KR20210006330A - 재조합 t 세포 수용체 유전자를 사용하여 세포-기반 치료제를 생성하는 기술 - Google Patents

재조합 t 세포 수용체 유전자를 사용하여 세포-기반 치료제를 생성하는 기술 Download PDF

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KR20210006330A
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Abstract

본 기술은 일반적으로, 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 라이브러리를 창출하기 위한 조성물 및 방법, 및 이들의 치료적 사용 방법에 관한 것이다. 본 기술의 조성물 및 방법은 암 및 바이러스 감염에 대한 개인화된 표적화 요법으로서 항원-특이적 TCR 레퍼토리의 신속한 단리에 유용하다.

Description

재조합 T 세포 수용체 유전자를 사용하여 세포-기반 치료제를 생성하는 기술
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 3월 1일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/637,240을 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
미국 정부 지원
본 발명은 국립 보건 연구소가 수여한 GM103418 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 갖고 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2019년 2월 25일에 생성된 상기 ASCII 카피는 104434-0179_SL.txt로 명명되고 그 크기가 206,931 바이트이다.
기술 분야
본 기술은 일반적으로, 세포 요법으로서 T 세포 수용체를 코딩하는 단일 T 세포로부터의 유전자의 고처리량 단리 및 조작 방법, T 세포 라이브러리의 조성물, 및 그의 치료적 사용 방법에 관한 것이다.
하기 설명은 독자의 이해를 돕기 위해 제공된다. 제공된 정보 또는 인용된 참고문헌 중 어느 것도 본 방법에 대한 선행 기술로 인정되지 않는다.
인간은 적응 면역 체계의 주요 구성요소를 제공하는 수천 종의 T 세포 수용체를 가지고 있으며, T 세포 수용체 반응은 바이러스 감염, 암 및 자가면역을 포함한 질환으로부터 보호하는데 중요한 기여를 하는 것으로 입증되었다. 그러나, 분자적으로 정의된 T 세포 수용체 요법은 임상 치료에 한정된 영향을 미쳤는데, 이는 T 세포 수용체 반응을 치료로 이어지게 하는 방법이 전환 요법에 실용적인 규모로 완전히 해명되지 않았기 때문이다. 현재의 방법은 낮은 처리량 T 세포 수용체 확인 기술, T 세포 수용체의 클로닝을 위한 번거로운 관행, 및 T 세포 라이브러리의 세포 상태를 지시할 수 있는 제한된 능력에 의존한다.
세포 치료제를 위한, 특히 암 치료를 위한 약물로서 T 세포 수용체 반응의 신속한 전환을 위한 방법을 확립할 필요가 있다. 본 기술은 TCR 레퍼토리가 암의 임상 치료 또는 예방을 위한 적응 면역에 기여하는 것을 부분적으로 활용함으로써 이러한 요구를 해결한다.
본 기술은 일반적으로 재조합 TCR 라이브러리를 창출하기 위한 신규 조성물 및 방법, 및 이들의 치료적 사용 방법에 관한 것이다. 본 기술의 조성물 및 방법은 암 및 바이러스 감염에 대한 개인화된 표적화 요법의 개발을 위한 항원-특이적 TCR 레퍼토리의 신속한 단리에 유용하다.
따라서, 한 측면에서, 본 기술은 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 라이브러리 벡터로서, (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내에 존재하는 단일 용해된 T 세포로부터 단리된 mRNA로부터 유래되는 것인 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약 또는 역전사-PCR (RT-PCR)을 사용하여 단리된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 임의적으로 링커 폴리뉴클레오티드를 통해 작동가능하게 연결된다. 상기 벡터의 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 포획된 T 세포 mRNA의 역전사 및 PCR 증폭에 의해 작동가능하게 연결되었다. 상기 벡터의 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 TCR 유전자에서 천연적으로 발견되는 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위에서의 절단에 의해 벡터 백본 내로 클로닝되었다. 특정 실시양태에서, 이러한 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위는 낮은 빈도로 TCR 유전자에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 표 7 또는 8에 개시된 적어도 하나의 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위를 혼입하도록 변경되었다. 특정 실시양태에서, 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위는 침묵 돌연변이를 포함한다.
상기 벡터의 특정 실시양태에서, mRNA 포획 시약은 폴리(dT) 코팅된 비드, 올리고뉴클레오티드-코팅된 비드, 히드로겔 비드, 및 마이크로어레이 웰의 표면 상의 프린팅된 올리고로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 구획은 에멀젼 액적 또는 웰이다. 특정 실시양태에서, 웰은 프린팅된 중합체 슬라이드, 플라스틱 플레이트, 미세역가 플레이트, 또는 겔에 위치한다. 일부 실시양태에서, 구획의 용적은 5 nL 이하이다.
상기 벡터의 특정 실시양태에서, 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 발현 제어 요소를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 프로모터, p2a 서열, 및 IRES 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 CMV 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 발현 제어 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 위치한다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 벡터는 원형화된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 발현 제어 요소의 벡터 내로의 혼입 전에 원형화되었다. 다른 실시양태에서, 벡터는 발현 제어 요소의 벡터 내로의 혼입 후에 원형화되었다. 일부 실시양태에서, 벡터는 선형이다 (예를 들어, 원형화되지 않는다).
상기 벡터의 특정 실시양태에서, 발현 제어 요소는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 근처에 혼입되었다. 다른 실시양태에서, 발현 제어 요소는 제한 효소 또는 TALEN으로부터 선택된 DNA-변형 효소를 사용하여 벡터 내로 혼입되었다. 다른 실시양태에서, 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에 작동가능하게 연결된 트랜스포손을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 벡터는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 검출가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 선택가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 활성화를 제어하기 위한 스위치 메카니즘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 코작 컨센서스 서열 또는 인핸서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
상기 벡터의 특정 실시양태에서, 벡터 백본은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 벡터 백본으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 벡터는 CRISPR/Cas9 통합을 위한 선형 DNA를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터는 리컴비나제 효소를 사용하여 숙주 내로 혼입될 수 있는 DNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 트랜스포사제 효소를 사용하여 숙주 내로 혼입될 수 있는 DNA를 포함할 수 있다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 상기 코딩된 T 세포 수용체 (예를 들어, TCRαβ 또는 TCRγδ)는 질환 항원 또는 표적 세포에 대항하여 반응성이다. 특정 실시양태에서, 질환 항원은 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원이다. 다른 실시양태에서, 질환 항원은 CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인 4, KIF20A, 렝신, 멜로에, 뮤신 5AC (MUC5AC), 서바이빈, 시클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAGE1b/GAGED2A, CD19, CD20, CD22, CD52, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 멤버 10a (TRAILR1), 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제 (RANKL), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), 및 암배아성 항원 (CEA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원이다.
또 다른 측면에서, 본 기술은 벡터를 포함하는 재조합 세포로서, 여기서 벡터는 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 재조합 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리되며, 임의적으로 여기서 재조합 세포는 박테리아 세포, 포유동물 세포, 또는 효모 세포이다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
한 측면에서, 본 기술은 복수개의 벡터를 포함하는 재조합 TCR 벡터 라이브러리로서, 각각의 벡터는 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약에 의해 포획된 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 재조합 TCR 벡터 라이브러리를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 벡터는 TCR 레퍼토리를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 벡터 라이브러리 내에서의 개별 벡터는 하기 특징: TCR 클로날 출현율, 시험관내 검정으로부터의 TCR 강화 특징, TCR 결합 특이성, TCR V 세그먼트 서열, TCR D 세그먼트 서열, TCR J 세그먼트 서열, TCR 유전자 모티프, 및/또는 CDR3 유전자 모티프 중 하나 이상을 기반으로 하여 TCR 라이브러리에 포함시키기 위해 선택되었다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리 내에서의 개별 벡터는 규정된 비로 혼합되어 합성적으로 유래된 TCR 라이브러리를 생성한다.
또 다른 측면에서, 본 기술은 단리된 면역 세포로서, (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약에 의해 포획된 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 단리된 면역 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서 면역 세포는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 자연 살해 (NK) 세포이다.
한 측면에서, 본 기술은 복수개의 벡터를 포함하는 재조합 TCR 벡터 라이브러리를 포함하는 세포 집단으로서, 각각의 벡터는 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 세포 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 상기 집단은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 NK 세포를 포함한다.
또 다른 측면에서, 또한 본원에는 재조합 TCR 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 상기 집단은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 벡터는 상기 방법의 특정 단계에서 원형화되고, 다른 단계에서 선형화된다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 라이브러리는 표적 세포에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝된다. 특정 실시양태에서, 세포는 암 세포 또는 바이러스에 감염된 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 대상체로부터 단리되었다.
상기 방법의 다른 실시양태에서, 라이브러리는 항원:MHC 복합체에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝된다. 일부 실시양태에서 항원:MHC 복합체의 항원은 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원이다. 다른 실시양태에서, 항원:MHC 복합체의 항원은 CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인 4, KIF20A, 렝신, 멜로에, 뮤신 5AC (MUC5AC), 서바이빈, 시클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAGE1b/GAGED2A, CD19, CD20, CD22, CD52, EGFR, HER2, TRAILR1, RANKL, IGF1R, EpCAM, 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원이다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 라이브러리는 T 세포 표현형 마커에 대하여 스크리닝된다. 상기 방법의 다른 실시양태에서, 라이브러리는 조혈 줄기 세포 표현형 마커에 대하여 스크리닝된다. 상기 방법의 다른 실시양태에서, 라이브러리는 자연 살해 세포 표현형 마커에 대하여 스크리닝된다.
상기 방법의 특정 실시양태에서, 라이브러리는 공동-배양 시스템에서의 활성에 대하여 스크리닝되며, 여기서 공동-배양 시스템은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: (a) 암 세포주; (b) 공지된 바이러스에 감염된 복수개의 세포; (c) 암 환자로부터 단리된 복수개의 종양 세포; (d) 불멸화된 세포주; 또는 (e) 환자 조직 생검으로부터 유래된 복수개의 세포.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 상기 형질전환된 세포는 시험관 내에서 활성화된다. 특정한 실시양태에서, 활성화는 하기 자극제: 항-CD3 항체, 항-CD8 항체, 항-CD27 항체, IL-2, IL-4, IL-21, 항-PD1 항체, 항-CTLA4 항체, 종양 세포 용해물, 바이러스 감염된 세포와의 세포성 공동-배양물, 및 종양 세포주 중 하나 이상을 사용하여 수행된다.
상기 방법의 특정 실시양태에서, 세포 집단은 전사 인자로 형질전환된다. 전사 인자는 형질전환된 세포의 행동 또는 표현형에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 전사 인자는 FOXP3, BLIMP-1, 헬리오스(Helios), 이카로스(Ikaros), 및 TGF-베타로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본원에는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합 TCR 라이브러리로서; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 재조합 TCR 라이브러리가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 상기 집단은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 NK 세포를 포함한다.
한 측면에서, 본 기술은 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합 TCR 라이브러리, 및 담체를 포함하는 조성물로서; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 조성물이 제공한다. 일부 실시양태에서, 담체는 제약상 허용되는 담체이다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
한 측면에서, 본원에는 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 TCR 라이브러리 또는 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법으로서, 여기서 재조합 TCR 라이브러리는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되었으며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
또 다른 측면에서, 본원에는 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 TCR 라이브러리 또는 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 재조합 TCR 라이브러리는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되었으며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
일부 실시양태에서, 암은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 부신피질 암종; AIDS-관련 암; 항문암; 충수암; 성상세포종; 비정형 기형양/횡문근양 종양, 뇌암; 피부의 기저 세포 암종; 담관암; 방광암; 골암; 유방암; 기관지 종양; 버킷 림프종; 카르시노이드 종양 (위장); 배세포 종양; 원발성 CNS 림프종; 자궁경부암; 담관암종; 척삭종; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 만성 골수성 백혈병 (CML); 만성 골수증식성 신생물; 결장직장암; 두개인두종; 피부 T-세포 림프종; 관 상피내 암종 (DCIS); 자궁내막암; 상의세포종; 식도암; 감각신경모세포종; 두개외 배세포 종양; 고환외 배세포 종양; 안암; 안내 흑색종; 망막모세포종; 난관암; 골의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종; 담낭암; 위암; 위장 카르시노이드 종양; 위장 기질 종양 (GIST); 배세포 종양; 임신성 영양막 질환; 모발상 세포 백혈병; 두경부암; 심장 종양; 간세포성암; 조직구증, 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종; 하인두암; 안내 흑색종; 섬 세포 종양, 췌장 신경내분비 종양; 신장암; 후두암; 백혈병; 구순 및 구강암; 간암; 폐암; 림프종; 남성 유방암; 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종; 흑색종; 메르켈 세포 암종; 중피종; 전이성 암; 구강암; 다발성 내분비 신생물 증후군; 다발성 골수종/형질 세포 신생물; 균상 식육종; 골수이형성 증후군, 골수증식성 신생물, 만성; 비인두암; 신경모세포종; 비-호지킨 림프종; 비소세포 폐암; 구강암, 구인두암; 골육종; 난소암; 췌장암; 췌장 신경내분비 종양; 유두종증; 부신경절종; 부비동암; 부갑상선암; 인두암; 크롬친화세포종; 뇌하수체 종양; 흉막폐 모세포종; 전립선암; 직장암; 재발성 암; 신세포암; 망막모세포종; 횡문근육종; 타액선암; 육종; 유잉 육종; 카포시 육종; 골육종; 자궁 육종; 세자리 증후군; 피부암; 소세포 폐암; 소장암; 연부 조직 육종; 피부의 편평 세포 암종; 편평 경부암; 위암; T 세포 림프종; 고환암; 인후암; 비인두암; 하인두암; 흉선 암종; 갑상선암; 요도암; 자궁암; 질암; 혈관 종양; 외음부암; 또는 윌름스 종양이다.
한 측면에서, 본원에는 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 재조합 TCR 라이브러리 또는 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 여기서 재조합 TCR 라이브러리는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되었으며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다.
또 다른 측면에서, 본원에는 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 TCR 라이브러리 또는 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법으로서, 여기서 재조합 TCR 라이브러리는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되었으며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 감염은 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 하나 이상의 부가 용량의 재조합 TCR 라이브러리 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 TCR 라이브러리는 치료되는 대상체에 대해 자가이거나 또는 동종이계인 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간, 동물, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 양, 마우스, 말 또는 소이다. 특정한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
도 1은 전장 TCR α:β 가변 영역을 수득하기 위한 중첩 연장 (OE-PCR)의 겔 영상을 제시한다. OE-PCR 후, PCR 산물을 정제하고 DNA 겔 전기영동에 의해 분석하였다. TCR α:β 앰플리콘 (약 1000 b.p.)이 가시적이었으며, 네스티드 PCR을 사용하여 추가로 강화시켰다. DNA 겔 전기영동 후, 겔 추출을 수행하여 TCR α:β 앰플리콘을 수득하였다. 5 ng의 정제된 PCR 산물을 세미-네스티드 PCR을 수행하기 위한 주형으로서 사용하였다.
도 2는 네스티드 PCR 산물의 겔 전기영동을 제시한다. DNA 전기영동 후, TCR α:β 앰플리콘을 절제하고, 자이모클린(Zymoclean)™ 겔 DNA 회수 키트 [자이모 리서치(Zymo Research)]를 사용하여 겔 정제를 수행하였다. 정제된 앰플리콘을 제로 블런트 클로닝 [써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)]에 적용하여 TCR α:β 앰플리콘 서열을 분석하였다. 이러한 서열은 NCBI IGBLAST T 세포 수용체 유전자 데이터베이스에 의해 확인되었다.
도 3은 예시적인 pLVX-CMV-TCR1-pTert-iCas9 벡터에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV6-2 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV38-1, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, tet 유도성 프로모터에 의해 제어되고 cHS4 인슐레이터 서열에 의해 플랭킹된 i-카스파제9 자살 스위치, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 4는 pLVX-CMV-TCR2-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV5-8 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV40, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, tet 유도성 프로모터에 의해 제어되고 cHS4 인슐레이터 서열에 의해 플랭킹된 i-카스파제9 자살 스위치, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 5는 pLVX-CMV-TCR3-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV10-3 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV13-2, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, tet 유도성 프로모터에 의해 제어되고 cHS4 인슐레이터 서열에 의해 플랭킹된 i-카스파제9 자살 스위치, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 6은 pLVX-CMV-TCR4-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV28-1 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV38-1, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, tet 유도성 프로모터에 의해 제어되고 cHS4 인슐레이터 서열에 의해 플랭킹된 i-카스파제9 자살 스위치, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 7은 pLVX-CMV-TCR5-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV24-1 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV38, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, tet 유도성 프로모터에 의해 제어되고 cHS4 인슐레이터 서열에 의해 플랭킹된 i-카스파제9 자살 스위치, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 8은 pLVX-TCR1-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV6-2 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV38-1, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 9는 pLVX-TCR2-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV5-8 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV40, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 10은 pLVX-TCR3-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV10-3 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV13-2, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 11은 pLVX-TCR4-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV28-1 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV38-1, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 12는 pLVX-TCR5-pTert-iCas9에 대한 벡터 맵을 제시한다. 벡터는 암피실린 내성 유전자, 5' 및 3' LTR, CMV 프로모터, TCR 베타 서열 (TRBV24-1 리더 펩티드, TRBV25, TRBC) 및 TCR 알파 서열 (TRAV38, TRAV35, 및 TRAC), TCR 베타와 TCR 알파 사이에 삽입된 p2A 서열, TCR 알파 서열 다음에 삽입된 IRES 서열, mCherry 형광 마커, 및 WPRE 인핸서를 포함한다.
도 13은 원래 pLVX-EF1α-IRES-mCherry 벡터에 대한 벡터 맵을 제시한다.
도 14는 변형된 pLVX-EF1α-IRES-mCherry 벡터에 대한 벡터 맵을 제시하며, 여기서 과잉 AgeI, SphI, NheI 및 MluI 제한 부위는 부위 지정 돌연변이 유발을 수행함으로써 제거되었다.
도 15는 단일 세포 유화 중첩-연장 RT-PCR로부터 T 세포 수용체 (TCR) 앰플리콘 (알파:베타 쇄)의 DNA 전기영동 분석을 제시한다. 좌측 패널은 쌍형성된 알파:베타 쇄 TCR 앰플리콘의 PCR 증폭 계획을 나타낸다. 우측 패널은 제1 세미-네스티드, 제2 세미-네스티드 및 Mi-seq PCR의 DNA 전기영동 결과를 표시한다. T 세포 수용체 앰플리콘은 적색 사각형으로 강조 표시되었다. Miseq 프라이머는 TRBV 유전자의 FR3 영역에서 어닐링되어, 천연적으로 쌍형성된 DNA 서열 분석을 위한 약 550 bp의 쌍형성된 알파:베타 PCR 앰플리콘을 산출하였다.
도 16은 연결된 알파:베타 T 세포 수용체 유전자 분포의 요약을 제시한다. 고처리량 시퀀싱 후, 원시 DNA 서열을 품질-필터링하고 NCBI IgBLAST 및 CDR3 모티프 알고리즘을 통해 TCR 유전자 활용에 대해 주석을 달고, α 및 β 쇄에 의해 쌍형성하였으며, TCR 레퍼토리로 컴파일링하였다.
도 17은 돌연변이체 항-HIV-Nef-Rm9 TCR의 발현 및 pMHC에 대한 그의 결합 친화도의 평가를 제시하며, 여기서 이들 돌연변이체 TCR은 원래 야생형 항-HIV-Nef-Rm9 리더 펩티드와 상이한 리더 펩티드를 포함한다. 이들 비-천연 리더 펩티드는 모두 제한 효소 커팅 부위를 포함하기 위해 침묵 DNA 돌연변이 서열을 갖는다 (원래 및 비-침묵 돌연변이체 리더 펩티드 DNA 서열 및 도입된 제한 커팅 부위는 표 7 내지 8에 요약되어 있음).
도 18은 돌연변이체 항-HIV-Nef-Rm9 TCR의 발현 및 pMHC에 대한 그의 결합 친화도의 평가를 제시한다. 이러한 돌연변이체 TCR은 TCR 클로닝을 위한 제한 커팅 부위의 혼입을 위해 TCR 불변 영역에서 하나의 비-침묵 또는 하나의 침묵 돌연변이를 포함한다 (표 7에서의 침묵 돌연변이 및 표 8에서의 비-침묵 돌연변이 모두 참조).
도 19(a)는 인간화 마우스 모델 및 암 환자의 종양-특이적 T 세포 분석을 위한 인간 이펙터 T 세포의 단리를 제시한다. 도 19(b)는 단리되고, RT-PCR 증폭되며, NGS를 통해 분석된 31,718개의 인간 CD8+ TCR 클러스터에서의 Vα:Vβ 유전자 활용을 제시한다.
도 20은 본 기술의 렌티바이러스 TCR 세포 디스플레이 플랫폼을 제시한다. p2a에 의해 분리된 TCRα:β 유전자는 IRES TCR 발현 벡터의 다중 클로닝 부위 (MCS)에 삽입되었다. 패키징 및 외피 벡터를 사용한 HEK293T에서의 공동-형질감염은 TCR 유전자 (세포 표면에서 발현됨) 및 mCherry 리포터로 J.RT3/CD8 세포주를 형질도입하는 렌티바이러스 입자를 생성한다. 플로우 플롯: HIV Nef B*0702 RM9, RPQVPLRPM (SEQ ID NO: 1)으로 염색된 항-B*0702 NEF TM9 TCR을 수반한 J.RT3/CD8.
도 21(a)는 면역 체크포인트 억제제로 처리된 인간화 마우스에서의 RKO 종양 크기를 제시한다. TCR 스크리닝은 RKO 세포를 표적화하는 항원-특이적 TCR을 발견하기 위해 수행될 것이다. 도 21(b)는 항원-특이적 면역요법에 대해 확인된 TCR을 평가하는데 사용될 마우스 결장암 모델에서의 치료군을 제시한다.
도 22는 PDX 마우스 모델에서 항원-특이적 암 면역요법을 시험하고 최적화하기 위한 워크플로우를 제시한다. (좌측) 환자 종양을 단리하여 마우스 이종이식편으로서 배양하며, LN2에서 냉동 보존하고 배양에서 증식시켰다. (중앙) TCR 유전자를 수집하고 PDX 세포에 대항하여 스크리닝하였다. (우측) PDX 모델에서 유전자 요법으로서 항-종양 TCR 유전자를 사용하여 치료 효능을 시험하고 최적화하였다.
면역 체크포인트 억제제는 암 요법에서 엄청난 발전을 촉진시켜, 종양 성장을 제어하는데 있어서 면역 세포, 특히 CD8+ T 세포의 중요한 역할을 강조한다. 그러나, 최근 면역 수용체 시퀀싱에 있어서의 진전이 적응 면역의 클로날 순위-기반 특색에 관한 통찰력을 제공했지만, 쌍형성된 TCR 알파 및 베타 쇄의 서열을 분석할 수 없고 기능적으로 스크리닝할 수 없기 때문에, 종양 면역억제에 관한 더 광범위한 기능적 데이터의 수집이 불가능해졌고 유전자 요법을 위한 항암 T 세포 수용체 유전자의 발견 및 신속한 치료적 사용이 복잡해졌다 (Bonter, K. et al., Regen. Med. 12, 623-636 (2017); Malherbe, L., Ann. Allergy. Asthma. Immunol. 103, 76-79 (2009); Ahmad, T. A. et al., Vaccine Rep. 6, 13-22 (2016); Maus, M. V. et al., Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014); Yee, C. J. Transl. Med. 3, 17 (2005)). 현재까지, 종양-특이적 T 세포의 클로닝 및 기능적 분석은 1차, 생육성 T 세포를 분류하기 위한 요구 사항으로 인해 샘플당 아주 조금의 통상의 펩티드-MHC 조합으로 실제적으로 제한된다 (Malherbe, L., Ann. Allergy. Asthma. Immunol. 103, 76-79 (2009); Ahmad, T. A. et al., Vaccine Rep. 6, 13-22 (2016); Sanchez-Trincado, J. L. et al., Journal of Immunology Research (2017)). 효과적으로 스크리닝될 수 있는 적은 수의 펩티드-MHC는, 각각의 종양 샘플이 자신의 독특한 체세포 돌연변이 상황을 가지고 있기 때문에 신생항원 발견을 위해 반복적인 스크리닝이 필요하다는 사실로 인해 더욱 복잡해진다 (Martincorena, I. & Campbell, P. J. Science 349, 1483-1489 (2015); Tran, E. et al., Science aad1253 (2015); Choudhury, N. J. et al., Eur. Urol. Focus 2, 445-452 (2016)). 대체 방법, 예컨대 T 세포 증식 및 ELISPOT는 많은 환자 샘플에서 고도로 제한적일 뿐만 아니라 세포 성장 속도, 세포-기반 요법으로서 적용하는데 필요한 시간, 특이성 및 적절한 T 세포 표현형의 유지의 관점에서 제한이 있는 살아있는 T 세포에 의존한다 (Bonter, K. et al., Regen. Med. 12, 623-636 (2017); Maus, M. V. et al., Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014); Yee, C. J. Transl. Med. 3, 17 (2005); Redeker, A. & Arens, R., Front. Immunol. 7, (2016)).
본원에 기재된 방법 및 조성물은 이러한 병목 현상을 직접적으로 해결하고 환자에서 에피토프-특이적 T 세포 반응에 대한 최초의 포괄적인 서열- 및 기능-기반 주석을 제공하여, 표적화된 암 치료제의 개발을 안내하는 새로운 분자 규모 기술을 제공한다. 본 기술의 조성물 및 방법은 일반적으로, 예를 들어, 암 및 바이러스 감염에 대한 개인화된 표적화 요법으로서 스크리닝, 변형 및 사용될 수 있는 항원-특이적 TCR 레퍼토리의 신속한 단리에 유용하다. 본원에 기재된 표적화 요법은 현재 이용가능한 세포-기반 요법보다 더 빠르게 (단지 5일 내지 2주 내에) 개발 및 투여될 수 있다. 또한, 이러한 요법은 면역 탈출을 피할 가능성이 더 큰 다수의 별개의 TCR을 포함하며, 이는 표적 세포가 표적화된 에피토프 또는 항원의 억제에 의해 면역 검출을 회피할 수 있는 메카니즘이다.
더욱이, 본원에 기재된 방법 및 조성물의 구체적 실시양태는 TCR 라이브러리를 창출하는 이전에 보고된 접근법에 비해 하기와 같은 뚜렷한 이점을 제공한다: (1) 일부 실시양태에서, 본원에는 TCR 라이브러리가 박테리아에서 콜로니로서 성장할 수 있고 수많은 콜로니가 선택되고, 시퀀싱되며, 함께 혼합되고 규정된 산물로서 재전달될 수 있는 방법이 기재되고; (2) 일부 실시양태에서, 본원에는 최종 의약품에 포함될 수 있는 PCR 오류 변이체의 가능성을 최소화함으로써, 최종 치료용 세포 조성물이 부작용을 유도할 수 있는 특징규명할 수 없고 잠재적으로 매우 위험한 변이체를 함유할 위험을 감소시키는 분리 및 특징규명 단계가 기재되고; (3) 일부 실시양태에서, 본원에는 합병증 및 표적을 벗어난 효과가 발생할 경우에 환자에게 해를 끼칠 위험을 감소시키기 위한 자살 스위치의 포함이 기재되고; (4) 일부 실시양태에서, 상기 세포는 생체 내에서 원하는 TCR 기능을 달성하거나 또는 증강시키기 위해 투여 전에 사전-자극되고; (5) 일부 실시양태에서, 상기 방법은 강력한 항암 표현형으로 T 세포 발달에 영향을 미치는 세포에서 전사 인자를 공동-발현할 수 있는 능력을 포함하고; (6) 일부 실시양태에서, 시험관내 활성화 기술은 요법 투여에 대한 환자의 특이적 반응에 따라 필요에 따라 변형될 수 있고; (7) 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 질환 상태가 지속되거나 재발하는 경우 환자에게 반복된 용량의 세포 요법을 제공하는데 사용될 수 있다.
본 기술의 실질적인 이해를 제공하기 위해 본 방법의 특정 측면, 모드, 실시양태, 변이 및 특색이 다양한 수준의 세부 사항으로 하기에 기재된다는 것을 인지해야 한다.
본 방법을 실행하는데 있어서, 분자 생물학, 단백질 생화학, 세포 생물학, 면역학, 미생물학 및 재조합 DNA에 있어서의 많은 통상적인 기술이 사용된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); and Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology]을 참조한다. 폴리펩티드 유전자 발현 산물의 수준 (즉, 유전자 번역 수준)을 검출하고 측정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 폴리펩티드 검출 방법, 예컨대 항체 검출 및 정량화 기술의 사용을 포함한다 (또한, 문헌 [Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition. (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999)] 참조).
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로, 본 기술이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다. 일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 하기 기재된 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학, 분석 화학 및 핵산 화학 및 혼성화에서의 실험실 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 흔히 이용되는 것이다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전문이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함된 것과 동일한 정도로 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은, 숫자와 관련하여 용어 "약"은 일반적으로, 달리 명시되거나 또는 문맥상 달리 명백하지 않는 한 숫자의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)으로 1%, 5%, 또는 10%의 범위 내에 속하는 숫자를 포함하는 것으로 간주된다 (이러한 숫자가 가능한 값의 0% 미만이거나 또는 100%를 초과하는 경우는 제외).
본원에 사용된 바와 같은, 대상체에 대한 작용제 또는 약물의 "투여"는 의도 된 기능을 수행하기 위한 화합물을 대상체에게 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 경구로, 비강내로, 비경구로 (정맥내로, 근육내로, 복강내로 또는 피하로), 직장으로 또는 국소적으로를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 자기 투여 및 또 다른 것에 의한 투여를 포함한다.
"아주반트"는 면역 체계의 자극을 야기하는 하나 이상의 물질을 지칭한다. 이러한 맥락에서, 아주반트는 하나 이상의 백신 항원 또는 항체에 대한 면역 반응을 증강시키는데 사용된다. 아주반트는 백신의 투여 전, 투여와 조합하여, 또는 투여 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 아주반트로서 사용되는 화합물의 예는 알루미늄 화합물, 오일, 블록 중합체, 면역 자극 복합체, 비타민 및 미네랄 (예를 들어, 비타민 E, 비타민 A, 셀레늄 및 비타민 B12), 퀼(Quil) A (사포닌), 박테리아 및 진균 세포벽 구성요소 (예를 들어, 리포폴리사카라이드, 지단백질 및 당단백질), 호르몬, 시토카인 및 공동-자극 인자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 집합적으로, 예로서 및 제한 없이, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 그의 조합, 및 임의의 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간, 염소, 토끼 및 마우스 뿐만 아니라 비-포유동물 종, 예컨대 상어 이뮤노글로불린에서 면역 반응 동안 생산된 유사한 분자를 포함한 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린-유사 분자를 지칭한다. 용어 "항체"는 다른 분자에 대한 결합을 실질적으로 제외하고는 관심 분자 (또는 고도로 유사한 관심 분자 군)에 특이적으로 결합하는 무손상 이뮤노글로불린 및 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편" (예를 들어, 생물학적 샘플 중의 다른 분자에 대한 결합 상수보다 적어도 103 M-1 더 크거나, 적어도 104 M-1 더 크거나, 또는 적어도 105 M-1 더 큰 관심 분자에 대한 결합 상수를 갖는 항체 및 항체 단편)을 포함한다. 용어 "항체"는 또한, 유전적으로 조작된 형태, 예컨대 키메라 항체 (예를 들어, 인간화 뮤린 항체), 이종 접합체 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함한다. 또한, 문헌 [Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997]을 참조한다.
보다 특히, 항체는 항원의 에피토프를 특이적으로 인식하고 그에 결합하는, 적어도 경쇄 이뮤노글로불린 가변 영역 또는 중쇄 이뮤노글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 리간드를 지칭한다. 항체는 중쇄 및 경쇄로 구성되며, 그의 각각은 가변 중쇄 (VH) 영역 및 가변 경쇄 (VL) 영역이라고 하는 가변 영역을 가지고 있다. 함께, VH 영역 및 VL 영역은 항체에 의해 인식된 항원에 결합하는 것을 담당한다. 전형적으로, 이뮤노글로불린은 디술피드 결합에 의해 상호연결된 중쇄 (H)와 경쇄 (L)를 갖는다. 람다 (λ)와 카파 (κ) 2가지 유형의 경쇄가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5가지 주요 중쇄 부류 (또는 이소형)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 함유한다 (이러한 영역은 "도메인"으로서 공지되기도 함). 조합하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항원에 특이적으로 결합한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 하는 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위가 정의되어 있다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991] 참조; 본원에 참조로 포함됨). 카바트(Kabat) 데이터베이스는 현재 온라인으로 유지되고 있다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에 상대적으로 보존된다. 구성분 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역인 항체의 프레임워크 영역은 주로 β-시트 입체형태를 채택하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄간 비-공유 상호작용에 의해 CDR을 올바른 배향으로 위치설정하는 것을 제공하는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다.
본원에 사용된 바와 같은, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 또는 항원:MHC 복합체의 에피토프에 대한 결합을 주로 담당하는 항체 또는 TCR의 영역을 지칭한다. CDR은 초가변 영역으로서 지칭되기도 한다. 각각의 TCR 또는 항체 쇄의 CDR은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 지칭되며, N-말단에서 시작하여 순차적으로 번호가 매겨지며, 또한 전형적으로, 특정한 CDR이 위치하는 쇄에 의해 확인된다. 상이한 특이성 (즉, 상이한 항원에 대한 상이한 조합 부위)을 갖는 항체 및 TCR은 상이한 CDR을 갖는다. CDR 내의 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접적으로 수반된다. CDR 내의 이러한 위치는 특이성 결정 잔기 (SDR)라고 한다.
본원에 사용된 바와 같은, "항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 표적 항원은 단백질 (예를 들어, 항원성 펩티드), 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐, 또는 다른 자연적으로 발생하는 또는 합성 화합물일 수 있다. 표적 항원은 폴리펩티드 또는 펩티드 모방체일 수 있다. 항원은 또한 동물에게 투여되어 동물에서 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 또는 이러한 항원으로부터 유래된 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 복합체 내로 로딩될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 세포와 관련하여 용어 "자가"는 단리되어 동일한 대상체 (예를 들어, 수용자, 공여자 또는 숙주)로 다시 투여되는 세포를 지칭한다. "동종이계"는 비-자가 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "결합 친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원 또는 항원성 펩티드) 사이의 총 비공유 상호작용의 강도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로, 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 낮은 친화도 복합체는 일반적으로 항원으로부터 쉽게 해리되는 경향이 있는 항체를 함유하는 반면, 높은 친화도 복합체는 일반적으로 더 긴 지속기간 동안 항원에 결합된 상태로 유지되는 경향이 있는 항체를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "B 세포"는 적응 면역 체계의 체액성 면역에 있어서 특정 유형의 림프구를 지칭한다. B 세포는 주로, 항체를 만들고, 항원 제시 세포로서 작용하며, 시토카인을 방출하고, 항원 상호작용에 의한 활성화 후 기억 B 세포를 발생시키는 기능을 한다. B 세포는 세포 표면 상의 B-세포 수용체의 존재에 의해, 다른 림프구, 예컨대 T 세포와 구별된다. B 세포는 단리될 수 있거나 또는 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 B 세포주의 비-제한적인 예는 계통 AHH-1 (ATCC® CRL-8146™), BC-1 (ATCC® CRL-2230™), BC-2 (ATCC® CRL-2231™), BC-3 (ATCC® CRL-2277™), CA46 (ATCC® CRL-1648™), DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™), DS-1 (ATCC® CRL-11102™), EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85™), Z-138 (ATCC #CRL-3001), DB (ATCC CRL-2289), 톨레도(Toledo) (ATCC CRL-2631), 파이퍼(Pfiffer) (ATCC CRL-2632), SR (ATCC CRL-2262), JM-1 (ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693); NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695), 및 SUP-B15 (ATCC CRL-1929)를 포함한다. 추가 예는 역형성 큰 세포 림프종으로부터 유래된 세포주, 예를 들어, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, 카르파스(Karpas) 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU-DHL-1, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, 및 -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, 그란다(Granda) 519, USC-DHL-1, RL; 호지킨 림프종으로부터 유래된 세포주, 예를 들어, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L 428, L 540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, SU/RH-HD-l을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주에 대한 비-제한적인 예시적인 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 또는 ATCC (www.atcc.org/) 및 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동족"은 두 분자 사이의 (예를 들어, 수용체와 그의 리간드 사이의)의 상응도를 나타내는 관계를 지칭한다. TCR의 맥락에서, "동족 쌍"은 2개의 별개의 TCR 폴리펩티드, 또는 단일 T 세포로부터 유래된 폴리펩티드 (예를 들어, 단일 T 세포로부터 유래된 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 관계를 지칭한다. "동족"은 또한, TCR과 그에 특이적으로 결합하는 상응하는 항원:MHC 복합체 사이의 관계를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CRISPR"은 클러스터된 규칙적으로 공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 경로 (CRISPR)에 의존하는 서열 특이적 유전적 조작 기술을 지칭한다. CRISPR은 유전자 편집 및/또는 유전자 조절을 수행하기 위해 사용될 뿐만 아니라 단순히 특이적 게놈 위치로 단백질을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 편집은 표적 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 이러한 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결실, 삽입 또는 염기 치환의 도입을 통해 변화시키는 유전 공학의 한 유형을 지칭한다. 일부 측면에서, CRISPR-매개된 유전자 편집은 비상동 단부-연결 (NHEJ) 또는 상동 재조합의 경로를 활용하여 편집을 수행한다. 유전자 조절은 특이적 유전자 산물, 예컨대 단백질 또는 RNA의 생산을 증가 또는 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 CRISPR 복합체를 특이적 뉴클레오티드 서열, 예컨대 세포 게놈의 특이적 영역으로 표적화하는데 사용되는 가이드 RNA 서열을 지칭한다. 표적 특이성을 위한 gRNA 및 공여자 치료용 폴리뉴클레오티드를 설계하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7, Mohr, S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38, and Graham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260]). gRNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 융합 폴리뉴클레오티드; 또는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 추가로 이루어진다. 일부 측면에서, gRNA는 합성이다 (Kelley, M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "검출가능한 마커"는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 시그널을 생산할 수 있는 적어도 하나의 마커를 지칭한다. 예시적인 마커의 비-포괄적 목록은, 예를 들어, 비색법, 형광, 발광에 의해 검출가능한 시그널을 생산하는 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 발색단, 예컨대 형광성, 발광성 염료, 전자 현미경검사에 의해 검출되거나 또는 그의 전기적 특성, 예컨대 전도도, 전류측정법, 전압전류법, 임피던스에 의해 검출된 전자 밀도를 갖는 기, 검출가능한 기, 예를 들어, 그의 분자가 물리적 및/또는 화학적 특성에 있어서 검출가능한 변형을 유도하기에 충분한 크기인 것을 포함하며, 이러한 검출은 광학적 방법, 예컨대 회절, 표면 플라즈몬 공명, 표면 변동, 접촉각 변화, 또는 물리적 방법, 예컨대 원자 힘 분광법, 터널 효과 또는 방사성 분자, 예컨대 32P, 35S, 또는 125I에 의해 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "정제 마커"는 정제 또는 확인에 유용한 적어도 하나의 마커를 지칭한다. 이러한 마커의 비-포괄적 목록은 His, lacZ, GST, 말토스 결합 단백질, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, cherry, 티오레독신, 폴리(NANP), V5, Snap, HA, 키틴 결합 단백질, 소프트태그(Softag) 1, 소프트태그 3, Strep 또는 S-단백질을 포함한다. 적합한 직접 또는 간접 형광 마커는 FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, cherry, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, 비오틴, 디옥시게닌, 탐라(Tamra), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 알렉사 플루오르(Alexa fluor), FITC, TRITC 또는 임의의 다른 형광성 염료 또는 합텐을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 조성물의 "유효량" 또는 "치료상 유효량"은 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어, 치료되는 질환, 예를 들어, 암 또는 바이러스 감염과 연관된 질환 또는 의학적 병태와 연관된 증상에 있어서의 감소를 초래하는 양이다. 대상체에게 투여되는 본 기술의 조성물의 양은 질환의 유형 및 중증도 및 개체의 특징, 예컨대 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 좌우될 것이다. 또한, 질환의 정도, 중증도 및 유형에 따라 달라질 것이다. 통상의 기술자는 이들 및 다른 요인에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 기술의 조성물은 또한, 하나 이상의 부가의 치료 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량은 암 또는 바이러스 감염을 중화시키는데 있어서 부분적으로 또는 완전히 유효한 본 기술의 세포의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "에피토프"는 항체 또는 TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로, 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적으로 활성인 표면 집단으로 이루어지고, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 가지고 있다. 입체형태적 에피토프 및 비입체형태적 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 손실되지만 후자의 경우에는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본원에 사용된 바와 같은, "발현"은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 유전자의 전구체 mRNA로의 전사; 성숙 mRNA를 생산하기 위한 전구체 mRNA의 스플라이싱 및 다른 프로세싱; mRNA 안정성; 성숙 mRNA의 단백질로의 번역 (코돈 활용 및 tRNA 가용성 포함); 및 적당한 발현 및 기능에 필요한 경우, 번역 산물의 글리코실화 및/또는 다른 변형.
본원에 사용된 바와 같은, "상승된 발현"은 대조군 또는 참조 샘플과 비교 시 유전자 발현 또는 단백질 발현 상의 증가를 지칭한다 (예를 들어, 대조군 또는 정상적인 참조 샘플과 비교 시, 적어도 2배, 약 2배 내지 약 150배, 5배 내지 150배, 5배 내지 100배, 10배 내지 150배, 10배 내지 100배, 50배 내지 150배, 50배 내지 100배, 75배 내지 150배, 또는 75배 내지 100배의 증가). "감소된 발현"은 대조군 또는 참조 샘플과 비교 시, 유전자 발현 또는 단백질 발현에 있어서의 전반적인 감소를 지칭한다 (예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 감소). 유전자 발현 또는 단백질 발현 상의 증가 또는 감소는 관련 기술분야에 공지되거나 또는 본원에 기재된 임의의 유용한 방법 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 결정될 수 있다. 치료적 적용의 경우, "감소"시키는 것은 장애 (예를 들어, 타우병증, TBI 또는 뇌졸중)와 연관된 폴리펩티드 또는 단백질의 수준 상의 감소를 지칭할 수 있다. 진단 또는 모니터링 적용의 경우, "감소"시키는 것은 진단 또는 모니터링 검정에 의해 검출된 단백질 또는 핵산의 수준 상의 감소를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자"는 프로모터, 엑손, 인트론, 및 발현을 제어하는 다른 비-번역된 영역을 포함한, RNA 산물의 조절된 생합성에 대한 모든 정보를 함유하는 DNA의 세그먼트를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인간화" 형태의 비-인간 단백질 (예를 들어, 뮤린 TCR)은 단백질의 비-인간 상동체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 단백질이다. 대부분의 경우, 인간화 단백질은 수용자의 가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 생산 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 TCR), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류로부터의 가변 영역 잔기로 대체된 인간 TCR이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 사용될 때, 하기에 설명된 디폴트 파라미터가 있는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, NCBI 웹 사이트)에 의해 측정된 바와 같이, 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위 서열, 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율 [즉, 비교 창 또는 지정된 영역 전반에 걸친 최대 상응도를 위해 비교 및 정렬된 경우, 명시된 영역 (예를 들어, 본원에 기재된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열) 전반에 걸쳐 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성]을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 이어서, 이러한 서열은 "실질적으로 동일하다"고 한다. 이러한 용어는 또한, 시험 서열의 보체를 지칭하거나 또는 이러한 보체에 적용할 수 있다. 상기 용어는 또한, 결실 및/또는 부가를 갖는 서열 뿐만 아니라 치환을 갖는 서열도 포함한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 또는 50 내지 100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역 전반에 걸쳐 존재한다.
"코작 컨센서스 서열" 또는 "코작 서열"은 번역 출발 부위로서 리보솜에 의해 인식되는 mRNA 서열이다. 코작 서열은 번역의 개시를 위한 출발 코돈 (개시 코돈으로서 공지되기도 함) 및 부가의 플랭킹 뉴클레오티드를 포함한다. 출발 코돈은 번역된 폴리펩티드의 N-말단에 메티오닌 아미노산을 명시한다. 척추동물에 대한 코작 컨센서스 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Kozak, M. 1987 Nucleic Acids Res. 15(20): 8125-48]). 일부 실시양태에서, 코작 서열은 "강하게" 변형될 수 있는데, 이는 뉴클레오티드 서열이 번호 1 뉴클레오티드와 비교하여 특히 뉴클레오티드 +4 및 -3에서 컨센서스 서열과 밀접하게 매칭된다는 것을 의미한다. "적절한" 코작 서열은 이들 매칭 뉴클레오티드 중 단지 하나를 갖는 반면, "약한" 코작 서열은 매칭 뉴클레오티드를 전혀 갖지 않는다. 코작 서열의 강도는 발현된 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드의 양과 직접적인 상관이 있다. 일반적으로, 강한 코작 서열은 발현된 mRNA의 번역 효율을 높이는 반면, 약한 코작 서열의 경우에는 mRNA로부터 더 적은 수의 폴리펩티드가 전사된다.
본원에 사용된 바와 같은, "주요 조직적합성 복합체" 또는 "MHC"는 T 세포에 항원을 제시하는 세포 표면 단백질을 지칭한다. 클래스 I MHC 분자는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. 클래스 II MHC 분자는 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 항원 또는 그의 에피토프가 로딩된 MHC 분자가 항원:MHC 복합체로서 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같은, 자연 살해 세포로서 공지되기도 한 용어 "NK 세포"는 골수에서 유래하고 선천 면역 체계에서 중요한 역할을 하는 특정 유형의 림프구를 지칭한다. NK 세포는 세포 표면 상의 항체 및 주요 조직적합성 복합체의 부재 하에서도, 바이러스에 감염된 세포, 종양 세포 또는 다른 스트레스 받은 세포에 대항하여 신속한 면역 반응을 제공한다. NK 세포는 단리될 수 있거나 또는 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 상업적 NK 세포주의 비-제한적인 예는 계통 NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)를 포함한다. 추가 예는 NK 계통 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, 및 YT를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주에 대한 비-제한적인 예시적인 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 또는 ATCC (http://www.atcc.org/) 및 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스 (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동가능하게 연결된"은 동일한 핵산 분자의 일부로서 연결되는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이와 같이 연결된 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 제어 요소로부터 개시될 전사를 위해 적합하게 위치설정되고 배향된다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소 (예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 전사는 발현 제어 요소에 의해 제어, 조절 또는 영향을 받는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균 화합물, 등장성 및 흡수 지연 화합물 등을 포함하는 것으로 의도된다. 제약상 허용되는 담체 및 그의 제형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 비변형된 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 RNA 또는 DNA를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는, 제한 없이, 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일-가닥 및 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 및 단일-가닥 또는 보다 전형적으로 이중-가닥 또는 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한, 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 중합체, 즉 펩티드 동배체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 통상적으로 펩티드, 글리코펩티드 또는 올리고머로서 지칭되는 짧은 쇄와, 일반적으로 단백질로서 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. 폴리펩티드는 20개 유전자-코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 자연적 프로세스, 예컨대 번역 후 프로세싱에 의해, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 방대한 연구 문헌 뿐만 아니라 기본 텍스트와 더 자세한 논문에 잘 기재되어 있다.
폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 세포는 물리적, 기계적 또는 화학적 방법을 이용하여 다른 세포 또는 세포 구성분으로부터 이러한 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 세포를 제거한 경우에 "단리"되었거나 또는 "실질적으로 순수한" 것이라 할 수 있다. 단리된 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 세포 (예를 들어, 단리된 세포), "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 순수하고 단리된" 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 세포는 전형적으로, 그와 자연적으로 연합되는 단백질 및 자연적으로 발생하는 유기 분자가 적어도 60 중량% 없을 때, 세포 구성분으로부터 제거되었고 실질적으로 순수한 것으로 간주된다. 폴리펩티드는 적어도 75 중량%, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 또는 99 중량% 순수할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 세포 (예를 들어, 실질적으로 순수한 항체 또는 그의 단편)는 표준 기술에 의해, 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해, 또는 폴리펩티드를 화학적으로 합성함으로써 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 예를 들어, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은 이러한 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었다는 것, 또는 그 물질이 그렇게 변형된 세포로부터 유래된다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 그렇지 않으면 비정상적으로 발현되거나, 과소 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "별도의" 치료적 사용은 적어도 2가지 활성 성분을 상이한 경로에 의해 동시에 또는 실질적으로 동시에 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "반복" 치료적 사용은 상이한 시간에 활성 성분의 투여를 지칭하며, 투여 경로는 동일하거나 상이하다. 보다 특히, 순차적 사용은 동일하거나 상이한 활성 성분의 제2 투여가 시작되기 전에 활성 성분의 전체 투여를 지칭한다. 따라서, 제2 투여 전 수 분, 수 시간, 수 일, 수 개월 또는 수 년에 걸쳐 활성 성분 중 하나를 투여하는 것이 가능하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용되며, 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들어, 가축 (예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등), 야생 동물 (박쥐, 너구리, 여우, 스컹크, 다람쥐, 얼룩 다람쥐, 마우스, 토끼 등) 및 실험실 동물 (예를 들어 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니 피그 등)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 특정한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "스위치"는 재조합 TCR 또는 재조합 TCR의 구성요소의 발현, 활성화 또는 안정성을 제어하는 메카니즘 (즉, TCR을 "켜거나" 또는 "끄는" 메카니즘)을 지칭한다. 스위치 메카니즘은 활성화될 둘 이상의 구축물의 공동-발현을 필요로 하는 TCR 발현 시스템, 자살 스위치, 안전 스위치, 및 활성화를 위해 다중체화를 필요로 하는 TCR을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 스위치는 유도가능하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포"는 흉선에서 성숙하는 특정 유형의 림프구를 지칭한다. T 세포는 세포-매개된 면역에서 중요한 역할을 하며, 세포 표면 상에서의 T-세포 수용체의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대 B 세포와 구별된다. T-세포는 단리될 수 있거나 또는 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. "T 세포"는 T-헬퍼 세포 (CD4+ 세포), 세포독성 T-세포 (CD8+ 세포), 자연 살해 T-세포, T-조절 세포 (Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함한, CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다. "세포독성 세포"는 CD8+ T 세포, 자연 살해 (NK) 세포 및 호중구를 포함하며, 이들 세포는 세포독성 반응을 매개할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 T-세포주의 비-제한적인 예는 계통 BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™), 네오 Jurkat (ATCC® CRL-2898™), TALL-104 세포독성 인간 T 세포주 (ATCC # CRL-11386)를 포함한다. 추가 예는 성숙 T-세포주, 예를 들어, 예컨대 데글리스(Deglis), EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, 카르파스 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 및 T34; 및 미성숙 T-세포주, 예를 들어, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, Jurkat, 카르파스 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, 로우시(Loucy), MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/이치카와(Ichikawa), 피어(Peer), PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 내지 T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3, 및 -4, CCRF-HSB-2 (CCL-120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL-1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4;11 (ATCC CRL-1873), CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119); 및 피부 T-세포 림프종 계통, 예를 들어, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. REH, NALL-1, KM-3, L92-221을 포함하나 이에 제한되지는 않는 아무 가치없는 (Null) 백혈병 세포주는 다른 백혈병 및 림프종, 예컨대 K562 적백혈병, THP-1 단핵구성 백혈병, U937 림프종, HEL 적백혈병, HL60 백혈병, HMC-1 백혈병, KG-1 백혈병, U266 골수종으로부터 유래된 세포주와 같이, 면역 세포의 또 다른 상업적으로 이용가능한 공급원이다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주에 대한 비-제한적인 예시적인 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 또는 ATCC (http://www.atcc.org/) 및 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스 (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 시그널 변환을 매개하는데 수반되는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연합되는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 이종이량체성 세포 표면 단백질을 지칭한다. TCR은 2개의 동족 단백질 쇄: 알파 (α) 쇄와 베타 (β) 쇄 [각각 TRA (엔트레즈 유전자: 6955) 및 TRB 유전자 (엔트레즈 유전자: 6957)에 의해 코딩됨], 또는 감마 (γ) 쇄와 델타 (δ) 쇄 [각각 TRG (엔트레즈 유전자: 6965) 및 TRD 유전자 (엔트레즈 유전자: 6964)에 의해 코딩됨]로 구성된다. 각각의 쇄는 2가지 세포외 도메인, 즉 가변 (V) 영역 및 불변 (C) 영역으로 구성된다. 불변 영역은 세포막에 근접하고, 이어서 막횡단 영역과 짧은 세포질 꼬리가 뒤따르는 반면, 가변 영역은 항원:MHC 복합체에 결합한다. TCR α-쇄와 β-쇄 둘 다의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 가지고 있다. 또한 β-쇄 (HV4) 상에는 정상적으로 항원과 접촉하지 않으므로 CDR로 간주되지 않는 부가의 초가변성 영역이 있다. CDR3은 프로세싱된 항원을 인식하는 것을 담당하는 주요 CDR이지만, 알파 쇄의 CDR1은 또한, 항원성 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용하는 것으로 밝혀진 반면, β-쇄의 CDR1은 상기 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용한다. CDR2는 MHC를 인식하는 것으로 여겨진다. β-쇄의 CDR4는 항원 인식에 참여하는 것으로 생각되지 않지만, 초항원과 상호작용하는 것으로 나타났다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 두 쇄 사이에 링크를 형성하는 디술피드 결합을 형성하는 짧은 연결 서열로 이루어진다.
대상체에서 TCR의 다양한 레퍼토리는 가변 (V), 연결 (J) 및 다양성 (D) 유전자 세그먼트를 재배열하는 체세포 재조합 메카니즘인 V(D)J 재조합에 의해 달성된다. 인간에서, TRA 유전자 자리는 54개의 TRAV (V) 세그먼트, 61개의 TRAJ (J) 세그먼트 및 독특한 불변 TRAC (C) 세그먼트를 포함한다. TRB 유전자 자리는 64-67개의 TRBV (V) 세그먼트, 2개의 TRBD (D) 세그먼트, 14개의 TRBJ (J) 세그먼트 및 2개의 TRBC (C) 세그먼트를 포함한다. TRG 유전자 자리는 12-15개의 TRGV (V) 세그먼트, 5개의 TRGJ (J) 세그먼트, 및 2개의 TRGC (C) 세그먼트를 포함한다. TRD 유전자 자리는 TRA 유전자 자리에 포매되고, 8개의 TRDV 또는 TRAV/DV (V) 세그먼트, 3개의 TRDD (D) 세그먼트, 4개의 TRDJ (J) 세그먼트, 및 1개의 TRDC (C) 세그먼트를 함유한다. TCR 아미노산 서열의 비-제한적인 예는 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원에 제공된다.
인간 TCR (α) 쇄 TRAC 세그먼트:
Figure pct00001
인간 TCR (β) 쇄 TRBC1 세그먼트:
Figure pct00002
인간 TCR (β) 쇄 TRBC2 세그먼트:
Figure pct00003
인간 TCR (γ) 쇄 TRGC1 세그먼트:
Figure pct00004
인간 TCR (γ) 쇄 TRGC2 세그먼트:
Figure pct00005
인간 TCR (δ) 쇄 TRDC 세그먼트:
Figure pct00006
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료제"는 유효량으로 존재할 때, 그를 필요로 하는 대상체에 대해 원하는 치료 효과를 생성하는 핵산, 재조합 TCR, 벡터, 세포 또는 세포 집단을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 기재된 TCR의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, TCR의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. TCR의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 TCR 핵산에 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은, 예를 들어, TCR의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 수득된 TCR이 원하는 특성을 보유하는 한, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 관심 TCR을 수득하기 위해 만들어진다. 변형은 또한, 단백질의 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 치환 돌연변이 유발에 가장 큰 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 고려된다. "보존적 치환"이 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
본원에 사용된 바와 같은, "특이적으로 결합한다"는 또 다른 분자 (예를 들어, 항원:MHC 복합체)를 인식하고 그에 결합하지만, 다른 분자를 실질적으로 인식하지 않고 그에 결합하지 않는 분자 (예를 들어, TCR)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 특정한 분자 (예를 들어, 특정한 세포, 항원, 에피토프 또는 항원:MHC 복합체)에 대한 "특이적 결합", 그 분자에 "특이적으로 결합하는" 또는 상기 분자에 "특이적"인 것은, 예를 들어, 그에 결합하는 분자에 대한 Kd가 적어도 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 또는 그 초과인 분자로 나타낼 수 있다. 용어 "특이적으로 결합하는" 것은 또한, 분자 (예를 들어, TCR)가 임의의 다른 세포, 항원, 에피토프, 또는 항원:MHC 복합체에 실질적으로 결합하지 않으면서, 특정한 세포, 항원, 에피토프, 또는 항원:MHC 복합체에 결합하는 결합을 지칭할 수 있다. 예를 들어, TCR은, 예를 들어, 또 다른 항원:MHC 복합체에 대한 것보다 하나의 항원:MHC 복합체에 대한 적어도 10배 내지 100배 더 큰 친화도 (예를 들어, 101배, 102배, 103배, 104배, 105배, 106배, 107배, 108배, 109배, 또는 1010배 더 큰 친화도)를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드, 파지, BAC, YAC 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 상이한 숙주 사이의 전달을 위해 설계된 핵산 구축물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드 벡터는 상업적으로 이용가능한 벡터로부터 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라 바큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 등으로부터 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 유전자와 같은 코딩 서열의 발현을 조절하는 임의의 서열을 지칭한다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적, 유도성, 억제성 또는 조직-특이적일 수 있다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 폴리뉴클레오티드 서열의 영역인 제어 서열이다. RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같이 조절 단백질 및 분자에 결합할 수 있는 유전적 요소를 함유할 수 있다. 프로모터의 비-제한적인 예는 p2A, CMV 및 E1α를 포함한다.
재조합 세포의 생산에 적용되는 바와 같은 용어 "형질도입하다" 또는 "형질도입"은 외래 뉴클레오티드 서열이 세포 내로 도입되는 프로세스를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 형질도입은 벡터를 통해 수행된다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대 인간에서 본원에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 포괄하고, (i) 질환 또는 장애를 억제하는 것, 즉 그의 발생을 저지하는 것; (ii) 질환 또는 장애를 완화하는 것, 즉 장애의 퇴행을 유발하는 것; (iii) 장애의 진행을 느리게 하는 것; 및/또는 (iv) 질환 또는 장애의 한 가지 이상의 증상의 진행을 억제, 완화 또는 느리게 하는 것을 포함한다. "암을 치료하는"은 암 또는 암 세포가, 예를 들어, 경감, 감소, 치유 또는 관해 상태에 있는 것을 의미한다. "바이러스 감염을 치료하는"은 바이러스 또는 바이러스 로드가, 예를 들어, 경감, 감소, 치유 또는 관해 상태에 있는 것을 의미한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 암 및 바이러스 감염의 다양한 치료 방식은 전체 치료를 포함하지만 전체 치료보다 덜한 "실질적인" 것을 의미하는 것으로 의도되며, 일부 생물학적으로 또는 의학적으로 관련된 결과, 예컨대 대상체의 수명 연장이 달성된다는 것을 인지해야 한다. 치료는 재발을 방지하기 위한 지속적인 장기 치료, 또는 급성 치료를 위한 몇 번의 투여일 수 있다.
I. 본 기술의 조성물
한 측면에서, 본 기술은 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 라이브러리 벡터로서, (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내에 존재하는 단일 용해된 T 세포로부터 단리된 mRNA로부터 유래되는 것인 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 mRNA 포획 시약 또는 역전사-PCR (RT-PCR)을 사용하여 단리된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 구획 내부에 단리된다.
용어 "벡터"는 비-분열 및/또는 서서히 분열하는 세포를 감염 및 형질도입할 수 있고 표적 세포의 게놈으로 통합할 수 있는 능력을 보유하는 재조합 벡터를 의도한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 야생형 바이러스로부터 유래되거나 또는 그에 근거한다. 추가 실시양태에서, 벡터는 야생형 야생형 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스로부터 유래되거나 또는 그에 근거한다. 이러한 것의 예는, 제한 없이, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 T-림프친화성 바이러스 유형 1 (HTLV-1), 인간 T-림프친화성 바이러스 유형 2 (HTLV-2), 인간 아데노바이러스 (HadV-1 내지 57), 아데노-연관 바이러스 (AAV), 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV), 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 및 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)를 포함한다. 본 개시내용에 따른 바이러스 벡터는 특정한 바이러스의 구성요소에 국한될 필요가 없다는 것이 명백할 것이다. 바이러스 벡터는 2가지 이상의 상이한 바이러스로부터 유래된 구성요소를 포함할 수 있고 합성 구성요소를 또한 포함할 수 있다.
상기 벡터의 특정 실시양태에서, 벡터 백본은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 벡터 백본으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 벡터 백본의 게놈은 그로부터 원래 유래된 바이러스로부터의 구성요소를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 벡터 백본은 역전사 및 통합 시스템을 포함한, RNA 게놈과 상용성인 필수 벡터 구성요소를 함유한다. 일부 실시양태에서, 이들은 특정한 레트로바이러스로부터 유래된 gag 및 pol 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 백본의 구조적 구성요소는 원하는 유용한 특성을 제공하도록 유전적으로 또는 다른 방식으로 변경되었다. 예를 들어, 벡터 숙주 범위 및 표적 세포 유형은 벡터 생산 시스템에서 상이한 env 유전자를 사용하여 벡터에 상이한 표적 특이성을 제공함으로써 변경할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 벡터 백본은 렌티바이러스 벡터 백본, 예를 들어, pLVX이다. 렌티바이러스 벡터는 온코레트로바이러스 (MLV를 함유하는 레트로바이러스의 하위군) 및 렌티바이러스 (HIV를 함유하는 레트로바이러스의 하위군)에 근거하거나 또는 그로부터 유래된다. 비-제한적인 예는 ASLV, SNV 및 RSV를 포함하며, 이들 모두는 렌티바이러스 벡터 입자 생산 시스템을 위한 패키징 및 벡터 구성요소로 분할되었다. 본 개시내용에 따른 렌티바이러스 벡터 입자는 특정한 레트로바이러스의 유전적으로 또는 달리 (예를 들어, 패키징 세포 시스템의 특이적 선택에 의해) 변경된 버전에 근거할 수 있다.
비-제한적인, 예시적인 벡터 백본은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,924,123; 7,056,699; 7,07,993; 7,419,829 및 7,442,551 (본원에 참조로 포함됨)을 참조할 수 있고, 실험실에서 생성되었고 시티 오브 호프 리서치 인스티튜트(City of Hope Research Institute)에 의해 사용되는, 인비트로젠(Invitrogen)의 pLenti 시리즈 버전 4, 6, 및 6.2 "비라파워(ViraPower)" 시스템, pHIV-7-GFP; 클론테크(Clontech)에 의해 제조된 "Lenti-X" 렌티바이러스 벡터, pLVX; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에 의해 제조된 pLKO.1-puro; 오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems)에 의해 제조된 pLemiR; 및 실험실에서 생성되고 샤리테 의대 바이러스학 연구소 (CBF) (독일 베를린)에 의해 사용된 pLV이 있다.
특정 레트로바이러스 서열은 표적 세포 게놈으로의 통합을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,924,123 참조). 각각의 레트로바이러스 게놈은 비리온 단백질 및 효소를 코딩하는 gag, pol 및 env라고 하는 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 긴 말단 반복부 (LTR)라고 하는 영역에 의해 양쪽 단부에서 플랭킹된다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사를 담당한다. 그들은 또한, 바이러스 유전자의 발현을 제어할 수 있는 인핸서-프로모터 서열로서 작용한다. 레트로바이러스 게놈의 캡시드로 둘러싸기는 바이러스 게놈의 5' 단부에 위치한 psi 서열을 통해 발생한다. LTR 자체는 U3, R 및 U5라고 하는 3가지 요소로 나뉠 수 있는 동일한 서열이다. U3는 RNA의 3' 단부에 독특한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양쪽 단부에서 반복되는 서열로부터 유래되고, U5는 RNA의 5' 단부에 독특한 서열로부터 유래된다. 3가지 요소의 크기는 상이한 레트로바이러스 중에서 상당히 다양할 수 있다. U3은 프로바이러스의 대부분의 발현 제어 요소를 함유하며, 이는 프로모터, 및 세포성 및 일부 경우에 바이러스 전사 활성화제 단백질에 반응하는 다수의 인핸서 서열을 포함한다.
구조적 유전자 gag, pol 및 env 자체와 관련하여, gag는 바이러스의 내부 구조 단백질을 코딩한다. gag 단백질은 성숙 단백질 MA (매트릭스), CA (캡시드) 및 NC (뉴클레오캡시드)로 단백질분해적으로 프로세싱된다. pol 유전자는 DNA 폴리머라제, 연관된 RNase H, 및 게놈의 복제를 매개하는 인테그라제 (IN)를 함유하는 역전사 효소 (RT)를 코딩한다.
바이러스 입자는 숙주 세포에서 그를 코딩하는 DNA 구축물로부터의 벡터 RNA 게놈을 발현함으로써 생산된다. 일부 실시양태에서, 벡터 백본에 의해 코딩되지 않은 바이러스 입자의 구성요소는 숙주 세포에서 발현된 부가의 핵산 서열 (통상적으로 gag/pol 및 env 유전자 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 "패키징 시스템")에 의해 트랜스로 제공된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 입자의 생산에 필요한 서열 세트는 일시적 형질감염에 의해 숙주 세포에 도입되거나, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합되거나, 또는 패키징 세포주의 사용을 통해 제공된다. 수반되는 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 유도 방법 또는 프로세스는 관련 기술분야에 공지된 다른 벡터 및 방법과 뚜렷이 구별되는 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드에서의 구조적 특징을 초래한다. 예를 들어, 용해된 T 세포를 위한 개별 구획과 함께 mRNA 포획 시약을 사용하면, TCR 폴리뉴클레오티드의 동족 쌍을 포획할 수 있다. 구조적 특징의 다른 비-제한적인 예는 제한 효소 인식 부위, 통합된 프라이머 부위, 및 mRNA 포획 시약으로부터 유래된 서열을 포함한다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, mRNA 포획 시약은 폴리(dT) 코팅된 비드, 올리고뉴클레오티드-코팅된 비드, 히드로겔 비드, 및 마이크로어레이 웰의 표면 상의 프린팅된 올리고로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, mRNA 포획제는 고정화된 올리고뉴클레오티드 또는 중합체 네트워크, 예컨대 덱스트란 및 아가로스를 포함하는 고체 지지체, 예컨대 비드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 실리카 비드 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, mRNA 포획제는 mRNA를 혼성화시키는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 이러한 올리고뉴클레오티드는 관심 전사체에 특이적인 적어도 하나의 폴리(T) 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, mRNA 포획 시약의 비드는 단리되는 개별 세포 (예를 들어, T 세포)보다 더 작다. 일부 실시양태에서, mRNA 포획제로 단일 T 세포를 격리시키는 것은 T 세포의 용해 전에 수행된다. 다른 실시양태에서, mRNA 포획제로 단일 T 세포를 격리시키는 것은 T 세포 용해와 공동으로 수행된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단일 T 세포 및 mRNA 포획제는 세포 용해 용액의 존재 하에 에멀젼에서 개별 미세소포로 단리된다.
일부 실시양태에서, 개별 구획은 100 nL 이하, 50 nL 이하, 40 nL 이하, 30 nL 이하, 20 nL 이하, 10 nL 이하, 5 nL 이하의 용적을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 개별 구획은 5 nL 이하의 용적을 갖는다. 일부 실시양태에서, 개별 구획은 임의적으로 에멀젼 중의 액적 또는 미세소포이다. 일부 실시양태에서, 구획은 웰이다. 특정 실시양태에서, 웰은 프린팅된 중합체 슬라이드, 플라스틱 플레이트, 미세역가 플레이트 또는 겔에 위치한다. 일부 실시양태에서, 웰은 T 세포의 용해 전 또는 RT-PCR을 수행하기 전에 투과성 막으로 밀봉된다. 본원에 기재된 바와 같은 구획화된 제제는 라이브러리의 특징규명을 가능하게 하고 최종 의약품에 포함될 수 있는 PCR 오류 변이체의 가능성을 최소화한다. 이것은 최종 치료용 세포 조성물이 부작용 및/또는 표적을 벗어난 TCR 결합 특이성을 유발할 수 있는, 특징규명할 수 없고 잠재적으로 매우 위험한 변이체를 함유할 위험을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 cDNA로 역전사된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 역전사는 중첩 연장 (OE) 역전사 PCR (RT-PCR)을 사용하여 수행된다. OE-RT-PCR을 위한 반응 혼합물은 함께 공유적으로 연결된 2개 이상의 관심 전사체의 cDNA를 포함하는 단일 PCR 산물을 창출하도록 설계된 프라이머를 포함한다. OE-RT-PCR을 위한 프라이머 설계는 주어진 세포에 의해 발현된 관심 전사체 (예를 들어, TCR 유전자 전사체)가 함께 연결되어 있는지를 결정한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 동족 쌍 TCR 쇄 전사체로부터의 각각의 cDNA가 함께 공유적으로 연결되도록 프라이머가 설계된다. OE-RT-PCR 반응 조건의 비-제한적인 예는 본원의 표 3에 제공된다. 연결된 TCR cDNA를 수득하기 위한 반응을 수행하는데 적합한 PCR 프라이머의 비-제한적인 예는 본원의 표 4에 제공된다. OE RT-PCR의 연결된 cDNA 산물은 회수되고, 이는 상기 연결된 관심 전사체를 증폭시키는 네스티드 PCR에 대한 주형으로서 사용된다. 네스티드 PCR에 대한 예시적인 반응 조건은 본원의 표 5에 제공된다. 일부 실시양태에서, 네스티드 PCR의 정제된 생성물이 시퀀싱되고 쌍형성 정보가 분석된다. 일부 실시양태에서, 제한 및 라이게이션은 다수의 관심 전사체의 cDNA를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합은 다수의 관심 전사체의 cDNA를 연결하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, TCRα 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRAV 세그먼트 및 TRAC 세그먼트 또는 그의 각각의 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRα 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRAV 세그먼트, TRAC 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRAD 세그먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRα 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRAV 세그먼트, TRAC 세그먼트, 적어도 하나의 TRAD 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRAJ 세그먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRα 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRAV 세그먼트, TRAC 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRAJ 세그먼트를 포함한다.
일부 실시양태에서, TCRβ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRBV 세그먼트 및 TRBC 세그먼트 또는 그의 각각의 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRβ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRBV 세그먼트, 적어도 하나의 TRBC 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRBD 세그먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRβ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRBV 세그먼트, 적어도 하나의 TRBC 세그먼트, 적어도 하나의 TRBD 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRBJ 세그먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRβ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRBV 세그먼트, 적어도 하나의 TRBC 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRBJ 세그먼트를 포함한다.
일부 실시양태에서, TCRγ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRGV 세그먼트 및 TRGC 세그먼트 또는 그의 각각의 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRγ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRGV 세그먼트, 적어도 하나의 TRGC 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRGD 세그먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRγ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRGV 세그먼트, 적어도 하나의 TRGC 세그먼트, 적어도 하나의 TRGD 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRGJ 세그먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRγ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRGV 세그먼트, 적어도 하나의 TRGC 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRGJ 세그먼트를 포함한다.
일부 실시양태에서, TCRδ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRDV 세그먼트 및 TRDC 세그먼트 또는 그의 각각의 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRδ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRDV 세그먼트, 적어도 하나의 TRDC 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRDD 세그먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRδ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRDV 세그먼트, 적어도 하나의 TRDC 세그먼트, 적어도 하나의 TRDD 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRDJ 세그먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCRδ 폴리펩티드는 적어도 하나의 TRDV 세그먼트, 적어도 하나의 TRDC 세그먼트, 및 적어도 하나의 TRDJ 세그먼트를 포함한다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 임의적으로 링커 폴리뉴클레오티드를 통해 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드는 링커 폴리펩티드를 코딩한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "링커 폴리펩티드"는 1 내지 10회, 또는 대안적으로 약 8회, 또는 대안적으로 약 6회, 또는 대안적으로 약 5회, 또는 4회 또는 대안적으로 3회, 또는 대안적으로 2회 반복될 수 있는 1 내지 10개, 또는 대안적으로, 8개의 아미노산, 또는 대안적으로 6개의 아미노산, 또는 대안적으로 5개의 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 링커는 3회 반복된 펜타펩티드로 이루어진 15개 이하의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 링커 서열은 gly-gly-gly-gly-ser (SEQ ID NO: 9)의 3개 카피, 또는 그의 등가물을 포함하는 (글리신4세린)3 (SEQ ID NO: 8) 가요성 폴리펩티드 링커이다. 링커 서열의 비-제한적인 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) (및 그의 등가물); 트리펩티드 EFM; 또는 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met (SEQ ID NO: 11), 및 그의 각각의 등가물이다. 상기 벡터의 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 포획된 T 세포 mRNA의 역전사 및 PCR 증폭에 의해 작동가능하게 연결되었다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 TCR 유전자에서 천연적으로 발견되는 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위에서 절단되는 제한 효소를 사용하여 벡터 백본에 연결되고/거나 클로닝되었다. 특정 실시양태에서, 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위는 낮은 빈도로 TCR 유전자에서 발생한다. "낮은 빈도"는 TCR 유전자에서 20회 미만, 15회 미만, 10회 미만, 5회 미만 또는 2회 미만 발생하는 부위를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위는 발현된 TCR 폴리펩티드 서열을 변경시키지 않는 침묵 돌연변이를 포함한다. 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위의 비-제한적인 예는 본원의 표 6 및 7에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드는 표 6 또는 표 7에 개시된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 5개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위를 혼입하도록 변경되었다.
상기 벡터의 특정 실시양태에서, 벡터는 발현 제어 요소를 코딩하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "발현 제어 요소"는 폴리뉴클레오티드의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 용이하게 하거나, 촉진시키거나, 조절하거나 또는 이에 영향을 주는 폴리뉴클레오티드를 의도한다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 폴리뉴클레오티드의 발현을 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유지시킨다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증강시킨다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 폴리뉴클레오티드의 전사체를 안정화시킨다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제한다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소의 활성은 유도가능하다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드에 대해 상류 (5')에 있다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드에 대해 하류 (3')에 있다. 특정 실시양태에서, 발현 제어 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 요소는 프로모터, p2A 서열, 인핸서, 및 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
p2A 서열은 동일한 mRNA로부터 등몰 수준의 다수의 유전자를 생산하는 짧은 펩티드 (약 20개 아미노산)이다. 펩티드는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 건너 뛰게 하여, 2A 서열의 단부와 그 다음 펩티드 하류 사이의 분리를 초래함으로써 기능하는 것으로 생각된다. 이로써 초래되는 "절단"은 C-말단 상에 발견되는 글리신 잔기와 프롤린 잔기 사이에서 발생되는데, 이것은 상류 시스트론이 그 단부에 부가된 몇 개의 부가의 잔기를 가질 것이지만, 하류 시스트론은 프롤린으로 시작될 것이라는 것을 의미한다. 특정한 실시양태에서, p2A 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00009
프로모터는 폴리뉴클레오티드의 조절된 전사를 위한 제어점을 제공하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV, EF1a, SV40, PGK1, UBC, MNDU3, 인간 베타 액틴, CAG, TRE, UAS, Ac5, 폴리헤드린, CaMKIIa, GAL1, GAL10, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, 및 U6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 CMV 프로모터이다.
내부 리보솜 진입 부위는 단백질 합성의 더 큰 프로세스의 일부로서, cap-독립적 방식으로 번역 개시를 허용하는 RNA 요소이다. 진핵 번역에서, 개시 복합체의 어셈블리를 위해 5' cap 인식이 필요하기 때문에, 개시는 전형적으로 mRNA 분자의 5' 말단에서 발생한다. IRES 요소에 대한 위치는 종종 5'UTR에 있지만, mRNA 내의 다른 곳에서도 발생할 수 있다. 특정 실시양태에서, IRES는 FMDV 또는 EMCV IRES 서열이다. IRES 서열 (EMCV)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예가 본원에 제공된다:
Figure pct00010
인핸서는 특정한 표적 폴리뉴클레오티드의 전사가 발생할 가능성을 증가시키기 위해 단백질 (예를 들어, 전사 인자)에 의해 결합될 수 있는 DNA 영역이다. 인핸서는 시스 작용성이다. 일부 실시양태에서, 이들은 50 내지 1500개의 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, 이들은 표적 폴리뉴클레오티드 상류, 하류, 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 인핸서는 CENTG2, GADD45G 및 WPRE 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 인핸서는 전사될 때 발현을 증강시키는 3차 구조를 창출하는 DNA 서열인 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE)이다. WPRE는 감마, 알파 및 베타 구성요소를 수반한 삼자 조절 요소이다. 일부 실시양태에서, 인핸서는 WPRE의 알파 구성요소만을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인핸서는 완전한 삼자 WPRE 서열을 포함한다. 감마 및 베타 WPRE 구성요소 없이 단독으로 사용되는 경우, 알파 구성요소는 완전한 삼자 WPRE만큼의 활성 상태가 9%에 불과하다.
WPRE 알파 서열:
Figure pct00011
완전한 삼자 WPRE 서열:
Figure pct00012
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 벡터는 원형화된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 발현 제어 요소의 벡터 내로의 혼입 전에 원형화되었다. 다른 실시양태에서, 벡터는 발현 제어 요소의 벡터 내로의 혼입 후에 원형화되었다.
상기 벡터의 특정 실시양태에서, 발현 제어 요소는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 근처에 혼입되었다. 이들 실시양태에서, 발현 제어 요소는 CRISPR/Cas 매개된 메카니즘을 통해 벡터 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, 발현 제어 요소는 제한 효소 또는 TALEN으로부터 선택된 DNA-변형 효소를 사용하여 벡터 내로 혼입되었다.
특정 실시양태에서, 벡터는 표적 세포 또는 숙주 세포로의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 통합을 용이하게 하기 위해 트랜스포손을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 트랜스포손을 수용자 DNA 서열 내의 TA 디뉴클레오티드 염기 쌍에 삽입시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 플랭킹하는 트랜스포손은 TA 디뉴클레오티드에서 재조합 세포 게놈 또는 면역 세포 게놈으로의 통합을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 벡터 백본은 비-바이러스 벡터로부터 유래되거나 또는 그를 포함한다. 비-바이러스 벡터의 장점은 전체 환자 집단을 충족시키는데 필요한 충분한 양을 생산하는 용이성과 비교적 낮은 비용, 저장 동안의 안정성 및 면역원성의 결여를 포함한다. 본 기술의 벡터에 사용하기 적합한 트랜스포손 시스템의 비-제한적인 예는 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템이다 (예를 들어, 문헌 [Kebriaei, P. et al. (2017) Trends in Genetics 33: 852-70] 참조; 본원에 참조로 포함됨). 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템은 하기 두 구성요소로 이루어진다: (i) 트랜스포손 함유 유전자 발현 카세트 및 (ii) 트랜스포사제 효소의 공급원. 플라스미드로부터의 발현 카세트를 게놈으로 전위시킴으로써, 트랜스진의 지속적인 전사를 달성할 수 있다. 예시적인 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 벡터는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: pSBbi (문헌 [Kowarz, E. et al. Biotechnol J. 10(4):647-53]; 애드젠(Addgene)으로부터 입수가능함), pCMV(CAT)T7-SB100 (문헌 [Mates, L. et al. Nat Genet. 2009 Jun;41(6):753-61]; 애드젠으로부터 입수가능함), 및 pT2/LTR7 (문헌 [Wang, J. et al. Nature. 2014 Dec 18;516(7531):405-9]; 애드젠으로부터 입수가능함).
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 벡터는 검출가능한 마커 또는 정제 마커를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 검출가능한 마커는 GFP, YFP, RFP, dTomato, 체리, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, 비오틴, 디옥시게닌, 탐라, 텍사스 레드, 로다민, 알렉사 플루오르, FITC, 및 TRITC로 이루어진 군으로부터 선택된 형광 단백질이다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 벡터는 선택가능한 마커를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 선택가능한 마커는 진핵 세포에서 양성 선택 형질을 부여하며, 예를 들어, 블라스티시딘 (bsd 유전자), G418/제네티신 (neo 유전자), 히그로마이신 B (hygB 유전자), 퓨로마이신 (pac 유전자) 또는 제오신 (Sh bla 유전자)이다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 박테리아 세포에서 양성 선택 형질을 부여하며, 예를 들어, 베타-락타마제 유전자이다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 활성화를 제어하기 위한 스위치 메카니즘을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 상기 벡터의 다른 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 재조합 TCR은 스위치 메카니즘을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 스위치 메카니즘은 TCR 라이브러리를 포함하는 세포의 아폽토시스 또는 사멸을 야기하기 위해 활성화될 수 있는 안전 메카니즘인 자살 스위치, 예를 들어 i카스파제 9이다.
예를 들어, 일부 실시양태에서 TCR은 표적 세포 상에서 또는 표적 세포에 의해 발현되는 표적 항원 이외의 분자에 특이적인 표지, 결합 도메인 또는 태그를 포함하는 표적-특이적 결합 요소를 갖는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, TCR의 특이성은 표적 항원 결합 도메인 및 TCR 상의 표지, 결합 도메인 또는 태그에 의해 인식되거나 또는 그에 결합하는 도메인을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어지는 제2 구축물에 의해 제공된다. 예를 들어, WO 2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9,233,125, US 2016/0129109를 참조한다. 이러한 방식으로, TCR을 발현하는 T-세포는 대상체에게 투여될 수 있지만, 항원-특이적 결합 도메인을 포함하는 제2 조성물이 투여될 때까지 그의 표적 항원에 결합할 수 없다.
다른 실시양태에서, TCR은 활성화되기 위해 다량체화를 필요로 하도록 변형되고/거나 (예를 들어, US 2015/0368342, US 2016/0175359, US 2015/0368360 참조) 외인성 시그널, 예컨대 소분자 약물을 필요로 하도록 변형된다 (US 2016/0166613, Yung et al., Science, 2015).
일부 실시양태에서, 벡터는 치료 후 벡터 발현 세포의 세포 사멸을 유도하거나 (문헌 [Buddee et al., PLoS One, 2013]) 또는 표적 항원에의 결합 후 TCR의 발현을 하향조절하기 위해 "자살 스위치" 또는 "안전 스위치"를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다 (WO 2016/011210). 예를 들어, 벡터는 TCR 활성을 중단시키기 위해 투여될 수 있는 항체 또는 전구 약물에 대한 감수성을 부여하는 자살 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 전구 약물은 유해 사례의 발생 시 TCR 라이브러리 요법을 받은 대상체에게 투여된다. 예시적인 자살 유전자는 세포를 간시클로비르에 대해 감수성으로 만드는 단순 포진 바이러스-티미딘 키나제 (HSV-TK) (문헌 [Bonini et al. Science 276: 1719-1724 (1997)]), 이량체화 약물에 의해 활성화될 때 이량체화 및 아폽토시스의 활성화를 허용하는 유도성 카스파제 9 (i카스파제9) (문헌 [Gargett et al., Front Pharmacol, 2014 5: 235]), 및 세포를 세툭시맙(cetuximab)에 대해 감수성으로 만드는 말단절단된 EGFR (문헌 [Wang et al. Blood 118: 1255-63 (2011)])을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, 벡터는 코작 컨센서스 서열을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코작 컨센서스 서열은 강하거나, 적절하거나, 또는 약하다.
상기 벡터의 일부 실시양태에서, T 세포는 용해 전에 표적 세포 또는 질환 항원과의 반응성에 대하여 스크리닝되었다. 상기 벡터의 특정 실시양태에서, 벡터에 의해 코딩된 TCR은 표적 세포 또는 질환 항원에 대한 결합 특이성을 갖거나 또는 이에 의해 활성화된다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포, 바이러스에 감염된 세포, 바이러스에 감염된 대상체로부터 유래된 세포, 종양 세포, 또는 바이러스 감염 또는 암이 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 단리된 조직 생검 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 단리되었다. 상기 벡터의 일부 실시양태에서, TCR은 질환 항원:MHC 복합체에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝된다.
특정 실시양태에서, 질환 항원은 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원이다.
다른 실시양태에서, 질환 항원은 CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인 4, KIF20A, 렝신, 멜로에, 뮤신 5AC (MUC5AC), 서바이빈, 시클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAGE1b/GAGED2A, CD19, CD20, CD22, CD52, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 멤버 10a (TRAILR1), 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제 (RANKL), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), 및 암배아성 항원 (CEA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원이다.
단지 예로서, 일부 실시양태에서, 원래 목적지 클로닝 벡터 (예를 들어, pLVX-EF1α-IRES-mCherry)는 제한 효소에 대한 다중 인식 부위, 예컨대 AgeI (2415), SphI (2331), NheI (8192) 및 MluI (6669) 커팅 부위를 함유할 수 있다 (숫자는 이들 커팅 부위의 위치를 나타냄). 도 13을 참조한다. 일부 실시양태에서, AgeI, SphI, NheI 및 MluI에 대한 과잉 제한 효소 부위는 부위 지정 돌연변이 유발을 수행함으로써 제거될 수 있다 (도 14 참조). 일부 실시양태에서, 목적지 클로닝 벡터로부터 제거될 과잉 제한 효소 부위는 표 7 또는 표 8에 열거된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, 과잉 제한 효소 부위는 선형 또는 원형화된 벡터 포맷으로의 T 세포 수용체 쌍형성된 알파:베타 클로닝을 허용하는 다른 공지된 제한 효소 부위로 치환될 수 있다.
원래 pLVX-EF1α-IRES mcherry 벡터 서열
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
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Figure pct00017
변형된 pLVX-EF1α-IRES mcherry 벡터 서열
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
본 개시내용의 벡터의 핵산 서열의 비-제한적인 예는 본원의 표 2에 제공되고 도 3 내지 12에 예시된다.
표 2. 예시적인 벡터 서열
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또 다른 측면에서, 본 기술은 벡터를 포함하는 재조합 세포로서, 여기서 벡터는 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 재조합 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리되며, 임의적으로 여기서 재조합 세포는 박테리아 세포, 포유동물 세포, 또는 효모 세포이다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
한 측면에서, 본 기술은 재조합 TCR 벡터 라이브러리로서, (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 재조합 TCR 벡터 라이브러리를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
일부 실시양태에서, TCR 벡터 라이브러리는 TCR 레퍼토리를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, TCR 벡터 라이브러리는 V(D)J 재배열 및/또는 T 세포 선택의 결과로서 단일 공여자 또는 대상체에서 생산된 상이한 TCR의 전체 또는 부분 컬렉션이다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR 벡터 라이브러리는 그의 결합 특이성 또는 다른 원하는 특징에 대해 특이적으로 선택된 TCR의 규정된 컬렉션을 포함한다. 예를 들어, TCR 벡터 라이브러리는 특정한 표적 세포, 항원, 항원:MHC 복합체 또는 그의 조합에 특이적으로 결합하는 TCR의 서브세트를 포함할 수 있다. 이들 실시양태에서, TCR은 단일 공여자 또는 대상체, 또는 둘 이상의 공여자 또는 대상체로부터 유래될 수 있다.
특정 실시양태에서, TCR 벡터 라이브러리 내의 각각의 TCR은 유전적으로 별개이고, 별개의 결합 특이성을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 벡터는 약 2개 내지 약 5개의 상이한 TCR, 약 2개 내지 약 10개의 상이한 TCR, 약 5개 내지 약 10개의 상이한 TCR, 약 5개 내지 약 15개의 상이한 TCR, 약 5개 내지 약 20개의 상이한 TCR, 약 10개 내지 약 30개의 상이한 TCR, 약 10개 내지 약 40개의 상이한 TCR, 약 10개 내지 약 50개의 상이한 TCR, 약 20개 내지 약 60개의 상이한 TCR, 약 25개 내지 약 75개의 상이한 TCR, 약 50개 내지 약 100개의 상이한 TCR, 또는 100개 초과의 상이한 TCR을 포함한다.
정확한 분자 조성물은 바이오 치료제의 안정성, 효능 및/또는 안전성에 유리할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, TCR 벡터 라이브러리 내의 각각의 벡터 및/또는 TCR은 TCR의 핵산 및/또는 아미노산 서열 및/또는 그의 결합 특이성을 결정하기 위해 특징규명된다. 일부 실시양태에서, 분자 특징규명은 벡터 또는 벡터의 일부 (예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드)를 핵산 시퀀싱함으로써 수행된다. 특정 실시양태에서, 분자 특징규명은 질량 분석법을 사용하여 TCR 단백질을 분석함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, TCR 벡터 라이브러리의 분자 특징규명은 각각 TCR 벡터 라이브러리로 형질전환된 재조합 세포 (예를 들어, 박테리아 세포)를 포함하는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 5개 이상, 또는 6개 이상, 또는 7개 이상, 또는 8개 이상, 또는 9개 이상, 또는 10개 이상, 또는 15개 이상, 또는 20개 이상, 또는 30개 이상, 또는 40개 이상, 또는 50개 이상의 단리된 콜로니를 핵산 시퀀싱함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, TCR 벡터 라이브러리는 형질전환된 재조합 세포의 단일 콜로니 핵산 증폭 및 시퀀싱에 이어, 규정된 분자 라이브러리 조성물을 생성하기 위해 규정된 비로 상이한 벡터 콜로니를 혼합함으로써 정제되거나 선택된다. 일부 실시양태에서, 라이브러리에 포함시키기 위한 개별 벡터의 선택은 출발 라이브러리의 특징규명 및/또는 결합 특이성의 측면에 의해 통보된다. 이러한 측면의 비-제한적인 예는 TCR 클로날 출현율, 시험관내 검정으로부터의 TCR 강화 특징, TCR V 세그먼트 서열, TCR D 세그먼트 서열, TCR J 세그먼트 서열, TCR 유전자 모티프, 및/또는 CDR3 유전자 모티프를 포함한다.
일부 실시양태에서, TCR 벡터 라이브러리 내의 벡터의 비는 이러한 라이브러리의 치료 활성을 최적화하도록 조정 또는 선택된다. 예를 들어, 2개의 TCR을 포함하는 TCR 벡터 라이브러리는 각각의 벡터의 약 1:1, 약 1:2, 약 1:5, 약 1:10 등의 벡터 비를 가질 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예에서, 3개의 TCR을 포함하는 라이브러리는 각각의 벡터의 약 1:1:1, 약 2:1:1, 약 2:2:1 등의 벡터 비를 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 기술은 단리된 면역 세포로서, (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 단리된 면역 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서 면역 세포는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 자연 살해 (NK) 세포이다.
한 측면에서, 본 기술은 세포 집단으로서, (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 재조합 TCR 벡터 라이브러리를 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 세포 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 상기 집단은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 대상체의 전체 또는 부분 TCR 레퍼토리를 포함한다.
본 기술의 부가의 측면은 담체 및 본 기술의 하나 이상의 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 대안적으로, 조성물은 담체 및 본 기술의 하나 이상의 재조합 TCR 벡터 라이브러리를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 담체 및 본 기술의 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 면역 세포를 포함한다. 또한 또 다른 실시양태에서, 조성물은 담체 및 본 기술의 재조합 TCR 벡터 라이브러리를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 널리 공지된 담체의 예는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 자연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 본 개시의 목적을 위해 가용성이거나 불용성일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 벡터, 세포, 세포 집단 또는 벡터 라이브러리를 결합하기 위한 다른 적합한 담체를 알고 있거나 또는 일상적인 실험을 사용하여 그를 확인할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 담체는 제약상 허용되는 담체이다. 청구된 조성물 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 개시내용의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 라이브러리, 세포 또는 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트 (예를 들어, 수산화 알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 경구, 정맥내, 국소, 장내 및/또는 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다.
II. 본 기술의 조성물을 제조하는 방법
본원에는 재조합 TCR 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 이러한 방법은 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 상기 집단은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 NK 세포를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 라이브러리는 표적 세포에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝된다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포, 바이러스에 감염된 세포, 바이러스에 감염된 대상체로부터 유래된 세포, 종양 세포, 또는 바이러스 감염 또는 암이 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 단리된 조직 생검 세포이다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 라이브러리는 항원:MHC 복합체에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝된다. 일부 실시양태에서 항원:MHC 복합체의 항원은 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원이다. 다른 실시양태에서, 항원:MHC 복합체의 항원은 CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인 4, KIF20A, 렝신, 멜로에, 뮤신 5AC (MUC5AC), 서바이빈, 시클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAGE1b/GAGED2A, CD19, CD20, CD22, CD52, EGFR, HER2, TRAILR1, RANKL, IGF1R, EpCAM, 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원이다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 라이브러리는 T 세포 표현형 마커에 대하여 스크리닝된다. 특정 실시양태에서, T 세포 표현형 마커는 하나 이상의 TCR 복합체 구성요소, 예를 들어, TCR알파, TCR베타, TCR감마, TCR델타, CD3δ/ε, CD3γ/ε, 및 CD247 ζ/ζ 또는 ζ/η의 발현을 확인한다. 일부 실시양태에서, T 세포 표현형 마커는 특이적 T 세포 서브세트, 예컨대 나이브 CD8+ T 세포, 나이브 CD4+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ 세포독성 T 세포, 감마/델타 T 세포, NKT 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th22 세포, T 난포 헬퍼 세포, Th17 세포 및 조절 T 세포의 확인에 도움을 준다. 이들 T 세포 서브세트를 확인하는데 적합한 세포 표면 마커에 특이적인 항체는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터 입수가능하다. 스크리닝은 ELISA, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, PCR, qPCR 및 유동 세포계수법을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법의 특정 실시양태에서, 라이브러리는 공동-배양 시스템에서의 활성에 대하여 스크리닝되며, 여기서 공동-배양 시스템은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: (a) 암 세포주; (b) 공지된 바이러스에 감염된 복수개의 세포; (c) 암 환자로부터 단리된 복수개의 종양 세포; (d) 불멸화된 세포주; 또는 (e) 환자 조직 생검으로부터 유래된 복수개의 세포. 일부 실시양태에서, 활성은 재조합 TCR/CD3 복합체와 공동-자극 수용체, 예를 들어, CD28의 공동-결속을 검정함으로써 측정된다. 세포 표면 상에서 이들 수용체의 공동-결속은 세포내 시그널링 이벤트 및 핵 전사 인자, 예컨대 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFAT), NF-kB 및 AP-1의 활성화를 초래한다. 구체적으로, TCR/CD3 복합체의 결속은 PLC-g의 인산화 및 활성화, 세포내 칼슘 플럭스 및 NFAT 경로의 전사 활성화를 초래한다. 일부 실시양태에서, TCR/CD3과 공동-자극 수용체 CD28의 공동-결속은 ERK/JNK 및 IkB 키나제 (IKK)의 활성화를 초래하고, 이는 결국 AP-1 및 NF-kB 경로 각각의 전사 활성화를 조절한다. IL-2 프로모터는 NFAT, NF-kB 및 AP-1에 대한 DNA 결합 부위를 함유한다. 따라서, TCR/CD3 및 CD28의 공동-결속은 IL-2 생산을 초래하며, 이는 통상적으로, T 세포 활성화에 대한 기능적 판독 값으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화를 측정하기 위해 사용되는 다른 평가 항목은 세포 증식, 세포독성 (표적 세포의 사멸) 및 부가의 시토카인, 예컨대 IFNγ의 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. T 세포 활성 키트의 측정 또는 검출에 적합한 키트는, 예를 들어, 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)으로부터 입수가능하다 [T 세포 활성화 생물검정 (IL-2)(a,b) (Cat. # J1651 및 J1655)].
상기 방법의 일부 실시양태에서, 형질전환된 세포는 시험관 내에서 활성화된다. 특정한 실시양태에서, 활성화는 하기 자극제: 항-CD3 항체, 항-CD8 항체, 항-CD27 항체, IL-2, IL-4, IL-21, 항-PD1 항체, 항-CTLA4 항체, 항 CD3/CD28 사량체성 항체, 종양 세포 용해물, 바이러스 감염된 세포와의 세포성 공동-배양물, 및 종양 세포주 중 하나 이상을 사용하여 수행된다. T 세포 활성화 키트는, 예를 들어, 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec)으로부터 입수가능하다 (T 세포 활성화/확장 키트, 인간, cat# 130-091-441).
상기 방법의 특정 실시양태에서, 세포 집단은 전사 인자로 형질전환된다. 일부 실시양태에서, 전사 인자는 포크헤드 박스 P3 (FOXP3, 엔트레즈 유전자: 50943, RefSeq mRNA: NM_001114377; NM_014009), PR 도메인 징크 핑거 단백질 1 (BLIMP-1, 엔트레즈 유전자: 639, RefSeq mRNA: NM_001198; NM_182907), 헬리오스 (IKZF2, 엔트레즈 유전자: 22807, RefSeq mRNA: NM_001079526.1; NM_016260.2, 유니프롯(Uniprot): Q9UKS7), 이카로스 (IKZF1, 엔트레즈:유전자: 10320, RefSeq mRNA: NM_001220765.2; NM_006060.6 등; 유니프롯: Q13422) 및 전환 성장 인자 베타 1 (TGF-베타 1, 엔트레즈 유전자: 7040, RefSeq mRNA: NM_000660)로 이루어진 군으로부터 선택된다. FOXP3은 면역 체계 반응에 수반되는 단백질이며 조절 T 세포의 발달 및 기능의 마스터 조절인자로서 기능하는 것으로 생각된다. 조절 T 세포는 일반적으로 면역 반응을 억제한다. BLIMP-1은 베타-인터페론 (β-IFN) 유전자 발현의 억제인자로서 작용한다. 조절 T 세포는 TGF-β1을 방출시켜 다른 T 세포의 작용을 억제한다. 활성화된 T 세포의 인터류킨 1 의존적 증식 및 인터류킨 2 의존적 증식, 및 휴지 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포의 활성화는 TGF-β1의 활성에 의해 방지된다. 유사하게, TGF-β1은 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 및 다양한 인터류킨을 포함한 많은 다른 시토카인의 분비 및 활성을 억제할 수 있다. 이는 또한, 시토카인 수용체, 예컨대 IL-2 수용체의 발현 수준을 감소시켜 면역 세포의 활성을 하향-조절할 수 있다. 전사 인자 아미노산 서열의 비-제한적인 예가 본원에 제공된다:
FOXP3 (유니프롯 Q9BZS1):
Figure pct00057
BLIMP-1 (유니프롯 O75626):
Figure pct00058
TGF-베타 1 (유니프롯 P01137):
Figure pct00059
일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 유효량의 재조합 TCR 라이브러리를, 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 그를 필요로 하는 대상체는 암 또는 바이러스 감염을 앓고 있다.
또 다른 측면에서, 본원에는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합 TCR 라이브러리로서; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 재조합 TCR 라이브러리가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 상기 집단은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 NK 세포를 포함한다.
한 측면에서, 본 기술은 담체 및 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 담체는 제약상 허용되는 담체이다.
III. 사용 방법
본원에 기재된 치료 방법은 병상 요법과 관련되는 시간 척도로 (예를 들어, 수 개월이 아닌 수 주) 신속하게 발견되고, 증폭되고, 대상체에게 돌려보낼 수 있는 특이적 TCR의 단리 및 사용을 위한 포맷을 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 본원에는 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 TCR 라이브러리 또는 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법으로서, 여기서 재조합 TCR 라이브러리는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되었으며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
또 다른 측면에서, 본원에는 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 TCR 라이브러리 또는 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 재조합 TCR 라이브러리는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되었으며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다.
일부 실시양태에서, 암은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 부신피질 암종; AIDS-관련 암; 항문암; 충수암; 성상세포종; 비정형 기형양/횡문근양 종양, 뇌암; 피부의 기저 세포 암종; 담관암; 방광암; 골암; 유방암; 기관지 종양; 버킷 림프종; 카르시노이드 종양 (위장); 배세포 종양; 원발성 CNS 림프종; 자궁경부암; 담관암종; 척삭종; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 만성 골수성 백혈병 (CML); 만성 골수증식성 신생물; 결장직장암; 두개인두종; 피부 T-세포 림프종; 관 상피내 암종 (DCIS); 자궁내막암; 상의세포종; 식도암; 감각신경모세포종; 두개외 배세포 종양; 고환외 배세포 종양; 안암; 안내 흑색종; 망막모세포종; 난관암; 골의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종; 담낭암; 위암; 위장 카르시노이드 종양; 위장 기질 종양 (GIST); 배세포 종양; 임신성 영양막 질환; 모발상 세포 백혈병; 두경부암; 심장 종양; 간세포성암; 조직구증, 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종; 하인두암; 안내 흑색종; 섬 세포 종양, 췌장 신경내분비 종양; 신장암; 후두암; 백혈병; 구순 및 구강암; 간암; 폐암; 림프종; 남성 유방암; 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종; 흑색종; 메르켈 세포 암종; 중피종; 전이성 암; 구강암; 다발성 내분비 신생물 증후군; 다발성 골수종/형질 세포 신생물; 균상 식육종; 골수이형성 증후군, 골수증식성 신생물, 만성; 비인두암; 신경모세포종; 비-호지킨 림프종; 비소세포 폐암; 구강암, 구인두암; 골육종; 난소암; 췌장암; 췌장 신경내분비 종양; 유두종증; 부신경절종; 부비동암; 부갑상선암; 인두암; 크롬친화세포종; 뇌하수체 종양; 흉막폐 모세포종; 전립선암; 직장암; 재발성 암; 신세포암; 망막모세포종; 횡문근육종; 타액선암; 육종; 유잉 육종; 카포시 육종; 골육종; 자궁 육종; 세자리 증후군; 피부암; 소세포 폐암; 소장암; 연부 조직 육종; 피부의 편평 세포 암종; 편평 경부암; 위암; T 세포 림프종; 고환암; 인후암; 비인두암; 하인두암; 흉선 암종; 갑상선암; 요도암; 자궁암; 질암; 혈관 종양; 외음부암; 또는 윌름스 종양이다.
한 측면에서, 본원에는 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 재조합 TCR 라이브러리 또는 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 여기서 재조합 TCR 라이브러리는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되었으며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약을 사용하여 단리된다. 다른 실시양태에서, 쌍형성된 T 세포 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, mRNA 포획 시약의 사용 없이, 단일 세포로부터 유래된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 단일 용해된 T 세포의 내용물을 함유하는 구획은 마이크로웰 (예를 들어, 96-웰 플레이트 내의 마이크로웰) 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다.
또 다른 측면에서, 본원에는 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 재조합 TCR 라이브러리 또는 재조합 TCR 라이브러리를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법으로서, 여기서 재조합 TCR 라이브러리는 세포 집단을 (a) 벡터 백본; 및 (b) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수개의 벡터를 포함하는 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되었으며; 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내의 mRNA 포획 시약에 의해 포획된 단일 용해된 T 세포의 mRNA로부터 유래되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 감염은 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 자살 스위치 (예를 들어, i-카스파제9)를 갖는 벡터를 포함하는 세포 또는 세포 집단을 사멸시키기 위해 자살 스위치를 활성화시킴으로써, 환자에 대한 상해의 위험을 감소시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 장기 부작용의 위험을 감소시키기 위해, 자살 스위치는 대상체의 암 또는 감염의 현저한 개선 또는 명백한 치료 후에 촉발된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 제조 방법에 기재된 바와 같이, 생체 내에서 원하는 TCR 기능 또는 T 세포 동일성을 달성하기 위해 투여 전에 시험관 내에서 세포를 사전-자극하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 제조 방법에 기재된 바와 같이, 강력한 항암 또는 항바이러스 표현형으로의 T 세포 발달에 영향을 미치거나, 또는 면역억제성 Treg의 발달을 방지하기 위해 재조합 세포에서 하나 이상의 전사 인자를 공동-발현하는 것을 추가로 포함한다.
세포, 라이브러리, 세포 집단 또는 조성물의 투여는 치료 과정 전반에 걸쳐 1회 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 이루어질 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 요법에 사용되는 조성물, 요법의 목적 및 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴에 따라 단일 또는 다수의 투여가 수행될 수 있다. 적합한 투여 제형 및 작용제를 투여하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 추가 측면에서, 본 개시내용의 세포 및 조성물은 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 세포 및 세포 집단은 관련 기술분야에 공지되고, 예를 들어, PCT/US2011/064191에 기재된 방법을 사용하여 숙주에게 투여된다. 본 개시내용의 세포 또는 조성물의 이러한 투여는 실험 및 스크리닝 검정을 위해 원하는 질환, 장애 또는 병태의 동물 모델을 생성하기 위해 수행될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 치료 또는 예방하고자 하는 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환 유형 및 중증도와 같은 요인에 따라 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 TCR 라이브러리의 유효 용량은 약 50개 내지 약 102개 세포, 약 102개 세포 내지 약 103개 세포, 약 102개 세포 내지 약 104개 세포, 약 103개 세포 내지 약 105개 세포, 약 104개 세포 내지 약 106개 세포, 약 105개 세포 내지 약 107개 세포, 약 106개 세포 내지 약 108개 세포, 약 107개 세포 내지 약 109개 세포, 또는 약 108개 세포 내지 약 1010개 세포를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 유효 용량은 약 5x105개 세포 내지 약 1.5x106개 세포 또는 약 1x104개 세포 내지 약 5x104개 세포, 약 5x104개 세포 내지 약 5x105개 세포, 또는 약 2.5x105개 세포 내지 약 7.5x105개 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 투여는 요법 투여에 대한 대상체의 특이적 반응에 반응하여 필요에 따라 반복 및/또는 변형된다. 예를 들어, 그를 필요로 하는 대상체에서 암 세포 또는 바이러스가 재발할 때 (예를 들어, 종양 면역 "탈출"), 반복 투여가 필요할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반복 투여는 초기 투여와 뚜렷이 구별되는 방법에 의해 제조된 세포, 라이브러리, 세포 집단 또는 조성물을 포함한다 (예를 들어, 반복 용량은 T 세포를 사전-스크리닝하거나 또는 사전-활성화시키는 부가의 단계를 포함한다). 특정한 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 재조합 TCR 라이브러리 또는 조성물의 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 용량을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 TCR 라이브러리는 치료되는 대상체에 대해 자가이거나 또는 동종이계인 세포를 포함한다.
면역검정 및 영상화. 일부 측면에서, 본원에 개시된 재조합 TCR 라이브러리는 대상체로부터 단리된 생물학적 샘플 (예를 들어, 인간 혈장)에서의 표적 세포의 존재에 대하여 검정하기 위해 사용될 수 있다. 표적 세포 (예를 들어, 암 세포)는 재조합 TCR 라이브러리를 생물학적 샘플에 노출시키고 TCR 활성화 및/또는 결합에 대하여 검정함으로써 검출될 수 있다.
표적 세포의 존재에 대하여 검정하는 것에 덧붙여, 본원에 개시된 재조합 TCR 라이브러리는 생체내 영상화를 위해 사용될 수 있다. 재조합 TCR 라이브러리와 함께 혼입될 수 있는 검출가능한 표지는 X-방사선 촬영, NMR 또는 ESR에 의해 검출가능한 것을 포함한다. X-방사선 촬영의 경우, 적합한 표지는 방사성동위원소, 예컨대 바륨 또는 세슘을 포함하며, 이는 검출가능한 방사선을 방출하지만 대상체에게 명백히 해롭지는 않다. NMR 및 ESR에 적합한 마커는 TCR 라이브러리 내로 혼입될 수 있는 검출가능한 특징적 스핀, 예컨대 중수소가 있는 것을 포함한다. 적절한 검출가능한 영상화 모이어티, 예컨대 방사성동위원소 (예를 들어, 131I, 112In, 99mTc), 방사성-비투과성 물질, 또는 핵 자기 공명에 의해 검출가능한 물질로 표지된 TCR 라이브러리가 대상체 내로 도입된다 (예를 들어, 비경구로, 피하로, 또는 복강내로). 대상체의 크기 및 사용된 영상화 시스템이 진단 영상을 생산하는데 필요한 영상화 모이어티의 양을 결정할 것이라는 것이 관련 기술분야에서 이해될 것이다. 방사성동위원소 모이어티의 경우, 인간 대상체에 대하여 주사되는 방사능의 양은 정상적으로, 99mTc 약 5 내지 20 밀리퀴리의 범위일 것이다. 이어서, 재조합 TCR 라이브러리는 표적 세포의 위치에 우선적으로 축적될 것이다. 예를 들어, 생체내 종양 영상화는 문헌 [S. W. Burchiel et al., Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer 13 (1982)]에 기재되어 있다.
진단 용도. 본원에 개시된 재조합 TCR 라이브러리는 진단 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 대상체에서 암 또는 바이러스 감염의 진단에, 본원에 개시된 재조합 TCR 라이브러리를 사용하는 방법을 제공한다. 진단 방법은 대상체로부터 단리된 생물학적 샘플을 본 개시내용의 재조합 TCR 라이브러리와 접촉시키는 것을 포함한다. 생물학적 샘플은 대상체의 임의의 조직 (생검 포함), 세포 또는 체액으로부터 수득될 수 있다. 재조합 TCR 라이브러리의 활성 또는 결합이 검정된다. 재조합 TCR 라이브러리가 생물학적 샘플에 노출되었을 때 활성화되는 경우, 대상체의 생물학적 샘플은 TCR 라이브러리에 의해 인식되는 세포를 함유한다. 따라서, 대상체는 암 또는 바이러스 감염이 있는 것으로 진단된다.
예후 용도. 본원에 개시된 재조합 TCR 라이브러리는 예후 방법에 사용될 수있다. 따라서, 본 개시내용은 암 또는 바이러스 감염이 있는 대상체의 예후를 예측하는데 있어서 본원에 개시된 재조합 TCR 라이브러리를 사용하는 방법을 제공한다. 예후 방법은 대상체로부터 단리된 생물학적 샘플을 본 개시내용의 재조합 TCR 라이브러리와 접촉시키는 것을 포함한다. 생물학적 샘플은 대상체의 임의의 조직 (생검 포함), 세포 또는 체액으로부터 수득될 수 있다. 재조합 TCR 라이브러리의 활성 또는 결합이 검정된다. 재조합 TCR 라이브러리가 생물학적 샘플에 노출되었을 때 활성화되는 경우, 대상체의 생물학적 샘플은 TCR 라이브러리에 의해 인식되는 세포를 함유한다. 따라서, 대상체는 암 및/또는 고형 종양, 또는 바이러스 감염이 있거나 또는 그것에 걸릴 위험이 있는 것으로 확인된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간, 동물, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 양, 마우스, 말 또는 소이다. 특정한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
IV. 키트
본원에 제시된 바와 같이, 본 개시내용은 TCR 라이브러리 제조 방법, 치료 방법, 진단 방법 및 예후 방법을 제공한다. 한 특정한 측면에서, 본 개시내용은 이들 방법을 수행하기 위한 키트 뿐만 아니라 본 개시내용의 방법을 수행하기 위한, 예컨대 공여자 세포를 수집하고/거나 스크린을 수행하고/거나 결과를 분석하기 위한 지침을 제공한다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 재조합 TCR 라이브러리 및 사용 설명서를 포함하거나, 또는 대안적으로 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 추가로 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 하나 이상의 벡터 및 사용 설명서를 포함하거나, 또는 대안적으로 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 추가로 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물 및 사용 설명서를 포함하거나, 또는 대안적으로 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 추가로 이로 이루어진다.
일부 측면에서, 키트는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 벡터, 세포, 집단 또는 재조합 TCR 라이브러리; 생물학적 샘플 중의 반응성 항원 또는 세포의 양을 결정하기 위한 수단 또는 TCR 라이브러리의 활성을 검정하는 수단; 및 표준과의 비교를 위한 수단을 포함할 수 있다.
키트 구성요소 (예를 들어, 시약)는 적합한 용기에 패키징될 수 있다. 예를 들어, 이러한 제안된 키트 구성요소는 용액 중에 또는 액체 분산액 등으로서 제공될 수 있다. 키트는 또한, 예를 들어, 완충제, 보존제 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출가능한 표지를 검출하는데 필요한 구성요소, 예를 들어, 효소 또는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 함유할 수 있으며, 그를 검정하여 시험 샘플과 비교할 수 있다. 키트의 각각의 구성요소는 개별 용기 내에 넣을 수 있으며, 다양한 용기 모두는 키트를 사용하여 수행된 검정 결과를 해석하기 위한 지침과 함께 단일 패키지 내에 있을 수 있다. 본 개시내용의 키트는 키트 용기 상에 또는 내에 제품 설명서를 함유할 수 있다. 제품 설명서는 키트 내에 함유된 시약을 사용하는 방법을 기재한다.
실시예
본 기술은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 어떠한 방식으로든 이로써 제한되는 것으로 해석되서는 안된다.
실시예 1: 쌍형성된 천연 TCRα:β 앰플리콘 생성 및 발현 벡터로의 클로닝
먼저, 천연적으로 쌍형성된 T 세포 수용체 유전자의 공급원으로서 쌍형성된 TCRα:β 앰플리콘을 수집하기 위하여 인간 T 세포 집단을 단리하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 30분 동안 400x g에서 원심 분리함으로써 히스토파크(Histopaque)®-1077을 사용하여 건강한 인간 환자로부터의 항응고 전혈로부터 단리하였다. 상부 혈장 층을 제거한 후, 혈장과 히스토파크®-1077 사이의 단핵 세포를 수집하고, 그를 인산염 완충 식염수에 재현탁시켰다. 세포를 부드럽게 혼합하고 250 xg에서 10분 동안 원심 분리하여 혈소판을 제거하였다. 상층액을 제거하고, 냉동 보존을 위해 PBMC 배양 배지 (10% 소 태아 혈청을 수반한 RPMI) 또는 세포 동결 배지 (10% 소 태아 혈청 및 10% DMSO를 수반한 RPMI)를 이용하여 세포 펠릿을 재현탁시켰다.
이어서, PBMC를, 4시간 동안 10% 소 태아 혈청이 공급된 RPMI 배지와 함께 배양한 후, 전장 T 세포 수용체 알파 및 베타 쇄를 증폭하기 위한 에멀젼 PCR, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 이오노마이신을 PBMC 배양 배지에 부가하여 T 세포의 자극을 위해 100 ng/mL의 최종 농도가 되도록 하였다. 맞춤형 유동 초점 조절 노즐을 사용하여, 단일 PBMC 세포를 세포 용해 완충액과 mRNA를 포획하는 폴리(dT) 비드가 있는 에멀젼 액적 내로 단리하였다 (Ref # 1-4). 노즐 설계는 세포가 단일 액적 내로 단리될 때까지는 세포가 용해 완충액에 노출되지 않도록 해야 한다. 이러한 액적 내에서, 세포를 용해 시약과 공동-캡슐화하여 mRNA 포획 및 정제를 위해 mRNA 및 폴리(dT) 자기 비드를 방출하였다. 디에틸 에테르를 사용하여 에멀젼을 파괴시키는 반면, 먼저 고염도 혼성화 완충액을 사용한 다음 PCR 완충액을 사용하여 폴리(dT) 비드를 회수 및 세척하였다. 이어서, 상기 비드를, 하류 클로닝을 위해 제한 효소 서열 및 T 세포 수용체 리더 서열을 혼입하면서 TCR 알파 및 베타 쇄 서열에 특이적인 문헌 [Boria et al.] (Ref # 5)으로부터 각색된 프라이머를 사용하여 중첩 연장 역전사 PCR OE-RTRT-PCR 혼합물에서 재유화시켰다. 링커 서열은 또한, TCR OE-RT-PCR 동안 TCR α 및 β 쇄의 물리적 연결을 가능하게 하기 위해 포함되었다. 플래티늄™ Taq DNA 폴리머라제를 수반한 슈퍼스크립트(SuperScript)™ III 원-스텝 RT-PCR 시스템이 에멀젼 PCR 시약을 위해 사용되었다. OE-PCR 열 순환 조건이 표 3에 제공되고 프라이머 서열은 표 4에 제공된다.
표 3: OE-PCR 열 순환 조건
Figure pct00060
표 4: OE-PCR을 위해 사용된 프라이머
Figure pct00061
Figure pct00062
OE-RT-PCR 반응 후, PCR 샘플을 DNA-클린업 키트에 의해 정제하고 DNA 겔 전기영동을 하였다. 도 1에 제시된 바와 같이, 연결된 TCR 알파 및 베타 앰플리콘은 약 1000 b.p.로 확인되었으며, 이는 성공적인 OE-RT-PCR 반응을 나타낸다.
DNA 겔 전기영동 후, 겔 추출을 수행하여 TCR α:β 앰플리콘을 수득하였다. 세미-네스티드 PCR을 수행하기 위한 주형으로서 5 ng 정제된 PCR 산물을 사용하였다. 네스티드 PCR 열 순환 조건이 표 5에 제공된다.
표 5: 네스티드 PCR 열 순환 조건
Figure pct00063
PCR 산물을 정제하기 위해 자이모 DNA 클린 & 농축 키트 (자이모 리서치)를 사용하여 DNA 클린 업을 수행하였다. 이와 같이 정제된 PCR 산물을 DNA 전기영동으로 분석하였다. PCR 결과가 도 2에 제시되었으며, 밴드 약 1000 b.p.는 TCR α:β 앰플리콘의 성공적인 증폭을 나타내었다.
DNA 전기영동 후, TCR α:β 앰플리콘을 절제하고, 자이모클린™ 겔 DNA 회수 키트 (자이모 리서치)를 사용하여 겔 정제를 수행하였다. 이와 같이 정제된 앰플리콘을 제로 블런트 클로닝 (써모 피셔 사이언티픽)에 적용하여 TCR α:β 앰플리콘 서열을 분석하였다. 서열은 NCBI IGBLAST T 세포 수용체 유전자 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/에서 입수가능함)에 의해 확인되었다. 8개의 TCR α:β 앰플리콘 및 그의 각각의 TCR 알파 및 베타 쇄 유전자의 시퀀싱 결과가 표 6에 열거되어 있다.
표 6: 단일 콜로니 시퀀싱을 위해 플라스미드 벡터 내로 클로닝된 TCR α:β 앰플리콘의 유전자 시퀀싱 결과
Figure pct00064
이와 같이 시퀀싱된 TCR α:β 앰플리콘은 인간 PBMC로부터의 다양한 TCR α:β 레퍼토리를 나타내었으며, 이는 본 실시예에 기재된 TCR 프라이머 설계가 TCR 레퍼토리를 성공적으로 증폭시킬 수 있다는 결론을 뒷받침해주었다. 제한 엔도뉴클레아제 표적 절단 부위를 갖는 표 4에 제시된 프라이머를 상기 앰플리콘 및 OE-PCR 내로 혼입하고 네스티드 PCR을 성공적으로 수행하였다. 제한 효소는 T 세포 수용체 유전자 (가변, 다양성, 연결 및 불변 영역 포함)에서는 거의 발견되지 않는 (예를 들어, 5개 미만의 세그먼트에서 발견되는) 표적 절단 부위를 선택하여, TCR 라이브러리 다양성을 상실하지 않으면서 원래 TCR 아미노산 서열의 발현을 허용하고, 제한 효소 소화 동안의 절단 및 그 후 발현 플라스미드 프로세스의 순환으로 인한 TCR 라이브러리 편향을 감소시키도록 선택되었다. 몇 가지 제한 부위를 침묵 및 비-침묵 돌연변이와 함께 혼입하여 천연 TCR 유전자에서는 거의 발견되지 않는 부가의 제한 효소 커트 부위를 부가하였다 (표 7 및 8).
표 7: 유전자의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 T 세포 수용체를 렌티바이러스 발현 벡터 내로 클로닝하는데 사용되는 침묵 돌연변이.
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
표 8: 천연 아미노산 서열에 대한 최소한의 변형으로 T 세포 수용체를 렌티바이러스 발현 벡터 내로 클로닝하는데 사용되는 비-침묵 돌연변이.
Figure pct00068
Figure pct00069
TCR α:β 앰플리콘을 렌티바이러스 발현 벡터인 pLVX-EF1알파-IRES-mCherry (클론테크) 내로 서브클로닝하였다. TCR 함유 렌티바이러스 발현 벡터를 렌티바이러스 패키징 벡터 및 외피 벡터와 함께 HEK293T 세포로 공동-형질감염하여 TCR 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생성하였다. HEK293T 세포는 하기 비로 형질감염되었다: 10 μg pLVX, 8 μg psPAX2 패키징 플라스미드, 3 μg pMD2.g 외피 플라스미드, 100 μl 퓨진(Fugene) 형질감염 시약. TCR을 코딩하는 재조합 렌티바이러스는 TCR의 발현을 위해 시험관내 디스플레이 J.RT3 T 세포주로 형질도입되었다. J.RT3의 내인성 TCR 알파 및 베타 유전자가 녹아웃되어 외래 TCR 알파 및 베타 쇄의 트랜스제닉 발현이 가능하였다. 형질도입 프로토콜은 대부분의 세포가 단일 TCR 쌍형성된 알파:베타 앰플리콘만을 발현하도록 MOI ≤0.2를 달성하기 위해 최적화되었다. 최종적으로, 형질도입된 세포를 유동 세포계수법 분석을 위해 항-α 쇄, 항-β 쇄, 항-CD8, 및 항-CD3 항체로 염색하여, 기능적 펩티드-MHC 결합 분석를 위해 준비된 완전히 어셈블리된 TCR 복합체를 표시하는 mCherry 발현 세포의 분획을 결정하였다.
도 15는 단일 세포 유화 중첩 연장 RT-PCR로부터 T 세포 수용체 (TCR) 앰플리콘 (알파:베타 쇄)의 DNA 전기영동 분석을 제시한다. 간단히 말해서, CD8 단리 키트를 사용하여 PBMC로부터 정제된 T 세포를, 세포 용해 및 RNA 포획을 위한 mRNA를 포획하기 위해 용해 완충액 및 폴리(dT) 비드로 오일 에멀젼 액적 내로 단리하였다. T 세포 RNA를 수반한 폴리(dT) 비드를, cDNA 합성 및 중첩 연장 PCR (OE-PCR)을 위해 재유화시켰다. TCR 쌍 α:β 쇄 앰플리콘 농도를 증가시키기 위해 2개의 세미-네스티드 PCR (제1 세미-네스티드 및 제2 세미-네스티드)을 수행하였다. 이어서, Mi-seq PCR을 수행하여 고처리량 시퀀싱 분석을 위한 차세대 서열 바코드를 부가하였다.
고처리량 시퀀싱 후, 원시 DNA 서열을 품질-필터링하고 NCBI IgBLAST 및 CDR3 모티프 알고리즘을 통해 TCR 유전자 활용에 대해 주석을 달며, α 및 β 쇄에 의해 쌍형성하고, TCR 레퍼토리로 컴파일링하였다. 도 16은 연결된 알파:베타 T 세포 수용체 유전자 분포의 요약을 제시한다.
실시예 2: 침묵 또는 비-침묵 돌연변이를 함유하는 TCR 클론의 평가
본원에 열거된 제한 효소를 사용하여 TCR 유전자에서 성공적으로 클로닝하기 위해, 목적지 클로닝 벡터 pLVX-EF1α-IRES-mCherry를 변형시켜, 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 하기 4개의 커팅 부위를 제거하였다: AgeI (2415), SphI (2331), NheI (8192) 및 MluI (6669) 커팅 부위 (숫자는 이들 커팅 부위의 위치를 나타냄).
이전에 확인된 TCR, 항-HIV-Nef-Rm9를, 표 7 및 표 8에 열거된 상이한 돌연변이를 가진 TCR 유전자의 평가를 위한 모델 TCR로서 사용하였다. 야생형 항-HIV-Nef-RM9 TCR 유전자 단편을, 활성 TCR의 발현을 위해 렌티바이러스 벡터인 pLVX-EF1α-IRES-mCherry 내로 서브클로닝하였다. 모든 항-HIV-Nef-RM9 돌연변이체 클론 (표 7 및 표 8)은 제한 효소 소화 및 라이게이션과 함께 유전자 합성에 의해 도입되었다. 야생형 및 돌연변이체 항-HIV-Nef-Rm9 TCR을 수반한 렌티바이러스 발현 벡터는 렌티바이러스의 발현을 위해 외피 및 패킹 플라스미드 (psPAX2 및 pMD2.G)와 별도로 HEK293FT 세포 내로 형질감염시켰다. 활성 T 세포 수용체 발현을 갖지 않도록 변형시킨 조작된 Jurkat 세포주인 JRT3/CD8을 TCR 발현 플랫폼으로서 사용하였다. 야생형 및 돌연변이체 항-HIV-Nef-RM9 TCR을 코딩하는 렌티바이러스는 TCR 발현을 위해 JRT3/CD8 세포 내로 별도로 형질도입되었다. 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 상으로 커플링된, HIV 펩티드인 RPQVPLRPM (SEQ ID NO: 1)에 대한 야생형 및 돌연변이체 항-HIV-Nef-Rm9 TCR 결합 친화도를 평가하였다. RPQVPLRPM-MHC ("RPQVPLRPM"은 SEQ ID NO: 1로서 개시됨) 복합체를, 펩티드-MHC에 대한 TCR의 결합의 검출을 위해 스트렙타비딘-알로피코시아닌 (SA-APC)과 접합시켰다. 이와 병행하여, 상기 형질도입된 JRT3/CD8 세포를, 상이한 돌연변이를 갖는 항-HIV-Nef-Rm9의 T 세포 수용체 발현의 평가를 위해 BV421 형광 마커와 접합된 항-TCR 항체로 염색하였다.
도 17 및 도 18은 상이한 비-천연 리더 펩티드를 갖는 돌연변이체 항-HIV-Nef-Rm9 TCR이 상이한 수준의 TCR 발현을 초래할 수 있다는 것을 명확하게 보여준다. 야생형 항-HIV-TCR 발현 수준 및 pMHC에 대한 그의 결합 친화도와 비교하여 (도 17 패널 C 및 D), TRBV24-1 또는 TRAV40-1 리더 펩티드를 포함한 돌연변이체 TCR은 거의 동등한 수준의 TCR 발현 및 pMHC 결합 친화도를 나타낸 반면 (TRBV24-1의 경우 도 17 패널 G 및 H, 및 TRAV40-1의 경우 패널 K 및 L), TRBV30 리더 펩티드를 갖는 돌연변이체 TCR은 감소된 TCR 발현 및 pMHC 결합 능력을 나타냈다 (도 17 패널 E 및 F). TRAV17-1 리더 펩티드를 갖는 돌연변이체 항-HIV TCR은 pMHC 결합 경향이 없고 낮은 수준의 TCR 발현을 명확하게 보여주었다 (도 17 패널 I 및 J). 야생형 항-HIV-TCR 발현 수준 및 pMHC에 대한 그의 결합 친화도와 비교하여 (도 17 패널 C 및 D), 침묵 돌연변이 (SpeI 제한 부위의 혼입을 위함)를 갖는 TCR은 거의 동등한 수준의 TCR 발현 및 pMHC 결합 친화도를 가졌다 (도 18 패널 A 및 B). 단일 아미노산 돌연변이 TRBCV30A를 갖는 돌연변이체 TCR은 야생형 항-HIV TCR과 유사한 TCR 발현 및 pMHC 결합 능력을 나타냈다 (도 18 패널 C 및 D). 단일 아미노산 돌연변이 TRBCP9L을 갖는 돌연변이체 항-HIV TCR은 pMHC 결합 경향이 없고 TCR 발현이 없다는 것을 명확하게 보여주었다 (도 18 패널 E 및 F).
도 19(a)는 인간화 마우스 모델 및 암 환자의 종양-특이적 T 세포 분석을 위한 인간 이펙터 T 세포의 단리를 제시한다. 도 19(b)는 단리되고, RT-PCR 증폭되며, NGS를 통해 분석된 31,718개의 인간 CD8+ TCR 클러스터에서의 Vα:Vβ 유전자 활용을 제시한다.
실시예 3: 공지된 펩티드:MHC 조합에의 결합에 대하여 천연 TCRα:β를 스크리닝하는 것
본 실시예에서, 사량체 염색은 공지된 엡스타인-바르 바이러스 (EBV) 펩티드가 로딩된 재조합 인간 백혈구 항원 (HLA) 사량체 복합체를 사용하여 수행된다. 세포 표면 상의 TCR을 수반한 EBV-반응성 T 세포는 EBV 펩티드-HLA 사량체 복합체를 인식할 것이다. HLA 복합체는 비오티닐화되었고 EBV-반응성 T 세포의 분류를 허용하는 형광단에 연결된 스트렙타비딘과 접합되었다. PBMC를, 공지된 HLA 대립 유전자를 갖는 엡스타인-바르 바이러스 양성 공여자로부터 단리하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 에멀젼 중첩 역전사 연장 PCR (OE-RT-PCR)을 수행하여 공여자의 T 세포 수용체 레퍼토리를 단리한다. TCR 앰플리콘을, 실시예 1에서 구축된 개발된 TCR 발현 렌티바이러스 벡터 내로 삽입하였다. 천연적으로 쌍형성된 T 세포 수용체 라이브러리를 발현하기 위한 벡터의 생성 후, J.RT3 세포주를 ≤0.2의 MOI에서 렌티바이러스 벡터로 형질도입하여, 시험관내 세포 라이브러리 상에서의 TCR α 및 β 쇄의 발현을 허용한다.
이전에 특징규명된 몇 가지 EBV TCR-펩티드-MHC 상호작용을 평가한다 (Ref # 6-8). 특히, 잠복 EBV 항원 단백질 EBNA3A로부터 유래된 공지된 면역우성 EBV 펩티드, HLA-B8 제한된 에피토프 FLRGRAYGL (SEQ ID NO: 79)이 로딩된 HLA B8 (Ref # 9). EBV 보호에 중요하고 잠재적으로 보호 효과가 있다고 생각되지만 보다 측정된 EBV 반응을 포함하는, 공지된 EBV 발암성 단백질인 LMP2로부터의 HLA-A*02.01-제한된 에피토프에 대한 트랜스제닉 J.RT3 세포의 반응을 또한 시험한다 (Ref #10). 이어서, 비오티닐화된 HLA 사량체를, 세포 분류 마커로서 MHC 단량체 대 스트렙타비딘의 5:1 몰비로 써모 피셔 사이언티픽 (카탈로그 # S32362)로부터의 스트렙타비딘 알로피코시아닌 접합체와 접합시킨다. 스트렙타비딘 표지된 MHC 복합체를, 세포 표면 상에 재조합 TCR을 수반한 렌티바이러스-형질도입된 J.RT3 세포와 함께 인큐베이션하고 문헌 [Altman et al. (Ref # 11)]에 기재된 바와 같이 형광 활성화 세포 분류를 수행한다.
EBV-반응성 T 세포 수용체 서열 (α:β 쇄)을 발현하는 상기와 같이 분류된 J.RT3 세포를 유동 세포계수법에 의해 분류하고, 10% FBS를 수반한 RPMI에서 밤새 회수한다. 이어서, TCR 앰플리콘 서열을, 이전에 보고된 바와 같이 (Refs # 12-16), 분류된 T 세포 수용체 라이브러리의 차세대 시퀀싱 분석에 의해 확인하였다. 대안적으로, EBV 반응성 함유 J.RT3 세포를, 단일 세포 클론을 단리하기 위해 1개 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트 상으로 시딩한다. 일단 단일 세포가 콜로니 내로 전파되면, RNA를 추출하고 cDNA를 역전사 효소에 의해 합성한다. PCR은 이전에 보고된 바와 같이 (Refs # 17-19), TCR 알파:베타 쌍 서열을 충분히 생성하기 위해 수행된다. 플라스미드를 추출하고 서열을 생어 시퀀싱으로 확인한다.
실시예 4: 시험관 내에서 세포주에 의한 활성화 및 EBV 감염된 세포 사멸에 대하여 천연 TCRα:β를 스크리닝하는 것
나이브 T 세포는 건강한 인간 공여자의 PBMC로부터 이지셉(EasySep)™ 인간 나이브 CD8+ T 세포 단리 키트 [스템셀 테크놀로지(Stemcell Technology)]를 사용하여 단리된다. 슬리핑 뷰티 트랜스포손/트랜스포사제 시스템을 사용하여, 실시예 1 및 2에서 회수된 바와 같은 TCRα:β 유전자 서열을 상기 단리된 나이브 T 세포 내로 전달한다. TCR 서열 라이브러리를, 유전자 발현을 위한 EF1알파 프로모터와 함께 실시예 2로부터의 pLVX 벡터에서, SB 트랜스포사제를 함유하는 슬리핑 뷰티 트랜스포손 클로닝 벡터 pT2/BH 내로 서브클로닝한다 (Ref # 20). 나이브 T 세포를 pT2/BH 벡터 및 pCMV(CAT)T7-SB100 (애드젠 플라스미드 # 34879) 둘 다로 형질감염시킨다. pCMAT7-SB100은 과다활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 발현하여, 전장 TCR의 발현을 가능하게 하였다. EBV TCR을 함유하는 유전자 전달 트랜스포손 플라스미드 및 SB100X 트랜스포사제 플라스미드는 제조업체 [론자 (Lonza; 독일 쾰른)]의 지침에 따라 4D뉴클레오펙터를 사용하여 T 세포 집단으로 형질감염시킨다. 이와 병행하여, 나이브 T 세포를 음성 대조군으로서 실시예 2에서 확인된 비-EBV 반응성 TCR로 형질감염시킨다. 형질도입된 T 세포 라이브러리를, 안정한 TCR 복합체 어셈블리 (항-α, 항-β, 항-CD8, 항-CD3)를 나타내는 TCR 표면 마커에 대한 염색에 의해 확인하고 유동 세포계수법을 통해 분석한다. 형질도입된 세포 상에서의 생산적인 TCR 디스플레이의 효율을 분석한다.
다음으로, 형질감염된 TCR 라이브러리를, EBV 감염된 B 세포 (EBV의 존재에 대하여 양성으로 시험된 암 세포주인 Raji 세포)와 공동-배양함으로써 시험관내 기능에 대하여 분석하고, 또한 EBV에 감염된 자가 공여자 B 세포에 대항한 활성에 대하여 분석한다. T 세포에 EBV 양성 B 세포를 10:1의 비로 시딩하고 24시간 동안 공동-배양한다. 24시간의 시험관내 공동-배양 후, T 세포를 회수하고, 염색하며, T 세포 마커 및 CD107의 발현/막 TNF-α 상향조절에 대해 분류한다 (Ref # 21-23). 그들이 코딩하는 TCR은 차세대 서열 분석에 의해 분석하여, 레퍼토리 내의 EBV-표적화 종양 침윤 림프구 (TIL) 서열을 밝혀낸다.
이어서, 모노클로날 쌍형성된 TCRα:β cDNA를 회수하고, 모노클로날 TCR로서 나이브 인간 T 세포 내로 형질도입하며, 동일한 EBV 감염된 B 세포 집단과 시험관내 공동-배양함으로써 검정하여 이들 TCR이 EBV 펩티드를 표적화할 수 있는 능력을 검증한다. 공동-배양 검정을 반복하고, IFN 감마, TNF-α, 퍼포린 및 그랜자임을 측정하기 위한 ELISA 키트를 사용하여 염증 유발성 시토카인을 측정한다. 음성 대조군 TCR 형질감염된 나이브 T 세포와 비교하여, EBV-특이적 TCR을 발현하는 나이브 T 세포는 모든 염증 유발성 시토카인의 증가된 수준을 명확하게 보여준다.
EBV 감염된 B 세포 또는 Raji 세포에 대한 형질전환된 나이브 T 세포의 활성을 평가하기 위해 시험관내 세포독성 검정을 또한 수행한다. Raji 세포와 자가 B 세포를 5x106/mL의 농도로 별도로 희석하고, 0.25 μM 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)와 함께 37℃ CO2 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하여, CFSE 염료가 세포로부터의 모든 유리 아민과 공유적으로 결합할 수 있도록 하였다. CFSE 염료는 B 세포의 생육력 및 증식을 평가할 수 있게 하였다. 염색된 B 세포를 RPMI 배지로 3회 세척한다. 이어서, 대조군 TCR 레퍼토리와 함께 EBV-반응성 TCR 단독을 발현한 나이브 T 세포를, 일정 범위의 이펙터 세포 대 표적 세포 비를 갖는 CFSE-염색된 B 세포 또는 Raji 세포와 공동-배양하였다. 세포독성은 각각 492 및 517에서의 여기 및 방출 파장을 사용하여 유동 세포계수법에 의해 평가된다. 대조군 TCR 실험 (EBV 펩티드 친화도가 없는 TCR)에서의 나이브 T 세포와 비교하여, 건강한 나이브 T 세포 집단으로 형질도입된 EBV 반응성 TCR은 EBV 감염된 자가 B 세포 또는 Raji 세포에 대해 우수한 세포독성을 나타낸다.
실시예 5: 암 치료를 위한 천연 TCRα:β 라이브러리의 유전자 전달
동물 모델은 암-특이적 TCR 단리, 회수, 및 세포-기반 치료제로서의 회수된 TCR 라이브러리의 후속 적용을 입증하는데 사용된다. 인간 PBMC가 생착된 CD34-NSG 인간화 마우스에 인간 RKO 결장 암종 이종이식편 [찰스 리버 랩스(Charles River Labs)]을 체내 이식한다. CD34-NSG에 먼저, 정맥내 주사 (i.v.)에 의해 인간 PBMC를 생착시킨 다음, 피하 주사에 의해 50% 마르티겔(Matrigel)® 매트릭스 [코닝(Corning)] 중의 1x107개 RKO 종양을 생착시켰다. 이어서, 마우스에게 2가지 체크포인트 억제제인 펨브롤리주맙 (항-PD-1) 및 이필리무맙 (항-CTLA-4)을 제공하여 항종양 TCR 반응을 증강시켰다. 마우스에게 격주로 100 μg의 펨브롤리주맙 및 100 μg의 이필리무맙을 제공하였다. 제15일에, 마우스로부터 비장 및 종양 조직을 꺼내어 비장 및 종양 침윤 T 세포를 단리하였다. CD3+CD8+CD45RA CCR7 발현에 대한 FACS 분석에 의해 중앙 기억 (TCM) 및 전이 기억 (TTM) T 세포를 수득하였다. 이어서, TCM 및 TTM 집단을 확장하고 에멀젼 OE-PCR 및 네스티드 PCR을 실시하여 실시예 1 및 2에서와 같이 TCR 레퍼토리를 수득하며, 실시예 3에 기재된 바와 같이 슬리핑 뷰티 트랜스포손/트랜스포사제 형질도입 플라스미드 내로 클로닝하였다.
일루미나(Illumina) MiSeq 2x300 페어드-엔드 판독 플랫폼을 사용하여 TCR 라이브러리의 분자 특색을 정확하게 규정하고 결정하였다. 원시 일루미나 서열을 품질-필터링하고, V-, D- 및 J-유전자에 맵핑하였으며, CDR3는 국제 면역유전학 정보 시스템 (IMGT, Ref # 24)을 사용하여 추출하였다. 서열 데이터는 프레임 내 V(D)J 연접부에 대해 필터링되고, 생산적인 TCRα 및 TCRβ 서열은 일루미나 판독 ID에 의해 쌍형성되며 정확한 CDR3 뉴클레오티드 및 V(D)J 유전자 활용 매치에 의해 컴파일링된다. CDR-β3 뉴클레오티드 서열을 추출하고, 말단 갭이 무시된 96% nt 동일성이 되도록 클러스터링되었으며 (USEARCH v5.2.32, Ref # 25), 이로써 생성되는 ≥2 판독치를 갖는 Vα:Vβ 쌍은 Vα:Vβ 클러스터의 목록을 포함하였다.
대안적으로, 에멀젼 RT-PCR 및 네스티드 PCR을 수행한 후, TCR α:β 앰플리콘 라이브러리를 슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터 (pT2/BH)에 라이게이션하고 고효율 적격 이. 콜라이(E. coli) 세포, 예컨대 XL-골드 [애질런트(Agilent) #200314] 내로 형질전환시켜 매우 다양한 TCR 라이브러리를 클로닝할 수 있다. 이어서, 쌍형성된 알파 베타 TCR을 박테리아 콜로니 생어 시퀀싱에 의해 개별적으로 시퀀싱하였다. 약 100개의 콜로니를 공지된 TCR 서열과 조합하여, 나이브 T 세포 내로전달하기 위해 정확하게 규정된 쌍형성된 알파 베타 TCR 라이브러리를 생성한다. RKO 암 세포주의 생착 없이 인간화 마우스로부터 유래된 TCM 및 TTM T 세포로부터 획득된 TCR 레퍼토리를 음성 대조군으로서 사용한다.
다음으로, 두 TCR 레퍼토리 (RKO 이종이식편 TCR로부터 유래되거나, 또는 RKO 이종이식편 TCR이 없는 마우스로부터 유래됨)은 실시예 3에 보고된 바와 같이 슬리핑 뷰티 트랜스포손/트랜스포사제 시스템을 사용하여 나이브 T 세포에서 발현된다. 형질전환된 TCR 라이브러리를, i.v. 주사를 통하여 상이한 RKO 이종이식편 마우스에게 별도로 투여한다. 개별 마우스의 종양 용적 및 체중 변화를 매일 측정하여 종양 크기 및 질환의 진행을 추적한다. 다른 RKO-이종이식편 마우스로부터의 TIL로 형질도입된 T 세포 집단으로 처리된 RKO-이종이식편 마우스는 대조군으로부터의 TCR 라이브러리 (즉, RKO 이종이식편이 없는 인간 PBMC CD34-생착된 마우스로부터 유래됨)로 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스와 비교 시 종양 성장에 있어서의 지연을 나타낸다. 이는 종양 진행을 효과적으로 감소시킬 수 있었던 세포-기반 치료제로서 정확하게 규정된 TCR 라이브러리의 적용가능성을 명확하게 보여준다.
실시예 6: 암 치료를 위한 항암 활성을 위한 사전-선택 후 천연 TCRα:β 라이브러리의 유전자 전달
실시예 4와 유사한 절차 및 동일한 마우스 모델 (RKO 결장암 이종이식편 모델을 수반한 인간 PBMC-생착된 CD34-NSG 인간화 마우스)이 본 실시예에 사용되지만, 세포-기반 치료제로서 사용하기 전에 시험관내 선택에 의해 항암 TCR을 단리하기 위한 부가의 T 세포 사전-선택 단계가 이용된다. RKO 결장암 생착 후 비장 세포 및 종양 침윤 림프구 집단을 단리한다. TCM 및 TTM은 마커 CD3+CD8+CD45RA 및 CCR7을 사용하여 FACS에 의해 단리된다. TCR 레퍼토리는 에멀젼 OE-PCR 및 네스티드 PCR을 사용하여 단리된 다음, 슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터로 서브클로닝되고 실시예 4에 기재된 바와 같이 PBMC로부터 단리된 나이브 T 세포로 재전달된다. 트랜스제닉 나이브 T 세포는 방사선 조사된 RKO 결장암 세포주와의 공동-배양에 의해 자극되고 실시예 3에 기재된 바와 같이, CD107 및 막 TNF-α에 대한 유동 세포계수법을 사용하여 단리된다.
대안적으로, 혈액 수지상 세포 단리 키트 II (밀테니이 바이오텍)를 사용하여 인간화 마우스로부터 수지상 세포 (DC)를 단리하고, DC를 50 ng/mL의 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)가 보충된 10% FBS를 갖는 RPMI에서 배양한다. 수지상 세포를 RKO 암 세포 용해물 또는 인간 결장암 세포 용해물로 2시간 동안 펄싱한다. 이어서, 슬리핑 뷰티 트랜스포손/트랜스포사제 벡터로 클로닝된 TCR 라이브러리로 형질도입된 나이브 T 세포를 4일 동안 10:1의 비로 DC 세포와 공동-배양한다. 자극된 항암 세포독성 T 세포를 막 결합된 CD107, 막 결합된 TNF-α 발현 또는 CD137 (4-1BB) 발현으로 게이팅한다. CD107a는 활성화된 CD8+ T 세포의 탈과립화를 위한 마커이다 (Refs # 26-33). CD137은 TNFR 패밀리에 속하며 T 세포 증식 및 생존과 연관된다 (Ref # 34-35). 분류된 T 세포 (항암 T 세포)를 실시예 4에 기재된 바와 같이 RKO 결장암 마우스 모델로 전달한다. RKO 이종이식편이 없는 마우스로부터의 TCR로 형질도입된 나이브 T 세포로 처리된 마우스와 비교하여, 시험관내 기능적 스크리닝으로부터 단리된 RKO-표적화 TCR로 형질도입된 나이브 T 세포로 처리된 마우스는 더 높은 생존율과 감소된 종양 성장을 나타내었다. T 세포는 항암 공동-배양 검정에서 활성화를 위해 선택되고 최종 세포-기반 치료제의 항암 효능을 증가시키기 위해 암-특이적 TCR에 대해 강화된다.
실시예 7: 항암 활성을 위한 사전-선택 및 항-종양 세포 사멸을 증강시키기 위한 시험관내 사전-활성화 후 천연 TCRα:β 라이브러리의 유전자 전달
실시예 6에서의 실험 절차는 천연적으로 쌍형성된 TCR 라이브러리를 나이브 T 세포로 형질도입한 후 부가의 T 세포 활성화 단계를 이용하여, 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행된다. 이러한 활성화 단계는 T 세포를 사전-프라이밍하고 증강된 암 세포 사멸을 위해 그를 활성화시킨다. 간단히 말해서, OE-PCR 및 제1 네스티드 PCR 후, TCR 라이브러리를, TCR의 트랜스제닉 발현을 위해 슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터로 클로닝한다. TCR 라이브러리 크기 및 다양성을 규정하기 위해 개별 플라스미드의 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱을 수행한다. 풀링된 TCR 트랜스포손 플라스미드는 나이브 T 세포에서의 TCR의 발현을 허용하는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 발현 벡터 SB100으로 공동-형질감염시킨다. 트랜스제닉 T 세포를 먼저, RKO 세포주 또는 암 항원 펄스된 T 세포로 자극하고, CD137/CD107/TFN-α 발현 항암 T 세포를 FACS에 의해 분류한다. 이어서, 이들 세포를 세포-기반 치료제로서 RKO 종양 마우스 모델에 전달하기 전에 시험관 내에서 활성화시킨다. 깁코(Gibco)™ 다이나비즈(Dynabeads)™ 인간 T-활성화제 CD3/CD28 (써모 피셔 사이언티픽)을, TCR 형질도입된 나이브 T 세포 배양물에 비드 대 세포 1:1의 최종 비로 부가하고, 37℃ CO2 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션한다. 다이나비즈를, T 세포와 항원 제시 세포 (APC)의 생체내 상호작용을 모방하는 항CD3 및 항CD28 항체와 접합시켜, T 세포 클로날 확장 및 분화를 허용한다 (Ref # 36). 활성화 후 세포 성장 및 생육력을 매일 모니터링한다.
IFN-감마 및 TNF-알파의 발현을 ELISA에 의해 조사하며, 이는 T 세포의 분화를 나타낸다. 비드 부가 후 제3일에, 20 U/mL의 재조합 인간 인터류킨2 (IL2)를 배양 배지에 부가하여 추가 T 세포 확장을 유도한다. 제7일에, 상기 확장된 T 세포를 계수하고 꼬리 정맥 i.v. 주사를 통해 RKO 이종 이식 마우스로 전달한다. 종양 성장 및 개별 마우스 체중을 평가하고 실시예 4 및 5에서 수득된 것과 비교하였다. 본 실시예에서 트랜스제닉, RKO 종양-특이적, 자극되고 활성화된 T 세포로 처리된 RKO-생착된 마우스는 실시예 4로부터의 것 (종양 선택 또는 활성화가 없는 트랜스제닉 T 세포) 및 실시예 5로부터의 것 (시험관내 사전-활성화 없이 RKO에 대한 반응성에 대하여 스크리닝된 T 세포)과 비교 시 우수한 항암 효율을 나타낸다. 본 실시예에 기재된 부가의 활성화 단계는 치료적 전달 전에 이펙터 세포독성 T 세포의 분화를 허용하여, 마우스 모델에서 종양 면역억제의 속도 및 강도를 증강시킨다.
실시예 8: 항원-특이적 면역 관용성의 유도를 위한 천연 TCRα:β 라이브러리의 유전자 전달
CD34+ 인간 PBMC-생착된 마우스 모델은 마우스에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 문제를 개선하기 위해, GvHD를 앓고 있는 마우스로부터 단리된 TCR이 있는 조절 T 세포를 유도하고, 그를 면역 관용성을 유도하는 치료제로서 사용하였다.
실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 마우스의 비장 및 PBMC로부터 T 세포를 단리한다. GvHD 발병이 시작되는 생착 후 30일에 T 세포를 단리한다. 실시예 1로부터의 TCR 클로닝 프라이머 세트를 이용하여 중첩 연장 역전사 효소 PCR을 수행하여, Treg 세포 (CD4+CD25+) 뿐만 아니라 통상적인 T 세포 (CD4+CD25-) 둘 다로부터 TCR 라이브러리를 수득한다. 다음으로, 2가지 TCR 라이브러리를 pT2/BH 슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터로 서브클로닝한다. 이들 두 세트의 T 세포 수용체 라이브러리를 분석하고 T 세포 수용체 유전자 활용을 명확히 규명하기 위해 차세대 시퀀싱을 수행한다.
나이브 T 세포를 하기 분류 마커 설정으로 PBMC로부터 단리한다: CD25-CD44lowCD62Lhi. 상기 세포를, GvHD 마우스로부터 단리된 TCR 서열 라이브러리를 사용하여, TCR 발현을 위한 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 플라스미드 (SB100)와 함께 상기 기재된 2가지 라이브러리를 함유하는 TCR 공여자 트랜스포손 플라스미드로 형질감염시킨다. 이어서, 트랜스제닉 나이브 T 세포를 5 ng/mL의 TGF-β1과 함께 다이나비즈™ 인간 T-활성화제 CD3/CD28에 의해 T reg 세포로 유도한다. Foxp3 발현을 유도하는 것으로 밝혀진 마스터 조절인자인 TGF-β는 나이브 T 세포를 조절 T 세포로 분화할 수 있게 해준다 (Ref # 37-38). 유도 5일 후, 이와 같이 유도된 T 조절 세포 (iTreg)에, GvHD 발병 마우스의 치료를 위해 T 세포 확장을 가능하게 하는 rIL-2를 공급한다.
대안적으로, T 세포를 이전에 보고된 바와 같이 Foxp3 서열로 직접적으로 형질도입시킨다 (Ref # 39-40). 확장한지 3일 후, 트랜스제닉 TCR이 있는 iTreg 세포 및 트랜스제닉 TCR이 없는 iTreg 세포를 꼬리 정맥 주사 (n = 5)를 통해 GvHD 발병 마우스에게 별도로 정맥내로 주사하고; 이들 마우스에게 이전 GvHD 마우스와 동일한 공여자 및 샘플링 시점으로부터의 CD34+ 인간 PBMC를 생착시켰다. CD4+ CD25+ 트랜스제닉 TCR이 있는 iTreg로 처리된 마우스는 트랜스제닉 CD4+ CD25-TCR이 있는 iTreg 세포 및 트랜스제닉 TCR이 없는 iTreg로부터의 것과 비교 시 지연된 GvHD 질환 발병을 나타낸다.
3가지 군 (트랜스제닉 TCR이 없음, CD4+ CD25+TCR 및 CD4+ CD25-TCR) 사이의 체중 변화 및 GvHD 점수를 분석한다. CD4+CD25+ 트랜스제닉 TCR을 발현하는 T 세포가 주사된 마우스는, T 세포 만 주사된 마우스 및 CD4+CD25- 트랜스제닉 TCR이 있는 T 세포가 주사된 마우스와 비교 시 가장 낮은 체중 변화 및 가장 낮은 GvHD 점수를 나타냈다. 면역관용 활성 및 T 세포 표현형을 모니터링한다. T 세포 주입 후 20일에, 인간화 마우스를 희생시키고, 비장을 수거하며, 적혈구 용해 완충액을 소화함으로써 비장 세포를 단리한다. 그 결과로서 생성된 백혈구를 항-CD25, 항-CD4+, 항-CD3 및 Foxp3로 염색한 다음, 유동 세포계수법 분석에 의해 면역관용 활성을 평가한다. 트랜스제닉 CD4+CD25+TCR을 갖는 마우스로부터의 백혈구는 다른 2가지 군의 마우스 (트랜스제닉 TCR이 없는 마우스 및 CD4+CD25-TCR을 갖는 마우스)로부터의 백혈구와 비교 시 유동 세포계수 염색 분석으로부터 가장 강한 Foxp3 및 CD25 시그널을 나타낸다.
실시예 9: 포유동물 또는 인간 환자에서 암 요법을 위한 천연 TCRα:β 라이브러리 유전자 전달의 적용
본 실시예에서는, 포유동물 환자, 예컨대 인간 암 환자를 치료한다. 일부 실시양태에서, 암 유형은 폐암, 흑색종, 신세포 암종, 유방암 (삼중 음성 유방암 포함), 결장암 또는 전립선암이다. 치료 절차는 실시예 4에 기재된 바와 유사하게 수행될 수 있다. 간단히 말하면, 포유동물 또는 인간 환자로부터의 T 세포를 회수하며, 이는 PBMC, 종양 침윤 림프구, 비장 조직, 병에 걸린 기관, 또는 환자로부터의 다른 인간 조직으로부터 유래될 수 있다. 이어서, TCR 유전자를 회수하여, 그를 발현 벡터로 클로닝한다. 일부 실시양태에서, T 세포 라이브러리를 먼저, 항 종양 활성에 대하여 사전-스크리닝한다. 스크리닝은 종양 펩티드 신생항원에 대항한 반응성, 또는 대안적으로 시험관내 전체 종양 세포에 대항한 반응성으로 TCR을 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 암 환자로부터 유래될 수 있다.
다음으로, 상기 선택된 T 세포 라이브러리를 세포-기반 치료제로서 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 세포-기반 TCR 치료제의 분자 조성을 정확하게 규정하기 위해 고처리량 시퀀싱을 사용하여 분석한다. 다른 실시양태에서, 상기 라이브러리는 박테리아에서 다수의 개별 플라스미드 콜로니 (라이브러리로부터 유래된 3 내지 100,000개 콜로니 범위)를 서브-샘플링하고 미니-프렙 후 각각의 플라스미드 콜로니를 개별적으로 시퀀싱함으로써 선택된다. 이어서, 이러한 개별 플라스미드를 규정된 비로 혼합하여, 정확하게 규정된 분자 라이브러리를 재생시킨다. 이러한 정확하게 규정된 분자 라이브러리는, TCR 라이브러리가 RT-PCR에 의해 원래 생성될 때 발생할 수 있는 PCR 오류 변이체의 존재를 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 마우스 TCR 불변 영역 유전자는 TCR 트랜스진이 유전자 수용자 T 세포에서 천연 인간 T 세포 수용체 유전자와 연합하는 것을 방지하는데 사용될 것이다. 라이브러리는 TCR 및 임의의 다른 플라스미드 유전자를 인간 T 세포로 전달하는데 사용될 것이다. 일부 실시양태에서, 이들 T 세포는 환자로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이들 T 세포는 환자 유래 나이브 T 세포일 것이다. 다른 실시양태에서, 이들 T 세포는 다른 인간 또는 세포주로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실시예 6에 기재된 바와 같이 T 세포를 사전-프라이밍하고 증강된 암 세포 사멸을 위해 그를 활성화시키는 활성화 단계가 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 실시예 7에 기재된 바와 같이, 전사 인자를 사용하여 세포 운명에 영향을 미칠 수 있다. TCR 트랜스진을 발현하는 형질전환된 T 세포는 시험관 내에서 확장되어 세포 은행을 생성할 수 있거나, 또는 환자에게 직접적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 종양 내로 직접적으로 주사된다. 다른 실시양태에서, T 세포는 정맥내로 또는 척수강내로 투여된다.
플라스미드 유전자 라이브러리는 후속 반복 투여를 위해 T 세포 트랜스진 집단을 재창출하기 위해 언제든지 다시 사용될 수 있으며; 다른 실시양태에서, 확장된 세포 은행은 반복적인 치료적 투여를 위해 사용될 수 있다. 지속적인 암 진행 및/또는 종양 성장 또는 어떤 방식으로든 종양의 부적절한 치료의 경우에는, 전체 치료 과정을 반복할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이것은 환자의 T 세포 유전자를 다시 포획하고 스크리닝 및 라이브러리 생성 프로세스를 반복하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 반복 요법은 진화된 암 세포를 표적화하는 TCR을 확인하기 위해 저항성 종양 세포 집단에 대항하여 원래 포획된 TCR 유전자 라이브러리를 재스크리닝하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 반복 요법은 TCR 유전자 라이브러리의 부가의 활성화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내 세포 활성화 프로세스는 다중 치료 투여 과정 전반에 걸쳐 변화될 수 있으며, 예를 들어, 암이 진행됨에 따라 치료적 투여 전에 시험관내 세포-기반 치료제에 대해 보다 강력한 활성화 단계가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, i-카스파제 유전자 또는 다른 유도성 자살 스위치 유전자가 트랜스진 벡터에 포함되어 치료적 투여 후 세포-기반 요법의 운명을 제어할 수 있다.
실시예 10: 바이러스 감염의 치료를 위한 천연 TCRα:β 라이브러리 유전자 전달의 적용
이식 후 림프 증식성 장애 (PTLD)는 고형 기관 이식의 심각한 합병증이다. 1차 엡스타인-바르 바이러스 (EBV) 감염이 주요 위험 요인이며, PTLD 증례의 약 60 내지 80%가 EBV 혈청 양성이다. EBV 펩티드에 대한 T 세포 반응은 악성 종양을 억제하는데 결정적이다 (Llaurador, G. et al., Curr. Opin. Pediatr. 29, 34-40 (2017)).
본원에 개시된 TCRα:β 라이브러리는 항바이러스 TCR 치료제를 위한 모델로서 마우스 모델에서 PTLD를 치료 또는 예방하는데 사용될 것이다 (Ahmed, E. H. & Baiocchi, R. A, ILAR J. 57, 55-62 (2016); Ricciardelli, I. et al., Blood 124, 2514-2522 (2014)). 간단히 말해서, 항-EBV TCR은 쌍형성된 알파 및 베타 유전자의 단일 세포 단리에 의해 확인될 것이며, TCR 디스플레이 벡터로 클로닝될 것이며, 항-EBV 펩티드 결합을 위해 FACS에 의해 세포-기반 스크리닝될 것이다. 다른 실시양태에서, 항-EBV TCR은 트랜스제닉 TCR로 형질전환된 T 세포의 인식, 확장 및/또는 시험관내 사멸 활성을 확인함으로써 발견될 수 있다. 다른 실시양태에서, 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV), 단순 포진 바이러스 1 또는 2 (HSV-1/HSV-2), 및 황열병 바이러스 (YFV)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 상이한 항바이러스 요법에 다른 바이러스를 표적화하는 T 세포 수용체가 발견되었다.
항바이러스 T 세포 수용체 폴리뉴클레오티드를 단리한 후, 이들은 DNA 벡터로 클로닝될 것이고, PTLD를 치료하기 위해 자가 유전자 요법에 활용될 것이다. 형질전환된 T 세포는 다른 바이러스 감염을 치료하거나 또는 이종 유전자 요법에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이들은 PTLD 또는 다른 바이러스 감염을 예방하기 위한 예방적 세포 요법으로서 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 벡터는 바이러스에 의해 연관된 예방적 암 백신으로서 유전자 요법에 사용될 수 있다.
렌티바이러스 유전자 형질도입은 바이러스에 의해 감염된 세포의 시험관내 사멸 효능을 평가하기 위해 항바이러스 TCR로 인간 범-T 세포를 형질전환시키는데 사용될 것이다. 형질전환된 T 세포는 하기 자극 조건 중 임의의 것을 이용하여, 바이러스에 의해 감염된 세포와 공동-배양될 수 있다: 없음, IL-2, 항-CD3/항-CD28 자기 비드, 또는 IL-2/항-CD3/항-CD28. 시험관 내에서 바이러스에 의해 감염된 세포 사멸은, 세포 사멸로 인한 형광 표지된 종양 세포의 손실을 측정하는 인큐사이트(IncuCyte) 생세포 검정에 의해 평가될 것이다 (Single, A. et al., J. Biomol. Screen. 20, 1286-1293 (2015)).
다음으로, 인간 범-T 세포는 최적화된 조건 하에 항바이러스 TCR로 형질도입되고 마우스 모델에서 바이러스 감염을 치료하는데 사용될 것이다. EBV 감염 및 PTLD의 마우스 모델이 사용될 것이다 (Johannessen, I. et al. J. Med. Virol. 83, 1585-1596 (2011)). 다른 실시양태에서, 마우스는 바이러스에 감염되고 바이러스 단백질에 특이적인 T 세포로 치료될 수 있다. 형질도입된 T 세포는 순수한 형질도입된 TCR 라이브러리를 수득하기 위해 트랜스제닉 TCR 발현에 대한 유동 세포계수법에 의해 단리될 것이다. 다음으로, 형질전환된 세포는 상기 기재된 조건을 포함할 수 있는 T 세포 자극 프로토콜을 사용하여 자극될 것이고, 자극된 T 세포는 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스로 전달될 것이다 (Kurtz, A. Mesenchymal Stem Cell Delivery Routes and Fate. Int. J. Stem Cells 1, 1-7 (2008)).
체중 감소 및 PTLD 종양 용적을 기록하기 위해 마우스를 30일 동안 추적할 것이다. 처리된 마우스는 비처리된 마우스 대조군 뿐만 아니라 항바이러스 항체 및 항바이러스 소분자 억제제로 처리된 다른 대조군과 비교될 것이다. PTLD 종양 성장에 있어서의 어떠한 지연도 주요 연구 평가 항목으로서 정량화될 것이다. 본 기술의 항-EBV TCR을 포함한 형질전환된 세포로 처리된 마우스는 비처리된 대조군과 비교하여 PTLD 성장에 있어서의 지연, 바이러스 성장 동력 지연 및/또는 바이러스 감염 후 더 빠른 질환 회복을 보일 것으로 예상된다. 이러한 결과는 본 기술의 조성물이, 바이러스 감염 및 바이러스에 의해 연관된 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염 및 바이러스에 의해 연관된 암을 치료 또는 예방하는 방법에 유용하다는 것을 입증할 것이다.
실시예 11: PDX 마우스 모델에서 암을 치료하는데 있에서 항원-특이적 TCRα:β의 평가
난소암 환자로부터의 환자 유래 이종이식편 (PDX) 마우스 모델은 항종양 T 세포 발견을 위한 재생가능한 세포 공급원으로 확립될 것이다 (도 22).
인간 범-T 세포는 0.2 미만의 감염 다중도로 형질도입되고 (즉, 세포당 하나의 TCR 트랜스진), 형질도입된 라이브러리는 공동-배양된 PDX 종양 세포에 대항한 TCR 활성화에 대하여 시험관 내에서 스크리닝된다. 확장 및 활성화제 유전자 발현 (CD69/CD107/막 TNF-α)은 항종양 TCR 인식의 특징으로서 정량화된다. 일루미나 MiSeq 2x300 페어드-엔드 시퀀싱은 TCR 라이브러리 다양성을 분석하고 클로닝 및 선택 프로세스 내의 각각의 단계에서 Vβ 및 Vα 유전자를 특징규명하는데 활용된다 (즉, 투입 cDNA, 렌티바이러스 입자 생성 후, 및 표면 디스플레이된 TCR을 갖는 mCherry+ J.RT3 세포). 2x300 시퀀싱은 CDRα3 및 CDRβ3 영역의 전체 적용 범위를 허용한다. 고처리량 시퀀싱은 TCR 라이브러리가 높은 다양성을 유지하고 포유동물 T 세포 상에 디스플레이된 ≥105개의 천연 TCRα:β가 생성되는지를 검증할 것이다. NGS는 또한, PDX 신생항원을 확인하는데 사용될 것이며 TCR 분자 모델링은 항-PDX TCR의 신생항원 표적을 결정하기 위해 수행될 것이다.
일단 항-PDX TCR이 스크리닝에 의해 확인되면, 자가 환자 T 세포가 이러한 항종양 TCR로 형질도입되고 시험관 내에서 PDX 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 능력이 검정될 것이다. 인간 T 세포는 렌티바이러스 유전자 형질도입을 통해 항종양 TCRα:β 유전자로 형질감염될 것이다 (도 20). 환자 T 세포는 형질도입된 TCR의 우선적 발현을 촉진시키기 위한 시스테인 변형을 포함한, 천연 인간 TCR 불변 영역 유전자로 형질도입된다. 형질도입된 T 세포는 T 세포 자극제 (한 예로서, 항-CD3/항-CD28 자기 비드/IL-2))로 사전-활성화되고, 인큐사이트 표지된 종양 세포와 함께 인큐베이션되어 시험관내 TCR-기반 종양 세포 사멸을 평가한다. 종양 세포를 표적화하지 않는 연결된 TCRα:β 유전자로 형질도입되는 자가 T 세포는 음성 대조군으로서 제공될 것이다. ANOVA는 음성 대조군 TCR 유전자와 비교하여 종양 세포 사멸의 통계적 분석에 사용될 것이다.
다음으로, 트랜스제닉 항-PDX T 세포는 항원-특이적 종양 면역요법을 위해 PDX 마우스에 전달될 것이다. 형질도입된 T 세포는 순수한 형질도입된 TCR 라이브러리를 수득하기 위해 유동 세포계수법에 의해 단리된다. 마우스 범-T 세포는 항-PDX TCR로 형질도입되고 세포 사멸 검정에서 결정된 조건을 사용하여 사전-자극되며; 자극된 T 세포는 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 전달된다. 마우스를 30일 동안 추적하고, 처리된 마우스를 대조군 및 체크포인트 억제제로 처리된 동물과 비교한다. 지연된 종양 성장은 통계적 유의성을 검증하기 위해 생존의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 분석을 적용하여 주요 연구 평가 항목으로서 정량화된다. 항-PDX TCR을 포함하는 T 세포로 처리된 동물은 체크포인트 면역 요법 치료를 받은 동물에서 관찰된 치료 반응과 일치하거나 또는 그를 초과할 것으로 예상된다. 이러한 결과는 본 기술의 TCR 라이브러리가 인간 환자에서 개인화된 항원-특이적 요법에 유용하다는 것을 입증해줄 것이다.
실시예 12: PDX 마우스 모델에서 암을 치료하는데 있어서 항원-특이적 TCRα:β의 평가
신세포 암종 (RCC)은 면역요법에 취약하며 전형적으로 종양이 국부적으로 진행되거나 전이될 때까지 임상적으로 침묵한다. 따라서, 말기 RCC 진단이 흔하며, 외과적으로 절제하면 실험실 연구를 위한 상당한 T 세포 침윤물을 가진 큰 종양이 산출된다. 진행성 RCC는 또한, 체크포인트 억제 및 재조합 IL-2 요법에 대한 FDA 승인된 적응증이며, RCC는 면역요법으로 활성화될 수 있는 큰 T-세포 침윤물로 고도의 면역원성이 될 수 있다. RCC에 반응하는 TIL TCR의 고처리량 스크리닝은 정밀 요법에 활용할 수 있는 신생항원-특이적 TCR을 확인하는데 사용될 것이다.
먼저, TIL 및 암 세포는 유동 세포계수법을 사용하여 종양으로부터 단리되며; TIL이 TCR 레퍼토리 단리 및 클로닝을 위한 투입물인 동안에는 종양 세포를 냉동 보존한다. 다음으로, TCR 레퍼토리는 나이브 T 세포로 형질전환되고, 이로써 생성된 디스플레이 라이브러리는 자가 환자 종양 세포와 공동-배양으로 시딩된다. 공동-배양 24시간 후, 활성화된 T 세포는 CD69/CD107/막 TNF-α 상향조절을 위해 FACS에 의해 분류되고, 코딩된 TCR은 차세대 시퀀싱에 의해 분석되어 레퍼토리 내의 종양-표적화 TCR을 밝혀낸다. 마지막으로, 모노클로날 쌍형성된 TCRα:β cDNA를 회수하고, 인간 범-T 세포로 형질도입하며, 항-RCC TCR을 확인하기 위해 종양 세포 공동-배양에 의해 검정한다. 이러한 결과는 본 기술의 TCR 라이브러리가 인간 환자에서 개인화된 항원-특이적 요법에 유용하다는 것을 명확하게 보여줄 것이다.
실시예 13: 결장 암종, 난소암 및 B 세포 암을 치료하기 위한 쌍형성된 TCRα:β 유전자 요법의 적용
결장암. RKO 세포 (인간 결장 암종 세포주)에 대항한 쌍형성된 TCRα:β 유전자 라이브러리를 마우스 T 세포로 클로닝한다. 간단히 말해서, 범-T 세포는 자기 비드를 사용하여 마우스 비장으로부터 단리되고 렌티바이러스 또는 트랜스포사제-기반 TCR 유전자 전달을 받게 될 것이다.
도 20에 예시된 렌티바이러스 전략에 따르면, 인간 TCR 불변 영역 유전자는 천연 마우스 TCR과의 교차-이량체화를 방지하기 위해 사용된다. 다음으로, T 세포를 항체로 염색하여 트랜스제닉 인간 α 및 β 불변 영역 단백질의 표면 발현을 평가하고, TCR 발현을 유동 세포계수법에 의해 정량화한다. 렌티바이러스 유전자 형질도입을 사용하여, RKO 사멸 효능을 평가하기 위해 마우스 범-T 세포를 항-RKO TCR로 형질전환시킨다. 형질도입된 T 세포는 순수한 형질도입된 TCR 라이브러리를 수득하기 위해 인간 TCR 발현에 대한 유동 세포계수법에 의해 단리된다. 형질전환된 세포는 하기 자극 조건 중 임의의 것을 이용하여 RKO 종양 세포와 공동-배양될 수 있다: 없음, IL-2, 항-CD3/항-CD28 자기 비드, 또는 IL-2/항-CD3/항-CD28. 시험관내 RKO 세포 사멸은, 세포 사멸로 인한 형광 표지된 종양 세포의 손실을 측정하는 인큐사이트 생세포 검정에 의해 평가되었다.
생체내 연구를 위해, 자극된 T 세포를 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에게 전달한다. 체중 감소와 종양 용적을 기록하기 위해 마우스를 30일 동안 추적한다. 처리된 마우스를 비처리된 마우스 대조군 (군 1 및 4, 도 21(b)) 뿐만 아니라 현재 승인된 항체-기반 면역요법으로 처리된 실제적 대조군 (도 21(a))과 비교한다. 종양 성장에 있어서의 지연은 주요 연구 평가 항목으로서 정량화된다. 항-RKO TCR을 포함하는 T 세포로 처리된 동물은 항체-기반 면역요법으로 처리된 동물에서 관찰된 종양 성장에 있어서의 지연과 일치하거나 또는 그를 초과할 것으로 예상된다.
난소암. 인간 임상 PBMC 및 TIL 샘플은 절제된 종양 및/또는 환자 혈액으로부터 수집된다. 난소암 환자로부터 TCRα:β 라이브러리를 단리한다. 임상 PBMC 및/또는 TIL 샘플은 외과적 절제 및/또는 혈액 채취 후 수득된다. TCRα:β 클로닝은 J.RT3 T 세포로의 레트로바이러스 TCR 형질도입을 위해 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터 시스템을 사용하여 수행된다. J.RT3 세포는 내인성 TCR을 발현하지 않으며 TCR 발현을 위한 안정화 단백질 및 공동-발현 인자 (CD3 및 CD8 포함)를 제공하여, J.RT3를 TCR 디스플레이를 위한 이상적인 포유동물 숙주로 만든다. 천연적으로 쌍형성된 α:β 가변 영역 유전자는 상기 연결된 앰플리콘의 말단에 있는 제한 부위를 사용하여 pLVX 렌티바이러스 발현 벡터로 클로닝된다. 벡터 라이브러리를 이. 콜라이에서 증폭시키고, TCRα:β 발현 라이브러리를, 패키징 및 외피 벡터 (psPax2 및 pMD2.g)와 함께 HEK293T 세포로 공동-형질감염시켜 렌티바이러스 TCRα:β 형질도입 입자를 생성한다 (도 20).
B 세포 암. B 세포 계통 암은 TCR에 의해 표적화되는 종양-특이적 신생항원으로서 항체 유전자를 발현하는 림프종 및 다발성 골수종을 포함한다. 쌍형성된 TCRα:β 유전자 라이브러리는 B 세포 계통 암 환자로부터 단리된다. TCR 발현 플라스미드를 J.RT3 T 세포로 레트로바이러스 형질도입하기 위해 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터 시스템을 사용하여, 쌍형성된 TCRα:β 클로닝을 수행한다. J.RT3 세포는 내인성 TCR을 발현하지 않으며 안정한 TCR 발현에 필요한 안정화 단백질 및 공동-발현 인자 (CD3 및 CD8 포함)를 또한 제공하여, J.RT3를 TCR 라이브러리 디스플레이에 적합한 포유동물 숙주로 만든다. 천연적으로 쌍형성된 α:β 가변 영역 유전자는 상기 연결된 앰플리콘의 말단에 있는 제한 부위를 사용하여 pLVX 렌티바이러스 발현 벡터로 클로닝된다 (도 20에 제시된 바와 같음).
벡터 라이브러리는 안정한 렌티바이러스 플라스미드 복제를 위해 설계된 균주 (예를 들어, Stbl312)를 사용하여 이. 콜라이에 증폭시킨 다음, TCRα:β 발현 라이브러리를 패키징 및 외피 벡터 (psPax2 및 pMD2.g)와 함께 HEK293T 세포로 공동-형질감염시켜 렌티바이러스 TCRα:β 형질도입 입자를 생성한다. 이와 병행하여, 종양-특이적 BCR을 PBMC 임상 샘플로부터 시퀀싱한다. J.RT3 T 세포는 0.2 미만의 감염 다중도 (MOI)로 형질도입되어 (즉, 세포당 하나의 TCR 트랜스진) BCR 신생항원에 대한 TCR 결합을 검정한다. 형질도입된 세포는 환자-시퀀싱된 종양-코딩된 항체 유전자로부터의 CDR-H3 유래, CDR-L3 유래 및 체세포 돌연변이 유래 신생항원으로부터의 중첩 펩티드-MHC에 대항하여 스크리닝될 것이다.
일루미나 MiSeq 2x300 페어드-엔드 NGS 시스템은 라이브러리 다양성을 분석하고 클로닝 프로세스의 각각의 단계에서 Vβ 및 Vα 라이브러리를 특징규명하는데 사용된다 (즉, 투입 cDNA, 렌티바이러스 입자 생성 후, 및 표면 디스플레이된 TCR을 갖는 mCherry+ J.RT3/CD8 세포). 2x300 시퀀싱은 CDRα3 및 CDRβ3 영역의 전체 적용 범위를 허용한다. 고처리량 시퀀싱은 TCR 라이브러리가 상기 라이브러리 클로닝 프로세스 전반에 걸쳐 높은 다양성을 유지하고 있다는 것과, 포유동물 세포 상에 디스플레이된 ≥106개의 천연 TCRα:β가 생성될 것인지를 검증할 것이다. 펩티드:MHC 신생항원 스크리닝에 의해 발견된 TCRα:β는 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용하여 친화도에 대하여 시험된다. 이러한 결과는 본 기술의 TCR 라이브러리가 인간 환자에서 개인화된 항원-특이적 요법에 유용하다는 것을 입증해줄 것이다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 각각이 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
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등가물
본 기술은 본 기술의 개별 측면의 단일 예시로서 의도된 본 출원에 기재된 특정한 실시양태의 관점에서 제한되지 않아야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 기술의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 많은 변형 및 변이가 이루어질 수 있다. 본원에 열거된 것들에 더하여, 본 기술의 범주 내에서 기능적으로 동등한 방법 및 장치는 전술한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 변형 및 변이는 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하도록 의도된다. 본 기술은 첨부된 청구범위가 부여되는 등가물의 전체 범주와 함께, 그러한 청구범위의 관점에 의해서만 제한되어야 한다. 본 기술은 물론 다양할 수 있는 특정한 방법, 시약, 화합물 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한 본원에 사용된 전문 용어는 특정한 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
또한, 본 개시내용의 특징 또는 측면이 마쿠쉬(Markush) 군의 관점에서 설명되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한, 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 관점에서 설명된다는 것을 인식할 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 특히 서면 설명을 제공하는 것과 관련하여 임의의 및 모든 목적을 위해, 본원에 개시된 모든 범위는 또한, 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 그의 하위 범위의 조합을 포괄한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위를 최소한 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 세분화하여 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로서 쉽게 인식될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본원에서 논의된 각각의 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1 등으로 쉽게 나눌 수 있다. 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, "이하", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 나열된 수를 포함하며, 상기 논의된 바와 같이 후속적으로 하위 범위로 나눌 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 내지 3개의 세포를 갖는 군은 1, 2 또는 3개의 세포를 갖는 군을 지칭한다. 유사하게, 1 내지 5개의 세포를 갖는 군은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 세포 등을 갖는 군을 지칭한다.
본원에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은 본 명세서의 명시적인 교시와 일치하는 범위까지 모든 도면 및 표를 포함하여 그 전문이 참조로 포함된다.
본 기술은 다음 단락에 나열된 특징 및 특징의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 하기 단락은 본원에 첨부된 바와 같은 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되서는 안되거나 또는 이러한 모든 특징이 반드시 청구범위에 포함되어야만 하는 것으로 강압되서는 안된다:
A. 하기를 포함하는 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 라이브러리 벡터로서:
(a) 벡터 백본; 및
(b) (i) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는
(ii) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드;
여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내에 존재하는 단일 용해된 T 세포로부터 단리된 mRNA로부터 유래되는 것인
벡터.
B. 단일 용해된 T 세포의 mRNA가 mRNA 포획 시약 또는 역전사-PCR (RT-PCR)을 사용하여 단리되는 것인, 단락 A의 벡터.
C. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 임의적으로 링커 폴리뉴클레오티드를 통해 작동가능하게 연결되고, 임의적으로 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 T 세포 mRNA의 역전사 및 PCR 증폭에 의해 작동가능하게 연결되는 것인, 단락 A 또는 단락 B의 벡터.
D. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 TCR 유전자에서 천연적으로 발견되는 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위에서의 절단에 의해 벡터 백본 내로 클로닝된 것인, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
E. 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위가 낮은 빈도로 TCR 유전자에서 발생되는 것인, 단락 D의 벡터.
F. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 표 7 또는 8에 개시된 적어도 하나의 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위를 혼입하도록 변경된 것인, 단락 D 또는 단락 E의 벡터.
G. 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위가 침묵 돌연변이를 포함하는 것인, 단락 D-F 중 어느 하나의 벡터.
H. mRNA 포획 시약이 폴리(dT) 코팅된 비드, 올리고뉴클레오티드-코팅된 비드, 히드로겔 비드, 및 마이크로어레이 웰의 표면 상의 프린팅된 올리고로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단락 D-G 중 어느 하나의 벡터.
I. 구획이 에멀젼 액적 또는 웰인, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
J. 웰이 프린팅된 중합체 슬라이드, 플라스틱 플레이트, 미세역가 플레이트, 또는 겔 내에 위치하는 것인, 단락 I의 벡터.
K. 구획이 5 nL 이하의 용적을 갖는 것인, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
L. 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 발현 제어 요소를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
M. 발현 제어 요소가 프로모터, p2A 서열, 및 IRES 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단락 L의 벡터.
N. 프로모터가 EF1α 프로모터 또는 CMV 프로모터인, 단락 M의 벡터.
O. 발현 제어 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 위치하는 것인, 단락 L-N 중 어느 하나의 벡터.
P. 벡터가 원형화되는 것인, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
Q. 벡터가 발현 제어 요소의 벡터 내로의 혼입 전에 원형화된 것인, 단락 L-P 중 어느 하나의 벡터.
R. 벡터가 발현 제어 요소의 벡터 내로의 혼입 후에 원형화된 것인, 단락 L-P 중 어느 하나의 벡터.
S. 발현 제어 요소가 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 근처에 혼입된 것인, 단락 L-R 중 어느 하나의 벡터.
T. 발현 제어 요소가 제한 효소 또는 TALEN으로부터 선택된 DNA-변형 효소를 사용하여 벡터 내로 혼입된 것인, 단락 L-R 중 어느 하나의 벡터.
U. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에 연결된 트랜스포손을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
V. 검출가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
W. 선택가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
X. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 활성화를 제어하기 위한 스위치 메카니즘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
Y. 코작 컨센서스 서열 또는 인핸서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
Z. 벡터 백본이 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 벡터 백본으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
AA. 벡터가, 표적 세포 또는 질환 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 TCR을 코딩하는 것인, 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터.
BB. 표적 세포가 암 세포 또는 바이러스에 감염된 세포이며, 임의적으로 표적 세포가 대상체로부터 단리된 것인, 단락 AA의 벡터.
CC. 질환 항원이 바이러스 항원 또는 종양 항원이며, 임의적으로 항원이 항원:MHC 복합체 내로 로딩되는 것인, 단락 AA의 벡터.
DD. 질환 항원이 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원인, 단락 CC의 벡터.
EE. 질환 항원이 CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인 4, KIF20A, 렝신, 멜로에, 뮤신 5AC (MUC5AC), 서바이빈, 시클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAGE1b/GAGED2A, CD19, CD20, CD22, CD52, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 멤버 10a (TRAILR1), 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제 (RANKL), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), 및 암배아성 항원 (CEA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원인, 단락 CC의 벡터.
FF. 전술한 단락 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 재조합 세포로서, 임의적으로 박테리아 세포, 포유동물 세포, 또는 효모 세포인 재조합 세포.
GG. 단락 A-EE 중 어느 하나에 따른 복수개의 벡터를 포함하는 재조합 TCR 벡터 라이브러리.
HH. 복수개의 벡터가 TCR 레퍼토리를 포함하는 것인, 단락 GG의 재조합 TCR 벡터 라이브러리.
II. 복수개의 벡터 내의 각각의 벡터가 하기 특징: TCR 클로날 출현율, 시험관내 검정으로부터의 TCR 강화 특징, TCR 결합 특이성, TCR V 세그먼트 서열, TCR D 세그먼트 서열, TCR J 세그먼트 서열, TCR 유전자 모티프, 및/또는 CDR3 유전자 모티프 중 하나 이상을 기반으로 하여 선택된 것인, 단락 GG 또는 단락 HH의 재조합 TCR 벡터 라이브러리.
JJ. TCR 벡터 라이브러리가 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 핵산 시퀀싱에 의해 특징규명된 것인, 단락 GG-II 중 어느 하나의 재조합 TCR 벡터 라이브러리.
KK. 단락 A-EE 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 단리된 면역 세포.
LL. 면역 세포가 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 자연 살해 (NK) 세포인, 단락 KK의 단리된 면역 세포.
MM. 단락 A-EE 중 어느 하나의 벡터, 또는 단락 GG-JJ 중 어느 하나의 벡터 라이브러리를 포함하는 세포 집단.
NN. 집단이 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포를 포함하는 것인, 단락 MM의 세포 집단.
OO. 재조합 TCR 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 세포 집단을 단락 GG-JJ 중 어느 하나의 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법.
PP. 세포가 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 NK 세포인, 단락 OO의 방법.
QQ. 라이브러리를 표적 세포에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함하는, 단락 OO 또는 단락 PP의 방법.
RR. 표적 세포가 암 세포 또는 바이러스에 감염된 세포이며, 임의적으로 세포가 대상체로부터 단리된 것인, 단락 QQ의 방법.
SS. 라이브러리를 항원:MHC 복합체에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함하는, 단락 OO 또는 단락 PP의 방법.
TT. 항원:MHC 복합체의 항원이 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원인, 단락 SS의 방법.
UU. 항원:MHC 복합체의 항원이 CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인 4, KIF20A, 렝신, 멜로에, 뮤신 5AC (MUC5AC), 서바이빈, 시클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAGE1b/GAGED2A, CD19, CD20, CD22, CD52, EGFR, HER2, TRAILR1, RANKL, IGF1R, EpCAM, 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원인, 단락 SS의 방법.
VV. 라이브러리를 T 세포 표현형 마커에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함하는, 단락 OO-UU 중 어느 하나의 방법.
WW. 라이브러리를 공동-배양 시스템에서의 활성에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 공동-배양 시스템이 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 단락 OO-VV 중 어느 하나의 방법:
(a) 암 세포주;
(b) 공지된 바이러스에 감염된 복수개의 세포;
(c) 암 환자로부터 단리된 복수개의 종양 세포;
(d) 불멸화된 세포주; 또는
(e) 환자 조직 생검으로부터 유래된 복수개의 세포.
XX. 형질전환된 세포 집단의 시험관내 활성화를 추가로 포함하는, 단락 OO-WW 중 어느 하나의 방법.
YY. 시험관내 활성화가 하기 자극제: 항-CD3 항체, 항-CD8 항체, 항-CD27 항체, IL-2, IL-4, IL-21, 항-PD1 항체, 항-CTLA4 항체, 종양 세포 용해물, 바이러스 감염된 세포와의 세포성 공동-배양물, 및 종양 세포주 중 하나 이상을 사용하여 수행되는 것인, 단락 XX의 방법.
ZZ. 세포 집단을 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 것을 추가로 포함하는, 단락 OO-YY 중 어느 하나의 방법.
AAA. 전사 인자가 FOXP3, BLIMP-1, 이카로스, 헬리오스 및 TGF-베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단락 ZZ의 방법.
BBB. 하기 특징: TCR 클로날 출현율, 시험관내 검정으로부터의 TCR 강화 특징, TCR 결합 특이성, TCR V 세그먼트 서열, TCR D 세그먼트 서열, TCR J 세그먼트 서열, TCR 유전자 모티프, 및/또는 CDR3 유전자 모티프 중 하나 이상을 기반으로 하여 재조합 TCR 라이브러리에 포함시키기 위해 개별 벡터를 선택하는 것을 추가로 포함하는, 단락 OO-AAA 중 어느 하나의 방법.
CCC. 선택이 개별 벡터를 규정된 비로 혼합하여 합성적으로 유래된 TCR 라이브러리를 생성하는 것을 포함하는 것인, 단락 BBB의 방법.
DDD. 단락 OO-CCC 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 재조합 TCR 라이브러리.
EEE. 단락 DDD의 재조합 TCR 라이브러리 및 담체를 포함하는 조성물.
FFF. 담체가 제약상 허용되는 담체인, 단락 EEE의 조성물.
GGG. 치료를 필요로 하는 대상체에게 단락 DDD의 재조합 TCR 라이브러리 또는 단락 EEE 또는 단락 FFF의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
HHH. 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 단락 DDD의 재조합 TCR 라이브러리 또는 단락 EEE 또는 단락 FFF의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
III. 암이 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 부신피질 암종; AIDS-관련 암; 항문암; 충수암; 성상세포종; 비정형 기형양/횡문근양 종양, 뇌암; 피부의 기저 세포 암종; 담관암; 방광암; 골암; 유방암; 기관지 종양; 버킷 림프종; 카르시노이드 종양 (위장); 배세포 종양; 원발성 CNS 림프종; 자궁경부암; 담관암종; 척삭종; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 만성 골수성 백혈병 (CML); 만성 골수증식성 신생물; 결장직장암; 두개인두종; 피부 T-세포 림프종; 관 상피내 암종 (DCIS); 자궁내막암; 상의세포종; 식도암; 감각신경모세포종; 두개외 배세포 종양; 고환외 배세포 종양; 안암; 안내 흑색종; 망막모세포종; 난관암; 골의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종; 담낭암; 위암; 위장 카르시노이드 종양; 위장 기질 종양 (GIST); 배세포 종양; 임신성 영양막 질환; 모발상 세포 백혈병; 두경부암; 심장 종양; 간세포성암; 조직구증, 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종; 하인두암; 안내 흑색종; 섬 세포 종양, 췌장 신경내분비 종양; 신장암; 후두암; 백혈병; 구순 및 구강암; 간암; 폐암; 림프종; 남성 유방암; 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종; 흑색종; 메르켈 세포 암종; 중피종; 전이성 암; 구강암; 다발성 내분비 신생물 증후군; 다발성 골수종/형질 세포 신생물; 균상 식육종; 골수이형성 증후군, 골수증식성 신생물, 만성; 비인두암; 신경모세포종; 비-호지킨 림프종; 비소세포 폐암; 구강암, 구인두암; 골육종; 난소암; 췌장암; 췌장 신경내분비 종양; 유두종증; 부신경절종; 부비동암; 부갑상선암; 인두암; 크롬친화세포종; 뇌하수체 종양; 흉막폐 모세포종; 전립선암; 직장암; 재발성 암; 신세포암; 망막모세포종; 횡문근육종; 타액선암; 육종; 유잉 육종; 카포시 육종; 골육종; 자궁 육종; 세자리 증후군; 피부암; 소세포 폐암; 소장암; 연부 조직 육종; 피부의 편평 세포 암종; 편평 경부암; 위암; T 세포 림프종; 고환암; 인후암; 비인두암; 하인두암; 흉선 암종; 갑상선암; 요도암; 자궁암; 질암; 혈관 종양; 외음부암; 또는 윌름스 종양인, 단락 HHH의 방법.
JJJ. 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 단락 DDD의 재조합 TCR 라이브러리 또는 단락 EEE 또는 단락 FFF의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
KKK. 종양이 고형 종양인, 단락 JJJ의 방법.
LLL. 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 단락 DDD의 재조합 TCR 라이브러리 또는 단락 EEE 또는 단락 FFF의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법.
MMM. 바이러스 감염이 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발되는 것인, 단락 LLL의 방법.
NNN. 단락 DDD의 재조합 TCR 라이브러리 또는 단락 EEE 또는 단락 FFF의 조성물의 제2 용량을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 단락 GGG-MMM 중 어느 하나의 방법.
OOO. 재조합 TCR 라이브러리가 치료되는 대상체에 대해 자가이거나 또는 동종이계인 세포를 포함하는 것인, 단락 GGG-NNN 중 어느 하나의 방법.
PPP. 대상체가 인간, 동물, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 양, 마우스, 말 또는 소인, 단락 GGG-OOO 중 어느 하나의 방법.
QQQ. 대상체가 인간인, 단락 PPP의 방법.
다른 실시양태는 하기 청구범위 내에 제시된다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF KANSAS <120> TECHNIQUES FOR GENERATING CELL-BASED THERAPEUTICS USING RECOMBINANT T CELL RECEPTOR GENES <130> 104434-0179 <140> <141> <150> 62/637,240 <151> 2018-03-01 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 1 Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met 1 5 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 85 90 95 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 100 105 110 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 115 120 125 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<213> Woodchuck hepatitis virus <400> 17 gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg 60 ggcactgaca attccgtggt 80 <210> 18 <211> 592 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 18 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592 <210> 19 <211> 8904 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60 cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780 aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga 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gaaaacgttc 11400 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 11460 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 11520 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 11580 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 11640 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 11700 aaaagtgcca cctgacgtcg acggatcggg agatcaactt gtttattgca gcttataatg 11760 gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 11820 ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc aactggataa 11880 ctcaagctaa ccaaaatcat cccaaacttc ccaccccata ccctattacc actgccaatt 11940 acctgtggtt tcatttactc taaacctgtg attcctctga attattttca ttttaaagaa 12000 attgtatttg ttaaatatgt actacaaact tagtagt 12037 <210> 24 <211> 12037 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60 cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780 aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840 aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900 caagcaggga 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ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 11040 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 11100 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 11160 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 11220 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 11280 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 11340 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 11400 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 11460 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 11520 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 11580 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 11640 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 11700 aaaagtgcca cctgacgtcg acggatcggg agatcaactt gtttattgca gcttataatg 11760 gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 11820 ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc aactggataa 11880 ctcaagctaa ccaaaatcat cccaaacttc ccaccccata ccctattacc actgccaatt 11940 acctgtggtt tcatttactc taaacctgtg attcctctga attattttca ttttaaagaa 12000 attgtatttg ttaaatatgt actacaaact tagtagt 12037 <210> 25 <211> 12031 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60 cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tctctggcta 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gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2220 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280 ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2640 acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700 gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 2760 tccatagaag acaccgactc tactagagga tctatttccg gtgaattcgc caccatggcc 2820 tccctgctct tcttctgtgg ggccttttat ctcctgggaa ccggttccat ggaagctgac 2880 atctaccaga ccccaagata ccttgttata gggacaggaa agaagatcac tctggaatgt 2940 tctcaaacca tgggccatga caaaatgtac tggtatcaac aagatccagg aatggaacta 3000 cacctcatcc actattccta tggagttaat 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gccaggggtc agatatccac 120 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780 aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840 aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900 caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca 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cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780 aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840 aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900 caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960 gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 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ttaagaatag tttttgctgt 1860 actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920 cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980 cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040 gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100 aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160 acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2220 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280 ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2640 acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 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cgtatggctt tcattttctc 6060 ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca 6120 acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac 6180 cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact 6240 catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc 6300 cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg 6360 gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc 6420 ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac 6480 gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt aattctgcag tcgagaccta 6540 gaaaaacatg gagcaatcac aagtagcaat acagcagcta ccaatgctga ttgtgcctgg 6600 ctagaagcac aagaggagga ggaggtgggt tttccagtca cacctcaggt acctttaaga 6660 ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa gaggggactg 6720 gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatatccttg atctgtggat ctaccacaca 6780 caaggctact tccctgatta gcagaactac acaccagggc caggggtcag atatccactg 6840 acctttggat ggtgctacaa gctagtacca gttgagccag 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Met 50 55 60 Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala 65 70 75 80 Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu 85 90 95 Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His 100 105 110 Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met 115 120 125 Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys 130 135 140 Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp 145 150 155 160 Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala 165 170 175 Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro 180 185 190 Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe 195 200 205 Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu 210 215 220 Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln 225 230 235 240 Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met 245 250 255 Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val 260 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Met Asp Met Glu Asp Ala Asp Met Thr Leu 35 40 45 Trp Thr Glu Ala Glu Phe Glu Glu Lys Cys Thr Tyr Ile Val Asn Asp 50 55 60 His Pro Trp Asp Ser Gly Ala Asp Gly Gly Thr Ser Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Ala Ser Leu Pro Arg Asn Leu Leu Phe Lys Tyr Ala Thr Asn Ser Glu 85 90 95 Glu Val Ile Gly Val Met Ser Lys Glu Tyr Ile Pro Lys Gly Thr Arg 100 105 110 Phe Gly Pro Leu Ile Gly Glu Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Val Pro Lys 115 120 125 Asn Ala Asn Arg Lys Tyr Phe Trp Arg Ile Tyr Ser Arg Gly Glu Leu 130 135 140 His His Phe Ile Asp Gly Phe Asn Glu Glu Lys Ser Asn Trp Met Arg 145 150 155 160 Tyr Val Asn Pro Ala His Ser Pro Arg Glu Gln Asn Leu Ala Ala Cys 165 170 175 Gln Asn Gly Met Asn Ile Tyr Phe Tyr Thr Ile Lys Pro Ile Pro Ala 180 185 190 Asn Gln Glu Leu Leu Val Trp Tyr Cys Arg Asp Phe Ala Glu Arg Leu 195 200 205 His Tyr Pro Tyr Pro Gly Glu Leu Thr Met Met Asn Leu Thr Gln Thr 210 215 220 Gln Ser Ser Leu Lys Gln Pro Ser Thr Glu Lys Asn Glu Leu Cys Pro 225 230 235 240 Lys Asn Val Pro Lys Arg Glu Tyr Ser Val Lys Glu Ile Leu Lys Leu 245 250 255 Asp Ser Asn Pro Ser Lys Gly Lys Asp Leu Tyr Arg Ser Asn Ile Ser 260 265 270 Pro Leu Thr Ser Glu Lys Asp Leu Asp Asp Phe Arg Arg Arg Gly Ser 275 280 285 Pro Glu Met Pro Phe Tyr Pro Arg Val Val Tyr Pro Ile Arg Ala Pro 290 295 300 Leu Pro Glu Asp Phe Leu Lys Ala Ser Leu Ala Tyr Gly Ile Glu Arg 305 310 315 320 Pro Thr Tyr Ile Thr Arg Ser Pro Ile Pro Ser Ser Thr Thr Pro Ser 325 330 335 Pro Ser Ala Arg Ser Ser Pro Asp Gln Ser Leu Lys Ser Ser Ser Pro 340 345 350 His Ser Ser Pro Gly Asn Thr Val Ser Pro Val Gly Pro Gly Ser Gln 355 360 365 Glu His Arg Asp Ser Tyr Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Tyr Gly Thr Glu 370 375 380 Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Gly Tyr Ala Pro Leu Pro His Leu Pro Pro 385 390 395 400 Ala Phe Ile Pro Ser Tyr Asn Ala His Tyr Pro Lys Phe Leu Leu Pro 405 410 415 Pro Tyr Gly Met Asn Cys Asn Gly Leu Ser Ala Val Ser Ser Met Asn 420 425 430 Gly Ile Asn Asn Phe Gly Leu Phe Pro Arg Leu Cys Pro Val Tyr Ser 435 440 445 Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser Leu Pro His Pro Met Leu Asn Pro Thr 450 455 460 Ser Leu Pro Ser Ser Leu Pro Ser Asp Gly Ala Arg Arg Leu Leu Gln 465 470 475 480 Pro Glu His Pro Arg Glu Val Leu Val Pro Ala Pro His Ser Ala Phe 485 490 495 Ser Phe Thr Gly Ala Ala Ala Ser Met Lys Asp Lys Ala Cys Ser Pro 500 505 510 Thr Ser Gly Ser Pro Thr Ala Gly Thr Ala Ala Thr Ala Glu His Val 515 520 525 Val Gln Pro Lys Ala Thr Ser Ala Ala Met Ala Ala Pro Ser Ser Asp 530 535 540 Glu Ala Met Asn Leu Ile Lys Asn Lys Arg Asn Met Thr Gly Tyr Lys 545 550 555 560 Thr Leu Pro Tyr Pro Leu Lys Lys Gln Asn Gly Lys Ile Lys Tyr Glu 565 570 575 Cys Asn Val Cys Ala Lys Thr Phe Gly Gln Leu Ser Asn Leu Lys Val 580 585 590 His Leu Arg Val His Ser Gly Glu Arg Pro Phe Lys Cys Gln Thr Cys 595 600 605 Asn Lys Gly Phe Thr Gln Leu Ala His Leu Gln Lys His Tyr Leu Val 610 615 620 His Thr Gly Glu Lys Pro His Glu Cys Gln Val Cys His Lys Arg Phe 625 630 635 640 Ser Ser Thr Ser Asn Leu Lys Thr His Leu Arg Leu His Ser Gly Glu 645 650 655 Lys Pro Tyr Gln Cys Lys Val Cys Pro Ala Lys Phe Thr Gln Phe Val 660 665 670 His Leu Lys Leu His Lys Arg Leu His Thr Arg Glu Arg Pro His Lys 675 680 685 Cys Ser Gln Cys His Lys Asn Tyr Ile His Leu Cys Ser Leu Lys Val 690 695 700 His Leu Lys Gly Asn Cys Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gly Leu Pro Leu 705 710 715 720 Glu Asp Leu Thr Arg Ile Asn Glu Glu Ile Glu Lys Phe Asp Ile Ser 725 730 735 Asp Asn Ala Asp Arg Leu Glu Asp Val Glu Asp Asp Ile Ser Val Ile 740 745 750 Ser Val Val Glu Lys Glu Ile Leu Ala Val Val Arg Lys Glu Lys Glu 755 760 765 Glu Thr Gly Leu Lys Val Ser Leu Gln Arg Asn Met Gly Asn Gly Leu 770 775 780 Leu Ser Ser Gly Cys Ser Leu Tyr Glu Ser Ser Asp Leu Pro Leu Met 785 790 795 800 Lys Leu Pro Pro Ser Asn Pro Leu Pro Leu Val Pro Val Lys Val Lys 805 810 815 Gln Glu Thr Val Glu Pro Met Asp Pro 820 825 <210> 33 <211> 390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala 35 40 45 Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu 85 90 95 Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu 100 105 110 Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr 115 120 125 His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val 130 135 140 Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn 165 170 175 Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser 180 185 190 Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu 195 200 205 Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser 210 215 220 Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr 225 230 235 240 Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro 245 250 255 Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln 260 265 270 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser 275 280 285 Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys 290 295 300 Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn 305 310 315 320 Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr 325 330 335 Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala 340 345 350 Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 355 360 365 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val 370 375 380 Arg Ser Cys Lys Cys Ser 385 390 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 cgcagtagcg gtaaacggcg atgctgaagt crcmcagact cc 42 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 cgcagtagcg gtaaacggcg atgcwgmtgt twcccagac 39 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 cgcagtagcg gtaaacggcg acactgragt yacscagaca cc 42 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 cgcagtagcg gtaaacggcg aggctggagt cachcaaas 39 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 cgcagtagcg gtaaacggcg agcctggwgt casycagac 39 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 cgcagtagcg gtaaacggcg gtgctggagt ykcccagw 38 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 cgcagtagcg gtaaacggcg atgctgrrat cacccagr 38 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 cgcagtagcg gtaaacggcg aagctgaagt tgcccagtc 39 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 cgcagtagcg gtaaacggcg atgctggagt yatccagtc 39 <210> 43 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 cgcagtagcg gtaaacggcg aagctggagt krytcagt 38 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 cgcagtagcg gtaaacggcg atgccatggt catccagaa 39 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 cgcagtagcg gtaaacggca atgccggcgt catgcagaa 39 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 cgcagtagcg gtaaacggcg atggtggaat cactcagtc 39 <210> 47 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 cgcagtagcg gtaaacggca gtgctgtcrt ctctcaama 39 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 cgcagtagcg gtaaacggcg aagctgacat ctaccagac 39 <210> 49 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 cgcagtagcg gtaaacggcg atgtgaaagt racccagarc yc 42 <210> 50 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 cgcagtagcg gtaaacggca cactccaggc acagagata 39 <210> 51 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 tgctaaaacg ctagctgctg gttcgtcgac caaggcagta tctggagtca ttgag 55 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 cgcagtagcg gtaaacggc 19 <210> 53 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 ccagcagcta gcgttttagc aggacaaarc mttgascagc c 41 <210> 54 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 ccagcagcta gcgttttagc aaaggaccaa gtgtttcagc c 41 <210> 55 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 ccagcagcta gcgttttagc agctcagtca gtgrcycagc c 41 <210> 56 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 ccagcagcta gcgttttagc agatgctaag accacmcagc c 41 <210> 57 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 ccagcagcta gcgttttagc aagaaaasaw stggagcaga gtc 43 <210> 58 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 ccagcagcta gcgttttagc aagccaaaag atagaacaga a 41 <210> 59 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 ccagcagcta gcgttttagc agaaaaccag gtggagcaca g 41 <210> 60 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 ccagcagcta gcgttttagc agcccagtck gtgasccagc w 41 <210> 61 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 ccagcagcta gcgttttagc aggaaattca gtgryccaga y 41 <210> 62 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 ccagcagcta gcgttttagc acagaaggag gtggagcagr atyc 44 <210> 63 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 ccagcagcta gcgttttagc aggagagart gtggrgcwgc a 41 <210> 64 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 ccagcagcta gcgttttagc agcccagaag rtwactcaar c 41 <210> 65 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 ccagcagcta gcgttttagc agcccagasa gtsactcagy c 41 <210> 66 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 ccagcagcta gcgttttagc aagtcaacag ggagaagagg a 41 <210> 67 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 ccagcagcta gcgttttagc aggagactcg gttacccaga c 41 <210> 68 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 ccagcagcta gcgttttagc aaaacaggag gtgacgcaga ktcc 44 <210> 69 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 ccagcagcta gcgttttagc aggccaacag aaggagaaaa g 41 <210> 70 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 ccagcagcta gcgttttagc agagctgaam gtggaacaaa r 41 <210> 71 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 ccagcagcta gcgttttagc aggacaacag gtaatgcaaa t 41 <210> 72 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 ccagcagcta gcgttttagc aacccagctg ctggagcaga g 41 <210> 73 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 ccagcagcta gcgttttagc aagtcaacag aagaatgatg a 41 <210> 74 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 ccagcagcta gcgttttagc acaacaacca gtgcagagtc c 41 <210> 75 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 ccagcagcta gcgttttagc aggtcaacag ctgaatcaga g 41 <210> 76 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 ccagcagcta gcgttttagc agaagacaag gtggtacaaa g 41 <210> 77 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 ccagcagcta gcgttttagc aagcaattca gtcaagcaga c 41 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 cgaccagctt gacatcacag 20 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <400> 79 Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu 1 5

Claims (69)

  1. 하기를 포함하는 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 라이브러리 벡터로서:
    (a) 벡터 백본; 및
    (b) (i) TCRα 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는
    (ii) TCRγ 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRδ 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드;
    여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동족 쌍이고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 특정 구획 내에 존재하는 단일 용해된 T 세포로부터 단리된 mRNA로부터 유래되는 것인
    벡터.
  2. 제1항에 있어서, 단일 용해된 T 세포의 mRNA가 mRNA 포획 시약 또는 역전사-PCR (RT-PCR)을 사용하여 단리되는 것인 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 임의적으로 링커 폴리뉴클레오티드를 통해 작동가능하게 연결되고, 임의적으로 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 T 세포 mRNA의 역전사 및 PCR 증폭에 의해 작동가능하게 연결되는 것인 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가, TCR 유전자에서 천연적으로 발견되는 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위에서의 절단에 의해 벡터 백본 내로 클로닝된 것인 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위가 낮은 빈도로 TCR 유전자에서 발생되는 것인 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 표 7 또는 8에 개시된 적어도 하나의 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위를 혼입하도록 변경된 것인 벡터.
  7. 제4항에 있어서, 표적 제한 엔도뉴클레아제 부위가 침묵 돌연변이를 포함하는 것인 벡터.
  8. 제2항에 있어서, mRNA 포획 시약이 폴리(dT) 코팅된 비드, 올리고뉴클레오티드-코팅된 비드, 히드로겔 비드, 및 마이크로어레이 웰의 표면 상의 프린팅된 올리고로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 구획이 에멀젼 액적 또는 웰인 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 웰이 프린팅된 중합체 슬라이드, 플라스틱 플레이트, 미세역가 플레이트, 또는 겔 내에 위치하는 것인 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 구획이 5 nL 이하의 용적을 갖는 것인 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 발현 제어 요소를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 발현 제어 요소가 프로모터, p2A 서열, 및 IRES 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 프로모터가 EF1α 프로모터 또는 CMV 프로모터인 벡터.
  15. 제12항에 있어서, 발현 제어 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 위치하는 것인 벡터.
  16. 제1항에 있어서, 벡터가 원형화되는 것인 벡터.
  17. 제12항에 있어서, 벡터가 발현 제어 요소의 벡터 내로의 혼입 전에 원형화된 것인 벡터.
  18. 제12항에 있어서, 벡터가 발현 제어 요소의 벡터 내로의 혼입 후에 원형화된 것인 벡터.
  19. 제12항에 있어서, 발현 제어 요소가 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 근처에 혼입된 것인 벡터.
  20. 제12항에 있어서, 발현 제어 요소가 제한 효소 또는 TALEN으로부터 선택된 DNA-변형 효소를 사용하여 벡터 내로 혼입된 것인 벡터.
  21. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에 연결된 트랜스포손을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 벡터.
  22. 제1항에 있어서, 검출가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 벡터.
  23. 제1항에 있어서, 선택가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 벡터.
  24. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 활성화를 제어하기 위한 스위치 메카니즘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 벡터.
  25. 제1항에 있어서, 코작 컨센서스 서열 또는 인핸서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 벡터.
  26. 제1항에 있어서, 벡터 백본이 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 벡터 백본으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  27. 제1항에 있어서, 벡터가 표적 세포 또는 질환 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 TCR을 코딩하는 것인 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 표적 세포가 암 세포 또는 바이러스에 감염된 세포이며, 임의적으로 표적 세포가 대상체로부터 단리된 것인 벡터.
  29. 제27항에 있어서, 질환 항원이 바이러스 항원 또는 종양 항원이며, 임의적으로 항원이 항원:MHC 복합체 내로 로딩되는 것인 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 질환 항원이 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원인 벡터.
  31. 제29항에 있어서, 질환 항원이 CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인 4, KIF20A, 렝신, 멜로에, 뮤신 5AC (MUC5AC), 서바이빈, 시클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAGE1b/GAGED2A, CD19, CD20, CD22, CD52, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 멤버 10a (TRAILR1), 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제 (RANKL), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), 및 암배아성 항원 (CEA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원인 벡터.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 재조합 세포로서, 임의적으로 박테리아 세포, 포유동물 세포, 또는 효모 세포인 재조합 세포.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 복수개의 벡터를 포함하는 재조합 TCR 벡터 라이브러리.
  34. 제33항에 있어서, 복수개의 벡터가 TCR 레퍼토리를 포함하는 것인 재조합 TCR 벡터 라이브러리.
  35. 제33항에 있어서, 복수개의 벡터 내의 각각의 벡터가 하기 특징: TCR 클로날 출현율, 시험관내 검정으로부터의 TCR 강화 특징, TCR 결합 특이성, TCR V 세그먼트 서열, TCR D 세그먼트 서열, TCR J 세그먼트 서열, TCR 유전자 모티프, 및/또는 CDR3 유전자 모티프 중 하나 이상을 기반으로 하여 선택된 것인 재조합 TCR 벡터 라이브러리.
  36. 제33항에 있어서, 재조합 TCR 벡터 라이브러리가 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 핵산 시퀀싱에 의해 특징규명된 것인 재조합 TCR 벡터 라이브러리.
  37. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 단리된 면역 세포.
  38. 제37항에 있어서, 면역 세포가 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 자연 살해 (NK) 세포인 단리된 면역 세포.
  39. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항의 벡터 라이브러리를 포함하는 세포 집단.
  40. 제39항에 있어서, 집단이 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포를 포함하는 것인 세포 집단.
  41. 재조합 TCR 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 세포 집단을 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항의 벡터 라이브러리로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포가 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 NK 세포인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 라이브러리를 표적 세포에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 표적 세포가 암 세포 또는 바이러스에 감염된 세포이며, 임의적으로 세포가 대상체로부터 단리된 것인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 라이브러리를 항원:MHC 복합체에의 특이적 결합에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 항원:MHC 복합체의 항원이 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 항원:MHC 복합체의 항원이 CD45, 글리피칸-3, IGF2B3, 칼리크레인 4, KIF20A, 렝신, 멜로에, 뮤신 5AC (MUC5AC), 서바이빈, 시클린-A1, MAGE-A1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAGE1b/GAGED2A, CD19, CD20, CD22, CD52, EGFR, HER2, TRAILR1, RANKL, IGF1R, EpCAM, 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원인 방법.
  48. 제41항에 있어서, 라이브러리를 T 세포 표현형 마커에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  49. 제41항에 있어서, 라이브러리를 공동-배양 시스템에서의 활성에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 공동-배양 시스템이 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
    (a) 암 세포주;
    (b) 공지된 바이러스에 감염된 복수개의 세포;
    (c) 암 환자로부터 단리된 복수개의 종양 세포;
    (d) 불멸화된 세포주; 또는
    (e) 환자 조직 생검으로부터 유래된 복수개의 세포.
  50. 제41항에 있어서, 형질전환된 세포 집단의 시험관내 활성화를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 시험관내 활성화가 하기 자극제: 항-CD3 항체, 항-CD8 항체, 항-CD27 항체, IL-2, IL-4, IL-21, 항-PD1 항체, 항-CTLA4 항체, 종양 세포 용해물, 바이러스 감염된 세포와의 세포성 공동-배양물, 및 종양 세포주 중 하나 이상을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  52. 제41항에 있어서, 세포 집단을 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 전사 인자가 FOXP3, BLIMP-1, 이카로스, 헬리오스 및 TGF-베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제41항에 있어서, 하기 특징: TCR 클로날 출현율, 시험관내 검정으로부터의 TCR 강화 특징, TCR 결합 특이성, TCR V 세그먼트 서열, TCR D 세그먼트 서열, TCR J 세그먼트 서열, TCR 유전자 모티프, 및/또는 CDR3 유전자 모티프 중 하나 이상을 기반으로 하여 재조합 TCR 라이브러리에 포함시키기 위해 개별 벡터를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 선택이 개별 벡터를 규정된 비로 혼합하여 합성적으로 유래된 TCR 라이브러리를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  56. 제41항에 따른 방법에 의해 제조된 재조합 TCR 라이브러리.
  57. 제56항의 재조합 TCR 라이브러리 및 담체를 포함하는 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 담체가 제약상 허용되는 담체인 조성물.
  59. 치료를 필요로 하는 대상체에게 제56항의 재조합 TCR 라이브러리 또는 제57항 또는 제58항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
  60. 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 제56항의 재조합 TCR 라이브러리 또는 제57항 또는 제58항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 암이 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 부신피질 암종; AIDS-관련 암; 항문암; 충수암; 성상세포종; 비정형 기형양/횡문근양 종양, 뇌암; 피부의 기저 세포 암종; 담관암; 방광암; 골암; 유방암; 기관지 종양; 버킷 림프종; 카르시노이드 종양 (위장); 배세포 종양; 원발성 CNS 림프종; 자궁경부암; 담관암종; 척삭종; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 만성 골수성 백혈병 (CML); 만성 골수증식성 신생물; 결장직장암; 두개인두종; 피부 T-세포 림프종; 관 상피내 암종 (DCIS); 자궁내막암; 상의세포종; 식도암; 감각신경모세포종; 두개외 배세포 종양; 고환외 배세포 종양; 안암; 안내 흑색종; 망막모세포종; 난관암; 골의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종; 담낭암; 위암; 위장 카르시노이드 종양; 위장 기질 종양 (GIST); 배세포 종양; 임신성 영양막 질환; 모발상 세포 백혈병; 두경부암; 심장 종양; 간세포성암; 조직구증, 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종; 하인두암; 안내 흑색종; 섬 세포 종양, 췌장 신경내분비 종양; 신장암; 후두암; 백혈병; 구순 및 구강암; 간암; 폐암; 림프종; 남성 유방암; 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종; 흑색종; 메르켈 세포 암종; 중피종; 전이성 암; 구강암; 다발성 내분비 신생물 증후군; 다발성 골수종/형질 세포 신생물; 균상 식육종; 골수이형성 증후군, 골수증식성 신생물, 만성; 비인두암; 신경모세포종; 비-호지킨 림프종; 비소세포 폐암; 구강암, 구인두암; 골육종; 난소암; 췌장암; 췌장 신경내분비 종양; 유두종증; 부신경절종; 부비동암; 부갑상선암; 인두암; 크롬친화세포종; 뇌하수체 종양; 흉막폐 모세포종; 전립선암; 직장암; 재발성 암; 신세포암; 망막모세포종; 횡문근육종; 타액선암; 육종; 유잉 육종; 카포시 육종; 골육종; 자궁 육종; 세자리 증후군; 피부암; 소세포 폐암; 소장암; 연부 조직 육종; 피부의 편평 세포 암종; 편평 경부암; 위암; T 세포 림프종; 고환암; 인후암; 비인두암; 하인두암; 흉선 암종; 갑상선암; 요도암; 자궁암; 질암; 혈관 종양; 외음부암; 또는 윌름스 종양인 방법.
  62. 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 제56항의 재조합 TCR 라이브러리 또는 제57항 또는 제58항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 종양이 고형 종양인 방법.
  64. 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제56항의 재조합 TCR 라이브러리 또는 제57항 또는 제58항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 바이러스 감염이 아데노바이러스, CMV, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 뎅기 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 엔테로바이러스 71 (EV71), 에볼라 바이러스, A형 간염 (HAV), B형 간염 (HBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), C형 간염 (HCV), D형 간염 (HDV), E형 간염 (HEV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 일본 뇌염, 백혈병 바이러스, 홍역 바이러스, 전염성 연속종, orf 바이러스, 파르보바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, 진드기-매개 뇌염 (TBEV), 유인원 면역결핍 바이러스, 담배 식각 바이러스 (TEV), 수두 대상포진 바이러스, 두창, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 치쿤군야 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발되는 것인 방법.
  66. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제56항의 재조합 TCR 라이브러리 또는 제57항 또는 제58항의 조성물의 제2 용량을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  67. 제59항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 TCR 라이브러리가 치료되는 대상체에 대해 자가이거나 또는 동종이계인 세포를 포함하는 것인 방법.
  68. 제59항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간, 동물, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 양, 마우스, 말 또는 소인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
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