CN112218659A - 用于治疗葡萄球菌感染的治疗性噬菌体组合物 - Google Patents

用于治疗葡萄球菌感染的治疗性噬菌体组合物 Download PDF

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G·梅尔恩斯
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Abstract

本发明涉及包含能够感染并裂解金黄色葡萄球菌的一种或多种(适当地两种或更多种，或三种)专性裂解性噬菌体的噬菌体组合物，并且涉及其在治疗金黄色葡萄球菌细菌感染中的应用。

Description

用于治疗葡萄球菌感染的治疗性噬菌体组合物
交叉引用的申请
本申请要求于2018年1月2日提交的美国临时申请No.62/613,050、于2018年5月31日提交的美国临时申请No.62/678,611和于2018年9月14日提交的美国临时申请No.62/731,775的优先权，这些临时申请通过引用完整地结合于此。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并且由此通过引用完整地结合于此。所述ASCII副本于2019年1月2日创建，命名为054249-502001WO_Sequence_Listing_ST25并且大小为1.77兆字节。
技术领域
本文描述了噬菌体、噬菌体组合物、及其在医学和非医学应用中的用途。
背景技术
逐渐增加数目的对抗生素具有抗性的人病原体已经产生了对于严重细菌感染的新治疗的迫切需求。规避抗生素抗性的传统机制的新方法可以有效抗生物膜，并且特别希望避免破坏天然肠道菌群。该临床挑战已经重新激发了对于噬菌体疗法的兴趣。
发明内容
本文提供了噬菌体，包括非天然存在的噬菌体，噬菌体组合物。该组合物可以基本上不含细菌组分如细菌内毒素和宿主细胞组分(例如，蛋白质)。组合物可以包括一种或多种专性裂解性噬菌体和任选地冷冻保护剂或其他赋形剂。在一些方面，噬菌体包括核酸序列，或具有可以包括核苷酸序列的基因组，所述核苷酸序列与以下中任一具有至少93％同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，该序列与SEQ ID NO:1-10中的一个或多个不具有100％序列同一性。在一些情形中，每种单个噬菌体不易于普遍性转导和/或不携带抗生素抗性基因。在一些实施方案中，一种或多种噬菌体不是天然存在的。
在一个方面，本文提供了噬菌体组合物，其基本上不含细菌组分如细菌内毒素、细菌宿主蛋白等。在一些实施方案中，本文提供了噬菌体组合物，其包括一种或多种能够互补的专性裂解性噬菌体。噬菌体可以包括核酸或基因组，所述核酸或基因组包括与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中任一具有至少93％同一性的核苷酸序列，和任选地冷冻保护剂。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中至少一种不具有100％同一性。在一些实施方案中，组合物的目标细菌范围宽于组合物中任何单个噬菌体的范围或组合物中单个噬菌体的总和。在一些实施方案中，组合物中的一种或多种噬菌体不是天然存在的。
一方面，本文提供了噬菌体组合物。该组合物可以基本上不含细菌组分诸如细菌内毒素、细菌宿主蛋白等。组合物可以包括至少一种专性裂解性噬菌体。在一些实施方案中，组合物包括用于储存在选择为8℃或低于8℃的温度下的储存介质。组合物中的任何噬菌体可以包含这样的核酸或具有这样的基因组，所述核酸或基因组包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中一个或多个具有至少93％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，至少一种噬菌体核酸或基因组与SEQ ID NO:1-10中任一不具有100％同一性。至少一种单个噬菌体不易于普遍性转导和/或不携带抗生素抗性基因。在一些实施方案中，组合物的一种或多种噬菌体不是天然存在的。
在另一方面，提供了用作药物的噬菌体组合物，或用于治疗与金黄色葡萄球菌(S.aureus)相关的细菌疾病的噬菌体组合物。考虑本文提供的任何组合物用于治疗诸如金黄色葡萄球菌感染的疾病或病症。在一些实施方案中，一种多种噬菌体不是天然存在的。还提供了相应的治疗疾病的方法，所述方法包括将噬菌体组合物施用于受试者。
在一方面，提供了治疗具有细菌感染的人的方法，包括向人施用组合物，所述组合物包括一种或多种不同的(distinct)感染并裂解金黄色葡萄球菌细菌的噬菌体。至少一种噬菌体可以具有核酸或基因组，所述核酸或基因组包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、或与SEQ ID NO:1-10中任一具有至少93％同一性的序列中一个或多个的多核苷酸序列。在一些方面，一种或多种噬菌体不是天然存在的。该方法可以包括选择具有金黄色葡萄球菌感染的患者。在一些方面，感染是非肺部的。
在一方面，提供了治疗具有证实的非肺部的金黄色葡萄球菌感染的人的方法，包括向人施用组合物，所述组合物包括一种或多种不同的感染并裂解金黄色葡萄球菌细菌的噬菌体。至少一种噬菌体包括核酸或基因组，所述核酸或基因组包含选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:1-10中任一具有至少93％同一性的序列中一个或多个的多核苷酸序列。在一些方面，感染不是肺部的金黄色葡萄球菌感染。在一些方案中，一种或多种噬菌体不是天然存在的。该方法可以包括选择具有金黄色葡萄球菌感染的患者。在一些方面，感染是非肺部的。
在一方面，本文提供了改变人的微生物菌群的方法，包括向所述人施用组合物，所述组合物包括一种或多种不同的具有针对金黄色葡萄球菌细菌的裂解性活性的噬菌体。所述一种或多种不同的噬菌体选自具有这样的核酸或基因组的噬菌体，所述核酸或基因组包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:1-10中任一具有至少93％同一性的序列中任一的核苷酸序列。在一些方案中，一种或多种噬菌体不是天然存在的。该方法可以包括选择具有金黄色葡萄球菌感染的患者。在一些方面，感染是非肺部的。
另一方面涉及例如用于治疗受试者中细菌感染的噬菌体组合物，其中所述噬菌体组合物被施用于受试者，并且其中所述细菌感染包括葡萄球菌(Staphylococcus)(例如，金黄色葡萄球菌)感染。
一些方面例如涉及噬菌体组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的细菌感染，其中所述噬菌体组合物被施用于受试者，并且其中所述细菌感染包括葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌)感染。
一些方面涉及噬菌体。例如，在本文中称为Sa87、J-Sa36、Sa83、Sa38、Sa41、Sa42、Sa44、Sa51、Sa76和Sa81的噬菌体。此外，与它们中任一和/或SEQ ID NO:1-10中一个或多个具有90-100％核酸序列同一性的噬菌体。
一些方面涉及本文所述的任何噬菌体或组合物在治疗人中的金黄色葡萄球菌感染中的用途，其中所述感染是基本上或完全非肺部的。所述用途可以包括将所述组合物施用于患有金黄色葡萄球菌感染的人。
一些方面涉及本文所述的任何噬菌体或组合物在治疗人中的金黄色葡萄球菌感染中的用途。所述用途可以包括例如向所述人施用一种或多种不同的噬菌体的组合物；其中所述一种或多种噬菌体中至少一种包含基因组，所述基因组包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和与SEQ ID NO:1-10中任一具有至少93％同一性的序列组成的组的多核苷酸序列。在一些用途中，所述一种或多种噬菌体不是天然存在的。
一些方面涉及本文所述的任何噬菌体或组合物在治疗人中证实的非肺部的金黄色葡萄球菌感染中的用途。所述用途可以包括治疗，所述治疗包括向所述人施用组合物，所述组合物包含至少两种噬菌体，所述噬菌体包含核酸或基因组，所述核酸或基因组包括选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和与SEQ ID NO:1-10中任一具有至少93％同一性的序列组成的组的核苷酸序列，其中所述感染不是肺部金黄色葡萄球菌感染。在一些用途中，所述一种或多种噬菌体不是天然存在的。
附图说明
现在将仅通过举例的方式参考附图描述实施方案，其中：
图1A、1B和1C显示了三种组分噬菌体Sa83(图1A)、Sa87(图1B)和J-Sa36(图1C)的实例的透射电子显微镜(TEM)图像。该图像显示了直的可收缩尾部和窄的颈部，这些是属于有尾噬菌体目(Caudovirales)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体的特征。
图2显示了(从上到下)Sa83、Sa87、J-Sa36和噬菌体K(GenBank登录号K766114)的Progressive Mauve比对，每个显示了注释基因(白框)和长末端重复序列(红框)。在每个注释基因组上的红色块中的中断表示核苷酸序列的不同。
图3A和3B是显示根据本文所述的一个或多个方面的噬菌体的组合物(AB-SA01)减轻中性粒细胞减少的CD-1小鼠(2A)和免疫活性的BALB/c小鼠(2B)中肺部菌量(bacterialburden)的图表。噬菌体剂量以总PFU/剂量提供。
图4是显示了噬菌体候选物的单拷贝核酸类似性(其以(核苷酸同一性百分比)表示)的汇总图表。在每个格子中，数值是横跨全部比对的同一性百分比。由空位(gap)补足的比对的百分比分别在括号中通过这些空位占总同一性的百分比报道。
具体实施方式
应当理解，本发明不限于所描述的具体实施方案，并且因此当然可以改变。还应理解，本文所用的术语是仅为了描述具体实施方案的目的，并且不意欲是限制性的，因为本发明的范围将仅受后附权利要求的限制。
本文详述分成各个部分仅仅为了读者方便，并且在任何部分存在的内容可以与另一部分存在的内容组合。除非另外指出，本文所用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
定义
必须注意的是，除非上下文另有明确说明，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数指代。因此，例如，提及“一种噬菌体组合物”包括多种这样的候选试剂，并且提及“这种噬菌体”包括提及一种或更多种噬菌体及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
如本文所用，当在数字名称例如温度、时间、量、浓度等等之前使用的术语“大约”表示可以以(+)或(-)10％、5％或1％变化的近似值。
当在本文中列出一个范围(例如，剂量范围)时，应当理解，该值可以包括在所述范围内的任何单个值或范围，包括端点。
如本文所用的术语“突变体”是指与Sa87、J-Sa36或Sa83在基因上不同但仍保留感染并裂解金黄色葡萄球菌目标细菌的能力的噬菌体。突变体典型地包括例如沉默突变、保守突变、微小缺失(minor deletion)和/或遗传物质的微小复制，并且保持参照噬菌体的表型特征。在一个实施方案中，突变体保留任何可观察的特征或性质(这取决于本文所述的噬菌体的基因组)，即所述噬菌体的表型特征和/或针对葡萄球菌属的裂解性活性。优选的突变体保留感染并裂解金黄色葡萄球菌目标细菌的能力并且与参照噬菌体的基因组相比具有小于10％的核酸改变，甚至更优选小于7％，更优选小于1％。备选地，备选地，或组合地，与参照噬菌体的多肽相比，在编码的多肽序列中突变体具有优选小于7％的氨基酸改变。当与Sa87、J-Sa36或Sa83中任一相比在整个基因组上具有小于10％核酸改变并且具有针对金黄色葡萄球菌目标细菌的裂解性活性的噬菌体的实例包括Sa38、Sa41、Sa42、Sa44、Sa51、Sa76和Sa81(图4)。
关于核酸或氨基酸序列的术语“％同一性”或“％序列同一性”表示在所述序列之间的同一性或同源性的水平，并且可以通过本领域已知的技术确定。各种各样的序列比对方法中的任一种可以用于确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和杂交方法，诸如分段法(segment approach methods)。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过将各个核苷酸对的分数相加以及通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等，CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of ProgressiveMultiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific GapPenalties and Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代细化。非限制性方法包括例如BLAST、Match-box，参见例如Align-M，参见例如，Ivo Van WaIIe等，Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of HighlyDivergent Sequences，Bioinformatics 20(9):1428-1435(2004)。该定义也参考或者可适用于测试序列的编撰。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些。如下所述，优选的算法可以说明空位等。优选地，同一性在长度为至少大约100个核苷酸的区域上存在，或更优选在长度为100-1000或更多个核苷酸的区域上存在。
本文所用的术语“互补(complementation)”是指具有特定基因组的噬菌体补偿具有不同基因组的不同的相异的噬菌体的能力。更具体地，(目标细菌的)噬菌体不敏感突变体菌落可以对于特定噬菌体产生，但仍然可以对于另外的噬菌体敏感。换句话说，对于一种噬菌体产生的抗噬菌体突变体细菌仍然对于另一噬菌体敏感。
本文所用的术语“普遍性转导”是指这样的过程，通过该过程任何细菌DNA可以经由噬菌体转移至另一细菌。这是稀有事件；非常小百分比的噬菌体颗粒偶尔携带供体细菌的DNA，大约10,000个中有1个噬菌体。本质上，这是将细菌DNA包装到病毒包膜中。
本文所用的术语“治疗(treat/treating)”意欲包括预防性治疗以及矫正治疗(治疗已经患有疾病的受试者)。
术语“裂解性”或“裂解性活性”表示噬菌体导致细菌细胞裂解的性质。噬菌体的裂解性活性可以根据本领域已知的技术在细菌(例如，金黄色葡萄球菌菌株)上测试。当噬菌体已经感染细胞、复制新噬菌体颗粒并从宿主细胞膜中释放时发生的过程称为裂解周期。一些噬菌体显示溶原周期，在此期间由于噬菌体过程的主动抑制，噬菌体DNA实际上保持休眠。当细菌分裂时，噬菌体的DNA也复制。由此，病毒可以在其宿主中持续复制而不裂解宿主。在某个点，条件可能变化并且噬菌体进入裂解周期。“专性裂解”是指不能经历溶原周期的噬菌体。
用途或方法典型地包括向受试者施用本文所述的噬菌体或噬菌体组合物。如本文所用，“受试者”是哺乳动物，诸如人或其他动物。优选地，所述受试者是人。
本文所用的术语“分离的”表示噬菌体从其天然存在的原始环境中移出。具体地，分离的噬菌体是例如与其天然位于的环境中分开培育的或培养的。
本文所用的术语“纯化的”表示噬菌体从制造宿主细菌中移出。具体地，纯化的噬菌体将生产杂质诸如细菌组分从其制造或生产环境中去除。细菌组分包括但不限于细菌宿主蛋白、脂质和/或细菌内毒素。术语“纯化的”也可以是指基因纯化，其中噬菌体株在遗传上是同质的。
本文所用的术语“基本上纯化的”是指组合物含有少于1％、少于0.1％、少于0.001％或无可检测量的污染物如宿主细菌蛋白或内毒素。此外，如本文所用，当用于描述噬菌体株时术语“基本上纯的”是指组合物的基因纯度，使得株系大于99％、大于99.9％、大于99.999％或100％是一种特定基因组序列。
典型地，当样品中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的总物质(按体积计、按湿重或干重计或按摩尔百分比或摩尔分数计)不含杂质或遗传变体时，组合物是基本上纯的。
术语“受试者”或“患者”是指人或非人动物。优选地，受试者或患者需要用本文所述的组合物治疗，例如具有对组合物治疗敏感的细菌感染。
本文所用的“协同量”是指第一个量(例如，一种噬菌体)和第二个量(例如，不同噬菌体)的总和导致协同作用(即，大于累加作用的效果)。因此，术语“协同”、“协同作用”、“协同的”、“组合的协同量”和“协同的治疗效果”在本文中可互换使用，是指组合施用的化合物的测量的效果，其中测量的效果大于每个本文提供的化合物作为单个试剂单独施用的单独效果的总和。
本文所用的术语“基本上不含”可以是指具有少于10％的待排除的物质的某物。例如，0.01％至10％不含，包括其中的任何子值和子范围。例如，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10％。
以下定义另外的术语和短语。
噬菌体组合物
本文提供了噬菌体组合物，其包括基本上不含细菌组分诸如例如细菌内毒素、细菌宿主蛋白等的组合物。组合物可以包括一种或多种专性裂解性噬菌体和任选地冷冻保护剂。噬菌体可以是本文所述的任何噬菌体，包括至少一种具有核酸序列或基因组的噬菌体，所述核酸序列或基因组包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中任一具有至少93％同一性的核苷酸序列。在一些方面，至少一种噬菌体与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中一种或多种不具有100％同一性。在一些方面，一种或多种噬菌体不是天然存在的。在一些方面，单个噬菌体不易于普遍性转导和/或不携带抗生素抗性基因。
在实施方案中，与Sa87(SEQ ID NO.:1)、J-Sa36(SEQ ID NO.:2)和/或Sa83(SEQID NO.:3)的基因组序列相比，噬菌体在核苷酸或基因组序列方面差别多至大约10％，多至大约9％，多至大约8％，多至大约7％，多至大约6％，多至大约5％，多至大约4％，多至大约3％，多至大约2％或多至大约1％。当与Sa87、J-Sa36或Sa83中任一相比时在整个基因组上具有小于10％核酸变化并且具有针对金黄色葡萄球菌目标细菌的裂解性活性的噬菌体的实例包括Sa38(SEQ ID NO.:4)、Sa41(SEQ ID NO.:5)、Sa42(SEQ ID NO.:6)、Sa44(SEQ IDNO.:7)、Sa51(SEQ ID NO.:8)、Sa76(SEQ ID NO.:9)和Sa81(SEQ ID NO.:10)(图4)。在一些方面，一种或多种噬菌体、噬菌体组合物和使用方法包括这样的一种或多种噬菌体，其具有的核酸的序列与SEQ ID NO.1-10中的一种或多种或与Sa87、J-Sa36、Sa83、Sa38、Sa41、Sa42、Sa44、Sa51、Sa76和Sa81的核酸序列具有90％-99.99％同一性，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性。在一些方面，一种或多种噬菌体是非天然存在的，而在其他方面，一种或多种噬菌体是天然存在的。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括一种或多种另外的噬菌体。本文公开的噬菌体及其突变体用于治疗细菌感染，特别是金黄色葡萄球菌感染。
噬菌体Sa87(以ECACC保藏号17020901保藏)、J-Sa36(以ECACC保藏号17020903保藏)和Sa83(以ECACC保藏号17020902保藏)于2017年2月9日保藏于欧洲动物细胞保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)(Culture Collections,PublicHealth England,Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 0JG,英国)。所有这些保藏都是按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定进行的。
在一方面，本文提供了基本上不含细菌组分(包括细菌内毒素和细菌宿主蛋白)的噬菌体组合物。在一些实施方案中，组合物可以包括一种或多种能够互补的专性裂解性噬菌体。噬菌体可以具有核酸序列或基因组，所述核酸序列或基因组包括与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性的核苷酸序列，和冷冻保护剂。组合物的目标细菌范围可以宽于组合物中任何单个噬菌体或噬菌体总体的范围，或者具有的功效大于单个噬菌体的功效的总和。组合物可以具有至少一种非天然存在的噬菌体。组合物可以包括至少一种天然存在的噬菌体或可以不包括天然存在的噬菌体。
在一方面，本文提供了基本上不含细菌组分如细菌内毒素、细菌宿主蛋白等的噬菌体组合物。噬菌体组合物可以包括至少一种专性裂解性噬菌体和任选地用于储存在选在8℃或低于8℃的温度下的储存介质。噬菌体可以包括核酸或基因组，所述核酸或基因组包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性的核苷酸序列。一种或多种单个噬菌体可能不易于普遍性转导并且不携带抗生素抗性基因。组合物可以具有至少一种非天然存在的噬菌体。组合物可以包括至少一种天然存在的噬菌体或可以不包括天然存在的噬菌体。
在实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种具有核酸或基因组核酸序列的噬菌体，所述核酸或基因组核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性。在实施方案中，噬菌体组合物包括至少两种具有核酸或基因组核酸序列的噬菌体，所述核酸或基因组核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性。在实施方案中，噬菌体组合物包括至少三种具有核酸或基因组核酸序列的噬菌体，所述核酸或基因组核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性。在另一个实施方案中，噬菌体组合物包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性的噬菌体。在实施方案中，噬菌体组合物基本上由具有核酸或基因组核酸序列的噬菌体组成，所述核酸或基因组核酸序列与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性。包括两种或更多种噬菌体的噬菌体组合物在本文中可以称为噬菌体“组(panel)”。在其中组合物包括一种或多种与SEQ ID NO:1-10中一个或多个不具有100％同一性的噬菌体的一些实施方案中，组合物可以包括至少一种不具有100％同一性的噬菌体。组合物可以具有至少一种非天然存在的噬菌体。组合物可以包括至少一种天然存在的噬菌体或可以不包括天然存在的噬菌体。
在实施方案中，噬菌体组合物包括一种或多种具有核酸或基因组核酸序列的噬菌体，所述核酸或基因组核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性。在实施方案中，噬菌体组合物包括两种或更多种具有基因组核酸序列的噬菌体，所述核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性。在实施方案中，噬菌体组合物包括三种或更多种噬菌体，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中任一具有至少93％的但非100％的同一性。组合物可以具有至少一种非天然存在的噬菌体。组合物可以包括至少一种天然存在的噬菌体或可以不包括天然存在的噬菌体。
在实施方案中，噬菌体组合物可以是常规抗菌剂/治疗剂的备选方案，并且克服了与其相关的一个或多个问题。在一些方面，噬菌体组合物可以用作联合治疗或者与常规抗菌剂/治疗剂组合使用。在一些方面，本文的方法可以包括使用本文所述的噬菌体和组合物来治疗患者，所述患者已经用另一种疗法诸如抗生素疗法来治疗他/她的感染。基于已经接受这样的先前治疗，包括其中感染没有完全消除或其中感染持续的先前治疗，可以鉴定和/或选择用于该方法的患者。在其他方面，由于没有接受另外的先前治疗，可以选择该患者。
在实施方案中，噬菌体组合物可以包括一种或多种另外的噬菌体。在优选实施方案中，所述一种或多种另外的噬菌体适合于治疗细菌感染，特别是葡萄球菌感染。所述另外的一种或多种噬菌体可以是天然或非天然存在的。所述一种或多种另外的噬菌体可以是与本文所述的噬菌体中任一具有90％-100％核酸序列同一性的噬菌体，包括与SEQ ID NO:1-10相关的噬菌体。
本文所用的术语“基本上由……组成”是指在噬菌体组合物中仅存在明确指出的噬菌体，但是所述组合物也可以含有另外的非噬菌体成分，诸如适当的载体、稀释剂、抗生素(例如，化学抗生素)等。
在一方面，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约60％的目标细菌菌株有效。例如，噬菌体组合物针对给定组中至少60％的金黄色葡萄球菌菌株有效(例如，杀死或裂解)。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约70％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约75％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约76％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约77％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约78％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约79％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约80％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约81％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约82％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约83％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约84％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约85％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对至少大约90％的目标细菌菌株有效。在一个实施方案中，噬菌体组合物包括至少一种、至少两种或至少三种噬菌体，使得组合物针对来自具有细菌感染的受试者的一种或多种细菌菌株(或分离株)有效。
在实施方案中，组合物的目标细菌的范围宽于组合物中包括的任何单个噬菌体的目标细菌的范围。该活性可以被认为是协同的，因为组合物的效果(目标杀死范围)大于每个组分噬菌体的单个效果(目标杀死范围)的总和。
在一个实施方案中(备选地或另外地)，“突变体”噬菌体能够裂解一些或所有与Sa87、J-Sa36、Sa83、Sa38、Sa41、Sa42、Sa44、Sa51、Sa76和/或Sa81中一种或多种相同的目标细菌菌株，和/或进一步能够裂解一种或多种另外的细菌菌株。在一个实施方案中，突变体可以与Sa87、J-Sa36、Sa83、Sa38、Sa41、Sa42、Sa44、Sa51、Sa76和Sa81中一种或多种的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，当与Sa87、J-Sa36、Sa83、Sa38、Sa41、Sa42、Sa44、Sa51、Sa76和Sa81中的一种或多种相比较时，突变体或变体可以在其整个基因组上具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，当与SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10相比较时，突变体可以在其整个基因组上具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在实施方案中，“突变体”可以是噬菌体后代。噬菌体后代可以是使用本文所述的噬菌体(即，“亲本噬菌体”)裂解葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌)目标细菌后可获得的噬菌体。换句话说，噬菌体后代可以是第二(或下一)代的噬菌体。
在实施方案中，噬菌体后代通过以下可获得：将一种或多种本文所述的噬菌体(包括例如选自Sa87、J-Sa36和/或Sa83的噬菌体)与葡萄球菌目标细菌接触，使得所述一种或多种噬菌体感染并裂解目标细菌；以及获得在裂解目标细菌后释放的噬菌体。当与相关亲本噬菌体相比时，噬菌体后代将典型地包括一个或多个核苷酸突变。
本文所用的术语“可获得”还包括术语“获得的”。在一个实施方案中，术语“可获得”是指获得的。
噬菌体组合物靶向(并优选杀死)一种或多种葡萄球菌菌种或菌株。在实施方案中，组合物靶向金黄色葡萄球菌，包括例如一个或多个金黄色葡萄球菌菌株。在一个实施方案中，噬菌体靶向的葡萄球菌菌种或菌株是耐受化学抗生素的葡萄球菌菌种或菌株，诸如多重耐药葡萄球菌菌种或菌株。在一个实施方案中，噬菌体靶向的葡萄球菌菌种或菌株是耐受化学抗生素的金黄色葡萄球菌菌株，诸如多重耐药金黄色葡萄球菌。
在实施方案中，本文所述的噬菌体组合物已经显示特别有效治疗耐受化学抗生素的葡萄球菌菌种或菌株感染，诸如多重耐药葡萄球菌菌种或菌株。在实施方案中，本文所述的噬菌体组合物已经显示特别有效治疗耐受化学抗生素的金黄色葡萄球菌感染，诸如多重耐药金黄色葡萄球菌菌株。
噬菌体可以以如下形式提供：单一治疗剂组合物(优选的)或者作为多个分开的各自包含一个或多个组合物成员的组合物。在其中噬菌体以多个分开的组合物提供的实施方案中，所述噬菌体可以顺序或同时(适当地同时)施用于受试者。
在其中多于一种噬菌体存在于噬菌体组合物中的实施方案中，配制组合物使得每种噬菌体可以以与组合物中任何其他噬菌体的量(例如浓度)相比1:10至10:1(或两者之间的任何子值或范围，包括端点)的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:1的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:2的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:3的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:4的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:5的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:6的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:7的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:8的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:9的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约1:10的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约10:1的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约5:1的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约10:3的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约5:2的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约2:1的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约5:3的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约10:7的比率存在。在实施方案中，每种噬菌体以与组合物中一种或多种其他噬菌体相比大约5:4的比率存在。
包括在组合物中的噬菌体可以通过本领域已知的任何适当方法繁殖。例如，一种或多种噬菌体可以在能够支持噬菌体生长的宿主细菌菌株中分开培养。典型地，噬菌体将在所述宿主细菌菌株中培养至高浓度，滴定并且组合以形成组合物。使用的每种噬菌体的量(例如，在噬菌体组合物、方法或用途中)将取决于其对于目标细菌菌种的毒力。
使用的每种噬菌体的量(例如，在噬菌体组合物、方法或用途中)将取决于其对于目标细菌菌种的毒力。
计数(count)细菌菌株可以用于开发组合物，计数细菌菌株即为指示组合物(例如，组)的单个预期成员的细菌菌株。计数菌株可以允许噬菌体组合物的一个预期成员比另一个有至少1000倍更多的空斑形成。由此，可以获得对各种各样的细菌分离株始终有效的组合物(例如，组)。
典型地，所述一种或多种噬菌体可以组合形成组合物，所述组合物在每毫升(ml)组合物中包括至少大约1x 105、1x106、1x107、1x108、1x109或1x1010或1x1011空斑形成单位(PFU)的每种噬菌体。组合物可以包括1x105至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物可以包括1x105至1x106PFU、1x105至1x107PFU、1x105至1x108PFU、1x105至1x109PFU或1x105至1x1010PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物可以包括1x106至1x107PFU、1x106至1x108PFU、1x106至1x109PFU、1x106至1x1010PFU或1x106至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物可以包括1x107至1x108PFU、1x107至1x109PFU、1x107至1x1010PFU或1x107至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物可以包括1x108至1x109PFU、1x108至1x1010PFU或1x108至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物可以包括1x109至1x1010PFU或1x109至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物可以包括1x1010至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，一种或多种噬菌体可以组合形成组合物，所述组合物可以包括1x 105、1x106、1x107、1x108、1x109或1x1010或1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在一些实施方案中，组合物包括相等(或基本上相等)浓度的其中所包括的每种噬菌体。适当的浓度包括在所示范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些方面，组合物中的噬菌体是纯化的或基本上纯化的。
当选择包括在组合物中的噬菌体时，所述方法包括：(a)提供两种或更多种不同噬菌体，其中所述两种或更多种不同噬菌体中的每一种独立地阻滞葡萄球菌种或菌株在限定生长条件下的生长；(b)组合所述两种或更多种不同噬菌体；和(c)在存在所述两种或更多种不同噬菌体的组合的情况下确定所述葡萄球菌种或菌株的生长，其中所述葡萄球菌种或菌株生长条件在步骤(a)和(c)中相同或等同；其中，如果所述组合阻滞所述葡萄球菌种或菌株的生长至少等于通过所述两种或更多种不同噬菌体的任一种独立地实现的最大生长阻滞，则所述组合被接受为噬菌体组合物。在实施方案中，如果所述组合阻滞目标细菌菌种或菌株的生长小于通过所述两种或更多种不同噬菌体的任一种独立地实现的最大生长阻滞，则该组合最初被拒绝作为噬菌体的组合物。
本文提供了噬菌体组合物，其包括噬菌体Sa87、J-Sa36和Sa83(和任选地其突变体和同一性变体)中的一种或多种。噬菌体组合物包括Sa87、J-Sa36和Sa83或者基本上由其组成。噬菌体组合物包括这样的噬菌体或基本上由其组成：所述噬菌体具有与本文所述的噬菌体或噬菌体序列具有90％-100％同一性的核苷酸基因组序列。例如，在一方面，噬菌体组合物可以包括具有与Sa87、J-Sa36和Sa83的基因组序列(或本文所述的任何其他序列)具有至少93％但非100％同一性的噬菌体或者基本上由其组成。在实施方案中，组合物中仅存在具有与Sa87、J-Sa36和/或Sa83的基因组序列具有至少93％同一性的核苷酸基因组序列的噬菌体。在一些实施方案中，组合物中的噬菌体由具有与Sa87、J-Sa36和/或Sa83中至少一种的基因组序列具有至少93％同一性的核苷酸基因组序列的噬菌体组成，并且组合物中不存在其他(可检测的)噬菌体。在实施方案中，组合物中存在的靶向金黄色葡萄球菌的唯一噬菌体是具有与Sa87、J-Sa36和/或Sa83的基因组序列具有至少93％同一性的核苷酸基因组序列的噬菌体。在实施方案中，具有与Sa87、J-Sa36和/或Sa83的基因组序列具有至少93％同一性的核苷酸基因组序列的噬菌体与Sa87、J-Sa36和/或Sa83的基因组序列不具备100％同一性。在一些实施方案中，组合物包括至少一种本文所述的噬菌体，或至少两种、至少三种或更多种。在一些实施方案中，组合物包括Sa87、J-Sa36和Sa83中的一种或多种噬菌体，和与其至少之一具有至少90-99％序列同一性的一种或多种其他噬菌体，或至少一种对金黄色葡萄球菌有效的其他噬菌体。
在一些实施方案中，噬菌体组合物可以进一步包含一种或更多种另外的噬菌体。所述一种或更多种另外的噬菌体可靶向金黄色葡萄球菌种或菌株，或靶向不同的细菌靶标，例如选自下列属中的一种或多种：葡萄球菌属(Staphylococcus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、脑膜炎球菌属(Meningococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、梭菌属(Clostridium)、军团菌属(Legionella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)或其组合。
所述一种或更多种另外的噬菌体可以是在WO 2009/044163(对于所有其噬菌体、组合物、组合物组分/赋形剂和使用方法，通过参考完整地结合于此)中教导的一种，其中所述的噬菌体K和/或噬菌体P68。
在一些实施方案中，噬菌体组合物包括一种或多种噬菌体和用于储存的保存剂。储存包括冷冻、冷藏和室温储存。在一个实施方案中，保存剂是甘油。在一个实施方案中，保存剂以足以保存组合物的量存在于所述组合物中(例如，在储存在冷冻柜或超级冷冻柜中(例如，在大约0℃至大约-80℃、更优选大约-20℃至大约-80℃和最优选大约-80℃的温度下)或在液氮中)。在另一个实施方案中，保存剂以足以在长期储存期间(例如，在冷冻柜或超级冷冻柜或液氮中)保存组合物的量存在于所述组合物中。在一个实施方案中，保存剂是大约5％至大约50％的甘油；更优选大约10％至大约30％的甘油；最优选大约20％的甘油。适当的浓度可以是在所述范围内的任何值或子值，包括端点。
制剂
本文提供了噬菌体组合物，其包括一种或多种本文所述的噬菌体的或基本上由其组成。在一些方面，组合物可以基本上不含细菌组分，诸如例如细菌内毒素、细菌宿主细胞组分和材料(例如，蛋白质)等。在一些实施方案中，组合物可以包含一种或多种专性裂解性噬菌体。所述一种或多种噬菌体可以包括核酸，例如基因组，其包括与SEQ ID NO:1-10中一个或多个具有90％-100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，至少一种或多种噬菌体与SEQ ID NO:1-10中任一、优选与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少93％但非100％的核酸序列同一性。每种单个噬菌体可以是不易于普遍性转导和/或不携带抗生素抗性基因的噬菌体。噬菌体可以是天然存在的或非天然存在的。在一些实施方案中，例如，在具有多于一种噬菌体的组合物中，至少一种可以是天然存在的，至少一种可以是非天然存在的，或者都不可以是天然存在的。组合物任选地可以包括冷冻保护剂或赋形剂。赋形剂可以例如稳定噬菌体功效或减少功效随时间损失。
在一些实施方案中，本文提供的噬菌体组合物另外包括药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或其组合。适当的载体、稀释剂和/或赋形剂可以包括等渗盐水溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水。“药学可接受的赋形剂”和“药学可接受的载体”是指这样的物质，其帮助活性剂向受试者的施用和/或活性剂被受试者吸收，并且可以被包括在本发明的组合物中而不导致对患者的显著不利毒理学作用。药学可接受的赋形剂的非限制性实例包括：水，NaCl，生理盐水溶液，乳酸化林格氏液，生理蔗糖，生理葡萄糖，粘合剂，填料，崩解剂，润滑剂，包衣，甜味剂，调味剂，盐溶液(诸如林格氏液)，醇，油，明胶，糖如乳糖、直链淀粉或淀粉，脂肪酸酯，羟甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮和颜料等等。该制剂可以是无菌的并且如果需要与辅助剂诸如润滑剂、保存剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐(例如用于影响渗透压)、缓冲液、着色剂和/或芳香物质等(其不会与本发明的化合物有害地反应)混合。本领域技术人员将认识其他药学赋形剂可用于本发明中。
本文所述的噬菌体组合物可以配制为消毒剂组合物。该消毒剂组合物可以是表面用喷雾剂或液体洗涤液的形式。组合物可以是洗手液。适当地当组合物是用于局部施用的制剂时，它采取洗剂、霜剂、软膏剂、糊剂、凝胶剂、泡沫剂的形式，或作为通常已知用于局部施用的载体的任何其他物理形式。这种增稠的局部制剂是特别有利的，因为制剂粘附在放置材料的皮肤区域上，因此使得能够将局部高浓度的噬菌体引入待消毒的特定区域。例如，在本领域中通常已知的是基于石蜡和羊毛脂的霜剂，其特别适用于将产品应用于鼻腔。然而，可以使用其他增稠剂，诸如聚合物增稠剂。制剂还可包含以下一种或多种：水、保存剂、活性表面活性剂、乳化剂、抗氧化剂或溶剂。
本文所述的噬菌体组合物可以配制用于经鼻、口服、肠胃外、肌内、关节内、静脉内、皮下、经皮、眼部或耳部给药。该噬菌体制剂可以直接使用、冷藏、冻干、冷冻在水性或其他溶液中储存(任选地与适当的冷冻保护剂(例如，20％甘油)一起)、冷冻干燥和在使用前再水合、或使得在一些其他制剂(包括但不限于片剂、乳剂、软膏剂或浸渍伤口敷料或其他物品)中稳定。在实施方案中，冷冻保护剂是10-30％甘油。在实施方案中，冷冻保护剂是10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％甘油。在实施方案中，噬菌体组合物包括盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水，含有镁或不含镁)。在实施方案中，噬菌体组合物包括缓冲液。在实施方案中，缓冲液包括钙盐或镁盐。在一个实施方案中，缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水和MgSO4。缓冲液可以包括：1mM至20mM MgSO4，2mM至19mM MgSO4，3mM至17mM MgSO4，4mM至16mM MgSO4，5mM至15mM MgSO4，6mM至14mM MgSO4，7mM至13mM MgSO4，8mM至12mM MgSO4，9mM至11mM MgSO4或大约10mM MgSO4。浓度可以是在所述范围内的任何值或子范围，包括端点。例如，缓冲液可以包括大约1mM MgSO4、大约2mM MgSO4、大约3mM MgSO4、大约4mM MgSO4、大约5mM MgSO4、大约6mM MgSO4、大约7mM MgSO4、大约8mM MgSO4、大约9mM MgSO4、大约10mM MgSO4、大约11mMMgSO4、大约12mM MgSO4、大约13mM MgSO4、大约14mM MgSO4、大约15mM MgSO4、大约16mMMgSO4、大约17mM MgSO4、大约18mM MgSO4、大约19mM MgSO4或大约20mM MgSO4。
噬菌体组合物可以配制用于经鼻、口服、肠胃外、关节内、肌内、静脉内、皮下、经皮、眼部或耳部给药。该噬菌体制剂可以直接使用，冷冻在水性或其他溶液中储存，任选地与适当的冷冻保护剂(例如，10％蔗糖或甘油)一起，储存在冷藏温度，冷冻干燥和在使用前再水合，或使得在一些其他制剂(包括但不限于片剂、乳剂、软膏剂或浸渍伤口敷料或其他物品)中稳定。在一些实施方案中，噬菌体组合物可以包括在静脉递送装置中。
在一些实施方案中，噬菌体组合物是无菌的。该无菌产品可以适合于受试者中的肠胃外给药。
在一些实施方案中，本文提供了气溶胶制剂，其包括本文所述的噬菌体和/或噬菌体组合物/制剂。一些实施方案涉及该气溶胶制剂的方法和用途。
在实施方案中，本文所述的噬菌体组合物配制用于静脉内(IV)施用。静脉内施用可以是通过静脉推注或使用IV袋。
用途/使用方法
本文提供了一种或多种噬菌体或噬菌体组合物作为药物(例如，用于治疗葡萄球菌感染)的用途。还提供了治疗疾病的相应方法，包括将所述一种或多种噬菌体或噬菌体组合物施用于受试者。在一些实施方案中，在美国专利公开No.2017-0065649和WO 2018/146437(对于所有其噬菌体、组合物、组分、赋形剂和方法，通过参考完整地结合于此)中所述的疾病/病症的治疗被特别排除在本文所述的方法之外。例如，在一些实施方案中，可以特别排除治疗肺部感染的方法。
一方面，提供了用于治疗细菌感染的噬菌体组合物。在相关方面，提供了噬菌体组合物在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途，以及治疗细菌感染的方法，所述方法包括将噬菌体组合物施用于受试者。
一方面，本文提供了一种治疗细菌感染的方法，包括选择具有证实的葡萄球菌感染的受试者，和施用本文所述的噬菌体组合物。在一个实施方案中，该方法包括选择具有对使用一种或多种抗生素的治疗没有响应的葡萄球菌感染的受试者。
噬菌体组合物用于治疗葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌)细菌感染。在一个实施方案中，细菌感染是鼻窦感染、鼻感染或呼吸道感染。在一个实施方案中，细菌感染是鼻窦炎。在一个实施方案中，细菌感染是尿路感染(或并发尿路感染)、腹腔内感染(或并发腹腔内感染)、败血症(例如，由于烧伤、失控菌血症导致的败血症)或菌血症(例如，由于肺炎、尿路感染、心内膜炎等导致)。在一个实施方案中，细菌感染是移植物感染，诸如心脏移植物感染(例如，心室辅助装置感染；起搏器感染)或人工关节感染。在一个实施方案中，细菌感染是心内膜炎或人工瓣膜心内膜炎。在一个实施方案中，细菌感染是皮肤感染或皮肤结构感染。在优选实施方案中，细菌感染不是肺部感染。在一个实施方案中，细菌感染是院内感染或医院感染。
在一些实施方案中，感染的特征在于存在细菌生物膜。
在一些实施方案中，受试者具有对一种或多种抗生素不响应的细菌感染。在一些实施方案中，受试者具有对于标准护理抗生素不响应的细菌感染。
在实施方案中，在给药之前，测试来自受试者的一种或多种细菌分离株对于细菌组合物的敏感性。
本文所述的用途或方法典型地包括将本文所述的噬菌体组合物施用于受试者。如本文所用，“受试者”是哺乳动物，诸如人或其他动物。优选地，术语“受试者”是指人受试者。在一个实施方案中，受试者是具有葡萄球菌感染(例如，金黄色葡萄球菌感染)的人受试者。
可以将噬菌体组合物以治疗有效量或预防有效量施用于受试者。
如本文所用，“治疗有效量”是当单独或组合施用于受试者以治疗细菌感染(或其症状)时，足以实现对感染或其症状的这种治疗的组合物的任何量。
如本文所用，“预防有效量”是当单独或组合施用于受试者时，抑制或延迟细菌感染(或其症状)的发作或复发的组合物的任何量。在一些实施方案中，预防有效量完全防止细菌感染的发作或复发。“抑制”发作意味着减少细菌感染发作(或其症状)的可能性，或完全预防发作。
合适的剂量范围是产生所需治疗效果的剂量范围(例如，组合物以治疗或预防有效量给药)。
在一个实施方案中，受试者是具有葡萄球菌感染(例如，金黄色葡萄球菌感染)的人受试者。在实施方案中，组合物包括1x105至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物包括1x105至1x106PFU、1x105至1x107PFU、1x105至1x108PFU、1x105至1x109PFU或1x105至1x1010PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物包括1x106至1x107PFU、1x106至1x108PFU、1x106至1x109PFU、1x106至1x1010PFU或1x106至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物包括1x107至1x108PFU、1x107至1x109PFU、1x107至1x1010PFU或1x107至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物包括1x108至1x109PFU、1x108至1x1010PFU或1x108至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物包括1x109至1x1010PFU或1x109至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，组合物可以包括1x1010至1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，噬菌体组合物施用于受试者的剂量为至少大约1x105PFU每种噬菌体、至少大约1x106PFU每种噬菌体、至少大约1x107PFU每种噬菌体、至少大约1x108PFU每种噬菌体、至少大约1x109PFU每种噬菌体、至少大约1x1010PFU每种噬菌体或至少大约1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，一种或多种噬菌体可以组合以形成组合物，该组合物包括1x 105、1x106、1x107、1x108、1x109或1x1010或1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。剂量包括在所述范围内的任何值或范围，包括端点。
在一些实施方案中，本文提供的噬菌体组合物施用于受试者的剂量为至少大约1x105PFU全部噬菌体、至少大约1x106PFU全部噬菌体、至少大约1x107PFU全部噬菌体、至少大约1x108PFU全部噬菌体、至少大约1x109PFU全部噬菌体、至少大约1x1010PFU全部噬菌体或至少大约1x1011PFU全部噬菌体。噬菌体组合物的施用剂量是大约1x105至大约1x1011PFU全部噬菌体/ml组合物。在实施方案中，噬菌体组合物的施用剂量是大约1x105至大约1x106PFU、大约1x105至大约1x107PFU、大约1x105至大约1x108PFU、大约1x105至大约1x109PFU或大约1x105至大约1x1010PFU全部噬菌体/ml组合物。在实施方案中，噬菌体组合物的施用剂量是大约1x106至大约1x107PFU、大约1x106至大约1x108PFU、大约1x106至大约1x109PFU、大约1x106至大约1x1010PFU或大约1x106至大约1x1011PFU全部噬菌体/ml组合物。在实施方案中，噬菌体组合物的施用剂量是大约1x107至大约1x108PFU、大约1x107至大约1x109PFU、大约1x107至大约1x1010PFU、或大约1x107至大约1x1011PFU每种噬菌体/ml组合物。在实施方案中，噬菌体组合物的施用剂量是大约1x108至大约1x109PFU、大约1x108至大约1x1010PFU或大约1x108至大约1x1011PFU全部噬菌体/ml组合物。在实施方案中，噬菌体组合物的施用剂量是大约1x109至大约1x1010PFU或大约1x109至大约1x1011PFU全部噬菌体/ml组合物。在实施方案中，噬菌体组合物的施用剂量是大约1x1010至大约1x1011PFU全部噬菌体/ml组合物。剂量可以是3x109PFU/ml组合物。剂量包括所述范围内的任何值或范围，包括端点。
在一些实施方案中，噬菌体组合物每天施用至少一次、两次、三次或四次。适当地，噬菌体组合物可以一天施用两次。因此，在一个实施方案中，将至少大约1x105PFU每种噬菌体的剂量每天施用至少一次、两次、三次或四次。因此，在一个实施方案中，将至少大约1x106PFU每种噬菌体的剂量每天施用至少一次、两次、三次或四次。在另一个实施方案中，每天施用至少大约1x107PFU每种噬菌体至少一次、两次、三次或四次。在另一个实施方案中，每天施用至少大约1x108PFU每种噬菌体至少一次、两次、三次或四次。在另一个实施方案中，每天施用至少大约1x109PFU每种噬菌体至少一次、两次、三次或四次。在另一个实施方案中，每天施用至少大约1x1010PFU每种噬菌体至少一次、两次、三次或四次。在另一个实施方案中，每天施用至少大约1x1011PFU每种噬菌体至少一次、两次、三次或四次。可以每天施用剂量范围为大约1x105PFU每种噬菌体至大约1x1011PFU每种噬菌体至少一次、两次、三次或四次。优选地，可以每天施用剂量范围为大约1x107PFU每种噬菌体至大约1x109PFU每种噬菌体至少一次、两次、三次或四次。
在一些实施方案中，每2小时、每4小时、每6小时、每8小时、每12小时、每24小时、每48小时或每72小时施用噬菌体组合物。在一些实施方案中，每2小时施用噬菌体组合物。在一些实施方案中，每4小时施用噬菌体组合物。在一些实施方案中，每6小时施用噬菌体组合物。在一些实施方案中，每8小时施用噬菌体组合物。在一些实施方案中，每12小时施用噬菌体组合物。在一些实施方案中，每24小时施用噬菌体组合物。在一些实施方案中，每48小时施用噬菌体组合物。在一些实施方案中，每72小时施用噬菌体组合物。施用频率包括在所述范围内的任何值或范围，包括端点。
在一些实施方案中，施用噬菌体达至少一天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周或超过10周。在一些实施方案中，施用噬菌体组合物达至少一天。在一些实施方案中，施用噬菌体组合物达至少一周。在一些实施方案中，施用噬菌体组合物达至少两周。在一些实施方案中，施用噬菌体组合物达至少三周。在一些实施方案中，施用噬菌体组合物达至少四周。在一些实施方案中，施用噬菌体组合物达至少五周。在一些实施方案中，施用噬菌体组合物达至少六周。在一些实施方案中，施用噬菌体组合物达大约3天至大约100天。在一个实施方案中，施用噬菌体组合物达大约7天至大约60天。在一个实施方案中，施用噬菌体组合物达大约14天至大约30天。在一个实施方案中，施用噬菌体组合物达大约3天至大约28天。在一个实施方案中，施用噬菌体组合物达至少14天。在一个实施方案中，施用噬菌体组合物达大于14天。施用的持续时间包括在所述范围内的任何值或范围，包括端点。
用作药物的噬菌体组合物可以通过任何途径施用，所述途径基于待治疗的病症选择。在一个实施方案中，施用途径是经鼻、口服、肺部、肠胃外、肌内、关节内、静脉内、皮下、经皮、眼部、耳部或它们的组合。当用于治疗肺部细菌感染时，噬菌体组合物可以经鼻或口服施用，例如使用适当的肺部递送装置如吸入器、雾化器或呼吸器通过气溶胶化或气雾化。组合物可以通过多于一种途径例如静脉内和通过吸入、或静脉内和关节内施用于患者。
在一个实施方案中，抗生素(适当地化学抗生素)可以与噬菌体组合物组合施用。抗生素和噬菌体的组合施用在WO 2008/110840和WO 2005/009451中教导，该教导关于所有其组合物、噬菌体、组分/赋形剂和方法通过参考完整地结合于此。抗生素可以与噬菌体组合物同时或顺序施用。适当地，可以在组合物后施用一种或多种抗生素，以便在抗生素治疗开始前已经建立噬菌体复制。在这种情况下，抗生素治疗可以从施加一种或多种噬菌体后延迟一个或多个小时或一天或多天，例如1至2、3、4、5、6、7、8、9或10天。当使用包含多个噬菌体的噬菌体组合物(组合物的每个成员显示不同的菌株特异性)时，它满足组合物的至少一部分(例如，一种或多种噬菌体)能够靶向细菌感染。
因此，在一些实施方案中，噬菌体组合物包含一种或多种抗生素，诸如一种或多种化学抗生素。抗生素的选择可以基于葡萄球菌菌种或菌株对于所述抗生素的敏感性。抗生素包括选自包括下述抗生素种类的抗生素：氟喹诺酮类(fluoroquinolone)，碳青霉烯类(carbapenem)，氨基糖苷类(aminoglycoside)，安莎霉素类(ansamycin)，头孢菌素(cephalosporin)，青霉素(penicillin)，β内酰胺，β内酰胺酶抑制剂，叶酸途径抑制剂，fucidane，糖肽，甘氨酰环素(glycylcycline)，林可酰胺(lincosamide)，脂肽，大环内酯，噁唑烷酮(oxazolidinone)，苯尼考膦酸(phenicol phosphonic acid)，链阳性菌素(streptogramin)或四环素(tetracycline)。在一些实施方案中，可以从本文的组合物和方法中特别排除一种或多种上述抗生素。在一些实施方案中，抗生素可以用作并非同一组合物的一部分的联合治疗。适当地，葡萄球菌菌种或菌株可以是在待治疗的受试者中存在的相同菌种或菌株。在一个实施方案中，从待治疗的受试者中取出葡萄球菌菌种或菌株并测试抗生素敏感性。可以通过本领域已知的体外敏感性测定确定敏感性。
备选地或另外地，可以选择抗生素，因为已知其针对细菌有活性，所述细菌已知(或认为可能)与待治疗的葡萄球菌感染一起存在(例如，作为细菌生物膜的一部分)。
在一个实施方案中，抗生素是选自以下中的一种或多种：万古霉素、替考拉宁、青霉素、甲氧西林、氟氯西林、双氯西林、头孢菌素(例如，头孢唑啉、头孢金素、头孢氨苄)、氯林霉素，林可霉素、红霉素或其组合。适当地，抗生素可以是万古霉素和/或替考拉宁。在一些实施方案中，可以从本文的组合物和方法中特别排除一种或多种上述抗生素。
本文提供了用途或方法，包括体内施用噬菌体组合物于受试者；体外监视来自感染(存在于受试者中)的细菌细胞或来自同一菌株的另一感染的细菌细胞样品对于一种或多种抗生素的敏感性；和施用所述一种或多种抗生素，其中已经确定已经诱导了对于所述一种或多种抗生素的敏感性。
在一个实施方案中，本文提供了一种通过施用本文所述的组合物来恢复对一种或多种抗生素的敏感性的方法。在一个实施方案中，提供了通过施用本文所述的组合物来破坏生物膜的方法。在一个实施方案中，提供了通过施用本文所述的组合物来消除生物膜的方法。
在一个实施方案中，以通过所述组合物诱导采样细菌对于抗生素的敏感性的时间段施用抗生素(例如，化学抗生素)。在一些实施方案中，时间段可以是6小时、12小时、24小时或48小时。在其他实施方案中，噬菌体组合物和抗生素可以以下述间隔施用：分开一天至两个月的间隔，优选以分开一至四周的间隔，适当地以分开两周的间隔。
在一个实施方案中，提供了通过施用本文所述的组合物来恢复对一种或多种抗生素的敏感性的方法。在一个实施方案中，提供了通过施用本文所述的组合物来破坏生物膜的方法。在一个实施方案中，提供了通过施用本文所述的组合物来消除生物膜的方法。
在一个实施方案中，噬菌体组合物可以用于杀死表面上的葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌)的方法中，所述方法包括将噬菌体组合物(配制为消毒剂组合物)施用于所述表面。适当地，所述表面是污染场所或者预期的污染场所。
在一个实施方案中，所述表面是哺乳动物(例如，人)的皮肤。备选地或另外地，所述表面可以是设备(适当地，医疗设备)、床具、家具、墙壁或地板(例如，在临床环境中)。
一些方面涉及例如试剂盒，其包含：噬菌体组合物；及其使用说明(例如，在医学中)。试剂盒可以进一步包含抗生素(例如，化学抗生素)和任选地将其与噬菌体组合物组合使用的使用说明。
在一个实施方案中，使用说明提供了关于剂量给药本文所述的噬菌体组合物的详情。在一个实施方案中，包括在试剂盒中的使用说明是关于在治疗葡萄球菌感染中的用途。
一些方面涉及例如噬菌体组合物或试剂盒用于非医疗应用的用途。例如，噬菌体组合物或试剂盒可以用于食品卫生、农业或作物保护和/或环境卫生应用。因此，在一个实施方案中，试剂盒包括关于将噬菌体组合物用于非医疗应用的使用说明。
噬菌体组合物也可以包含在绷带或伤口敷料中。伤口敷料可以是垫或有粘性的石膏型敷料。噬菌体可以作为消毒制剂或局部霜剂施加到伤口敷料或绷带，之后施加到伤口敷料或绷带。备选地，伤口敷料或绷带可以浸入包含噬菌体的载体中并且干燥以将所述噬菌体浸渍在所述敷料或绷带中。噬菌体也可以使用本领域公知的技术吸附在绷带或伤口敷料的表面上。该方法的优点是绷带或伤口敷料允许噬菌体与可能含有细菌的伤口接触。例如，一方面涉及通过将绷带或伤口敷料施用于受试者来抑制或处理细菌的方法。
噬菌体组合物特别有益于医学用途，并且在治疗葡萄球菌感染中显示临床功效。
另外地，噬菌体组合物对于广谱的葡萄球菌菌种和菌株有效。
噬菌体组合物和抗生素(例如，化学抗生素)的组合可以提供相对于单独抗生素疗法的增强的(例如协同的)治疗剂。
除非另外指出，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
本发明不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方案。数字范围包括限定范围的数字。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，其可以通过参考整个说明书获得。因此，通过参考整个说明书，可以更全面地定义下面紧接被定义的术语。
术语的其他定义可以出现在整个说明书中。在更详细地描述示例性实施方案之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，并且因此可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，还具体公开了该范围的上限和下限之间的介于下限单位的十分之一的每个中间值。本发明涵盖在规定范围内的任何规定值或中间值与规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且涵盖了在该较小范围中包括任一个端点、不包括端点或包括两个端点的每个范围，其在规定范围内的端点受任何特别的排除。当规定的范围包括一个或两个端点的情况下，则本发明还包括排除这些端点中的一个或两个的范围。
本文讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供的。本文中的任何内容均不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。本文引用的所有出版物关于它们的所有教导(包括但不限于所有噬菌体、组合物、组分、赋形剂和方法)通过参考完整地结合于此。
实施例
实施例1:3噬菌体组合物的组装
进行实验以产生满足以下标准的噬菌体疗法：1)专性裂解的，以避免细菌基因的局限性转导；2)未知的(通过经验测试和/或从基因组学推断)，以易于普遍性转导，和3)完全测序，以避免噬菌体具有已知携带抗生素抗性的基因或细菌毒力基因，和帮助评估其他生活方式特性。
总之，一起用来治疗患者的噬菌体应当：1)具有针对目标病原体而非其他物种的广谱活性，以最大化潜在功效和最小化脱靶效应，和2)能够互补，其中对一种噬菌体产生抗性的突变体对于另一种噬菌体敏感。
除了噬菌体它们本身的特征以外，用于临床应用的材料应当以这种方式生产，以便确信最终产品保持这些特征(即，仍然为相同噬菌体)并且不含潜在有害的(或有害量的)杂质，如内毒素或宿主细胞蛋白。
每种选择的噬菌体分离自环境来源并且随后与充分表征的金黄色葡萄球菌菌株(其用作噬菌体的制造宿主)配对。在传代和迭代选择后，选择候选噬菌体。这些的基因组序列与原始的天然存在的序列是不同的。纯化宿主配对的噬菌体，以确保获得的原种(masterstock)产生遗传学上和表型上一致的多批次的每种噬菌体。除非另外指出，所有数据来源于宿主配对的、空斑纯化的噬菌体。使用植物蛋白胨培养基(VP0101，Oxoid，UK)，噬菌体在液体培养物中繁殖。将裂解液通过0.2μm滤器以去除大的细胞碎片，并且根据随后测试的需要，任选地进行基于柱的纯化步骤的专门工艺，以进一步去除宿主细胞蛋白和其他细菌碎片，并且用含有10mM硫酸镁的磷酸缓冲盐水(PBS)(PBS+Mg)替换生长培养基。将相等浓度的每种噬菌体合并以形成噬菌体混合物(已知为AB-SA01)。噬菌体在整个储存和生产过程中在遗传学上一致。
细菌:AB-SA01制造宿主是最初分离自人的金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌多样性组和菌种特异性组源于美国典型培养物保藏中心(Manassas，USA)、多药耐药性生物储存和监视网络沃尔特里德陆军研究所(Walter Reed Army Institute of ResearchMultidrug-resistant Organism Repository and Surveillance Network(“MRSN”，Silver Spring，USA))和澳大利亚以及英国的临床地点。金黄色葡萄球菌菌株的全球监视组获自JMI Laboratories(North Liberty，USA)。目标感兴趣的组包括来自比利时的慢性鼻窦炎(CRS)菌株和来自疾病控制中心(CDC)和食品药物管理局(FDA)抗微生物抗性分离株库(Atlanta，USA)的万古霉素中度耐药性(VISA)菌株。多药耐药(MDR)和广泛耐药(XDR)菌株的定义是根据Magiorakos等(Clin Microbiol Infect 18(3):268-281，2012)。
噬菌体敏感性测定：关于金黄色葡萄球菌组的测试使用心浸液肉汤，对于平板另加1.5％琼脂或对于覆盖层(overlays)加0.7％琼脂。使用小滴琼脂覆盖法的改进(Mazzocco等，Methods Mol Biol.2009；501:81-5，2009)，评估噬菌体活性。简而言之，将100μL的16-18h浮游细菌培养物与熔融的0.7％顶层琼脂混合，并且均匀倒在琼脂平板上。当顶层琼脂层固定后，将系列稀释的标准化噬菌体溶液点在覆盖层和平板上，并在37℃孵育过夜。通过在噬菌体施加位点的细菌菌苔的清除，和通过随着噬菌体样品稀释时单个空斑的形成，指示噬菌体活性。仅当样品稀释时可以观察到离散的空斑(表明噬菌体复制)的时候，菌株被认为是敏感的。类似地进行对于菌种特异性组的测试，其使用对于特定细菌菌种推荐的培养基和适合于生产均匀菌苔的细菌培养物体积。
抗性和互补频率:在产物选择期间进行的互补研究使用表观噬菌体不敏感突变体(BIM)菌落，其在用单独的候选噬菌体感染敏感的金黄色葡萄球菌菌株后分离的。将菌落在琼脂平板上划线纯化。为筛选噬菌体敏感性，将10μL的PBS或噬菌体的点液(～1×109PFU/mL；PFU:空斑形成单位)点在营养琼脂平板上。在10min后，将来自每个BIM或亲本菌株的5μL过夜营养肉汤培养物施加于每个噬菌体斑点。在37℃孵育24h后，将噬菌体+细菌点和PBS+细菌对照比较并且评分为R(抗性；与对照点无区别)、I(中度，在细菌点内观察到噬菌体活性)或S(敏感，在点中观察到<10个细菌菌落)。对于最终AB-SA01组合物，使用O’Flynn等(2004Appl Environ.Microbio.70(6):3417-3424)的改进形式，评估一式三份的相同金黄色葡萄球菌菌株群体中自发噬菌体抗性的频率。在200μL中，将6-8×108CFU(菌落形成单位)与2-3×109PFU的纯化噬菌体(AB-SA01或单独组分)混合，在37℃孵育10min，然后与3mL熔融0.4％营养琼脂混合并倒在10mm圆的1.5％营养琼脂平板上。在37℃孵育24h和48h后对细菌菌落计数。BIM的表观频率计算为在每个测试平板上的菌落数除以在该复制品(replicate)中细菌的输入数。使用重复测量值ANOVA比较结果，并且使用配对t检验进行AB-SA01和3组分噬菌体之间的事先比较。将来自每个噬菌体+宿主组合的多至10个BIM(如果<10个，则所有BIM)在琼脂板上划线纯化，并使用噬菌体敏感性测试的点稀释法测试可遗传的抗性的存在。
基因组测序和分析:噬菌体基因组DNA纯化自过滤的裂解液或纯化的制备物，并且使用无PCR文库通过Illumina双端(ACGT)或PacBio技术(Expression Analysis)测序。使用myRAST进行注释。注释的蛋白与整合酶以及注释的基因与细菌毒力或抗生素抗性基因的相似性是如下评估的：使用blast搜索，要求跨越50％的所述序列的至少30％同一性，和E≤0.05；基于诸如命中的原始注解的可能准确性和来自通过HHPred(Soding等.2005，Bioinformatics.21(7):951-960；Soding等.2005，Nucl.Acid Res.33(增刊2):W244-W248，2005)预测的二级结构的证据的因素，人工检查任何命中的有效性。使用ProgressiveMauve利用系统默认参数(Darling等.2004,Genome Res 14(7):1394-1403)进行基因组比对。
动物研究:将纯化的噬菌体物质用于所有动物研究。AB-SA01:将三组五只雌性BALB/c小鼠麻醉，并且将3.0×108CFU的甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌菌株Xen29(Perkin Elmer)的接种物以35μL的体积鼻内(IN)递送。在感染后2和6小时(hpi)，未处理的对照接受50μL PBS-Mg IN，噬菌体处理组以50μL IN剂量接受5×108PFU/噬菌体。在2、6和12hpi，抗生素对照以SC注射接受110mg/kg万古霉素。在24hpi，小鼠通过吸入CO2安乐死，并且处理肺以获得细菌滴度。在Mueller Hinton琼脂上计算细菌计数，并使用ANOVA在log10-转换值上将处理组与对照比较，使用与对照的Dunnett’s检验多重比较。在两个小鼠研究后，如前所述测试从小鼠肺组织回收的细菌的噬菌体敏感性。
AB-SA01组分噬菌体的物理化学性质：当对它们配对的金黄色葡萄球菌宿主涂板时所有三种AB-SA01组分噬菌体产生小的透明的空斑。三种AB-SA01组分噬菌体的透射电子显微镜(TEM)图像显示了直的可收缩尾部和窄的颈部，这些是属于有尾噬菌体目(Caudovirales)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体的特征(图1)。
从无扩增文库将所有AB-SA01组分噬菌体测序，其能够揭示基因组区域的相对频率。测序读取映射(read-mapping)数据显示大约双倍覆盖率的区域，其鉴定了基因组末端和相关的大约8至10kb的固定直接末端重复序列。该基因组结构表明与普遍性转导不相关的序列特异性的包装机制。共线单拷贝组分噬菌体基因组的成对相关性范围为93至97％核苷酸同一性(图2)，并且全部与充分研究的金黄色葡萄球菌肌病毒噬菌体K相关。在AB-SA01组分噬菌体基因组中没有发现可识别的整合酶，并且在三种噬菌体的每一个中大约200个预测噬菌体基因中没有一个与已知的细菌毒力或抗生素抗性基因类似。
AB-SA01的体外活性
AB-SA01的目标菌种是金黄色葡萄球菌。整体上，401个临床金黄色葡萄球菌分离株中的94％对AB-SA01敏感(表1)，包括已知为MDR的205个分离株中的95％，并且遗传谱系、分离年代或感染类型几乎没有表观变异。当在代表性的正常人微生物群和相关葡萄球菌上测试时，AB-SA01及其组分噬菌体显示了针对五种表皮葡萄球菌测试菌株中的两种的一些活性，但是没有跨属活性(表2)。当在金黄色葡萄球菌菌株上测试时，没有观察到在组分噬菌体之间干扰的证据。对于AB-SA01观察到的滴度大部分与组分噬菌体活性一致，一些情形可能具有协同作用，其中即使组分噬菌体都不产生空斑，AB-SA01产生了空斑。另外，将当与Sa87、J-Sa36或Sa83中任一比较时在整个基因组上具有小于10％核酸变化的噬菌体针对七个金黄色葡萄球菌分离株进行测试。关于两个噬菌体的代表性数据显示在表3中。
部分基于68-成员多样性组，选择AB-SA01组分噬菌体，所述68-成员多样性组包括所有主要社区获得型(CA-)和医院获得型(HA-)MRSA谱系的代表(Stefani等.2012，Int JAntimicrob Agents 39(4):273-282；Otter等.2010，Lancet Infect Dis 10(4):227-239.)。每个组分噬菌体具有不同的宿主范围，大多数细菌菌株对于超过一种的AB-SA01噬菌体敏感。AB-SA01活性在各组分离株中是类似高的，所述各组分离株代表近年来全球流行的来自血液、伤口、肺、泌尿和其他感染的金黄色葡萄球菌。使用目标感兴趣的组，AB-SA01也显示具有针对以下的活性：具有相对稀少但是关注的VISA表型的菌株，完全CRS分离株组和各种各样的临床上重要的USA300谱系。
表1.针对金黄色葡萄球菌的噬菌体活性
Figure BDA0002629332220000351
表2.AB-SA01及其组分噬菌体对于除了金黄色葡萄球菌以外的细菌菌种的体外活性
Figure BDA0002629332220000361
Figure BDA0002629332220000371
表3.Sa76和Sa81针对金黄色葡萄球菌分离株的噬菌体活性
Figure BDA0002629332220000372
抗性和互补的频率
在细菌抗性产生的情况下噬菌体彼此互补的潜力被认为是AB-SA01开发的一部分。在敏感型金黄色葡萄球菌菌株上评估六种具有宽范围或不同宿主范围的候选噬菌体。首先测试使用一种噬菌体产生的BIM，以证实它们在划线纯化后是否真正显示降低的噬菌体敏感性，然后通过相同方法测试对其他噬菌体的交叉抗性(表4)。Sa83、Sa81和Sa76相似地能够互补Sa87-诱导的抗性并且先前已经显示非常相似的宿主范围，因此仅保留Sa83作为AB-SA01的一部分。J-Sa37与互补相比更经常地显示了交叉抗性，并且没有包括在AB-SA01中。J-Sa36显示了与Sa87或Sa83不同的互补行为。
表4.在候选噬菌体之间的互补
Figure BDA0002629332220000381
S＝敏感的；I＝中度耐受；R＝抗性
1使用与第1栏相同的噬菌体进行BIM证实。R:抗性(无细菌生长抑制)，I:中度耐受(在细菌点内看到噬菌体活性)，S:敏感的(在细菌点内<10个菌落)，-:未测试
2在划线纯化期间没有回收BIM，因此得出结论是敏感的；无其他测试可能
在AB-SA01组合物完成后，在24h和48h，对AB-SA01抗性的平均表观频率低于对于单个噬菌体观察到的值(表5)。然而，该倾向并非统计学显著的(P>0.05)，可能是因为在该研究中观察到的值接近检测极限。这提示在敏感性金黄色葡萄球菌群体之中AB-SA01抗性的自发频率不大于大约3×10-9。该数字是如下产生的：用观察到的细菌菌落数除以最初存在的细菌细胞的总数。在该研究中观察到的BIM菌落中没有一个可以通过在琼脂平板上再划线来分离，暗示它们在测试平板上的生长不是由于稳定的可遗传的抗性，而是暂时的表型或空间现象，其中在涂板之前在噬菌体-细菌混合物的孵育期间细胞逃脱与噬菌体的接触。
表5.在对AB-SA01及其组分噬菌体敏感的金黄色葡萄球菌群体中内在噬菌体抗性的表观频率
Figure BDA0002629332220000391
实施例2:对人患者的噬菌体施用
将噬菌体混合物施用于具有对单独的抗生素治疗没有响应的金黄色葡萄球菌感染的人患者。该患者患有菌血症、心内膜炎(天然瓣膜)、人工瓣膜心内膜炎或心室辅助装置感染。
将含有大约等比率的三种噬菌体(Sa87、J-Sa36、Sa83，参见美国专利公开No.2017/0065649，其通过参考完整地结合于此)的噬菌体混合物施用于具有金黄色葡萄球菌感染的患者中的四个。噬菌体混合物具有大约96％的金黄色葡萄球菌菌株覆盖率，包括多重耐药分离株。在治疗之前通过软琼脂覆盖小滴测定，确定来自患者的金黄色葡萄球菌分离株的易感性。用3x109PFU的噬菌体混合物通过每12小时的静脉内施用来治疗患者。实施治疗达3至14天，这取决于适应症。患者也施用最佳的可用抗生素疗法(由主治医师确定)。
结果显示，在治疗结束时(通过治疗医师确定为基线迹象和症状的完全消失或显著改善)在用AB-SA01治疗的调整意向治疗人群(mITT，定义为满足临床诊断标准的所有患者，其细菌分离株对AB-SA01敏感并且其接受至少一个剂量的AB-SA01)中75％的患者(即，三个)中治疗成功。治疗是很好耐受的，并且没有治疗相关的严重不利事件。所有治疗的患者除了一个以外都显示了基线迹象和症状的完全消失或显著改善。
施用九十个(90)剂量的AB-SA01。在整个治疗期间，来自患者的细菌分离株保持对所述混合物敏感。
实施例3:在人患者中的噬菌体施用
将噬菌体混合物施用于具有对单独的抗生素治疗没有响应的金黄色葡萄球菌感染的人患者。该患者患有金黄色葡萄球菌感染，包括菌血症和败血症、心内膜炎(天然瓣膜)、人工瓣膜心内膜炎、骨髓炎、心室辅助装置(VAD)感染、人工关节感染或慢性鼻窦炎。
将含有大约等比率的三种噬菌体(Sa87、J-Sa36、Sa83，参见美国专利公开No.2017/0065649，其通过参考完整地结合于此)的噬菌体组合物“混合物”施用于具有金黄色葡萄球菌感染的十五(15)名患者。噬菌体混合物具有大约96％的金黄色葡萄球菌菌株覆盖率，包括多重耐药分离株。在治疗之前通过软琼脂覆盖小滴测定，确定来自患者的金黄色葡萄球菌分离株的易感性。用3x109PFU的噬菌体混合物通过每12小时或一次的静脉内、关节内或窦内施用来治疗患者。施用治疗达3至28天，这取决于适应症。患者也施用最佳的可用抗生素疗法(由主治医师确定)。
结果显示，在治疗结束时(通过治疗医师确定为基线迹象和症状的完全消失或显著改善)在用AB-SA01治疗的调整意向治疗人群(mITT，定义为满足临床诊断标准的所有患者，其细菌分离株对AB-SA01敏感并且其接受至少一个剂量的AB-SA01)中85％的患者(十一个)中治疗成功。一个患者显示改善(7.5％)(“改善”是通过治疗医师确定为基线迹象和症状的临床上有意义的改善)。一个患者在用AB-SA01后显示无改善(“无改善”是通过治疗医师确定为没有基线迹象和症状的消失，或死亡)。
施用超过400+剂量的AB-SA01，包括300+个剂量的静脉内、2个关节和50+个窦内。治疗在所有患者中耐受良好。没有治疗相关的SAE。
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应该理解，要求保护的本发明不应该不适当地限于这些特定的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入后附权利要求的范围内。
实施方案
实施方案1-1.一种治疗受试者中细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一种或多种选自Sa87、J-Sa36、Sa83及其突变体的噬菌体的噬菌体组合物，其中所述细菌感染包括葡萄球菌。
实施方案1-2.实施方案1-1的方法，所述组合物包含至少两种选自Sa87、J-Sa36、Sa83或其突变体的噬菌体。
实施方案1-3.实施方案1-1的方法，所述组合物包含至少三种选自Sa87、J-Sa36、Sa83或其突变体的噬菌体。
实施方案1-4.实施方案1-1的方法，所述组合物包含Sa87、J-Sa36和Sa83或其突变体。
实施方案1-5.实施方案1-1的方法，所述组合物基本上由Sa87、J-Sa36和Sa83或其突变体组成。
实施方案1-6.前述实施方案中任一项的方法，其中当与Sa87、J-Sa36或Sa83比较时，所述突变体在其整个基因组上具有至少75％的序列同一性。
实施方案1-7.前述实施方案中任一项的方法，其中当与Sa87、J-Sa36或Sa83比较时，所述突变体在其整个基因组上具有至少80％的序列同一性。
实施方案1-8.前述实施方案中任一项的方法，其中当与Sa87、J-Sa36或Sa83比较时，所述突变体在其整个基因组上具有至少90％的序列同一性。
实施方案1-9.前述实施方案中任一项的方法，其中当与Sa87、J-Sa36或Sa83比较时，所述突变体在其整个基因组上具有至少95％的序列同一性。
实施方案1-10.前述实施方案中任一项所述的噬菌体组合物，其包含一种或多种噬菌体及其突变体，所述噬菌体具有选自以下的基因组序列：SEQ ID NO.:1，SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.:3。
实施方案1-11.实施方案1-10所述的噬菌体组合物，其包含至少两种噬菌体及其突变体，所述噬菌体具有选自以下的基因组序列：SEQ ID NO.:1，SEQ ID NO.:2，SEQ IDNO.:3。
实施方案1-12.实施方案1-10所述的噬菌体组合物，其包含三种噬菌体及其突变体，所述噬菌体具有选自以下的基因组序列：SEQ ID NO.:1，SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.:3。
实施方案1-13.实施方案1-10至1-12任一项所述的噬菌体组合物，其基本上由具有SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:3的基因组序列的噬菌体或其突变体组成。
实施方案1-14.实施方案1-10至1-12任一项所述的噬菌体组合物，其中当与SEQID NO.:1、SEQ ID NO.:2和/或SEQ ID NO.:3比较时，所述突变体在其整个基因组上具有至少75％的序列同一性。
实施方案1-15.实施方案1-10至1-12任一项所述的噬菌体组合物，其中当与SEQID NO.:1、SEQ ID NO.:2和/或SEQ ID NO.:3比较时，所述突变体在其整个基因组上具有至少80％的序列同一性。
实施方案1-16.实施方案1-10至1-12任一项所述的噬菌体组合物，其中当与SEQID NO.:1、SEQ ID NO.:2和/或SEQ ID NO.:3比较时，所述突变体在其整个基因组上具有至少90％的序列同一性。
实施方案1-17.实施方案1-10至1-12任一项所述的噬菌体组合物，其中当与SEQID NO.:1，SEQ ID NO.:2和/或SEQ ID NO.:3比较时，所述突变体在其整个基因组上具有至少95％的序列同一性。
实施方案1-18.前述实施方案中任一项的方法，其中所述组合物还包含抗生素(例如，化学抗生素)。
实施方案1-19.实施方案3-28的方法，其中所述抗生素是氟喹诺酮类(fluoroquinolone)、碳青霉烯类(carbapenem)、氨基糖苷类(aminoglycoside)、头孢菌素(cephlasporin)、青霉素(penicillin)、β内酰胺或β内酰胺酶抑制剂。
实施方案1-20.前述实施方案中任一项的方法，其中所述组合物还包含药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或其组合。
实施方案1-21.实施方案3-20所述的方法，其中所述药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或其组合包括MgSO4。
实施方案1-22.前述实施方案中任一项的方法，其中所述细菌感染包括金黄色葡萄球菌。
实施方案1-23.前述实施方案中任一项的方法，所述方法还包括向所述受试者施用抗生素(例如，化学抗生素)。
实施方案1-24.实施方案1-23所述的方法，其中所述抗生素是氟喹诺酮类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、头孢菌素、青霉素、β内酰胺或β内酰胺酶抑制剂。
实施方案1-25.前述实施方案中任一项的方法，其中所述细菌感染是特征在于存在细菌生物膜的感染。
实施方案1-26.前述实施方案中任一项的方法，其中所述细菌感染不是肺部感染。
实施方案1-27.前述实施方案中任一项的方法，其中所述细菌感染是鼻窦炎、尿路感染、腹腔内感染、皮肤感染、皮肤结构感染、菌血症、心内膜炎或移植物感染。
实施方案1-28.实施方案1-27的方法，其中所述移植物感染是心脏移植物感染(例如，心室辅助装置感染、起搏器感染)、人工关节感染或人工瓣膜心内膜炎。
实施方案1-29.前述实施方案中任一项的方法，其中所述细菌感染对抗生素具有抗性。
实施方案1-30.前述实施方案中任一项的方法，其中通过所述组合物的气雾化制剂来施用所述组合物。
实施方案1-31.实施方案1-22至1-30中任一项的方法，其中静脉内施用所述组合物。
实施方案1-32.噬菌体组合物，其包含：一种或多种选自Sa87、J-Sa36、Sa83及其突变体的噬菌体，和冷冻保护剂。
实施方案1-33.噬菌体组合物，其包含一种或多种噬菌体和冷冻保护剂，所述噬菌体选自具有选自SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3的基因组序列的噬菌体及其突变体。
实施方案1-34.实施方案1-32或1-33的噬菌体组合物，其中所述冷冻保护剂包括甘油。
实施方案1-35.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述组合物的噬菌体感染并裂解葡萄球菌。
实施方案1-36.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述组合物的噬菌体感染并裂解金黄色葡萄球菌。
实施方案1-37.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述组合物的噬菌体感染并裂解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

Claims (45)

1.一种治疗具有细菌感染的人的方法，所述方法包括向所述人施用组合物，所述组合物包含一种或多种不同的感染并裂解金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)并且具有以下基因组的噬菌体：所述基因组包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％同一性的序列的多核苷酸序列。
2.一种治疗具有证实的非肺部金黄色葡萄球菌感染的人的方法，所述方法包括向所述人施用组合物，所述组合物包含至少两种不同的感染并裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体，并且所述至少两种噬菌体包含基因组，所述基因组包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3和与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％同一性的序列的核苷酸序列，其中所述感染不是肺部金黄色葡萄球菌感染。
3.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少三种不同的噬菌体，所述噬菌体选自具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的多核苷酸序列或与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％同一性的序列的噬菌体。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌感染是鼻窦炎、尿路感染、腹腔内感染、皮肤感染、皮肤结构感染、菌血症、败血症、心内膜炎或移植物感染。
5.权利要求4所述的方法，其中所述移植物感染是心脏移植物感染(例如，心室辅助装置感染、起搏器感染)、人工关节感染或人工瓣膜心内膜炎。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌感染对抗生素具有抗性。
7.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含噬菌体Sa87、J-Sa36和Sa83的组合，所述噬菌体分别包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物基本上不含内毒素。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物基本上不含细菌宿主细胞蛋白。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含药学可接受的赋形剂、载体或其组合。
11.权利要求10所述的方法，其中所述药学可接受的赋形剂、载体或其组合包含钙盐或镁盐。
12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物是液体、半液体、固体、冷冻或冻干制剂。
13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含3x105至3x1011空斑形成单位(PFU)的总噬菌体。
14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含1x105至1x1011PFU的每种噬菌体。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中以一毫升包含3x 109PFU总噬菌体的剂量施用所述组合物。
16.一种改变人中微生物菌群的方法，所述方法包括向所述人施用组合物，所述组合物包含至少两种不同的具有针对金黄色葡萄球菌细菌的裂解性活性的噬菌体，所述至少两种不同的噬菌体选自具有以下基因组的噬菌体：所述基因组包括选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％同一性的序列的核苷酸序列。
17.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含抗生素。
18.权利要求17所述的方法，其中所述抗生素来自选自以下的抗生素类别：氟喹诺酮类，碳青霉烯类，氨基糖苷类，安莎霉素类，头孢菌素，青霉素，β内酰胺，β内酰胺酶抑制剂，叶酸途径抑制剂，fucidane，糖肽，甘氨酰环素，林可酰胺，脂肽，大环内酯，噁唑烷酮，苯尼考膦酸，链阳性菌素和四环素。
19.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用抗生素。
20.权利要求19所述的方法，其中所述抗生素是氟喹诺酮类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、头孢菌素、青霉素、β内酰胺或β内酰胺酶抑制剂。
21.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌感染是特征在于存在细菌生物膜的感染。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述组合物。
23.权利要求1-21中任一项所述的方法，其中关节内施用所述组合物。
24.前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少每6小时施用所述组合物。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少每12小时施用所述组合物。
26.前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少每24小时施用所述组合物。
27.前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述组合物达至少7天。
28.基本上不含细菌组分的噬菌体组合物，其包含一种或多种专性裂解性噬菌体和冷冻保护剂，其中所述噬菌体具有以下基因组：所述基因组包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％而非100％的同一性的核苷酸序列，其中每种单个噬菌体不易于普遍性转导并且不携带抗生素抗性基因。
29.基本上不含细菌组分的噬菌体组合物，其包含一种或多种能够互补的专性裂解性噬菌体和冷冻保护剂，其中所述噬菌体具有以下基因组：所述基因组包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％而非100％的同一性的核苷酸序列，其中所述组合物的目标细菌范围宽于所述组合物中任何单个噬菌体的范围。
30.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保护剂包含甘油。
31.权利要求30所述的组合物，其中所述甘油的浓度为大约10％至大约30％(v/v)。
32.权利要求28-31中任一项所述的组合物，其中所述细菌组分是细菌内毒素。
33.权利要求28-31中任一项所述的组合物，其中所述细菌组分是细菌宿主蛋白。
34.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含药学可接受的赋形剂或载体。
35.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或其组合包含钙盐或镁盐。
36.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是液体、半液体、固体、冷冻或冻干制剂。
37.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物的噬菌体感染并裂解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
38.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含1x105至1x1011PFU的每种噬菌体。
39.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中以每毫升3x109PFU总噬菌体的剂量施用所述组合物。
40.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物储存在2-8℃。
41.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中至少一种噬菌体的序列不是天然存在的。
42.基本上不含细菌组分的噬菌体组合物，其包含至少一种专性裂解性噬菌体和用于储存在8℃或低于8℃的温度下的储存介质，其中所述噬菌体具有以下基因组：所述基因组包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％而非100％的同一性的核苷酸序列，其中每种单个噬菌体不易于普遍性转导并且不携带抗生素抗性基因。
43.根据权利要求28-42中任一项所述的组合物在治疗人中金黄色葡萄球菌感染的用途，其中所述感染基本上或完全是非肺部的，所述用途包括施用所述组合物于遭受金黄色葡萄球菌感染的人。
44.组合物在治疗具有金黄色葡萄球菌细菌感染的人中的用途，所述组合物包含一种或多种不同的感染并裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体，所述用途包括向所述人施用一种或多种不同的噬菌体的组合物；其中所述一种或多种噬菌体中至少一种包含以下基因组：所述基因组包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％同一性的序列的多核苷酸序列。
45.组合物在治疗人中证实的金黄色葡萄球菌细菌感染中的用途，所述组合物包含至少两种不同的感染并裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体，所述治疗包括向所述人施用所述组合物，所述组合物包含至少两种噬菌体，所述噬菌体包含以下基因组：所述基因组包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一具有至少93％同一性的序列的核苷酸序列，其中所述感染不是肺部金黄色葡萄球菌细菌感染。
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