FR2841258A1 - Procede et preparation de mononegavirus recombinants et leurs applications - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de préparation, de construction et/ ou de génération de Mononegavirus recombinants dans un hôte cellulaire capables de se disséminer, ainsi qu'une méthode de production de peptides recombinants mettant en oeuvre de tels Mononegavirus recombinants. L'invention comprend également des compositions d'ADNc, des cellules hôtes ou des kits comprenant les éléments nécessaires à cette construction. L'invention est aussi relative à des compositions pharmaceutiques, notamment vaccinales, comprenant de tels Mononegavirus recombinants et l'utilisation de ces Mononegavirus recombinants comme vecteur pour la thérapie génique.

Description

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La présente invention se rapporte à une méthode de préparation, de construction et/ou de génération de Mononegavirus recombinants dans un hôte cellulaire capables de se disséminer, ainsi qu'une méthode de production de peptides recombinants mettant en oeuvre de tels Mononegavirus recombinants. L'invention comprend également des compositions d'ADNc, des cellules hôtes ou des kits comprenant les éléments nécessaires à cette construction. L'invention est aussi relative à des compositions pharmaceutiques, notamment vaccinales, comprenant de tels Mononegavirus recombinants, et l'utilisation de ces Mononegavirus recombinants comme vecteur pour la thérapie génique.

Les virus à ARN sont classés en trois groupes, les virus à ARN double brin, les virus à ARN de polarité positive et les virus à ARN de polarité négative.

Le groupe des virus à ARN double brin comprend les reovirus, les rotavus, les phytoreovirus, etc.. Ils ont un génome à ARN double brin multi-filamenteux segmenté.

Les virus à ARN positif comprennent les poliovirus, le virus Sindbis, le virus Semliki forest , et le virus japonais de l'encéphalite B ; ils possèdent un génome ARN simple brin de sens positif. L'ARN du génome peut fonctionner ainsi comme un ARNm et est capable de produire les protéines nécessaires pour la réplication de l'ARN et pour la formation de particules selon les fonctions de traduction des cellules hôtes. En d'autres termes, l'ARN du génome, lui-même de virus à ARN brin positif est infectieux.

D'autre part, les virus adéno-associés, classifiés dans la famille des parvovirus, ont la capacité d'infectivité mais pas la capacité de dissémination (l'infection mixte des adénovirus est nécessaire à la formation de particules virales).

De plus, l'ARN simple brin positif issu du virus Sindbis qui est transcrit artificiellement in vitro est capable d'infection, c'est-à-dire de former des particules virales lorsqu'il est transfecté dans des cellules. Par opposition, non seulement le brin négatif mais aussi le brin positif de l'ARN viral de Sendaï transcrit artificiellement in vitro n'est pas infectieux, c'est-à-dire ne forme pas de particules virales infectieuses lorsqu'il est transfecté dans des cellules.

Récemment, des vecteurs viraux ont été utilisés comme véhicule de thérapie génique. Afin de les utiliser comme vecteurs de thérapie génique, il est nécessaire d'établir des techniques de reconstitution de particules virales, c'est-à-dire la formation artificielle du génome viral et la production de virus recombinant in vitro ou de manière intracellulaire. En effet, pour transférer des gènes étrangers dans de tels vecteurs viraux, il est nécessaire de reconstituer les particules virales avec des gènes étrangers

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introduits par manipulation génétique dans le génome du virus. Dès lors que les techniques de reconstitution virale sont établies, il devient possible de produire des virus avec le transgène désiré introduit ou avec les gènes cibles supprimés ou inactivés.

La reconstitution de virus à ADN possédant de l'ADN comme acide nucléique génomique est connue. Elle peut être réalisée en introduisant le génome purifié luimême, comme par exemple pour SV40, dans des cellules de singe (J. Exp. Cell Res., 43 :415-425, 1983). La reconstitution de virus à ARN contenant un génome ARN a d'abord été effectuée pour un virus à ARN à brin positif, étant donné que l'ARN génomique fonctionne également comme ARNm. Par exemple, dans le cas du poliovirus, la capacité de dissémination de l'ARN génomique purifié avait déjà été démontrée en 1959 (Journal of Experimental Medicine, 110 :65-89, 1959). Puis, la reconstitution du virus Semliki forest (SFV) par l'introduction d'ADN complémentaire (ADNc) cloné dans les cellules hôtes en utilisant l'ARN-polymérase ADN-dépendante des cellules hôtes a été démontrée (Journal of Virology, 65 :4107- 4113, 1991).

Ainsi, en utilisant ces techniques de reconstitution virale, des vecteurs de thérapie génique ont été développés (Bio/Technology, 11:916-920, 1993 ; Nucleic Acids Research, 23 :1495-1501, 1995 ; Human Gene Therapy, 6:1161-1167, 1995 ; Methods in Cell Biology, 43:43-53, 1994 ; Methods in Cell Biology, 43 :55-78, 1994).

Le virus Sendaï (SeV) est également nommé hemagglutinating virus of Japan (VHJ) , et est classifié comme un virus parainfluenza de type I murin, appartenant à la famille des Paramyxoviridae et à la super famille des Mononegavirales (Mononegavirus).

Les particules de virus Sendaï sont des virus enveloppés pléomorphiques de 150-200 nm de diamètre et possèdent un génome à ARN de polarité négative non segmenté, supérieur à 15 Kb.

Historiquement, le virus Sendaï a été considéré comme un virus à fort potentiel industriel, en étant largement utilisé, particulièrement pour la production d'hétérokaryons et de cellules hybrides, du fait de sa capacité de fusion cellule-virus.

De plus, le virus Sendaï est aussi utilisé comme inducteur de nombreux interférons.

Toutefois, comme il est décrit ci-dessus, malgré les nombreux avantages que présente le virus Sendaï en tant que virus utile dans le domaine industriel, ce n'est que tout récemment qu'une méthode pour reconstituer des virions infectieux a été établie, principalement à cause de son génome à ARN de polarité négative. Ces méthodes

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développées sont toutefois très laborieuses et ne facilitent pas la manipulation du génome.

Il a été clairement démontré qu'une simple introduction d'un ARN d'un virus à ARN de polarité négative ou son ARN complémentaire (ARNc) dans des cellules hôtes ne permet pas la génération de virus à ARN de polarité négative. Ce qui est tout à fait différent dans le cas de virus à ARN de polarité positive. Des systèmes de reconstitution de virus à ARN de polarité négative ont été présentés pour le virus influenza (Annu. Rev. Microbiol., 47:765-790, 1993 ; Curr. Opin. Genet. Dev., 2:77-81, 1992). Le virus influenza est un virus ARN de polarité négative ayant un génome segmenté en huit. Dans ces articles, un gène étranger a d'abord été introduit dans l'ADNc de l'un desdits segments du génome, puis l'ARN transcrit à partir d'un ADNc de l'ensemble des huit segments a été assemblé avec la protéine NP du virus pour former des RNPs ( RNP pour RiboNucléoProtéine). Ensuite, la reconstitution virale est effectuée en utilisant dans des cellules hôtes ces RNPs et une ARN-polymérase ARNdépendante. Plus récemment, la reconstitution d'un virus à ARN simple brin de polarité négative à partir d'un ADNc a été mise au point pour des virus rabiques appartenant à la famille des Rhabdovirus (J. Virol., 68:713-719, 1994).

Contrairement aux virus à ARN positif, ni les génomes (-) ni les antigénomes (+) des virus à ARN simple brin de polarité négative ne sont infectieux, car aucune de ces matrices ne peut être utilisée comme ARNm pour exprimer les éléments essentiels du mécanisme de réplication (à savoir les protéines N, P et L). L'approche utilisée pour résoudre ce problème a été basée sur la capacité d'expression dans le cytoplasme de cellules de mammifères de l'ARN-polymérase du bactériophage T7 en utilisant le virus recombinant de la vaccine (vTF-7).

Ce moyen très efficace pour exprimer transitoirement des clones d'ADNc dans des cellules de mammifères consiste à placer les clones sous le contrôle du promoteur ARN-polymérase T7 et de transfecter ces ADNs (généralement sous forme de plasmides) dans des cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine qui exprime l'ARN-polymérase T7. La vaccine en outre de fournir la polymérase, se réplique également et par là même amplifie les plasmides et les recombine à haute fréquence si ils contiennent des homologies.

Un clone d'ADNc représentant la totalité (dénommé ci-après ADNc full length ) du génome d'un Mononegavirus (virus appartenant à la super famille des Mononegavirales) d'environ 15 Kb peut être cloné en aval d'un promoteur T7 (dans des plasmides tels que pBluescript ou pGEM). Les nucléotides supplémentaires non

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viraux sont ensuite perdus au cours de l'amplification subséquente du génome. L'extrémité 3' de la transcription du génome est précisément définie par le positionnement du ribozyme du virus hépatique delta (VHD) en aval de l'insertion (Pattnaik et al., Cell, 69 :1011-20, 1992). Les protéines virales agissant en trans ( trans-acting ) fondamentales (N, P et L) sont fournies via les plasmides T7 cotransfectées dans la cellule infectée par vTF-7 et contenant un clone de l'ADNc full length du génome (Pattnaik et al., 1992 ; Cakaub et al., Virology, 191:62-71, 1992). Les virus infectieux peuvent ensuite être récupérés soit après plaquage à partir des extraits de cellules transfectées sur des lignées cellulaires, ou comme dans le cas de SeV, après inoculation de cellules transfectées dans la cavité amniotique d'oeufs embryonnaires de poules (Garcin et al., EMBO J., 14 :6087-94, La demande de brevet EP 0 702 085 divulgue un tel processus de préparation de virus infectieux réplicatifs à ARN non segmenté de polarité négative comprenant les étapes d'introduction dans une cellule hôte exprimant une ARN-polymérase de molécules d'ADN codant les protéines N, P et L du virus, ou leurs analogues et une molécule ADN comprenant l'ADNc génomique non segmenté du virus à ARN de polarité négative.

Garcin et al. (EMBO J., 14 (24):6087-6094, 1995) décrivent également un virus Sendaï d'ADNc full length transfecté avec des plasmides pGEM exprimant la protéine nucléocapside (N), la phosphoprotéine (P) et les grandes protéines (L) dans des cellules infectées par un virus de la vaccine exprimant l'ARN-polymérase T7.

Dans la publication J. Virol., 72 (7):5984-5993, 1998, les virus Sendaï recombinants sont préparés de sorte que leurs protéines C' et/ou C ne puissent s'exprimer à cause d'une mutation de leurs codons start respectifs. Un des ADNc du virus Sendaï utilisé dans cet article contient une délétion d'une partie des gènes N et P, correspondant approximativement à 2,4 kb de l'ADNc entier supérieur à 15 kb du virus Sendaï, c'est-à-dire que la délétion représente 16 % du génome. Cette délétion a été introduite dans l'ADNc full length pour éviter la génération d'un virus Sendaï recombinant par recombinaison entre les plasmides support N et P avec l'ADNc full length délété.

Une méthode de régénération des particules du virus Sendaï, en transfectant le génome du virus Sendaï chez un hôte exprimant tous les gènes pour la réplication virale initiale, a été décrite dans la demande de brevet WO 97/16539.

La demande de brevet WO 00/70070 décrit des particules virales défectueuses en F et/ou HN générées en utilisant un ADNc génomique du virus Sendaï présentant

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une délétion du gène F et/ou du gène HN. Les particules virales défectueuses en F et/ou HN ont été récupérées dans des cellules helper exprimant F et HN.

Dans la publication J. Virol., 74 (14):6564-6569, 2000, les ribonucléoprotéines (RNPs) fonctionnelles ont été extraites de SeV cloné à partir d'ADNc délété du gène F (protéine d'enveloppe de fusion), en présence de plasmides exprimant la protéine de la nucléocapside et l'ARN-polymérase viral. Ces RNPs ont été transfectées dans des cellules amenées à exprimer la protéine F. Ce vecteur défectueux s'est spécifiquement amplifié dans une lignée cellulaire exprimant la protéine F de façon trypsinedépendante mais ne s'est pas amplifié dans les cellules n'exprimant pas F. Ce vecteur est infectieux et exprime un gène rapporteur, la GFP ( Green Fluorescent Protein ).

Toutefois, dans toutes ces approches, la manipulation génétique du virus Sendaï recombinant est restée techniquement laborieuse étant donné qu'elle était basée sur l'ADNc génomique total ou pratiquement total.

Le problème technique majeur dans cette approche est la génération et la maintenance de la stabilité du clone ADNc génomique supérieur à 15 Kb, sans compter la taille pour le plasmide ou vecteur lui même, dans des lignées cellulaires bactériennes. Ce problème devient d'autant plus complexe lorsque l'objectif est d'introduire des transgènes étrangers dans le clone d'ADNc dans le but de les exprimer via des virus recombinants. La stabilité génétique est cruciale pour une production virale efficace en raison en grande partie de la règle de six (Calain et Roux, Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, p.4822-4830, 1993) qui établit que pratiquement tous les génomes de Mononegavirus sont efficacement amplifiés seulement si la longueur du génome est un multiple de six.

Le but de la présente invention est d'établir un système efficace pour reconstituer un Mononegavirus, de préférence pour un virus de la famille des Paramyxoviridae, notamment de la sous-famille des Paramyxovirinae tel que le virus Sendaï, permettant la manipulation génétique de tel Mononegavirus reconstitué, et procurant des vecteurs viraux recombinants, utiles par exemple dans le domaine de la thérapie génique ou comme vaccins.

Les présents inventeurs ont de façon surprenante établi que ce problème peut dans une large mesure être résolu en découpant le génome en deux parties se chevauchant qui peuvent ensuite être rassemblées dans la cellule infectée par le virus de la vaccine par recombinaison homologue.

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Les principaux avantages de cette méthode par rapport aux approches précédentes, dans lesquelles les clones d'ADNc génomiques full length ou pratiquement full length étaient introduits dans les cellules hôtes, sont doubles : - les plus petits plasmides manipulés sont ainsi plus stables, et - leur plus petite taille permet d'obtenir des sites de restriction d'endonucléase unique, c'est-à-dire présents en un seul endroit sur chaque plasmide, ce qui facilite la manipulation génétique de ces ADNs.

Par conséquent, la présente invention concerne une méthode de construction, de préparation ou de génération de Mononegavirus recombinants, de préférence pour un virus de la famille des Paramyxoviridae, notamment le virus Sendaï, comprenant les étapes suivantes : (i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue : - du gène N et/ou P et/ou L exprimé (s) ladite cellule hôte avec ledit premier ADNc, et/ou, - dudit premier ADNc avec un deuxième ADNc, le cas échéant avec plusieurs autres ADNc, contenu dans ladite cellule hôte, ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc et ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.

De manière préférée et afin de permettre la recombinaison homologue à l'étape (ii) de la méthode selon la présente invention, ladite cellule hôte est capable d'exercer une activité de type recombinase. Cette activité pourra être une activité constitutive de ladite cellule hôte, telle que celle que l'ont peut observer dans les lymphocytes B ou T, ou pourra, de préférence, résulter de l'expression d'un gène hétérologue codant pour un protéine à activité recombinase, telle que par exemple l'activité recombinase apportée par l'intermédiaire du virus de la vaccine utilisé dans un mode de réalisation

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préféré pour exprimer l'ARN polymérase de ladite cellule hôte à l'étape (i) de la méthode selon l'invention (voir ci-après).

Par capacité de dissémination pour un virus, on entendra désigner un virus possédant à la fois la capacité d'infecter une cellule et celle de se répliquer à l'intérieur de cette cellule et, de préférence, donnant lieu à des progéniteurs réplicatifs.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants comprend les étapes suivantes : (i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue du gène N et/ou P et/ou L exprimé (s) parladite cellule hôte avec ledit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.

Dans un mode de réalisation également préféré de l'invention, la méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants comprend les étapes suivantes : (i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue : - dudit premier ADNc avec un deuxième ADNc contenu dans ladite cellule hôte, ledit deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc et ledit deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.

Si, dans les méthodes de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants selon la présente invention, ledit deuxième ADNc et, le

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cas échéant, lesdits autres ADNc, peut ou peuvent être introduit(s) dans ladite cellule hôte préalablement ou postérieurement à l'introduction dudit premier ADNc, dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, est (sont) introduit(s) dans la cellule hôte simultanément à l'introduction dudit premier ADNc.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule hôte exprimant les gènes N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, est une cellule hôte comprenant des vecteurs permettant l'expression desdites protéines N, P et L et de ladite ARN-polymérase.

En accord avec la présente invention, les Mononegavirus (virus appartenant à la super famille des Mononegavirales) sont définis comme des virus à enveloppe dont le génome est composé d'ARN simple brin de polarité négative, c'est-à-dire dont la transcription ne résulte pas en ARNm capable d'être traduit en protéine. Ils incluent les familles virales Paramyxoviridae , Rhabdoviridae et Filoviridae . Cette classification est dérivée du Comité International sur la Taxonomie des Virus (ICTV), et figure dans le livre Virus Taxonomie : The Classification and Nomenclature of Viruses. The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (book). M.H.V. van Regenmortel, C.M. Fauquet, D. H.L. Bishop, E.B. Carstens, M.K.

Estes, S.M. Lemon, J. Maniloff, M. A. Mayo, D. J. McGeoch, C. R. Pringle, R. B. Wickner (2000). Virus Taxonomy, Vllth report of the ICTV. Academic Press, SanDiego, 1167pp .

Les Paramyxoviridae comprennent le virus Sendaï (SeV), le virus parainfluenza humain types 1,2, 3,4A, 4b (PIV1, 2,3, 4A/B), le virus parainfluenza bovin type 3, le virus de la rougeole, le virus des oreillons, le virus syncytial respiratoire humain et bovin (VRS), le virus rinderpest , le virus de la maladie de Carré du chien, le virus Nipah, le virus Hendra, le virus de la maladie de Newcastle, le virus simien 5, le virus simien 41, le morbillivirus du dauphin, le virus de la peste des petits ruminants, le virus de la maladie de Carré phocine , le virus murin de la pneumonie, le virus de la rhinotrachéite de l'oie, le métapneumovirus humain.

Les ADNcs codant pour le génome des Mononegavirus sont déjà décrits dans l'art antérieur ; plus particulièrement, les ADNcs codant pour le virus Sendaï, le virus de la rougeole, le virus des oreillons, le virus rinderpest , le virus de la maladie de Newcastle, le virus de la maladie de Carré du chien, le virus Nipah, le virus parainfluenza humain types 2 et 3, le virus parainfluenza bovin type 3, le virus syncytial respiratoire humain et bovin (VRS) sont décrits dans la littérature.

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Les ADNcs du virus Sendaï utilisés dans la présente invention peuvent être dérivés de souches virales, telles que par exemple les souches Z ou Fushimi. Les génomes des particules défectives et interférentes (appelés génome DI - particules virales contentant un gémome virale délété qui a besoin d'un virus natif pour sa dissémination et dont la réplication interfère avec la réplication du virus native) ou les minigénomes du virus Sendaï (réf. : Defective interfering particle in EMBO J., 10:3079- 3085, 1991) peuvent également être utilisés. De préférence, les ADNcs utilisés correspondent aux clones FL4 ou FL3. Ces derniers correspondent à un clone ADNc full length (c'est-à-dire codant pour le génome entier) de la souche Z du virus Sendaï qui a été inséré dans un vecteur plasmide pBluescript sous le contrôle du promoteur T7, et desquels des virus infectieux et disséminatifs ont été isolés. Ils contiennent les trois nucléotides G supplémentaires à l'extrémité 5' et le ribozyme VHD, tel que défini ci-dessus.

Pour l'expression de l'ARN-polymérase, on utilise de préférence comme vecteur le virus recombinant de la vaccine exprimant l'ARN-polymérase T7. L'infection par le virus de la vaccine permet d'obtenir des taux élevés de recombinaison entre les plasmides car les ADNcs double brin sont répliqués par le mécanisme de réplication viral. Une source alternative de polymérase T7 correspond aux lignées qui expriment cette enzyme de façon stable (intégré dans l'ADN chromosomal des cellules).

Les protéines N (également connue sous la dénomination NP), P et L des Mononegavirus exprimées dans l'hôte à l'étape (i) de la méthode selon l'invention sont exprimées en utilisant des plasmides helper, tels que ceux décrits dans Curran et al., EMBO J., 10 :3079-3085, 1991. Généralement, l'ADNc cloné est positionné en aval du promoteur T7 dans des plasmides tels que pGEM ou pBluescript.

Dans un mode de réalisation préféré, ledit premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome d'un Mononegavirus est préparé à partir du clone FL4 full length, lorsqu'il s'agit du virus Sendaï. La délétion est effectuée en utilisant les sites de restriction enzymatiques adéquats à l'intérieur dudit ADNc cloné (ex : Spel ; voir cidessous).

Dans une forme particulièrement appréciée de l'invention, ledit premier ADNc comprend de 25 % à 80 %, et de préférence de 40 % à 70 % du génome dudit Mononegavirus.

Dans un mode de réalisation préféré, ledit premier ADNc comprend une délétion dans le gène L codant pour la grande protéine ( L pour Large protein).

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Le gène L représente, par exemple dans le clone FL4, approximativement la moitié du génome entier. Cette séquence est en fait dupliquée dans la cellule hôte, puisqu'elle est également présente dans le vecteur utilisé pour exprimer la protéine L de la polymérase virale. Une grande portion interne du gène L peut ainsi être délétée de FL4, une délétion qui sera par la suite réparée dans la cellule transfectée par recombinaison homologue (double cross-over) avec le vecteur utilisé pour exprimer la protéine L (voir figure 1 B). A l'intérieur du clone SeV-FL4, ceci peut être effectué en retirant un fragment de restriction Spel de 4 759 nucléotides (position 9 368 à 14 127) du corps du gène L, réduisant ainsi de presqu'un tiers la taille du clone infectieux.

Une seconde approche de délétion à l'intérieur du clone FL4 peut consister à supprimer un ou plusieurs gènes. Par exemple, on pourra utiliser ledit deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc, et comprenant en outre au moins une région homologue dudit ADNc premier. Cela est effectué par la suppression dans ledit premier ADNc d'une portion du génome comprenant un ou plusieurs gènes.

Le génome est par la suite complété intracellulairement dans les cellules hôtes infectées par exemple par la vaccine en procurant un ou plusieurs plasmides helper (correspondant audit deuxième ADNc et, le cas échéant, auxdits autres ADNc) contenant au total la région délétée et pour chacun d'entre eux les séquences flanquantes permettant ainsi une recombinaison à l'intérieur du génome.

Dans une forme de réalisation encore plus particulièrement préférée de l'invention, le génome dudit Mononegavirus est divisé en deux plasmides (correspondant audit premier et audit deuxième ADNc de la méthode selon l'invention), un premier plasmide codant pour la moitié 3' du génome et un deuxième plasmide codant pour la moitié 5' du génome (ou inversement), comprenant chacun la région centrale du génome de manière à permettre la recombinaison homologue (voir exemple figure 1A).

Ainsi, il apparaît que le premier et, le cas échéant, le deuxième ADNc et/ou, le cas échéant, lesdits autres ADNc utilisés dans la méthode de l'invention sont des clones de plasmide bien plus petits que ceux de l'art antérieur et qu'ainsi, ils peuvent être manipulés plus facilement, tout en étant plus stables.

En accord avec l'invention, le terme stable réfère à la stabilité génétique des clones ADNc pendant l'amplification dans une bactérie telle que la bactérie E. Coli.

C'est une étape obligatoire pendant la procédure de manipulation et de clonage.

Toutefois, les grands ADNc dans les plasmides tendent à être faiblement tolérés dans

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une bactérie telle que E. Coli, et ceci crée des conditions dans lesquelles les délétions ou les réarrangements de l'ADNc peuvent être sélectionnés pendant la croissance bactérienne. De tels problèmes sont rencontrés régulièrement au cours de la manipulation du clone ADNc full length du virus Sendaï.

Le premier et, le cas échéant, le deuxième ADNc et, le cas échéant, lesdits autres ADNc utilisés dans la méthode de l'invention, simplement à cause de leur plus petite taille, porteront un plus petit nombre de sites de restriction mais surtout plus de sites de restriction uniques comparativement aux plasmides utilisés dans l'art antérieur. Il est extrêmement avantageux d'introduire des sites de restriction enzymatiques uniques flanquant chaque région intergénique des gènes puisque : (a) cela facilite la manipulation génétique de chaque gène du virus étant donné que ces gènes peuvent être séparés en sous-clones ou en cassettes génétiques, par exemple pour l'introduction de mutations à l'intérieur d'un gène défini ; (b) cela facilite la substitution des gènes par exemple le remplacement des gènes d'un Mononegavirus, tels que les gènes F/HN du virus Sendaï, par ceux d'un autre Mononegavirus ; (c) cela facilite l'insertion de transgène entre n'importe quel gène. Ce dernier point offre la possibilité du dosage de l'expression du transgène puisque son expression augmentera s'il est placé au plus près de l'extrémité 3', conséquemment au gradient transcriptionnel viral. Ceci permet une manipulation facile de l'ADNc cloné.

Une recombinaison homologue peut être définie comme une recombinaison requérant un simple cross-over ou un double cross-over. Une recombinaison requérant un simple cross-over se présente lorsque deux segments sont contigus, un représentant l'extrémité génomique 3', et le second l'extrémité génomique 5' (voir figure 1A).

Toutefois, lorsqu'une large délétion est effectuée à l'intérieur du clone génomique full length générant ce qui est en réalité un génome défectueux, il ne peut pas lui-même engendrer une lignée disséminative infectieuse car il est incapable d'exprimer de(s) protéine(s) essentielle(s), la récupération de virus infectieux non défectueux (dans lequel cette défectuosité a été corrigée) requiert un événement double cross-over. L'information supprimée doit être apportée au moins par un deuxième plasmide (segment 1, voir figure 1 B) dont les extrémités chevauchent et sont homogènes avec le site de suppression. Ceci permet de réparer les défectuosités par un événement de double cross-over par recombinaison homologue (figure 1 B).

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Selon l'invention, lorsqu'une recombinaison adéquate se produit, les Mononegavirus, notamment les Paramyxoviridae tels que le SeV, recombinants préservent leur capacité de dissémination, c'est-à-dire ils amplifient leur génome dans la cellule transfectée et libèrent des virus infectieux dans le milieu extra cellulaire de la cellule. Ces virus sont génétiquement stables et peuvent être soumis à des passages pour préparer des stocks viraux.

La récolte des Mononegavirus recombinants qui en résultent, qui détiennent la capacité de dissémination, peut être effectuée par passages répétés du milieu cellulaire dans des lignées de culture cellulaire, ou par infection de la cavité allantoïque des oeufs de poules embryonnés.

Dans un mode de réalisation également préféré, la méthode de construction, de préparation ou de génération de Mononegavirus recombinants selon l'invention est caractérisée en ce que ledit premier et/ou deuxième ADNc et/ou, le cas échéant, l'un desdits autres ADNc comprend au moins un site unique de restriction d'enzymes.

En accord avec les méthodes de l'invention, ledit premier ou deuxième ADNc ou, le cas échéant, l'un desdits autres ADNc comprend au moins une séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue audit Mononegavirus.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'ADN exogène est flanquée par un signal d'arrêt et de marche de transcription fonctionnels spécifiques dudit Mononegavirus.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'ADN exogène est monocistronique, bicistronique ou polycistronique et que les cistrons sont séparés par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm monocistronique, bicistronique ou polycistronique codant pour une ou plusieurs protéines hétérologues.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est positionnée dans une région 3' non traduite d'un gène dudit Mononegavirus ou à l'intérieur des régions leader et/ou terminale qui contiennent les promoteurs de réplication du génome viral, et est précédée par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm bicistronique ou polycistronique codant la protéine virale et la protéine hétérologue.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est positionnée dans une région 5' non traduite d'un gène dudit Mononegavirus ou à l'intérieur des régions leader et/ou terminale qui contiennent les promoteurs de réplication du génome viral et est suivie par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm bicistronique ou polycistronique codant la protéine virale et la protéine hétérologue.

Les molécules d'ADNc premier et/ou deuxième (respectivement premier et deuxième ADNc) et/ou, le cas échéant, l'un desdits autres ADNc, peuvent porter une séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue capable d'être exprimé dans des cellules hôtes.

Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation de Mononegavirus recombinants obtenus par une méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants selon l'invention et dans laquelle méthode ledit premier et/ou ledit deuxième ADNc et/ou, le cas échéant, l'un desdits autres ADNc porte(nt) une séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue capable d'être exprimé dans des cellules hôtes pour la production de protéines recombinantes.

La présente invention comprend également une méthode de production de protéines recombinantes, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes infectées par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants selon l'invention, ledit Mononegavirus comprenant un gène hétérologue codant pour ladite protéine recombinante ; et

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b) la récupération desdites protéines recombinantes exprimées à partir du milieu de culture desdites cellules hôtes et/ou à partir desdites cellules hôtes cultivées.

La présente invention comprend également une méthode de production de protéines recombinantes, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'infection de la cavité allantoïque d'oeufs d'oiseaux, notamment de poules, embryonnés par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode de construction, de préparation ou de génération des Mononegavirus recombinants selon l'invention, ledit Mononegavirus comprenant un gène hétérologue codant pour ladite protéine recombinante ; et b) la récupération desdites protéines recombinantes exprimées à partir du fluide chorio-allantoïque desdits #ufs d'oiseaux à partir desdites cellules hôtes cultivées.

Tout gène hétérologue, également appelé transgène, peut être introduit dans n'importe quel site de n'importe quel ADNc de n'importe quel Mononegavirus recombinant. Les gènes hétérologues, destinés à être introduits, peuvent être exemplifiés, sans pour autant consister en une liste limitative, par des gènes codant pour des composés d'intérêt, tels que notamment des composés présentant ou pouvant présenter une activité thérapeutique ou préventive de maladie tels que par exemple des cytokines, des hormones peptidiques, ou tout peptides qui peuvent être exprimés à l'intérieur d'une cellule hôte. Parmi les gènes hétérologues on préféra les gènes à partir desquels on peut transcrire des molécules d'ARN avec une activité biologique intrinsèque, telle qu'une ribozyme. Parmi ces gènes hétérologues, on préférera également les gènes codant pour un peptide, polypeptide ou une protéine (termes indifféremment employées ici) qui lorsqu'il est exprimé ou administré chez l'homme ou chez un animal, produit un effet thérapeutique ou une immunité protectrice, par exemple contre un organisme pathogène ou une maladie associée avec la présence d'un antigène ou causée par cet antigène. Si plus d'un antigène hétérologue, ou un de leurs épitopes d'intérêt, est codé par les séquences d'acide nucléique exogène, ils peuvent être des antigènes ou des épitopes provenant d'un seul agent pathogène ou des antigènes ou des épitopes provenant de différents agents pathogènes. Dans un des modes de réalisation préférés, un tel agent pathogène est un micro-organisme pathogène. Par exemple, un antigène hétérologue, ou un de ses épitopes, peut provenir de bactéries, parasites, virus ou de champignons qui sont des agents causals de maladies ou de troubles. Des épitopes d'allergènes, de spermatozoïdes ou de cellules cancéreuses peuvent être également utilisés. Dans un

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autre mode de réalisation préféré de l'invention, un antigène spécifique de tumeur (dénommé TAA pour Tumor associated Antigen) peut être exprimé en tant que protéine hétérologue recombinante pour l'induction d'une réponse immunitaire protectrice ou thérapeutique contre le cancer. N'importe quelle séquence codant pour un TAA peut être introduite dans les Mononegavirus recombinants de l'invention. Le TAA en entier, sans que cela soit nécessaire, peut être introduit. Une portion du TAA, par exemple, un épitope et particulièrement un épitope reconnu par un lymphocyte T :ytotoxique ( CTL ) ou par un autre composant du système immunitaire et ayant des capacités prophylactiques ou thérapeutiques, peut être également introduit. Des TAA (ou fragments contenant des épitopes de TAA) pouvant être introduits dans des Mononegavirus recombinants de l'invention incluent, sans que ce soit limitatif, les MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, antigène MAA mélanome-associé de poids moléculaire élevé, GD2, antigène carcinoembryonnaire (CEA), TAG-72, antigènes OV-TL3 et MOV18 ovaires-associés, TUAN, alpha-foeto protéine (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, antigène G250 associé à la tumeur rénale, EGP-40 (également connu sous le nom de EpCAM), S100 (antigène associé au mélanome malin), p53, antigène associé à la tumeur de la prostate (par exemple, PSA et PSMA), et p21ras.

Les séquences de gènes codant une protéine hétérologue destinée à être exprimée par le Mononegavirus recombinant selon l'invention, peuvent être obtenues par des techniques connues dans l'art antérieur, telles que par exemple et sans que ce soit limitatif, les synthèses chimiques et enzymatiques, la purification à partir de l'ADN génomique de micro-organismes, par purification ou isolement à partir d'ADNc codant pour un TAA, par synthèse d'ADNc à partir d'un ARN de micro-organisme, ou par des méthodes d'ADN recombinant.

Lorsqu'une recombinaison simple cross-over a lieu, le transgène peut être nséré soit dans le premier ou le deuxième ADNc représentant la partie 3' ou 5' du génome du Mononegavirus (segment 1 ou 2 de la figure 1A), ou encore soit dans les deux ADNc.

Lorsqu'une recombinaison double cross-over a lieu, le transgène peut être nséré soit dans le génome défectif (correspondant généralement audit premier ADNc) et/ou soit dans le deuxième ADNc et/ou, le cas échéant, dans l'un desdits autres ADNc, si undit deuxième et, le cas échéant, plusieurs autres ADNc sont utilisés.

Afin d'exprimer la protéine désirée, le gène codant pour ladite protéine désirée est inséré. Comme mentionné ci-dessus, il est préférable d'introduire une séquence de

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bases d'un nombre multiple de 6 ; parexemple pour le SeV entre les séquences R1 (5'-AGGGTCAAAGT-3') (SEQ ID N 1) et R2 (5'GTAAGAAAAA-3') (SEQ ID N 2) (Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, p. 4822-4830, 1993). Les insertions de transgènes de séquences nucléotidiques non multiples de six sont possibles. Toutefois, dans ce cas la séquence génomique doit être compensée par l'addition ou la délétion de nucléotides de façon à ce que l'ensemble du génome recombinant soit un multiple de six nucléotides. L'introduction d'acide nucléique hétérologue peut être effectuée selon les techniques standard de la biologie moléculaire, telles que celles décrites dans de nombreux textes de protocoles standard, dont par exemple, Current Protocols in Molecular Biology , (F. M. Ausubel et al., Eds. 1987, and updates). Les exemples fournissent plus d'informations sur la façon dont des insertions particulières ont été effectuées. En utilisant ces lignes directrices, n'importe quelle variété d'acides nucléiques exogènes peut être insérée dans le génome du Mononegavirus.

Le gène hétérologue peut être exprimé, par exemple, selon l'une des deux possibilités, c'est-à-dire : - comme un élément transcriptionnel indépendant : cette approche nécessite une introduction du transgène dans une jonction transcriptionnelle. Le gène doit luimême porter les codons d'initiation et les codons stop nécessaires à l'ARNpolymérase virale ARN-dépendante (ceci a été largement décrit pour beaucoup de Mononegavirus) pour garantir qu'un ARNm correctement polyadenylé en 3' et cappé en 5' soit généré. A cause du gradient transcriptionnel qui existe au sein de cette famille de virus (les gènes situés à l'extrémité 3' du génome sont exprimés à un niveau supérieur de ceux situés vers l'extrémité 5'), le positionnement du transgène dictera également en grande partie son niveau d'expression ; - comme un deuxième cadre ouvert de lecture au sein d'un gène viral préexistant : ceci est effectué en insérant le transgène dans la région 3' ou 5' non traduite (UTR) du gène viral. Le transgène portera un site ribosomal interne en amont ou en aval (IRES- International Ribosomal Entry Site), tel que, par exemple l'IRES de EMCV, Polio ou HCV. Ceci génère effectivement une transcription bicistronique dans laquelle le transgène comprend le premier ou le second cistron.

Les niveaux d'expression d'un gène étranger inséré dans un vecteur peuvent être régulés par les avantages du site d'insertion du gène et les séquences flanquantes du gène étranger.

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Par exemple, dans le cas du virus Sendaï, il est connu qu'il y a des niveaux croissants d'expression du gène introduit en fonction d'une distance décroissante dudit gène par rapport au gène N.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le gène hétérologue souhaité est inséré de façon à ce que les Mononegavirus recombinants selon l'invention retiennent leur capacité disséminative.

Les hôtes préférés pour l'expression des protéines peuvent être n'importe quelles cellules sensibles à l'infection par les Mononegavirus recombinants, telles que par exemple des cellules de mammifères et des oeufs de poule. Il est possible de produire efficacement le produit du gène étranger en infectant ces hôtes avec un Mononegavirus recombinant obtenue par la méthode selon l'invention comprenant un gène hétérologue exprimable et en récupérant le produit du gène étranger exprimé.

Par exemple, les protéines ainsi exprimées peuvent alors être récoltées par une méthode standard à partir du milieu de culture ou de cellules lorsque les hôtes sont des cellules, et à partir du fluide chorio-allantoïque lorsque les hôtes sont des oeufs de poule.

Selon l'invention, un ou plusieurs gènes du génome des Mononegavirus dans la molécule d'ADNc première et/ou seconde peut être muté, c'est-à-dire n'importe quel gène de génome des Mononegavirus peut être délété ou modifié. Les mutations incluent les délétions, modification d'acide(s) nucléique(s) ou addition d'acide(s) nucléique(s).

De même, par exemple, afin d'inactiver des gènes pour l'immunogénicité, ou d'améliorer l'efficacité de la transcription et la réplication de l'ARN, les séquences des gènes liées à la réplication à ARN du Mononegavirus peuvent être modifiées.

Concrètement, notamment pour le SeV, au moins un des facteurs de réplication, les protéines P/C et L peuvent être modifiées pour augmenter ou réduire les capacités de transcription et de réplication. La protéine HN, une des protéines constitutionnelles, a une activité double d'hémagglutinine et de neuraminidase. Par exemple, la modification de cette dernière activité peut permettre la régulation de l'infectivité virale.

De même, la modification de la protéine F, protéine de fusion de la membrane, peut être utile pour améliorer les ribosomes de fusion membranaires construits en fusionnant les Mononegavirus recombinants constitués avec des liposomes artificiels contenant la drogue ou le gène désiré.

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L'invention concerne également les Mononegavirus recombinants, mutés ou non et/ou portant ou non un transgène, obtenu par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention.

L'invention concerne de plus un hôte pour la construction, la préparation ou la génération de Mononegavirus recombinants, comprenant des vecteurs permettant l'expression des protéines NP, P/C et L dudit Mononegavirus et de l'ARN-polymérase, en ce qu'il comprend en outre : - une molécule d'ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène NP et/ou P/C et/ou L, ou, - une première molécule d'ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et, une deuxième molécule d'ADNc, et, le cas échéant, plusieurs autres ADNc, comprenant au moins une partie dudit Mononegavirus non compris dans ladite première molécule d'ADNc, et ledit deuxième ADNc, et, le cas échéant, lesdits autres ADNc, comprenant en outre au moins une région homologue audit premier ADNc.

L'invention concerne également un hôte pour la génération de peptide recombinant codé par un gène hétérologue (dénommée ici encore transgène), comprenant des vecteurs permettant l'expression des protéines NP, P et L de Mononegavirus et de l'ARN-polymérase, caractérisé en ce qu'il contient en outre : - une molécule ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène NP et/ou P et/ou L, dans lequel un transgène est inséré dans ledit ADNc, ou - une première molécule d'ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et un deuxième ADNc, et, le cas échéant, plusieurs autres ADNc, comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc, et ledit deuxième ADNc, et, le cas échéant, lesdits autres ADNc comprenant en outre au moins une région homologue dudit ADNc premier ; un transgène étant introduit dans au moins un desdits ADNcs.

Les hôtes de préférence peuvent être n'importe quelles cellules sensibles à l'infection par les Mononegavirus recombinants, illustrés par des cellules de mammifères ou d'oeufs de poule. Il est possible de produire efficacement des Mononegavirus recombinants ou le produit des gènes étrangers en infectant ces hôtes avec des Mononegavirus recombinants et en récoltant les Mononegavirus recombinants ou le produit exprimé des gènes étrangers. Par exemple, les protéines

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ainsi exprimées peuvent être récoltées par méthode standard à partir du milieu de culture ou de cellules lorsque les hôtes sont des cellules, ou encore à partir du fluide chorio-allantoïque lorsque les hôtes sont des oeufs d'oiseaux, notamment de poule.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le Mononegavirus recombinant est utilisé et récolté par passage à travers les oeufs embryonnés. L'oeuf est un système sensible à une infection virale et produit des interférons de type 1. Les virus portant des mutations sur les gènes neutralisant cette réponse anti-virale, particulièrement le gène C, seront difficiles à récolter par le passage dans les oeufs.

Dans ces cas, les virus recombinants pourront être plaqués sur des lignées cellulaires défectueuses en interféron. Dans ces cas, la charge virale de la vaccine devient un trait important qui peut sérieusement gêner l'isolation du virus infectieux. Ceci peut être réduit par l'utilisation de produit qui inhibe la réplication du virus helper, tel que la cytosine arabinoside, et/ou par la filtration des surnageants de cellules transfectées avant le premier passage. Alternativement, on peut utiliser la souche MVA-T7 de la vaccine qui était adaptée à la croissance dans l'oeuf. Cette souche est moins cytopathique dans la plupart des lignées cellulaires de mammifères. En particulier, il a été trouvé que la croissance de la souche MVA-T7 est particulièrement retardée dans les cellules Hep-2 humaines (pas d'effet cytopathiques ( c.p.e. ) visible avant 6 jours de post infection), ceci suggérant que cela peut être un background dans lequel on peut isoler sélectivement des plaques des Mononegavirus générés pendant la transfection initiale (celles-ci sont généralement visibles en tant que plaques entre le 3ème et le 5ème jour de post infection). En conséquence, la sélection des plaques apparaissant avant le 5ème jour de post infection devrait permettre la récolte sélective des Mononegavirus recombinants. Le passage répété de ces plaques sur les cellules Hep-2 devrait également fournir un moyen d'élimination du virus de la vaccine MVA-T7 puisque ce virus se réplique considérablement moins bien dans ces lignées cellulaires que le Mononégavirus, notamment que le virus Sendaï.

Un milieu de culture, un extrait cellulaire ou un fluide chorio-allantoïque contenant la protéine hétérologue exprimée, obtenue en suivant la méthode de l'invention pour la production d'une protéine hétérologue est un autre des aspects de l'invention.

L'invention est également orientée vers un kit comprenant au moins des vecteurs permettant l'expression des protéines N, P et L d'un Mononegavirus et de l'ARN-polymérase, et :

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# une molécule d'ADNc (correspondant au premier ADNc de la méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'invention) comprenant 80 % au moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène NP et/ou P et/ou L, ou # un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et au moins un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit
Mononegavirus non comprise dans ledit premier ADNc, et ledit au moins deuxième
ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc.

Une composition comprenant un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome d'un Mononegavirus et au moins un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non comprise dans ledit premier ADNc, et ledit au moins deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc dudit Mononegavirus, fait également partie de la présente invention. Ce premier ADNc et deuxième ADNc entrant dans cette composition sont de préférence ceux décrits pour les méthodes préférées de préparation de
Mononegavirus recombinants selon l'invention.

Une telle composition comprenant en outre des ADNc codant, de préférence séparément, pour les protéines N, P et L dudit Mononegavirus et, le cas échéant, pour un ARN polymérase, est particulièrement préférée.

De préférence encore, le kit ou la composition selon l'invention contient des
ADNc premier et/ou deuxième comprenant au moins un site unique de restriction d'enzymes.

De manière également préférée, le kit selon la présente invention peut également comprendre un hôte sensible à l'infection par ledit Mononegavirus, tel que ceux décrits ci-avant.

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition, notamment pharmaceutique, comprenant des Mononegavirus recombinants obtenus par la méthode de l'invention.

Lesdites compositions comprenant les Mononegavirus recombinants de l'invention peuvent inclure un tampon ou un agent stabilisant, qui est sélectionné en accord avec l'utilisation désirée des Mononegavirus ou de la protéine hétérologue que l'on désire exprimée, et peuvent également inclure d'autres substances appropriées à l'utilisation à laquelle ces compositions sont destinées. L'homme de l'art peut facilement sélectionner un tampon approprié ou un agent stabilisateur approprié à l'utilisation désirée, dont une grande variété est connue dans le domaine. Dans

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certains cas, le composé peut comprendre un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, dont une grande variété est connue dans le domaine, et dont il n'est )as nécessaire de parler ici en détail. Les excipients acceptables sur le plan pharmaceutique ont été largement décrits dans de nombreuses publications, dont par exempte, "Remington : The Science and Practice of Pharmacy", 19th Ed. (1995) Mack Publishing Co.

Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées sous de nombreuses formes, telles que les granules, les tablettes, les pilules, les suppositoires, es capsules, les suspensions, les sprays, les applications transdermiques (ex : les )atches, etc. ), les baumes, les lotions et produits du même ordre. Des porteurs et/ou Jes diluants organiques ou inorganiques de qualité pharmaceutique, appropriés pour une utilisation orale et d'actualité peuvent être utilisés pour constituer des composés contenant l'agent actif sur le plan thérapeutique. Les diluants connus dans le domaine ncluent le milieu aqueux, les huiles et les graisses animales ou végétales. Les agents stabilisateurs, agents humidifiants ou émulsifiants, les sels pour varier la pression smotique ou tampons pour garantir un taux de pH adéquat, et des stimulants de pénétration dermique peuvent être utilisés comme agents auxiliaires.

L'invention concerne également les vaccins qui comprennent les mononegavirus recombinants obtenus par la méthode de préparation de l'invention.

Dans ces cas, les Mononegavirus recombinants contiennent un gène hétérologue, tel lue ceux définis ci-dessous. Les vaccins peuvent être utilisés pour le traitement des naladies humaines ou vétérinaires. En général, le vaccin de l'invention est formulé en accord avec les méthodes bien connues dans ce domaine, utilisant le(s) porteur(s) t/ou le(s) véhicule(s) pharmaceutique(s) approprié (s). Une solution isotonique de sel(s) alcalin(s) stérile est un véhicule approprié. D'autres solutions injectables sotoniques stériles aqueuses ou non aqueuses et des suspensions stériles aqueuses )u non aqueuses, connues comme étant des porteurs acceptables sur le plan )harmaceutique et bien connues des experts dans le domaine, pourraient être employées dans ce but.

L'inoculation dans des oeufs d'oiseaux, notamment de poule, de Vlononegavirus recombinants ayant des mutations atténuées, produit des vaccins vivants. Les informations ainsi obtenues peuvent s'appliquer à des virus à brin négatif ayant une demande élevée de vaccins vivants, tels que le virus de la rougeole et le virus des oreillons.

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De façon optionnelle, une composition vaccinale de l'invention peut être formulée pour contenir d'autres composants, dont par exemple des adjuvants, des stabilisateurs, des ajusteurs de pH, des conservateurs et autres du même ordre. De tels composants sont bien connus de ceux qui sont experts dans l'art du vaccin. Les adjuvants incluent, sans que ce soit limitatif, des adjuvants salins d'aluminium (Nicklas, Res. Immunol. 143:489-493, 1992) ; des adjuvants de saponine ; des adjuvants Ribi (Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT) ; des adjuvants ISA de Montanide (Seppic, Paris, France) ; adjuvants de Hunter's TiterMax (CytRx Corp., Norcross, GA) ; des adjuvants Gerbu (Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany) ; et de la nitrocellulose (Nilsson and Larsson, Res. Immunol., 143 :553-557, 1992). De plus, d'autres composants pouvant moduler une réponse immunitaire peuvent être inclus dans la composition, dont, sans que ce soit limitatif, des cytokines, telles que les interleukines ; des facteurs stimulateurs de colonies (ex : GM-CSF, CSF, et autres semblables) ; et un facteur de nécrose tumorale.

L'invention présente fournit des méthodes d'induction d'une réponse immunitaire à un antigène comprenant l'administration à un sujet mammifère d'un Mononegavirus recombinant de l'invention contenant un gène hétérologue codant pour ledit antigène donné. Dans une telle méthode d'induction, les Mononegavirus infectent et entrent dans une cellule dudit mammifère, le polypeptide antigénique est libéré, notamment par clivage protéolytique, et une réponse immunitaire contre ledit polypeptide hétérologue est provoquée.

Lorsqu'ils sont utilisés comme vaccins, les Mononegavirus recombinants de la présente invention sont administrés à un individu en utilisant des méthodes connues.

Ils seront généralement administrés par les mêmes voies par lesquelles les vaccins conventionnels (actuellement disponibles) sont administrés et/ou par des voies qui imitent la voie utilisée par le pathogène d'intérêt pour l'infection. Ils peuvent être administrés dans une composition vaccinale qui inclut un porteur physiologiquement acceptable, en plus du Mononegavirus recombinant selon l'invention, de préférence réplication-compétent. La composition peut également inclure un agent immunostimulant ou un adjuvant, un agent de sapidité, ou un stabilisateur.

Les voies d'administration conventionnelles et acceptables sur le plan pharmaceutique incluent les voies intranasale, intramusculaire, intratrachéale, intratumorale, sous-cutanée, intradermique, vaginale, intrapulmonaire, intraveineuse, rectale, orale et autres voies parentérales d'administration. Les voies d'administration peuvent être combinées, si souhaité, ou ajusté selon le peptide antigénique ou la

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maladie. La composition vaccinale peut être administrée en une seule dose ou en doses multiples, et peut inclure l'administration de doses de rappel pour provoquer et/ou maintenir l'immunité.

Le vaccin comprenant les Mononegavirus recombinants selon l'invention comprend une quantité suffisante desdits Mononegavirus recombinants et est administré par une voie d'administration sélectionnée pour provoquer une réponse immunitaire efficace afin de faciliter la protection de l'hôte contre l'infection, ou les symptômes associés à l'infection, provoqués par l'organisme pathogène, ou encore pour provoquer une réaction immunitaire efficace contre une tumeur associée à un antigène, pathogène ou tumeur contre lequel le vaccin est dirigé., Par quantité suffisante desdits Mononegavirus recombinants , on entend désigné une quantité pour une voie d'administration donnée permettant de provoquer une réponse immunitaire destinée à réduire ou inhiber la croissance dudit pathogène ou des cellules tumorales, notamment quand il s'agit de tumeur pour réduire la masse cellulaire tumorale ou le nombre de cellules tumorales, ou réduire la probabilité qu'une tumeur se forme.

Le nombre de Mononegavirus recombinants dans chaque dose de vaccin est sélectionné comme étant un nombre qui induit une réponse immuno-protectrice ou autre réponse immunothérapeutique, sans effets secondaires significatifs généralement associés aux vaccins types. Un tel nombre variera selon l'immunogène spécifique employé, selon que la composition du vaccin contient ou non un adjuvant, et une multitude de facteurs dépendants de l'hôte. Une dose efficace de vaccin de Mononegavirus recombinants sera généralement dans une gamme d'environ 102 à environ 107, d'environ 103 à environ 106, ou d'environ 104 à environ 105 unités de formation de plaque (PFU). Un nombre optimal pour un vaccin particulier peut être confirmé par des études standard impliquant l'observation des titres d'anticorps et autres réponses chez le sujet. Le taux d'immunité procuré par le vaccin peut être monitoré pour déterminer le besoin, s'il y en a un, des rappels. Suivant un contrôle des titres d'anticorps dans le sérum, les immunisations optionnelles de rappel peuvent être souhaitées. La réponse immunitaire à la protéine de cette invention est accrue par l'utilisation d'un adjuvant et ou d'un immunostimulant.

L'invention présente est de plus orientée pour l'utilisation des Mononegavirus recombinants obtenus par la méthode de préparation selon l'invention pour l'analyse de fonction virale. La méthode de l'invention a permis l'introduction de points de mutation et d'insertion sur tout site de l'ADNc génomique, une telle méthode

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permettant d'obtenir plus rapidement que les techniques antérieures des informations génétiques sur les fonctions virales. Par exemple, après avoir élucidé le mécanisme de réplication de l'ARN viral, il sera possible avec une telle méthode de développer un virucide moins dangereux pour une cellule hôte en ciblant le processus de réplication d'acide nucléique en utilisant les différences entre les métabolismes de l'acide nucléique viraux et ceux de l'hôte cellulaire. De plus, l'élucidation des fonctions des protéines virales encodées par des gènes viraux peut contribuer au développement de virucides ciblant les protéines impliquées dans l'infectivité et la formation de particules virales. Concrètement, par exemple, ces techniques peuvent être utilisées pour l'analyse d'épitopes présentateur d'antigènes des protéines F et HN qui peuvent agir comme des molécules antigéniques à la surface de la cellule.

Egalement, lorsque le gène de la cellule hôte pour la résistance virale est activé lors de l'infection virale, entraînant une résistance virale accrue, des informations importantes sur de tels mécanismes d'activation du gène hôte peuvent être obtenues par l'analyse génétique des fonctions virales. Par exemple, il est connu que les Mononegavirus, tels que le virus Sendaï sont efficaces pour l'induction des interférons, et est ainsi utilisé dans plusieurs études de base. En analysant la région du génome nécessaire à l'induction des interférons, il peut être par conséquent possible de produire un inducteur d'interféron non viral.

Comme il est décrit ci-dessus, les Mononegavirus recombinants de la présente invention peuvent également être utilisés pour la production de polypeptides hétérologues dans des cellules hôtes, telles que des cellules de mammifères, particulièrement humaines, ou autres types de cellules. La protéine hétérologue ainsi produite peut être isolée en utilisant les méthodes standard de purification bien connues de l'homme de l'art.

Les Mononegavirus recombinants porteurs d'un transgène obtenu par la méthode de l'invention peuvent être utilisés dans les vaccins, comme démontré cidessus.

De plus, la présente invention est également liée à l'utilisation des Mononegavirus obtenus par la méthode de l'invention comme vecteurs de thérapie génique.

Lesdits Mononegavirus recombinants porteurs d'un transgène selon l'invention en tant que vecteurs de thérapie génique peuvent être particulièrement utiles lorsque la suppression d'une réplication d'un vecteur viral pour la thérapie génique devient nécessaire à l'accomplissement de la thérapie ou pendant la thérapie, dans la mesure

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où il suffit d'administrer seulement un inhibiteur d'ARN-polymérase ARN-dépendant pour supprimer spécifiquement la réplication du vecteur viral sans endommager les hôtes cellulaires.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées.

Les exemples suivants ont été choisis pour fournir à l'Homme de l'art une description complète afin de pouvoir réaliser et utiliser la présente invention. Ces exemples ne sont pas destinés à limiter la portée de ce que les inventeurs considèrent comme leur invention, ni destinées à montrer que seules les expériences ci-après ont été effectuées.

Légende des figures
Figures 1A et 1 B : Représentations schématiques d'une recombinaison requérant un événement cross-over simple (figure 1A) ou un événement cross-over double (figure 1 B).

Figure 1A : Recombinaison homologue requérant un événement cross-over simple
La recombinaison requérant un événement cross-over simple survient lorsque deux segments (1 et 2) sont contigus et présentent une partie commune, l'un représentant l'extrémité génomique 3' et le second l'extrémité génomique 5'.

Figure 1 B : homologue requérant un événement cross-over double
Lorsqu'une importante suppression est faite à l'intérieur du clone génomique full length générant un génome défectueux (segment 2), et lorsque cette défection est réparée par recombinaison avec le segment correspondant à la région du génome qui a été enlevée du génome défectueux (segment 1), segment comprenant en outre les séquences homologues flanquantes requises pour la recombinaison, un événement cross-over double survient.

La figure 2 est une représentation schématique d'un clone génomique full length de SeV. La suppression du fragment du gène L est représentée.

La figure 3 montre la construction FL4 HN Mlu ASpel portant un nouveau signal start/stop dérivé de la frontière entre les gènesdu gène N et P, et un site unique Mlul d'insertion de transgène (construction FL4 HN Mlu ASpel).

Figure 4 : schématique des étapes de construction d'un premier virus de Sendaï recombinant full length (rSev) dans lequel un gène hétérologue est inséré.

Figure 5 : protéique des rSeV produits en oeufs embryonnés.

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Des oeufs embryonnés de poules ont été infectés aux jours 9-10 après fécondation, par les rSeV du stock 1. Au jour 12 après la fécondation, le liquide allantoïque de chaque oeuf a été récolté et analysé par un gel SDS- PAGE coloré au bleu colloïdal.

Piste 1 :SeV wt
Piste 2 : rSeV/mTRP2
Piste 3 : rSeV/spG140-210
Piste 4 : rSeV/spG130-210
Piste 5 :rSeV/spG 130-200 Piste 6: rSeV/spG 140-200
Figure 6 : RT-PCR une étape ( one step ) sur les extraits d'ARN viraux des rSeV/spG130-200, rSeV/spG130-210, rSeV/spG140-200, rSev/spG140-210 avec les amorces SeVMlul-3' et SeVMlul-5' et rSeV/mTRP2 avec les amorces mTRP2-5'. 1 et mTRP2-3'.

Piste 1 :spG130-200
Piste 2 :spG130-210
Piste 3 spG140-200
Piste 4 spG140-210
Piste 5 : mTRP2 Figure 7 : schématique du principe de la RT-PCR avec l'amorce Oligod(T)15.

Les ARNm sont convertis spécifiquement en ADNc simple brin grâce à l'utilisation de l'amorce oligod(T)15. Les ARN totaux sont ensuite dégradés par la RNAse H, afin d'éviter les faux positifs et l'amplification de l'ARN génomique viral.

Figures 8A et 8B : Electrophorèse des produits obtenus par RT-PCR.

Figure 8A : RT-PCR des ARN extraits des cellules infectées par rSeV/spG130-200, rSeV/spG130-210, rSeV/spG140-200. rSeV/spG140-210 (pistes 1,2, 3, 4 : passage 4 et pistes 1', 2', 3', 4' : passage 5).

Figure 8B : RT-PCR des ARN extraits des cellules infectées par rSeV/mTRP2.

Figures 9A à 9E : Images obtenues par microscope à fluorescence de cellules infectées par des rSeV pour différents transgènes insérés dans les rSeV recombinants.

Les images montrent clairement des signaux positives dans les cellules infectées par les rSeV contenant des fragments du gène codant pour la protéine G du virus syncytial respiratoire (VRS) (9A-9D). Le rSeV/mTRP2, contenant un transgène

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codant pour la protéine TRP-2 ( Tyrosine Related protein type 2 d'origine murine), utilisé comme témoin négatif, ne donne pas de signal (9E). Les résultats d'immunofluorescences indiquent donc que les fragments du gène G du VRS sont correctement exprimés à partir de tous les rSeV contenant un fragment du gène G du VRS.

EXEMPLE 1 : Suppression d'une grande section du gène L
Une représentation schématique du clone génomique full length de SeV (souche Z) est montrée figure 2 (en référence à SeV-FL4, il a été inséré dans un plasmide pBluescript de telle façon que la transcription conduite par le promoteur T7 produira une transcription de sens full length +ve (antigénomique). La séquence de SeV souche Z est publiée dans Genbank, accession number M30202.

Le gène L représente approximativement la moitié du clone FL4 entier. Cette séquence est en fait dupliquée au cours d'une rescue ( rescue pour méthode de préparation de Mononégavirus recombinant capable de dissémination) puisqu'il est également présent dans le plasmide utilisé pour exprimer la polymérase virale (la protéine L exprimée du clone pGEM3-L ou de pBluescript-L). Ceci ouvre la possibilité de supprimer une grande portion interne du gène L à l'intérieur du clone FL4, une suppression qui sera subséquemment réparée dans la cellule transfectée par la recombinaison avec le plasmide exprimant L. Ceci a été accompli à l'intérieur du clone SeV-FL4 en retirant un fragment de restriction Spel de 4 759 nucléotides (position 9368 à 14127) du corps du gène L, réduisant la taille du clone infectieux d'un tiers (en référence à FL4ASpe). Brièvement, le clone FL4 a été digéré avec l'enzyme Spel et approximativement 13 kbps de fragment (ASpe) a été récupéré d'un gel 0,6 % agarose. Ce fragment a été lié avec la ligase ADN T4 et transformé dans la souche d'E. coli DH5a. Les clones de plasmides ont été triés pour la suppression par digestion avec Spel. Les clones supprimés ont alors été testés dans une expérience de rescue en les transfectant dans des cellules humaines A549 infectées avec de la vaccinia-T7 avec des plasmides de rescue supplémentaires (c'est-à-dire pGEM-NP, pGEM-P, pGEM-L). En tant que contrôle négatif, le plasmide pGEM-L a été exclu. 24 heures après l'infection, les cellules infectées/transfectées étaient passées dans PBS et injectées dans la cavité allantoïque d'un embryon de poulet de 9 jours. Le virus infectieux a été extrait d'un clone de FL4ASpe en présence de pGEM-L mais pas en son absence, en accord avec un événement de recombinaison entre deux plasmides.

Le virus extrait s'est répliqué en titres équivalents à ceux observés avec les virus extraits directement de clone parent FL4.

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La suppression d'une grande section de gène L a permis d'obtenir un clone plus stable qui peut être directement libéré dans le virus infectieux.

EXEMPLE 2 : Insertion de transqènes entre les gènes HN et L
Le clone FL4ASpe est fondamentalement plus stable dans les bactéries et rend disponible un grand nombre de sites de restriction d'enzymes utiles (c'est-à-dire les sites qui apparaissent une seule fois ou peu de fois à l'intérieur de l'ADNc). Au départ de ce clone, une nouvelle jonction transcriptionnelle marche/arrêt a été insérée 13 nts ( nts pour nucléotides) en aval de la frontière intergénique HN/L au site Hindlll (position 8540). Le fragment 42 nts inséré (un multiple de six nucléotides) a été synthétisé ainsi que deux oligonucléotides complémentaires portant les sites Hindlll aux deux extrémités et un site interne Mlul. Les oligonucléotides ont été réchauffés et l'ADN double brin digéré avec Hindlll avant l'insertion à la position 8540. L'insertion porte un nouveau signal marche/arrêt dérivé de la frontière du gène NP/P. L'unique Mlul sert de site pour l'insertion des transgènes entre HN et L. Cette construction est appelée FL4 HN Mlu ASpe (voir figure 3).

Pour l'insertion dans ce vecteur le transgène doit lui-même être un multiple intégral de six nucléotides (afin que le virus recombinant obéisse à la règle de six ) et doit contenir des sites flanqués (généralement introduits par PCR). Les insertions transgéniques qui ne sont pas multiple de six sont possibles. Toutefois, dans ce cas la séquence génomique doit être compensée par l'addition ou la suppression de nucléotides de façon à ce que le génome recombinant entier soit un multiple de six nucléotides.

Cette approche a été exploitée pour produire des virus recombinants exprimant la luciférase et des fragments de la protéine G du Virus syncytial respiratoire (VRS) et la protéine TRP2 ("tyrosine related protein 2") d'origine murine.

EXEMPLE 3 : Caractérisation des virus recombinants obtenus avec la procédé revendiqué a. Production des Mononegavirus recombinants
Quatre virus exprimant un fragment de la protéine G du VRS-A ont été créés.

Ils s'agit de rSeV/spG130-200, rSeV/spG130-210, rSeV/spG140-200, rSeV/spG140- 210 qui codent respectivement pour les résidus 130 à 200,130 à 210,140 à 200 et 140 à 210 de la protéine G de VRS-A en fusion avec le peptide signal (sp) qui permet la sécrétion des protéines de fusion. Ces 4 fragments de la protéine G ont été obtenu par RT-PCR, en utilisant des amorces spécifiques, à partir des cellules eucaryotiques infectées par le VRS-A, et ensuite ont été génétiquement fusionné au peptide signal.

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Ils contiennent une région très conservée de la protéine G du VRS-A, impliquée dans la réponse immunitaire anti-VRS A et B. Un vaccin candidat anti-VRS est en phase clinique, il s'agit de la protéine BBG2Na et correspond à la partie centrale de la protéine G (G2Na, résidus 130 à 230) en fusion avec la protéine BB (région fixant l'albumine de la protéine G du streptocoque).

Un cinquième rSeV a été crée codant pour un antigène associé au mélanome, la Tyrosinase Related Protein 2 murine (mTRP2). Cet antigène appartient au groupe des antigènes de différenciation mélanocytaire et possède son équivalent chez l'homme, TRP2. De par sa nature, cet antigène induit une réponse CTL auto-immune grâce à un mécanisme immunologique de suppression de tolérance. Ce rSeV/mTRP2 se situe donc dans le développement d'une immunothérapie du mélanome.

Ces 5 rSeV ont été obtenus par reverse genetics comme indiqué dans la Figure X, les gènes hétérologues étant sous-cloné dans un site Mlul de l'unité de transcription artificielle pré-cloné entre les gènes HN et L de SeV. La spécificité de la rescue utilisée au CIPF est l'utilisation d'un Full-Length déleté pour une grande partie du gène L de SeV permettant de diminuer la taille du plasmide manipulé et donc de faciliter les sous-clonages.

Lors de la rescue, les cellules sont infectées par le virus de la vaccine recombinant exprimant la RNA-polymérase T7 (rVV/T7) et transfectées par l'ADNc Full-Length délété contentant le gène hétérologue d'intérêt, et les plasmides codant pour N, P et L nécessaires à la formation des Mononégavirus. Comme indiqué auparavant, le rW/T7 apporte la polymérase permettant la production de l'ARN génomique et facilite la recombinaison entre le plasmide codant pour le gène L et l'ADN génomique délété pour ce gène recréant ainsi le génome entier du rSeV.

Après 2-3 jours de l'infection/transfection chez les cellules adhérentes, les cellules ont été grattées dans le milieu, récoltées et soniquées. Une aliquote de 0,2 à 0,5 ml a été injectée dans des #ufs embryonnés de 9-11jours. Trois jours plus tard, le liquide allantoïque (LA) a été prélevé et ré-injecté (dilué ou non) chez des #ufs embryonnés, et ainsi de suite pendant 2-5 passages des virus. Après le prélèvement, 1 ml de LA est centrifugé à travers un coussin de 25 % glycérol dans le tampon Tris NaCI EDTA (TNE) et le culot est repris dans le tampon de charge (+ 2 % ssmercaptoéthanol) puis testé sur gel SDS-PAGE 12 %Tris-Glycine pour vérifier la présence des particules virales (figure 5). En effet, pour chaque récolte de LA, le profil obtenu correspond à celui du témoin positif, SeV wt. b. Confirmation de la présence du gène hétérologue dans le génome du rSeV

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i. RT-PCR
Les ARN génomiques des stocks viraux et les ARN totaux des cellules infectées par les différents rSeV ont été extraits. Une extraction phénol/chloroforme avec le RNA-B a donc été réalisée comme indiqué par le fabricant. Les cellules ou les virus sont lysés dans 500 !-IL du RNA-B. 0,1 volume de chloroforme est ajouté à chaque échantillon qui est vortexé 15 s, incubé 5 min dans la glace et centrifugé 5 min à 12 000 g et 4 C. La phase aqueuse est récupérée. Un volume d'isopropanol est ajouté et les échantillons sont incubés 15 min à 4 C et centrifugés 15 min à 12 000 g et 4 C. Les culots d'ARN obtenus sont lavés avec 900 l d'éthanol à 70 %, centrifugés 8 min à 7500 g et 4 C. Les échantillons sont ensuite séchés au SpeedVac (Automatic Environmental SpeedVac, Savant) et repris dans 13 l d'H20 traitée au di- éthylpyrocarbonate (DEPC).

Une RT-PCR en une seule étape a été réalisée sur chaque lot d'ARN grâce au kit OneStep RT-PCR (Qiagen). Les fragments G (G130-200, G130-210, G140-200 et G140-210) ont été amplifiés avec les amorces : SeV-Mlu-5' : 5'-AACCCAGGGTGAATGG-3' (SEQ ID No. 3), SeV-Mlu-3' : 5'-AGACCTATGGCAAGC-3' (SEQ ID No. 4).

Le fragment mTRP2 a été amplifié avec les amorces : TRP2-5'.1 : 5'- AAAGTCAGACAGAAACCAGGTGGGACGCCG-3' (SEQ ID No. 5), TRP2-3' : 5'-GAGCGACGG TGTAATTAGTTACTACCCA-3' (SEQ ID No. 6).

Les 5 fragments ont été traités selon le même protocole d'amplification, d'abord 30 min à 50 C pour la transcription inverse, suivi de 15 min à 95 C pour inactiver la reverse transcriptase et activer la Taq polymérase, puis 35 cycles comprenant 1 min de dénaturation à 95 C, 1 min d'hybridation à 60 C et 1 min d'élongation à 72 C, et la réaction se finit par 10 min de fin d'élongation à 72 C. Les produits issus de cette réaction sont déposés sur gel TBE 1% agarose révélé au Bromure d'éthidium (BEt ; Sigma chem. Co, St Quentin, France).

La taille des fragments obtenus correspond parfaitement à ce qui était attendu après amplification avec les amorces citées. En effet, l'amplification des gènes des différents fragments spG (spG130-210, spG130-210, spG140-200 et spG140-210) doit fournir respectivement des ADNc de 424 pb, 454 pb, 394 pb et 424 pb. Et un fragment de 1700 pb est attendu pour mTRP2.

Une RT-PCR en deux étapes a été réalisée sur chaque lot d'ARN (figure 6).

Les réactions de transcription inverse ont été réalisées avec l'amorce Oligo(dT)15 (Promega, Madison, WI), la RNAse inhibitor (Roche Molecular Biochemicals, Meylan,

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France), l'AMV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI) ou la SuperScript Il RNAse H reverse transcriptase qui est plus fidèle (Life Technologies, Cergy Pontoise, France). L'utilisation de l'amorce Oligo(dT)15 donne accès aux seuls ARNm. Ces deux réactions ont été réalisées comme indiqué par le fabricant. Après avoir inactivé la RNAse inhibitor à 72 C pendant 20 min, les échantillons sont soumis à l'action de la RNAse H (New England Biolabs, UK) pendant 15 min à 37 C afin de digérer tout les ARN restants (matriciel et autres). Les ADNc simple brin issus de la transcription inverse sont amplifiés par la DYNAzyme EXT for High Perfomance PCR (Finnzymes, Finlande) avec, pour les 4 fragments G, l'amorce : spG140linker-5' : 5'-ATTAGCTAGCACGCGTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTAATACAC-3' (SEQ I D No. 7), pour les fragments G130-200 et G140-200, l'amorce : Ga200-3' : 5'-ATAGTCGACCGTTAGGTGGTTTTCTTTCCTGGTTTTTTGTTTGG-3' (SEQ ID No.

8), pour les fragments G130-210 et G140-210, l'amorce : Ga210-3' : 5'-ATAGTCGACGCGTTACTTGAAGGTTGGTTTTTTTGTAGGCTTGG-3' (SEQ ID No.

9), et les amorces TRP2-5'.1et TRP2-3' pour le fragment mTRP2.

Les produits issus de ces PCR sont déposés sur gel TBE 1 % agarose révélé au BEt.

Les produits de réaction ont ensuite été identifiés par électrophorèse (figures 8A et 8B) et séquences.

L'électrophorèse révèle la présence de l'ADNc de taille attendue pour chaque virus. En effet, un fragment de 342 pb est attendu pour le rSeV/spG 130-200, un fragment de 372 pb pour le rSeV/spG130-210, puis un de 312 pb pour le rSeV/spG140-200 et un de 342 pb pour le rSeV/spG140-210. Enfin, l'ADNc du rSeV/mTRP2 doit avoir une taille de 1700 pb. Ces donnés indiquent que le gène hétérologue de chaque rSeV est transcrit. ii. Séquençage
Les amplicons issues de RT-PCR ont été séquences pour confirmer la fidélité des gènes hétérologues trancrits après plusieurs passages de rSeV. Les réactions de séquençage ont été réalisées avec le BigDye Terminator cycle Sequencing Ready

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Reaction Kit (ABI PRISM ; Applied Biosystem) comme décrit dans le protocole du fournisseur. Les amorces utilisées pour les fragments G sont SeV-Mlul-5', SeV-Mlul-3' et pour le fragment mTRP2 sont, mTRP2-5'.1, mTRP2-3', mTRP2-5'.2 : 5'-AGAGGGAGCAGTTCTTGGGCGCCTTA-3' (SEQ ID No. 10), mTRP2-5'.3 : 5'-GACAAGATGACCCAACGCTGA-3' (SEQ ID No. 11), et mTRP2-5'.4 : 5'-GGCTGAAGAGAAACAACCCTT-3' (SEQ ID No. 12).

Le programme de PCR a été le même pour tous les échantillons, 5 min de prédénaturation à 94 C, puis 25 cycles comprenant 15 s de dénaturation à 94 C, 15 s d'hybridation à 50 C et 4 min d'élongation à 60 C, pour finir la réaction par 10 min de fin d'élongation à 60 C. Les échantillons sont purifiés sur colonne de séphadex G50 (centriflex gelfiltration Cartridge, Edge Biosystems) et repris dans une solution de formamide/EDTA (rapport 5/1). Puis, les échantillons sont dénaturés 5 min à 95 C et déposés sur gel 6 % polyacrylamide dans uns système de séquençage automatique de ABI Prism. La migration est réalisée à 2500 V sur la nuit. Les séquences obtenues sont analysées grâce au logiciel SEQUENCHER (Gene Codes Corporation).

Des résultats fiables ont été obtenus pour 4 rSeV testés : - rSeV/spG130-200, rSeV/spG140-200, rSeV/spG140-210 et rSeV/mTRP2. Ces virus possèdent la bonne séquence et le bon cadre de lecture pour leur gène hétérologue, même après 4 et 5 passages du virus en oeufs embryonnés (tableau 1). Ceci indique une bonne stabilité de l'insert dans le génome du virus au cours des réplications. Ce critère est important pour l'utilisation du virus comme vecteur vaccinal et thérapeutique.

Tableau 1 : Récapitulatif du séquençage des gènes hétérologues introduits dans les différents rSeV et des ARNm issus de ces gènes spG130-200 spG140-200 spG140-210 mTRP2 'rSeV GENES 2OK OK OK OK
ARNm passage 4 OK OK OK OK
ARNm passage 5 OK OK OK OK
En conclusion, il apparaît donc que les gènes hétérologues sont transcrits en ARNm.

1 rSev GENES : contrôle de la séquence du transgène inséré dans le rSeV recombinant full lenght initial avant délétion (cf. figure 3) par rapport à la séquence du transgène avant son insertion ;

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2 OK : séquence du transgène identique à la séquence du transgène avant insertion.

De plus, ces ARNm possèdent le cadre de lecture correct pour permettre l'expression des protéines relevantes. iii. Immunofluorescence:
Pour caractériser les 4 rSeV exprimant les fragments spG en terme d'expression protéique une technique d'immunoprécipitation a été mise en place. Les anticorps monoclonaux de souris 5C2 (dirigés spécifiquement contre le fragment 144- 159 de la protéine G du VRS) et 18D1 (dirigés spécifiquement contre le fragment 172- 187 de la protéine G du VRS) utilisés lors de cette étude, ont été produits et purifiés.

Une plaque 12 puits a été ensemencée avec 2x105 cellules HEp-2 par puits et infectées par les différents rSeV (rSeV/spG 130-200, rSeV/spG 130-210, rSeV/spG140- 200, rSeV/spG140-210, rSeV/mTRP2) avec une MOI de 4. La MOI ( MOI pour Multiplicity Of Infection) correspond au ratio du nombre de virus sur le nombre de cellules. Par exemple, une MOI de 1 correspond à 1 virus pour 1 cellule. Après l'infection, les cellules sont incubées 48 heures à 33 C dans du milieu de maintenance HEp-2 (MEM 10X, Medium 199 Hank's salt 10X, 1 % SVF, 50 ug/mL de gentamycine et 2mM de L-glutamine). Les cellules sont fixées et perméabilisées au méthanol (sds, France) pendant 6 min, à -20 C avec 700 l/puits de méthanol froid (-20 C). Après 3 lavages au PBS-ABC (Life Technologies), elles sont bloquées 30 min à température ambiante (TA) avec 700 l/puits de solution de blocage (PBS-ABC, 0,5 % de gélatine, 0,25 % BSA). Ensuite, les cellules sont incubées 30 min avec 700 L d'anticorps primaire (5C2 ou 18D1) dilué au 300 ème dans la solution de blocage, lavées 4 fois avec la solution de lavage (PBS-ABC, 0,2 % gélatine) et incubées 30 min à TA avec 700 l d'anticorps secondaire (anticorps de cheval anti-IgG de souris marqué Alexa à 2 mg/mL ; Molecular Probe) dilué au 200ème dans la solution de blocage. Les cellules sont lavées 4 fois avec la solution de lavage et observées au microscope à fluorescence à 488 nm (figures 9A à 9E).

EXEMPLE 4 : Insertion de transqène entre les gènes NP et P
Comme il en a été fait allusion plus haut, une expression élevée des copies du transgène sera favorisée s'il est positionné vers l'extrémité 3' du génome. Tenant compte de cela, il a été développé un vecteur permettant l'insertion du transgène entre le gène N (le 1er gène) et P (le 2ème) en utilisant une approche analogue à celle dont il a été donné les grandes lignesci-avant. Une portion d'approximativement 2,5 kb de

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FL4 a été supprimée s'étendant d'un site Ncol dans le gène N (position 361 sur la carte) à un site Eagl dans le centre du gène P (position 2746 sur la carte). Ces sites ont été émoussés en utilisant l'enzyme E. coli Klenow en présence des quatre déoxynucléotides et liés avec la ligase ADN T4. Cette construction est appelée FL4A1.

Afin d'accroître encore la stabilité du plasmide, cette suppression peut être combinée avec la suppression de ASpe à l'intérieur du gène L, et ainsi générer la construction FL4#1#Spe. Un vecteur navette permettant l'insertion d'un transgène entre les gènes N et P via un événement cross-over double peut être construit de la façon suivante. Le clone FL4 est coupé avec l'enzyme de restriction Stul (position 3979 au tout début du gène M) et Kpnl (position 15281, près de la fin du gène L). Le fragment entourant les gènes M, F, HN et L est enlevé en séparant les fragments sur gel d'agarose à faible pourcentage. Le fragment 7Kbp contient le vecteur pBluescript plus les 4 000 premières bases du génome du virus Sendaï (le leader, gènes N et P). Ceci représente le vecteur navette de base 01 qui peut se recombiner avec le FL4A1 pour réparer la brèche faite dans les gènes NP-P. Pour convertir ceci en un vecteur navette pour l'insertion de transgène, un nouveau site de restriction unique doit d'abord être introduit en aval du codon NP reading frame stop mais en amont de la jonction du gène NP-P (par exemple un site Sphl pourrait être introduit vers la position 1517 par la technique de mutagénèse orientée par PCR). Une cassette de jonction de gènes peut alors être introduite essentiellement à ce site comme montré plus haut dans les grandes lignes pour la frontière du gène HN-L.

Claims (32)

1/ Méthode de préparation de Mononegavirus recombinants, comprenant les étapes suivantes : (i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue : - du gène N et/ou P et/ou L exprimé (s) ladite cellule hôte avec ledit premier ADNc, et/ou, - dudit premier ADNc avec au moins un deuxième ADNc contenu dans ladite cellule hôte, ledit deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc et ledit deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.

2/ Méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : (i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue du gène N et/ou P et/ou L exprimé (s) parladite cellule hôte avec ledit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.

3/ Méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : (i) l'introduction, dans une cellule hôte exprimant les protéines N, P et L d'un Mononegavirus et exprimant une ARN-polymérase, d'un premier ADNc comprenant

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80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus, ledit premier ADNc comprenant au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; (ii) la recombinaison homologue : - dudit premier ADNc avec un deuxième ADNc contenu dans ladite cellule hôte, ledit deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc et ledit deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc, de façon à ce que les Mononegavirus obtenus après la recombinaison homologue détiennent la capacité de dissémination ; et (iii) la récupération desdits Mononegavirus recombinants en résultant possédant la capacité de dissémination.

4/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit premier et/ou deuxième ADNc comprend entre 25 % et 80 %, et de préférence entre 40 % et 70 % du génome dudit Mononegavirus.

5/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit premier ADNc comprend une délétion dans le gène L.

6/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit premier et/ou deuxième ADNc comprend au moins un site unique de restriction d'enzymes.

7/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'au moins un gène du génome dudit Mononegavirus est muté dans ledit premier et/ou deuxième ADNc.

8/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'expression de ladite ARN-polymérase dans la cellule hôte est assurée par le virus recombinant de la vaccine exprimant l'ARN-polymérase.

9/ Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit premier et/ou deuxième ADNc comprend au moins une séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue audit Mononegavirus.

10/ Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN exogène est flanquée par un signal d'arrêt et de marche de transcription fonctionnels spécifiques dudit Mononegavirus.

11/ Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN exogène est monocistronique, bicistronique ou polycistronique et que les cistrons sont séparées par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que

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la transcription virale résulte en un ARNm monocistronique, bicistronique ou polycistronique codant pour une ou plusieurs protéines hétérologues.

12/ Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est positionnée dans une région 3' non traduite d'un gène dudit Mononegavirus ou à l'intérieur des régions leader et/ou terminale qui contiennent les promoteurs de réplication du génome virale , et est précédée par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm bicistronique ou polycistronique codant la protéine virale et la protéine hétérologue.

13/ Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est positionnée dans une région 5' non traduite d'un gène dudit Mononegavirus ou à l'intérieur des régions leader et/ou terminale qui contiennent les promoteurs de réplication du génome virale et est suivi par un site interne d'entrée ribosomique de façon à ce que la transcription virale résulte en un ARNm bicistronique ou polycistronique codant la protéine virale et la protéine hétérologue.

14/ Méthode selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que la séquence d'ADN exogène codant pour un gène hétérologue est exprimée par ladite cellule hôte.

15/ Procédé de production de protéine recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes : a) de culture de cellules hôtes contenant des Mononegavirus recombinants obtenus par une méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'une des revendications 9 à 14 et dans laquelle méthode ladite séquence d'ADN exogène code pour ladite protéine recombinante ; et b) de récupération de ladite protéine hétérologue exprimée par lesdites cellules hôtes.

16/ Procédé de production de protéine recombinante, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes infectées par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'une des revendications 9 à 14 et dans laquelle méthode ladite séquence d'ADN exogène code pour ladite protéine recombinante ; et b) la récupération desdites protéines recombinantes exprimées à partir du milieu de culture desdites cellules hôtes et/ou à partir desdites cellules hôtes cultivées.

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17/ Procédé de production de protéine recombinante, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'infection de la cavité allantoïque d'oeufs d'oiseaux, notamment de poules, embryonnés par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode de préparation de Mononegavirus recombinants selon l'une des revendications 9 à 14 et dans laquelle méthode ladite séquence d'ADN exogène code pour ladite protéine recombinante ; et b) la récupération desdites protéines recombinantes exprimées à partir du fluide chorio-allantoïque desdits #ufs d'oiseaux à partir desdites cellules hôtes cultivées.

18/ Mononegavirus recombinants capables de dissémination et le cas échéant de produire des progéniteurs réplicatifs susceptibles d'être obtenus par une méthode selon l'une des revendications 1 à 17.

19/ Cellule hôte pour la préparation de Mononegavirus recombinants, comprenant des vecteurs permettant l'expression des protéines N, P et L de Mononegavirus et d'une ARN-polymérase, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) soit un ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène N et/ou P et/ou L ; ou b) un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit ADNc premier, avec ledit ADNc second comprenant au moins une région homologue dudit ADNc premier.

20/ Cellule hôte pour la production de protéines recombinantes, comprenant des vecteurs permettant l'expression des protéines N, P et L de Mononegavirus et d'une ARN-polymérase, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) soit un ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue du gène NP et/ou P et/ou L, et dans lequel ADNc, un transgène codant pour ladite protéine recombinante est introduit ; ou b) un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus et un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit ADNc premier, avec ledit ADNc second comprenant au moins une région homologue dudit ADNc premier, et dans lequel l'un au moins dudit premier ou deuxième ADNc, un transgène codant pour ladite protéine recombinante est introduit.

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21/ Milieu de culture, extrait cellulaire ou fluide chorio-allantoïque contenant des protéines recombinantes exprimées par un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 9 à 14 ou selon la revendication 18.

22/ Kit comprenant au moins des vecteurs permettant l'expression des protéines N, P et L de Mononegavirus et d'une ARN-polymérase, et : - une molécule d'ADNc comprenant 80 % ou moins du génome dudit Mononegavirus avec au moins une région homologue des gènes NP et/ou P et/ou L ; ou - un premier ADNc comprenant 80 % ou moins du génome desdits Mononegavirus et un deuxième ADNc comprenant au moins une partie du génome dudit Mononegavirus non compris dans ledit premier ADNc, et ledit deuxième ADNc comprenant au moins une région homologue dudit premier ADNc.

23/ Kit selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'ADNc comprend au moins un site unique de restriction d'enzymes.

24/ Kit selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une cellule hôte pour ladite molécule d'ADNc, ou, le cas échéant, pour ledit premier et deuxième ADNc, et pour lesdits vecteurs.

25/ Composition comprenant ledit premier et ledit deuxième ADNc comme défini dans n'importe laquelle des revendications 1 à 9.

26/ Composition comprenant un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18.

27/ Vaccin comprenant un Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18.

28/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou d'un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18 pour l'analyse de la fonction virale.

29/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou d'un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18 comme un système de production de polypeptides recombinants dans les cellules hôtes.

30/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 pour la préparation de vaccins.

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31/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou d'un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18 comme vecteur pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention de maladie par thérapie génique.

32/ Utilisation de Mononegavirus recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14 ou d'un Mononegavirus recombinant selon la revendication 18 comme vecteur pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des cancers.