CN104519893A - 用于治疗细菌感染的包含抗细菌噬菌体的混合物的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗和控制细菌感染(特别是糖尿病足感染)的噬菌体治疗领域。更具体而言，本发明涉及噬菌体菌株F44/10、F125/10、F770/05、F510/08、F1245/05、和/或其变体的新型混合物；以及使用该混合物来治疗和预防细菌感染的方法，包括由例如金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌引起的与糖尿病足感染有关的皮肤溃疡。所述的混合物可以单独用作药物组合物，或者与其他疗法(例如抗生素、生长因子或者糖尿病足感染的其他标准及非标准的疗法)进一步结合来用作药物组合物。

Description

用于治疗细菌感染的包含抗细菌噬菌体的混合物的组合物及其使用方法

序列表

本发明包含序列表，该序列表通过EFS-Web以ASCII形式提交，并以引用方式全文并入本文。在2012年3月14日创建的所述ASCII拷贝命名为16395105.txt，并且大小为574,104字节。

技术领域

本发明涉及用于治疗和控制细菌感染(具体为慢性溃疡，例如糖尿病足感染)的噬菌体疗法领域。更具体而言，本发明涉及噬菌体菌株F44/10、F125/10、F770/05、F510/08、F1245/05、其他噬菌体和/或其变体的新型混合物；以及使用该混合物在治疗和预防细菌感染中的方法，包括由例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)引起的与糖尿病足感染有关的皮肤溃疡。所述的混合物可以单独地用作药物组合物，或者与其他疗法(例如抗生素、生长因子或用于慢性溃疡的其他标准或非标准的疗法)进一步组合使用。

背景技术

糖尿病足感染(DFI)是糖尿病(DM)的频繁且严重的并发症，并且是全世界非创伤性下肢截肢的主要因素(Jeffcoate WJ,et al.2003.Lancet 361:1545-1551)。在目前的临床实践中，DFI的治疗包括清创术和系统性抗生素(例如参见Lipsky BA,et al.2004.Clin Infect Dis.39:885-910)。然而，由于血管化缺陷及局部微环境，所以抗生素浓度为多次低治疗浓度(Lipsky BA,et al.2009.Clin Infect Dis.49:1541-1549)。此外，随着社区和医院患者数量的逐渐增多，多重耐药有机体(例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌以及泛耐药非发酵阴性杆菌)的发生率的增加威胁着上述结果(Mendes JJ,et al.2012.Diabetes Res Clin Pract.95(1):153-161；Tascini C,et al.2011.DiabetesRes Clin Pract 94(1):133-139)。因此，仍需要鉴定用于治疗、控制和处理DFI的新方案。

局部治疗提供了避免系统性不利作用、提供增加的靶位点浓度并允许使用不可用于系统性疗法的试剂的优点。由于机械清创术降低了细菌存在的生物负担并且还为局部抗微生物疗法(TAT)开放了时间依赖的治疗窗口，其改善了局部治疗(Wolcott RD,et al.2010.JWound Care 19:320-328)。然而，到目前为止，没有TAT试剂被证明可以有效用于治疗DFI(Nelson EA,et al.2006.Diabet Med23:348-359)。

噬菌体为特异性地感染并溶解细菌的病毒。噬菌体疗法由Felixd’Herelle在二十世纪20年代引入，其为使用整个噬菌体病毒来治疗细菌感染疾病的方法。但是随着抗生素在二十世纪40年代的发展，西方世界对基于噬菌体的疗法的兴趣下降。导致这种下降的最重要的因素之一是缺乏标准的测试方案和生产方法。就噬菌体疗法的价值而言，不能研发出用于测试噬菌体疗法的工业规模的标准干扰了研究结果的记录，导致可觉察的效力缺乏及可靠性问题。噬菌体生产的另一个问题涉及噬菌体的商业化制备物的纯度级别，其中制备物包含不需要的细菌成分，例如内毒素。因此，不良事件通常与制备物有关，特别是在静脉接受它们的患者中。

然而，在东欧和前苏联(接受抗生素受到限制的地方)，噬菌体疗法的发展和使用与抗生素相关联地继续着，或者替代了抗生素。此外，随着许多细菌的抗生素抗性菌株的出现，对噬菌体基疗法的兴趣重返西方世界。换言之，即使可以研发新种类的抗生素，但是细菌将逐渐发展出对新药品的抗性的前景加剧了对用于控制、预防和治疗细菌感染的非化学疗法手段的探索。

溶菌性噬菌体，特别是在补充有充分的机械清创术时，提供治疗DFI的溶液，例如用作新型TAT试剂。溶菌性细菌可以在溶解病原体细菌(特别是与多重抗药性有关的那些)中提供特异性和有效性的优点(Rossney AS，et al.1994.J Hosp Infect 26:219-234)。其他的优点可以包括缺乏对人和动物的致病性(Burrowes B,et al.2011.ExpertRev Anti Infect Ther 9:775-785)，在生物膜中针对细菌的抗细菌活性，在微需氧环境(甚至具有高的细菌负荷)中的活性(Azeredo J,et al.2008.Curr Pharm Biotechnol 9:261-266)，以及在世界上某些地方噬菌体疗法通常可接受的安全性(Sulakvelidze A,et al.,2001,Antimicrob Agents Chemother.45(3):649-659)。近期噬菌体疗法的动物试验证明了其在内部(McVay CS,et al.2007.Antimicrob AgentsChemother 51:1934-1938)和外部应用(Soothill JS.1994.Burns20:209-211；Wills QF,et al.2005.Antimicrob Agents Chemother49:1220-1221)中治愈或改善皮肤细菌疾病的潜力。但是，支持使用噬菌体来治疗形成超过几个小时的感染的公开证据较少(Ryan EM,etal.2011J Pharm Pharmacol 63:1253-1264)。

具体而言，例如在增加针对具体细菌菌株的溶菌活性以及降低对单一噬菌体具有抗性的细菌出现的可能性方面，噬菌体混合物可以提供强于使用单一噬菌体的优点。换言之，不同的噬菌体可以混合成混合物，从而拓宽它们的性质，由此优选地得到整体更广的抗细菌活性谱系，例如扩大的宿主范围，对于该范围的宿主，发展出抗性的可能性较低。但是，到目前为止，很少有噬菌体混合物具有针对不同细菌的抗微生物活性，可能是因为在将不同特异性的噬菌体结合起来同时保持储存稳定性中存在困难。

因此，需要研发出作为用于体内针对致病性细菌的治疗性试剂和/或预防性试剂的新型噬菌体产物。此外，还需要更好的DFI治疗，特别是局部治疗。具体而言，需要能够溶解导致DFI的细菌的噬菌体混合物，包括金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌。本申请解决了这种及其他的需要。

发明概述

在一个方面中，本发明涉及包括噬菌体混合物的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少2种不同的分离的噬菌体菌株的组合物，每种噬菌体菌株都具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQID NO:1(F44/10),SEQ ID NO:2(F125/10),SEQ ID NO:3(F770/05),SEQ ID NO:4(F510/08),SEQ ID NO:5(F1245/05)，或其变体，所述的变体与相应的核酸序列具有至少95％的序列一致性并且显示出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的至少一种的抗细菌活性。在一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株中的一种为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:2或者其变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2或者其变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述的组合物进一步包含至少第三噬菌体菌株，所述第三噬菌体菌株具有包含选自下述核酸序列的基因组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5或者其变体。在一些实施方案中，所述的组合物进一步包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株各自具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5或者其变体。在一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株中的一种为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ IDNO:3或EQ ID NO:4或者其变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:3和EQ ID NO:4或者其变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述的组合物进一步包含至少第三噬菌体菌株，所述第三噬菌体菌株具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:5或者其变体。在一些实施方案中，所述的组合物进一步包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株各自具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:5或者其变体。在一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株中的一种为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:5或者其变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述的组合物进一步包含至少第三噬菌体菌株，该噬菌体菌株具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或者其变体。在一些实施方案中，所述的组合物进一步包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株各自具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或者其变体。

在一些优选的实施方案中，本发明涉及包含至少5种分离的噬菌体菌株的组合物，其中所述的菌株具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQID NO:5或者其变体的核酸序列，其中所述的变体与相应的核酸序列具有至少95％的序列一致性并且显示出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的至少一种的抗细菌活性。在一些实施方案中，具有包含SEQ ID NO:1,2,4和5或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株各自以相当于具有包含SEQ ID NO:3或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株大约10倍的量存在于所述的组合物中。在一些实施方案中，所述的组合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核酸序列。

在另一个方面中，本发明涉及包含噬菌体混合物的药物组合物，特别是包含上述任一种组合物和药物可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述的药物组合物被配制用于局部应用。在一些实施方案中，所述的药物组合物包括无菌缓冲剂，例如包含大约0.05MTris-HCl、大约0.1M NaCl和大约10mM MgSO₄.7H₂O的缓冲剂。在一些实施方案中，所述的药物组合物装在安瓿瓶中。

在一些实施方案中，所述的药物组合物进一步包含其他试剂，例如选自抗生素试剂、抗炎症试剂、抗病毒试剂、局部麻醉剂、生长因子和皮质类固醇中的试剂。在一些实施方案中，其他试剂为抗生素试剂，例如具有针对鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的抗细菌活性的抗生素试剂；或者具有针对除了鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。更具体而言，在一些实施方案中，其他试剂为具有针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性的抗生素试剂或具有针对除了金黄色葡萄球菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。在一些实施方案中，其他试剂为具有针对绿脓假单胞菌的抗细菌活性的抗生素试剂或具有针对除了绿脓假单胞菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。在一些实施方案中，其他试剂为具有针对鲍曼不动杆菌的抗细菌活性的抗生素试剂或具有针对除了鲍曼不动杆菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。在一些实施方案中，抗生素试剂的施用包括系统施用。

在一些实施方案中，所述的组合物用于治疗与不完整皮肤的区域有关的细菌感染，并且各种噬菌体菌株以相当于10³至10¹³噬菌体颗粒/cm²所述区域的量存在于所述的组合物中。在一些实施方案中，各种噬菌体菌株以相当于10⁷至10⁹噬菌体颗粒/cm²所述区域的量存在于所述的组合物中。

本发明的另一个方面涉及治疗或预防有需要的受试对象中的细菌感染的方法，该方法包括向受试对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。在一些实施方案中，细菌感染为由鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种引起的感染。在一些实施方案中，所述的药物组合物为局部施用。在一些实施方案中，受试对象为哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，细菌感染为糖尿病足感染。在一些实施方案中，糖尿病足感染包括皮肤溃疡。在一些实施方案中，细菌感染与不完整皮肤的区域有关，其中所述的不完整皮肤的区域选自与蜂窝组织炎、丹毒病变、烧伤、慢性溃疡、褥疮性溃疡和压疮有关的伤处。在一些实施方案中，治疗包括向与糖尿病足感染有关的皮肤溃疡局部施用所述的药物组合物。在一些优选的实施方案中，在溃疡的机械清创术后进行所述的施用。在一些实施方案中，所述的施用包括使用敷料、滴注装置和负压伤口治疗装置中的至少一种。

在一些实施方案中，在最初的24小时内，每4小时或每6小时施用所述的药物组合物。在一些实施方案中，在最初的24小时后，在至少其他3天中，每12小时或每24小时施用所述的药物组合物。在一些实施方案中，在至少其他4天中，每12小时或每24小时施用所述的药物组合物。

在一些实施方案中，所述的方法与糖尿病足感染的标准疗法组合使用，例如选自细胞外基质替代疗法、湿性伤口疗法、负压伤口疗法、动脉血管再形成疗法、高压氧疗、施用抗生素试剂和施用生长因子中的标准疗法。在一些实施方案中，湿性伤口疗法包括使用粘合性底膜、涂敷有机硅(silicone)的泡沫、水凝胶和/或水状胶体。在一些实施方案中，细胞外基质替代疗法包括使用生物改造的组织。在一些实施方案中，施用抗生素试剂包括系统性施用。在一些实施方案中，生长因子为选自血小板衍生的生长因子、粒细胞集落刺激因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子和血管内皮细胞生长因子中的至少一种。在一些实施方案中，施用生长因子包括局部施用。在一些实施方案中，所述的方法与糖尿病足感染的非标准疗法组合使用，例如其中糖尿病足感染难以用标准疗法治疗。

定义

如本文所用，术语“分离的”就核酸分子而言，是指第一核酸分子，其与第一核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子相分离。此外，“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)基本上不含其他细胞物质，或者在通过重组技术生产时基本上不含培养基，或者当以化学方式合成时基本上不含化学前体或其他化学品，并且可以不含其他cDNA或其他基因组DNA分子，例如在这种情况下，所述的核酸已经与核酸文库中其他的克隆分离。此外，“分离的”基因组DNA基本上不含其他病毒细胞物质，或者在通过重组技术生产时基本上不含培养基，或者当以化学方式合成时基本上不含化学前体或其他化学品，并且可以不含其他cDNA或其他基因组DNA分子，例如在这种情况下，所述的核酸已经与包含多于一种的噬菌体和/或细菌菌株的制备物分离。

就噬菌体而言，术语“纯化的”是指通过任何纯化工艺将噬菌体的浓度可测量地增加，其中所述的工艺包括但不限于由环境或培养基中分离，例如在繁殖和/或扩增之后与培养物分离、离心等，由此部分地、基本上、几乎完全地或完全地除去杂质，例如宿主细胞或宿主细胞成分。本领域技术人员将理解的是用于给定用途所需要的纯化的量。例如根据管理标准和良好的生产规范，打算用于旨在施用给人类的治疗组合物的分离的噬菌体通常必须是高纯度的。

术语“纯化的”是指通过任何纯化工艺，肽、多肽、融合蛋白质或核酸分子的浓度已经可测量地增加，所述纯化工艺包括但不限于柱色谱、HPLC、沉淀、电泳等，从而部分地、基本上、基本完全地或完全地除去杂质，例如与制备肽、多肽、融合蛋白质或核酸分子有关的前体或其他化学品。本领域的技术人员将理解的是用于给定用途所需要的纯化的量。例如根据管理标准和良好的生产规范，打算用于治疗组合物(将施用人类)的分离的基因组DNA通常必须是高纯度的。

如本文所用，术语“变体”就核酸序列而言是指这样的核酸序列，其中包含或者由与参照核酸序列具有至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者至少99％的序列一致性的核酸序列组成。可以选择保持参照核酸序列的一种或多种功能的变体。例如变体噬菌体可以表现出与衍生出该变体噬菌体的噬菌体的至少一种生物学活性，例如抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌性杀伤活性)。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指使用核酸分子转染的特定的受试对象细胞，以及包含核酸分子或染色体整合的核酸分子的此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代可以与核酸分子转染的亲代细胞不同，这是由于突变或环境影响，这种突变或环境影响可以在随后的传代或核酸分子整合到宿主细胞基因组中发生。对于噬菌体传代而言，宿主细胞可以与分离或培养出噬菌体的物种或菌株相同或不同。

如本文所用，术语“组合”、“其他的组合”或“进一步组合”是指使用其他的预防性试剂和/或治疗性试剂、以及本发明的噬菌体混合物。术语“组合”的使用不限定预防性试剂和/或治疗性试剂被施用给受试对象的顺序。第一预防性试剂或治疗性试剂可以在将第二预防性试剂或治疗性试剂(不同于第一预防性试剂或治疗性试剂)施用给受试对象之前(例如之前的5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或随后(例如之后的5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。

如本文所用，术语“治疗性试剂”和“预防性试剂”是指诸如本发明的噬菌体混合物之类的试剂，其可以用于预防、处理或控制疾病或紊乱的一种或多种症状，特别是与细菌感染有关的疾病或紊乱，例如糖尿病足感染。

如本文所用，术语“治疗性试剂”是指可以用于治疗、处理或控制一种或多种疾病或紊乱的症状的试剂(例如本发明的噬菌体混合物)，特别是与细菌感染(例如糖尿病足感染)有关的疾病或紊乱。

如本文所用，术语动词性“治疗”、名词性“治疗”和动名词性“治疗”是指在接受药物组合物的受试对象中获得治疗性益处。就取得治疗性益处而言，目的是消除、减轻、降低与致病状况或紊乱有关的症状或根本原因(例如细菌感染)的严重性，缓解或减慢与致病状况或紊乱有关的症状或根本原因(例如细菌感染)的进程。“治疗有效量”是指治疗性试剂(例如本发明的噬菌体混合药物组合物)在接受药物组合物的受试对象中足以取得至少一种治疗性益处的量。

如本文所用，术语动词性“预防”、名词性“预防”和动名词性“预防”是指在接受药物组合物的受试对象中获得预防性益处。就取得预防性益处而言，目的是延迟或阻止与致病状况或紊乱有关的症状或根本原因(例如细菌感染)。“预防有效量”是指预防性试剂(例如本发明的噬菌体混合药物组合物)在接受药物组合物的受试对象中足以取得至少一种预防性益处的量。

如本文所用，就噬菌体(或者其变体或片段)或噬菌体产物而言，术语“抗细菌活性”和“抗微生物活性”可以交换使用，其是指杀灭和/或抑制微生物有机体(特别是噬菌体感染的细菌物种或菌株)的生长或繁殖的能力。在某些实施方案中，抗细菌或抗微生物活性通过以下评估：根据标准的技术(例如在液体培养物中或在琼脂平板上)培养细菌，例如革兰氏阳性细菌(例如金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性细菌(例如鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、和/或绿脓假单胞菌)、或者未分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌；使所述的培养物与本发明的噬菌体或其变体接触；以及在所述的接触后监测细胞的生长。例如在液体培养物中，可以使细菌生长至代表了培养物指数生长的中点的光密度(“OD”)；使培养物暴露于本发明的一种或多种噬菌体或其变体的一种或多种浓度，并监测相对于对照培养物的OD。OD相对于对照培养物降低代表了噬菌体展现出抗细菌活性(例如表现出溶菌性杀灭活性)。类似地，可以允许在琼脂平板上形成细菌菌落，将该平板暴露于本发明的一种或多种噬菌体或其变体；以及随后评价菌落相对于对照平板的生长情况。菌落大小的减小或菌落总数的减少表明噬菌体具有抗细菌活性。

附图说明

图1示出了根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的制备。

图2示出了在根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的大鼠模型中，用于证明体内效力的研究方案。

图3示出了在根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的猪模型中，用于证明体内效力的研究方案。

图4示出了针对金黄色葡萄球菌743/06评价的溶菌性研究结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。

图5示出了针对绿脓假单胞菌433/07评价的溶菌性研究结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。

图6示出了针对鲍曼不动杆菌1305/05评价的溶菌性研究结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。

图7示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的对照组(C)和测试组(T)的微生物负荷分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。

图8示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的阴性组、对照组(C)和测试组(T)的伤口闭合分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。

图9示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的阴性组、对照组(C)和测试组(T)的组织学分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。

图10示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的对照组(C)和测试组(T)的微生物负荷分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。

图11示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的阴性组、对照组(C)和测试组(T)的伤口闭合分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。

图12示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的阴性组、对照组(C)和测试组(T)的组织学分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。

图13示出了糖尿病足感染的分类以及使用根据本发明的示例性噬菌体混合组合物对其实施噬菌体疗法的应用。

图14示出了根据本发明的示例性噬菌体混合组合物用于糖尿病足部溃疡疗法中的临床研究设计。

发明详述

本发明涉及用于治疗和控制细菌感染(特别是糖尿病足感染)的噬菌体疗法。在一个方面中，本发明涉及不同噬菌体菌株的新型混合组合物。“混合物”可以包括至少2种不同的分离的噬菌体菌株，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的分离的噬菌体菌株。混合物可以单独使用，或者与其他疗法(例如抗生素试剂和/或生长因子)进一步组合使用。

噬菌体混合物提供了强于使用单独的噬菌体的益处，例如增加针对具体细菌菌株的溶菌活性和/或降低对单独噬菌体具有抗性的细菌出现的可能性。不同的噬菌体可以混合成混合物，从而拓宽它们的性质，由此优选地得到整体更广的抗细菌活性谱系。但是，很少有噬菌体混合物具有针对不同细菌的抗微生物活性，可能是因为在将不同特异性的噬菌体菌株组合同时在截然不同的噬菌体菌株存在下保持单独噬菌体的感染能力和/或溶菌活性存在困难。

在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了包含5种分离的噬菌体菌株F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05的混合组合物，其中所述的混合组合物被配制成局部配制物，并且在治疗和/或预防糖尿病足感染中发挥作用。

在一些实施方案中，本发明提供了混合组合物，其包含至少2种不同的分离的噬菌体菌株，具有针对相同或不同细菌物种或菌株的抗细菌活性。在优选的实施方案中，所述的混合物的治疗性成分靶向2种或更多种细菌物种或菌株。在一些实施方案中，噬菌体混合物包含至少2种噬菌体菌株、至少3种噬菌体菌株、至少4种噬菌体菌株、至少5种噬菌体菌株、至少6种噬菌体菌株、至少7种噬菌体菌株、至少8种噬菌体菌株、至少9种噬菌体菌株、至少10种噬菌体菌株或更多。在一些实施方案中，噬菌体混合物包含2-20种噬菌体菌株、2-15种噬菌体菌株、2-10种噬菌体菌株、3-8种噬菌体菌株、或者4-6种噬菌体菌株。在更优选的实施方案中，在截然不同的噬菌体菌株存在下，所述的组合不损害或降低(或者不基本上或显著地损害或降低)单一噬菌体的感染能力和/或溶菌活性。

在一些实施方案中，所述的混合物的至少一种噬菌体菌株为具有针对至少一种革兰氏阴性细菌的抗细菌活性的菌株，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于鲍曼不动杆菌和绿脓假单胞菌；和/或具有针对至少一种革兰氏阳性细菌的抗细菌活性的菌株，所述革兰氏阳性细菌包括但不限于金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，所述的混合组合物包含至少2种不同的分离的噬菌体菌株，其中所述的菌株表现出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的至少1种的抗细菌活性。在一些更优选的实施方案中，所述的混合组合物表现出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的至少1种的抗细菌活性。在一些甚至更优选的实施方案中，所述的混合组合物表现出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的每一种的抗细菌活性

在一些实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种表现出针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球形兼性厌氧生物，其生长成葡萄状簇，具有特征性的金色，并且为葡萄球菌感染的最常见的因素。金黄色葡萄球菌是人类皮肤菌丛的最常见的部分，并且造成广泛的感染，包括丘疹、痈、烫伤样皮肤综合征、肺炎、肠胃炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征、菌血症和脓毒病。此外，金黄色葡萄球菌通常与糖尿病足感染有关，包括但不限于皮肤溃疡。此类皮肤溃疡在本文中还称为“糖尿病足部溃疡”。

特别受到关注的是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)。直到二十世纪90年代，MRSA在医院环境中才开始出现，那时医院爆发了MRSA流行病。MRSA目前被认为是医院特有的，特别是在UK(Johnson AP et al.2001J.Antimicrobial Chemotherapy 48(1):143-144)。此外，MRSA在糖尿病足感染中呈现出新的威胁(RetrievedJanuary 17,2009,from CDC:Centers for Disease Control andPrevention Web site)。在糖尿病患者足部形成的溃疡和开放性伤口将该患者置于感染MRSA的风险中，并且近期研究显示出当糖尿病患者伤口处存在MRSA时其会损害健康的证据(Bowling FL,et al.2009Curr Diab Rep 9(6):440-444)。此外，参见Kosinski,MA,et al.2010.Expert Rev AntiInfect Ther.8(11):1293-1305。

在一些实施方案中，本发明提供了包含具有如下基因组的噬菌体的混合组合物，其中所述的基因组包含或由SEQ ID NO:1的核酸序列组成。根据该实施方案的具体的实例为分离的噬菌体F44/10，其靶向多种葡萄菌属物种的菌株，包括金黄色葡萄球菌。根据布达佩斯条约，菌株F44/10于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(FergusonBuilding,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号为41867。在一些实施方案中，本发明提供了包含具有如下基因组的噬菌体的混合组合物，其中所述的基因组包含或由SEQ ID NO:2的核酸序列组成。根据该实施方案的具体的实例为分离的噬菌体F125/10，其也靶向多种葡萄菌属物种的菌株，包括金黄色葡萄球菌。根据布达佩斯条约，菌株F125/10于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号为41866。在一些实施方案中，混合组合物包含至少F44/10和F125/10噬菌体菌株。在某些实施方案中，噬菌体混合物包含至少一种表现出针对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株的抗细菌活性的噬菌体菌株(例如F44/10和F125/10)，和至少一种表现出针对不同细菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。例如在一些实施方案中，噬菌体混合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:1或2、或者其变体组成，以及至少一种具有如下基因组的其他噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:3、4或5、或者其变体组成)。

在一些实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种表现出针对绿脓假单胞菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。绿脓假单胞菌是在土壤、水、皮肤菌丛以及大多数的人造环境中发现的普通的革兰氏阴性杆状细菌。绿脓假单胞菌不仅在正常气氛中生长旺盛，而且在很少的氧气下作为兼性厌氧生物生长，并且可以影响损坏的组织或免疫系统损伤的个体，包括糖尿病患者。事实上，绿脓假单胞菌在糖尿病足部溃疡中通常导致严重的组织损坏，并且绿脓假单胞菌感染的主要问题在于这种病原体对广谱抗生素表现出高度的抗性(Murugan,S.et al.2010Intl J of Microbiol Res 1(3):123-128)。例如在Murugan等人的研究中，发现由糖尿病足部溃疡得到的100％的绿脓假单胞菌分离物对美罗培南具有抗性，并且发现超过71％的绿脓假单胞菌分离物对亚胺培南具有抗性。

在一些实施方案中，本发明提供了包含具有如下基因组的噬菌体，其中所述的基因组包含或由SEQ ID NO:3的核酸序列构成。根据本实施方案的具体实例为分离的噬菌体F770/05，其靶向多种假单胞菌物种的菌株，包括绿脓假单胞菌。此外，参见国际申请公开WO2010/090542，其中公开了所述的噬菌体菌株。根据布达佩斯条约，菌株F770/05于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(FergusonBuilding,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号为41864。在一些实施方案中，本发明提供了包含噬菌体的混合组合物，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述基因组包含或由SEQ ID NO:4的核酸序列构成。根据本实施方案的具体实例为分离的噬菌体F510/08，其也靶向多种假单胞菌物种的菌株，包括绿脓假单胞菌。根据布达佩斯条约，菌株F510/08于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号为41868。在一些实施方案中，所述的混合组合物包括至少F770/05和F510/08噬菌体菌株两者。在某些实施方案中，所述的噬菌体混合物包含至少一种表现出针对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株的抗细菌活性的噬菌体菌株(例如F770/05和F510/08)，和至少一种表现出针对不同细菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。例如在一些实施方案中，噬菌体混合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:3或4、或者其变体组成，以及至少一种具有如下基因组的其他噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:1、2或5、或者其变体组成。

在一些实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种表现出针对鲍曼不动杆菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。鲍曼不动杆菌是一种导致多种严重的临床感染的细菌物种，特别是在具有受损的免疫系统的个体中，包括糖尿病患者。例如已经由患有下肢感染的糖尿病患者中分离出鲍曼不动杆菌(Colayco,CAS,et al 2002Phil J Microbiol InfectDis 31(4):151-106)。鲍曼不动杆菌为多形性需氧革兰氏阴性杆菌，其通常会通过开放性伤口进入肌体，例如糖尿病足部溃疡。此外，已知鲍曼不动杆菌对多种抗生素具有抗性，并且由鲍曼不动杆菌引起的医院内感染的数量今年来有所上升。此外参见Browne AC,et al.2001Ostomy Wound Management 47(10):44-49(其讨论了金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和不动杆菌物种在糖尿病足部溃疡中的发生)。鲍曼不动杆菌是通常在伤口感染过程的后期出现的定植者。因此，在某些实施方案中，重要的是噬菌体混合组合物包含感染鲍曼不动杆菌的噬菌体。

在一些实施方案中，本发明提供了包含具有如下基因组的噬菌体的混合组合物，所述的基因组包含或由SEQ ID NO:5的核酸序列构成。根据本实施方案的具体实例为分离的噬菌体F1245/05，其靶向多种不动杆菌物种的菌株，包括鲍曼不动杆菌。此外，参见国际申请公开WO 2010/090542，其中公开了所述的噬菌体菌株。根据布达佩斯条约，菌株F1245/05于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号为41865。在某些实施方案中，所述的噬菌体混合物包含至少一种表现出针对一种或多种鲍曼不动杆菌菌株的抗细菌活性的噬菌体菌株(例如F1245/05)，和至少一种表现出针对不同细菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。例如在一些实施方案中，噬菌体混合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:5、或者其变体组成，以及至少一种具有如下基因组的其他噬菌体菌株所述基因组包含或由SEQ ID NO:1、2、3或4、或者其变体组成。

在某些实施方案中，本发明的混合物包含噬菌体，该噬菌体为核酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意一种的变体，该变体噬菌体表现出噬菌体菌株F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05中的一种或多种的至少一种生物学活性，例如抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌株F44/10或F125/10的变体保持针对一种或多种葡萄球菌物种的菌株(更优选的是包括金黄色葡萄球菌)的抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。在一些优选的实施方案中，所述的混合物包含噬菌体菌株F770/05或F510/08的变体，该变体保持针对一种或多种假单胞菌物种的菌株(更优选的是包括绿脓假单胞菌)的抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。在一些优选的实施方案中，所述的混合物包含噬菌体菌株F1245/05的变体，该变体保持针对一种或多种不动杆菌物种的菌株(更优选的是包括鲍曼不动杆菌)的抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。

变体噬菌体菌株可以包含或由如下基因组构成，所述的基因组具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者至少99％的序列一致性，所述的噬菌体变体分别表现出噬菌体F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05的至少一种生物学活性，例如抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌株F44/10的变体包含或由如下基因组组成，所述的基因组具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者至少99％的序列一致性，并且所述的噬菌体菌株F44/10的变体保持针对一种或多种葡萄球菌物种的菌株(更优选的是包括金黄色葡萄球菌)的抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌株F125/10的变体包含或由如下基因组组成，所述的基因组具有与SEQ ID NO:2的核酸序列至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者至少99％的序列一致性，并且所述的噬菌体菌株F125/10的变体保持针对一种或多种葡萄球菌物种的菌株(更优选的是包括金黄色葡萄球菌)的抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌株F770/05的变体包含或由如下基因组组成，所述的基因组具有与SEQID NO:3的核酸序列至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者至少99％的序列一致性，并且所述的噬菌体菌株F770/05的变体保持针对一种或多种假单胞菌物种的菌株(更优选的是包括绿脓假单胞菌)的抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌株F510/08的变体包含或由如下基因组组成，所述的基因组具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者至少99％的序列一致性，并且所述的噬菌体菌株F510/08的变体保持针对一种或多种假单胞菌物种的菌株(更优选的是包括绿脓假单胞菌)的抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌株P1245/05的变体包含或由如下基因组组成，所述的基因组具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者至少99％的序列一致性，并且所述的噬菌体菌株P1245/05的变体保持针对一种或多种不动杆菌物种的菌株(更优选的是包括鲍曼不动杆菌)的抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)。

备选地或此外，本发明的混合物包含具有如下基因组的变体，所述的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的核酸序列的功能片段，其中所述的变体分别表现出噬菌体F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05的至少一种生物学活性，例如抗微生物或抗细菌活性(例如溶菌杀灭活性)，优选如上文所述。

在一些实施方案中，本发明提供了混合组合物，该混合组合物包含至少2种不同的分离的噬菌体菌株，各种菌株各自具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID NO:1(F44/10)、SEQ ID NO:2(F125/10)、SEQ ID NO:3(F770/05)、SEQ ID NO:4(F510/08)和SEQ IDNO:5(F1245/05)、或其变体，如上文所述。在一些优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或者其变体的核酸序列。在一些更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少2种具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2或者其变体的核酸序列。在一些还要更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少第三噬菌体菌株，该第三噬菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或者其变体的核酸序列。在一些甚至更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或者其变体的核酸序列。

在一些优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:3或SEQID NO:4或者其变体的核酸序列。在一些更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少2种具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或者其变体的核酸序列。在一些还要更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少第三噬菌体菌株，所述第三噬菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5，或者其变体的核酸序列。在一些甚至更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5，或者其变体的核酸序列。

在一些优选的实施方案中，所述的混合组合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:5或其变体的核酸序列。在一些更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含噬菌体(其具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID NO:5或其变体的核酸序列)以及1、2或3种其他的噬菌体菌株(其各自具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，以及它们的变体中的核酸序列)。

在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含至少5种分离的噬菌体菌株的混合组合物，所述的菌株具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、或其变体的核酸序列。在一些此类的实施方案中，选择用于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5任意一种的变体与相应的核酸序列具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，并且显示针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌中的至少一种的抗细菌活性。特别优选的实施方案将针对所有3种细菌菌株的抗细菌活性组合起来。在一些实施方案中，所述的混合组合物进一步包含一种或多种其他的噬菌体菌株，所述其他噬菌体菌株具有针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌中的至少一种和/或针对其他细菌的抗细菌活性。

在特别优选的实施方案中，本发明提供了混合组合物，该混合组合物包含5种分离的噬菌体菌株，并进一步组合有至少一种其他的噬菌体菌株，其中所述的5种分离的噬菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5、或其变体的核酸序列。在一些优选的实施方案中，其他的噬菌体菌株选自：噬菌体菌株F168/08，其具有针对粪肠球菌(E.faecalis)和/或屎肠球菌(E.faecium)中的一种或多种菌株的抗生素活性(如在WO 2011/065854和美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F170/08，其具有针对粪肠球菌和/或屎肠球菌中的一种或多种菌株的抗生素活性(如在WO2011/065854和美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F197/08，其具有针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F86/06，其具有针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F87s/06，其具有针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F91a/06，其具有针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F391/08，其具有针对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国临时申请号61/384,015中所公开的那样)；噬菌体菌株F394/08，其具有针对鲍曼不动杆菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国临时申请号61/384,01中所公开的那样)；噬菌体菌株F488/08，其具有针对大肠杆菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国临时申请号61/384,01中所公开的那样)；以及噬菌体菌株F387/08，其具有针对肺炎克雷伯氏菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国临时申请号61/384,015中所公开的那样)(这些申请的内容均以引用方式全文并入本文)。此外，在2010年9月17日提交的美国临时申请号61/384,015和2011年9月19日提交的国际申请PCT/PT2011/000031的内容也均以引用方式全文并入本文。

在一些实施方案中，本发明提供了包含至少5种分离的噬菌体菌株的组合物，所述的噬菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQID NO:5、或其变体的核酸序列，其中所述的具有包含SEQ ID NO:1,2,4和5或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株各自以高于所述的具有包含SEQ ID NO:3或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株的量存在于所述的组合物中。在一些优选的实施方案中，所述的具有包含SEQ ID NO:1,2,4和5或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株各自相当于所述的具有包含SEQ ID NO:3或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株的大约2倍、大约5倍、大约8倍、大约9倍、大约10倍、大约11倍、大约12倍、大约15倍或大约20倍的量存在于混合组合物中。

在一些实施方案中，噬菌体混合组合物包含或不包含选择用于增加的体内半衰期的噬菌体，例如在US 5,688,501中所公开的那样，该文献的公开内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，在缺乏分离的多肽(例如缺乏溶菌酶)的条件下施用所述的混合物。

此外，本发明还提供了使用本发明的一种或多种噬菌体感染的分离的细菌。在某些实施方案中，本发明提供了使用噬菌体感染的分离的金黄色葡萄球菌，所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQ ID NO:1和/或2或者其变体组成。在某些实施方案中，本发明提供了使用噬菌体感染的分离的绿脓假单胞菌，所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQ ID NO:3和/或4或者其变体组成。在某些实施方案中，本发明提供了使用噬菌体感染的分离的鲍曼不动杆菌，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQ ID NO:5或者其变体组成。

用于本发明的噬菌体混合物的噬菌体可以通过本领域已知的和/或本发明所公开的任何方法来生产和/或分离。例如技术人员可以使用一种或多种方法来生产和/或分离具有如下基因组的噬菌体，所述的基因组包含或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5、或其变体的核酸序列。生产和/或分离具有如下基因组的噬菌体的方法可以包括，所述基因组包含或由SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2、或其变体组成：(i)获得金黄色葡萄球菌的培养物；(ii)使用具有如下基因组的噬菌体感染该培养物，所述基因组包含或由SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2、或其变体组成；(iii)培养至观察到培养物发生明显的溶菌；以及(iv)从培养物分离噬菌体。所用的宿主细胞可以是容易被噬菌体感染并且可以用于复制噬菌体的任何的细菌菌株，例如任何的金黄色葡萄球菌菌株。在一些实施方案中，所用的宿主细胞为金黄色葡萄球菌菌株743/06，根据布达佩斯条约，金黄色葡萄球菌菌株743/06于2011年9月16日保藏在NCIMBLimited(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号为NCIMB41862。生产和/或分离具有如下基因组的噬菌体的方法可以包括，所述基因组包含或由SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4、和/或其变体组成：(i)获得绿脓假单胞菌的培养物；(ii)使用具有如下基因组的噬菌体感染该培养物，所述基因组包含或由SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4、和/或其变体组成；(iii)培养至观察到培养物发生明显的溶菌；以及(iv)从培养物分离噬菌体。所用的宿主细胞可以是容易被噬菌体感染并且可以用于复制噬菌体的任何的细菌菌株，例如任何的绿脓假单胞菌菌株。在一些实施方案中，所用的宿主细胞为例如绿脓假单胞菌菌株433/07，根据布达佩斯条约，绿脓假单胞菌菌株433/07于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号为NCIMB41861。生产和/或分离具有如下基因组的噬菌体的方法可以包括，所述基因组包含或由SEQ ID NO:5、和/或其变体组成：(i)获得鲍曼不动杆菌的培养物；(ii)使用具有如下基因组的噬菌体感染该培养物，所述基因组包含或由SEQ ID NO:5、和/或其变体组成；(iii)培养至观察到培养物发生明显的溶菌；以及(iv)从培养物分离噬菌体。所用的宿主细胞可以是容易被噬菌体感染并且可以用于复制噬菌体的任何的细菌菌株，例如任何的鲍曼不动杆菌菌株1305/05。在一些实施方案中，所用的宿主细胞为例如鲍曼不动杆菌菌株1305/05，根据布达佩斯条约，鲍曼不动杆菌菌株1305/05于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号为NCIMB41863。

可以使用本发明所述的或本领域已知的任何方法由细菌样品分离噬菌体(例如参见Carlson,“Working with bacteriophage:commontechniques and methodological approaches,”In,Kutter andSulakvelidze(Eds)Bacteriophage:Biology and Applications,5^th ed.CRC Press(2005)；该文献以引用方式全文并入本文)。可以使用的特定的细菌菌株包括例如金黄色葡萄球菌743/06菌株(例如用于分离噬菌体F44/10和F125/10)、绿脓假单胞菌433/07菌株(例如用于分离噬菌体F770/05和F510/08)、以及鲍曼不动杆菌菌株1305/05(例如用于分离噬菌体F1245/05)。根据布达佩斯条约，金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05菌株于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号分别为NCIMB 41862、NCIMB 41861和NCIMB 41863。此外，噬菌体可以由任何其他的细菌菌株分离，其中所述的细菌菌株容易被一种或多种噬菌体感染，并且噬菌体在该细菌菌株中复制。

抗生素组合物

本发明的噬菌体混合物被引入到药物组合物中用于治疗和/或预防由细菌引起的细菌感染(例如糖尿病足感染)，其中所述的细菌包括但不限于鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌。不同的噬菌体菌株的混合物(例如本发明所公开的)可以与药物可接受的载体组合，例如赋形剂或稳定剂。药物可接受的载体、赋形剂和稳定剂的实例包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白和明胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；盐形成的抗平衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。此外，本发明的药物组合物(例如抗细菌组合物)例如除了上述组分以外，还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、风味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。

此外，本发明的噬菌体混合组合物还可以与一种或多种非噬菌体治疗性试剂和/或预防性试剂组合，用于治疗和/或预防细菌感染，如本发明所述和/或本领域已知的那样(例如一种或多种抗生素试剂)。可以与本发明的噬菌体混合物组合使用的其他治疗性试剂和/或预防性试剂包括但不限于抗生素试剂、抗炎症试剂、抗病毒试剂、局部麻醉剂、生长因子和皮质类固醇。在一些优选的实施方案中，药物组合物被配制用于治疗和/或预防糖尿病足感染，并且包括选自抗生素试剂、局部麻醉剂和生长因子中的一种或多种其他的治疗性试剂和/或预防性试剂。在一些实施方案中，在缺乏抗生素试剂的条件下施用噬菌体混合物。

可以与包含本发明的噬菌体混合物的药物组合物一起使用的标准的抗生素包括但不限于：丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红球菌链霉素、链霉素、托普霉素、阿泊拉霉素、利福霉素、萘霉素、莫匹罗星、格尔德霉素、安丝菌素、碳头孢烯类、亚胺培南、美罗培南、尔他培南、法罗培南、多尼培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南、PZ-601、头孢霉素类、头孢乙腈素、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、先锋霉素、头孢匹林、羟胺唑头孢菌素、头孢氮氟、孢西酮、唑啉头孢菌素、头孢拉定、头孢沙定、头孢替唑、氯氨苄青霉素、头孢尼西、头孢罗齐、头孢呋辛、头孢唑南、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、头孢卡品酯、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美酯、头孢克肟、头孢甲肟、头孢特仑、头孢布腾、头孢噻夫、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他定拉氢头孢、头孢吡肟、头孢平、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹咪、氟氧头孢、正头孢吡普、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、美红霉素、罗红霉素、噻肟单酰胺菌素、青霉素及青霉素衍生物、放射菌素、杆菌肽、黏菌素、多黏菌素B、西诺沙星、氟甲喹、萘啶酮酸、恶喹酸、吡咯酸、吡呱酸、罗索沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、罗氟哌酸、那地沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟哌酸、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、妥舒沙星、克林沙星、加雷沙星、吉米沙星、stifloxacin、trovalfloxacin、普卢利沙星、醋唑磺胺、苯唑拉胺、丁尿胺、塞来考昔、氯噻酮、氯哌胺、二氯苯二磺胺、多佐胺、依索唑胺、腹安酸、二氢氯噻、吲达帕胺、mafendide、美夫西特、美托拉宗、丙磺舒、磺胺醋酰、磺胺地托辛、磺胺多辛、磺胺、磺胺甲恶唑、柳氮磺胺吡啶、硫噻嗪、舒马普坦、希帕胺、四环素、氯四环素、氧四环素、多西环素、赖氨四环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、氢吡四环素、甲氧西林、萘夫西林、oxacilin、氯洒西林、万古霉素、替考拉宁、氯林可霉素、复方增效磺胺、氟氯西林、双氯青霉素、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素以及它们的任意组合，其中对于给定感染而言，所述药的药量为有效额外和/或协同地增加本发明的噬菌体混合物的治疗和/或预防作用。

在一些优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含具有针对鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌中的一种或多种的抗细菌活性的抗生素试剂。在一些更有选的实施方案中，本发明的药物组合物包含具有针对鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的抗细菌活性的抗生素试剂。在一些其他的实施方案中，本发明的药物组合物包含抗生素试剂，该试剂具有针对除了鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌以外的细菌的抗细菌活性。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于治疗和/或预防由葡萄球菌物种引起的细菌感染，例如金黄色葡萄球菌。在一些此类的实施方案中，所述的药物组合物包含含有如下噬菌体的混合组合物，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQID NO:1的核酸序列组成，例如分离的噬菌体F44/10，所述的噬菌体靶向多种葡萄球菌物种的菌株，包括金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，所述的药物组合物包含含有如下噬菌体的混合物，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQ ID NO:2的核酸序列组成，例如分离的噬菌体F125/10，所述的噬菌体靶向多种葡萄球菌物种的菌株，包括金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，所述的药物组合物包含混合物，该混合物包含至少F44/10和F125/10噬菌体菌株。在某些实施方案中，所述的药物组合物包含混合物，该混合物包含至少一种表现出针对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株(例如F44/10和F125/10)的抗细菌活性的噬菌体菌株，以及至少一种表现出针对不同细菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。例如在一些实施方案中，所述的药物组合物包含混合物，该混合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:1或2或者其变体组成，以及至少一种具有如下基因组的其他噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:3,4或5或者其变体。在一些实施方案中，所述的药物组合物可以进一步包含其他试剂，例如具有针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性的抗生素试剂；和/或具有针对除了金黄色葡萄球菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于治疗和/或预防由假单胞菌物种引起的细菌感染，例如绿脓假单胞菌。在一些此类的实施方案中，所述的药物组合物包含含有如下噬菌体的混合组合物，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQ IDNO:3的核酸序列组成，例如分离的噬菌体F770/05，所述的噬菌体靶向多种假单胞菌物种的菌株，包括绿脓假单胞菌。在一些实施方案中，所述的药物组合物包含含有如下噬菌体的混合组合物，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQ ID NO:4的核酸序列组成，例如分离的噬菌体F510/08，所述的噬菌体靶向多种假单胞菌物种的菌株，包括绿脓假单胞菌。在一些实施方案中，所述的药物组合物包含混合物，该混合物包含至少F770/05和F510/08噬菌体菌株。在某些实施方案中，所述的药物组合物包含混合物，该混合物包含至少一种表现出针对一种或多种绿脓假单胞菌菌株的抗细菌活性的噬菌体菌株(例如F770/05和F510/08)，以及至少一种表现出针对不同细菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。例如，在一些实施方案中，所述的药物组合物包含混合物，该混合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:3或4或者其变体组成，以及至少一种具有如下基因组的其他噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQID NO:1,2或5或者其变体组成。在一些实施方案中，所述的药物组合物可以进一步包含其他试剂，例如具有针对绿脓假单胞菌的抗细菌活性的抗生素试剂；和/或具有针对除了绿脓假单胞菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于治疗和/或预防由不动杆菌物种引起的细菌感染，例如鲍曼不动杆菌。在一些此类的实施方案中，所述的药物组合物包含含有如下噬菌体的混合组合物，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQ IDNO:5的核酸序列组成，例如分离的噬菌体F1245/05，所述的噬菌体靶向多种不动杆菌物种的菌株，包括鲍曼不动杆菌。在某些实施方案中，所述的药物组合物包含混合物，该混合物包含至少一种表现出针对一种或多种鲍曼不动杆菌菌株的抗细菌活性的噬菌体菌株(例如F1245/05)，以及至少一种表现出针对不同细菌的抗细菌活性的噬菌体菌株。例如在一些实施方案中，所述的药物组合物包含混合物，该混合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQID NO:5或者其变体组成，以及至少一种具有如下基因组的其他噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO:1,2,3或4或者其变体组成。在一些实施方案中，所述的药物组合物可以进一步包含其他试剂，例如具有针对鲍曼不动杆菌的抗细菌活性的抗生素试剂；和/或具有针对除了鲍曼不动杆菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

可以配制用于本发明的药物组合物的局部麻醉剂包括但不限于丁卡因、盐酸丁卡因、盐酸利多卡因、盐酸二甲异喹、辛可卡因、盐酸辛可卡因、氨苯丁酯苦味酸和盐酸普拉莫星。局部麻醉剂的示例性浓度为全部组合物重量的大约0.025％至大约5％。在一些优选的实施方案中，将麻醉剂与本发明的混合物一起配制在药物组合物(其为局部配方)中。

可以与本发明的药物组合物一起使用的皮质类固醇包括但不限于倍他米松、二丙酸盐、氟新诺龙、锕类、戊酸倍他米松、triamcinoloneactinide、丙酸氯倍他索、去羟米松、双醋二氟拉松、安西缩松、氟氢缩松、戊酸氢化可的松、氢化可的松丁酸酯和地奈德。皮质类固醇的示例性浓度为全部组合物重量的大约0.01％至大约1％。

可以与本发明的药物组合物一起使用的生长因子包括但不限于血小板衍生的生长因子、粒细胞集落刺激因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子和血管内皮细胞生长因子。

在一些优选的实施方案中，用于治疗和控制糖尿病足部溃疡的生长因子还可以与本发明的噬菌体混合组合物组合使用。例如在治疗和预防糖尿病足部溃疡中，血小板衍生的生长因子(PDGF)和粒细胞集落刺激因子(GCSF)为重要的生长因子(Papanas et al.2007.LowerExtremity Wounds 6(1):37-53)。认为PDGF有助于巨噬细胞向溃疡处迁移，并且刺激胶原蛋白的合成，从而改善愈合(例如参见Meyer-Ingold W et al.1995Cell Biol Int 19:389-398)。PDGF是市售可得的。市售可得的形式包括：Procurn(Curative Technologies In.,New York)，其包含所有血小板相关生长因子悬浮于胶原蛋白基中形成的溶液；贝卡普勒明(Regranex gel,Ortho-McNeil Pharmaceutical,Inc.,Titusville,NJ)，其包含重组同源二聚体PDGF。认为GCSF会增强嗜中性粒细胞的杀细菌和噬菌活性，而该活性在糖尿病患者中受到损害(Roilides E et al 1991J Infect Dis 163:579-583)。此外，PDGF也是市售可得的。市售可得的形式包括非格司亭(非糖基化的GCSF；Neupogen,Amgen Inc.,Thousand Oaks,CA)和来诺拉提(糖基化的GCSF；Granocyte,Sanofi Aventis Inc.,Paris France)。

用于治疗和控制糖尿病足部溃疡的其他生长因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。认为EGF会促进胶原蛋白的合成、上皮形成和血管再生(Brown GL et al 1986J Exp Med163:1319-1342；and Brown GL et al 1991Plast Reconstr Surg88:189-194)。此外，认为FGF会促进胶原蛋白合成、上皮形成、血管再生以及有助于成纤维细胞增殖(Sasaki T 1992J Dermatol19:664-666；and Auirinia A et al 1998Scand J Plast Reconstr HandSurg 32:9-18)。认为NGF通过刺激角化细胞生长和心血管形成而促进愈合(Generini S et al 2004Exp Clin Endocrinol Diabetes112:542-544)。此外，VEGF还显示出加速皮肤愈合，并且被认为会动员来自骨髓的血管先驱细胞和内皮细胞(Galiano RD et al.2004AmJ Pathol 164:1935-1947)。本发明所公开的和/或本领域已知的一种或多种生长因子可以与包含本发明的噬菌体混合物的药物组合物组合使用。

包含本发明的噬菌体混合物的药物组合物可以配制成单位剂量或多剂量配制物。优选的配制物为可以局部施加的配制物，例如选自软膏、溶液和喷雾的配制物。其他合适的配制物包含悬浮物、乳液、提取物、粉末或颗粒；此外，可以包括分散剂或稳定剂。

本发明的药物组合物优选地局部(例如以洗剂、溶液、乳膏、软膏或隔离剂形式)，或者皮外或经皮(例如通过使用皮肤贴膏)施用。此外或可任选地，本发明的药物组合物可以通过吸入、栓剂或阴道栓剂形式、口服(例如片剂，其可以包含赋形剂，例如淀粉或乳糖；胶囊、胚珠制剂、酏剂、溶液或悬浮物，它们均可任选地包含风味剂、着色剂和或赋形剂)施用，或者它们可以为肠胃外注射(例如静脉内、肌肉内或皮下)。对于肠胃外施用而言，所述的组合物可以以无菌水溶液形式使用，其中所述的溶液可以包含其他的物质，例如足够的盐或单糖，从而得到与血液等渗的溶液。对于口腔或舌下施用而言，所述的组合物可以以片剂或锭剂的形式施用，其中所述的片剂或锭剂可以以传统的方式配制。在优选的实施方案中，本发明的噬菌体混合物可以以单一的试剂或者与其他治疗和/或预防性试剂(如本发明所述的或本领域已知的那些)组合的形式配制用于局部施用。

在特别优选的实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于局部施用，例如向不完整皮肤的区域。不完整的皮肤可以包括但不限于皮肤损伤、水疱、慢性溃疡、囊肿、水肿、大疱、开放性疮口例如褥疮性溃疡(褥疮)和其他压疮、蜂窝组织炎、丹毒病变、伤口、烧伤、痈、皮肤溃疡(例如与糖尿病足感染有关的皮肤溃疡)，或者其中皮肤受到损伤、破坏、破裂、缺口和/或其他损害的其他状况。局部配制物通常包含无菌缓冲剂，例如无菌PBS，水，生理盐水缓冲剂或无菌SM缓冲剂。一种特别适用于本发明的某些实施方案中的SM缓冲剂包括Tris-HCl,NaCl和/或MgSO₄.7H₂O，例如大约0.05M Tris-HCl(pH7.4-7.5)、大约0.1M NaCl和/或大约10mM MgSO₄.7H₂O。在其他的实施方案中，所述的配制物进一步包含SM缓冲剂和10mM MgCl₂。在其他实施方案中，所述的配制物进一步包含SM缓冲剂和大约20％至大约30％的乙醇。

对于皮肤的局部用途而言，本发明的药物组合物可以与用于局部配制物的一种载体或者载体的组合相组合，其中所述的载体可以包括但不限于水性液体、醇基液体、水溶性胶体、洗剂、软膏、非水性液体基、矿物油基、矿物油与矿脂的共混物、羊毛脂、脂质体、蛋白质载体(例如血清白蛋白或明胶)、粉末状纤维素carmel、及它们的组合。

用于局部配制物的载体可以包含半固体和/或胶体状的媒介物，其可以包括聚合物增稠剂、水、防腐剂、活性表面活性剂、乳化剂和/或溶剂或混合溶剂系统。美国专利No.5,863,560公开了可以有助于皮肤暴露于药剂的多种不同载体的组合，并且该文献的内容以引用方式并入本文。所述的载体可以包括或不包括控释配制物，例如US2008/0260697中所公开的那样，该文献的内容以引用方式并入本文。所述的载体包括或不包括吸附于基质上的噬菌体，例如在US2008/0038322、US 2008/0138311、US 2009/0130196、EP 1 812 025、EP 1 817 043和EP 1 833 497中的任意一个所公开的那样，这些文献的内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，所述的载体可以包含或不包含粘性配制物，例如胶体，例如US 2009/0191254中所公开的那样，该文献的内容以引用方式并入本文。

在一些特别优选的实施方案中，本发明的局部药物组合物在密闭容器中提供。所述的容器可以为小瓶、管、瓶、安瓿等；并且可以包括或由玻璃、塑料或其他合适的材料组成。例如安瓿通常由长度较短的玻璃管通过使用气焊枪加热成型和施加重力(gravity)而工业化生产的。通常使用计算机可视技术用于质控。安瓿的填充和密封可以通过自动化的机器来进行。空安瓿可以购自scientific glass supply house，并且优选在惰性气氛下使用例如小型气焊枪密封。在一些实施方案中，所述的容器除了药物组合物以外还可以充满惰性气体。在一些实施方案中，所述的噬菌体混合组合物在安瓿或其他合适的容器中提供，并被转移至适于与不完整的皮肤直接接触的媒介物，例如贴膏、毛巾、绑带、敷料，如下文所述。

局部递送模式可以包括涂抹、喷雾、绷带、定时释放的贴膏、液体吸附的毛巾及它们的组合。在一些特别优选的实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物以直接方式，或者在载体中、在贴膏、毛巾、绷带、敷料或适用于与皮肤(特别是不完整的皮肤)直接接触的其他媒介物中提供。

在一些实施方案中，局部施用的本发明的药物组合物包括敷料的使用。包含本发明的噬菌体混合物的药物组合物可以被引入到敷料中，和/或与敷料分别分开使用。敷料通过保持伤口潮湿、创建针对感染的屏障和/或保持周围皮肤干燥而促进愈合。

在一些实施方案中，所述的敷料可以包括湿性伤口敷料。例如包含使用湿性伤口敷料的湿性伤口疗法在治疗和控制未愈合的伤口(包括糖尿病足部溃疡)中代表了标准的疗法。在湿性伤口疗法中，将伤口敷以可以提供免于外部污染的保护、防止伤口干燥和提供有助于伤口闭合的环境的材料。在治疗糖尿病溃疡时，应考虑伤口中的湿度。高水平的渗出物是选择吸湿材料的理由，包括但不限于藻酸盐、泡沫、胶原蛋白-藻酸盐的组合、羧甲基纤维素材料或纱布。低渗出物和干燥的伤口对水凝胶通常反应良好。水凝胶片通常包含交联的亲水性聚合物的三维网格。无定型的水凝胶与水凝胶片中的组成相似，但是缺乏交联。此外，所述的胶体可以包括其他的组分，例如胶原蛋白、藻酸盐或络合的碳水化合物。

在US，用于治疗糖尿病足部溃疡的标准的敷料护理仍使用湿到干或湿到微湿的盐水纱布敷料。藻酸盐敷料通常包括由褐海藻衍生的天然多糖的钙盐或钙-钠盐。当藻酸盐材料将要与富含钠的伤口渗出物接触时，发生离子交换，从而产生亲水性胶体。

其他敷料的选择包括但不限于膜，其包括粘合性底膜、胶体、泡沫(包括涂敷有机硅的泡沫)、水状胶体、胶原蛋白基敷料、吸水性聚合物等。水状胶体敷料通常包括粘合剂、吸水剂和弹性体成分。例如羧甲基纤维素为普通的吸水性组分。此外，亲水性纤维敷料通常也包括羧甲基纤维素，例如羧甲基纤维素钠。泡沫敷料通常包括聚合物(例如聚亚胺酯)，具有能够保持流体的小型开放小室。一些不同种类的泡沫敷料具有覆盖顶表面的防水膜，并且在伤口接触一侧或在伤口边缘具有粘合涂层。膜敷料通常包括涂敷在具有粘合剂一侧上的聚亚胺酯的单一薄透片。该片可渗透气体和水蒸气，但是不能渗透伤口的流体。亲水性纤维敷料通常包括羧甲基纤维素钠纤维。胶原蛋白基敷料通常包括由牛、猪、马或鸟类来源衍生的纯化的胶原蛋白。认为胶原蛋白基敷料例如通过刺激成纤维细胞的生产而有助于伤口愈合。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物的局部施用包括滴注。包含本发明的噬菌体混合物的药物组合物可以被引入到滴注中，和/或与使用的滴注分开施加。滴注是指通过逐渐引入(例如滴落流体)流体药物组合物来施用。典型的滴注疗法在低的正压力下将流体滴注至伤口中。用于滴注的装置包括例如Kritter型滴注导管(例如参见Brent H.et al.2005.Wounds 17(2):37-48)。用于改善流体的滴注和分布的本领域已知的技术包括但不限于使用滴注流体填充伤口、施加多孔伤口填料和/或与负压伤口疗法组合。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物的局部施用包括负压伤口疗法。负压伤口疗法(NPWT)是指在伤口附近或不完整皮肤的其他区域使用减压来加强和/或加快新组织的生长。所述的疗法涉及使用与真空泵连接的密封伤口敷料以受控的方式向所述的区域施加低气压。此外，“负压伤口疗法”还可以称为“减压疗法”或“真空疗法”。通常，通过多孔垫向不完整皮肤的区域施加减压。多孔包括能够将减压分布于所述的区域和/或将在沟槽中的流体吸出的孔。

在NPWT中可以使用多种装置。NPWT装置通常包括真空泵、排放管和/或敷料组套。根据AC或电池功率和/或允许调节抽吸的强度，所述的泵可以是固定的或便携式的。敷料组套可以包括例如放置在伤口上的泡沫或纱布敷料，和用于密封所述的区域的粘合性膜覆盖物。根据所用的敷料或待治疗的伤口，排放管可以形成多种构造。根据所用的敷料或待治疗的伤口，排放管可以形成多种构造。一旦敷料被密封，便可以设定真空泵以递送连续的或间断的压力，其水平通常在-125和-75mmHg之间变化。NPWT可以用于施用本发明的药物组合物，例如其中所用的NPWT装置允许递送流体，例如流体药物组合物(例如参见Gerry R,et al.2007.Ann Plast Surg 59(1):58–62)。

本发明所述的和/或本领域已知的施用方式可以用于根据合适的剂量方案来递送所需剂量的本发明的噬菌体混合物。剂量和剂量方案可以根据具体的配方、施用途径、待处理的状况和其他因素而改变。动物试验为确定在人类疗法中的有效剂量提供可靠的指导，例如其在普通医生的技术范围内。根据所述的原理，本领域的任一普通技术人员可以进行有效剂量的种间类推，例如通过Mordenti,J.et al.“Theuse of interspecies scaling in toxicokinetics”in Toxicokinetics andNew Drug Development,Yacobi et al.,Eds.,Pergamon Press,NewYork 1989,pp 42-96。

可以根据剂量方案施用本发明的药物组合物。在慢性溃疡和糖尿病足感染的治疗(例如包括但不限于与其有关的皮肤溃疡的治疗)，最初(例如在诱导期)可以遵循第一剂量方案，并且之后(例如在维持期)可以遵循第二剂量方案。在一些实施方案中，在治疗的最初的大约12小时内，或者在最初的大约18小时、大约24小时、大约36小时或者大约48小时，遵循诱导期剂量方案。在一些优选的实施方案中，诱导期剂量方案包括大约每小时、大约每2小时、4小时、6小时、8小时、10小时或12小时施用药物组合物。在更优选的实施方案中，诱导期剂量方案包括大约每4小时或大约每6小时(例如经过最初的24小时)施用本发明的药物组合物。在甚至更优选的实施方案中，根据诱导期剂量方案局部施用药物组合物。

在一些优选的实施方案中，诱导期后为维持期，例如其中可以遵循不同的剂量方案。维持期可以持续几天、几周、几个月或更长，在起始治疗之后。在一些实施方案中，在诱导期后，维持期持续大约1、2、3、4、5、6或7天。在一些实施方案中，所述的药物组合物施用2、3或4周；2、4、6、8、10或12个月；或者2、3、4、5或更多年。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物例如在几年或在患者的一生中长期施用。

在一些实施方案中，与诱导期剂量方案相比，维持期剂量方案包括以较低的剂量频率施用本发明的药物组合物。例如在一些优选的实施方案中，大约每6小时、8小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时施用药物组合物。在更优选的实施方案中，维持期剂量方案包括大约每12小时或大约每24小时施用本发明的药物组合物，例如在诱导期后至少大约3或4次其他施用。在甚至更优选的实施方案中，根据维持期剂量方案局部施用所述的药物组合物。

治疗用途

本发明的另一个方面涉及噬菌体混合组合物在预防和/或治疗细菌感染中的用途。在具体的实施方案中，接受本发明的药物组合物的受试对象为哺乳动物，例如牛、绵羊、公山羊、马科动物、灵长动物(例如人类)、啮齿动物、兔类动物或鸟类(例如鸡、鸭和鹅)。在优选的实施方案中，接受本发明的药物组合物的受试对象为人类，具体为遭受慢性溃疡或处于遭受慢性溃疡风险中的糖尿病患者，所述慢性溃疡包括糖尿病足感染。就本发明而言，“治疗”是指在接受药物组合物的患者中获得治疗性益处。就取得治疗性益处而言，目的是消除、减轻、处理、降低与致病状况或紊乱有关的症状或根本原因(例如细菌感染)的严重性，防止恶化，缓解或减慢与致病状况或紊乱有关的症状或根本原因(例如细菌感染)的进程。此外还考虑，在某些实施方案中，本发明的噬菌体混合物可以作为预防或治疗措施，从而防止由一种或多种细菌引起的感染的发作。“预防”是指在接受药物组合物的受试对象中获得预防性益处。就取得预防性益处而言，目的是延迟或阻止与致病状况或紊乱有关的症状或根本原因(例如细菌感染)。

本发明的噬菌体混合物具有针对多种细菌菌株的活性。在一些优选的实施方案中，噬菌体混合物具有针对多种鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌菌株的活性。因此，本发明的另一个方面提供了使用噬菌体混合组合物来治疗和/或预防人类和动物两者中与鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌有关的感染。在其他的方面中，本发明提供了治疗和/或预防与这些细菌的有关物种或菌株有关的感染。在一些特别优选的实施方案中，细菌感染为与糖尿病下肢感染(例如糖尿病足感染)有关的感染。

特别是在具有受损的免疫系统的个体(包括糖尿病患者)中，鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌会造成许多严重的机会感染。本发明的药物组合物被考虑用于治疗和/或预防与鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌有关的、或者与如下细菌的其他物种或菌株有关的任何感染，所述细菌包括但不限于皮肤感染、伤口中或伤口周围感染、慢性溃疡、与烧伤有关的溃疡、手术后感染、与导管和手术排放有关的感染和血液感染。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物在治疗和/或预防与不完整皮肤的区域有关的细菌感染中具有用途。与不完整皮肤的区域有关的感染包括但不限于与皮肤溃疡有关的感染，例如糖尿病足部溃疡、皮肤损伤、水疱、囊肿、水肿、大疱、开放性疮口例如褥疮性溃疡(褥疮)和其他压疮、慢性溃疡、蜂窝组织炎和与之有关的伤处、丹毒和与之有关的损伤、伤口、烧伤和与之有关的伤口、痈或者其中皮肤受到损伤、破坏、破裂、缺口和/或其他损害。

在特别优选的实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物在治疗慢性溃疡中具有用途。慢性溃疡可以由多种因素所导致的伤口中出现，特别是在患有受损的血液循环(例如由心血管问题或者由床或轮椅产生的外部压力)的患者中。仅仅在美国，每年可诊断出超过8百万的患者患有慢性皮肤溃疡(Harsha,A.et al.,2008,Journal ofMolecular Medicine,86(8):961–969)，这每年要花掉超过100亿美元(Margolis,DJ,et al.,2002,Journal of the American Academy ofDermatology 46(3):381–386)。慢性溃疡可以在嘴、喉咙、胃和皮肤上发展。慢性皮肤溃疡包括糖尿病溃疡、静脉性溃疡、放射性溃疡和压力性溃疡，其中3种主要类别的慢性皮肤溃疡是糖尿病溃疡、静脉血溃疡和压力性溃疡。慢性溃疡可以导致大部分皮肤的整体性丧失，甚至导致发病率和死亡率。

在甚至更加特别优选的实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物在治疗糖尿病下肢感染(例如糖尿病足感染)中具有用途。糖尿病足感染为糖尿病的一种主要的并发症，所有糖尿病患者的15％会发生此并发症，并且导致大约85％整个小腿截肢(Brem,et al.,J.ClinicalInvest.,2007,117(5):1219–1222)。糖尿病阻断了伤口愈合过程的正常步骤，因此糖尿病足感染将与非治愈性慢性皮肤溃疡有关。

慢性伤口表示急性伤口愈合的正常过程失效。伤口愈合通常被分成3个截然不同的阶段：炎症、增殖和重塑。伤口愈合的炎症阶段开始于损伤时，此时通过血小板血栓形成了凝块，由此激发自于嗜中性粒细胞和巨噬细胞的应答。最初，嗜中性粒细胞通过释放多种蛋白酶和反应性氧自由基来清除细菌和残渣的伤口。然后，巨噬细胞通过化学诱导物被吸引至伤口位点，随后释放它们自己的化学诱导物以刺激成纤维细胞和更多的巨噬细胞。在增殖阶段，成纤维细胞激发上皮形成、血管再生和胶原蛋白形成。如果基底膜保持完整，上皮形成通常由基底膜开始，如果基底膜不完整，则上皮形成由伤口边缘开始。在该阶段，成纤维细胞合成III型胶原蛋白，并转变成肌成纤维细胞，其有助于刺激伤口收缩。在重塑阶段，III型胶原蛋白开始被I型胶原蛋白替代。胶原蛋白被编织成有组织的交联的网格，该网格的力量达到原始未损伤组织的80％。

有许多因素可以拖延3个阶段的愈合过程，并将急性伤口转变为慢性伤口。这些因素可以包括成纤维细胞的增殖能力低、受体的下调、生长因子减少或者皮肤中合适的蛋白质基质的缺乏。此外，低灌注和/或低营养可以导致伤口停滞在炎症阶段，并导致渗出物在伤口中过多形成。慢性溃疡可以被认为是不完整皮肤的非治愈性区域，例如不能遵循伤口愈合的正常过程(例如上文所述的那样)和/或对初始治疗不能应答或不能对初始治疗适当应答的、不完整皮肤的区域。皮肤上的慢性溃疡特征在于持续超过4周而没有明显的愈合趋势的伤口损伤，或频繁再现的伤口(Fonder,M.et al.,2012,Journal of the AmericanAcademy of Dermatology 58(2):185–206)。慢性伤口可以出现红色肉芽和黄脓、在肉芽组织周围的暗紫色皮肤、或灰白色和肿胀的肉芽。慢性皮肤溃疡的标准护理程序包括例如以下方面：除去坏死或感染的组织；建立充足的血液循环；保持湿的伤口环境；处理伤口感染；伤口清洁；和营养支持，包括对患有糖尿病溃疡的受试对象进行血糖控制。例如在糖尿病患者中，差的血糖水平允许细菌在伤口中更快速地生长；此外，糖尿病中的神经变性是指至少在开始时，所述的状况可能是不痛苦的，因此是不被觉察的。慢性溃疡(包括糖尿病足部溃疡)通常被机会性细菌进一步感染，从而导致所述的状况恶化。鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌与此类感染有关。

此外，鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌也与涉及器官系统(其中具有高的流体含量)的感染有关，并且考虑就此类感染而言，本发明的噬菌体混合物具有治疗和/或预防用途。例如本发明的药物组合物可以用于预防或治疗呼吸道、脑脊髓液、腹水和泌尿道的感染。此外，本发明的组合物还可以用于预防和/或治疗医院获得性肺炎、与持续不卧床腹膜透析(CAPD)有关的感染、导管相关的菌血症和医院获得性脑膜炎。在一些实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物在例如医院环境中预防使用。例如本发明的噬菌体混合组合物可以在预防与伤口或破碎皮肤(例如由于导管术和任何其他的医疗程序或装置)有关的感染中具有用途。

在一些优选的实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于治疗和/或预防由鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌所引起的细菌感染的方法中。在一些更优选的实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于治疗和/或预防由鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌所引起的细菌感染的方法中。在一些其他的实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于治疗和/或预防除了鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌以外的细菌所引起的细菌感染的方法中。

在一些优选的实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于治疗和/或预防由葡萄球菌物种(例如金黄色葡萄球菌)；假单胞菌物种(例如绿脓假单胞菌)；和不动杆菌物种(例如鲍曼不动杆菌)所引起的细菌感染的方法中。在一些此类的实施方案中，所述的药物组合物可以包含含有如下噬菌体的混合组合物，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述的基因组包含或由SEQ ID NO:1、2、3、4和5或者其变体组成的核酸序列组成，例如分离的噬菌体菌株F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05或者其变体。在一些特别优选的实施方案中，药物混合组合物用于治疗、预防、控制和/或处理慢性溃疡，例如糖尿病足感染和与其有关的皮肤溃疡。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防慢性溃疡的方法，该方法包括向有需要的受试对象施用治疗或预防有效量的本发明的药物组合物。在优选的实施方案中，施用包括向与慢性溃疡有关的不完整皮肤的区域的局部施用。在更优选的实施方案中，在对待治疗的区域实施清创术后，进行局部施用。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防糖尿病足感染的方法，该方法包括向有需要的受试对象施用治疗或预防有效量的本发明的药物组合物。在优选的实施方案中，施用包括向与糖尿病足感染有关的不完整皮肤的区域(例如皮肤溃疡)的局部施用。在更优选的实施方案中，在对待治疗的区域实施清创术后，进行局部施用。

可以通过多种方法完成清创术。手术清创涉及切去伤口的死亡组织或不完整皮肤的其他区域。机械清创术使用了多种方法来松动和除去伤口残渣，例如加压冲洗装置、漩涡水浴或特定的敷料。自溶性清创术增强了募集酶从而破坏死亡组织的肌体的天然过程，其中例如使用了保持伤口潮湿和清洁的合适的敷料。酶解清创术在伤口的位点或不完整皮肤的其他区域处使用化学酶和合适的敷料来进一步帮助破坏死亡组织。

由于清创术降低了细菌存在的生物负担，而且还开放了用于局部抗微生物疗法(TAT)的、时间依赖的治疗窗口，所以改善了局部治疗(Wolcott RD,et al.2010.J Wound Care 19:320-328)。关于清创术的时间选择而言，一旦在伤口处理中选择了这种治疗，则早期或立即清创术优于延迟的清创术。此外，在伤口处理的过程中可以开始多次清创术(Wolcott RD,et al.2009.J Wound Care 18(2):54-6)。例如在一些实施方案中，清创术早于本发明噬菌体混合组合物的局部应用，并且在每次施用混合组合物之前重复该清创术。在一些实施方案中，仅仅在每隔一次施用混合组合物之前实施清创术，或者仅仅在每第3次、第4次、第5次或第6次施用混合组合物之前实施清创术。在一些实施方案中，无论在局部施用本发明的混合组合物之前是否实施清创术，其都在治疗伤口的保健医生(例如医生、医生助手或紧急医务人员)的临床判断范围内。

本发明的噬菌体混合组合物可以在治疗、处理、控制和/或预防与慢性溃疡有关的感染(包括糖尿病足感染和与其有关的皮肤溃疡)中具有用途。在其他的实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物可以在治疗、处理、控制和/或预防与不完整的皮肤的其他区域有关的细菌感染(例如蜂窝组织炎伤处、丹毒病变、褥疮性溃疡、烧伤和压疮)中具有用途。在一些类此的实施方案中，所用的组合物可以为配制用于局部施用的局部组合物，例如用于直接应用于不完整皮肤的区域，例如上文所述。

此外，本发明的噬菌体混合组合物在治疗、处理、控制和/或预防褥疮性溃疡中具有用途。褥疮性溃疡也称为压疮或压力性溃疡，是由于对该区域的长期压力而导致的皮肤及皮下组织的损伤。例如褥疮更通常的是在覆盖肌体(例如后脚跟、脚踝、臀部或屁股)的骨骼区域上发展。

基于褥疮的严重性，其将分入4期中的一个时期。I期是压疮开始的时期，同时皮肤仍是完整的。皮肤可以出现红色、灰白色、浅蓝色或紫色，并在接触时不变白。II期通常涉及不完整的皮肤开放性伤口。在该时期，皮肤的外层(表皮)和皮肤下层的部分(真皮)已经被损坏或丧失。溃疡可以表现为浅层桃红色盆形伤口。在III期，溃疡是深的伤口，其中皮肤的丧失可以暴露一定量的脂肪并且溃疡具有火山口样的外观。此外，伤口的底部还可以具有一些浅黄色的死亡组织(腐肉)。IV期溃疡表现出组织的大范围丧失，其中伤口可以暴露肌肉、骨骼和肌腱。伤口的底部可能包含腐肉，或黑色硬皮的死亡组织(焦痂)。

如在糖尿病足部溃疡的治疗中，清创术可以用于从伤口除去损坏、死亡或感染的组织，从而促进适当的愈合，例如如本文所述和/或以其他方式如本领域已知的那样。在一些实施方案中，在清创术之后施用本发明的药物组合物。例如在手术、机械清创术、自溶性清创术或酶解清创术之后，可以将本发明的包含噬菌体混合物的药物组合物局部施用至褥疮性溃疡。

此外，本发明的噬菌体混合组合物还在治疗、处理、控制和/或预防蜂窝组织炎和/或丹毒(包括但不限于与蜂窝组织炎和丹毒有关的伤处和损伤)中具有用途。蜂窝组织炎和丹毒是细菌通过破坏皮肤的保护性屏障而进入后所发展的皮肤感染。例如皮肤破裂、切口、水肿、烧伤、昆虫叮咬、蜘蛛叮咬、纹身、手术伤口、静脉药品注射或静脉导管插入的位点可以提供细菌进入的手段。A群链球菌和葡萄球菌是与蜂窝组织炎有关的最普通的细菌。蜂窝组织炎在中年和老年个体中是最常见的，而丹毒在年幼的孩子和老年人中发生(Ellis Simonsen SMet al.2006.Epidemiol Infect.134(2):293；and Eriksson B.et al.1996Clin Infect Dis 23:1091)。此外，患有免疫缺陷、糖尿病、酗酒、真菌感染和受损的淋巴引流的人中风险增高。糖尿病患者特别倾向于足部的蜂窝组织炎，这是因为糖尿病导致腿部的血液循环受损。下肢是丹毒和蜂窝组织炎感染的最普通的位点(Ellis Simonsen SM et al.2006.Epidemiol Infect.134(2):293；Chartier C et al 1996Int J Dermatol35:779)。

蜂窝组织炎和单独通常是共存的，并且通常显示在皮肤红斑、浮肿和温暖的区域。它们的不同之处在于，丹毒与上肢和浅表淋巴有关，而蜂窝组织炎与更深的真皮和皮下脂肪有关。因此，丹毒比蜂窝组织炎具有更截然不同的解剖学特征—丹毒病变可以升高至周围皮肤水平以上，并且在有关和无关的组织之间形成清晰的界限(Bisno AL et al.1996N Engl J Med 334:240)。病变可以表现为红色、肿胀、温暖、变硬和/或与橘皮相似的皮疹。丹毒可以出现在脸上，例如以“蝴蝶”的图案。更严重的感染可以导致水疱、大疱和瘀点，以及可能的皮肤坏疽。此外，患有丹毒的患者往往具有系统性表现症状的发作，例如发烧和发冷。

患有蜂窝组织炎的患者往往具有更渐进的发展过程，并且症状经过几天的时间出现。不同形式的蜂窝组织炎包括眶周蜂窝组织炎、腹壁蜂窝组织炎(在病态肥胖的个体中)、颊间隙蜂窝组织炎(由于链球菌肺炎)、Ludwig咽峡炎(下颌下间隙内的蜂窝组织炎)和肛周蜂窝组织炎(由于A群β溶血性链球菌)(Barzilai A,et al,1998PediatrInfect Dis J.17(4):358；Thorsteinsdottir B,et al.2005Scand J InfectDis.37(8):605)。此外，蜂窝组织炎还可以导致类流感的症状(具有高温和颤抖)。

在一些实施方案中，蜂窝组织炎或丹毒的治疗进一步包括施用抗生素试剂。例如，根据本发明的药物组合物可以与选自青霉素、氯林可霉素和美红霉素中的抗生素试剂组合来局部施用至丹毒病变。另一个实例，根据本发明的药物组合物可以与选自氟氯西林、双氯青霉素、青霉素、氨苄青霉素和羟氨苄青霉素中的抗生素试剂来局部施用与蜂窝组织炎有关的伤处。所述的抗生素可与例如本发明的混合物的局部施用一起经口服、静脉或局部施用。

此外，本发明的噬菌体混合组合物还在治疗、处理、控制和/或预防与烧伤有关的感染中具有用途。烧伤为由燃烧而直接或间接导致的不完整皮肤的区域。烧伤是可以由加热、电力、化学品、光、辐射或摩擦所导致的一种对皮肤的损伤。烧伤可以只影响皮肤(表皮组织)，但是在一些情况下还损伤更深层的组织，例如肌肉、骨骼和血管。烧伤可以根据损伤的机制、深度、程度、关联的损伤和共病来分类。烧伤可以根据真皮中损伤的深度而方便地描述，粗略地分为一度、二度、三度和四度烧伤(Walls et al.,2009,Rosen’s Emergency Medicine:Expert Consult Premium Edition(Rosen’s Emergency Medicine:Concepts&Clinical Practice(2v))。烧伤的重要特征包括其原因(热、化学品、电力)、解剖学位置、深度(整个或部分厚度)、持续的时间和程度(整个身体表面积的百分率)。影响烧伤愈合的患者特征包括年龄、营养状态、基本的医疗条件和伴随的损伤(例如脑创伤、吸入损伤、骨骼)。

烧伤患者的感染是主要问题，并且医院获得性感染的报告发生率在63-240/100名患者之间，以及53-93/1000个患者日之间(主要根据所用的定义)(Chim H,et al,2007,Burns 33:1008-1014；andWibbenmeyer L,et al.,2006,J Burn Care Res 27:152-60)。此外，烧伤的细菌感染与不利的结果和死亡率有关。在患有严重烧伤的175名患者系列中，例如在83％的患者中，感染先于多器官功能损伤，并且在36％的未存活患者中，认为感染是死亡的直接原因(Fitzwater J,etal.,2003,J Trauma 54:959-66)。烧伤可以由多种来源导致感染。烧伤最初可以感染革兰氏阳性细菌(主要是葡萄球菌)，这些细菌是被烧伤所暴露的汗腺和头发毛囊的正常深处寄居者(Sharma BR.,2007,Infect Dis Clin North Am 21:745-59；ix)。潮湿的血管烧伤焦痂可以促进微生物生长。革兰氏阴性细菌感染可以由自结肠的易位所导致，这是由于例如在烧伤和随后损伤时，肠系膜血液流动的减少所造成(Herndon DN,et al.,2000,Crit Care Med 28:1682-3)。此外，烧伤患者可以发展成免疫缺陷，包括受损的细胞毒性T细胞应答、导致嗜中性粒细胞减少症的骨髓成熟停止、受损的嗜中性粒细胞功能、和减少的巨噬细胞的生产(Sharma BR.,2007,Infect Dis Clin North Am21:745-59,ix；Gamelli RL,et al.,2000,J Burn Care Rehabil 21:64-9；Hunt JP,et al.,1998,J Surg Res 80:243-51；and Shoup M,et al.,1998,Ann Surg 228:112-22)。最后，烧伤患者对医院获得性感染敏感，而特护室中的其他患者则对此感染一般，这些感染包括血管内导管相关的感染和呼吸机相关的肺炎，并且感染的总体发生率高于特护室中的其他患者(Chim H,et al.,2007,Burns 33:1008-14；and WibbenmeyerL,et al.,2006,J Burn Care Res 27:152-60)。事实上，在第一周后，烧伤患者中的血流感染的多数事件是由医院型多重耐药细菌所导致的(Wibbenmeyer L,et al.,2006,J Burn Care Res 27:152-60；andRessner RA,et al.,2008,J Am Coll Surg 206:439-44)。

烧伤的传统治疗包括清创术和切除、向伤口施加敷料、伤口闭合、皮肤移植、流体复苏、伤口感染的处理(例如施用抗生素)、疼痛控制、营养支持和/或测量，以抑制过多瘢痕的形成。烧伤可以用清洁且干燥的片或敷料(例如保鲜膜)覆盖。在烧伤的30分钟内，使用冷水进行早期冷却可以降低烧伤的深度和疼痛。清创术、清洁和敷料是烧伤护理的重要方面。

在一些实施方案中，烧伤的治疗进一步包括施用抗生素试剂。已经显示在特护室的患者中，抗生素预防可以降低死亡率、菌血症和呼吸机相关的肺炎(Silvestri L,et al,2007,J Hosp Infect 65:187-203；andDe Smet AM,et al.,2009,N Engl J Med 360:20-31)。在烧伤患者中，皮肤是感染的另一个来源(Avni T,et al.,2010,BMJ 340:c241)。在一些实施方案中，烧伤的治疗进一步包括施用用于处理疼痛的试剂。根据本发明的药物组合物可以与用于疼痛处理的试剂组合来局部施用于烧伤处，其中所述用于疼痛处理试剂选自简单的止痛剂、布洛芬、醋氨酚和麻醉剂。抗生素试剂和/或用于处理疼痛的试剂可以与例如本发明的混合物的局部施用一起经口服、静脉或局部施用。此外，烧伤的传统治疗的一个或多个其他的方面可以与本发明的噬菌体混合组合物组合使用。

在一些实施方案中，与本发明的噬菌体混合组合物组合使用的、用于疼痛处理的试剂包括选自以下的一种或多种试剂：扑热息痛(醋氨酚)、非甾类化合物的抗炎药品、布洛芬、酮洛芬、吡罗昔康、氢可酮、吗啡、氢吗啡、氧吗啡酮、芬太尼、氧可酮、二乙酰吗啡、美沙酮、丁丙诺啡、哌替啶、戊唑辛、右旋吗拉迈得、地匹哌酮、阿密曲替林、地劳迪德、他喷他多和美沙酮。用于疼痛处理的试剂可以包括本发明所述的和/或本领域已知的用于疼痛的任何其他的试剂。

在一些优选的实施方案中，用于疼痛处理的试剂为可以局部施用的试剂，例如局部麻醉剂。局部麻醉剂为用于麻木肌体部分的表面(例如皮肤的任何区域，眼球的前面，鼻子、耳朵或喉咙的里面，肛门或性区)的局部麻醉剂。在一些实施方案中，与本发明的噬菌体混合组合物组合使用的、用于疼痛处理的试剂包括选自以下的一种或多种局部麻醉剂：苯坐卡因、氨苯丁酯、辛可卡因、利多卡因、奥布卡因、普莫卡因、丙胺卡因、丙美卡因、丙氧间卡因和丁卡因(阿美索卡因)。局部麻醉剂可以在乳膏、软膏、气溶胶、喷雾、洗剂和胶状剂中使用。在其他的实施方案中，局部麻醉剂可以与用于疼痛处理的一种或多种其他的试剂(例如另一种局部麻醉剂)或用于疼痛处理的不同试剂(例如本文所述的和/或本领域已知的、用于疼痛处理的任何其他的试剂)一起使用。

本发明的噬菌体混合组合物包括治疗和/或预防有效量的多种噬菌体菌株中的一种，如本文所述。治疗和/或预防有效量是指在接受所述量的组合物的受试对象中分别带来大致的治疗和/或预防性益处所需的量。治疗和/或预防有效量取决于特定的配方、施用途径、待治疗的状况、其他试剂或疗法是否与本发明的方法组合使用、及其他因素。

在一些具体的实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物被配制成用于治疗和/或预防与不完整皮肤的区域有关的细菌感染的药物组合物。治疗和/或预防有效量取决于不完整皮肤的区域，并且所述的药物组合物可以被配制成反应出不完整皮肤的区域。例如在一些优选的实施方案中，所述的药物组合物包含噬菌体菌株，其中各噬菌体均以大约10³至大约10¹³噬菌体颗粒/cm²所述的区域的量存在。在一些更优选的实施方案总，治疗和/或预防量可以相当于至少大约10⁴、至少大约10⁵、至少大约10⁶、至少大约10⁷、至少大约10⁸、至少大约10⁹噬菌体颗粒/cm²待治疗的不完整皮肤的区域。在一些更优选的实施方案中，治疗和/或预防量可以相当于低于大约10¹³、低于大约10¹²、低于大约10¹¹、低于大约10¹⁰、低于大约10⁹、低于大约10⁸噬菌体颗粒/cm²待治疗的不完整皮肤的区域。在还要更优选的实施方案中，各噬菌体菌株以相当于10⁷至10¹⁹噬菌体颗粒/cm²不完整皮肤的区域的量存在于药物组合物中。

在一些优选的实施方案中，根据本发明施用治疗有效量的噬菌体混合组合物使得伤口的闭合得到改善，例如不完整皮肤的区域(伤口区域)比开始治疗前的区域减小。伤口区域可以表示为在开始治疗后的一个或多个时间点时初始伤口区域的百分率。例如在一些优选的实施方案中，经过使用本发明的噬菌体混合组合物治疗一段时间后，伤口区域减少至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％或至少大约90％。在一些具体的实施方案中，伤口区域的减小发生在至少治疗开始后的第1天(t1)、在治疗开始后的第2天(t2)、在治疗开始后的第3天(t3)、在治疗开始后的第4天(t4)、在治疗开始后的第5天(t5)、在治疗开始后的第6天(t6)、在治疗开始后的第7天(t7)、在治疗开始后的第8天(t8)、在治疗开始后的第9天(t9)、在治疗开始后的第10天(t10)、在治疗开始后的第12天(t12)、在治疗开始后的第15天(t15)、在治疗开始后的第20天(t20)、在治疗开始后的第25天(t25)、在治疗开始后的第30天(t30)。在特别优选的实施方案中，伤口区域在至少治疗开始后的第9天(t9)减少大约30％至大约40％。在另一个特别优选的实施方案中，伤口区域至少在治疗开始后的第9天(t9)减少大约40％至大约50％。在另一个特别优选的实施方案中，伤口区域在治疗开始后的至少第9天(t9)减少大约50％至大约60％。在甚至更加特别优选的实施方案中，伤口区域在至少治疗开始后的第9天(t9)减少大约60％至大约70％。

在一些实施方案中，根据本发明施用治疗有效量的噬菌体混合组合物使得伤口愈合得到改善，例如根据PEDIS分类，溃疡的级别比开始治疗前的溃疡级别有所改善。PEDIS是用于与伤口有关感染的常用且有效的分类系统，该系统由the International Working Group on theDiabetic Foot(IWGDF)研发而来。IWGDF特别研发了用于分类与糖尿病足感染有关的伤口的系统，其中所述的系统使用简写PEDIS，其代表了滴注、程度(大小)、深度(组织损失)、感染、感觉(神经病)。所述的分类最初发展成研究工具(Schaper NC.,2004,DiabetesMetab Res Rev 20(Suppl 1):S90–5)，并提供各类别的严重程度的半定量级别。具体而言，PEDIS 1级相当于无感染症状或迹象；2级相当于仅涉及皮肤和皮下组织的局部感染(未涉及更深的组织并且无系统性迹象)，同时所涉及的任何红斑必须在0.5cm至2cm之间；3级相当于局部感染，如2级所描述的那样，但是涉及大于2cm的红斑或者涉及比皮肤和皮下组织更深的结构(例如脓肿、骨髓炎、脓毒性关节炎、肠膜炎)，但是不具有任何系统性炎症应答的迹象；4级相当于局部感染，如2级和3级所述，但是具有系统性炎症应答综合征的迹象，其可通过超过以下2项来证明：温度＞38℃或者＜36℃；心率＞90次/min；呼吸速率＞20次/min或者动脉二氧化碳分压＜32mmHg；白细胞计数＞12000或＜4000个/μL或者≥10％不成熟(带状)形式(例如参见Lipsky,BA,et al.,2012,CID 54:e132-e173)。另一个分类系统由IDSA(the Infectious Diseases Society of America)研发，其评定了感染伤口(特别是糖尿病足感染)的感染严重性的等级。具体而言，IDSA将PEDIS 1-4级分别评定为“未感染的”、“轻度”、“中度”和“重度”(再次参见Lipsky,BA,et al.,2012,CID 54:e132-e173)。

在一些优选的实施方案中，经过使用本发明的噬菌体混合组合物的治疗过程，PEDIS级别由4级降至3级、2级或1级。在其他优选的实施方案中，经过使用本发明的噬菌体混合组合物的治疗过程，PEDIS级别由3级降至2级或1级。在其他优选的实施方案中，经过使用本发明的噬菌体混合组合物的治疗过程，PEDIS级别由2级降至1级。在一些具体的实施方案中，溃疡级别的降低发生在至少治疗开始后的第1天(t1)、在治疗开始后的第2天(t2)、在治疗开始后的第3天(t3)、在治疗开始后的第4天(t4)、在治疗开始后的第5天(t5)、在治疗开始后的第6天(t6)、在治疗开始后的第7天(t7)、在治疗开始后的第8天(t8)、在治疗开始后的第9天(t9)、在治疗开始后的第10天(t10)、在治疗开始后的第12天(t12)、在治疗开始后的第15天(t15)、在治疗开始后的第20天(t20)、在治疗开始后的第25天(t25)、在治疗开始后的第30天(t30)。

在某些实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物用作用于治疗或预防由鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌所引起的感染(例如糖尿病足感染)的单一试剂。在其他的实施方案中，本发明的噬菌体混合物与其他试剂或靶向相同或不同细菌的抗生素进一步组合使用，其中所述的其他试剂包括其他的噬菌体(例如靶向与糖尿病足感染有关的细菌的不同物种或菌株)，所述的细菌包括选自任何的革兰氏阳性细菌、任何革兰氏阴性细菌和任何其他类的细菌(其未分为革兰氏阳性或革兰氏阴性)中的细菌。此外，本发明的组合物还可以与本领域的技术人员已知的、治疗细菌感染的任何其他的手段(具体而言为治疗糖尿病足部溃疡的任何其他的手段)组合使用。

在一些实施方案中，根据本发明的混合组合物与至少一种针对相同或不同细菌物种的其他的噬菌体菌株组合使用。在一些优选的实施方案中，根据本发明的混合组合物与至少一种选自以下的其他的噬菌体菌株组合使用：噬菌体菌株F168/08，其具有针对粪肠球菌和/或屎肠球菌中的一种或多种菌株的抗生素活性(如在WO 2011/065854和美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F170/08，其具有针对粪肠球菌和/或屎肠球菌中的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在WO 2011/065854和美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F197/08，其具有针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F86/06，其具有针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F87s/06，其具有针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F91a/06，其具有针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国专利申请公开号2012/0052048中所公开的那样)；噬菌体菌株F391/08，其具有针对肺炎克雷伯氏菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国临时申请号61/384,015中所公开的那样)；噬菌体菌株F394/08，其具有针对鲍曼不动杆菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国临时申请号61/384,01中所公开的那样)；噬菌体菌株F488/08，其具有针对大肠杆菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国临时申请号61/384,01中所公开的那样)；以及噬菌体菌株F387/08，其具有针对肺炎克雷伯氏菌的一种或多种菌株的抗细菌活性(如在美国临时申请号61/384,015中所公开的那样)(这些申请的内容均以引用方式全文并入本文)。此外，在2010年9月17日提交的美国临时申请号61/384,015和2011年9月19日提交的国际申请PCT/PT2011/000031的内容也均以引用方式全文并入本文。

如本文所用，术语“组合”、“其他的组合”或“进一步组合”是指使用其他的预防性试剂和/或治疗性试剂、以及本发明的噬菌体混合物。术语“组合”的使用不能限定将预防性试剂和/或治疗性试剂施用至受试对象的顺序。第一预防性试剂或治疗性试剂可以在将第二预防性试剂或治疗性试剂(不同于第一预防性试剂或治疗性试剂)施用至受试对象之前(例如在施用第二预防性试剂或治疗性试剂之前的5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或随后(例如在施用第二预防性试剂或治疗性试剂之后的5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防糖尿病足感染的方法，该方法包括：与用于糖尿病足感染的标准和/或非标准疗法结合施用本发明的噬菌体混合物。用于糖尿病足感染(包括但不限于与其有关的皮肤溃疡)的标准疗法包括细胞外基质替代疗法、湿性伤口疗法、负压伤口疗法、动脉血管再形成疗法、高压氧疗、施用抗生素试剂及施用生长因子(Blume et al.2008Diabetes Care 31:631-636)。

在一些实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物局部施用至例如糖尿病足部溃疡的位点，同时系统性施用其他的试剂。例如在一些优选的实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物局部施用至例如糖尿病足部溃疡的位点，同时系统性施用抗生素试剂。在涉及糖尿病足部溃疡的治疗的还要更优选的实施方案中，系统性施用的抗生素试剂具有针对鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。在一些实施方案中，本发明的噬菌体混合组合物与其他的试剂一起局部施用至例如糖尿病足部溃疡的位点，其中所述的其他试剂也是局部施用的。例如在一些优选的实施方案中，本发明的噬菌体混合药物组合物与生长因子一起局部施用至例如糖尿病足部溃疡的位点。

细胞外基质疗法用于治疗、处理、控制和/或预防不完整皮肤的未愈合区域，并且为糖尿病足部溃疡的标准疗法。细胞外基质的合成(ECM)是伤口愈合的重要特征，特别是在有明显的组织损失时更是如此。细胞外基质疗法被设计成通过提供蛋白酶的竞争性底物(胶原蛋白)，从而减少基本细胞外基质(ECM)成分的蛋白水解破坏而降低伤口流体中的蛋白酶水平，并促进愈合。例如ECM疗法可以包括施用能够减少纤连蛋白和/或血小板衍生的生长因子(PDGF)的蛋白水解的破坏、以及减少基质金属蛋白酶(MMP)(例如金属阳离子的混合物)的合成的试剂。此外，ECM疗法还可以包括施用牙釉蛋白，其为在皮肤的再生和修复中具有生物学活性的ECM蛋白质(Romanelli M.2010Wounds-Clinical Review 6(2):47-52)。

此外，ECM疗法还可以包括使用生物改造的组织来例如替代丧失的ECM。生物改造的组织也称为“皮肤替代产物”或“皮肤取代物”，其通常包括具有活细胞或不具活细胞的生物学基质(Brian DL et al.2011.Expert Rev Dermatol.6(3):255-262)。大部分的生物改造组织可以分为活组织取代物与生物活性附件。生物改造的组织看起来像一块薄的圆形的真实皮肤，并且可以直接放置在不完整皮肤的区域上。尽管愈合的准确机制尚未完全了解，但是据信生物改造的组织可以通过使用细胞外基质填充伤口，并且还可以表达促进愈合的其他的生长因子和细胞因子来改善愈合。在糖尿病足部溃疡的治疗中使用的生物改造的组织的具体实例包括Apligraf和Dermagraft，其是市售可得的。

此外，动脉血管再形成疗法(ART)还用于治疗、处理、控制和/或预防不完整皮肤的非治愈性区域，并且也是用于糖尿病足部溃疡的标准疗法。治疗糖尿病足感染的优选方法包括ART的经皮疗法，其涉及经皮球囊血管形成术(可能具有隆起)。其他血管再形成方法包括使用隐静脉在主动脉股动脉搭桥和股-腘-胫动脉血管搭桥中的主髂动脉再造。

此外，高压氧疗(HBOT)还用于治疗、处理、控制和/或预防不完整皮肤的非治愈性区域，并且也是用于糖尿病足部溃疡的标准疗法。HBOT是指在高于正常大气压(与正常气体相比，通常氧含量升高)的条件下间歇治疗整个肌体。例如使用高压氧室，可以将压力升高至正常大气压力的2倍。此外，可以使患者暴露于浓度高达100％的氧气中。升高的压力与氧含量的升高组合使氧气溶解于血浆、体细胞、组织和流体中，这转而有助于伤口愈合过程。据信HBOT可以刺激心血管在循环降低的位置处生长，从而改善血液流入动脉阻塞的区域中。

在一些其他的实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防糖尿病足感染的方法，该方法包括施用本发明的噬菌体混合组合物与用于糖尿病足感染的非标准疗法的组合。非标准疗法通常在其中糖尿病足部溃疡难以用一种或多种标准疗法治疗的情况下使用。

实施例

应该理解的是本发明所述的以下实施例和实施方案仅是为了示例说明的目的，并且根据这些实施例和实施方案作出的多种修改或改变可以启示本领域的技术人员，并且它们将被涵盖在本申请的实质和范围内以及所附的权利要求书的范围内。

除非另作说明，否则本发明所公开的特定的噬菌体是根据本发明分离、加工和分析的。此外，根据葡萄牙的法律，下文所述的研究在当地经过the Animal Ethics Committee of the Instituto de MedicinaMolecular批准，在全国经过the Portuguese General Directorate ofVeterinary Services( Geral de Veterinária)的批准。研究中的所有动物都根据European Directive 86/609/EC(欧盟委员会与议会指令1986年11月24日第86/609/EEC号，关于试验和其他科学目的使用的动物的保护，成员国的相似的法律、法规和行政法案。Off J EurCommunities L358:1-28)、葡萄牙法律(Portaria 1005/92)(葡萄牙农业部10月23日第Portaria no.1005/92号，关于试验和其他科学目的使用的动物的保护。Diário da República I–Série B245:4930-4942)和the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NRC2011)(试验动物研究所，2011，Guide for the care and use oflaboratory animals.Washington(DC):National Academies Press)饲养。

本研究的一个目的是在DM的2种动物模型(大鼠和猪)中，研究局部递送的噬菌体溶液针对具有慢性金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌感染的伤口的抗微生物活性和伤口愈合能力。

6.1.1 细菌菌株的制备

由得自患者的人类临床皮肤伤口样品分离金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05菌株并由the里斯本地区的医院确认。根据布达佩斯条约的条款，金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05菌株于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号分别为NCIMB 41862、NCIMB 41861和NCIMB 41863。将各分离物划线于胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板(TSA,Biokar Diagnostics,PantinCedex,France)上，并在37℃下温育18小时。将所有的宿主菌株在-70℃下储存在具有15％甘油(w/v)的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB,Biokar Diagnostics,Pantin Cedex,France)中，直至需要时为止。

使在-70℃下的冷冻保藏菌株在37℃下在TSA上过夜生长。

对于体外试验而言，使单一的菌落在37℃下在TSB中伴以搅拌过夜生长。制备另一种细菌悬浮物(过夜培养物的稀释液)，在37℃下温育伴以搅拌，并且在达到指数生长期(600nm下的光密度为0.3-0.5)时收获。将大约2.0x10⁷cfu/ml的届接种物用于生长曲线。

对于体内试验而言，使单一的菌落在37℃下在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA,Biokar Diagnostics)中过夜生长。在24h温育后，在生理盐水(NaCl 0.9％、Applichem,Darmstadt,Germany)中制备细菌悬浮物，并与McFarland Standard比较，换言之，调节至McFarland标度(bioMérieux,Craponne,France)，虽后以1:10稀释，从而生产出2.0x10⁷cfu/cm的最终溶液浓度。将单一剂量为2.0x10⁶cfu的临床菌株用于接种伤口。

6.1.2 噬菌体菌株的制备

从由里斯本地区得到的污水分离金黄色葡萄球菌F44/10和F125/10、绿脓假单胞菌F770/05和F510/08、以及鲍曼不动杆菌F1245/05溶菌性噬菌体，并分别在金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05的临床菌株中扩增。使用上文所述的宿主菌株来实施用于噬菌体分离和扩增的标准方法(Adams M.Bacteriophages.New York:Interscience Publishers,Inc.,1959)。为了生产用于试验的足量噬菌体原液，使用之前所述的扩增方法、高速离心浓缩以及在氯化铯梯度上纯化(Miller H.,1987,Methods Enzymol.152:145-70)。使用双琼脂覆盖斑块检验测定最终浓度(Kropinski etal.,2009,In:Clokie M,Kropinski A,editors.Bacteriophages Methodsand Protocols,volume 1:isolation,characterization,and interactions.New York:Humana Press,Springer Science+Business Media,69-76)。根据布达佩斯条约的条款，噬菌体菌株F44/10,F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05于2011年9月16日保藏在NCIMBLimited(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland UK)，并且登录号分别为NCIMB 41867、NCIMB41866、NCIMB 41864、NCIMB 41868和NCIMB 41865。

为了分离针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌的溶菌性噬菌体，使用3种临床菌株(指示菌株)。得自里斯本城市地区的不同来源的污水通过高速离心浓缩，然后用于双琼脂覆盖斑块检验以测定噬菌体的存在情况。

将50ml水样品在4℃下在8000xg下离心10分钟。使用0.45μmMillex过滤器(Millipore,Massachusetts,USA)过滤上清液，并在4℃下在17000rpm(Beckman J2-21M/E,rotor JA-20)下离心3小时。在5ml的SM缓冲剂(0.05M Tris-HCl pH 7.5，0.1M NaCl，10mMMgSO₄.7H₂O，0.03％凝胶)中洗脱所得的团，并使其在4℃下洗脱过夜。将再悬浮的团储存在4℃下，直至需要为止。

此外，富集水样品以增加分离噬菌体的机会(Van Twest andKropinski 2009)。将单一菌落的金黄色葡萄球菌743/06指示菌株接种于补充有0.5％酵母提取物的5ml胰蛋白胨大豆肉汤(TSBY,BiokarDiagnostics,PantinCedex,France)中，并且在37℃下过夜温育伴以搅拌。制备具有5ml TSBY、50μl过夜的细菌培养物、100μl浓缩的水、以及5mM的CaCl₂和MgCl₂的培养物，并且在37℃下过夜温育伴以搅拌。在室温下加入氯仿，并温育5至10分钟，从而溶解细胞，并释放培养基中的细胞内噬菌体，然后在4℃下在8000xg下将培养物离心10分钟。使用0.45μm Millex过滤器(Millipore,Massachusetts,USA)过滤上清液，并在4℃下储存直至需要时为止。

在浓缩和/或富集后，针对具有感染金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05临床菌株的能力的噬菌体，通过双琼脂覆盖斑块检验测试污水样品。简言之，使细菌指示菌株在37℃下在TSB或TSBY(用于分离金黄色葡萄球菌噬菌体)中伴以搅拌过夜生长。制备另一种细菌悬浮物(过夜培养物的稀释液：金黄色葡萄球菌指示菌株以1:200稀释；绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌指示菌株以1:50稀释)，在37℃下温育伴以搅拌，并且在达到指数生长期(600nm下的光密度为0.3-0.5)时收获。各培养物补充有CaCl₂和MgCl₂(金黄色葡萄球菌菌株补充有5mM的CaCl₂和MgCl₂，绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌菌株补充有10mM的MgCl₂)，并放置在具有浓缩的和/或富集的水样品(100μl用于分离金黄色葡萄球菌噬菌体，50μl用于分离绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌噬菌体)的玻璃管中(200μl用于金黄色葡萄球菌，400μl用于绿脓假单胞菌，150μl用于鲍曼不动杆菌菌株)。将混合物在37℃下温育30分钟，其后加入在50℃下预平衡的3ml软琼脂(0.35％用于分离金黄色葡萄球菌噬菌体，0.7％用于分离绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌噬菌体)。在短暂的涡流处理后，将琼脂-水-细菌的悬浮物覆盖在补充有0.5％酵母提取物(TSAY,Biokar Diagnostics,Pantin Cedex,France)的用于分离金黄色葡萄球菌噬菌体的胰蛋白胨大豆琼脂上，或者覆盖在TSA平板1.5％(用于分离绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌噬菌体)上，使其在室温下固化，并在37℃下温育。在18至24小时后，检查平板在菌苔中的噬菌体(澄清区)，表明噬菌体存在。使用无菌吸管尖采集噬菌体斑，将其转移至100μl的SM缓冲剂中，并储存在4℃下。

6.1.3 噬菌体繁殖和特征

将分离的噬菌体在指示菌株中经历繁殖、扩增和纯化(3个连续的洗脱)过程，然后评价其宿主范围。使用小滴斑检验系统(MazzoccoA,et al.2009.Bacteriophages,methods and protocols vol.1chapter 9Humana Press)来测试30种细菌分离物针对特定噬菌体的敏感性。简言之，使细菌指示菌株在37℃下在TSB中伴以搅拌过夜生长。制备新的细菌悬浮物(过夜培养物的稀释液：金黄色葡萄球菌指示菌株以1:200稀释；绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌指示菌株以1:50稀释)，在37℃下温育伴以搅拌，并且在达到指数生长期(600nm下的光密度为0.3-0.5)时收获。各培养物补充有CaCl₂和MgCl₂(金黄色葡萄球菌菌株补充有5mM的CaCl₂和MgCl₂，绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌菌株补充有10mM的MgCl₂)，并放置于玻璃管(200μl用于金黄色葡萄球菌，400μl用于绿脓假单胞菌，150μl用于鲍曼不动杆菌菌株)中，该玻璃管中加入在50℃下预平衡的3ml软琼脂(0.35％用于分离金黄色葡萄球菌噬菌体，0.7％用于分离绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌噬菌体)。在短暂的涡流处理后，将琼脂-细菌的悬浮物覆盖在1.5％TSA平板上，使其在室温下固化。将少量(5μl)的各种新分离的噬菌体滴入到新制备的菌苔上，并使平板在室温下干燥，然后在37℃下温育过夜。通过观察斑点区域内溶菌区的外观来测定30种细菌分离物针对特定噬菌体的敏感性。

选择其中宿主感染范围的百分率最好的噬菌体，并通过高速离心、在氯化铯(CsCl)梯度中纯化、噬菌体基因组DNA的提取和限制性消化而进入扩增、浓缩过程。在具有100种细菌分离物的宿主范围上重复上述过程，直至进行噬菌体的最终选择，并测序它们的基因组。

6.1.4 噬菌体混合物在体外的效力

实施体外检验，来研究金黄色葡萄球菌F44/10和F125/10、绿脓假单胞菌F770/05和F510/08、以及鲍曼不动杆菌F1245/05噬菌体针对金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05指示菌株的溶菌活性，其中所述的噬菌体是单独的或者与液体培养物结合的。

使细菌指示菌株在37℃下在TSB中伴以搅拌过夜生长。制备新鲜的细菌悬浮物(过夜培养物的稀释液：金黄色葡萄球菌指示菌株以1:200稀释；绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌指示菌株以1:50稀释)，在37℃下温育伴以搅拌，并且在达到指数生长期(600nm下的光密度为0.3-0.5)时收获。各培养物补充有CaCl₂和MgCl₂(金黄色葡萄球菌菌株补充有5mM的CaCl₂和MgCl₂，绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌菌株补充有10mM的MgCl₂)。

对于各细菌而言，同时制备并测试10ml TSB的3种液体培养物。将细菌的对照培养物接种于培养基和指数生长期的2.0x10⁷cfu/ml的各指示菌株(金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05)中。将噬菌体的对照培养物接种于培养基和针对指示菌株(具有预定的感染复度：F44/10MOI＝10、F125/10MOI＝10、F770/05MOI＝1、F510/08MOI＝10和F1245/05MOI＝10)的待测试噬菌体中。将测试培养物接种于培养基、待测试的噬菌体(F44/10MOI＝10、F125/10MOI＝10、F770/05MOI＝1、F510/08MOI＝10和F1245/05MOI＝10)和处于指数生长期的2.0x10⁷cfus/ml各指示菌株(黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05)中。所有培养物均补充有CaCl₂和MgCl₂(金黄色葡萄球菌菌株补充有5mM的CaCl₂和MgCl₂，绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌菌株补充有10mM的MgCl₂)。将培养物在37℃下温育，并低速搅拌。在24小时的温育时间内，在1小时的间隔下，由各培养物取得100μl等分样品，并用于无菌稀释。

通过10倍系列稀释法定量活菌计数(Murray PR,et al.2003.Manual of clinical microbiology.Washington,DC:ASM Press)。对于细菌的对照培养物和测试培养物而言，将100μl各稀释液接种于各选择培养基平板上：金黄色葡萄球菌使用Chapman甘露醇食盐琼脂(Biokar diagnostics,PantinCedex,France)，绿脓假单胞菌使用溴棕三甲铵琼脂(Merck Chemical,Darmstadt,Germany)，而鲍曼不动杆菌使用CHROmagar Acinetobacter(CHROmagar,Paris,France)。将平板在37℃下在好氧条件下温育24小时，然后进行菌落计数。根据菌落形态和甘露醇食盐琼脂的发酵情况，将在Chapman甘露醇食盐琼脂上生长的分离物推测鉴定为金黄色葡萄球菌(Chapman GH.1946.J Bacteriol 51:409-410)。根据菌落形态，将在溴棕三甲铵琼脂上生长的分离物推测鉴定为绿脓假单胞菌(Brown VI,et al.1965.JClin Pathol 18:752-756)。根据菌落的红色，将在CHROmagarAcinetobacter上生长的分离物推测鉴定为鲍曼不动杆菌(WarehamDW,et al.2011.J Clin Pathol 64:164-167)。

对于噬菌体的对照培养物而言，在时间点(t0)取得100μl等分物，并立即稀释，从而通过双琼脂覆盖斑块检验测定各噬菌体的初始效价。简言之，使细菌指示菌株在37℃下在TSB中伴以搅拌过夜生长。制备新鲜的细菌悬浮物(过夜培养物的稀释液：金黄色葡萄球菌指示菌株以1:200稀释；绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌指示菌株以1:50稀释)，在37℃下温育并伴以搅拌，并且在达到指数生长期(600nm下的光密度为0.3-0.5)时收获。各培养物补充有CaCl₂和MgCl₂(金黄色葡萄球菌菌株补充有5mM的CaCl₂和MgCl₂，绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌菌株补充有10mM的MgCl₂)，并放置在具有100μl噬菌体培养物稀释液的玻璃管中(200μl用于金黄色葡萄球菌，400μl用于绿脓假单胞菌，150μl用于鲍曼不动杆菌菌株)。在30分钟过程中将混合物在37℃下温育，其后加入在50℃下预平衡的3ml软琼脂(0.35％用于金黄色葡萄球菌培养物，0.7％用于绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌培养物)。在短暂的涡流处理后，将琼脂-噬菌体-细菌的悬浮物覆盖在1.5％TSA平板上，使其在室温下固化，并在37℃下温育。在18至24小时后，通过计数噬菌斑形成单位(pfus)来测定噬菌体的效价。6.1.5噬菌体混合物的制备

图1示出了根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的制备。在F44/10F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05噬菌体(单独的或组合的)的体外检验之后，在单一的噬菌体混合物中一起测试5种噬菌体的溶菌活性。使用不同浓度和相对比例的纯化噬菌体来制备3种主要的混合物(金黄色葡萄球菌混合物、绿脓假单胞菌混合物和鲍曼不动杆菌混合物)和1种最终的混合物。使用以预定的MOI(F44/10MOI＝10,10¹⁰pfu/mL；F125/10MOI＝10,10¹⁰pfu/mL；F770/05MOI＝1,10⁹pfu/mL；F510/08MOI＝10,10¹⁰pfu/mL和F1245/05MOI＝10,10¹⁰pfu/mL)存在于生理盐水中的各种噬菌体来制备噬菌体混合物。

按照之前所述的形成各种培养物用于单个噬菌体的测试。针对金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05指示菌株制备细菌的对照培养物、噬菌体混合物的对照培养物和测试培养物。将培养物在37℃下温育并进行低速搅拌，在24小时内，在1小时的间隔下，取得100μl等分物，并用于系列稀释。

通过10倍系列稀释法定量活菌计数(Murray PR,et al.2003.Manual of clinical microbiology.Washington,DC:ASM Press)。对于细菌的对照培养物和测试培养物而言，将100μl各稀释液接种于各选择培养基平板上：金黄色葡萄球菌使用Chapman甘露醇食盐琼脂，绿脓假单胞菌使用溴棕三甲铵琼脂，而鲍曼不动杆菌使用CHROmagar Acinetobacter。将平板在37℃下温育24小时，此后进行菌落计数。根据菌落形态和甘露醇食盐琼脂的发酵情况，将在Chapman甘露醇食盐琼脂上生长的分离物推测鉴定为金黄色葡萄球菌(Chapman GH.1946.J Bacteriol 51:409-410)。根据菌落形态，将在溴棕三甲铵琼脂上生长的分离物推测鉴定为绿脓假单胞菌(BrownVI,et al.1965.J Clin Pathol 18:752-756)。根据菌落的红色，将在CHROmagar Acinetobacter上生长的分离物推测鉴定为鲍曼不动杆菌(Wareham DW,et al.2011.J Clin Pathol 64:164-167)。

通过双琼脂覆盖斑块检验测定各噬菌体的初始效价。在时间点(t0)取得100μl等分物样品，并立即稀释。使细菌指示菌株在37℃下在TSB中伴以搅拌过夜生长。制备新鲜的细菌悬浮物(过夜培养物的稀释液：金黄色葡萄球菌指示菌株以1:200稀释；绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌指示菌株以1:50稀释)，在37℃下温育伴以搅拌，并且在达到指数生长期(600nm下的光密度为0.3-0.5)时收获。各培养物补充有CaCl₂和MgCl₂(金黄色葡萄球菌菌株补充有5mM的CaCl₂和MgCl₂，绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌菌株补充有10mM的MgCl₂)，并放置在具有100μl噬菌体混合培养物稀释液的玻璃管中(200μl用于金黄色葡萄球菌，400μl用于绿脓假单胞菌，150μl用于鲍曼不动杆菌菌株)。将混合物在37℃下温育30分钟，其后加入在50℃下预平衡的3ml软琼脂(0.35％用于金黄色葡萄球菌培养物，0.7％用于绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌培养物)。在短暂的涡流处理后，将琼脂-噬菌体-细菌的悬浮物覆盖在1.5％TSA平板上，使其在室温下固化，并在37℃下温育。在18至24小时后，通过pfu(噬菌斑形成单位)计数来测定噬菌体的效价。

6.1.6 噬菌体混合物在大鼠模型中的体内效力

图2示出了用于证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力的研究方案。使用在化学诱导的糖尿病Wistar小鼠中之前优化的啮齿动物伤口感染模型(Mendes JJ,et al.2012.Comp Med 62:1-12)。

动物

由Charles River Laboratories(L’Arbresle,Cedex,France)获得体重为250-350g的不含特异性病原体的Wistar雄性大鼠[Crl:WI(Han)](8至10周龄)。在以下条件下将动物寄养在经批准的动物养护中心：在具有受控的湿度(50-70％)和温度(20-22℃)的房间内，将动物饲养在小隔离笼中，14小时光及10小时暗的循环，随意获得团状的啮齿动物食物和过滤器消毒的水。最初将动物分2组饲养。在除去毛发和随后的过程中，将它们单独饲养以保护皮肤及后期的敷料完整性。在消毒的手术室中，使用高压釜灭菌的仪器进行所有的手术过程。

DM的诱导

按照Wu等人所述化学诱导DM(Wu K,et al.2008.Curr ProtocPharmacol 40:5.47.1-5.47.14)。在禁食12小时后，对动物单一地腹膜内注射(i.p.)在0.1M柠檬酸盐缓冲剂(pH4.5)中新制备的链脲霉素(65mg/kg；Merck Chemical,Darmstadt,Germany)。8天后，使用血糖测试仪在鼠尾静脉血上测量血糖。禁食血糖水平高于250mg/dL的大鼠被认为是糖尿病。

毛发的去除

在确认DM(8天后)后，通过i.p.注射盐酸甲苯噻嗪(10mg/kg)和盐酸氯胺酮(25mg/kg)麻醉42只糖尿病大鼠，并使用电动剪毛机修剪它们的背部表面毛发，同时使用冷蜡条给剩余的毛发全部上蜡(Veet cold wax strips,Reckitt Benckiser,West Ryde,Australia)。接着，使用10％聚维酮碘溶液冲洗动物的背部，在感染和清洁后，均匀地施加形成液膜的丙烯酸酯(Cavilon Skin Cleanser,3M Health Care,Saint Paul,MN)，以覆盖它们除去毛发的区域。

形成伤口、夹板疗法、第一张照片和敷料

在除去毛发后的4天，再次使用相同的方案麻醉动物，并使用无菌生理盐水彻底清洗背部皮肤，然后使用10％聚维酮碘消毒，在聚维酮碘接触时间达10分钟后再使用70％异丙醇洗涤。使用钻孔活组织检测仪器(直径为6mm；Accu-Punch,Acuderm,Fort Lauderdale,FL,USA)，在各大鼠的上背的肩胛间区，通过形成一个延伸通过脂膜肌的全层切割来创建圆形的伤口，并使用虹膜剪切除皮瓣。椭圆形的有机硅夹板由自粘附的棉垫改造而来(Comforsil,Toledo,Spain)。使用一次性单剂量包装中的速粘结氰基丙烯酸酯胶水(Loctite,HenkelCorporation,Westlake,OH)将夹板固定在皮肤上，然后间断地缝合3-0尼龙以确保其位置。在敷料之前，使用固定的数字显微镜(SuperEyes 200×USB Digital Microscope,Shenzhen Tak andAssistive Technology,Shenzhen,China)，由标准高度(距离1.5cm)对伤口拍照。然后，将形成液膜的丙烯酸酯施加在脱毛的区域，并使用之前剪裁的半塞非织造聚酯敷料(Fixomull Stretch,BSN Medical,Hamburg,Germany)覆盖伤口和周围区域。在整个的试验过程中，使用由胶带制成的护套将夹板和敷料保持在适当的位置(Leukoplastsurgical tape,BSN Medical,Hamburg,Germany)。

随机分组

在施加敷料后，并且动物仍被麻醉，将动物随机分成7组：阴性对照(n＝6)，接种金黄色葡萄球菌的对照(n＝6)和接种金黄色葡萄球菌的测试(n＝6)，接种绿脓假单胞菌的对照(n＝6)和接种绿脓假单胞菌的测试(n＝6)，以及接种鲍曼不动杆菌的对照(n＝6)和接种鲍曼不动杆菌的测试(n＝6)。

伤口感染

在阴性对照组中，对动物的伤口注射100μL的生理盐水，而接种组的伤口(测试和对照)通过将与1mL一次性注射器连接的27G/19mm针头以45°角插入通过硅夹板而分别接种再次悬浮于无菌生理盐水中的100μL经培养的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌或鲍曼不动杆菌(大约2.0x10⁶cfu)。

清创术

在形成伤口后的第4、5和8天，在所有的动物中切除半塞敷料并清除伤口。清创术由采用严格的无菌技术而简单地机械除去痂(定义为干态血液、血清和渗出物的硬皮)所组成。

噬菌体治疗方案

噬菌体治疗方案分成诱导期和维持期，并在所有测试组中实行。在第一次清创术之后(在形成伤口后的第4天)执行诱导期，并且该诱导期由6次(每4小时1次)施用100μL最初的噬菌体溶液组成。在第5天至第8天执行维持期，并且该维持期由每日2次(每12小时1次)施用100μL最初的噬菌体溶液组成。如果实行清创术，则随后施用噬菌体。对照组以相同的频率接受100μL无菌生理盐水。

微生物分析

在形成伤口后的第4、5和8天并且在清创术后，使用Amies洗脱液拭子(eSwab Collection and Preservation System,Copan,Corona,CA)来收集和转移拭子培养物。使用Sullivan等人所述的单点法来收集细菌(Sullivan PK et al.2004Wounds 16:115-123)。简言之，使用无菌拭子，通过以足够的手工压力顺时针旋转拭子3次来刮擦各伤口的中心表面，从而产生少量的渗出物。然后将拭子插入到管中，并转移至进行立即处理的试验室。使拭子收集管旋动(在里面使用拭子)5秒钟，并将所得悬浮物的100μL等分物用于细菌稀释。

使用10倍系列稀释法进行定量(Murray PR,et al.2003.Manualof clinical microbiology.Washington,DC:ASM Press)。在感染/接种组中，将100μL各稀释液铺平板于各选择性培养基平板上：Chapman甘露醇食盐琼脂(Biokar diagnostics,Pantin Cedex,France)用于金黄色葡萄球菌，溴棕三甲铵琼脂(Merck Chemical,Darmstadt,Germany)用于绿脓假单胞菌，而CHROmagar Acinetobacter(CHROmagar,Paris,France)用于鲍曼不动杆菌。在鲍曼不动杆菌感染组中，将100μL各稀释液同时接种于胰蛋白酶大豆琼脂培养基平板(TSA,Biokar Diagnostics,Pantin Cedex,France)上。在阴性对照组中，将100μL各稀释液同时接种于胰蛋白酶大豆琼脂培养基平板上。将平板在37℃下在好氧条件下温育24小时，此后进行菌落计数。根据菌落形态和甘露醇食盐琼脂的发酵情况，将在Chapman甘露醇食盐琼脂上生长的分离物推测鉴定为金黄色葡萄球菌(Chapman GH.1946.J Bacteriol 51:409-410)。根据菌落形态，将在溴棕三甲铵琼脂上生长的分离物推测鉴定为绿脓假单胞菌(Brown VI,et al.1965.JClin Pathol 18:752-756)。根据菌落的红色，将在CHROmagarAcinetobacter上生长的分离物推测鉴定为鲍曼不动杆菌(WarehamDW,et al.2011.J Clin Pathol 64:164-167)。

伤口闭合的动力学(测面法)

按照之前所述，在形成伤口后的第9天，在处死前，使用固定的数字显微镜由1.5cm标准高度对伤口拍照。使用图像处理软件对伤口的动力学定量(ImageJ,US National Institutes of Health,Bethesda,MD)，从而通过测面法测量伤口区域；伤口区域表示为最初伤口区域的百分率。

组织学分析

在形成伤口后的第9天，通过i.p.注射戊巴比妥(200mg)处死所有动物，使用无菌手术剪完整地收获各溃疡(包括0.5cm皮肤边界)并放置在管中。将样品固定于10％缓冲的福尔马林溶液中，在过夜固定后，修整组织，并在最厚的边缘处穿过，包埋于石蜡中，并以3μm的增量切片。以垂直于前后轴并垂直于伤口表面的方式进行切片。

对于各伤口而言，将2个连续的切片放置在载玻片上，并使用苏木精和曙红染色。在光学显微镜下，使用电动倒明场显微镜(ZeissAxiovert 200M,Germany)给切片拍照，其中所述的显微镜装配有放大50x的彩色照相机(Leica DM2500,Leica MicrosystemsGmbH,Wetzlar,Germany)。使用显微镜自动化软件(MetaMorph,MDS Analytical Technologies,Sunnyvale,CA)制作各伤口的全景断层数字图像，并使用图像处理软件(ImageJ,US National Institutes ofHealth,Bethesda,MD)进行处理。使用相同的图像处理软件，针对上皮缝隙(EG)和真皮缝隙(DG)来分析图像。

EG定义为清晰的多层新表皮的前边缘之间的距离(Galiano RD,et al.2004.Wound Repair Regen 12:485-492；Scherer SS,et al.2008.Wounds 20:18-28)，并且以mm测量其大小，EG为0表示完整的上皮再形成的伤口。DG定义为伤口两边上未损伤的真皮之间的距离(Galiano RD,et al.2004.Wound Repair Regen 12:485-492；SchererSS,et al.2008.Wounds 20:18-28)，并且以mm测量。所有的伤口动力学和组织学测量均由对样品起源(测试或对照)盲态的研究者来进行。

6.1.7 噬菌体混合物在猪模型中的体内效力

图3示出了用于证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力的研究方案。按照Hirsch等人所述(Hirsch T,et al.2008.BMC Surg 8:5)，对之前优化的猪伤口感染模型(动物中患有化学诱导的DM)进行修改，以合适本研究的需要。在本研究中使用3种动物(阴性对照、接种对照和接种测试)，其中共有48处切割伤口(12处阴性对照伤口、12处接种绿脓假单胞菌的伤口，12处接种金黄色葡萄球菌的伤口，以及12处接种鲍曼不动杆菌的伤口)。

动物

使得到时重为±60kg的3只Yorkshire雌猪(Farm)对环境适应1周，然后开始实验。将动物单独饲养于笼中，并随意获得水，每日2次喂养标准饮食。在这过程中，将动物放置在容纳设备中。

DM的诱导和控制

猪禁食12小时，然后进行DM诱导。在该过程的当天，对动物称重，并使用盐酸甲苯噻嗪和盐酸氯胺酮诱导肌肉内麻醉。在动物处于麻醉的同时，将21Gauge静脉留置针(i.v.)插入到耳静脉中。制备剂量为150mg/kg体重的链脲霉素(稀释于10mL/g无菌生理盐水中)，通过过滤灭菌，并经过1分钟的时间通过留置针施用链脲霉素。在由麻醉中恢复后，实施使用灭吐灵的过程后镇吐疗法。在最初的3个小时连续观察猪，然后随意提供食物以避免低血糖。在试验过程中的每天都测量血糖。为了将血糖浓度保持在250至400mg/dL，猪每日以皮下注射的方式接受16IU预混的中性悬浮物(包含中性(30％)与低精蛋白胰岛素(70％))(Mixtard 30,Novo Nordisk,Denmark)。

毛发去除、形成伤口、第一张照片和感染

在诱导DM后的14天，按照之前所述，猪接受诱导麻醉。在诱导后，它们经历气管内插管，并使用容量型时间循环BIRD呼吸机(Mark9；Bird Corporation,Palm Springs,CA)在室内空气与滴定的异氟醚(0.5％至1.5％)的混合物上进行机械通气。潮气量设定为12mL/kg，通气速率为12次呼吸/分钟。手术前，使用电动剪毛机修剪它们的背部表面毛发，并使用冷蜡条给剩余的毛发全部上蜡，使用10％聚维酮碘漆彻底消毒脊柱旁的区域，在聚维酮碘漆与脊柱旁的区域接触15分钟后，使用70％异丙醇洗涤。

对于接种对照猪和接种测试猪而言，使用直径为6mm的活组织检测钻孔，在脊柱旁的区域的两侧(共18个)创建9个全厚度切除伤口(测量直径为6mm，深度为6mm)。对于阴性对照猪而言，在脊柱旁的区域的两侧(共12个)仅创建6个切除的伤口。随后，使用无菌手术钳和手术刀除去全厚度的皮瓣，并且使用无菌纱布来清洁任何凝固血液的伤口并控制出血。在使用粘合敷料腔(adesive chamber)覆盖之前，使用固定的数字显微镜，由标准高度对伤口拍照。将修改的粘合敷料腔放置在各伤口上，并使用手术钉(Manipler AZ,B.Braun,Tuttlingen,Germany)和胶布绷带固定在合适的位置上，其中所述的粘合敷料腔由结肠造瘘袋(Two Piece 35-mm Ostomy,HollisterIncorporated,Libertyville,IL)制成，其上覆盖有半塞非织造聚酯敷料。

在接种的对照动物和接种的测试动物中，将伤口分成3个亚组：金黄色葡萄球菌(2x6处溃疡)、绿脓假单胞菌(2x6处溃疡)和鲍曼不动杆菌(2x6处溃疡)。为了浸渍封闭的表面，将伤口分别接种：处于100μL总溶液(0.9％的无菌生理盐水)中的2x10⁶金黄色葡萄球菌cfu，处于100μL总溶液(0.9％的无菌生理盐水)中的2x10⁶绿脓假单胞菌cfu和处于100μL总溶液(0.9％的无菌生理盐水)中的2x10⁶鲍曼不动杆菌cfu。在阴性对照组(12处溃疡)，对伤口注射100μL无菌生理盐水。在由麻醉中恢复后，在48小时内，每12个小时施用过程后的麻醉(丁丙诺啡0.05mg/kg)和镇吐疗法。

清创术

在形成伤口后的第4、5和8天，切除半塞敷料并清除伤口。如啮齿动物模型中所述，清创术由采用严格的无菌技术而简单地机械除去痂(定义为干态血液、血清和渗出物的硬皮)所组成。

噬菌体治疗方案

使用类似于啮齿动物模型中的，被分为诱导期和维持期的噬菌体治疗方案。在第一次清创术之后(在形成伤口后的第4天)执行诱导期，并且该诱导期由6次(24小时内每4小时1次)施用100μL噬菌体溶液(使用最终的噬菌体混合物)组成。在第5天至第8天执行维持期，并且该维持期由每日2次(每12小时1次)施用100μL噬菌体溶液(使用最终的噬菌体混合物)组成。如果实行清创术，则随后施用噬菌体。对照组以相同的频率接受100μL无菌生理盐水。

微生物分析

使用类似于啮齿动物研究中的微生物分析方案。在形成伤口后的第4、5和8天并且在清创术后，使用Amies洗脱液拭子来收集和转移拭子培养物。如之前所述，使用Sullivan等人所述的单点法来收集细菌(Sullivan PK et al.2004Wounds 16:115-123)。然后将拭子插入到管中，并运送至进行立即处理的试验室。使用10倍系列稀释法进行定量(Murray PR,et al.2003.Manual of clinical microbiology.Washington,DC:ASM Press)。

在感染/接种组中，将100μL各稀释液铺平板于各选择性培养基平板上：Chapman甘露醇食盐琼脂、溴棕三甲铵琼脂和CHROmagarAcinetobacter。在阴性对照组中，将100μL各稀释液接种于胰蛋白酶大豆琼脂培养基平板上。将平板在37℃下在好氧条件下温育24小时，此后进行菌落计数。按照之前诉述，推测鉴定分离物。在阴性对照组中，在任何给定的一天中溃疡超过10³cfu/拭子被认为是危害菌落群聚的，并由进一步分析中排除。

伤口闭合的动力学(测面法)

按照之前所述，在形成伤口后的第9天，在处死后，使用固定的数字显微镜由标准高度对伤口拍照。使用如同啮齿动物研究中的图像处理软件对伤口的动力学定量。伤口区域表示为最初伤口区域的百分率。

组织学分析

在形成伤口后的第9天，通过i.v.注射戊巴比妥处死所有动物，使用无菌手术剪完整地收获各溃疡(包括0.5cm皮肤边界)并放置在管中。对样品进行处理，并按照如同啮齿动物研究中所述进行拍照。使用与啮齿动物研究中相同的方法针对上皮缝隙(EG)分析图像。

统计学分析

所有定量的微生物结果均以平均值及其各自的标准偏差呈现，并表示为对数转换值[log(cfu/swab)用于拭子样品，而log(cfu/ulcer)用于组织样品]。由于培养物中cfu/swab的广泛变化，所以使用对数标度来比较数据。使用双尾学生t检验进行组间比较，并且p值＜0.05被认为是有显著性的。所有平面结果均表示为在初始伤口区域的大小中的百分率的平均值及其标准偏差。使用双尾学生t检验进行组间比较，并且p值＜0.05被认为是有显著性的。组织学测量结果以平均值及其各自的标准偏差呈现。使用双尾学生t检验进行组间比较，并且p值＜0.05被认为是有显著性的。所有数据均输入电子数据表程序(Excel,Microsoft,Redmond,WA)中用于统计学分析。通过Analyse-it version2.21Excel 12+(Analyse-it Software,Leeds,UK)(一种用于电子数据表程序的统计学插件程序)来实施分析统计学。

6.1.8 结果

临床前研究—药理学/概念验证

为了克服对使用单一噬菌体菌株产生抗性的问题，尽管之前在将噬菌体的不同特异性结合起来方面具有困难(例如储存的不稳定性)，但是本发明仍研发出使用多于一种的截然不同的噬菌体菌株的噬菌体混合组合物，其中所述的噬菌体菌株各自具有高的溶菌活性。本发明的混合物惊人地证明比单独使用噬菌体时，优异的组合效力，如图4、5和6中用于体外测试的杀伤曲线所示。与使用单独的噬菌体菌株的培养物相比，使用例如F770/05和F510/08组合的培养物所观察到的减少证明使用多于一种的噬菌体菌株(即，使用根据本发明的噬菌体混合物)在增加针对绿脓假单胞菌菌株的溶菌活性同时减少针对噬菌体菌株的细菌抗性出现方面具有益处。在此，本发明人测量了各种所选的噬菌体在感染100种细菌菌株中的能力—F510/08具有80％的宿主范围，F770/05具有55％的宿主范围，F44/10和F125/10各自具有100％的宿主范围，F1245/05具有75％的宿主范围。

噬菌体混合物的研发

分别针对金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05菌株，评价新分离及表征的金黄色葡萄球菌噬菌体菌株F44/10和F125/10、绿脓假单胞菌噬菌体菌株F770/05和F510/08、以及鲍曼不动杆菌噬菌体菌株F1245/05的溶菌活性，以便研发用于在伤口感染中使用的噬菌体混合物。如图4、5和6所证明的那样，体外使用噬菌体混合物(红线)使得金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌细菌计数的明显减少。体外使用噬菌体的结果显示，由于截然不同的细菌的不同噬菌体菌株的存在，噬菌体菌株的感染能力未受抑制，并进一步证明在一些情况下(例如在绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌细菌的情况下)所述的混合物实际上增强细菌的溶解。

使用之前确定的细菌接种物，在受控的条件下完成常规生长曲线。进行初步研究以测定在大鼠模型中，使用金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07或鲍曼不动杆菌1305/05菌株的4天感染中，细菌的质量负荷。cfu测定表明细菌负荷为大约2.0x10⁷cfu/伤口。这为在体外测试中使用的接种物。

在评价噬菌体混合组合物之前，使用不同的MOI(数据未示出)单独测试和组合测试各种噬菌体，以筛选它们在动物模型中的潜在治疗和试验用途的效力。在24小时内，在1小时的间隔下监测活菌计数。

图4示出了针对金黄色葡萄球菌743/06评价的溶菌性研究结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。在MOI等于10的条件下，单独测试噬菌体F44/10感染金黄色葡萄球菌743/06。在最初的3小时内，与细菌的对照培养物相比，活菌计数减少大约4log单位。此后，细菌开始增加，在感染培养物后的6个小时，活菌为2.1x10⁶cfu/ml。尽管当与细菌的对照培养物相比活菌减少97％(在24小时温育下，活菌计数为9.9x10⁹cfu/ml)，但是噬菌体F44/10不能完全消除宿主细胞。相似的结果在单独测试的5种噬菌体中观察到，并且可能是出现了对噬菌体感染的敏感性较低的细菌的结果。

在MOI等于10的条件下，使用噬菌体F125/10来感染金黄色葡萄球菌743/06(如图4所示)，并且在1个小时内，细菌的活菌计数比细菌743/06的对照培养物减少大约3log单位。在6个小时的温育，活菌为3.6x10⁷cfu/ml(低于F44/10培养物的值)，并且在温育期结束时(24小时)，活菌为6.6x10⁹cfu/ml。在温育的最初3个小时中，在噬菌体F44/10和F125/10活性的变化中所观察到的截然不同的行为，反应了它们在吸附速率、潜伏期和裂解量(数据未示出)中的差异。

预计，2种噬菌体菌株(F44/10和F125/10)的组合针对金黄色葡萄球菌743/06会进一步减少细菌的生长(与单独使用所观察到的情况相比)。当与细菌的对照培养物相比时，噬菌体F44/10和F125/10早期溶解的细菌减少5log单位(活菌为1.9x10⁴cfu/ml)。然而，尽管与细菌的对照培养物相比，活菌计数降低，但是低水平的活菌计数保持4个小时。在24个小时的温育下，活菌计数达到4.3x10⁹cfu/ml(细菌计数减少56.6％)。

图5示出了针对绿脓假单胞菌433/07评价的溶菌性研究结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。与使用金黄色葡萄球菌743/06所见相似的趋势在噬菌体F770/05和F510/08感染绿脓假单胞菌433/07中观察到。

如图5所示，在MOI等于1的条件下，单独测试噬菌体F770/05针对绿脓假单胞菌433/07。在温育的最初2个小时中，活菌计数比细菌433/07的对照培养物减少大约3log单位，达到4.6x10⁵cfu/ml。在温育的3个小时中，细菌开始呈指数生长，在温育的6个小时中，活菌为7.3x10⁷cfu/ml。在培养物温育期结束时(24小时)，细菌计数为2.8x10⁹cfu/ml，比细菌对照培养物的4.8x10⁹cfu/ml降低41.6％。

此外，如图5所示，在MOI等于10的条件下，单独测试噬菌体F510/08针对绿脓假单胞菌433/07，然后测试其与F770/05组合时的应用。在温育的2个小时中，噬菌体F510/08溶解细菌，使细菌计数与细菌的对照培养物相比减少大约5log单位。在温育的6个小时中，活菌为1.7x10⁷cfu/ml，初始接种物达到大约2.0x107cfu/ml。在24小时后，F510/08培养物呈现出于细菌的对照培养物相似的细菌计数，为2.8x10⁹cfu/ml，等于减少了41.6％。

之前使用具有不同MOI的噬菌体F770/05和F510/08的测试证明了2种噬菌体组合使用的合适的感染复度：使用MOI等于1的F770/05和MOI等于10的F510/08在感染绿脓假单胞菌433/07中是更有效的。

此外，如图5所示，测试MOI分别等于1和10的针对绿脓假单胞菌433/07的噬菌体F770/05和F510/08。在温育的3个小时中，细菌计数比细菌的对照培养物减少4log单位，比单独的F770/05的培养物减少1log单位。在该时间点下，单独的F510/08似乎是更有效的。在温育的6个小时时(即，培养物感染后的6个小时)，活菌计数为1.4x10⁸cfu/ml；而在温育期结束时(24小时)，活菌为1.7x10⁸cfu/ml。这表示比细菌的对照培养物减少96.5％。与使用各噬菌体的单一培养物相比，使用F770/05和F510/08所观察到的这种减少证明使用多于一种的噬菌体(如同噬菌体“混合物”，例如本发明所述)的益处。

图6示出了针对鲍曼不动杆菌1305/05评价的溶菌性研究结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。此外，选择噬菌体F1245/05包含在本发明所示的示例性噬菌体混合组合物中，并在MOI等于10的条件下单独测试针对鲍曼不动杆菌1305/05，如图6所示。在该MOI下，噬菌体F1245/05使得活菌快速减少，这样在仅1个小时内，计数由2.0x10⁷cfu/ml减少至6.8x10⁴cfu/ml。与细菌的对照培养物相比，低的cfu值保持大约3个小时。在温育的6个小时后，活菌计数为1.1x10⁸cfu/ml，并且在温育期结束时(24小时)，细胞生长至2.2x10⁹cfu/ml。由此，单独的噬菌体F1245/05显示针对鲍曼不动杆菌1305/05的高活性，在达到温育的24小时时，细菌计数比对照培养物减少76.3％。

该结果表明使用单独的噬菌体菌株最终可以导致针对特定噬菌体菌株的抗性出现，并且避免或减少这种情况的一种方法是研发包含多于一种的噬菌体菌株的组合物，优选的是每种噬菌体菌株都具有高的针对特定细菌的溶菌活性。

示例性噬菌体混合物

本研究的目的是使用噬菌体菌株来生产针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌菌株的示例性噬菌体混合物，其中所述的噬菌体菌株展现出针对所述这些细菌的广泛活性，并且可以用于处理伤口感染。

在测试某些噬菌体菌株单独针对细菌菌株的活性之后，制备具有以下组合物的噬菌体混合物：F44/10，MOI＝10；F125/10，MOI＝10；F770/05，MOI＝1；F510/08，MOI＝10；以及F1245/05，MOI＝10。参见图1。

体外测试所述的噬菌体混合物针对金黄色葡萄球菌743/06、绿脓假单胞菌433/07和鲍曼不动杆菌1305/05菌株。在24小时内，在1小时的间隔下，针对各种单独的细菌测定活菌计数。噬菌体混合物的体外应用使得金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌细菌计数显著减少(分别参见图4-6)。

如图4所示，与细菌的对照培养物相比，单一接种噬菌体混合物足以将金黄色葡萄球菌743/06减少5log单位。对于组合的2种金黄色葡萄球菌噬菌体菌株的活性，观察到相似的降低。在温育的第2和第6个小时，混合物的效力低于一起的2种噬菌体菌株F44/10和F125/10；但是24小时之后，2种培养物之间的差异是显著的。细菌计数开始是降低的，并且在温育期结束时(24小时)，活菌为6.8x108cfu/ml(与对照培养物相比，降低93.1％)。

此外，如图5所示，还测试噬菌体混合物针对绿脓假单胞菌433/07，在2个小时的温育期时，细菌计数减少几乎4log单位。在培养物温育期结束时(24小时)，细菌计数为3.9x10⁸cfu/ml，同时稍微高于一起测试的2种噬菌体菌株，这表示当与细菌绿脓假单胞菌433/07的对照培养物相比时，活菌减少91.9％。这种差异不足以将所述的混合物对绿脓假单胞菌噬菌体菌株F770/05和F510/08溶菌活性的抑制作用联系起来。

此外，如图6所示，还测试了噬菌体混合物针对鲍曼不动杆菌1305/05菌株。在温育的2个小时时，与细菌1305/05的对照培养物相比，噬菌体混合物将细菌计数减少大约4log单位。在培养物温育期结束时(24小时)，细菌计数达到8.6x10⁸cfu/ml，这表示与对照培养物相比，降低92.8％。该结果表明这种噬菌体在混合物中具有更好的性能。

噬菌体混合物的体外应用结果表明由于截然不同的细菌的不同噬菌体的存在对各种噬菌体的感染能力未发生抑制。

使用啮齿动物模型的结果

概括而言，根据葡萄牙的法律，在啮齿动物中实施的研究在当地是经过the Animal Ethics Committee of the Instituto de MedicinaMolecular批准的，在全国是经过the Portuguese General Directorateof Veterinary Services(Geral de Veterinária)批准的。所有动物都是根据European Directive 86/609/EC、葡萄牙的法律(Portaria1005/92)和the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NRC 2011)饲养的。使用在化学诱导的糖尿病Wistar小鼠中，之前优化的啮齿动物伤口感染模型(Mendes JJ,et al.2012.Comp Med62:1-12)。

如上文所述，图2示出了研究方案。简言之，在诱导和建立糖尿病后，根据噬菌体菌株的溶菌曲线和类似于抗生素的剂量学(即，在最初的24小时过程中每4小时1次，然后在5天内每天1次)来施用治疗。剂量是基于在由多个葡萄牙医院募集的患者中，在之前所进行的流行病学研究中所获得的结果(数据未示出)。在该研究中，结论是感染糖尿病足部溃疡的细菌浓度为10⁶至10⁸—体外测试表明根据噬菌体菌株，MOI为1或10，这样噬菌体的浓度为10⁷至10⁹/cm²溃疡。

感染的慢性伤口模型的选择是基于这样的事实：噬菌体仅在它们的特异性活细菌宿主中复制，因此研究其中感染并非为慢性的模型是无意义的。主要的结果是伤口中的微生物减少。此外，还可以测量伤口的闭合，但是伤口闭合的差异不总是反应真皮和表皮缝隙的真实的减少，在将组织学与微生物结果比较时便是如此。

为了克服噬菌体浪费和出现细菌抗性的问题(其可能在与环境条件及治疗延期有关的动物模型中发生)，也就是说，大量的噬菌体用于体内试验，来接种伤口和治疗动物。体内用途的示例性混合物中呈现的噬菌体颗粒的数量增加1log。

微生物分析

图7示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的对照组(C)和测试组(T)的微生物负荷分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。

在诱导疗法(t1)后，在接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌组中的对照和测试亚组之间，在选择性培养基上的菌落计数具有统计学显著性差异。在治疗开始后的第4天(t4)，在对照和测试亚组之间，在选择性培养基上的菌落计数具有统计学显著性差异。在接种有金黄色葡萄球菌和接种有绿脓假单胞菌的对照亚组中，在t0至t4，微生物负荷具有减少的趋势。换言之，在t1和t4中，在所有的3组中，经噬菌体治疗的动物显示比对照动物明显更低的计数。

伤口闭合动力学(测面法)

图8示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的阴性组、对照组(C)和测试组(T)的伤口闭合分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。在t1和t9评估伤口面积，并计算2个时间点之间的差异。

在大鼠模型中的伤口测面法分析显示在阴性对照组与所有的接种对照亚组的伤口区域之间具有显著的统计学差异，并且在所有组的对照和测试亚组之间伤口区域具有减小的趋势；在接种有金黄色葡萄球菌和接种有绿脓假单胞菌的组中，在对照和测试亚组的伤口区域之间具有显著的统计学差异。换言之，噬菌体治疗减小了金黄色葡萄球菌感染的和绿脓假单胞菌感染的伤口上的伤口大小(p<0.05)。

组织学分析

图9示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的阴性组、对照组(C)和测试组(T)的组织学分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。

在表皮缝隙(EG)和真皮缝隙(DG)中，在阴性对照组与所有接种的对照亚组之间具有统计学显著性差异。在接种有金黄色葡萄球菌和接种有绿脓假单胞菌的组中，对照组与测试亚组的EG之间具有统计学显著性差异(p<0.05)。在DG中，仅在接种有绿脓假单胞菌的组的测试和对照亚组之间获得统计学显著性差异。这些结果关乎这样的事实：绿脓假单胞菌比金黄色葡萄球菌更深地进入到组织中。鲍曼不动杆菌是患者中在该过程的后期出现的定植者，这是为什么在某些实施方案中所述的噬菌体混合物包含该种噬菌体是重要的。

使用猪模型的结果

使用猪模型获得了与如上文所示那些相似的结果。概括而言，按照Hirsch等人所述(Hirsch T,et al.2008.BMC Surg 8:5)，在化学诱导的动物中，对之前优化的猪伤口感染模型进行修改，以合适本研究的需要。使用3种动物(阴性对照、接种对照和接种测试)，其中共有48处切割伤口(12处阴性对照伤口、12处接种绿脓假单胞菌的伤口，12处接种金黄色葡萄球菌的伤口，以及12处接种鲍曼不动杆菌的伤口)。如上文所述，图3示出了研究方案。使用与在上文所述的大鼠模型中的那些相同的剂量和剂量时间表。

微生物分析

图10示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的对照组(C)和测试组(T)的微生物负荷分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。

在诱导疗法(t1)后，在接种有金黄色葡萄球菌和接种有绿脓假单胞菌组中的对照和测试亚组之间，在选择性培养基上的菌落计数具有统计学显著性差异，并且在接种有鲍曼不动杆菌测试和对照组中，在平均菌落计数中，微生物负荷具有减少的趋势(p<0.05)。在治疗开始后的第4天(t4)，在接种有金黄色葡萄球菌和接种有绿脓假单胞菌组中的对照和测试亚组之间，菌落计数具有统计学显著性差异。在接种有鲍曼不动杆菌的测试和对照亚组中，平均菌落计数不具有统计学显著性差异，但是菌落计数具有减少的趋势。

伤口闭合动力学(测面法)

图11示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的阴性组、对照组(C)和测试组(T)的伤口闭合分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。

组织学分析

图12示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌的动物的阴性组、对照组(C)和测试组(T)的组织学分析结果，其证明根据本发明的示例性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。

在EG中，在阴性对照组与所有的接种对照亚组之间具有统计学显著性差异。此外，就EG而言，在接种有金黄色葡萄球菌和接种有绿脓假单胞菌组中的对照和测试亚组之间具有显著的统计学差异(p<0.05)。

结果的讨论

基于之前啮齿动物的研究(Mendes JJ,et al.2012.Comp Med62:1-12)，已知在t4时由感染伤口培养的组织中，细菌集落计数平均为7.54±0.19log(CFU)/溃疡。本研究使用了高剂量的噬菌体(10⁸至10⁹pfu/次施用)，这产生了10至100的感染复度。据信该初始剂量足以使过多的目标细菌群体减少，而无需噬菌体复制并完成它们的生活周期。这与之前的噬菌体疗法相反，之前的噬菌体疗法使用了相对低的噬菌体剂量，并且主要依赖于主动疗法，这涉及噬菌体的感染/复制循环来减少目标细菌(Loc Carrillo C,et al.,2005,Appl EnvironMicrobiol.71(11):6554-6563)。主动和被动噬菌体疗法的这些过程已经在体外和体内研究中有所描述(Cairns BJ,et al.,2011,PLoS Pathog.5(1):e1000253；and Hooton SP,et al.,2011,Int J Food Microbiol.151(2):157-163)。

在感染金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌的动物中，所有3个结果都通过噬菌体治疗而改善，并且在感染鲍曼不动杆菌的那些动物中观察到细菌减少。不被理论所局限，这可以通过以下研究来解释(例如Simoes LC,et al.,2008,Appl Environ Microbiol.74(4):1259-1263)：其中发现在生物膜群落中存在不动杆菌菌株促进其他物种(即，葡萄球菌物种)的表面定植。本研究的结果符合这一发现：在接种有鲍曼不动杆菌的组中，在非选择性培养基上过量生长的细菌被鉴定为主要是葡萄球菌物种。

在本工作中，在t4时评估细菌计数(在治疗开始后的第4天)，并且与对照相比，金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌测试条件中的菌落计数具有显著性差异，特别是绿脓假单胞菌更加如此。这些发现符合之前的研究(例如Mendes JJ,et al.2012.Comp Med 62:1-12；and FazliM,et al.,2009,J Clin Microbiol.47(12):4084-4089)。具体而言，Fazli等人使用临床创面活组织检测样本的共聚焦激光扫描显微镜来证明绿脓假单胞菌聚集物与伤口表面的距离明显大于金黄色葡萄球菌聚集物与伤口表面的距离，这导致对拭子样品中的绿脓假单胞菌聚集物的低估。这种观察支持了这样的可能：各种致病性细菌菌株固有的因素可以有助于在这些研究(比较由拭子和组织样品生长得到的培养物)中的差异。

测面法评估表明在对照组和使用金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌处理的测试组之间具有统计学显著性差异，并且相同的趋势在鲍曼不动杆菌中见到。这些结果与收获的组织性样本中的EG和DG测量相似。

重要的是，由于猪被认为是研究皮肤疾病的理想的大型动物模型，所以在啮齿动物模型中获得的结果很大程度上在猪的试验中得到了证实(Greenhalgh DG.,2005,J Burn Care Rehabil.26(4):293-305)。在2种模型中，对于金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌感染而言，在2个时间点(t1和t4)时，细菌计数显著减少。

就EG测量而言，明显的结果在接种金黄色葡萄球菌和接种绿脓假单胞菌的测试动物中观察到。

因此，本研究表明包含噬菌体的TAT为DFI(包括由抗药细菌引起的感染)提供了切实可行的治疗方法，从而为解决与DFI和其他慢性皮肤和软组织感染有关的严重问题提供了有效且新型的治疗方法。换言之，噬菌体治疗有效地减少细菌菌落计数，并改善金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌感染中的伤口愈合(如较小的上皮和真皮缝隙所示)，因此，局部施用的噬菌体治疗在解决慢性感染(特别是在与伤口清创术联合使用时)中是有效的。

6.1.9 用于最初的人类研究的毒理学程序

提出如下文所示的，小型猪中的4周真皮刺激研究来支持最初的临床研究。如果需要，还可以在大鼠中实施4周静脉注射(iv)研究，但是据信iv研究不能得到关于如果噬菌体菌株未存在于特定的细菌中则其不能复制的任何结论；然而，iv研究可以证明这种观点，并且还可以证明当施用相当高的量的噬菌体菌株时，其是安全的(在iv研究中，使用与局部施加相同的剂量反应了比最大可能的吸收更高的剂量)。

在小型猪中的4周真皮刺激研究，4周恢复期(GLP)

本研究设计包括5只雌性小型猪，其中给药途径为真皮给药(2个位点/侧；覆盖的/洗过的)，频率为每日1次。剂量制备物以原样使用。每日2次观察(死亡率/发病率)，同时每周进行详细的临床观察，包括测量体重。由职业兽医对所有动物进行生理检查，然后开始施用根据本发明的示例性噬菌体混合组合物，作为测试制品(TA)。

为了评价皮肤的反应，在第2天开始施用各剂量之前，每日针对红斑和浮肿来评价各只动物。任何非测试位点的损伤也被记录和描述。如下所述，使用对皮肤刺激进行评分的Draize指数(Draize scale)。就红斑和焦痂的形成而言，0表示无红斑；1表示非常小的红斑(仅仅可感觉到的)；2表示明确定义的红斑；3表示中度至重度的红斑；而4表示重度的红斑(甜菜红)至微小焦痂的形成(全面损伤)。就浮肿的形成而言，0表示未浮肿；1表示极轻的浮肿(仅仅是可感觉到的)；2表示轻微的浮肿(由确切的升高而明确定义的区域的边缘)；3表示中度浮肿(升高大约1毫米)；而4表示严重浮肿(升高超过1毫米并且延伸至暴露区域以外的地方)。如果不进行尸检，则动物返回库中。

实施钻孔活组织检测以用于组织学分析。左侧的3种样品(天然、安慰剂、TA)是在第29天收集的；右侧的3种样品是在第57天收集的；所有样品都被保存、在载玻片上处理并在显微镜下评价。形成分析涉及由第三方提供的化验证明书。

在大鼠中的4周真皮毒理学研究，4周恢复期(GLP)

本研究设计包括用于施用根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的剂量时间表，如下表所示。

其他的动物/性别/治疗组被包含在内作为替代动物。

给药途径为iv团注，频率为每日1次。剂量制备物以原样使用。每日2次观察(死亡率/发病率)，同时每周进行详细的临床观察，包括测量体重。也测量每周的采食量。

在检验前对所有的动物、以及在结束和恢复期时对所有存活的主要研究动物进行眼科学检验。临床病理学检验(包括血液学、凝血、临床化学和尿液分析)是在结束或恢复期尸检时对所有存活的主要研究动物进行的。尸检检验是对所有主要研究和恢复期动物进行的；TK动物实施安乐死并丢弃。针对肾上腺、脑、心、肾、肝、肺、卵巢、垂体、前列腺、唾液腺、储精囊、脾、具有副甲状腺的甲状腺、胸腺、睾丸和子宫，测定器官的重量。

对媒介物对照和高剂量组中的所有动物、以及所有发现死亡的动物进行玻片标本制备和显微病理学，并且包括制备全套的标准组织(大约65个)并靶向低剂量和中剂量组、以及所有的恢复期动物的器官。此外，对所有动物的肉眼损伤进行玻片标本制备和显微病理学。

采用标准的统计学分析。此外，还使用用于毒代动力学分析的标准参数，例如AUC、t_1/2、t_max和C_max。

6.1.10临床研究

临床试验/概念验证

图13示出了糖尿病足感染的分类以及使用根据本发明的示例性噬菌体混合组合物对其实施噬菌体疗法的应用。总体而言，根据PEDIS分类，在2-3级的溃疡中施加根据本发明的噬菌体混合组合物。施用涉及在伤口的清创术之后，使用局部施加的液体配制物。

图14示出了根据本发明的示例性噬菌体混合组合物用于糖尿病足部溃疡疗法中的临床研究设计。研究类型是干涉型的，并且为平行赋值的干涉模型；研究设计涉及开放标签被掩盖的随机分配；终点分类包括安全性和效力，同时主要目的是用于治疗。主要的结果测量包括微生物组织负担(活组织检测)；伤口流体微生物负担(时间框：每一次泡沫的改变)；以及组织微生物负担(时间框：24h/3rd天/5th天/临床迹象结束/开始)。次要的结果测量包括每次随访中的伤口评估(时间框：4周至12周)。

在伤口的筛选观察和清创术后，合适的患者群体在最初的24小时中以4h/4h而随后的5天中每日1次随机地接受安慰剂和根据本发明的噬菌体混合组合物(10⁹噬菌体/cm²/次应用)。将药品的安全性和效力与安慰剂组比较；然而，如果患者被确认为处于需要截肢的风险中，该患者也可以被包括在治疗组中。

标准涉及以下的纳入和排除标准。纳入标准包括根据PEDIS分类，溃疡位点的临床细菌感染为2级或3级，并且不具有不利于伤口压力疗法的禁忌征候。排除标准包括在前7天内在伤口上局部应用了用于事先伤口护理的任何试剂(例如使用生长因子)。

本领域的那些技术人员在读取之前的描述时将进行某些修改和改善。应该理解的是为了简洁和易读，所有这些修改和改善已经由本说明书中删除，但是适当地包含在所附的权利要求书的范围内。

就所有目的而言，本发明引用的所有公开、专利和专利申请均以引用方式全文并入本文。

Claims (76)

1.一种包含至少2种不同的分离的噬菌体菌株的组合物，所述的菌株的每一种菌株都具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ IDNO:1(F44/10)、SEQ ID NO:2(F125/10)、SEQ ID NO:3(F770/05)、SEQ ID NO:4(F510/08)和SEQ ID NO:5(F1245/05)或者其变体，所述的变体与所述的核酸序列具有至少95％的序列一致性并且显示针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的至少一种的抗细菌活性。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的至少2种噬菌体菌株中的一种菌株为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2或者其变体的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的至少2种噬菌体菌株为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:1和SEQID NO:2或者其变体的核酸序列。

4.根据权利要求3所述的组合物，其进一步包含至少第三种噬菌体菌株，所述第三种菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5或者其变体的核酸序列。

5.根据权利要求3所述的组合物，其进一步包含至少第三种和第四种噬菌体菌株，所述第三种和第四种菌株各自具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5或者其变体的核酸序列。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的至少2种噬菌体菌株中的一种菌株为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4或者其变体的核酸序列。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的至少2种噬菌体菌株为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:3和SEQID NO:4或者其变体的核酸序列。

8.根据权利要求7所述的组合物，其进一步包含至少第三种噬菌体菌株，所述第三种菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5或者其变体的核酸序列。

9.根据权利要求7所述的组合物，其进一步包含至少第三种和第四种噬菌体菌株，所述第三种和第四种菌株各自具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5或者其变体的核酸序列。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的至少2种噬菌体菌株中的一种菌株为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ IDNO:5或者其变体的核酸序列。

11.根据权利要求10所述的组合物，其进一步包含至少第三种噬菌体菌株，所述第三种菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或者其变体的核酸序列。

12.根据权利要求10所述的组合物，其进一步包含至少第三种和第四种噬菌体菌株，所述第三种和第四种菌株各自具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或者其变体的核酸序列。

13.一种包含至少5种分离的噬菌体菌株的组合物，所述的菌株具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5或者其变体的核酸序列，所述的变体与所述的核酸序列具有至少95％的序列一致性并且显示针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的至少一种的抗细菌活性。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的具有包含SEQ IDNO:1,2,4和5或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株各自以相当于所述的具有包含SEQ ID NO:3或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株大约10倍的量存在于所述的组合物中。

15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的组合物包含所述的具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核酸序列。

16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-15的任意一项所述的组合物及药物可接受的载体。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述的组合物配制用于局部应用。

18.根据权利要求16或17所述的药物组合物，其中所述的组合物包含其他的无菌缓冲剂。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述的缓冲剂包含大约0.05M Tris-HCl、大约0.1M NaCl和大约10mM MgSO₄.7H₂O。

20.根据权利要求16-19的任意一项所述的药物组合物，其中所述的组合物装在安瓿瓶中。

21.根据权利要求16-20的任意一项所述的药物组合物，其进一步包含其他试剂，该其他试剂选自抗生素试剂、抗炎症试剂、抗病毒试剂、局部麻醉剂、生长因子和皮质类固醇。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述的其他试剂为抗生素试剂，该抗生素试剂具有针对鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。

23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述的其他试剂为抗生素试剂，该抗生素试剂具有针对除了鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌以外的细菌的抗细菌活性。

24.根据权利要求16-23的任意一项所述的药物组合物，其中所述的组合物用于治疗与不完整皮肤的区域有关的细菌感染，并且每种所述的噬菌体菌株均以相当于10³至10¹³噬菌体颗粒/cm²所述区域的量存在于所述的组合物中。

25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中每种所述的噬菌体菌株均以相当于10⁷至10⁹噬菌体颗粒/cm²所述区域的量存在于所述的组合物中。

26.一种药物组合物，其包含根据权利要求2-5的任意一项所述的组合物及药物可接受的载体。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述的组合物配制用于局部应用。

28.根据权利要求26或27所述的药物组合物，其进一步包含其他试剂，其中所述的其他试剂为具有针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

29.根据权利要求26或27所述的药物组合物，其进一步包含其他试剂，其中所述的其他试剂为具有针对除了金黄色葡萄球菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

30.一种药物组合物，其包含根据权利要求6-9的任意一项所述的组合物及药物可接受的载体。

31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述的组合物配制用于局部递送。

32.根据权利要求30或31所述的药物组合物，其进一步包含其他试剂，其中所述的其他试剂为具有针对绿脓假单胞菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

33.根据权利要求30或31所述的药物组合物，其进一步包含其他试剂，其中所述的其他试剂为具有针对除了绿脓假单胞菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

34.一种药物组合物，其包含根据权利要求10-12的任意一项所述的组合物及药物可接受的载体。

35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述的组合物配制用于局部应用。

36.根据权利要求34或35所述的药物组合物，其进一步包含其他试剂，其中所述的其他试剂为具有针对鲍曼不动杆菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

37.根据权利要求34或35所述的药物组合物，其进一步包含其他试剂，其中所述的其他试剂为具有针对除了鲍曼不动杆菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。

38.一种药物组合物，其包含根据权利要求13-15的任意一项所述的组合物及药物可接受的载体。

39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述的组合物配制用于局部应用。

40.根据权利要求38或39所述的药物组合物，其中所述的组合物用于治疗与不完整皮肤的区域有关的细菌感染，并且每种所述的噬菌体菌株均以相当于10⁷至10⁹噬菌体颗粒/cm²所述区域的量存在于所述的组合物中。

41.一种用于治疗或预防有需要的受试对象中的细菌感染的方法，其包括向所述的受试对象施用治疗有效量的根据权利要求16-25的任意一项所述的药物组合物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述的细菌感染是由鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种引起的感染。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述的药物组合物以局部方式施用。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述的受试对象为哺乳动物。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

46.根据权利要求41-45的任意一项所述的方法，其中所述的细菌感染与慢性溃疡有关。

47.根据权利要求41-46的任意一项所述的方法，其中所述的细菌感染与烧伤有关。

48.根据权利要求41-46的任意一项所述的方法，其中所述的细菌感染与糖尿病足感染有关。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述的糖尿病足感染包括皮肤溃疡。

50.根据权利要求41-46的任意一项所述的方法，其中所述的细菌感染与不完整皮肤的区域有关，其中所述的不完整皮肤的区域选自与蜂窝组织炎、丹毒病变、褥疮性溃疡和压疮有关的伤处。

51.一种用于治疗或预防有需要的受试对象中的细菌感染的方法，其包括向所述的受试对象施用治疗有效量的根据权利要求26-29的任意一项所述的药物组合物。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述的细菌感染是由金黄色葡萄球菌引起的感染。

53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述的细菌感染为糖尿病足感染。

54.一种用于治疗或预防有需要的受试对象中的细菌感染的方法，其包括向所述的受试对象施用治疗有效量的根据权利要求30-33的任意一项所述的药物组合物。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述的细菌感染是由绿脓假单胞菌引起的感染。

56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述的细菌感染为糖尿病足感染。

57.一种用于治疗或预防有需要的受试对象中的细菌感染的方法，其包括向所述的受试对象施用治疗有效量的根据权利要求34-37的任意一项所述的药物组合物。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述的细菌感染是由鲍曼不动杆菌引起的感染。

59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述的细菌感染为糖尿病足感染。

60.一种用于治疗或预防有需要的受试对象中的细菌感染的方法，其包括向所述的受试对象施用治疗有效量的根据权利要求38-40的任意一项所述的药物组合物。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述的细菌感染为糖尿病足感染。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述的治疗包括将所述的组合物局部施用至与所述的糖尿病足感染有关的皮肤溃疡。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述的施用是在所述的溃疡的机械清创术之后。

64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述的施用包括使用敷料、滴注装置和负压伤口治疗装置中的至少一种。

65.根据权利要求62-64的任意一项所述的方法，其中在最初的24小时内每4小时或每6小时施用所述的药物组合物。

66.根据权利要求65所述的方法，其中在所述的最初的24小时之后，在至少另外3天中，每12小时或每24小时施用所述的药物组合物。

67.根据权利要求66所述的方法，其中在至少另外4天中，每12小时或每24小时施用所述的药物组合物。

68.根据权利要求61-67的任意一项所述的方法，其中所述的方法与用于糖尿病足感染的标准疗法组合使用。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述的标准疗法选自细胞外基质替代疗法、湿性伤口疗法、负压伤口疗法、动脉血管再形成疗法、高压氧疗、施用抗生素试剂和施用生长因子。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述的湿性伤口疗法包括使用粘合性底膜、涂敷有机硅的泡沫、水凝胶和/或水状胶体。

71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述的细胞外基质替代疗法包括使用生物改造的组织。

72.根据权利要求69-71的任意一项所述的方法，其中所述的抗生素试剂具有针对鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。

73.根据权利要求72所述的方法，其中施用所述的抗生素试剂包括系统性施用。

74.根据权利要求69-73的任意一项所述的方法，其中所述的生长因子为选自血小板衍生的生长因子、粒细胞集落刺激因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子和血管内皮细胞生长因子中的至少一种。

75.根据权利要求74所述的方法，其中施用所述的生长因子包括局部施用。

76.根据权利要求61-75的任意一项所述的方法，其中所述的方法与用于糖尿病足感染的非标准疗法组合使用，其中所述的糖尿病足感染难以用标准疗法治疗。