KR20210003782A

KR20210003782A - 막 단백질의 제조 공정

Info

Publication number: KR20210003782A
Application number: KR1020207031915A
Authority: KR
Inventors: 스콧 트레븐 마이어스; 토르스텐 회이바이 박 레게이라; 레나 마리아 탄 엘링스가드; 사이몬 링가 크라베
Original assignee: 아쿠아포린 에이에스
Priority date: 2018-04-06
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2021-01-12
Also published as: US20210147477A1; JP2021519800A; BR112020020379A2; AU2019249933A1; SG11202009521YA; WO2019193139A1; RU2020136185A; IL277565A; EP3774842A1; JP2023182713A; MX2020010393A; CN112189016A; CA3095674A1

Abstract

수성 배지에 존재하는 숙주 유기체에서 막 단백질을 발현하는 단계, 숙주 유기체로부터 막 단백질을 유리시키는 단계, 세제 용액을 첨가하여 막 단백질을 용해시키는 단계, 용해된 막 단백질의 액체 분획을 회수하는 단계, 액체 분획을 크로마토그래피로 처리하여 고정상에 막 단백질을 결합하거나 보유하는 단계, 용출 완충액으로 고정상을 용리하여 막 단백질을 생성하는 단계를 포함하는 막 단백질의 생산 공정이 개시된다. 이 공정은 최종 산물의 품질을 손상시키지 않고 효율적인 방식으로 비교적 많은 양의 막 단백질을 생산할 수 있다.

Description

막 단백질의 제조 공정

본 발명은 막 단백질의 제조 공정에 관한 것이다. 본 발명에 따른 공정은 다량의 막 단백질을 제조하는 산업적 적용에 적합하다. 따라서 본 공정은 적어도 파일럿 플랜트 제조에 적합한 단위 조작을 적용하는 것을 목표로 한다. 특히, 본 발명은 초원심분리기를 피하는 것을 목적으로 한다.

인간 게놈에 있는 유전자의 약 1/3이 막 단백질을 암호화한다. 막 단백질은 에너지 변환, 세포 신호 전달, 세포-세포 상호 작용, 세포 접착, 세포 이동, 단백질 수송, 바이러스 융합, 신경 시냅스 활동 및 이온과 대사 산물 운송을 포함하는 중요한 많은 세포 활동에서 역할을 한다. 막 단백질은 세포막의 지질 이중 층에 내장되어 있으며 소수성 부분과 친수성 부분으로 구성된다.

최근 막 단백질은 다공성 구조 지지층에 접목된 박막 복합층에 성공적으로 혼입되었다. 또한, 막 단백질은 세포 생물학 및 단백질 생화학과 관련하여 중요한 약학적 표적 및 흥미로운 연구 주제를 대표한다.　따라서 막 단백질에 대한 파일럿 플랜트 또는 대규모 제조의 필요성이 있다.

WO2017137361(A1)호는 아쿠아포린 수분 통로(AQP: aquaporin water channel)와 폴리알킬렌이민(PAI)과 같은 막횡단 단백질 사이에 형성된 자기조립 나노 구조를 개시한다. 자기조립 나노 구조는 이후 다공성 지지막에 접목된 박막 복합(TFC: thin film composite) 막에 혼입된다. 다공성 지지막은 역삼투 또는 정삼투를 위한 중공사, 평판(flat sheet), 나선형 권취 막 등일 수 있다.

WO2013/043118호는 아쿠아포린 수분 통로(AQP)가 막의 활성층에 혼입된 박막 복합(TFC) 막을 개시한다. 또한, 상기 호는 박막 복합체 막의 제조 방법과 나노여과 및 삼투여과 공정과 같은 여과 공정에서 박막 복합체 막의 용도를 개시하고 있다. TFC 막은 TFC 활성층에 혼입된 지질-AQP/공중합체-AQP 소포를 포함한다. WO2010/146365호는 고정화된 AQP를 혼입하기 위한 소포 형성 물질로서 양친매성 삼중 블록 공중합체를 사용하는 TFC-아쿠아포린-Z(AqpZ)의 여과막의 제조를 기술하고 있다.

WO2014/108827호는 아쿠아포린 수분 통로가 TFC 층 내로 혼입되기 전에 소포에 혼입된 아쿠아포린 수분 통로를 포함하는 박막 복합체(TFC) 층으로 개질된 섬유를 갖는 중공사(HF: hollow fiber) 모듈을 개시하고 있다.

세포로부터 다량의 막 단백질을 분리하기 위한 산업적 방법은 일반적으로 당업자에게 이용이 가능하지 않다. 선행 기술에서는 연구 목적을 위해 비교적 소량의 막 단백질을 제조하는 데 초점을 맞추었다. 따라서 비교적 번거롭고 노동 집약적인 제조 방법이 허용되었다. 그러나 최근 역삼투와 정삼투용 산업용 막의 막 단백질에 대한 요구가 증가하면서 더 효율적인 제조 방법에 대한 필요성이 분명해졌다. 본 발명의 목적은 최종 산물의 품질을 손상시키지 않으면서 효율적인 방식으로 비교적 많은 양의 막 단백질을 제조할 수 있는 막 단백질의 제조 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 최종 산물의 품질을 손상시키지 않고 효율적인 방식으로 비교적 많은 양의 막 단백질을 생산하기 위한 막 단백질의 제조 공정을 제공하는 것이다.

본 발명은 막 단백질의 제조 공정에 관한 것으로 다음 단계들을 포함한다.

a. 수성 배지에 존재하는 숙주 유기체에서 막 단백질을 발현하는 단계;

b. 숙주 유기체로부터 상기 막 단백질을 유리시키는 단계;

c. 상기 막 단백질을 용해시키기 위해 세제 용액을 첨가하는 단계;

d. 원심분리에 의해 가용화된 막 단백질의 액체 분획을 상청액으로 회수하는 단계;

e. 상기 액체 분획을 크로마토그래피에 적용하여 고정상에서 상기 막 단백질을 결합하거나 보유하는 단계; 및

f. 상기 막 단백질을 제조하기 위해 용출 완충액으로 상기 고정상을 용리하는 단계를 포함하며,

단계 d의 원심분리는 500g 내지 30,000g에서 수행된다.

본 공정은 숙주 유기체를 포함하는 다량의 수성 배지를 처리할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 이 공정은 파일럿 플랜트 또는 본격적인 제조에 적합한 100L 이상의 적용 단위 작업과 같이 50L 이상의 양을 처리할 수 있다. 또한, 본 공정은 확장이 가능하며 숙주 유기체를 포함하는 다량의 수성 배지에 쉽게 적용할 수 있다.

놀랍게도 숙주 유기체에 의해 발현된 막 단백질은 세제 용액이 첨가될 때 다른 단백질보다 더 높은 정도로 용해된다는 것이 발명자들에 의해 발견되었다. 세제 용액에 의해 형성된 소포에 있는 단백질의 약 60% 이상이 관심 있는 막 단백질로 추정된다. 또한, 세제로 형성된 소포의 크기가 평소보다 더 큰 0.5㎛ 정도의 크기로 관찰되어 막 단백질이 자연적으로 사용되는 인광 지질보다 세제와 함께 더 안정적인 수퍼 형태를 형성함을 시사한다.

숙주 유기체를 포함하는 수성 배지는 공정에서 직접 사용될 수 있다. 그러나, 더 깨끗한 제품을 얻고 과량의 수성 배지 취급을 피하기 위해, 일반적으로 단계 a의 숙주 유기체를 포함하는 수성 배지는 단계 b에 따른 막 단백질의 유리 전에 여과된다.

일반적으로, 숙주 유기체를 포함하는 수성 배지는 기공이 세포 파편과 배지가 통과할 수 있을 만큼 충분히 작은 필터를 통해 여과함으로써 상향 농축되는 반면, 세포는 유지된다. 적합한 실시예에서, 단계 a의 숙주 유기체를 포함하는 수성 배지는 기공의 지름이 0.5 마이크로 미터 이하인 정밀 여과막을 통해 여과된다. 바람직하게는 기공의 지름은 0.1㎛ 이하이다.

정밀 여과에 의해 적절하게 수행되는 여과 단계 후, 숙주 유기체는 나머지 수성 배지로부터 분리될 수 있다. 여러 분리 공정이 가능하지만, 일반적으로 숙주 유기체를 포함하는 수성 배지의 원심분리에 의한 여과 후에 숙주 유기체를 분리하는 것이 바람직하다. 원심분리 공정은 일반적으로 적절한 시간 내에 펠렛(pellet)을 형성하는 중력에서 수행된다. 따라서 원심분리는 통상 500g 이상, 예컨대 1000g 이상, 바람직하게는 2000g 이상에서 수행된다. 펠렛의 밀도는 이후 단계에서 어려움을 방지하기 위해 너무 높으면 안 된다. 따라서, 원심분리는 일반적으로 30,000g 이상, 예컨대 20,000g 이상, 적합하게는 15,000g 이상, 바람직하게는 8,000g 이상에서 수행되지 않는다.

세포는 펠렛으로 수확되고 상청액은 폐기될 수 있다. 분리된 숙주 유기체를 등장성 식염수로 세척하여 오염 염을 용해시키고 이어서 상기 기재된 바와 같이 원심분리하여 세척된 숙주 유기체를 분리하는 것이 바람직하다. 상청액에 나타난 사용된 세척액은 폐기될 수 있다.

세척된 세포를 포함하는 펠렛은 -20℃에서 동결하여 저장하거나 다음 단계에서 바로 사용될 수 있다. 적절하게는, 희석 완충액이 단계 b 전에 첨가된다. 희석 완충액은 막 단백질의 분해를 방지하기 위한 프로테아제 억제제, pH 값을 원하는 범위 내로 유지하기 위한 TRIS 및 인산 염과 같은 pH 조절 물질 및/또는 EDTA와 같은 이온 스캐빈저(scavenger)를 함유할 수 있다.

막 단백질은 다양한 방식으로, 바람직하게는 세포의 화학적 또는 기계적 용해에 의해 숙주 유기체로부터 유리될 수 있다. 세포의 화학적 용해가 적절하게 수행될 때 수용성 용해 용액을 첨가하여 숙주 유기체로부터 막 단백질을 유리시킨다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 수성 용해 완충액은 막 단백질을 동시에 용해시키는 세제 용액이다.

세포의 용해와 막 단백질의 가용화가 일어나기 위해, 일반적으로 숙주 세포는 교반 중에 세제의 작용을 받게 된다. 일반적으로 숙주 세포는 적어도 1시간, 예컨대 2시간, 바람직하게는 적어도 6시간 동안 세제와 반응하도록 허용된다.

세포의 기계적 용해가 일반적으로 사용될 때 숙주 세포로부터 막 단백질의 유리는 균질화기에 의해 수행된다. 우유의 균질화를 위해 유제품 산업에서 사용되는 것과 동일한 유형의 균질화기를 사용하는 것이 적합하다. 적합한 예에는 Stansted 7575 균질화기가 있다. 균질화기에서 처리한 후 세포가 열리면서 막 단백질이 유리된다.

막 단백질의 유리 후에 양이온성 응집제가 첨가될 수 있다. 양이온성 응집제는 특히 음으로 하전된 세포 파편과 상호 작용하여 플록을 형성하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 양이온성 응집제는 Superfloc C581과 같은 폴리아민 화합물이다.

플록의 형성은 일반적으로 즉시 발생하지 않는다. 따라서 양이온성 응집제는 저속 교반 중에 재현탁액의 세포 부분과 반응하여 플록을 형성하는 것이 바람직하다. 일반적으로 양이온성 응집제와 세포 파편은 실온에서 교반하면서 10분에서 2시간 사이에 상호 작용하도록 한다.

세포의 화학적 용해가 사용될 때, 단계 e의 액체 분획은 플록을 포함하는 현탁액의 원심분리로부터 상청액으로 회수된다. 막 단백질은 세제 용액에 의해 용해됨에 따라 상청액에 나타난다.

세포의 기계적 용해가 사용되는 경우, 단계 e의 액체 분획은 고체 분획의 재현탁으로부터 회수되고, 상기 고체 분획은 막 단백질을 용해시키기 위해 세제 용액에 재현탁된다. 본 발명의 일 실시예에서, 고체 분획은 막 단백질을 함유하는 세포 단편(fragment)이 응집제와 상호 작용하고 원심분리에 의해 액체로부터 분리될 수 있는 플록을 형성한다는 사실로 인해 형성된다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 놀랍게도 응집제를 사용하지 않고 세포의 기계적 용해가 사용될 때 펠렛에서 막 단백질을 수확하는 것이 가능하다는 것이 발견되었다. 원심분리에 의해 얻어진 펠렛은 막 단백질을 가용화하기 위해 세제 용액에 재현탁될 수 있다. 이 단계에서 단계 e의 액체 분획은 원심분리에 의해 상청액으로 수확된다.

원심분리 공정은 일반적으로 적절한 시간 내에 펠렛(pellet)을 형성하는 중력에서 수행된다. 따라서 원심분리는 통상 500g 이상, 예컨대 1000g 이상, 바람직하게는 2000g 이상에서 수행된다. 펠렛의 밀도는 이후 단계에서 어려움을 방지하기 위해 너무 높으면 안 된다. 따라서, 원심분리는 일반적으로 30,000g 이상, 예컨대 20,000g 이상, 적합하게는 15,000g 이상, 바람직하게는 8,000g 이상에서 수행되지 않는다. 30,000g 미만의 중력을 적용하면 GEA, Tetra Pak, Alfa Laval 및 SPX Flow Seital Separation Technology의 포자 제거 원심분리기와 같이 낙농업에서 일반적으로 사용되는 정화기를 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 정화기는 또한 일부 제조업자에 의해 박토휴지(Bactofuge)로 지칭될 수 있다. 따라서, 본 발명은 소량의 회분식 원심분리와 처리만이 가능한 초원심분리기의 적용을 생략할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 세제에는 n-도데실-β-D-말토피라노사이드(DDM), n-데실-β-D-말토피라노사이드(DM) 또는 5-사이클로헥실펜틸 β-D-말토사이드(Cymal-5)와 같은 알킬말토피라노사이드; n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드(OG)와 같은 알킬 글루코피라노사이드; n-라우릴 디메틸아민 N-옥사이드(LDAO)와 같은 아민 옥사이드; n-도데실포스포콜린(FC-12), n-테트라데실포스포콜린(FC-14) 또는 n-헥사데실포스포콜린(FC-16)과 같은 포스포콜린; 또는 폴리옥시에틸렌 글리콜 등이 포함된다. 본 발명의 적합한 실시예에서, 세제는 라우릴 디메틸아민 N-옥사이드(LDAO), 옥틸 글루코사이드(OG), 도데실 말토사이드(DDM) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. LDAO는 크고 안정적인 소포가 생성되기 때문에 선호되는 세제이며, 이는 세제가 자연적으로 발생하는 인지질을 대체할 수 있음을 시사한다.

액체 분획은 막 단백질이 고정상에 결합되거나 유지되는 크로마토그래피 공정을 거친다. 크로마토그래피의 유형은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 변위 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 등으로 선택할 수 있다. 일반적으로 크로마토그래피 공정은 막 단백질의 정제를 형성하는 분석 크로마토그래피와 반대되는 준비 크로마토그래피이다.

현재 바람직한 실시예에서, 크로마토그래피 방법은 친화성 크로마토그래피로 선택되며, 이에 따라 친화성 쌍의 제1 부분은 막 단백질과 연관되고 친화성 쌍의 제2 부분은 고정상과 연관된다. 고정상의 예로는 비드(bead)와 컬럼 재료가 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 친화성 쌍의 제2 부분과 관련된 고정상은 컬럼에 존재한다. 일반적으로 친화성 쌍의 일부는 막 단백질 또는 고정상에 대한 공유 결합과 관련된다. 그러나 혼성화, 항체-항원 상호 작용을 통한 친화성 결합 등과 같은 다른 유형의 결합도 가능하다.

본 발명에서 적용할 수 있는 다수의 친화성 쌍은 당업자에게 공지되어 있으며 비오틴-스트렙타비딘 쌍, 항체-항원 쌍, 항체-합텐 쌍, 압타머 친화성 쌍, 포획 단백질 쌍, Fc 수용체-IgG 쌍, 금속 킬레이트 지질 쌍, 금속 킬레이트 지질 히스티딘(HIS) 태그 단백질 쌍, 또는 이들의 조합이 포함된다. 현재 바람직한 실시예에서 친화성 쌍은 금속 킬레이트 지질-히스티딘(HIS)-태그 단백질 쌍이다.

상기 금속은 일반적으로 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)라고 하는 기술에서 컬럼 재료에 고정된다. 상기 금속은 일반적으로 Cu(II) 또는 Ni(II), 바람직하게는 Ni(II)로 선택된다. Ni-NTA 수지를 사용하여 His 태그 단백질을 자동 또는 수동으로 정제할 수 있다. 적합한 고정상은 GE Healthcare의 "Capto Chelating” 또는 GE Healthcare의 HisTrap Gel 여과 물질(Ni Sepharose 6 Fast Flow)이다.

히스티딘 태그인 친화성 쌍의 제1 부분은 일반적으로 막 단백질의 C-말단에 부착된다. 히스티딘 태그는 일반적으로 6개의 연속 히스티딘 아미노산을 포함하는 반면, 본 발명에서 히스티딘 태그는 8개 이상의 히스티딘 분자를 포함하는 것이 바람직하다. 히스티딘 태그에서 많은 수의 히스티딘 아미노산은 특이적 결합 단백질과 비특이적 결합 단백질을 효과적으로 분리하는 것을 가능하게 한다.

컬럼에 막 단백질을 포함하는 액체 분획을 첨가한 후 액체는 중력 또는 압력에 의해 수지를 관통하도록 허용된다. 적합하게는, 용출 완충액은 이미다졸을 포함한다. 이미다졸은 수지에 고정된 금속 이온에 대한 His 태그의 결합과 상호 작용하는 능력을 가지고 있다. 특정 농도의 이미다졸에서 히스티딘 태그 막 단백질이 유리된다.

관심 있는 막 단백질로부터 비특이적 결합 막 단백질을 분리하기 위해, 일반적으로, 용출 완충액으로 용출되기 전 컬럼은 용출 완충액에서 이미다졸 농도의 40% 이하를 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 용출 완충액 중 이미다졸 농도는 일반적으로 200mM ~ 2000mM 이미다졸 범위이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 용출 완충액 중 이미다졸 농도는 400mM 이상이다. 더 효과적인 His 태그 막 단백질의 용출을 얻기 위해 완충액 중 이미다졸 농도는 일반적으로 600mM 또는 800mM 이상이다.

대부분의 응용 분야에서 His 태그가 일반적으로 단백질 구조, 기능 및 면역원성에 미치는 영향은 무시할 수 있다. 그러나 막 분자를 컬럼에 결합하는 기능을 제공한 후에 His 태그를 제거하는 것이 특정 응용 분야에서는 바람직할 수 있다. His 태그는 막 단백질과 His 태그 사이에 절단 가능한 연결을 도입함으로써 제거할 수 있다. 적합한 절단 가능 링크는 pH 민감성 링커, 이황화 링커, 프로테아제 민감성 링커 및 베타-글루쿠로나이드 링커를 포함한다.

막 단백질은 자연 환경에서 전체 이중 지질막, 즉 세포 내부에서 세포외 공간까지 확장된다. 막횡단 단백질의 대부분은 특정 물질에 대한 관문으로 기능하여, 세포 내부와 세포 외액 사이에서 이들 물질의 교환을 허용한다. 막횡단 단백질의 특징은 막 내로 막횡단 단백질의 통합을 보장하는 소수성 영역의 존재이다. 막횡단 단백질은 또한 중공사 영역의 양쪽에 친수성 세그먼트를 가지며, 상기 친수성 세그먼트는 각각 세포의 내부와 세포 외액으로 향한다.

임의의 막 단백질이 본 발명에 따라 생산될 수 있다고 생각하지만, 일반적으로 이온 (이온 통로)와 물(아쿠아포린 수분 통로)을 수송하는 막 단백질을 제조하기 위해 본 공정을 사용하는 것이 바람직하다. 이온 통로에는 염화물 통로와 금속 이온 수송체가 포함된다. 염화물 이온 외에 특정 염화물 통로는 HCO₃ ^-, I^-, SCN^- 및 NO₃ ^-를 전도한다. 금속 이온 수송체는 마그네슘 수송체, 칼륨 이온 통로, 나트륨 이온 통로, 칼슘 통로, 양성자 통로 등을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 막 단백질은 외막 단백질 A(OmpA)이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 막 단백질은 아쿠아포린 수분 통로이다. 아쿠아포린 수분 통로는 세포 내외부로 물 수송을 용이하게 한다. 산업용 막에서 아쿠아포린 수분 통로는 삼투에 의한 물의 유동을 보장하는 반면 용액 내 다른 성분은 거부된다. 아쿠아포린 수분 통로와 같은 막 단백질은 원핵 생물과 진핵 생물을 포함한 다양한 근원에서 방출될 수 있다. 아쿠아포린의 원핵 생물 근원은 E. coli, Kyrpidia spormannii, Methanothermobacter sp., Novibacillus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae, and Halomonas sp를 포함한다. 아쿠아포린의 진핵 생물 근원에는 Oryza sativa Japonica(일본 쌀), Eucalyptus grandis, Solanum tuberosum(덴마크 감자) 및 Milnesium tardigradum(물곰)이 포함된다.

근원 유기체에서 막 단백질의 핵산 서열은 일반적으로 숙주 유기체의 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화 된다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 히스티딘을 첨가하여 적절하게 합성된다. 합성 유전자 단편은 제한 효소로 분해되어 벡터 단편 내로 결찰될 수 있다. 생성된 결찰 혼합물은 바람직하게는 대장균 DH10B와 같은 유기체로 형질이 전환된다. 항생제 내성 형질 전환체는 항생제가 있는 배지에서 적절하게 선택된다. 형질 전환체는 유전자 구조체(genetic construct)의 시퀀싱에 의해 확인되었다. 분리된 벡터 DNA는 이후 생산 숙주로 옮겨졌다. 생산 숙주는 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 다수의 적합한 원핵 또는 진핵 유기체 중에서 선택될 수 있다.

숙주 유기체는 일반적으로 천연 막 단백질을 평소보다 더 많은 양으로 발현하거나 비천연 막 단백질을 발현하도록 조작된다. 막 단백질을 발현하는 한 가지 방법은 전술한 바와 같이 막 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터로 숙주 유기체를 형질 전환시키는 것일 수 있다. 막 단백질의 과발현을 얻는 또 다른 가능성은, 예컨대 억제 물질을 감쇠시키거나 적합한 프로모터 영역을 삽입함으로써 천연 막 단백질의 발현을 상향 조절하는 것이다. 비천연 단백질의 발현을 얻기 위한 추가 가능성은 막 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지로 숙주 유기체를 형질 감염시키는 것이다.

이상 상술한 바와 같이 본 발명에 따르면 최종 산물의 품질을 손상시키지 않고 효율적인 방식으로 비교적 많은 양의 막 단백질을 생산할 수 있는 장점이 있다.

실시예 1

C-말단에서 His 태그에 연결된 아쿠아포린 단백질을 생성하는 벡터를 포함하는 대장균 BL21 균주를 제조한다. His 태그는 아쿠아포린 막 단백질의 1차 시퀀스에 부착된 10개의 연속 히스티딘 분자를 포함한다.

대장균 균주는 표준 배지에서 배양하여 총 150L의 발효액을 얻었다. 대장균 세포는 기공의 지름이 0.05㎛인 미세 여과막을 통해 발효액을 여과하여 수확 하였다. 대장균 세포를 포함하는 거른액을 약 50L로 감소시킨 후 5300g에서 20분 동안 원심분리한다. 따라서, 대장균 세포는 정밀 여과에 의해 상향 농축되고 나머지 배지는 원심분리에 의해 이어서 상청액으로 제거된다.

원심분리로 얻은 펠렛을 수집하고 1:1 부피의 0.9% 염화나트륨을 첨가하여 세포를 세척하고 오염된 염을 용해시킨다. 그 후, 세척액은 5300g에서 20분 동안 작동하는 원심분리기에서 제거된다. 상청액을 버리고 세척된 세포를 펠렛으로 수집하였다. 펠렛은 -20℃에서 동결하여 저장하거나 다음 단계에서 바로 사용될 수 있다.

대장균 세포를 포함하는 펠렛은 결합 완충액으로 사용되는 약 47L TRIS 완충액에 용해되었다. 약 1시간 동안 교반한 후 6.4 L 세제(5% LDAO)를 가용화를 위해 첨가하여 최종 농도가 0.6%가 되도록 하였다. 혼합물을 저속으로 교반하면서 실온에서 밤새 배양하였다. 세제를 포함하는 완충액에 있는 세포의 재현탁에 의해 세포 용해가 발생했다. 세포 용해 막에 의해 단백질은 세포의 내부 막에서 유리되고 세제에 의해 용해된다.

음으로 하전된 셀 물질을 제거하기 위해 폴리아민(Superfloc C581)을 427mL의 부피로 첨가했다. 혼합물을 실온에서 교반하면서 30분 동안 배양하여 세포 파편, DNA, RNA와 같은 음으로 하전된 분자 및 일정 정도의 단백질을 응고시켰다. 세제에 의해 용해된 막 단백질은 수상에 남아 있다. 혼합물은 15분 동안 5300g의 최대 속도로 원심분리된다. 세포 파편, DNA, RNA 및 용해된 단백질을 포함하는 펠렛은 폐기되고 상청액은 수집된다. 상청액을 107L 희석 완충액이 들어 있는 용기로 옮겨 최종 농도가 0.2% LDAO 인 최종 부피 160L를 얻는다.

GE Healthcare의 친화성 수지 “Capto Chelating”을 포함하는 컬럼이 제공된다. 수지는 His10 태그에 결합하는 Ni2+로 충전된다. 컬럼에 희석된 상청액을 적재하고 이어서 200mM 이미다졸을 함유하는 10 컬럼 부피의 세척 완충액으로 세척하여 비특이적 결합 성분을 세척하였다. 이어서, 수성 1000mM 이미다졸의 2.5 컬럼 부피 용출 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 막 단백질을 방출하였다. 컬럼에서 용출된 단백질은 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 테스트되었으며, 이는 주로 80%가 넘는 순도를 나타내는 단일 밴드를 보여주었다.

실시예 2

대장균 균주는 표준 배지에서 배양하여 총 250L의 발효액을 얻었다. 대장균 세포는 기공의 지름이 0.05㎛인 PES 평판 막 여과막을 통해 발효 브로스를 여과하여 수확하였다. 대장균 세포를 포함하는 거른액을 약 50L로 감소시킨 후 Sorvall 16L 원심분리기로 5300g에서 20분 동안 원심분리한다. 따라서, 대장균 세포는 정밀 여과에 의해 상향 농축되고 나머지 배지는 원심분리에 의해 이어서 상청액으로 제거된다. 펠렛은 -20℃에서 동결하여 저장하거나 다음 단계에서 바로 사용될 수 있다.

대장균 세포를 포함하는 펠렛을 약 50L 완충액(프로테아제 억제제 PMSF 및 EDTA의 수용액)에 재현탁하고 Stansted nm-GEN 7575 균질화기로 1000bar에서 균질화했다. 관심 있는 세포 물질을 분리하기 위해 폴리아민(Superfloc C581)을 12ml/L 농도로 첨가한다. 온도는 약 10~15ºC로 유지했다. 혼합물을 실온에서 교반하면서 30분 동안 배양하였다. 혼합물은 30분 동안 5300g의 최대 속도로 원심분리했다. 펠렛은 막 단백질을 포함하고 상청액은 폐기한다.

펠렛을 0.9% 염화나트륨 용액에 재현탁하여 약 50mg/ml의 총 단백질 농도를 얻었다. 28L TRIS 결합 완충액과 4.5L 5% LDAO를 5L의 재현탁된 펠렛 물질에 첨가하여 막 단백질의 가용화를 수행했다. 실온에서 저속으로 교반하면서 혼합물을 2시간 내지 24시간 동안 배양했다.

가용화 공정 후 혼합물을 2L 용기에서 5300g에서 90분 동안 원심분리했다. 상청액을 회수하고 희석 완충액을 첨가하여 LDAO 농도를 0.2%로 조정하였다.

GE Healthcare의 친화성 수지인”Capto Chelating”을 포함하는 컬럼이 제공된다. 수지는 His10 태그에 결합하는 Ni²⁺로 충전된다. LDAO가 0.2%인 결합 완충액을 적재하여 컬럼을 평형화시켰다. 이후, 컬럼에 희석된 상청액을 적재하고 200mM 이미다졸을 함유하는 10 컬럼 부피의 세척 완충액으로 세척하여 비특이적 결합 성분을 세척하였다. 이어서, 수성 1000mM 이미다졸의 2.5 컬럼 부피 용출 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 막 단백질을 방출하였다. 컬럼에서 용출된 단백질은 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE) 크로마토그래피로 테스트되었으며, 이는 주로 95%가 넘는 순도를 나타내는 단일 밴드만을 보여주었다.

실시예 3

대장균 균주를 표준 배지에서 배양하여 250L의 총 발효 브로스를 얻었다. 발효 배치(batch)는 수확 시 OD600 13을 가졌고 42.5시간 동안 유도되었다. 물질은 Stansted nm-GEN 7575 균질화기로 100MPa에서 두 번 균질화했다. 용해된 물질로부터 10mL를 취하여 15mL 팔콘 튜브에 첨가하였다.

그 후 5300g으로 1시간 동안 원심분리를 수행하고 펠렛을 상청액으로부터 분리하였다. 그 후 펠렛을 0.9% NaCl 10mL에 재현탁시켰다. 첫 번째 스핀 후 재현탁된 펠렛 및 분리된 상청액의 농도(mg/mL 총 단백질)를 결정하는 데 BCA 분석을 사용했다.

재현탁된 펠렛 및 분리된 상청액을 0.6% LDAO(Carbosynth의 5% LDAO 스톡 120uL를 1mL 물질에 사용)에서 2시간 동안 최종적으로 용해시키고(1mL) 15분 동안 5300G에서 다시 원심분리했다. 다시 한 번, 상청액을 펠렛에서 분리했다. 펠렛을 LDAO 없이 결합 완충액에 재현탁시켰다(다시 최대 1mL까지).

모든 시료는 SDS-겔에서 분석되었으며, 상청액에 있는 단백질의 약 60%가 아쿠아포린 막 단백질이라는 것을 보여주었다.

실시예 4

실시예 2에서 아쿠아포린 Z를 정제한 후, LDAO에 용해된 단백질의 크기 분포를 측정했다.

입자 크기 분포가 완충액 성분(세제 포함) 또는 막 단백질의 영향을 받는지 여부를 평가하기 위해 단백질 유무와 관계없이 동일한 용출 완충액을 비교했다.

아쿠아포린 Z 단백질을 1000mM 이미다졸 및 0.2% w/v LDAO가 포함된 용출 완충액을 사용하여 IMAC 컬럼에서 용리했다. 정제된 단백질은 아미노산 분석을 통해 단백질 농도를 측정했다. 6.44mg/mL의 투명하고 용해된 용출 완충액 중 단백질을 3개의 큐벳(Sarstedt, 4mL, PMMA, ca. no. 67.755, N

mbrecht, Germany)에 넣고 Malvern Zetasizer Nano-ZS로 Malvern Zetasizer 소프트웨어 v.7.02를 사용하여 크기 분포를 분석했다(Malvern Instruments Ltd., Malvern UK). 표 1에 제시된 결과는 3회 실행된 시료의 평균이다.

시료	AqpZ 농도 (mg/mL)	크기, 지름(d.nm) 개체군 강도(%)
		개체군 1	개체군 2	개체군 3
용출 완충액 중 정제된 AqpZ (평균)	6.44	315.6±116.8 nm 45.9%	108±32.3 nm 35.5%	17.1±2.5 nm 14.9%
용출 완충액 (평균)	0	0.85±0.16 nm 56.8%	8.6±1.2 nm 41.1%	103±5.5 nm 2.1%

용출 완충액 시료(단백질 없음)에는 8.6nm 이하 크기의 입자가 97.9%인 개체군 분포가 포함되어 있어 미세 여과에 의해 유지되는 용액에 큰 세제 미셀(micelle)이 없음을 나타낸다. 단백질을 함유한 시료에서 입자의 81.4%는 108nm 이상의 크기를 나타내므로 단백질과 세제의 존재가 함께 미세 여과 중에 유지되는 큰 용해성 입자를 형성 함을 나타낸다. 실험은 놀랍게도 LDAO 미셀과 막 단백질로 구성된 크고 안정적인 입자가 생성된다는 것을 보여준다.

실시예 5

대장균에서 Oryza sativa Japonica(일본 쌀)의 히스티딘 태그 아쿠아포린 발현 및 IMAC를 이용한 정제

Oryza sativa Japonica에서 아쿠아포린을 암호화하는 유전자(UNIPROT:A3C132)를 대장균에서 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화했다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 NdeI/XhoI 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 10개의 히스티딘을 첨가하여 합성된다(유전자 ID: aquaporin_Oryza_sativa_Japonica). 합성 유전자 단편을 NdeI/XhoI 제한 효소로 분해하고 NdeI/XhoI-분해 및 정제된 벡터 pUP1909 단편에 연결했다. 생성된 결찰 혼합물을 대장균 DH10B로 형질 전환시키고 카나마이신 내성 형질 전환체를 카나마이신이 있는 LB 한천 플레이트에서 선택했다. 형질 전환체는 유전자 구조체의 시퀀싱에 의해 확인되었다. 분리된 벡터 DNA는 이후 생산 숙주인 대장균 BL21로 옮겨졌다.

대장균에서 아쿠아포린을 이종 발현하기 위해, 생산 숙주를 30g/L 글리세롤, 6g/L(NH₄)₂HPO₄, 3g/L KH₂PO₄, 5g/L NaCl, 0.25g/L MgSO₄·7H₂O, 0.4g/L Fe(III) 시트레이트 및 1mL/L 멸균 여과된 미량 금속 용액으로 구성된 최소 배지에서 성장시켰다. 미량 금속 용액은 1g/L EDTA, 0.8g/L CoCl₂·6H₂O, 1.5MnCl₂·4H₂O, 0.4g/L CuCl₂·2H₂O, 0.4g/L H₃BO₃, 0.8g/L Na₂MoO₄·2H₂O, 1.3g/L Zn(CH₃COO)2·2H₂O로 구성되었다. 접종 및 밤새 성장 후 추가적인 0.25g/L MgSO₄·7H₂O를 첨가했다.

대장균은 배치 발효 공정에서 ez-Control과 함께 3L Applikon Bioreactors에서 배양되었다. 약 30의 광학 밀도(OD 600nm)에서 0.5mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 배양을 약 24시간 동안 유도하고 박테리아 세포를 5300g에서 20분 동안 원심분리하여 수확하였다.

대장균 세포를 포함하는 펠렛을 완충액(프로테아제 억제제 PMSF 및 EDTA의 수용액)에 재현탁하고 Stansted nm-GEN 7575 균질화기로 1000bar에서 균질화했다. 온도는 약 10~15℃로 유지했다. 혼합물은 30분 동안 5300g의 최대 속도로 원심분리했다. 펠렛은 막 단백질을 포함하고 상청액은 폐기한다.

가용화와 정화 후, 단백질을 IMAC를 사용하여 포획하고 1000mM 이미다졸과 0.2% w/v LDAO를 함유하는 용출 완충액에서 용리시켰다. 용출 분획은 SDS Page로 분석되었으며 일본 쌀에서 추출한 아쿠아포린의 크기에 해당하는 27kDa에서 이동하는 단일 주요 밴드만 드러났다. 또한, 빈 벡터로 형질 전환된 대장균의 음성 대조군 정제와 비교하여 결과를 확인하였다. 음성 대조군은 정제된 단백질을 생성하지 않았다. 히스티딘 태그에 특이적인 항체(TaKaRa Bio)를 사용한 단백질 검출 검사법(Western blot analysis)은 예상대로 정제된 단백질에서 명확한 신호를 보였고 음성 대조군에서는 신호가 없었으며 정제된 단백질의 유래가 히스티딘 태그 막 단백질임을 확인했다.

실시예 6

대장균에서 Eucalyptus grandis의 히스티딘 태그 아쿠아포린 발현 및 IMAC를 이용한 정제

Eucalyptus grandis에서 아쿠아포린을 암호화하는 유전자(UNIPROT:A0A059C9Z4)를 대장균에서 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화했다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 NdeI/XhoI 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 10개의 히스티딘을 첨가하여 합성된다(유전자 ID: aquaporin_Eucalyptus_grandis). 이 유전자는 실시예 5에 기재된 바와 같이 복제되고 발현되었다. 단백질은 실시예 5에 기재된 바와 같이 성공적으로 정제되고 확인되었다.

실시예 7

대장균에서 Solanum tuberosum(덴마크 감자)의 히스티딘 태그 아쿠아포린 발현 및 IMAC를 이용한 정제

Solanum tuberosum에서 아쿠아포린을 암호화하는 유전자(UNIPROT:Q38HT6)를 대장균에서 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화했다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 NdeI/XhoI 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 10개의 히스티딘을 첨가하여 합성된다(유전자 ID: aquaporin_Solanum_grandis). 이 유전자는 실시예 5에 기재된 바와 같이 복제되고 발현되었다. 단백질은 실시예 5에 기재된 바와 같이 성공적으로 정제되고 확인되었다.

실시예 8

대장균에서 Milnesium tardigradum(물곰)의 히스티딘 태그 아쿠아포린 발현 및 IMAC를 이용한 정제

Milnesium tardigradum에서 아쿠아포린을 암호화하는 유전자(UNIPROT: G5CTG2)를 대장균에서 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화했다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 NdeI/XhoI 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 10개의 히스티딘을 첨가하여 합성된다(유전자 ID: aquaporin_Milnesium_tardigradum). 이 유전자는 실시예 5에 기재된 바와 같이 복제되고 발현되었다. 단백질은 실시예 5에 기재된 바와 같이 성공적으로 정제되고 확인되었다.

실시예 9

대장균에서 Halomonas sp.의 히스티딘 태그 아쿠아포린 발현 및 IMAC를 이용한 정제

Halomonas sp.에서 아쿠아포린을 암호화하는 유전자(UNIPROT: A0A2N0G6U6)를 대장균에서 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화했다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 NdeI/XhoI 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 10개의 히스티딘을 첨가하여 합성된다(유전자 ID: aquaporin_ Halomonas_sp). 이 유전자는 실시예 5에 기재된 바와 같이 복제되고 발현되었다. 단백질은 실시예 5에 기재된 바와 같이 성공적으로 정제되고 확인되었다.

실시예 10

대장균에서 Kyrpidia spormannii의 히스티딘 태그 아쿠아포린 발현 및 IMAC를 이용한 정제

Kyrpidia sp.에서 아쿠아포린을 암호화하는 유전자(UNIPROT: A0A2K8N5Z5)를 대장균에서 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화했다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 NdeI/XhoI 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 10개의 히스티딘을 첨가하여 합성된다(유전자 ID: aquaporin_Kyrpidia_spormannii). 이 유전자는 실시예 5에 기재된 바와 같이 복제되고 발현되었다. 단백질은 실시예 5에 기재된 바와 같이 성공적으로 정제되고 확인되었다.

실시예 11

대장균에서 Methanothermobacter sp.의 히스티딘 태그 아쿠아포린 발현 및 IMAC를 이용한 정제

Methanothermobacter sp.에서 아쿠아포린을 암호화하는 유전자(UNIPROT: A0A223ZCQ2)를 대장균에서 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화했다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 NdeI/XhoI 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 10개의 히스티딘을 첨가하여 합성된다(유전자 ID: aquaporin_Methanothermobacter_sp). 이 유전자는 실시예 5에 기재된 바와 같이 복제되고 발현되었다. 단백질은 실시예 5에 기재된 바와 같이 성공적으로 정제되고 확인되었다.

실시예 12

대장균에서 Novibacillus thermophilus의 히스티딘 태그 아쿠아포린 발현 및 IMAC를 이용한 정제.

Novibacillus thermophilus에서 아쿠아포린을 암호화하는 유전자(UNIPROT: A0A1U9K5R2)를 대장균에서 발현을 개선하기 위해 Geneart(Thermo Fischer Scientific의 자회사)의 서비스를 사용하여 코돈 최적화했다. 생성된 유전자는 N-말단 및 C-말단 측면 NdeI/XhoI 제한 부위와 함께 C-말단으로 코돈을 암호화하는 10개의 히스티딘을 첨가하여 합성된다(유전자 ID: aquaporin_ Novibacillus_thermophilus). 이 유전자는 실시예 5에 기재된 바와 같이 복제되고 발현되었다. 단백질은 실시예 5에 기재된 바와 같이 성공적으로 정제되고 확인되었다.

실시예 13

대장균에서 대장균의 외막 단백질 A(OmpA)의 발현 대장균에서 OmpA(UNIPROT: P0A910)의 발현과 정제는 대장균이 빈 벡터로 형질 전환되고 가용화가 24시간까지 연장된 것 외에는 본질적으로 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행되었다. 생성된 가용화 단백질은 SDS-PAGE에 의해 약 30~50%의 순도로 추정되었으며, 따라서 OmpA가 표준 정제 절차에 따라 막 분획에서 성공적으로 분리되었음을 분명히 나타낸다. 추가적인 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 단계로 OmpA를 추가로 정제할 수 있었다.

실시예 14

N-말단 히스티딘-태그 yEGFP에 융합되고 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위에 의해 분리된 대장균으로부터 아쿠아포린-Z(AqpZ)를 발현하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 구축.

AqpZ(UNIPROT ID: 대장균의 AqpZ(UNIPROT ID: P60844)는 S. cerevisiae에서 발현 개선을 위해 Geneart의 서비스를 사용하여 S. cerevisiae에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다. S. cerevisiae에서 발현을 위해, AqpZ를 효모 강화 녹색 형광 단백질(yEGFP: yeast enhanced green fluorescent protein) N-말단(Brendan P. Cormack et al, Microbiology(1997), 143, 303~311)과 융합하여 막 단백질의 시각적 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 또한, 8개의 히스티딘(His8)을 IMAC 정제 태그로서 yEGFP에 N-말단으로 첨가하였다. His8-yEGFP 및 AqpZ는 구축 동안 PCR 프라이머에 의해 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위에 의해 유전적으로 분리되었다.

His8-yEGFP-TEV-AqpZ 융합을 암호화하는 플라스미드의 신속하고 효율적인 구축은 His8-yEGFP-TEV PCR 단편인 TEV-AqpZ PCR 단편과 (Scientific Reports 7:16899)에 기술된 바와 같이 pEMBLyex4 플라스미드의 SalI, HindIII 및 BamHI 소화로부터 유래된 선형화된 발현 플라스미드 사이에 S. cerevisiae의 프라이머에 의해 통합된 중첩 영역의 생체 내 상동 재조합에 의해 수행되었다. TEV 절단 부위는 TEV 프로테아제에 의해 His8-yEGFP 단백질의 후속 제거를 가능하게 한다.

S. cerevisiae 형질 전환체의 선별은 우라실이 부족하지만 류신과 라이신이 보충된 최소 배지 플레이트에서 수행되어 올바르게 재조합된 DNA 단편을 가진 박테리아 세포의 생존을 보장했다. 이 실시예에서 사용된 배지 조성물 및 아미노산 농도는 실시예 15에 열거된 것과 동일했다.

실시예 15

Saccharomyces cerevisiae를 사용한 His8-yEGFP-TEV-AqpZ의 발현.

형질 전환된 효모 세포의 단일 콜로니는 60mg/L 류신 및 30mg/L 라이신이 보충된 5ml의 포도당 최소 배지에서 포화될 때까지 선택적으로 증식시켰다. 이어서 200μl의 이 배양물을 높은 플라스미드 카피 수에 대한 선택을 위해 30mg/L 라이신이 보충된 5ml의 포도당 최소 배지에서 증식시켰다. 높은 플라스미드 카피 수 세포의 동결 스톡을 준비했다.

라이신이 보충된 최소 배지 10ml에 해동된 동결 스톡 200μl를 첨가하고 포화될 때까지 성장시켰다. 배양액 1ml를 동일한 배지 100ml로 옮겼다. 밤새 성장한 후, 0.05의 최종 OD600에 해당하는 분취량을 탄소원으로서 20g/L 포도당의 초기 농도와 여분의 아미노산이 보충된 30g/L 글리세롤을 갖는 1.5 리터의 최소 배지로 옮겼다. Lucullus® 소프트웨어를 실행하는 PC(Applikon/네덜란드 및 SecureCell/스위스)에 연결된 ez-Control이 장착 된 3L Applikon® 생물 반응기에서 배양물을 성장시켰다.

발효의 초기 부분은 최소 배지에서 20℃로 수행되었다. 초기 양의 포도당이 대사되었을 때 생물 반응기에 포도당을 3% w/v의 최종 농도로 공급하였다. 성장 배지의 pH는 1M NH₄OH의 컴퓨터 제어 첨가에 의해 6.0으로 유지되었다. 제한된 포도당 접근으로 인해 CO₂ 배기가스가 평탄화되었을 때, 생물 반응기는 재조합 AQP 생산을 유도하기 전에 15℃로 냉각되었다. 400mL/L ASD-10, 400mL/L 여분의 아미노산, 200g/L 글리세롤 및 20g/L 갈락토스로 구성된 50mL/L 발현 배지를 첨가하니 재조합 단백질의 발현이 시작되었다. 96시간 후에 효모 세포를 수확하였다.

최소 배지는 20g/L 포도당, 100mL/L ASD-10, 5mL/L V-200, 30g/L 글리세롤, 0.1g/L Ca₂Cl로 구성되었다. ASD-10은 50g/L (NH₄)2SO₄, 8.75g/L KH₂PO₄, 1.25g/L K₂HPO₄, 5g/L MgSO₄·7H₂O, 1g/L NaCl, 5mg/L H₃BO₃, 1mg/L KI, 4mg/L MnSO₄·1H₂O, 4.2mg/L ZnSO₄·7H₂O, 0.4mg/L CuSO₄·5H₂O, 2mg/L FeCl₃ 및 2 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O로 구성되었다. V-200은 4mg/L 비오틴, 400mg/L D-판토텐산, 0.4mg/L 엽산, 2000mg/L 미오 이노시톨, 80mg/L 나이아신, 40mg/L p-아미노벤조에이트, 80mg/L 피리독신, 40mg/L 리보플라빈 및 80mg/L 티아민으로 구성되었다. 언급된 경우 배지에는 600mg/L 알라닌, 600mg/L 아르기닌, 600mg/L 시스테인, 3000mg/L 글루타민산, 2000mg/L 라이신, 600mg/L 메티오닌, 1500mg/L 페닐알라닌, 600mg/L 프롤린, 10000mg/L 세린, 900mg/L 티로신, 4500mg/L 발린, 2000mg/L 아스파르트산, 4000mg/L 트레오닌, 600mg/L 히스티딘 및 600mg/L 트립토판으로 구성된 추가 아미노산이 포함되어 있다.

실시예 16

Saccharomyces cerevisiae를 사용하여 생물 반응기에서 Milnesium tardigradum의 His8-yEGFP-TEV-AQP5 클로닝

His8-yEGFP-TEV-AQP5 구축물은 실시예 14에 요약된 절차에 따라 제조되었다. M. tardigradum(UNIPROT: G5CTG2)의 AQP5 단백질은 효모에서 발현 필요성에도 불구하고 대장균에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다.

실시예 17

S. cerevisiae로부터 His8-yEGFP-TEV-AqpZ 및 His8-yEGFP-TEV-AQP5의 정제

S. cerevisiae로부터 이종 발현된 막 단백질의 정제는 적용된 완충액 부피가 감소된 배양 부피와 일치하도록 축소되고 용해가 1800bar에서 수행되는 것 외에는 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다. 단백질 생산과 순도는 SDS-Page와 Western Blot으로 융합 단백질 모두에 대해 성공적으로 확인되었으며 오염 단백질은 검출되지 않았다.

Claims

막 단백질의 제조 공정에 있어서,
a. 수성 배지에 존재하는 숙주 유기체에서 막 단백질을 발현하는 단계;
b. 상기 숙주 유기체로부터 상기 막 단백질을 유리시키는 단계;
c. 상기 막 단백질을 용해시키기 위해 세제 용액을 첨가하는 단계;
d. 원심분리로 상기 가용화된 막 단백질의 액체 분획을 상청액으로 회수하는 단계;
e. 상기 액체 분획을 크로마토그래피에 적용하여 고정상에서 상기 막 단백질을 결합하거나 보유하는 단계; 및
f. 상기 막 단백질을 제조하기 위해 용출 완충액으로 상기 고정상을 용리하는 단계를 포함하며,
단계 d의 상기 원심분리는 500g 내지 30,000g에서 수행되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항에 있어서,
단계 a의 상기 숙주 유기체를 포함하는 상기 수성 배지는 단계 b에 따른 상기 숙주 유기체의 상기 유리 전에 여과되는, 막 단백질의 제조 공정.
제2항에 있어서,
상기 단계 a의 숙주 유기체를 포함하는 수성 배지는 기공 지름이 0.5 마이크로미터 이하인 정밀 여과막을 통해 여과되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 유기체는 선택적으로 여과 후에 상기 숙주 유기체를 포함하는 수성 배지의 원심분리로 분리되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 원심분리는 500g 내지 30,000g, 바람직하게는 1,000g 내지 10,000g에서 수행되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분리된 숙주 유기체는 등장성 식염수로 세척하여 오염 염을 용해시키고, 이어서 원심분리하여 상기 세척된 숙주 유기체를 분리하는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
희석 완충액은 단계 b 전에 첨가되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
수성 용해 용액은 상기 숙주 유기체로부터 상기 막 단백질을 유리시키기 위해 첨가되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수성 용해 완충액은 상기 막 단백질을 동시에 용해시키는 세제 용액인, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 교반 중에 상기 세제의 작용을 받게 되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포로부터 상기 막 단백질의 유리는 균질화기에 의해 수행되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온성 응집제는 상기 유리된 막 단백질에 첨가되어 현탁액을 형성하는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온성 응집제는 Superfloc C581과 같은 폴리아민 화합물인, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온성 응집제는 저속 교반 중에 상기 재현탁액의 세포 부분과 반응하여 플록(floc)을 형성하는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d의 상기 액체 분획은 상기 플록을 함유하는 상기 현탁액의 원심분리로부터 상청액으로 회수되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d의 상기 액체 분획은 고체 분획의 재현탁으로부터 회수되고, 상기 고체 분획은 상기 막 단백질을 용해시키기 위해 세제 용액에 재현탁되는, 막 단백질의 제조 공정.
제16항에 있어서,
단계 d의 상기 액체 분획은 원심분리에 의해 상기 상청액으로 수확되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세제는 라우릴 디메틸아민 N-옥사이드(LDAO), 옥틸 글루코사이드(OG), 도데실 말토사이드(DDM) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 원심분리는 500g 내지 30,000g, 바람직하게는 1,000g 내지 10,000g에서 수행되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 막 단백질에 결합하거나 보유할 수 있는 상기 고정상은 컬럼에 존재하는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 막 단백질은 친화성 쌍의 제1 부분과 결합되고 상기 고정상은 상기 친화성 쌍의 제2 부분과 결합되는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친화성 쌍의 제1 부분은 히스티딘 태그인, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 히스티딘 태그는 8개 이상의 히스티딘 분자를 포함하는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 희석 완충액은 이미다졸을 포함하는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용출 완충액으로 용리하기 전 상기 컬럼은 상기 용출 완충액 중 40% 이하 농도의 이미다졸을 포함하는 세척 완충액으로 세척하는, 막 단백질의 제조 공정.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용출 완충액 중 이미다졸의 농도는 400mM 이상인, 막 단백질의 제조 공정.