. Such a number will vary depending on the specific immunogen employed, whether the composition of the vaccine contains an adjuvant or not, and a host of host-dependent factors.
  • An effective dose of recombinant Mononegavirus vaccine will generally be in a range of from about 10 2 to about 10 7 , from about 10 3 to about 10 6 , or from about 10 4 to about 10 5 plaque forming units (PFUs) ).
  • An optimal number for a particular vaccine can be confirmed by standard studies involving the observation of antibody titers and other responses in the subject.
  • the immunity level provided by the vaccine can be monitored to determine the need, if any, for booster shots. Following a check of the antibody titers in the serum, optional booster immunizations may be desired.
  • the immune response to the protein of this invention is enhanced by the use of an adjuvant and or an immunostimulant.
  • the present invention is further oriented for the use of the recombinant Mononegaviruses obtained by the preparation method according to the invention for the analysis of viral function.
  • the method of the invention has made it possible to introduce mutation and insertion points at any site of the genomic cDNA, such a method making it possible to obtain genetic information on viral functions more quickly than the previous techniques. For example, after having elucidated the mechanism of replication of viral RNA, it will be possible with such a method to develop a virucide which is less dangerous for a host cell by targeting the nucleic acid replication process by using the differences between the metabolisms. viral nucleic acid and those of the cell host.
  • the elucidation of the functions of viral proteins encoded by viral genes can contribute to the development of virucides targeting the proteins involved in infectivity and the formation of viral particles.
  • these techniques can be used for the analysis of epitopes presenting F and HN protein antigens which can act as antigenic molecules on the surface of the cell.
  • the recombinant Mononegaviruses of the present invention can also be used for the production of heterologous polypeptides in host cells, such as mammalian, particularly human, or other cell types.
  • host cells such as mammalian, particularly human, or other cell types.
  • the heterologous protein thus produced can be isolated using standard purification methods well known to those skilled in the art.
  • the recombinant Mononegaviruses carrying a transgene obtained by the method of the invention can be used in vaccines, as demonstrated above.
  • the present invention is also related to the use of
  • Mononegaviruses obtained by the method of the invention as vectors for gene therapy.
  • Said recombinant Mononegaviruses carrying a transgene according to the invention as gene therapy vectors may be particularly useful when the suppression of a replication of a viral vector for gene therapy becomes necessary for the performance of therapy or during therapy, since it is sufficient to administer only an RNA-dependent RNA polymerase inhibitor to specifically suppress viral vector replication without damaging cellular hosts.
  • Other characteristics and advantages of the invention appear in the following description with the examples and figures whose legends are shown.
  • Figures 1A and 1B Schematic representations of a recombination requiring a single cross-over event (Figure 1A) or a double cross-over event (Figure 1B).
  • Figure 1A Homologous recombination requiring a simple cross-over event
  • Recombination requiring a simple cross-over event occurs when two segments (1 and 2) are contiguous and have a common part, one representing the 3 'genomic end and the second the 5' genomic end.
  • Figure 1B Homologous recombination requiring a double cross-over event When a major deletion is made inside the full length genomic clone generating a defective genome (segment 2), and when this defection is repaired by recombination with the segment corresponding to the region of the genome which has been removed from the defective genome (segment 1), a segment further comprising the flanking homologous sequences required for recombination, a double cross-over event occurs.
  • Figure 2 is a schematic representation of a full length genomic clone of SeV. The deletion of the L gene fragment is shown.
  • FIG. 3 shows the FL4 HN Mlu ⁇ Spel construct carrying a new “start / stop” signal derived from the border between the genes of the N and P gene, and a single Mlul site for transgene insertion (construction FL4 HN Mlu ⁇ Spel).
  • Figure 4 schematic representation of the stages of construction of a first recombinant Sendai virus "full length” (rSev) in which a heterologous gene is inserted.
  • Figure 5 Protein characterization of rSeV produced in embryonated eggs. Embryonated eggs of hens were infected on days 9-10 after fertilization, by rSeV from stock 1. On day 12 after fertilization, the allantoic fluid of each egg was harvested and analyzed by a blue SDS-PAGE gel. colloidal.
  • Track 1 SeV wt Track 2: rSeV / mTRP2
  • Lane 3 rSeV / spG140-210
  • Lane 4 rSeV / spG 130-210
  • Lane 5 rSeV / spG 130-200
  • Lane 6 rSeV / spG 140-200
  • Figure 6 One-step RT-PCR on viral RNA extracts from rSeV / spG130-200, rSeV / spG130-210, rSeV / spG 140-200, rSev / spG 140-210 with primers SeVMIul-3 'and SeVMIul-5' and rSeV / mTRP2 with the primers tnTRP2-5'.1 and mTRP2-3 '. Track 1: spG 130-200
  • Lane 5 mTRP2
  • Figure 7 schematic representation of the principle of RT-PCR with the primer
  • RNAs are specifically converted into single-stranded cDNA by using the primer oligod (T) 15.
  • T primer oligod
  • the total RNAs are then degraded by RNAse H, in order to avoid false positives and the amplification of the viral genomic RNA.
  • Figures 8A and 8B Electrophoresis of the products obtained by RT-PCR.
  • Figure 8A RT-PCR of RNA extracted from cells infected with rSeV / spG 130-200, rSeV / spG130-210, rSeV / spG 140-200, rSeV / spG 140-210 (tracks 1, 2, 3, 4: passage 4 and tracks l ', 2', 3 ', 4': passage 5).
  • Figure 8B RT-PCR of RNA extracted from cells infected with rSeV / mTRP2.
  • Figures 9A to 9E Images obtained by fluorescence microscope of cells infected with rSeV for different transgenes inserted into the recombinant rSeV.
  • the immunofluorescence results therefore indicate that the fragments of the RSV G gene are correctly expressed from all the rSeVs containing a fragment of the RSV G gene.
  • FIG. 2 A schematic representation of the full length genomic clone of SeV (strain Z) is shown in FIG. 2 (with reference to SeV-FL4, it was inserted into a plasmid pBluescript in such a way that the transcription carried out by the promoter T7 will produce a full length + ve (antigenomic) meaning transcription.
  • the SeV strain Z sequence is published in Genbank, accession number M30202.
  • the L gene represents approximately half of the entire FL4 clone. This sequence is in fact duplicated during a rescue (“rescue” for method of preparation of recombinant Mononegavirus capable of dissemination) since it is also present in the plasmid used to express the viral polymerase (the L protein expressed from the clone pGEM3 -L or pBluescript-L). This opens up the possibility of deleting a large internal portion of the L gene inside the clone FL4, a deletion which will be subsequently repaired in the cell transfected by recombination with the plasmid expressing L.
  • clone SeV-FL4 This was accomplished inside the clone SeV-FL4 by removing a Spel restriction fragment of 4,759 nucleotides (position 9368 to 14127) from the body of the L gene, reducing the size of the infectious clone by one third (with reference to FL4 ⁇ Spe). Briefly, the clone FL4 was digested with the Spel enzyme and approximately 13 kbps of fragment ( ⁇ Spe) was recovered from a 0.6% agarose gel. This fragment was linked with T4 DNA ligase and transformed into the strain of E. coli DH5 ⁇ . Plasmid clones were sorted for deletion by digestion with Spel.
  • the deleted clones were then tested in a rescue experiment by transfecting them into human A549 cells infected with vaccinia-T7 with additional rescue plasmids (i.e. pGEM-NP, pGEM-P, pGEM -L). As a negative control, the plasmid pGEM-L was excluded. 24 hours after infection, the infected / transfected cells were passed through PBS and injected into the allantoic cavity of a 9-day-old chicken embryo. The infectious virus was extracted from a clone of FL4 ⁇ Spe in the presence of pGEM-L but not in its absence, in accordance with a recombination event between two plasmids. The extracted virus replicated in titers equivalent to those observed with viruses extracted directly from parent clone FL4.
  • the 42 nts fragment inserted (a multiple of six nucleotides) has been synthesized as well as two complementary oligonucleotides carrying the HindIII sites at the two ends and an internal site Mlul.
  • the oligonucleotides were warmed and the double-stranded DNA digested with HindIII before insertion at position 8540.
  • the insertion carries a new on / off signal derived from the border of the NP / P gene.
  • the single Mlul serves as a site for the insertion of the transgenes between HN and L. This construction is called FL4 HN Mlu ⁇ Spe (see FIG. 3).
  • the transgene For insertion into this vector, the transgene must itself be an integral multiple of six nucleotides (so that the recombinant virus obeys the "rule of six") and must contain flanked sites (generally introduced by PCR). Transgenic insertions that are not multiple of six are possible. However, in this case the genomic sequence must be compensated for by the addition or deletion of nucleotides so that the entire recombinant genome is a multiple of six nucleotides.
  • rSeV / spG130-200 rSeV / spG 130-210
  • rSeV / spG 140-200 rSeV / spG140-210 which code respectively for residues 130 to 200, 130 to 210, 140 to 200 and 140 to 210 of protein G of VRS-A in fusion with the signal peptide (sp) which allows the secretion of fusion proteins.
  • sp signal peptide
  • An anti-RSV candidate vaccine is in clinical phase, it is the protein BBG2Na and corresponds to the central part of protein G (G2Na, residues 130 to 230) in fusion with protein BB (region fixing the albumin of protein G of streptococcus).
  • a fifth rSeV was created coding for an antigen associated with melanoma, the murine Tyrosinase Related Protein 2 (mTRP2).
  • mTRP2 murine Tyrosinase Related Protein 2
  • This antigen belongs to the group of melanocyte differentiation antigens and has its equivalent in humans, TRP2. By its nature, this antigen induces an autoimmune CTL response through an immunological mechanism to suppress tolerance.
  • This rSeV / mTRP2 therefore lies in the development of melanoma immunotherapy.
  • the cells are infected with the recombinant vaccinia virus expressing the T7 RNA polymerase (rVV / T7) and transfected with the deleted Full-Length cDNA containing the heterologous gene of interest, and the plasmids coding for N, P and L necessary for the formation of Mononegaviruses.
  • rVV / T7 provides the polymerase allowing the production of genomic RNA and facilitates the recombination between the plasmid coding for the L gene and the genomic DNA deleted for this gene thus recreating the entire genome of rSeV.
  • RNA-B The genomic RNAs of the viral stocks and the total RNAs of the cells infected with the various rSeVs were extracted. Phenol / chloroform extraction with RNA-B was therefore carried out as indicated by the manufacturer. Cells or viruses are lysed in 500 ⁇ L of RNA-B. 0.1 volume of chloroform is added to each sample which is vortexed for 15 s, incubated for 5 min in ice and centrifuged for 5 min at 12,000 g and 4 ° C. The aqueous phase is recovered. A volume of isopropanol is added and the samples are incubated for 15 min at 4 ° C. and centrifuged for 15 min at 12,000 g and 4 ° C.
  • RNA pellets obtained are washed with 900 ⁇ l of 70% ethanol, centrifuged 8 min at 7500 g and 4 ° C. The samples are then dried with SpeedVac (Automatic Environmental SpeedVac, Savant) and taken up in 13 ⁇ l of H2 ⁇ treated with diethylethylpyrocarbonate (DEPC).
  • SpeedVac Automatic Environmental SpeedVac, Savant
  • a single-step RT-PCR was carried out on each batch of RNA using the OneStep RT-PCR kit (Qiagen).
  • the G fragments (G130-200, G130-210, G140-200 and G140-210) were amplified with the primers: SeV-Mlu-5 ': 5'-AACCCAGGGTGAATGG-3' (SEQ ID No. 3), SeV -Mlu-3 ': 5'-AGACCTATGGCAAGC-3' (SEQ ID No. 4).
  • the mTRP2 fragment was amplified with the primers: TRP2-5M: 5'- AAAGTCAGACAGAAACCAGGTGGGACGCCG-3 '(SEQ ID No. 5), TRP2-3': 5'-GAGCGACGG TGTAATTAGTTACTACCCA-3 '(SEQ ID No. 6).
  • the 5 fragments were treated according to the same amplification protocol, first 30 min at 50 ° C for reverse transcription, followed by 15 min at 95 ° C to inactivate reverse transcriptase and activate Taq polymerase, then 35 cycles comprising 1 min of denaturation at 95 ° C, 1 min of hybridization at 60 ° C and 1 min of elongation at 72 ° C, and the reaction ends with 10 min of end of elongation at 72 ° C.
  • the products resulting from this reaction are deposited on a 1% TBE agarose gel revealed with ethidium bromide (BEt; Sigma chem. Co, St Quentin, France).
  • the size of the fragments obtained corresponds perfectly to what was expected after amplification with the primers mentioned. Indeed, the amplification of the genes of the different spG fragments (spG130-210, spG130-210, spG140-200 and spG140-210) must provide cDNAs of 424 bp, 454 bp, 394 bp and 424 bp respectively. And a fragment of 1700 bp is expected for mTRP2.
  • RNAse inhibitor Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France
  • AMV Reverse Transcriptase Promega, Madison, Wl
  • SuperScript II RNAse H reverse transcriptase which is more faithful (Life Technologies, Cergy Pontoise, France).
  • the use of the primer Oligo (dT) i5 gives access to only the mRNAs. These two reactions were carried out as indicated by the manufacturer.
  • RNAse H New England Biolabs, UK
  • RNAse H New England Biolabs, UK
  • the single strand cDNAs from reverse transcription are amplified by the DYNAzyme EXT for High Perfomance PCR (Finnzymes, Finland) with, for the 4 G fragments, the primer: spG140linker-5 ':
  • Electrophoresis reveals the presence of cDNA of expected size for each virus. Indeed, a 342 bp fragment is expected for rSeV / spG 130-200, a 372 bp fragment for rSeV / spG130-210, then one of 312 bp for rSeV / spG 140-200 and one of 342 bp for rSeV / spG 140-210. Finally, the rSeV / mTRP2 cDNA must be 1700 bp in size. These data indicate that the heterologous gene of each rSeV is transcribed, ii. Sequencing
  • the amplicons derived from RT-PCR were sequenced to confirm the fidelity of the heterologous cut genes after several passages of rSeV.
  • the sequencing reactions were carried out with the BigDye Terminator cycle Sequencing Ready
  • the primers used for the G fragments are SeV-Mlul-5 ', SeV-Mlul-3' and for the mTRP2 fragment are, mTRP2-5'.1, mTRP2-3 ', mTRP2-5'.2: 5'- AGAGGGAGCAGTTCTTGGGCGCCTTA-3 '(SEQ ID No. 10), mTRP2-5'.3: 5'-GACAAGATGACCCAACGCTGA-3' (SEQ ID No. 11), and mTRP2-5'.4: 5'-GGCTGAAGAGAAACAACCCTT-3 '( SEQ ID No. 12).
  • the PCR program was the same for all the samples, 5 min of pre-denaturation at 94 ° C, then 25 cycles including 15 s of denaturation at 94 ° C, 15 s of hybridization at 50 ° C and 4 min of elongation at 60 ° C., to finish the reaction with 10 min of end of elongation at 60 ° C.
  • the samples are purified on a Sephadex G50 column (centriflex gelfiltration Cartridge, Edge Biosystems) and taken up in a formamide / EDTA solution (5/1 ratio). Then, the samples are denatured for 5 min at 95 ° C. and deposited on 6% polyacrylamide gel in an automatic sequencing system of ABI Prism. The migration is carried out at 2500 V overnight.
  • the sequences obtained are analyzed using the SEQUENCHER software (Gene Codes Corporation).
  • Table 1 Summary of the sequencing of heterologous genes introduced into the various rSeVs and of mRNAs derived from these genes
  • heterologous genes are transcribed into mRNA.
  • rSev GENES control of the sequence of the transgene inserted in the initial full length lSen recombinant rSeV before deletion (cf. FIG. 3) relative to the sequence of the transgene before its insertion;
  • a 12-well plate was seeded with 2 ⁇ 10 5 HEp-2 cells per well and infected with the various rSeV (rSeV / spG 130-200, rSeV / spG 130-210, rSeV / spG140-200, rSeV / spG 140-210, rSeV / mTRP2) with an MOI of 4.
  • the MOI (“MOI” for Multiplicity Of Infection) corresponds to the ratio of the number of viruses to the number of cells. For example, an MOI of 1 corresponds to 1 virus for 1 cell.
  • the cells are incubated for 48 hours at 33 ° C in HEp-2 maintenance medium (MEM 10X, Medium 199 Hank's knows 10X, 1% FCS, 50 ⁇ g / ml of gentamycin and 2 mM L-glutamine) .
  • the cells are fixed and permeabilized with methanol (SDS, France) for 6 min, at -20 ° C with 700 ⁇ l / well of cold methanol (-20 ° C). After 3 washes with PBS-ABC (Life Technologies), they are blocked for 30 min at room temperature (RT) with 700 ⁇ l / well of blocking solution (PBS-ABC, 0.5% gelatin, 0.25% BSA) .
  • the cells are incubated for 30 min with 700 ⁇ L of primary antibody (5C2 or 18D1) diluted to 300 th in the blocking solution, washed 4 times with the washing solution (PBS-ABC, 0.2% gelatin) and incubated for 30 min at RT with 700 ⁇ l of secondary antibody (Alexa labeled anti-mouse IgG horse antibody to
  • FL4 ⁇ 1 This construction is called FL4 ⁇ 1.
  • this deletion can be combined with the deletion of ⁇ Spe inside the L gene, and thus generate the FL4 ⁇ 1 ⁇ Spe construct.
  • a shuttle vector allowing the insertion of a transgene between the N and P genes via a double cross-over event can be constructed in the following manner.
  • the clone FL4 is cut with the restriction enzyme Stul (position 3979 at the very start of the M gene) and Kpnl (position 15281, near the end of the L gene).
  • Stul restriction enzyme
  • Kpnl position 15281, near the end of the L gene
  • the 7Kbp fragment contains the vector pBluescript plus the first 4,000 bases of the genome of the Sendai virus (the leader, N and P genes).
  • a new unique restriction site must first be introduced downstream of the NP “reading frame stop” codon but upstream of the junction of the NP-P gene (for example a SphI site could be introduced towards position 1517 by the PCR-oriented mutagenesis technique).
  • a gene junction cassette can then be introduced essentially at this site as shown above in outline for the border of the HN-L gene.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de préparation, de construction et/ou de génération de Mononegavirus recombinants dans un hôte cellulaire capables de se disséminer, ainsi qu'une méthode de production de peptides recombinants mettant en oeuvre de tels Mononegavirus recombinants. L'invention comprend également des compositions d'ADNc, des cellules hôtes ou des kits comprenant les éléments nécessaires à cette construction. L'invention est aussi relative à des compositions pharmaceutiques, notamment vaccinales, comprenant de tels Mononegavirus recombinants, et l'utilisation de ces Mononegavirus recombinants comme vecteur pour la thérapie génique.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE MONONEGAVIRUS RECOMBINANTS
ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention se rapporte à une méthode de préparation, de construction et/ou de génération de Mononegavirus recombinants dans un hôte cellulaire capables de se disséminer, ainsi qu'une méthode de production de peptides recombinants mettant en oeuvre de tels Mononegavirus recombinants. L'invention comprend également des compositions d'ADNc, des cellules hôtes ou des kits comprenant les éléments nécessaires à cette construction. L'invention est aussi relative à des compositions pharmaceutiques, notamment vaccinales, comprenant de tels Mononegavirus recombinants, et l'utilisation de ces Mononegavirus recombinants comme vecteur pour la thérapie génique.
Les virus à ARN sont classés en trois groupes, les virus à ARN double brin, les virus à ARN de polarité positive et les virus à ARN de polarité négative. Le groupe des virus à ARN double brin comprend les reovirus, les rotavus, les phytoreovirus, etc.. Ils ont un génome à ARN double brin multi-filamenteux segmenté.
Les virus à ARN positif comprennent les poliovirus, le virus Sindbis, le virus « Semliki forest », et le virus japonais de l'encéphalite B ; ils possèdent un génome ARN simple brin de sens positif. L'ARN du génome peut fonctionner ainsi comme un ARNm et est capable de produire les protéines nécessaires pour la réplication de l'ARN et pour la formation de particules selon les fonctions de traduction des cellules hôtes. En d'autres termes, l'ARN du génome, lui-même de virus à ARN brin positif est infectieux.
D'autre part, les virus adéno-associés, classifiés dans la famille des parvovirus, ont la capacité d'infectivité mais pas la capacité de dissémination (l'infection mixte des adénovirus est nécessaire à la formation de particules virales).
De plus, l'ARN simple brin positif issu du virus Sindbis qui est transcrit artificiellement in vitro est capable d'infection, c'est-à-dire de former des particules virales lorsqu'il est transfecté dans des cellules. Par opposition, non seulement le brin négatif mais aussi le brin positif de l'ARN viral de Sendaï transcrit artificiellement in vitro n'est pas infectieux, c'est-à-dire ne forme pas de particules virales infectieuses lorsqu'il est transfecté dans des cellules.
Récemment, des vecteurs viraux ont été utilisés comme véhicule de thérapie génique. Afin de les utiliser comme vecteurs de thérapie génique, il est nécessaire d'établir des techniques de reconstitution de particules virales, c'est-à-dire la formation artificielle du génome viral et la production de virus recombinant in vitro ou de manière intracellulaire. En effet, pour transférer des gènes étrangers dans de tels vecteurs viraux, il est nécessaire de reconstituer les particules virales avec des gènes étrangers introduits par manipulation génétique dans le génome du virus. Dès lors que les techniques de reconstitution virale sont établies, il devient possible de produire des virus avec le transgène désiré introduit ou avec les gènes cibles supprimés ou inactivés.
La reconstitution de virus à ADN possédant de l'ADN comme acide nucléique génomique est connue. Elle peut être réalisée en introduisant le génome purifié lui- même, comme par exemple pour SV40, dans des cellules de singe (J. Exp. Cell Res., 43:415-425, 1983). La reconstitution de virus à ARN contenant un génome ARN a d'abord été effectuée pour un virus à ARN à brin positif, étant donné que l'ARN génomique fonctionne également comme ARNm. Par exemple, dans le cas du poliovirus, la capacité de dissémination de l'ARN génomique purifié avait déjà été démontrée en 1959 (Journal of Expérimental Medicine, 110:65-89, 1959). Puis, la reconstitution du virus « Semliki forest » (SFV) par l'introduction d'ADN complémentaire (ADNc) clone dans les cellules hôtes en utilisant l'ARN-polymérase ADN-dépendante des cellules hôtes a été démontrée (Journal of Virology, 65:4107- 4113, 1991 ). Ainsi, en utilisant ces techniques de reconstitution virale, des vecteurs de thérapie génique ont été développés (Bio/Technology, 11 :916-920, 1993 ; Nucleic Acids Research, 23:1495-1501 , 1995 ; Human Gène Therapy, 6:1161-1167, 1995 ; Methods in Cell Biology, 43:43-53, 1994 ; Methods in Cell Biology, 43:55-78, 1994).
Le virus Sendaï (SeV) est également nommé « hemagglutinating virus of Japan (VHJ) », et est classifié comme un virus parainfluenza de type I murin, appartenant à la famille des Paramyxoviridae et à la super famille des Mononegavirales (Mononegavirus).
Les particules de virus Sendaï sont des virus enveloppés pléomorphiques de 150-200 nm de diamètre et possèdent un génome à ARN de polarité négative non segmenté, supérieur à 15 Kb.
Historiquement, le virus Sendaï a été considéré comme un virus à fort potentiel industriel, en étant largement utilisé, particulièrement pour la production d'hétérokaryons et de cellules hybrides, du fait de sa capacité de fusion cellule-virus. De plus, le virus Sendaï est aussi utilisé comme inducteur de nombreux interférons. Toutefois, comme il est décrit ci-dessus, malgré les nombreux avantages que présente le virus Sendaï en tant que virus utile dans le domaine industriel, ce n'est que tout récemment qu'une méthode pour reconstituer des virions infectieux a été établie, principalement à cause de son génome à ARN de polarité négative. Ces méthodes développées sont toutefois très laborieuses et ne facilitent pas la manipulation du génome.
Il a été clairement démontré qu'une simple introduction d'un ARN d'un virus à ARN de polarité négative ou son ARN complémentaire (ARNc) dans des cellules hôtes ne permet pas la génération de virus à ARN de polarité négative. Ce qui est tout à fait différent dans le cas de virus à ARN de polarité positive. Des systèmes de reconstitution de virus à ARN de polarité négative ont été présentés pour le virus influenza (Annu. Rev. Microbiol., 47:765-790, 1993 ; Curr. Opin. Genêt. Dev., 2:77-81 , 1992). Le virus influenza est un virus ARN de polarité négative ayant un génome segmenté en huit. Dans ces articles, un gène étranger a d'abord été introduit dans l'ADNc de l'un desdits segments du génome, puis l'ARN transcrit à partir d'un ADNc de l'ensemble des huit segments a été assemblé avec la protéine NP du virus pour former des RNPs (« RNP » pour RiboNucléoProtéine). Ensuite, la reconstitution virale est effectuée en utilisant dans des cellules hôtes ces RNPs et une ARN-polymérase ARN- dépendante. Plus récemment, la reconstitution d'un virus à ARN simple brin de polarité négative à partir d'un ADNc a été mise au point pour des virus rabiques appartenant à la famille des Rhabdovirus (J. Virol., 68:713-719, 1994).
Contrairement aux virus à ARN positif, ni les génomes (-) ni les antigénomes (+) des virus à ARN simple brin de polarité négative ne sont infectieux, car aucune de ces matrices ne peut être utilisée comme ARNm pour exprimer les éléments essentiels du mécanisme de réplication (à savoir les protéines N, P et L). L'approche utilisée pour résoudre ce problème a été basée sur la capacité d'expression dans le cytoplasme de cellules de mammifères de l'ARN-polymérase du bactériophage T7 en utilisant le virus recombinant de la vaccine (vTF-7).
Ce moyen très efficace pour exprimer transitoirement des clones d'ADNc dans des cellules de mammifères consiste à placer les clones sous le contrôle du promoteur ARN-polymérase T7 et de transfecter ces ADNs (généralement sous forme de plasmides) dans des cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine qui exprime l'ARN-polymérase T7. La vaccine en outre de fournir la polymérase, se réplique également et par là même amplifie les plasmides et les recombine à haute fréquence si ils contiennent des homologies. Un clone d'ADNc représentant la totalité (dénommé ci-après ADNc «full length») du génome d'un Mononegavirus (virus appartenant à la super famille des Mononegavirales) d'environ 15 Kb peut être clone en aval d'un promoteur T7 (dans des plasmides tels que pBluescript ou pGEM). Les nucléotides supplémentaires non viraux sont ensuite perdus au cours de l'amplification subséquente du génome. L'extrémité 3' de la transcription du génome est précisément définie par le positionnement du ribozyme du virus hépatique delta (VHD) en aval de l'insertion (Pattnaik et al., Cell, 69:1011-20, 1992). Les protéines virales agissant en trans (« trans-acting ») fondamentales (N, P et L) sont fournies via les plasmides T7 co- transfectées dans la cellule infectée par vTF-7 et contenant un clone de l'ADNc full length du génome (Pattnaik et al., 1992 ; Cakaub et al., Virology, 191:62-71 , 1992). Les virus infectieux peuvent ensuite être récupérés soit après « plaquage » à partir des extraits de cellules transfectées sur des lignées cellulaires, ou comme dans le cas de SeV, après inoculation de cellules transfectées dans la cavité amniotique d'oeufs embryonnaires de poules (Garcin et al., EMBO J., 14:6087-94, 1995).
La demande de brevet EP 0 702 085 divulgue un tel processus de préparation de virus infectieux réplicatifs à ARN non segmenté de polarité négative comprenant les étapes d'introduction dans une cellule hôte exprimant une ARN-polymérase de molécules d'ADN codant les protéines N, P et L du virus, ou leurs analogues et une molécule ADN comprenant l'ADNc génomique non segmenté du virus à ARN de polarité négative.
Garcin et al. (EMBO J., 14 (24):6087-6094, 1995) décrivent également un virus Sendaï d'ADNc full length transfecté avec des plasmides pGEM exprimant la protéine nucléocapside (N), la phosphoprotéine (P) et les grandes protéines (L) dans des cellules infectées par un virus de la vaccine exprimant l'ARN-polymérase T7.
Dans la publication J. Virol., 72(7):5984-5993, 1998, les virus Sendaï recombinants sont préparés de sorte que leurs protéines C et/ou C ne puissent s'exprimer à cause d'une mutation de leurs codons start respectifs. Un des ADNc du virus Sendaï utilisé dans cet article contient une délétion d'une partie des gènes N et P, correspondant approximativement à 2,4 kb de l'ADNc entier supérieur à 15 kb du virus Sendaï, c'est-à-dire que la délétion représente 16 % du génome. Cette délétion a été introduite dans l'ADNc full length pour éviter la génération d'un virus Sendaï recombinant par recombinaison entre les plasmides support N et P avec l'ADNc full length délété. Une méthode de régénération des particules du virus Sendaï, en transfectant le génome du virus Sendaï chez un hôte exprimant tous les gènes pour la réplication virale initiale, a été décrite dans la demande de brevet WO 97/16539.
La demande de brevet WO 00/70070 décrit des particules virales défectueuses en F et/ou HN générées en utilisant un ADNc génomique du virus Sendaï présentant une délétion du gène F et/ou du gène HN. Les particules virales défectueuses en F et/ou HN ont été récupérées dans des cellules helper exprimant F et HN.
Dans la publication J. Virol., 74(14):6564-6569, 2000, les ribonucléoprotéines
(RNPs) fonctionnelles ont été extraites de SeV clone à partir d'ADNc délété du gène F (protéine d'enveloppe de fusion), en présence de plasmides exprimant la protéine de la nucléocapside et l'ARN-polymérase viral. Ces RNPs ont été transfectées dans des cellules amenées à exprimer la protéine F. Ce vecteur défectueux s'est spécifiquement amplifié dans une lignée cellulaire exprimant la protéine F de façon trypsine- dépendante mais ne s'est pas amplifié dans les cellules n'exprimant pas F. Ce vecteur est infectieux et exprime un gène rapporteur, la GFP (« Green Fluorescent Protein »).
Toutefois, dans toutes ces approches, la manipulation génétique du virus
Sendaï recombinant est restée techniquement laborieuse étant donné qu'elle était basée sur l'ADNc génomique total ou pratiquement total.
Le problème technique majeur dans cette approche est la génération et la maintenance de la stabilité du clone ADNc génomique supérieur à 15 Kb, sans compter la taille pour le plasmide ou vecteur lui même, dans des lignées cellulaires bactériennes. Ce problème devient d'autant plus complexe lorsque l'objectif est d'introduire des transgènes étrangers dans le clone d'ADNc dans le but de les exprimer via des virus recombinants. La stabilité génétique est cruciale pour une production virale efficace en raison en grande partie de la « règle de six » (Calain et Roux, Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, p.4822-4830, 1993) qui établit que pratiquement tous les génomes de Mononegavirus sont efficacement amplifiés seulement si la longueur du génome est un multiple de six.
Le but de la présente invention est d'établir un système efficace pour reconstituer un Mononegavirus, de préférence pour un virus de la famille des Paramyxoviridae, notamment de la sous-famille des Paramyxovirinae tel que le virus Sendaï, permettant la manipulation génétique de tel Mononegavirus reconstitué, et procurant des vecteurs viraux recombinants, utiles par exemple dans le domaine de la thérapie génique ou comme vaccins. Les présents inventeurs ont de façon surprenante établi que ce problème peut dans une large mesure être résolu en découpant le génome en deux parties se chevauchant qui peuvent ensuite être rassemblées dans la cellule infectée par le virus de la vaccine par recombinaison homologue. Les principaux avantages de cette méthode par rapport aux approches précédentes, dans lesquelles les clones d'ADNc génomiques full length ou pratiquement full length étaient introduits dans les cellules hôtes, sont doubles :
- les plus petits plasmides manipulés sont ainsi plus stables, et
- leur plus petite taille permet d'obtenir des sites de restriction d'endonucléase unique, c'est-à-dire présents en un seul endroit sur chaque plasmide, ce qui facilite la manipulation génétique de ces ADNs.
Par conséquent, la présente invention concerne une méthode de construction, de préparation ou de génération de Mononegavirus recombinants, de préférence pour un virus de la famille des Paramyxoviridae, notamment le virus Sendaï, comprenant les étapes suivantes :
(i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue :
- du gène N et/ou P et/ou L exprimé(s) par ladite cellule hôte avec ledit premier ADNc, et/ou,
- dudit premier ADNc avec un deuxième ADNc, le cas échéant avec plusieurs autres ADNc, contenu dans ladite cellule hôte, ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc et ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.
De manière préférée et afin de permettre la recombinaison homologue à l'étape (ii) de la méthode selon la présente invention, ladite cellule hôte est capable d'exercer une activité de type recombinase. Cette activité pourra être une activité constitutive de ladite cellule hôte, telle que celle que l'ont peut observer dans les lymphocytes B ou T, ou pourra, de préférence, résulter de l'expression d'un gène hétérologue codant pour un protéine à activité recombinase, telle que par exemple l'activité recombinase apportée par l'intermédiaire du virus de la vaccine utilisé dans un mode de réalisation préféré pour exprimer l'ARN polymérase de ladite cellule hôte à l'étape (i) de la méthode selon l'invention (voir ci-après).
Par « capacité de dissémination » pour un virus, on entendra désigner un virus possédant à la fois la capacité d'infecter une cellule et celle de se répliquer à l'intérieur de cette cellule et, de préférence, donnant lieu à des progéniteurs réplicatifs.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants comprend les étapes suivantes :
(i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ;
(ii) la recombinaison homologue du gène N et/ou P et/ou L exprimé(s) par ladite cellule hôte avec ledit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.
Dans un mode de réalisation également préféré de l'invention, la méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants comprend les étapes suivantes : (i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue :
- dudit premier ADNc avec un deuxième ADNc contenu dans ladite cellule hôte, ledit deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc et ledit deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.
Si, dans les méthodes de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants selon la présente invention, ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, peut ou peuvent être introduit(s) dans ladite cellule hôte préalablement ou postérieurement à l'introduction dudit premier ADNc, dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, est (sont) introduit(s) dans la cellule hôte simultanément à l'introduction dudit premier ADNc. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule hôte exprimant les gènes N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, est une cellule hôte comprenant des vecteurs permettant l'expression desdites protéines N, P et L et de ladite ARN-polymérase.
En accord avec la présente invention, les Mononegavirus (virus appartenant à la super famille des Mononegavirales) sont définis comme des virus à enveloppe dont le génome est composé d'ARN simple brin de polarité négative, c'est-à-dire dont la transcription ne résulte pas en ARNm capable d'être traduit en protéine. Ils incluent les familles virales « Paramyxoviridae », « Rhabdoviridae » et « Filoviridae ». Cette classification est dérivée du Comité International sur la Taxonomie des Virus (ICTV), et figure dans le livre « Virus Taxonomie : The Classification and Nomenclature of Viruses. The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (book). M.H.V. van Regenmortel, CM. Fauquet, D.H.L. Bishop, E.B. Carstens, M.K. Estes, S.M. Lemon, J. Maniloff, M.A. Mayo, D.J. McGeoch, C.R. Pringle, R.B. Wickner (2000). Virus Taxonomy, Vllth report of the ICTV. Académie Press, SanDiego, 1167pp ».
Les Paramyxoviridae comprennent le virus Sendaï (SeV), le virus parainfluenza humain types 1 , 2, 3, 4A, 4b (PIV1 , 2, 3, 4A/B), le virus parainfluenza bovin type 3, le virus de la rougeole, le virus des oreillons, le virus syncytial respiratoire humain et bovin (VRS), le virus « rinderpest », le virus de la maladie de Carré du chien, le virus Nipah, le virus Hendra, le virus de la maladie de Newcastle, le virus simien 5, le virus simien 41, le morbillivirus du dauphin, le virus de la peste des petits ruminants, le virus de la maladie de Carré « phocine », le virus murin de la pneumonie, le virus de la rhinotrachéite de l'oie, le métapneumovirus humain.
Les ADNcs codant pour le génome des Mononegavirus sont déjà décrits dans l'art antérieur ; plus particulièrement, les ADNcs codant pour le virus Sendaï, le virus de la rougeole, le virus des oreillons, le virus « rinderpest », le virus de la maladie de Newcastle, le virus de la maladie de Carré du chien, le virus Nipah, le virus parainfluenza humain types 2 et 3, le virus parainfluenza bovin type 3, le virus syncytial respiratoire humain et bovin (VRS) sont décrits dans la littérature. Les ADNcs du virus Sendaï utilisés dans la présente invention peuvent être dérivés de souches virales, telles que par exemple les souches Z ou Fushimi. Les génomes des particules défectives et interférentes (appelés génome « Dl » - particules virales contentant un gémome virale délété qui a besoin d'un virus natif pour sa dissémination et dont la réplication interfère avec la réplication du virus native) ou les minigénomes du virus Sendaï (réf.: Defective interfering particle in EMBO J., 10:3079- 3085, 1991) peuvent également être utilisés. De préférence, les ADNcs utilisés correspondent aux clones FL4 ou FL3. Ces derniers correspondent à un clone ADNc full length (c'est-à-dire codant pour le génome entier) de la souche Z du virus Sendaï qui a été inséré dans un vecteur plasmide pBluescript sous le contrôle du promoteur T7, et desquels des virus infectieux et disséminatifs ont été isolés. Ils contiennent les trois nucléotides G supplémentaires à l'extrémité 5' et le ribozyme VHD, tel que défini ci-dessus.
Pour l'expression de l'ARN-polymérase, on utilise de préférence comme vecteur le virus recombinant de la vaccine exprimant l'ARN-polymérase T7. L'infection par le virus de la vaccine permet d'obtenir des taux élevés de recombinaison entre les plasmides car les ADNcs double brin sont répliqués par le mécanisme de réplication viral. Une source alternative de polymérase T7 correspond aux lignées qui expriment cette enzyme de façon stable (intégré dans l'ADN chromosomal des cellules).
Les protéines N (également connue sous la dénomination NP), P et L des Mononegavirus exprimées dans l'hôte à l'étape (i) de la méthode selon l'invention sont exprimées en utilisant des plasmides helper, tels que ceux décrits dans Curran et al., EMBO J., 10:3079-3085, 1991. Généralement, l'ADNc clone est positionné en aval du promoteur T7 dans des plasmides tels que pGEM ou pBluescript.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome d'un Mononegavirus est préparé à partir du clone FL4 full length, lorsqu'il s'agit du virus Sendaï. La délétion est effectuée en utilisant les sites de restriction enzymatiques adéquats à l'intérieur dudit ADNc clone (ex : Spel ; voir ci- dessous). Dans une forme particulièrement appréciée de l'invention, ledit premier ADNc comprend de 25 % à 80 %, et de préférence de 40 % à 70 % du génome dudit Mononegavirus.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit premier ADNc comprend une délétion dans le gène L codant pour la grande protéine (« L » pour Large protein).
Le gène L représente, par exemple dans le clone FL4, approximativement la moitié du génome entier. Cette séquence est en fait dupliquée dans la cellule hôte, puisqu'elle est également présente dans le vecteur utilisé pour exprimer la protéine L de la polymérase virale. Une grande portion interne du gène L peut ainsi être délétée de FL4, une délétion qui sera par la suite réparée dans la cellule transfectée par recombinaison homologue (double cross-over) avec le vecteur utilisé pour exprimer la protéine L (voir figure 1B). A l'intérieur du clone SeV-FL4, ceci peut être effectué en retirant un fragment de restriction Spel de 4 759 nucléotides (position 9 368 à 14 127) du corps du gène L, réduisant ainsi de presqu'un tiers la taille du clone infectieux. Une seconde approche de délétion à l'intérieur du clone FL4 peut consister à supprimer un ou plusieurs gènes. Par exemple, on pourra utiliser ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc, et comprenant en outre au moins une région homologue dudit ADNc premier. Cela est effectué par la suppression dans ledit premier ADNc d'une portion du génome comprenant un ou plusieurs gènes. Le génome est par la suite complété intracellulairement dans les cellules hôtes infectées par exemple par la vaccine en procurant un ou plusieurs plasmides helper (correspondant audit deuxième ADNc et, le cas échéant, auxdits autres ADNc) contenant au total la région délétée et pour chacun d'entre eux les séquences flanquantes permettant ainsi une recombinaison à l'intérieur du génome.
Dans une forme de réalisation encore plus particulièrement préférée de l'invention, le génome dudit Mononegavirus est divisé en deux plasmides (correspondant audit premier et audit deuxième ADNc de la méthode selon l'invention), un premier plasmide codant pour la moitié 3' du génome et un deuxième plasmide codant pour la moitié 5' du génome (ou inversement), comprenant chacun la région centrale du génome de manière à permettre la recombinaison homologue (voir exemple figure 1A).
Ainsi, il apparaît que le premier et, le cas échéant, le deuxième ADNc et/ou, le cas échéant, lesdits autres ADNc utilisés dans la méthode de l'invention sont des clones de plasmide bien plus petits que ceux de l'art antérieur et qu'ainsi, ils peuvent être manipulés plus facilement, tout en étant plus stables.
En accord avec l'invention, le terme « stable » réfère à la stabilité génétique des clones ADNc pendant l'amplification dans une bactérie telle que la bactérie E. Coli. C'est une étape obligatoire pendant la procédure de manipulation et de clonage. Toutefois, les grands ADNc dans les plasmides tendent à être faiblement tolérés dans une bactérie telle que E. Coli, et ceci crée des conditions dans lesquelles les délétions ou les réarrangements de l'ADNc peuvent être sélectionnés pendant la croissance bactérienne. De tels problèmes sont rencontrés régulièrement au cours de la manipulation du clone ADNc full length du virus Sendaï.
Le premier et, le cas échéant, le deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc utilisés dans la méthode de l'invention, simplement à cause de leur plus petite taille, porteront un plus petit nombre de sites de restriction mais surtout plus de sites de restriction uniques comparativement aux plasmides utilisés dans l'art antérieur. Il est extrêmement avantageux d'introduire des sites de restriction enzymatiques uniques flanquant chaque région intergénique des gènes puisque :
(a) cela facilite la manipulation génétique de chaque gène du virus étant donné que ces gènes peuvent être séparés en sous-clones ou en cassettes génétiques, par exemple pour l'introduction de mutations à l'intérieur d'un gène défini ; (b) cela facilite la substitution des gènes par exemple le remplacement des gènes d'un Mononegavirus, tels que les gènes F/HN du virus Sendaï, par ceux d'un autre Mononegavirus ;
(c) cela facilite l'insertion de transgène entre n'importe quel gène. Ce dernier point offre la possibilité du dosage de l'expression du transgène puisque son expression augmentera s'il est placé au plus près de l'extrémité 3', conséquemment au gradient transcriptionnel viral. Ceci permet une manipulation facile de l'ADNc clone.
Une recombinaison homologue peut être définie comme une recombinaison requérant un simple cross-over ou un double cross-over. Une recombinaison requérant un simple cross-over se présente lorsque deux segments sont contigus, un représentant l'extrémité génomique 3', et le second l'extrémité génomique 5' (voir figure 1A).
Toutefois, lorsqu'une large délétion est effectuée à l'intérieur du clone génomique full length générant ce qui est en réalité un génome défectueux, il ne peut pas lui-même engendrer une lignée disséminative infectieuse car il est incapable d'exprimer de(s) protéine(s) essentielle(s), la récupération de virus infectieux non défectueux (dans lequel cette défectuosité a été corrigée) requiert un événement double cross-over. L'information supprimée doit être apportée au moins par un deuxième plasmide (segment 1, voir figure 1B) dont les extrémités chevauchent et sont homogènes avec le site de suppression. Ceci permet de réparer les défectuosités par un événement de double cross-over par recombinaison homologue (figure 1B).
Selon l'invention, lorsqu'une recombinaison adéquate se produit, les Mononegavirus, notamment les Paramyxoviridae tels que le SeV, recombinants préservent leur capacité de dissémination, c'est-à-dire ils amplifient leur génome dans la cellule transfectée et libèrent des virus infectieux dans le milieu extra cellulaire de la cellule. Ces virus sont génétiquement stables et peuvent être soumis à des passages pour préparer des stocks viraux.
La récolte des Mononegavirus recombinants qui en résultent, qui détiennent la capacité de dissémination, peut être effectuée par passages répétés du milieu cellulaire dans des lignées de culture cellulaire, ou par infection de la cavité allantoïque des oeufs de poules embryonnés.
Dans un mode de réalisation également préféré, la méthode de construction, de préparation ou de génération de Mononegavirus recombinants selon l'invention est caractérisée en ce que ledit premier et/ou deuxième ADNc et/ou, le cas échéant, l'un desdits autres ADNc comprend au moins un site unique de restriction d'enzymes. En accord avec les méthodes de l'invention, ledit premier ou deuxième ADNc ou, le cas échéant, l'un desdits autres ADNc comprend au moins une séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue audit Mononegavirus.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'ADN exogène est flanquée par un signal d'arrêt et de marche de transcription fonctionnels spécifiques dudit Mononegavirus.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'ADN exogène est monocistronique, bicistronique ou polycistronique et que les cistrons sont séparés par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm monocistronique, bicistronique ou polycistronique codant pour une ou plusieurs protéines hétérologues.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est positionnée dans une région 3' non traduite d'un gène dudit Mononegavirus ou à l'intérieur des régions leader et/ou terminale qui contiennent les promoteurs de réplication du génome viral, et est précédée par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm bicistronique ou polycistronique codant la protéine virale et la protéine hétérologue.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est positionnée dans une région 5' non traduite d'un gène dudit Mononegavirus ou à l'intérieur des régions leader et/ou terminale qui contiennent les promoteurs de réplication du génome viral et est suivie par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm bicistronique ou polycistronique codant la protéine virale et la protéine hétérologue.
Les molécules d'ADNc premier et/ou deuxième (respectivement premier et deuxième ADNc) et/ou, le cas échéant, l'un desdits autres ADNc, peuvent porter une séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue capable d'être exprimé dans des cellules hôtes.
Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation de Mononegavirus recombinants obtenus par une méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants selon l'invention et dans laquelle méthode ledit premier et/ou ledit deuxième ADNc et/ou, le cas échéant, l'un desdits autres ADNc porte(nt) une séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue capable d'être exprimé dans des cellules hôtes pour la production de protéines recombinantes. La présente invention comprend également une méthode de production de protéines recombinantes, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes infectées par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants selon l'invention, ledit Mononegavirus comprenant un gène hétérologue codant pour ladite protéine recombinante ; et b) la récupération desdites protéines recombinantes exprimées à partir du milieu de culture desdites cellules hôtes et/ou à partir desdites cellules hôtes cultivées.
La présente invention comprend également une méthode de production de protéines recombinantes, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'infection de la cavité allantoïque d'œufs d'oiseaux, notamment de poules, embryonnés par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants selon l'invention, ledit Mononegavirus comprenant un gène hétérologue codant pour ladite protéine recombinante ; et b) la récupération desdites protéines recombinantes exprimées à partir du fluide chorio-allantoïque desdits œufs d'oiseaux à partir desdites cellules hôtes cultivées.
Tout gène hétérologue, également appelé transgène, peut être introduit dans n'importe quel site de n'importe quel ADNc de n'importe quel Mononegavirus recombinant. Les gènes hétérologues, destinés à être introduits, peuvent être exemplifiés, sans pour autant consister en une liste limitative, par des gènes codant pour des composés d'intérêt, tels que notamment des composés présentant ou pouvant présenter une activité thérapeutique ou préventive de maladie tels que par exemple des cytokines, des hormones peptidiques, ou tout peptides qui peuvent être exprimés à l'intérieur d'une cellule hôte. Parmi les gènes hétérologues on préféra les gènes à partir desquels on peut transcrire des molécules d'ARN avec une activité biologique intrinsèque, telle qu'une ribozyme. Parmi ces gènes hétérologues, on préférera également les gènes codant pour un peptide, polypeptide ou une protéine (termes indifféremment employées ici) qui lorsqu'il est exprimé ou administré chez l'homme ou chez un animal, produit un effet thérapeutique ou une immunité protectrice, par exemple contre un organisme pathogène ou une maladie associée avec la présence d'un antigène ou causée par cet antigène. Si plus d'un antigène hétérologue, ou un de leurs epitopes d'intérêt, est codé par les séquences d'acide nucléique exogène, ils peuvent être des antigènes ou des epitopes provenant d'un seul agent pathogène ou des antigènes ou des epitopes provenant de différents agents pathogènes. Dans un des modes de réalisation préférés, un tel agent pathogène est un micro-organisme pathogène. Par exemple, un antigène hétérologue, ou un de ses epitopes, peut provenir de bactéries, parasites, virus ou de champignons qui sont des agents causals de maladies ou de troubles. Des epitopes d'allergenes, de spermatozoïdes ou de cellules cancéreuses peuvent être également utilisés. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, un antigène spécifique de tumeur (dénommé « TAA » pour Tumor associated Antigen) peut être exprimé en tant que protéine hétérologue recombinante pour l'induction d'une réponse immunitaire protectrice ou thérapeutique contre le cancer. N'importe quelle séquence codant pour un TAA peut être introduite dans les Mononegavirus recombinants de l'invention. Le TAA en entier, sans que cela soit nécessaire, peut être introduit. Une portion du TAA, par exemple, un épitope et particulièrement un épitope reconnu par un lymphocyte T cytotoxique (« CTL ») ou par un autre composant du système immunitaire et ayant des capacités prophylactiques ou thérapeutiques, peut être également introduit. Des TAA (ou fragments contenant des epitopes de TAA) pouvant être introduits dans des Mononegavirus recombinants de l'invention incluent, sans que ce soit limitatif, les MAGE-2, MAGE-3, MUC-1 , MUC-2, HER-2, antigène MAA mélanome-associé de poids moléculaire élevé, GD2, antigène carcinoembryonnaire (CEA), TAG-72, antigènes OV-TL3 et MOV18 ovaires-associés, TUAN, alpha-foeto protéine (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, antigène G250 associé à la tumeur rénale, EGP-40 (également connu sous le nom de EpCAM), S100 (antigène associé au mélanome malin), p53, antigène associé à la tumeur de la prostate (par exemple, PSA et PSMA), et p21 ras. Les séquences de gènes codant une protéine hétérologue destinée à être exprimée par le Mononegavirus recombinant selon l'invention, peuvent être obtenues par des techniques connues dans l'art antérieur, telles que par exemple et sans que ce soit limitatif, les synthèses chimiques et enzymatiques, la purification à partir de l'ADN génomique de micro-organismes, par purification ou isolement à partir d'ADNc codant pour un TAA, par synthèse d'ADNc à partir d'un ARN de micro-organisme, ou par des méthodes d'ADN recombinant.
Lorsqu'une recombinaison simple cross-over a lieu, le transgène peut être inséré soit dans le premier ou le deuxième ADNc représentant la partie 3' ou 5' du génome du Mononegavirus (segment 1 ou 2 de la figure 1A), ou encore soit dans les deux ADNc.
Lorsqu'une recombinaison double cross-over a lieu, le transgène peut être inséré soit dans le génome défectif (correspondant généralement audit premier ADNc) et/ou soit dans le deuxième ADNc et/ou, le cas échéant, dans l'un desdits autres ADNc, si undit deuxième et, le cas échéant, plusieurs autres ADNc sont utilisés. Afin d'exprimer la protéine désirée, le gène codant pour ladite protéine désirée est inséré. Comme mentionné ci-dessus, il est préférable d'introduire une séquence de bases d'un nombre multiple de 6 ; par exemple pour le SeV entre les séquences R1 (5'-AGGGTCAAAGT-3') (SEQ ID N° 1) et R2 (5'GTAAGAAAAA-3') (SEQ ID N° 2) (Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, p.4822-4830, 1993). Les insertions de transgènes de séquences nucleotidiques non multiples de six sont possibles. Toutefois, dans ce cas la séquence génomique doit être compensée par l'addition ou la délétion de nucléotides de façon à ce que l'ensemble du génome recombinant soit un multiple de six nucléotides. L'introduction d'acide nucléique hétérologue peut être effectuée selon les techniques standard de la biologie moléculaire, telles que celles décrites dans de nombreux textes de protocoles standard, dont par exemple, « Current Protocols in Molecular Biology », (F. M. Ausubel et al., Eds. 1987, and updates). Les exemples fournissent plus d'informations sur la façon dont des insertions particulières ont été effectuées. En utilisant ces lignes directrices, n'importe quelle variété d'acides nucléiques exogènes peut être insérée dans le génome du Mononegavirus. Le gène hétérologue peut être exprimé, par exemple, selon l'une des deux possibilités, c'est-à-dire :
- comme un élément transcriptionnel indépendant : cette approche nécessite une introduction du transgène dans une jonction transcriptionnelle. Le gène doit lui- même porter les codons d'initiation et les codons stop nécessaires à l'ARN- polymérase virale ARN-dépendante (ceci a été largement décrit pour beaucoup de Mononegavirus) pour garantir qu'un ARNm correctement polyadenylé en 3' et cappé en 5' soit généré. A cause du gradient transcriptionnel qui existe au sein de cette famille de virus (les gènes situés à l'extrémité 3' du génome sont exprimés à un niveau supérieur de ceux situés vers l'extrémité 5'), le positionnement du transgène dictera également en grande partie son niveau d'expression ;
- comme un deuxième cadre ouvert de lecture au sein d'un gène viral préexistant : ceci est effectué en insérant le transgène dans la région 3' ou 5' non traduite (UTR) du gène viral. Le transgène portera un site ribosomal interne en amont ou en aval (IRES- International Ribosomal Entry Site), tel que, par exemple TIRES de EMCV, Polio ou HCV. Ceci génère effectivement une transcription bicistronique dans laquelle le transgène comprend le premier ou le second cistron.
Les niveaux d'expression d'un gène étranger inséré dans un vecteur peuvent être régulés par les avantages du site d'insertion du gène et les séquences flanquantes du gène étranger. Par exemple, dans le cas du virus Sendaï, il est connu qu'il y a des niveaux croissants d'expression du gène introduit en fonction d'une distance décroissante dudit gène par rapport au gène N.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le gène hétérologue souhaité est inséré de façon à ce que les Mononegavirus recombinants selon l'invention retiennent leur capacité disséminative.
Les hôtes préférés pour l'expression des protéines peuvent être n'importe quelles cellules sensibles à l'infection par les Mononegavirus recombinants, telles que par exemple des cellules de mammifères et des oeufs de poule. Il est possible de produire efficacement le produit du gène étranger en infectant ces hôtes avec un Mononegavirus recombinant obtenue par la méthode selon l'invention comprenant un gène hétérologue exprimable et en récupérant le produit du gène étranger exprimé. Par exemple, les protéines ainsi exprimées peuvent alors être récoltées par une méthode standard à partir du milieu de culture ou de cellules lorsque les hôtes sont des cellules, et à partir du fluide chorio-allantoïque lorsque les hôtes sont des oeufs de poule.
Selon l'invention, un ou plusieurs gènes du génome des Mononegavirus dans la molécule d'ADNc première et/ou seconde peut être muté, c'est-à-dire n'importe quel gène de génome des Mononegavirus peut être délété ou modifié. Les mutations incluent les délétions, modification d'acide(s) nucléique(s) ou addition d'acide(s) nucléique(s).
De même, par exemple, afin d'inactiver des gènes pour l'immunogénicité, ou d'améliorer l'efficacité de la transcription et la réplication de l'ARN, les séquences des gènes liées à la réplication à ARN du Mononegavirus peuvent être modifiées. Concrètement, notamment pour le SeV, au moins un des facteurs de réplication, les protéines P/C et L peuvent être modifiées pour augmenter ou réduire les capacités de transcription et de réplication. La protéine HN, une des protéines constitutionnelles, a une activité double d'hémagglutinine et de neuraminidase. Par exemple, la modification de cette dernière activité peut permettre la régulation de l'infectivité virale. De même, la modification de la protéine F, protéine de fusion de la membrane, peut être utile pour améliorer les ribosomes de fusion membranaires construits en fusionnant les Mononegavirus recombinants constitués avec des liposomes artificiels contenant la drogue ou le gène désiré.
L'invention concerne également les Mononegavirus recombinants, mutés ou non et/ou portant ou non un transgène, obtenu par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention.
L'invention concerne de plus un hôte pour la construction, la préparation ou la génération de Mononegavirus recombinants, comprenant des vecteurs permettant l'expression des protéines NP, P/C et L dudit Mononegavirus et de l'ARN-polymérase, en ce qu'il comprend en outre : - une molécule d'ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit
Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène NP et/ou P/C et/ou L, ou,
- une première molécule d'ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et, une deuxième molécule d'ADNc, et, le cas échéant, plusieurs autres ADNc, comprenant au moins une partie dudit Mononegavirus non compris dans ladite première molécule d'ADNc, et ledit deuxième ADNc, et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, comprenant en outre au moins une région homologue audit premier ADNc.
L'invention concerne également un hôte pour la génération de peptide recombinant codé par un gène hétérologue (dénommée ici encore transgène), comprenant des vecteurs permettant l'expression des protéines NP, P et L de Mononegavirus et de l'ARN-polymérase, caractérisé en ce qu'il contient en outre :
- une molécule ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène NP et/ou P et/ou L, dans lequel un transgène est inséré dans ledit ADNc, ou
- une première molécule d'ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et un deuxième ADNc, et, le cas échéant, plusieurs autres ADNc, comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc, et ledit deuxième ADNc, et, le cas échéant, lesdits autres ADNc comprenant en outre au moins une région homologue dudit ADNc premier ; un transgène étant introduit dans au moins un desdits ADNcs.
Les hôtes de préférence peuvent être n'importe quelles cellules sensibles à l'infection par les Mononegavirus recombinants, illustrés par des cellules de mammifères ou d'oeufs de poule. Il est possible de produire efficacement des Mononegavirus recombinants ou le produit des gènes étrangers en infectant ces hôtes avec des Mononegavirus recombinants et en récoltant les Mononegavirus recombinants ou le produit exprimé des gènes étrangers. Par exemple, les protéines ainsi exprimées peuvent être récoltées par méthode standard à partir du milieu de culture ou de cellules lorsque les hôtes sont des cellules, ou encore à partir du fluide chorio-allantoïque lorsque les hôtes sont des oeufs d'oiseaux, notamment de poule.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le Mononegavirus recombinant est utilisé et récolté par passage à travers les oeufs embryonnés. L'oeuf est un système sensible à une infection virale et produit des interférons de type 1. Les virus portant des mutations sur les gènes neutralisant cette réponse anti-virale, particulièrement le gène C, seront difficiles à récolter par le passage dans les oeufs. Dans ces cas, les virus recombinants pourront être plaqués sur des lignées cellulaires défectueuses en interféron. Dans ces cas, la charge virale de la vaccine devient un trait important qui peut sérieusement gêner l'isolation du virus infectieux. Ceci peut être réduit par l'utilisation de produit qui inhibe la réplication du virus helper, tel que la cytosine arabinoside, et ou par la filtration des surnageants de cellules transfectées avant le premier passage. Alternativement, on peut utiliser la souche MVA-T7 de la vaccine qui était adaptée à la croissance dans l'oeuf. Cette souche est moins cytopathique dans la plupart des lignées cellulaires de mammifères. En particulier, il a été trouvé que la croissance de la souche MVA-T7 est particulièrement retardée dans les cellules Hep-2 humaines (pas d'effet cytopathiques (« c.p.e. ») visible avant 6 jours de post infection), ceci suggérant que cela peut être un « background » dans lequel on peut isoler sélectivement des plaques des Mononegavirus générés pendant la transfection initiale (celles-ci sont généralement visibles en tant que plaques entre le 3eme et le 5eme jour de post infection). En conséquence, la sélection des plaques apparaissant avant le 5eme jour de post infection devrait permettre la récolte sélective des Mononegavirus recombinants. Le passage répété de ces plaques sur les cellules Hep-2 devrait également fournir un moyen d'élimination du virus de la vaccine MVA-T7 puisque ce virus se réplique considérablement moins bien dans ces lignées cellulaires que le Mononegavirus, notamment que le virus Sendaï. Un milieu de culture, un extrait cellulaire ou un fluide chorio-allantoïque contenant la protéine hétérologue exprimée, obtenue en suivant la méthode de l'invention pour la production d'une protéine hétérologue est un autre des aspects de l'invention.
L'invention est également orientée vers un kit comprenant au moins des vecteurs permettant l'expression des protéines N, P et L d'un Mononegavirus et de l'ARN-polymérase, et :
• une molécule d'ADNc (correspondant au premier ADNc de la méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'invention) comprenant 80 % au moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène NP et/ou P et/ou L, ou
• un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et au moins un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non comprise dans ledit premier ADNc, et ledit au moins deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc. Une composition comprenant un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome d'un Mononegavirus et au moins un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non comprise dans ledit premier ADNc, et ledit au moins deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc dudit Mononegavirus, fait également partie de la présente invention. Ce premier ADNc et deuxième ADNc entrant dans cette composition sont de préférence ceux décrits pour les méthodes préférées de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'invention.
Une telle composition comprenant en outre des ADNc codant, de préférence séparément, pour les protéines N,P et L dudit Mononegavirus et, le cas échéant, pour un ARN polymérase, est particulièrement préférée.
De préférence encore, le kit ou la composition selon l'invention contient des ADNc premier et/ou deuxième comprenant au moins un site unique de restriction d'enzymes.
De manière également préférée, le kit selon la présente invention peut également comprendre un hôte sensible à l'infection par ledit Mononegavirus, tel que ceux décrits ci-avant.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition, notamment pharmaceutique, comprenant des Mononegavirus recombinants obtenus par la méthode de l'invention. Lesdites compositions comprenant les Mononegavirus recombinants de l'invention peuvent inclure un tampon ou un agent stabilisant, qui est sélectionné en accord avec l'utilisation désirée des Mononegavirus ou de la protéine hétérologue que l'on désire exprimée, et peuvent également inclure d'autres substances appropriées à l'utilisation à laquelle ces compositions sont destinées. L'homme de l'art peut facilement sélectionner un tampon approprié ou un agent stabilisateur approprié à l'utilisation désirée, dont une grande variété est connue dans le domaine. Dans certains cas, le composé peut comprendre un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, dont une grande variété est connue dans le domaine, et dont il n'est pas nécessaire de parler ici en détail. Les excipients acceptables sur le plan pharmaceutique ont été largement décrits dans de nombreuses publications, dont par exemple, "Remington : The Science and Practice of Pharmacy", 19th Ed. (1995) Mack Publishing Co.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées sous de nombreuses formes, telles que les granules, les tablettes, les pilules, les suppositoires, les capsules, les suspensions, les sprays, les applications transdermiques (ex : les patches, etc.), les baumes, les lotions et produits du même ordre. Des porteurs et/ou des diluants organiques ou inorganiques de qualité pharmaceutique, appropriés pour une utilisation orale et d'actualité peuvent être utilisés pour constituer des composés contenant l'agent actif sur le plan thérapeutique. Les diluants connus dans le domaine incluent le milieu aqueux, les huiles et les graisses animales ou végétales. Les agents stabilisateurs, agents humidifiants ou émulsifiants, les sels pour varier la pression osmotique ou tampons pour garantir un taux de pH adéquat, et des stimulants de pénétration dermique peuvent être utilisés comme agents auxiliaires.
L'invention concerne également les vaccins qui comprennent les Mononegavirus recombinants obtenus par la méthode de préparation de l'invention. Dans ces cas, les Mononegavirus recombinants contiennent un gène hétérologue, tel que ceux définis ci-dessous. Les vaccins peuvent être utilisés pour le traitement des maladies humaines ou vétérinaires. En général, le vaccin de l'invention est formulé en accord avec les méthodes bien connues dans ce domaine, utilisant le(s) porteur(s) et/ou le(s) véhicule(s) pharmaceutique(s) approprié(s). Une solution isotonique de sel(s) alcalin(s) stérile est un véhicule approprié. D'autres solutions injectables isotoniques stériles aqueuses ou non aqueuses et des suspensions stériles aqueuses ou non aqueuses, connues comme étant des porteurs acceptables sur le plan pharmaceutique et bien connues des experts dans le domaine, pourraient être employées dans ce but.
L'inoculation dans des oeufs d'oiseaux, notamment de poule, de Mononegavirus recombinants ayant des mutations atténuées, produit des vaccins vivants. Les informations ainsi obtenues peuvent s'appliquer à des virus à brin négatif ayant une demande élevée de vaccins vivants, tels que le virus de la rougeole et le virus des oreillons.
De façon optionnelle, une composition vaccinale de l'invention peut être formulée pour contenir d'autres composants, dont par exemple des adjuvants, des stabilisateurs, des ajusteurs de pH, des conservateurs et autres du même ordre. De tels composants sont bien connus de ceux qui sont experts dans l'art du vaccin. Les adjuvants incluent, sans que ce soit limitatif, des adjuvants salins d'aluminium (Nicklas, Res. Immunol. 143:489-493, 1992) ; des adjuvants de saponine ; des adjuvants Ribi (Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT) ; des adjuvants ISA de Montanide (Seppic, Paris, France) ; des adjuvants de Hunter's TiterMax (CytRx Corp., Norcross, GA) ; des adjuvants Gerbu (Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany) ; et de la nitrocellulose (Niisson and Larsson, Res. Immunol., 143:553-557, 1992). De plus, d'autres composants pouvant moduler une réponse immunitaire peuvent être inclus dans la composition, dont, sans que ce soit limitatif, des cytokines, telles que les interleukines ; des facteurs stimulateurs de colonies (ex : GM-CSF, CSF, et autres semblables) ; et un facteur de nécrose tumorale. L'invention présente fournit des méthodes d'induction d'une réponse immunitaire à un antigène comprenant l'administration à un sujet mammifère d'un Mononegavirus recombinant de l'invention contenant un gène hétérologue codant pour ledit antigène donné. Dans une telle méthode d'induction, les Mononegavirus infectent et entrent dans une cellule dudit mammifère, le polypeptide antigénique est libéré, notamment par clivage protéolytique, et une réponse immunitaire contre ledit polypeptide hétérologue est provoquée.
Lorsqu'ils sont utilisés comme vaccins, les Mononegavirus recombinants de la présente invention sont administrés à un individu en utilisant des méthodes connues. Ils seront généralement administrés par les mêmes voies par lesquelles les vaccins conventionnels (actuellement disponibles) sont administrés et/ou par des voies qui imitent la voie utilisée par le pathogène d'intérêt pour l'infection. Ils peuvent être administrés dans une composition vaccinale qui inclut un porteur physiologiquement acceptable, en plus du Mononegavirus recombinant selon l'invention, de préférence réplication-compétent. La composition peut également inclure un agent immunostimulant ou un adjuvant, un agent de sapidité, ou un stabilisateur.
Les voies d'administration conventionnelles et acceptables sur le plan pharmaceutique incluent les voies intranasale, intramusculaire, intratrachéale, intratumorale, sous-cutanée, intradermique, vaginale, intrapulmonaire, intraveineuse, rectale, orale et autres voies parentérales d'administration. Les voies d'administration peuvent être combinées, si souhaité, ou ajusté selon le peptide antigénique ou la maladie. La composition vaccinale peut être administrée en une seule dose ou en doses multiples, et peut inclure l'administration de doses de rappel pour provoquer et/ou maintenir l'immunité. Le vaccin comprenant les Mononegavirus recombinants selon l'invention comprend une quantité suffisante desdits Mononegavirus recombinants et est administré par une voie d'administration sélectionnée pour provoquer une réponse immunitaire efficace afin de faciliter la protection de l'hôte contre l'infection, ou les symptômes associés à l'infection, provoqués par l'organisme pathogène, ou encore pour provoquer une réaction immunitaire efficace contre une tumeur associée à un antigène, pathogène ou tumeur contre lequel le vaccin est dirigé., Par « quantité suffisante desdits Mononegavirus recombinants », on entend désigné une quantité pour une voie d'administration donnée permettant de provoquer une réponse immunitaire destinée à réduire ou inhiber la croissance dudit pathogène ou des cellules tumorales, notamment quand il s'agit de tumeur pour réduire la masse cellulaire tumorale ou le nombre de cellules tumorales, ou réduire la probabilité qu'une tumeur se forme.
Le nombre de Mononegavirus recombinants dans chaque dose de vaccin est sélectionné comme étant un nombre qui induit une réponse immuno-protectrice ou autre réponse immunothérapeutique, sans effets secondaires significatifs généralement associés aux vaccins types. Un tel nombre variera selon l'immunogène spécifique employé, selon que la composition du vaccin contient ou non un adjuvant, et une multitude de facteurs dépendants de l'hôte. Une dose efficace de vaccin de Mononegavirus recombinants sera généralement dans une gamme d'environ 102 à environ 107, d'environ 103 à environ 106, ou d'environ 104 à environ 105 unités de formation de plaque (PFU). Un nombre optimal pour un vaccin particulier peut être confirmé par des études standard impliquant l'observation des titres d'anticorps et autres réponses chez le sujet. Le taux d'immunité procuré par le vaccin peut être monitoré pour déterminer le besoin, s'il y en a un, des rappels. Suivant un contrôle des titres d'anticorps dans le sérum, les immunisations optionnelles de rappel peuvent être souhaitées. La réponse immunitaire à la protéine de cette invention est accrue par l'utilisation d'un adjuvant et ou d'un immunostimulant.
L'invention présente est de plus orientée pour l'utilisation des Mononegavirus recombinants obtenus par la méthode de préparation selon l'invention pour l'analyse de fonction virale. La méthode de l'invention a permis l'introduction de points de mutation et d'insertion sur tout site de l'ADNc génomique, une telle méthode permettant d'obtenir plus rapidement que les techniques antérieures des informations génétiques sur les fonctions virales. Par exemple, après avoir élucidé le mécanisme de réplication de l'ARN viral, il sera possible avec une telle méthode de développer un virucide moins dangereux pour une cellule hôte en ciblant le processus de réplication d'acide nucléique en utilisant les différences entre les métabolismes de l'acide nucléique viraux et ceux de l'hôte cellulaire. De plus, l'élucidation des fonctions des protéines virales encodées par des gènes viraux peut contribuer au développement de virucides ciblant les protéines impliquées dans l'infectivité et la formation de particules virales. Concrètement, par exemple, ces techniques peuvent être utilisées pour l'analyse d'épitopes présentateur d'antigènes des protéines F et HN qui peuvent agir comme des molécules antigéniques à la surface de la cellule.
Egalement, lorsque le gène de la cellule hôte pour la résistance virale est activé lors de l'infection virale, entraînant une résistance virale accrue, des informations importantes sur de tels mécanismes d'activation du gène hôte peuvent être obtenues par l'analyse génétique des fonctions virales. Par exemple, il est connu que les Mononegavirus, tels que le virus Sendaï sont efficaces pour l'induction des interférons, et est ainsi utilisé dans plusieurs études de base. En analysant la région du génome nécessaire à l'induction des interférons, il peut être par conséquent possible de produire un inducteur d'interféron non viral.
Comme il est décrit ci-dessus, les Mononegavirus recombinants de la présente invention peuvent également être utilisés pour la production de polypeptides hétérologues dans des cellules hôtes, telles que des cellules de mammifères, particulièrement humaines, ou autres types de cellules. La protéine hétérologue ainsi produite peut être isolée en utilisant les méthodes standard de purification bien connues de l'homme de l'art.
Les Mononegavirus recombinants porteurs d'un transgène obtenu par la méthode de l'invention peuvent être utilisés dans les vaccins, comme démontré ci- dessus. De plus, la présente invention est également liée à l'utilisation des
Mononegavirus obtenus par la méthode de l'invention comme vecteurs de thérapie génique.
Lesdits Mononegavirus recombinants porteurs d'un transgène selon l'invention en tant que vecteurs de thérapie génique peuvent être particulièrement utiles lorsque la suppression d'une réplication d'un vecteur viral pour la thérapie génique devient nécessaire à l'accomplissement de la thérapie ou pendant la thérapie, dans la mesure où il suffit d'administrer seulement un inhibiteur d'ARN-polymérase ARN-dépendant pour supprimer spécifiquement la réplication du vecteur viral sans endommager les hôtes cellulaires. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées.
Les exemples suivants ont été choisis pour fournir à l'Homme de l'art une description complète afin de pouvoir réaliser et utiliser la présente invention. Ces exemples ne sont pas destinés à limiter la portée de ce que les inventeurs considèrent comme leur invention, ni destinées à montrer que seules les expériences ci-après ont été effectuées. Légende des figures
Figures 1A et 1B : Représentations schématiques d'une recombinaison requérant un événement cross-over simple (figure 1A) ou un événement cross-over double (figure 1B). Figure 1A : Recombinaison homologue requérant un événement cross-over simple
La recombinaison requérant un événement cross-over simple survient lorsque deux segments (1 et 2) sont contigus et présentent une partie commune, l'un représentant l'extrémité génomique 3' et le second l'extrémité génomique 5'. Figure 1B : Recombinaison homologue requérant un événement cross-over double Lorsqu'une importante suppression est faite à l'intérieur du clone génomique full length générant un génome défectueux (segment 2), et lorsque cette défection est réparée par recombinaison avec le segment correspondant à la région du génome qui a été enlevée du génome défectueux (segment 1), segment comprenant en outre les séquences homologues flanquantes requises pour la recombinaison, un événement cross-over double survient.
La figure 2 est une représentation schématique d'un clone génomique full length de SeV. La suppression du fragment du gène L est représentée.
La figure 3 montre la construction FL4 HN Mlu ΔSpel portant un nouveau signal « start/stop » dérivé de la frontière entre les gènesdu gène N et P, et un site unique Mlul d'insertion de transgène (construction FL4 HN Mlu ΔSpel).
Figure 4 : représentation schématique des étapes de construction d'un premier virus de Sendaï recombinant « full length » (rSev) dans lequel un gène hétérologue est inséré.
Figure 5 : Caractérisation protéique des rSeV produits en oeufs embryonnés. Des oeufs embryonnés de poules ont été infectés aux jours 9-10 après fécondation, par les rSeV du stock 1. Au jour 12 après la fécondation, le liquide allantoïque de chaque oeuf a été récolté et analysé par un gel SDS- PAGE coloré au bleu colloïdal.
Piste 1 :SeV wt Piste 2 : rSeV/mTRP2
Piste 3 : rSeV/spG140-210
Piste 4 : rSeV/spG 130-210
Piste 5 : rSeV/spG 130-200
Piste 6 : rSeV/spG 140-200 Figure 6 : RT-PCR une étape (« one step ») sur les extraits d'ARN viraux des rSeV/spG130-200, rSeV/spG130-210, rSeV/spG 140-200, rSev/spG 140-210 avec les amorces SeVMIul-3' et SeVMIul-5' et rSeV/mTRP2 avec les amorces tnTRP2-5'.1 et mTRP2-3'. Piste 1 : spG 130-200
Piste 2 : spG130-210
Piste 3 : spG140-200
Piste 4 : spG140-210
Piste 5 : mTRP2 Figure 7 : représentation schématique du principe de la RT-PCR avec l'amorce
Oligod(T)15.
Les ARNm sont convertis spécifiquement en ADNc simple brin grâce à l'utilisation de l'amorce oligod(T)15. Les ARN totaux sont ensuite dégradés par la RNAse H, afin d'éviter les faux positifs et l'amplification de l'ARN génomique viral. Figures 8A et 8B : Electrophorèse des produits obtenus par RT-PCR.
Figure 8A : RT-PCR des ARN extraits des cellules infectées par rSeV/spG 130-200, rSeV/spG130-210, rSeV/spG 140-200, rSeV/spG 140-210 (pistes 1 , 2, 3, 4 : passage 4 et pistes l', 2', 3', 4' : passage 5).
Figure 8B : RT-PCR des ARN extraits des cellules infectées par rSeV/mTRP2. Figures 9A à 9E : Images obtenues par microscope à fluorescence de cellules infectées par des rSeV pour différents transgènes insérés dans les rSeV recombinants.
Les images montrent clairement des signaux positives dans les cellules infectées par les rSeV contenant des fragments du gène codant pour la protéine G du virus syncytial respiratoire (VRS) (9A-9D). Le rSeV/mTRP2, contenant un transgène codant pour la protéine TRP-2 (« Tyrosine Related protein type 2 » d'origine murine), utilisé comme témoin négatif, ne donne pas de signal (9E). Les résultats d'immunofluorescences indiquent donc que les fragments du gène G du VRS sont correctement exprimés à partir de tous les rSeV contenant un fragment du gène G du VRS.
EXEMPLE 1 : Suppression d'une grande section du gène L
Une représentation schématique du clone génomique full length de SeV (souche Z) est montrée figure 2 (en référence à SeV-FL4, il a été inséré dans un plasmide pBluescript de telle façon que la transcription conduite par le promoteur T7 produira une transcription de sens full length +ve (antigénomique). La séquence de SeV souche Z est publiée dans Genbank, accession number M30202.
Le gène L représente approximativement la moitié du clone FL4 entier. Cette séquence est en fait dupliquée au cours d'une rescue (« rescue » pour méthode de préparation de Mononegavirus recombinant capable de dissémination) puisqu'il est également présent dans le plasmide utilisé pour exprimer la polymérase virale (la protéine L exprimée du clone pGEM3-L ou de pBluescript-L). Ceci ouvre la possibilité de supprimer une grande portion interne du gène L à l'intérieur du clone FL4, une suppression qui sera subséquemment réparée dans la cellule transfectée par la recombinaison avec le plasmide exprimant L. Ceci a été accompli à l'intérieur du clone SeV-FL4 en retirant un fragment de restriction Spel de 4 759 nucléotides (position 9368 à 14127) du corps du gène L, réduisant la taille du clone infectieux d'un tiers (en référence à FL4ΔSpe). Brièvement, le clone FL4 a été digéré avec l'enzyme Spel et approximativement 13 kbps de fragment (ΔSpe) a été récupéré d'un gel 0,6 % agarose. Ce fragment a été lié avec la ligase ADN T4 et transformé dans la souche d'E. coli DH5α. Les clones de plasmides ont été triés pour la suppression par digestion avec Spel. Les clones supprimés ont alors été testés dans une expérience de rescue en les transfectant dans des cellules humaines A549 infectées avec de la vaccinia-T7 avec des plasmides de rescue supplémentaires (c'est-à-dire pGEM-NP, pGEM-P, pGEM-L). En tant que contrôle négatif, le plasmide pGEM-L a été exclu. 24 heures après l'infection, les cellules infectées/transfectées étaient passées dans PBS et injectées dans la cavité allantoïque d'un embryon de poulet de 9 jours. Le virus infectieux a été extrait d'un clone de FL4ΔSpe en présence de pGEM-L mais pas en son absence, en accord avec un événement de recombinaison entre deux plasmides. Le virus extrait s'est répliqué en titres équivalents à ceux observés avec les virus extraits directement de clone parent FL4.
La suppression d'une grande section de gène L a permis d'obtenir un clone plus stable qui peut être directement libéré dans le virus infectieux. EXEMPLE 2 : Insertion de transgènes entre les gènes HN et L Le clone FL4ΔSpe est fondamentalement plus stable dans les bactéries et rend disponible un grand nombre de sites de restriction d'enzymes utiles (c'est-à-dire les sites qui apparaissent une seule fois ou peu de fois à l'intérieur de l'ADNc). Au départ de ce clone, une nouvelle jonction transcriptionnelle marche/arrêt a été insérée 13 nts (« nts » pour nucléotides) en aval de la frontière intergénique HN/L au site Hindlll (position 8540). Le fragment 42 nts inséré (un multiple de six nucléotides) a été synthétisé ainsi que deux oligonucléotides complémentaires portant les sites Hindlll aux deux extrémités et un site interne Mlul. Les oligonucléotides ont été réchauffés et l'ADN double brin digéré avec Hindlll avant l'insertion à la position 8540. L'insertion porte un nouveau signal marche/arrêt dérivé de la frontière du gène NP/P. L'unique Mlul sert de site pour l'insertion des transgènes entre HN et L. Cette construction est appelée FL4 HN Mlu ΔSpe (voir figure 3).
Pour l'insertion dans ce vecteur le transgène doit lui-même être un multiple intégral de six nucléotides (afin que le virus recombinant obéisse à la « règle de six ») et doit contenir des sites flanqués (généralement introduits par PCR). Les insertions transgéniques qui ne sont pas multiple de six sont possibles. Toutefois, dans ce cas la séquence génomique doit être compensée par l'addition ou la suppression de nucléotides de façon à ce que le génome recombinant entier soit un multiple de six nucléotides.
Cette approche a été exploitée pour produire des virus recombinants exprimant la luciférase et des fragments de la protéine G du Virus syncytial respiratoire (VRS) et la protéine TRP2 ("tyrosine related protein 2") d'origine murine. EXEMPLE 3 : Caractérisation des virus recombinants obtenus avec la procédé revendigué a. Production des Mononegavirus recombinants Quatre virus exprimant un fragment de la protéine G du VRS-A ont été créés.
Ils s'agit de rSeV/spG130-200, rSeV/spG 130-210, rSeV/spG 140-200, rSeV/spG140- 210 qui codent respectivement pour les résidus 130 à 200, 130 à 210, 140 à 200 et 140 à 210 de la protéine G de VRS-A en fusion avec le peptide signal (sp) qui permet la sécrétion des protéines de fusion. Ces 4 fragments de la protéine G ont été obtenu par RT-PCR, en utilisant des amorces spécifiques, à partir des cellules eucaryotiques infectées par le VRS-A, et ensuite ont été génétiquement fusionné au peptide signal. Ils contiennent une région très conservée de la protéine G du VRS-A, impliquée dans la réponse immunitaire anti-VRS A et B. Un vaccin candidat anti-VRS est en phase clinique, il s'agit de la protéine BBG2Na et correspond à la partie centrale de la protéine G (G2Na, résidus 130 à 230) en fusion avec la protéine BB (région fixant l'albumine de la protéine G du streptocoque).
Un cinquième rSeV a été crée codant pour un antigène associé au mélanome, la Tyrosinase Related Protein 2 murine (mTRP2). Cet antigène appartient au groupe des antigènes de différenciation mélanocytaire et possède son équivalent chez l'homme, TRP2. De par sa nature, cet antigène induit une réponse CTL auto-immune grâce à un mécanisme immunologique de suppression de tolérance. Ce rSeV/mTRP2 se situe donc dans le développement d'une immunothérapie du mélanome.
Ces 5 rSeV ont été obtenus par reverse genetics comme indiqué dans la Figure X, les gènes hétérologues étant sous-cloné dans un site Mlul de l'unité de transcription artificielle pré-cloné entre les gènes HN et L de SeV. La spécificité de la rescue utilisée au CIPF est l'utilisation d'un Full-Length déleté pour une grande partie du gène L de SeV permettant de diminuer la taille du plasmide manipulé et donc de faciliter les sous-clonages.
Lors de la rescue, les cellules sont infectées par le virus de la vaccine recombinant exprimant la RNA-polymérase T7 (rVV/T7) et transfectées par l'ADNc Full-Length délété contentant le gène hétérologue d'intérêt, et les plasmides codant pour N, P et L nécessaires à la formation des Mononegavirus. Comme indiqué auparavant, le rVV/T7 apporte la polymérase permettant la production de l'ARN génomique et facilite la recombinaison entre le plasmide codant pour le gène L et l'ADN génomique délété pour ce gène recréant ainsi le génome entier du rSeV.
Après 2-3 jours de l'infection/transfection chez les cellules adhérentes, les cellules ont été grattées dans le milieu, récoltées et soniquées. Une aliquote de 0,2 à 0,5 ml a été injectée dans des œufs embryonnés de 9-11 jours. Trois jours plus tard, le liquide allantoïque (LA) a été prélevé et ré-injecté (dilué ou non) chez des œufs embryonnés, et ainsi de suite pendant 2-5 passages des virus. Après le prélèvement, 1 ml de LA est centrifugé à travers un coussin de 25 % glycérol dans le tampon Tris NaCI EDTA (TNE) et le culot est repris dans le tampon de charge (+ 2 % β- mercaptoéthanol) puis testé sur gel SDS-PAGE 12 %Tris-Glycine pour vérifier la présence des particules virales (figure 5). En effet, pour chaque récolte de LA, le profil obtenu correspond à celui du témoin positif, SeV wt. b. Confirmation de la présence du gène hétérologue dans le génome du rSeV i. RT-PCR
Les ARN génomiques des stocks viraux et les ARN totaux des cellules infectées par les différents rSeV ont été extraits. Une extraction phénol/chloroforme avec le RNA-B a donc été réalisée comme indiqué par le fabricant. Les cellules ou les virus sont lysés dans 500 μL du RNA-B. 0,1 volume de chloroforme est ajouté à chaque échantillon qui est vortexé 15 s, incubé 5 min dans la glace et centrifugé 5 min à 12 000 g et 4°C. La phase aqueuse est récupérée. Un volume d'isopropanol est ajouté et les échantillons sont incubés 15 min à 4°C et centrifugés 15 min à 12 000 g et 4°C. Les culots d'ARN obtenus sont lavés avec 900 μl d'éthanol à 70 %, centrifugés 8 min à 7500 g et 4°C. Les échantillons sont ensuite séchés au SpeedVac (Automatic Environmental SpeedVac, Savant) et repris dans 13 μl d'H2θ traitée au di- éthylpyrocarbonate (DEPC).
Une RT-PCR en une seule étape a été réalisée sur chaque lot d'ARN grâce au kit OneStep RT-PCR (Qiagen). Les fragments G (G130-200, G130-210, G140-200 et G140-210) ont été amplifiés avec les amorces : SeV-Mlu-5' : 5'-AACCCAGGGTGAATGG-3' (SEQ ID No. 3), SeV-Mlu-3' : 5'-AGACCTATGGCAAGC-3' (SEQ ID No. 4).
Le fragment mTRP2 a été amplifié avec les amorces : TRP2-5M : 5'- AAAGTCAGACAGAAACCAGGTGGGACGCCG-3' (SEQ ID No. 5), TRP2-3' : 5'-GAGCGACGG TGTAATTAGTTACTACCCA-3' (SEQ ID No. 6).
Les 5 fragments ont été traités selon le même protocole d'amplification, d'abord 30 min à 50°C pour la transcription inverse, suivi de 15 min à 95°C pour inactiver la reverse transcriptase et activer la Taq polymérase, puis 35 cycles comprenant 1 min de dénaturation à 95°C, 1 min d'hybridation à 60°C et 1 min d'élongation à 72°C, et la réaction se finit par 10 min de fin d'élongation à 72°C. Les produits issus de cette réaction sont déposés sur gel TBE 1% agarose révélé au Bromure d'éthidium (BEt ; Sigma chem. Co, St Quentin, France).
La taille des fragments obtenus correspond parfaitement à ce qui était attendu après amplification avec les amorces citées. En effet, l'amplification des gènes des différents fragments spG (spG130-210, spG130-210, spG140-200 et spG140-210) doit fournir respectivement des ADNc de 424 pb, 454 pb, 394 pb et 424 pb. Et un fragment de 1700 pb est attendu pour mTRP2.
Une RT-PCR en deux étapes a été réalisée sur chaque lot d'ARN (figure 6). Les réactions de transcription inverse ont été réalisées avec l'amorce Oligo(dT)i5 (Promega, Madison, Wl), la RNAse inhibitor (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France), l'AMV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, Wl) ou la SuperScript II RNAse H reverse transcriptase qui est plus fidèle (Life Technologies, Cergy Pontoise, France). L'utilisation de l'amorce Oligo(dT)i5 donne accès aux seuls ARNm. Ces deux réactions ont été réalisées comme indiqué par le fabricant. Après avoir inactivé la RNAse inhibitor à 72°C pendant 20 min, les échantillons sont soumis à l'action de la RNAse H (New England Biolabs, UK) pendant 15 min à 37°C afin de digérer tout les ARN restants (matriciel et autres). Les ADNc simples brins issus de la transcription inverse sont amplifiés par la DYNAzyme EXT for High Perfomance PCR (Finnzymes, Finlande) avec, pour les 4 fragments G, l'amorce : spG140linker-5':
5'-ATTAGCTAGCACGCGTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTAATACAC-3' (SEQ ID No. 7), pour les fragments G130-200 et G140-200, l'amorce : Ga200-3' :
5'-ATAGTCGACCGTTAGGTGGTTTTCTTTCCTGGTTTTTTGTTTGG-3' (SEQ ID No.
8), pour les fragments G130-210 et G140-210, l'amorce :
Ga210-3' :
» 5'-ATAGTCGACGCGTTACTTGAAGGTTGGTTTTTTTGTAGGCTTGG-3' (SEQ ID No.
9), et les amorces TRP2-5M et TRP2-3' pour le fragment mTRP2.
Les produits issus de ces PCR sont déposés sur gel TBE 1 % agarose révélé au BEt. Les produits de réaction ont ensuite été identifiés par électrophorèse (figures
8A et 8B) et séquences.
L'électrophorèse révèle la présence de l'ADNc de taille attendue pour chaque virus. En effet, un fragment de 342 pb est attendu pour le rSeV/spG 130-200, un fragment de 372 pb pour le rSeV/spG130-210, puis un de 312 pb pour le rSeV/spG 140-200 et un de 342 pb pour le rSeV/spG 140-210. Enfin, l'ADNc du rSeV/mTRP2 doit avoir une taille de 1700 pb. Ces donnés indiquent que le gène hétérologue de chaque rSeV est transcrit, ii. Séguençage
Les amplicons issues de RT-PCR ont été séquences pour confirmer la fidélité des gènes hétérologues trancrits après plusieurs passages de rSeV. Les réactions de séquençage ont été réalisées avec le BigDye Terminator cycle Sequencing Ready
Reaction Kit (ABI PRISM ; Applied Biosystem) comme décrit dans le protocole du fournisseur. Les amorces utilisées pour les fragments G sont SeV-Mlul-5', SeV-Mlul-3' et pour le fragment mTRP2 sont, mTRP2-5'.1 , mTRP2-3', mTRP2-5'.2 : 5'-AGAGGGAGCAGTTCTTGGGCGCCTTA-3' (SEQ ID No. 10), mTRP2-5'.3 : 5'-GACAAGATGACCCAACGCTGA-3' (SEQ ID No. 11), et mTRP2-5'.4 : 5'-GGCTGAAGAGAAACAACCCTT-3' (SEQ ID No. 12).
Le programme de PCR a été le même pour tous les échantillons, 5 min de pré- dénaturation à 94°C, puis 25 cycles comprenant 15 s de dénaturation à 94°C, 15 s d'hybridation à 50°C et 4 min d'élongation à 60°C, pour finir la réaction par 10 min de fin d'élongation à 60°C. Les échantillons sont purifiés sur colonne de séphadex G50 (centriflex gelfiltration Cartridge, Edge Biosystems) et repris dans une solution de formamide/EDTA (rapport 5/1). Puis, les échantillons sont dénaturés 5 min à 95°C et déposés sur gel 6 % polyacrylamide dans uns système de séquençage automatique de ABI Prism. La migration est réalisée à 2500 V sur la nuit. Les séquences obtenues sont analysées grâce au logiciel SEQUENCHER (Gène Codes Corporation).
Des résultats fiables ont été obtenus pour 4 rSeV testés : - rSeV/spG 130-200, rSeV/spG 140-200, rSeV/spG140-210 et rSeV/mTRP2. Ces virus possèdent la bonne séquence et le bon cadre de lecture pour leur gène hétérologue, même après 4 et 5 passages du virus en oeufs embryonnés (tableau 1). Ceci indique une bonne stabilité de l'insert dans le génome du virus au cours des réplications. Ce critère est important pour l'utilisation du virus comme vecteur vaccinal et thérapeutique.
Tableau 1 : Récapitulatif du séquençage des gènes hétérologues introduits dans les différents rSeV et des ARNm issus de ces gènes
Figure imgf000033_0001
En conclusion, il apparaît donc que les gènes hétérologues sont transcrits en ARNm. 1 « rSev GENES » : contrôle de la séquence du transgène inséré dans le rSeV recombinant full lenght initial avant délétion (cf. figure 3) par rapport à la séquence du transgène avant son insertion ;
2 « OK » : séquence du transgène identique à la séquence du transgène avant insertion. De plus, ces ARNm possèdent le cadre de lecture correct pour permettre l'expression des protéines relevantes, iii. Immunofluorescence:
Pour caractériser les 4 rSeV exprimant les fragments spG en terme d'expression protéique une technique d'immunoprécipitation a été mise en place. Les anticorps monoclonaux de souris 5C2 (dirigés spécifiquement contre le fragment 144- 159 de la protéine G du VRS) et 18D1 (dirigés spécifiquement contre le fragment 172- 187 de la protéine G du VRS) utilisés lors de cette étude, ont été produits et purifiés.
Une plaque 12 puits a été ensemencée avec 2x105 cellules HEp-2 par puits et infectées par les différents rSeV (rSeV/spG 130-200, rSeV/spG 130-210, rSeV/spG140- 200, rSeV/spG 140-210, rSeV/mTRP2) avec une MOI de 4. La MOI (« MOI » pour Multiplicity Of Infection) correspond au ratio du nombre de virus sur le nombre de cellules. Par exemple, une MOI de 1 correspond à 1 virus pour 1 cellule. Après l'infection, les cellules sont incubées 48 heures à 33°C dans du milieu de maintenance HEp-2 (MEM 10X, Médium 199 Hank's sait 10X, 1 % SVF, 50 μg/mL de gentamycine et 2mM de L-glutamine). Les cellules sont fixées et perméabilisées au méthanol (sds, France) pendant 6 min, à -20°C avec 700 μl/puits de méthanol froid (-20°C). Après 3 lavages au PBS-ABC (Life Technologies), elles sont bloquées 30 min à température ambiante (TA) avec 700 μl/puits de solution de blocage (PBS-ABC, 0,5 % de gélatine, 0,25 % BSA). Ensuite, les cellules sont incubées 30 min avec 700 μL d'anticorps primaire (5C2 ou 18D1) dilué au 300eme dans la solution de blocage, lavées 4 fois avec la solution de lavage (PBS-ABC, 0,2 % gélatine) et incubées 30 min à TA avec 700 μl d'anticorps secondaire (anticorps de cheval anti-IgG de souris marqué Alexa à
2 mg/mL ; Molecular Probe) dilué au 200 dans la solution de blocage. Les cellules sont lavées 4 fois avec la solution de lavage et observées au microscope à fluorescence à 488 nm (figures 9A à 9E).
EXEMPLE 4 : Insertion de transgène entre les gènes NP et P
Comme il en a été fait allusion plus haut, une expression élevée des copies du transgène sera favorisée s'il est positionné vers l'extrémité 3' du génome. Tenant compte de cela, il a été développé un vecteur permettant l'insertion du transgène entre le gène N (le 1er gène) et P (le 2eme) en utilisant une approche analogue à celle dont il a été donné les grandes lignesci-avant. Une portion d'approximativement 2,5 kb de FL4 a été supprimée s'étendant d'un site Ncol dans le gène N (position 361 sur la carte) à un site Eagl dans le centre du gène P (position 2746 sur la carte). Ces sites ont été émoussés en utilisant l'enzyme E. coli Klenow en présence des quatre déoxynucléotides et liés avec la ligase ADN T4. Cette construction est appelée FL4Δ1. Afin d'accroître encore la stabilité du plasmide, cette suppression peut être combinée avec la suppression de ΔSpe à l'intérieur du gène L, et ainsi générer la construction FL4Δ1ΔSpe. Un vecteur navette permettant l'insertion d'un transgène entre les gènes N et P via un événement cross-over double peut être construit de la façon suivante. Le clone FL4 est coupé avec l'enzyme de restriction Stul (position 3979 au tout début du gène M) et Kpnl (position 15281, près de la fin du gène L). Le fragment entourant les gènes M, F, HN et L est enlevé en séparant les fragments sur gel d'agarose à faible pourcentage. Le fragment 7Kbp contient le vecteur pBluescript plus les 4 000 premières bases du génome du virus Sendaï (le leader, gènes N et P). Ceci représente le vecteur navette de base Δ1 qui peut se recombiner avec le FL4Δ1 pour réparer la brèche faite dans les gènes NP-P. Pour convertir ceci en un vecteur navette pour l'insertion de transgène, un nouveau site de restriction unique doit d'abord être introduit en aval du codon NP « reading frame stop » mais en amont de la jonction du gène NP-P (par exemple un site SphI pourrait être introduit vers la position 1517 par la technique de mutagénèse orientée par PCR). Une cassette de jonction de gènes peut alors être introduite essentiellement à ce site comme montré plus haut dans les grandes lignes pour la frontière du gène HN-L.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Méthode de préparation de Mononegavirus recombinants, comprenant les étapes suivantes : (i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue : - du gène N et/ou P et/ou L exprimé(s) par ladite cellule hôte avec ledit premier
ADNc, et/ou,
- dudit premier ADNc avec au moins un deuxième ADNc contenu dans ladite cellule hôte, ledit deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc et ledit deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et
(iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination. 2/ Méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes :
(i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ;
(ii) la recombinaison homologue du gène N et/ou P et/ou L exprimé(s) par ladite cellule hôte avec ledit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.
3/ Méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes :
(i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue :
- dudit premier ADNc avec un deuxième ADNc contenu dans ladite cellule hôte, ledit deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc et ledit deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.
4/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit premier et/ou deuxième ADNc comprend entre 25 % et 80 %, et de préférence entre 40 % et 70 % du génome dudit Mononegavirus. 5/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit premier ADNc comprend une délétion dans le gène L.
6/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit premier et/ou deuxième ADNc comprend au moins un site unique de restriction d'enzymes. 11 Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'au moins un gène du génome dudit Mononegavirus est muté dans ledit premier et/ou deuxième ADNc.
8/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'expression de ladite ARN-polymérase dans la cellule hôte est assurée par le virus recombinant de la vaccine exprimant l'ARN-polymérase.
9/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit premier et/ou deuxième ADNc comprend au moins une séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue audit Mononegavirus.
10/ Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN exogène est flanquée par un signal d'arrêt et de marche de transcription fonctionnels spécifiques dudit Mononegavirus.
11/ Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN exogène est monocistronique, bicistronique ou polycistronique et que les cistrons sont séparées par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm monocistronique, bicistronique ou polycistronique codant pour une ou plusieurs protéines hétérologues.
12/ Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est positionnée dans une région 3' non traduite d'un gène dudit Mononegavirus ou à l'intérieur des régions leader et/ou terminale qui contiennent les promoteurs de réplication du génome virale , et est précédée par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm bicistronique ou polycistronique codant la protéine virale et la protéine hétérologue. 13/ Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est positionnée dans une région 5' non traduite d'un gène dudit Mononegavirus ou à l'intérieur des régions leader et/ou terminale qui contiennent les promoteurs de réplication du génome virale et est suivi par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm bicistronique ou polycistronique codant la protéine virale et la protéine hétérologue.
14/ Méthode selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que la séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est exprimée par ladite cellule hôte. 15/ Procédé de production de protéine recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes : a) de culture de cellules hôtes contenant des Mononegavirus recombinants obtenus par une méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'une des revendications 9 à 14 et dans laquelle méthode ladite séquence d'ADN exogène code pour ladite protéine recombinante ; et b) de récupération de ladite protéine hétérologue exprimée par lesdites cellules hôtes.
16/ Procédé de production de protéine recombinante, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes infectées par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'une des revendications 9 à 14 et dans laquelle méthode ladite séquence d'ADN exogène code pour ladite protéine recombinante ; et b) la récupération desdites protéines recombinantes exprimées à partir du milieu de culture desdites cellules hôtes et/ou à partir desdites cellules hôtes cultivées. 17/ Procédé de production de protéine recombinante, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'infection de la cavité allantoïque d'œufs d'oiseaux, notamment de poules, embryonnés par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'une des revendications 9 à 14 et dans laquelle méthode ladite séquence d'ADN exogène code pour ladite protéine recombinante ; et b) la récupération desdites protéines recombinantes exprimées à partir du fluide chorio-allantoïque desdits œufs d'oiseaux à partir desdites cellules hôtes cultivées. 18/ Mononegavirus recombinants capables de dissémination et le cas échéant de produire des progéniteurs réplicatifs susceptibles d'être obtenus par une méthode selon l'une des revendications 1 à 17.
19/ Cellule hôte pour la préparation de Mononegavirus recombinants, comprenant des vecteurs permettant l'expression des protéines N, P et L de Mononegavirus et d'une ARN-polymérase, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) soit un ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; ou b) un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit ADNc premier, avec ledit ADNc second comprenant au moins une région homologue dudit ADNc premier.
20/ Cellule hôte pour la production de protéines recombinantes, comprenant des vecteurs permettant l'expression des protéines N, P et L de Mononegavirus et d'une ARN-polymérase, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) soit un ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène NP et/ou P et/ou L, et dans lequel ADNc, un transgène codant pour ladite protéine recombinante est introduit ; ou b) un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit ADNc premier, avec ledit ADNc second comprenant au moins une région homologue dudit ADNc premier, et dans lequel l'un au moins dudit premier ou deuxième ADNc, un transgène codant pour ladite protéine recombinante est introduit. 21/ Milieu de culture, extrait cellulaire ou fluide chorio-allantoïque contenant des protéines recombinantes exprimées par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 9 à 14 ou selon la revendication 18.
22/ Kit comprenant au moins des vecteurs permettant l'expression des protéines N, P et L de Mononegavirus et d'une ARN-polymérase, et :
- une molécule d'ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue des gènes NP et/ou P et/ou L ; ou
- un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome desdits Mononegavirus et un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc, et ledit deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc.
23/ Kit selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'ADNc comprend au moins un site unique de restriction d'enzymes. 24/ Kit selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une cellule hôte pour ladite molécule d'ADNc, ou, le cas échéant, pour ledit premier et deuxième ADNc, et pour lesdits vecteurs.
25/ Composition comprenant ledit premier et ledit deuxième ADNc comme défini dans n'importe laquelle des revendications 1 à 9. 26/ Composition comprenant un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18.
27/ Vaccin comprenant un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18.
28/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou d'un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18 pour l'analyse de la fonction virale.
29/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou d'un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18 comme un système de production de polypeptides recombinants dans les cellules hôtes.
30/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 pour la préparation de vaccins. 31/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou d'un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18 comme vecteur pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention de maladie par thérapie génique.
32/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou d'un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18 comme vecteur pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des cancers.
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