BR112020020379A2

BR112020020379A2 - Processo de produção de uma proteína de membrana

Info

Publication number: BR112020020379A2
Application number: BR112020020379-3A
Authority: BR
Inventors: Scott Treven Myers; Torsten Høybye Bak Regueira; Lena Maria Than Ellingsgaard; Simon Lyngaa Krabbe
Original assignee: Aquaporin A/S
Priority date: 2018-04-06
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2021-01-12
Also published as: SG11202009521YA; RU2020136185A; AU2019249933A1; EP3774842A1; WO2019193139A1; US20210147477A1; CA3095674A1; KR20210003782A; IL277565A; MX2020010393A; JP2021519800A; JP2023182713A; CN112189016A

Abstract

é revelado um processo de produção de uma proteína de membrana compreendendo as etapas de: expressar uma proteína de membrana em um organismo hospedeiro presente em um meio aquoso, liberar a proteína de membrana do organismo hospedeiro, adicionar uma solução detergente para solubilizar a proteína de membrana, recuperar uma fração líquida da proteína de membrana solubilizada, submeter a fração líquida a cromatografia para ligar ou reter a proteína de membrana em uma fase estacionária e eluir a fase estacionária com um tampão de eluição para produzir a proteína de membrana. o processo pode produzir quantidades relativamente grandes de proteínas de membrana em uma forma eficiente sem comprometer a qualidade do produto final.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE MEMBRANA CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a um processo de produção de uma proteína de membrana. O processo de acordo com a invenção é adequado para aplicação industrial na qual se deve produzir uma grande quantidade de proteínas de membrana. Assim, o processo visa a aplicação de operações unitárias adequadas para pelo menos uma produção de planta piloto. Notadamente, a presente invenção visa evitar um aparelho de ultracentrifugação.

ANTECEDENTES

[002] Aproximadamente um terço dos genes do genoma humano codificam proteínas de membrana. As proteínas da membrana desempenham um papel em muitas atividades celulares importantes, incluindo conversão de energia, sinalização celular, interações célula-célula, adesão celular, migração celular, tráfego de proteínas, fusão viral, atividades sinápticas neurais e transporte de íons e metabólitos. As proteínas de membrana são incorporadas na bicamada lipídica da membrana celular e são compreendidas de porções hidrofóbicas e hidrofílicas.

[003] Recentemente, proteínas de membrana têm sido integradas com sucesso em uma camada de compósito de filme fino enxertada em uma camada de suporte estrutural porosa. Além disso, as proteínas de membrana representam alvos farmacêuticos importantes e assuntos interessantes de estudo no que diz respeito à biologia celular e bioquímica de proteínas. Existe, portanto, a necessidade de produção de planta piloto ou em larga escala de proteínas de membrana.

[004] WO2017137361 (A1) revela nanoestruturas automontadas formadas entre proteínas transmembranares, tais como canais de água de aquaporina

(AQPs) e polialquilenoiminas (PAI). As nanoestruturas automontadas são posteriormente incorporadas em membranas de compósito de filme fino (TFC) enxertadas em uma membrana de suporte porosa. A membrana de suporte porosa pode ser uma fibra oca, uma folha plana, uma membrana enrolada em espiral etc. para osmose reversa ou osmose direta.

[005] WO2013/043118 revela membranas de compósito de filme fino (TFC) em que canais de água de aquaporina (AQPs) são incorporados na camada ativa da membrana. Além disso, ele revela um método de produção de membranas compostas de filme fino e seus usos em processos de filtração, como nanofiltração e processos de filtração osmótica. As membranas TFC compreendem vesículas de lipídio-AQP/copolímero-AQP que são incorporadas na camada ativa de TFC. WO2010/146365 descreve a preparação de membranas de filtração de TFC-aquaporina-Z (AqpZ) que usam um copolímero tribloco anfifílico como uma substância formadora de vesículas para incorporar AQPs imobilizados.

[006] WO2014/108827 revela um módulo de fibra oca (HF) tendo fibras modificadas com uma camada de compósito de filme fino (TFC) compreendendo canais de água de aquaporina em que os canais de água de aquaporina são incorporados em vesículas antes da incorporação na camada de TFC.

[007] Métodos industriais para isolar grandes quantidades de proteínas de membrana de células geralmente não estão disponíveis para os técnicos no assunto. No estado da técnica, o foco tem sido na produção de quantidades relativamente pequenas de proteínas de membrana para fins de pesquisa. Portanto, um método de produção relativamente complicado e trabalhoso foi tolerado. No entanto, com as recentes demandas mais elevadas por proteínas de membrana em membranas industriais para osmose reversa e osmose direta, tornou-se clara a necessidade de um método de produção mais eficiente. O objetivo da presente invenção é fornecer um processo para a produção de proteínas de membrana, onde o processo pode produzir quantidades relativamente grandes de proteínas de membrana em uma maneira eficiente sem comprometer a qualidade do produto final.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção se refere a um processo de produção de uma proteína de membrana, compreendendo as etapas de: a. Expressar uma proteína de membrana em um organismo hospedeiro presente em um meio aquoso, b. Liberar a proteína de membrana do organismo hospedeiro, c. Adicionar uma solução detergente para solubilizar a proteína de membrana, d. Recuperar uma fração líquida da proteína de membrana solubilizada como o sobrenadante por centrifugação, e. Submeter a fração líquida à cromatografia para ligar ou reter a proteína de membrana em uma fase estacionária, e f. Eluir a fase estacionária com um tampão de eluição para produzir a proteína de membrana em que a centrifugação na etapa d é realizada a 500 g a 30.000 g.

[009] O presente processo tem a vantagem de poder lidar com uma grande quantidade de meio aquoso contendo o organismo hospedeiro. Assim, o processo é capaz de lidar com quantidades de 50 L ou mais, tal como 100 L ou mais, aplicando operações unitárias adequadas para produção de planta piloto ou em grande escala. Além disso, o processo é escalonável e pode ser facilmente adaptado a grandes quantidades de meio aquoso contendo o organismo hospedeiro.

[010] Surpreendentemente, os inventores descobriram que as proteínas de membrana expressas pelo organismo hospedeiro se tornam solubilizadas em maior medida do que outras proteínas, quando uma solução de detergente é adicionada. Estima-se que pelo menos cerca de 60% das proteínas nas vesículas formadas pela solução detergente sejam as proteínas de membrana de interesse. Além disso, as vesículas formadas do detergente foram observadas com um tamanho maior que o normal, como cerca de 0,5 µm, sugerindo que a proteína de membrana forma uma superforma mais estável com o detergente do que os fósforo-lipídeos usados pela natureza.

[011] O meio aquoso contendo o organismo hospedeiro pode ser usado diretamente no processo. No entanto, para obter um produto mais limpo e para evitar o manuseio de quantidades excessivas de meio aquoso, geralmente o meio aquoso compreendendo o organismo hospedeiro da etapa a é filtrado antes da liberação da proteína de membrana de acordo com a etapa b.

[012] Geralmente, o meio aquoso compreendendo o organismo hospedeiro é concentrado por filtração através de um filtro tendo poros pequenos o suficiente para permitir a passagem de detritos celulares e do meio, enquanto as células são retidas. Em uma modalidade adequada, o meio aquoso compreendendo o organismo hospedeiro da etapa a é filtrado através de uma membrana de microfiltração tendo um diâmetro de poro de 0,5 micrômetro ou menos. Preferencialmente, o diâmetro do poro é 0,1 µm ou menos.

[013] Após a etapa de filtração, adequadamente realizada por microfiltração, o organismo hospedeiro pode ser isolado do restante do meio aquoso. Embora sejam possíveis vários processos de separação, é geralmente preferencial que o organismo hospedeiro seja isolado após a filtração por centrifugação do meio aquoso compreendendo o organismo hospedeiro. O processo de centrifugação é geralmente realizado com uma força g que, dentro de um período de tempo adequado, forma um pellet. Portanto, a centrifugação é geralmente realizada a 500 g ou mais, tal como 1000 g ou mais, e preferencialmente 2000 g e mais. A densidade do pellet não deve ser muito alta para evitar dificuldades nas etapas posteriores. Portanto, a centrifugação geralmente não é realizada acima de 30.000 g, tal como não acima de 20.000 g, adequadamente não acima de 15.000 g e preferencialmente não acima de 8.000 g.

[014] As células são colhidas como o pellet e o sobrenadante pode ser descartado. É preferencial que o organismo hospedeiro isolado seja lavado com uma solução salina isotônica para dissolver sais contaminantes e subsequentemente centrifugado como descrito acima para isolar o organismo hospedeiro lavado. A solução de lavagem usada que aparece no sobrenadante pode ser descartada.

[015] O pellet contendo as células lavadas pode ser armazenado por congelamento a -20 °C ou usado diretamente na próxima etapa. Adequadamente, um tampão de diluição é adicionado antes da etapa b. O tampão de diluição pode conter inibidores de protease para prevenir a degradação da proteína de membrana, substâncias reguladoras de pH como TRIS e fosfato para manter um valor de pH dentro de uma faixa desejada e/ou captadores de íons, tal como EDTA.

[016] A proteína de membrana pode ser liberada do organismo hospedeiro de várias maneiras, preferencialmente por lise química ou mecânica das células. Quando a lise química das células é realizada adequadamente, uma solução de lise aquosa é adicionada para liberar a proteína de membrana do organismo hospedeiro. Em um aspecto preferencial da invenção, o tampão de lise aquoso é uma solução detergente, que simultaneamente solubiliza a proteína de membrana.

[017] Para que ocorra a lise das células e a solubilização da proteína de membrana, geralmente as células hospedeiras podem ser submetidas à ação do detergente durante a agitação. Geralmente, as células hospedeiras podem reagir com o detergente por pelo menos uma hora, tal como por 2 horas, e preferencialmente pelo menos 6 horas.

[018] Quando a lise mecânica das células é usada, geralmente a liberação da proteína de membrana das células hospedeiras é realizada por um homogeneizador. É adequado usar um homogeneizador do mesmo tipo usado na indústria de laticínios para homogeneização do leite. Um exemplo adequado inclui o homogeneizador Stansted 7575. Após o tratamento no homogeneizador, as células se rompem, liberando a proteína de membrana.

[019] Após a liberação da proteína de membrana, pode-se adicionar um floculante catiônico. Acredita-se que o floculante catiônico interaja com, inter alia, detritos celulares carregados negativamente, formando flocos. Em um aspecto preferencial da invenção, o floculante catiônico é um composto de poliamina, tal como Superfloc C581.

[020] A formação de flocos usualmente não ocorre instantaneamente. É, portanto, preferencial que o floculante catiônico possa reagir com as partes da célula da ressuspensão durante agitação suave para formar flocos. Usualmente, o floculante catiônico e os detritos celulares são deixados interagir por 10 minutos a 2 horas enquanto são agitados em temperatura ambiente.

[021] Quando a lise química das células é usada, a fração líquida da etapa e é recuperada como o sobrenadante de uma centrifugação da suspensão contendo os flocos. A proteína de membrana aparece no sobrenadante à medida que a proteína de membrana é solubilizada pela solução detergente.

[022] Quando a lise mecânica das células é usada, a fração líquida da etapa e é recuperada de uma ressuspensão de uma fração sólida, em que a fração sólida é ressuspensa em uma solução detergente para solubilizar a proteína de membrana. Em uma modalidade da invenção, a fração sólida é formada devido ao fato de que os fragmentos celulares contendo a proteína de membrana interagem com o floculante e formam flocos, que podem ser separados do líquido por centrifugação. Em outra modalidade da invenção, descobriu-se surpreendentemente que foi possível colher a proteína da membrana no pellet quando se utilizava uma lise mecânica das células, sem a utilização de um floculante. O pellet obtido pela centrifugação pode ser ressuspenso em uma solução detergente para solubilizar a proteína de membrana. Nessa etapa, a fração líquida da etapa e é colhida como o sobrenadante por centrifugação.

[023] O processo de centrifugação é usualmente realizado com uma força g que, dentro de um período de tempo adequado, forma um pellet. Portanto, a centrifugação é usualmente realizada a 500 g ou mais, tal como 1000 g ou mais, e preferencialmente 2000 g ou mais. A densidade do pellet não deve ser muito alta para evitar dificuldades nas etapas posteriores. Portanto, a centrifugação usualmente não é realizada acima de 30.000 g, tal como não acima de 20.000 g, adequadamente não acima de 10.000 g e preferencialmente não acima de 8.000 g. A aplicação de uma força g abaixo de 30.000 g torna possível usar um clarificador comumente usado em laticínios, tais como centrífugas de remoção de esporos da GEA, Tetra Pak, Alfa Laval e SPX Flow Seital Separation Technology. Os clarificantes úteis na presente invenção também podem se referidos como Bactofugos por alguns fabricantes. Assim, a presente invenção pode omitir a aplicação de ultracentrífugas, que são capazes apenas de centrifugação em batelada e tratamento de pequenas quantidades.

[024] Os detergentes usados na presente invenção incluem maltopiranosídeos de alquila, tais como n-dodecil-β-D-maltopiranosídeo (DDM), n-decil-β-D-maltopiranosídeo (DM), ou β-D-maltosídeo de 5-ciclohexilpentil (Cymal-5); glicopiranosídeos de alquila, tais como n-octil-β-D-glucopiranosídeo

(OG); óxidos de amina, tais como N-óxido de n-laurildimetilamina (LDAO); fosfocolinas, tais como n-Dodecilfosfocolina (FC-12), n-tetradecilfosfocolina (FC- 14), ou n-Hexadecilfosfocolina (FC-16); ou glicóis de polioxietileno. Em uma modalidade adequada da invenção, o detergente é selecionado a partir do grupo consistindo em N-óxido de laurildimetilamina (LDAO), octilglucosídeo (OG), dodecil maltosídeo (DDM) ou combinações dos mesmos. O LDAO é um detergente preferencial pois vesículas grandes e estáveis são produzidas, sugerindo que o detergente é capaz de deslocar os fosfolipídios de ocorrência natural.

[025] A fração líquida é submetida a um processo de cromatografia no qual a proteína de membrana é ligada a ou retida por meio de uma fase estacionária. O tipo de cromatografia pode ser selecionado como cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de deslocamento, cromatografia líquida, cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de fase reversa, cromatografia de interação hidrofóbica, etc. Usualmente, o processo de cromatografia é a cromatografia preparatória, ao contrário da cromatografia analítica, para formar uma purificação da proteína de membrana.

[026] Em uma modalidade atualmente preferencial, o método de cromatografia é selecionado como a cromatografia de afinidade, de acordo com a qual uma primeira parte de um par de afinidade é associado à proteína de membrana e a segunda parte do par de afinidade é associado à fase estacionária. Exemplos de uma fase estacionária incluem esferas e material de coluna. Em uma modalidade preferencial da invenção, a fase estacionária associada com uma segunda parte do par de afinidade está presente em uma coluna. Usualmente, as partes dos pares de afinidade são associados às ligações covalentes para a proteína de membrana ou para a fase estacionária. No entanto, outros tipos de associação também são possíveis, tais como hibridização, ligação por afinidade através de interação anticorpo-antígeno, etc.

[027] Um número de pares de afinidade aplicáveis na presente invenção é conhecido pelo técnico no assunto e inclui um par biotina-streptavidina, um par anticorpo-antígeno, um par anticorpo-hapteno, um par de afinidade por aptâmero, um par de proteína de captura, um par de receptor-igG FC, um par de lipídio quelante ao metal, um par de proteína marcado (por HIS) de lipídio- histidina quelante ao metal, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade atualmente preferencial, o par de afinidade é um par de proteína marcada (com HIS) de lipídio-histidina quelante ao metal.

[028] O metal é usualmente imobilizado no material de coluna em uma tecnologia referida como cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC). O metal é selecionado usualmente como Cu(II) ou Ni(II), preferencialmente Ni(II). Usando uma resina Ni-NTA, as proteínas marcadas com His podem ser purificadas automaticamente ou manualmente, Uma fase estacionária adequada é “Capto Chelating” da GE Healthcare ou alternativamente o material de filtração HisTrap Gel (Ni Sepharose 6 Fast Flow) da GE Healthcare.

[029] A primeira parte do par de afinidade sendo um marcador de histidina é ligada usualmente ao C-terminal da proteína de membrana. Considerando que o marcador de histidina compreende usualmente 6 aminoácidos de histidina consecutivos, é preferencial na presente invenção que o marcador de histidina compreenda 8 ou mais moléculas de histidina. O número alto de aminoácidos de histidina no marcador de histidina possibilita separar com eficácia as proteínas de ligação específicas e não-específicas.

[030] Após a adição da fração líquida contendo a proteína de membrana para a coluna, o líquido pode penetrar na resina, por gravidade ou pressão.

Adequadamente, o tampão de eluição compreende imidazol. O imidazol possui a habilidade de interagir com a ligação do marcador de His para o íon metálico imobilizado na resina. Em uma determinada concentração de imidazol, a proteína de membrana marcada com His será liberada.

[031] Para separar a proteína de ligação não-específica da proteína de membrana de interesse, a coluna, geralmente antes da eluição com o tampão de eluição, é lavada com um tampão de lavagem compreendendo 40% ou menos da concentração de imidazol no tampão de eluição. A concentração de imidazol no tampão de eluição está geralmente na faixa de 200mM a 2000mM de imidazol. Em modalidades preferenciais da invenção, a concentração de imidazol no tampão de eluição é 400 mM ou mais. Para obter uma eluição mais eficaz de proteína de membrana marcada com His, a concentração de imidazol nos tampões é geralmente 600mM ou 800mM ou mais.

[032] Para a maioria das aplicações, o marcador com His geralmente possui uma influência desprezível na estrutura, função ou imunogenicidade de proteína. No entanto, pode ser desejável para certas aplicações remover o marcador de His depois que esse tenha servido como função de ligação da molécula de membrana para a coluna. O marcador de His pode ser removido ao se introduzir uma ligação clivável entre a proteína de membrana e o marcador com His. Ligações cliváveis adequada incluem ligantes sensíveis ao pH, ligantes de dissulfeto, ligantes sensíveis à protease e ligantes beta-glucuronídeo.

[033] As proteínas de membrana abrangem, em seu ambiente natural, toda a membrana bilipídica, ou seja, desde o interior da célula até o espaço extracelular. Muitas das proteínas transmembranares funcionam como portas de entrada para substâncias específicas, permitindo assim a troca dessas substâncias entre o interior da célula e o líquido extracelular. Uma característica marcante das proteínas transmembranares é a presença de uma área hidrofóbica, que assegurará a integração da proteína transmembranar na membrana. Além disso, a proteína transmembranar possui segmentos hidrofílicos nos dois lados da área fibrosa oca, em que os referidos segmentos hidrofílicos são direcionados para o interior da célula e o fluido extracelular, respectivamente.

[034] Enquanto acredita-se que qualquer proteína de membrana pode ser produzida de acordo com a presente invenção, é geralmente desejável usar o processo de produção de proteínas de membrana que transportam íons (canais iônicos) e água (canais de água de aquaporina). Os canais iônicos incluem canais de cloreto e transportadores de íon metálico. Certos canais de cloreto, além do íon de cloreto, também conduzem HCO3−, I−, SCN−, e NO3−. Os transportadores de íon metálico incluem transportadores de magnésio, canais de íon de potássio, canais de íon de sódio, canais de cálcio, canais de próton, etc. Em uma determinada modalidade da invenção, a proteína de membrana é uma proteína de membrana externa (OmpA).

[035] Em uma modalidade preferencial da invenção, a proteína de membrana é um canal de água de aquaporina. Os canais de água de aquaporina facilitam o transporte de água para dentro e para fora de uma célula. Em uma membrana industrial, os canais de água de aquaporina asseguram o fluxo de água por osmose, enquanto outros componentes na solução são rejeitados. A proteína de membrana, tal como um canal de água de aquaporina, pode emanar de várias fontes, incluindo organismos procarióticos e eucarióticos. Uma fonte procariótica para aquaporina inclui E. coli, Kyrpidia spormannii, Methanothermobacter sp., Novibacillus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae, e Halomonas sp. Uma fonte eucariótica para aquaporina inclui Oryza sativa Japonica (Arroz japonês), Eucalyptus grandis, Solanum tuberosum (Batata dinamarquesa), e Milnesium tardigradum (urso d’água).

[036] A sequência nucleica da proteína de membrana a partir do organismo fonte é geralmente o códon otimizado usando o serviço da Geneart (Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão no organismo hospedeiro. O gene resultante é sintetizado adequadamente com a adição de códons codificando histidina C-terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N-terminais e C-terminais. O fragmento de gene sintético foi digerido com enzima de restrição e ligado em um fragmento de vetor. A mistura de ligação resultante é transformada preferencialmente em um organismo, tal como Escherichia coli DH10B. Os transformantes resistentes ao antibiótico são selecionados adequadamente em um meio com o antibiótico. Os transformantes foram confirmados por sequenciamento de construções genéticas. O DNA de vetor isolado foi subsequentemente transferido para a hospedeira de produção. A hospedeira de produção pode ser selecionada entre um número de organismos eucarióticos ou procarióticos adequado, tais como Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae.

[037] O organismo hospedeiro é geralmente manipulado para expressar uma proteína de membrana nativa em uma quantidade superior que o normal ou para expressar a proteína de membrana não-nativa. Uma maneira para expressar a proteína de membrana pode ser pela transformação do organismo hospedeiro com um vetor compreendendo DNA codificando a proteína de membrana, como discutido acima. Outra possibilidade para obter a sobre- expressão da proteína de membrana poderia ser pela super regulação da expressão de uma proteína de membrana nativa, por exemplo, ao atenuar um repressor ou inserir uma região promotora adequada. Uma possibilidade adicional para obter a expressão de uma proteína não-nativa seria transfectar um organismo hospedeiro com um vírus ou um bacteriófago contendo um ácido nucleico codificando a proteína de membrana.

EXEMPLOS Exemplo 1

[038] Uma cepa de E. coli BL21 é preparada compreendendo um vetor produzindo proteínas de aquaporina ligadas a um marcador com His no C- terminal. O marcador His contém dez moléculas de histidina consecutivas ligadas à sequência primária da proteína de membrana de aquaporina.

[039] A cepa de E. coli é nutrida em um meio padrão para obter um caldo de fermentação total de 150 L. As células de E. coli foram colhidas pela filtração do caldo de fermentação através de uma membrana de microfiltração com um diâmetro de poro de 0,05 µm. O filtrado contendo as células de E. coli é reduzido para cerca de 50 L e subsequentemente submetido a centrifugação em 5300g por 20 minutos. Assim, as células de E. coli concentradas para cima por microfiltração e o meio restante é subsequentemente removido como o sobrenadante por centrifugação.

[040] Os pellets obtidos por centrifugação são coletados e adicionados com concentração de 1:1 e volume com 0,9% de cloreto de sódio para lavar células e dissolver os sais contaminantes. Subsequentemente, a solução de lavagem é removida em uma centrífuga funcionando a 5300g por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células lavadas coletadas como pellets. Os pellets podem ser armazenados por congelamento a -20 °C ou usados diretamente na próxima etapa.

[041] Os pellets compreendendo as células de E. coli foram solubilizados em cerca de 47 L de tampão TRIS usado como um tampão de ligação. Após agitação por cerca de uma hora, 6,4 L de detergente (5% LDAO) foi adicionado para solubilização para uma concentração final de 0,6%. A mistura foi incubada durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave. Uma lise celular ocorreu pela ressuspensão das células em um tampão contendo um detergente.

Pela lise celular, as proteínas de membrana são liberadas das membranas internas das células e solubilizadas por meio do detergente.

[042] Para remover negativamente o material celular carregado, foi adicionada uma poliamina (Superfloc C581) em um volume de 427 mL. A mistura foi incubada por 30 minutos com agitação à temperatura ambiente para coagular as moléculas carregadas negativamente, tais como detritos celulares, DNA, RNA e uma certa extensão de proteínas. A proteína de membrana solubilizada pelo detergente permanece na fase aquosa. A mistura foi centrifugada a uma velocidade máxima de 5300 g por 15 minutos. O pellet contendo os detritos celulares, DNA, RNA e proteínas solubilizadas é descartado e o sobrenadante é coletado. O sobrenadante é transferido para um recipiente contendo 107 L de tampão de diluição para obter um volume final de 160 L com uma concentração final de 0,2% de LDAO.

[043] É fornecida uma coluna contendo a resina de afinidade ”Capto Chelating” da GE Healthcare. A resina é carregada com Ni2+ que se liga ao marcador His10. A coluna foi carregada com o sobrenadante diluído e lavada com tampão de lavagem de 10 volumes de coluna contendo imidazol 200 mM para remover os componentes de ligação não específicos. Subsequentemente, 2,5 volumes de coluna de tampão de eluição de imidazol aquoso 1000 mM foram usados para liberar a proteína de membrana da coluna. A proteína eluída da coluna foi testada por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio- poliacrilamida (SDS-PAGE), que mostrou apenas uma única faixa indicando uma pureza acima de 80%. Exemplo 2

[044] Uma cepa de E. coli BL21 é preparada compreendendo um vetor produzindo proteínas de aquaporina ligadas a um marcador His no C-terminal. O marcador His contém dez moléculas de histidina consecutivas ligadas à sequência primária da proteína de membrana de aquaporina.

[045] A cepa de E. coli é nutrida em um meio padrão para obter um caldo de fermentação total de 250 L. As células de E. coli foram colhidas pela filtração do caldo de fermentação através de uma membrana de folha plana PES com um diâmetro de poro de 0,05 µm. O filtrado contendo as células de E. coli é reduzido para cerca de 50 L e subsequentemente submetido a centrifugação em 5300g em uma centrífuga Sorvall de 16 L durante 20 minutos. Assim, as células de E. coli concentradas para cima por microfiltração e o meio restante é subsequentemente removido como o sobrenadante por centrifugação. Os pellets podem ser armazenados por congelamento a -20 °C ou usados diretamente na próxima etapa.

[046] Os pellets que compreendem as células de E. coli foram ressuspensos em cerca de 50 L de tampão (solução aquosa do inibidor de protease PMSF e EDTA) e homogeneizados a 1000 bar (1,0 x 108 Pa) em um homogeneizador Stansted nm-GEN 7575. Para isolar o material celular de interesse, uma poliamina (Superfloc C581) é adicionada em uma concentração de 12 mL/L. A temperatura foi mantida em torno de 10-15 °C. A mistura foi incubada por 30 minutos com agitação à temperatura ambiente. A mistura foi centrifugada a uma velocidade máxima de 5300 g por 30 minutos. O pellet contém a proteína de membrana e o sobrenadante é descartado.

[047] O pellet foi ressuspenso em uma solução de cloreto de sódio a 0,9% para obter uma concentração total de proteína de aproximadamente 50 mg/mL. A solubilização da proteína de membrana foi realizada pela adição de 28 L de tampão de ligação TRIS e 4,5 litros de LDAO a 5% a 5 L do material de pellet ressuspenso. À temperatura ambiente e com agitação suave, a mistura foi deixada para incubar por 2 a 24 horas.

[048] Após o processo de solubilização, a mistura foi centrifugada em recipientes de 2 L a 5300g por 90 minutos. O sobrenadante foi recuperado e a concentração de LDAO foi ajustada a 0,2% por adição de tampão de diluição.

[049] É fornecida uma coluna contendo a resina de afinidade ”Capto Chelating” da GE Healthcare. A resina é carregada com Ni2+ que se liga ao marcador His10. A coluna foi equilibrada ao carregar o tampão de ligação com 0,2% de LDAO. Subsequentemente, a coluna foi carregada com o sobrenadante diluído e lavada com tampão de lavagem de 10 volumes de coluna contendo imidazol 200 mM para remover os componentes de ligação não específicos. Subsequentemente, 2,5 volumes de coluna de tampão de eluição de imidazol aquoso 1000 mM são usados para liberar a proteína de membrana da coluna. A proteína eluída da coluna foi testada por cromatografia em eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), que mostrou apenas uma única faixa indicando uma pureza acima de 95%. Exemplo 3

[050] Uma cepa de E. coli BL21 é preparada compreendendo um vetor produzindo proteínas de aquaporina ligadas a um marcador His no C-terminal. O marcador His contém dez moléculas de histidina consecutivas ligadas à sequência primária da proteína de membrana de aquaporina.

[051] A cepa de E. coli é nutrida em um meio padrão para obter um caldo de fermentação total de 250 L. A batelada de fermentação teve um OD600 13 quando coletado, e foi induzido por 42,5 horas. O material foi homogeneizado duas vezes a 100 MPa em um homogeneizador Stansted nm-GEN 7575. 10 mL foram retirados do material lisado e adicionados a um tubo falcon de 15 mL.

[052] A centrifugação foi então realizada por 1 hora com 5300 g e o sedimento foi separado do sobrenadante. O sedimento foi então ressuspenso em 10 mL de NaCl a 0,9%. O ensaio de BCA foi usado para determinar a concentração (mg/mL de proteína total) dos pellets ressuspensos e os sobrenadantes separados após a primeira rotação.

[053] Os pellets ressuspensos e os sobrenadantes separados foram finalmente solubilizados (1 mL) por 2 horas em 0,6% LDAO (120 µL de estoque de LDAO a 5% da Carbosynth foi usado para 1 mL de material) e foram centrifugados novamente a 5300 G por 15 minutos. Mais uma vez, os sobrenadantes foram separados dos pellets. Os pellets foram ressuspensos (até 1 mL novamente) em tampão de ligação LDAO a/o.

[054] Todas as amostras foram analisadas em gel SDS, o que mostrou que cerca de 60% das proteínas no sobrenadante era proteína de membrana de aquaporina. Exemplo 4

[055] Após a purificação da Aquaporina Z no exemplo 2, foi medida a distribuição de tamanho da proteína solubilizada em LDAO.

[056] A comparação foi realizada entre o mesmo tampão de eluição, com ou sem proteína, para avaliar se a distribuição de tamanho de partícula foi influenciada pelos componentes de tampão (incluindo detergente) ou pela proteína de membrana.

[057] A proteína Aquaporina Z foi eluída a partir da coluna IMAC usando tampão de eluição com imidazol 1000 mM e 0,2% p/v de LDAO. A proteína purificada foi medida quanto à sua concentração de proteína por análise de aminoácidos. 6,44 mg/mL de proteína límpida solubilizada em tampão de eluição foram carregados em 3 cubetas separadas (Sarstedt, 4 mL, PMMA, ca. nº.

67.755, Nümbrecht, Alemanha) e analisados quanto à distribuição de tamanho pelo Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern UK) usando o software Malvern Zetasizer v.7.02. Os resultados apresentados na tabela 1 são as médias das amostras executadas em triplicado. Tabela 1:

Amostra Concentração de Tamanho, diâmetro (d.nm) AqpZ (mg/mL) Intensidade de população (%) Pop. 1 Pop. 2 Pop. 3 AqpZ purificada em 6,44 315,6 ± 108 ± 17,1 ± tampão de eluição 116,8 nm 32,3 nm 2,5 nm (méd.) 45,9% 35,5% 14,9% Tampão de eluição 0 0,85 ± 8,6 ± 1,2 103 ± (méd.) 0,16 nm nm 5,5 nm 56,8% 41,1% 2,1%

[058] A amostra de tampão de eluição (sem proteína) contém uma distribuição de população com 97,9% das partículas com um tamanho de 8,6 nm ou menor, indicando que não houve grandes micelas de detergente na solução que poderiam ser retidos por microfiltração. 81,4% das partículas na amostra com proteína mostraram um tamanho de 108 nm ou maior, indicando desse modo que a presença da proteína e detergente juntos formam grandes partículas solúveis que são retidas durante a microfiltração. Interessantemente, o experimento mostrou que são produzidas partículas grandes e estáveis compostas de micelas LDAO e proteína de membrana. Exemplo 5 Expressão de aquaporina rotulada a partir de Oryza sativa Japonica (Arroz japonês) em Escherichia coli e sua purificação usando IMAC

[059] O gene codificando aquaporina a partir de Oryza sativa Japonica (UNIPROT: A3C132) foi o códon otimizado usando o serviço da Geneart (Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão de E. coli. O gene resultante foi sintetizado com a adição de dez códons codificando histidina C-terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N- terminais e C-terminais, respectivamente (Gene ID:

aquaporin_Oryza_sativa_Japonica). O fragmento de gene sintético foi digerido com enzimas de restrição NdeI/XhoI e ligado ao fragmento de NdeI/XhoI - digerido e de vetor pUP1909 purificado. A mistura de ligação resultante foi transformada em Escherichia coli DH10B e transformantes resistentes a canamicina foram selecionados em placas de ágar LB com canamicina. Os transformantes foram confirmados por sequenciamento de construções genéticas. O DNA de vetor isolado foi transferido na sequência para a hospedeira de produção, Escherichia coli BL21.

[060] A fim de expressar aquaporina heterologamente em E. coli, a hospedeira de produção foi crescida em meio mínimo consistindo em 30 g/L de glicerol, 6 g/L de (NH4)2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 5 g/L de NaCl, 0,25 g/L de MgSO4∙7H2O, 0,4 g/L de citrato de Fe(III) de 1 mL/L de solução de metal vestigial filtrada estéril. A solução de metal vestigial consistiu em 1 g/L de EDTA, 0,8 g/L de CoCl2∙6H2O, 1,5 MnCl2∙4H2O, 0,4 g/L de CuCl2∙2H2O, 0,4 g/L de H3BO3, 0,8 g/L de Na2MoO4∙2H2O, 1,3 g/L de Zn(CH3COO)2∙2H2O. Após a inoculação e crescimento durante a noite, 0,25 g/L de MgSO4∙7H2O foram adicionados.

[061] A E. coli foi cultivada em Biorreatores 3L Applikon com ez-Control em um processo de fermentação em batelada. A produção de proteína foi induzida pela adição de IPTG adicionado a uma concentração final de 0,5 mM em uma densidade óptica (OD 600 nm) de aproximadamente 30. A cultura foi induzida por aproximadamente 24 horas e as células bacterianas foram coletadas com centrifugação a 5300 g por 20min.

[062] Os pellets que compreendem as células de E. coli foram ressuspensos em tampão (solução aquosa do inibidor de protease PMSF e EDTA) e homogeneizados a 1000 bar (1,0 x 108 Pa)em um homogeneizador Stansted nm- GEN 7575. A temperatura foi mantida em torno de 10-15 °C. A mistura foi centrifugada a uma velocidade máxima de 5300 g por 30 minutos. O pellet contém a proteína de membrana e o sobrenadante é descartado.

[063] O pellet foi ressuspenso em uma solução de cloreto de sódio a 0,9% para obter uma concentração total de proteína de aproximadamente 50 mg/mL. A solubilização da proteína de membrana foi realizada pela adição de 28 L de tampão de ligação TRIS e 4,5 litros de LDAO a 5% a 5 L do material de pellet ressuspenso. À temperatura ambiente e com agitação suave, a mistura foi deixada para incubar por 2 a 24 horas.

[064] Após o processo de solubilização, a mistura foi centrifugada em recipientes de 2 L a 5300g por 90 minutos. O sobrenadante foi recuperado e a concentração de LDAO foi ajustada a 0,2% por adição de tampão de diluição.

[065] Após a solubilização e clarificação, a proteína foi capturada usando IMAC e eluída em tampão de eluição contendo imidazol 1000 nM e 0,2% p/v de LDAO. As frações de eluição foram analisadas por SDS Page e revelaram apenas uma única banda principal que migrou a 27 kDa, o que corresponde ao tamanho da aquaporina a partir do arroz japonês. Além disso, o resultado foi confirmado pela comparação a uma purificação de controle negativa a partir de E. coli transformada com um vetor vazio. O controle negativo resultou em nenhuma proteína purificada. A análise de Western blot com anticorpos (TaKaRa Bio) específicas para o marcador de histidina resultaram conforme esperado em um sinal claro a partir da proteína purificada e em nenhum sinal a partir do controle negativo confirmando a origem da proteína purificada como proteína de membrana marcada com histidina. Exemplo 6 Expressão de aquaporina marcada a partir de Eucalyptus grandis em Escherichia coli e sua purificação usando IMAC

[066] O gene codificando aquaporina a partir de Eucalyptus grandis (UNIPROT: A0A059C9Z4) foi o códon otimizado usando o serviço da Geneart

(Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão de E. coli. O gene resultante foi sintetizado com a adição de dez códons codificando histidina C-terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N- terminais e C-terminais, respectivamente (Gene ID: aquaporin_Eucalyptus_grandis). O gene foi clonado e expresso conforme descrito no Exemplo 5. A proteína foi purificada com sucesso e confirmada conforme descrito no Exemplo 5. Exemplo 7 Expressão de aquaporina marcada a partir de Solanum tuberosum (batata dinamarquesa) em Escherichia coli e sua purificação usando IMAC

[067] O gene codificando aquaporina a partir de Solanum tuberosum (UNIPROT: Q38HT6) foi o códon otimizado usando o serviço da Geneart (Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão de E. coli. O gene resultante foi sintetizado com a adição de dez códons codificando histidina C-terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N- terminais e C-terminais, respectivamente (Gene ID: aquaporin_Solanum_tuberosum). O gene foi clonado e expresso conforme descrito no Exemplo 5. A proteína foi purificada com sucesso e confirmada conforme descrito no Exemplo 5. Exemplo 8 Expressão de aquaporina marcada a partir de Milnesium tardigradum (urso d’água) em Escherichia coli e purificada usando IMAC

[068] O gene codificando aquaporina a partir de Milnesium tardigradum (UNIPROT: G5CTG2) foi o códon otimizado usando o serviço da Geneart (Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão de E. coli. O gene resultante foi sintetizado com a adição de dez códons codificando histidina C-terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N-

terminais e C-terminais, respectivamente (Gene ID: aquaporin_Milnesium_tardigradum). O gene foi clonado e expresso conforme descrito no Exemplo 5. A proteína foi purificada com sucesso e confirmada conforme descrito no Exemplo 5. Exemplo 9 Expressão de aquaporina marcada a partir de Halomonas sp. em Escherichia coli e sua purificação usando IMAC

[069] O gene codificando aquaporina a partir de Halomonas sp. (UNIPROT: A0A2N0G6U6) foi o códon otimizado usando o serviço da Geneart (Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão de E. coli. O gene resultante foi sintetizado com a adição de dez códons codificando histidina C- terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N-terminais e C- terminais, respectivamente (Gene ID: aquaporin_ Halomonas_sp). O gene foi clonado e expresso conforme descrito no Exemplo 5. A proteína foi purificada com sucesso e confirmada conforme descrito no Exemplo 5. Exemplo 10 Expressão de aquaporina marcada a partir de Kyrpidia spormannii em Escherichia coli e sua purificação usando IMAC

[070] O gene codificando aquaporina a partir de Kyrpidia sp. (UNIPROT: A0A2K8N5Z5) foi o códon otimizado usando o serviço da Geneart (Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão de E. coli. O gene resultante foi sintetizado com a adição de dez códons codificando histidina C- terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N-terminais e C- terminais, respectivamente (Gene ID: aquaporin_Kyrpidia_spormannii). O gene foi clonado e expresso conforme descrito no Exemplo 5. A proteína foi purificada com sucesso e confirmada conforme descrito no Exemplo 5. Exemplo 11

Expressão de aquaporina marcada a partir de Methanothermobacter sp. em Escherichia coli e sua purificação usando IMAC

[071] O gene codificando aquaporina a partir de Methanothermobacter sp. (UNIPROT: A0A223ZCQ2) foi o códon otimizado usando o serviço da Geneart (Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão de E. coli. O gene resultante foi sintetizado com a adição de dez códons codificando histidina C-terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N- terminais e C-terminais, respectivamente (Gene ID: aquaporin_ Methanothermobacter_sp). O gene foi clonado e expresso conforme descrito no Exemplo 5. A proteína foi purificada com sucesso e confirmada conforme descrito no Exemplo 5. Exemplo 12 Expressão de aquaporina marcada a partir de Novibacillus thermophilus em Escherichia coli e sua purificação usando IMAC

[072] O gene codificando aquaporina a partir de Novibacillus thermophilus (UNIPROT: A0A1U9K5R2) foi o códon otimizado usando o serviço da Geneart (Subsidiária da Thermo Fischer Scientific) para aprimorar a expressão de E. coli. O gene resultante foi sintetizado com a adição de dez códons codificando histidina C-terminal, ao longo de sítios de restrição NdeI/XhoI com flancos N- terminais e C-terminais, respectivamente (Gene ID: aquaporin_ Novibacillus_thermophilus). O gene foi clonado e expresso conforme descrito no Exemplo 5. A proteína foi purificada com sucesso e confirmada conforme descrito no Exemplo 5. Exemplo 13 Expressão de proteína de membrana externa A (OmpA) a partir de Escherichia coli em E. coli

[073] A expressão e purificação de OmpA (UNIPROT: P0A910) em E. coli foi realizada essencialmente conforme descrito no Exemplo 5, exceto que E. coli foi transformada com um vetor vazio e solubilização foi prolongada para 24 horas. A proteína solubilizada resultante foi estimada para uma pureza de aproximadamente 30-50% por SDS-PAGE, atestando assim, claramente, que OmpA foi isolada com sucesso na fração de membrana seguindo o processo de purificação padrão. Uma etapa de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) adicional poderia adicionalmente ter purificado OmpA. Exemplo 14

[074] Construção de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae expressando aquaporina-Z (AqpZ) a partir de Escherichia coli fundida a um yEGFP marcado com histidina em N-terminal e separado por um sítio de clivagem de protease Tobacco Etch Virus (TEV).

[075] A AqpZ (UNIPROT ID: P60844) a partir de E. coli foi o códon otimizado para a expressão em S. cerevisiae usando o serviço Geneart para expressão aprimorada em S. cerevisiae. Para expressão em S. cerevisiae, a AqpZ foi fundida com proteína de levedura fluorescente verde (yEGFP) com N-terminal (Brendan P. Cormack et al, Microbiology (1997), 143, 303-311) para permitir a detecção visual e quantificação da expressão de proteína de membrana. Além disso, oito histidinas (His 8) foram adicionadas ao N-terminal para yEGFP como um marcador de purificação IMAC. A His8-yEGFP e AqpZ foram separadas geneticamente por meio de um sítio de clivagem de protease TEV incorporado por primers PCR durante a construção.

[076] A construção rápida e eficiente do plasmídeo codificando a fusão de His8-yEGFP-TEV-AqpZ foi realizada por recombinação homóloga in vivo de regiões de sobreposição incorporadas pelos primers em S. cerevisiae entre um fragmento de His8-yEGFP-TEV PCR, um fragmento de PCR TEV-AqpZ, e o plasmídeo de expressão linearizada derivado a partir da digestão de SalI, HindIII e BamHI do plasmídeo pEMBLyex4, conforme descrito em (Scientific Reports 7: 16899). O sítio de clivagem TEV permite a remoção subsequente da proteína His8-yEGFP por meio da protease TEV.

[077] A seleção de transformantes de S. cerevisiae foi realizada em placas de meio mínimo deficientes em uracila mas suplementadas com leucina e lisina para assegurar a sobrevivência das células bacterianas com fragmentos de DNA recombinados corretamente. A composição do meio e as concentrações de aminoácido usados nesse exemplo foram idênticas àquelas listadas no Exemplo

15. Exemplo 15

[078] Expressão de His8-yEGFP-TEV-AqpZ com Saccharomyces cerevisiae.

[079] Uma única colônia de células de levedura transformadas foi propagada seletivamente até a saturação em cerca de 5 mL de meio mínimo de glicose suplementado com 60 mg/L de leucina e 30 mg/L de lisina. 200 μL dessa cultura foi propagada subsequentemente em 5 mL de meio mínimo de glicose suplementado com 30 mg/L de lisina para seleção por números de cópias de plasmídeos elevados. Foram preparados estoques congelados de células com número elevado de cópias de plasmídeo.

[080] 200 µL descongelados de um estoque congelado foram adicionados a 10 mL de meio mínimo suplementado com lisina e crescidos até a saturação. 1 mL da cultura foi transferido para 100 mL do mesmo meio. Após crescer durante a noite, uma alíquota correspondente a um OD600 final de 0,05 foi transferido para 1,5 litros de meio mínimo com uma concentração inicial de 20 g/L de glicose como fonte de carbono e 30 g/L de glicerol suplementado com aminoácidos extras. A cultura foi crescida em um biorreator 3L Applikon® equipado com ez- Control conectado a um software Lucullus® funcionando em PC (Applikon, Holanda, e SecureCell, Suíça).

[081] A parte inicial da fermentação foi realizada a 20 °C em meio mínimo. O biorreator foi alimentado com glicose até uma concentração de 3% p/v quando a quantidade inicial de glicose foi metabolizada. O pH do meio crescido foi mantido em 6.0 por meio da adição de 1M de NH4OH controlada por computador. Quando o gás de exaustão de CO2 foi nivelado, devido ao acesso limitado de glicose, o biorreator foi arrefecido a 15 °C antes da indução da produção de AQP recombinante. A adição de 50 mL/L do meio de expressão consistindo em 400 mL/L de ASD-10, 400 mL/L de aminoácidos extras, 200 g/L de glicerol e 20 g/L de galactose iniciou a expressão da proteína recombinante. As células de levedura foram colhidas após ~96 h.

[082] O meio mínimo consistiu em 20 g/L de glicose, 100 mL/L de ASD-10, 5 mL/L de V-200, 30 g/L de glicerol e 0,1 g/L de Ca2Cl. O ASD-10 consiste em 50 g/L (NH4)2SO4, 8,75 g/L KH2PO4, 1,25 g/L K2HPO4, 5 g/L MgSO4∙7H2O, 1 g/L NaCl, 5 mg/L H3BO3, 1 mg/L KI, 4 mg/L MnSO4∙1H2O, 4,2 mg/L ZnSO4∙7H2O, 0,4 mg/L CuSO4∙5H2O, 2 mg/L FeCl3 e 2 mg/L Na2MoO4∙2H2O. O V-200 consistiu em 4 mg/L de Biotina, 400 mg/L de ácido D-pantotênico, 0,4 mg/L de ácido fólico, 2000 mg/L de mio-inositol, 80 mg/L de niacina, 40 mg/L de p-aminobenzoato, 80 mg/L de piridoxina, 40 mg/L de riboflavina e 80 mg/L de tiamina. Quando iniciado, o meio contendo os aminoácidos adicionais consistindo em 600 mg/L de alanina, 600 mg/L de arginina, 600 mg/L de cisteína, 3000 mg/L de ácido glutâmico, 2000 mg/L de lisina, 600 mg/L de metionina, 1500 mg/L de fenilalanina, 600 mg/L de prolina, 10000 mg/L de serina, 900 mg/L de tirosina, 4500 mg/L de valina, 2000 mg/L de ácido aspártico, 4000 mg/L de treonina, 600 mg/L de histidina e 600 mg/L de triptofano. Exemplo 16 Clonagem de His8-yEGFP-TEV-AQP5 a partir de Milnesium tardigradum em um Biorreator com Saccharomyces cerevisiae

[083] A construção de His8-yEGFP-TEV-AQP5 foi preparada seguindo o procedimento delineado no Exemplo 14. A proteína AQP5 a partir de M. tardigradum (UNIPROT: G5CTG2) foi o códon otimizado para a expressão em E. coli apesar da necessidade de expressão em levedura. Exemplo 17 Purificação de His8-yEGFP-TEV-AqpZ e His8-yEGFP-TEV-AQP5 a partir de S. cerevisiae

[084] A purificação da proteína de membrana expressa heterologamente a partir de S. cerevisiae foi realizada conforme descrito no exemplo 2, exceto que os volumes de tampão aplicados foram dimensionados por baixo para corresponder aos volumes de cultura reduzidos e que a lise foi realizada a 1800 bar (1,8 x 108 Pa). A produção e pureza de proteína foi confirmada com sucesso pelas duas proteínas de fusão com SDS page e Western Blot e não puderam detectar proteínas contaminantes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de uma proteína de membrana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. expressar uma proteína de membrana em um organismo hospedeiro presente em um meio aquoso, b. liberar a proteína de membrana do organismo hospedeiro, c. adicionar uma solução detergente para solubilizar a proteína de membrana, d. recuperar uma fração líquida da proteína de membrana solubilizada como o sobrenadante por centrifugação, e. submeter a fração líquida a cromatografia para ligar ou reter a proteína de membrana em uma fase estacionária, e f. eluir a fase estacionária com um tampão de eluição para produzir a proteína de membrana em que a centrifugação na etapa d é realizada a 500 g a 30.000 g.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio aquoso compreendendo o organismo hospedeiro da etapa a é filtrado antes da liberação do organismo hospedeiro de acordo com a etapa b.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o meio aquoso compreendendo o organismo hospedeiro da etapa a é filtrado através de uma membrana de microfiltração tendo um diâmetro de poro de 0,5 micrômetros ou menos.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o organismo hospedeiro é isolado, opcionalmente após a filtração, por centrifugação do meio aquoso compreendendo o organismo hospedeiro.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a centrifugação é realizada a 500 g a 30.000 g,

preferencialmente a 1.000 g a 10.000 g.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o organismo hospedeiro isolado é lavado com uma solução salina isotônica para dissolver sais contaminantes e subsequentemente centrifugado para isolar o organismo hospedeiro lavado.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que um tampão de diluição é adicionado antes da etapa b.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que uma solução de lise aquosa é adicionada para liberar a proteína de membrana do organismo hospedeiro.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o tampão de lise aquoso é uma solução detergente, que solubiliza simultaneamente a proteína de membrana.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras podem ser submetidas à ação do detergente durante a agitação.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a liberação da proteína de membrana das células hospedeiras é realizada por um homogeneizador.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que um floculante catiônico é adicionado à proteína de membrana liberada para formar uma suspensão.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o floculante catiônico é um composto de poliamina.

14. Processo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o floculante catiônico pode reagir com as partes celulares da ressuspensão durante uma agitação suave para formar flocos.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a fração líquida da etapa d é recuperada como o sobrenadante de uma centrifugação da suspensão contendo os flocos.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a fração líquida da etapa d é recuperada de uma ressuspensão de uma fração sólida, em que a fração sólida é ressuspensa em uma solução detergente para solubilizar a proteína de membrana.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a fração líquida da etapa d é colhida como o sobrenadante por centrifugação.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o detergente é selecionado a partir do grupo consistindo em N-óxido de laurildimetilamina (LDAO), octilglucosídeo (OG), dodecil maltosídeo (DDM) ou combinações dos mesmos.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a centrifugação é realizada a 500 g a 30.000 g, preferencialmente a 1.000 g a 10.000g.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a fase estacionária capaz de ligar ou reter a proteína de membrana está presente em uma coluna.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a proteína de membrana é associada com uma primeira parte de um par de afinidade e a fase estacionária é associada com uma segunda parte do par de afinidade.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a primeira parte do par de afinidade é um marcador de histidina.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o marcador de histidina compreende 8 ou mais moléculas de histidina.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição compreende imidazol.

25. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a coluna antes da eluição com o tampão de eluição, é lavada com um tampão de lavagem compreendendo 40% ou menos da concentração de imidazol no tampão de eluição.

26. Processo de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a concentração de imidazol no tampão de eluição é 400 mM ou mais.