LT7069B - Ląstelių auginimo būdas - Google Patents

Abstract

Pagal šį išradimą yra pateiktas nuskaidrintos ląstelių kultūros, apimančios rekombinantinį baltymą, gamybos būdas, kur metodas apima: i) bioreaktoriaus inokuliavimą ląstele šeimininke tam, kad būtų gauta ląstelių kultūra, kur minėta ląstelė šeimininkė yra Escherichia coli, transformuota raiškos sistema, apimančia: a) nukleorūgštį, koduojančią rekombinantinį baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi; ir b) nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, funkcionaliai susietą su antruoju indukuojamu promotoriumi; ii) ląstelių kultūros fermentavimą, esant tokioms sąlygoms, kurios: a) suteikia galimybę ekspresuoti rekombinantinį polipeptidą; ir b) suteikia galimybę prasiskverbti į ląstelę taip, kad susidarytų sferoplastas, išskiriantis rekombinantinį polipeptidą; iii) nuskaidrinimą fermentuotos ląstelių kultūros, apimančios išskiriamą rekombinantinį baltymą, kur minėtas nuskaidrinimas apima pirminio nuskaidrinimo etapą, naudojant pirmąjį nuskaidrinimo filtrą, kurio porų dydis užtikrina bent apie 0,4 µm arba didesnes sulaikymo ribas, kur nuskaidrinimo etapas neapima centrifugavimo.

Description

TECHNIKOS SRITIS

Šis išradimas yra susijęs su sistema, skirta ekspresuoti rekombinantinius baltymus panaudojant E. coli.

TECHNIKOS LYGIS

Escherichia coli yra dažnai pasirenkamas mikroorganizmas rekombinantiniams baltymams gaminti. Pagrindinės šio populiarumo priežastys yra dideli augimo tempai ir raiškos lygis, taip pat reikalingos paprastos ir nebrangios auginimo terpės. Tačiau E. coli yra prastai sekretuoja baltymus, o tarpląstelinių baltymų gamybos metodai, kuriuose naudojami E. coli, reikalauja ląstelių ardymo ir ląstelių nuolaužų pašalinimo. Priešingai, užląstelinė rekombinantinių baltymų ir fermentų gamyba labai sumažina bioproceso gamybos metodo sudėtingumą ir pagerina rekombinantinio produkto kokybę, kartu supaprastina baltymų aptikimą ir gryninimą. Be to, buvo įrodyta, kad aplinka, kurioje nėra su ląstelėmis susijusio proteolitinio skilimo, sukuria optimalią aplinką baltymų erdvinių struktūrų susidarymui.

Siekiant palengvinti tarpląstelinių baltymų gamybą iš E. coli, gali būti naudojamos įvairios technologijos. Paprastai pradiniai šių metodų etapai apima bakterijų ląstelių ūžavimą arba suardymą tam, kad būtų suardyta bakterijų ląstelių sienelė ir ląsteliniai baltymai galėtų išsiskirti į tarpląstelinę aplinką. Po šio atpalaidavimo reikalingi baltymai yra išgryninami iš ekstraktų, įprastai atliekant kelis chromatografijos etapus.

Įrodyta, kad keli metodai yra naudotini siekiant išlaisvinti tarpląstelinius baltymus iš bakterijų ląstelių. Tarp jų yra cheminės ližės naudojimas, fiziniai ardymo metodai arba cheminių ir fizinių metodų derinys (Felix, H., Anai. Biochem. 120:211-234 (1982)).

Cheminiai bakterijų ląstelių sienelių ardymo metodai, kurie pasirodė tinkami, apima ląstelių apdorojimą organiniais tirpikliais, tokiais kaip toluenas, (Putnam, S. L., and Koch, A. L., Anai. Biochem. 63:350-360 (1975); Laurent, S. J., and Vannier, F. S., Biochimie 59:747-750 (1977); Felix, H., Anai. Biochem. 120:211-234 (1982)), chaotropais, tokiais kaip guanidino druskos (Hettwer, D., and Wang, H., Biotechnol. Bioeng. 33:886-895 (1989)), antibiotikais, tokiais kaip polimiksinas B (Schupp, J. M., etai., BioTechniques 19:18-20 (1995); Felix, H., Anai. Biochem. 120:211-234 (1982)), arba fermentais, tokiais kaip lizocimas arba lizostafinas (McHenty, C. S., and Kornberg, A., J. Biol. Chem. 252(18):6478-6484 (1977); Cull, M., and McHenry, C. S., Meth. Enzymol. 182:147-153 (1990); Hughes, A. J., Jr., et al., J. Cell Biochem. Suppl. 016 (Part B):84 (1992); Sambrook, J., et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), pp. 17- 38; Ausubel, F. M., et al., in Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley & Sons (1993), pp. 4.4.1-4.47). Šių įvairių cheminių medžiagų poveikį galima sustiprinti tuo pačiu metu apdorojant bakterijų ląsteles detergentais, tokiais kaip Triton X-100®, natrio dodecilsulfatas (SDS) arba Brij 35 (Laurent, S. J., and Vannier, F. S., Biochimie 59:747-750 (1977); Felix, H., Anai. Biochem. 120:211234 (1982); Hettwer, D., and Wang, H., Biotechnol. Bioeng, 33:886-895 (1989); Cull, M., and McHenry, C. S., Meth. Enzymol. 182:147-153 (1990); Schupp, J. M., et ai., BioTechniques 19:18-20 (1995)), arba baltymais ar protaminais, tokiais kaip galvijų serumo albuminas ar spermidinas (McHenry, C. H. and Kornberg, A., J. Biol. Chem. 252(18): 6478-6484 (1977); Felix, H., Anai. Biochem. 120:211-234 (1982); Hughes, A. J., Jr., et al., J. Cell Biochem. Suppl. 0 16 (Part B):84 (1992)).

Be šių įvairių cheminių apdorojimo būdų, buvo naudojami keli fiziniai ardymo metodai. Šie fiziniai metodai apima osmosinį šoką, pvz., ląstelių suspensiją hipotoniniame tirpale, kai yra arba nėra emulsiklių (Roberts, J. D., and Lieberman, M. W., Biochemistry 18:4499-4505(1979); Felix, H., Anai. Biochem. 120:211-234(1982)), džiovinimą (Mowshowitz, D. B., Anai. Biochem. 70:94-99 (1976)), maišymą su granulėmis, tokį kaip malimą rutuliniame malūne (Felix, H., Anai. Biochem. 120:211234 (1982); Cull, M., and McHenry, C. S., Meth. Enzymol. 182:182:147-153 (1990)), temperatūrinį šoką, pvz., sušaldymo-atšildymo ciklai (Lazzarini, R. A., and Johnson L. D., Nature New Biol. 243:17-20 (1975); Felix, H., Anal, Biochem. 120:211-234(1982)), apdorojimą ultragarsu (Amos, H., et al., J. Bacteriol. 94:232-240 (1967); Ausubel, F. M., et al., in Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley & Sons (1993), pp. 4.4.1-4.47) suardymą slėgiu, pvz., panaudojant prancūziško preso slėgio kamerą (Ausubel, F. M., et al., in Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley & Sons (1993), pp. 16.8.6-16.8.8). Kiti metodai apjungia šiuos cheminius ir fizinius suardymo metodus, pvz., apdorojimą lizocimu, po kurio atliekamas apdorojimas ultragarsu arba slėgiu, siekiant maksimaliai padidinti ląstelių ardymą ir baltymų išsiskyrimą (Ausubel, F. M., et al., in Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley & Sons (1993), pp. 4.4.1 -4.47).

Šie suardymo metodai turi keletą privalumų, įskaitant jų gebėjimą greitai ir visiškai suardyti bakterijų ląsteles taip, kad būtų maksimaliai padidintas tarpląstelinių baltymų išsiskyrimas.

Tačiau šie metodai taip pat turi ryškių trūkumų. Pavyzdžiui, fiziniai metodai iš esmės apima bakterijų ląstelių sienelių ir plazmos membranų suplėšymą ir suskaidymą. Dėl šių procesų gaunami ekstraktai, kuriuose yra daug kietųjų dalelių, tokių kaip membranos arba ląstelės sienelės fragmentai, kurie turi būti pašalinti iš ekstraktų, įprastai centrifuguojant, prieš išgryninant rekombinantinius baltymus. Šis centrifugavimo poreikis apriboja serijos, kurią galima apdoroti vienu kartu, dydį iki turimos centrifūgos tūrio dydžio; taigi, didelio gamybos masto preparatai yra neįgyvendinami, o gal net neįmanomi. Be to, fiziniai metodai ir daugelis cheminių metodų įprastai lemia ne tik norimų tarpląstelinių baltymų, bet ir nepageidaujamų nukleorugščių bei membraninių lipidų išsiskyrimą iš ląstelių (pastarųjų ypač atsiranda naudojant organinius tirpiklius). Šie nepageidaujami ląstelių komponentai taip pat apsunkina tolesnius pageidaujamų baltymų gryninimo procesus, nes padidina ekstraktų klampumą (Sambrook, J., et al., in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), pp 17-38; Cull, M., and McHenry, C. S., Meth. Enzymol. 182:147-153 (1990)) ir su dideliu avidiškumu bei giminingumu jungiasi prie nukleorūgštis modifikuojančių baltymų, tokių kaip DNR polimerazės, RNR polimerazės ir restrikcijos fermentai.

Natūraliai atsirandantys lizuojantys ir simbiontiniai bakteriofagai turi galimybę išprovokuoti šeimininko ląstelių ližę, ekspresuodami specifinius baltymus lizinio ciklo metu. Šie lizinuojantys baltymai buvo nustatyti ir plačiai ištirti, pavyzdžiui, T4 ir T7 bakteriofaguose. Lizuojantys baltymai apima ir holinus, ir lizocimus. Holinai suformuoja stabilius ir nespecifinius citoplazminės membranos pažeidimus, kurie sudaro sąlygas lizocimams patekti į peptidoglikano sluoksnį. Lizocimai pasižymi muraliziniu aktyvumu prieš tris skirtingus ląstelės sienelės peptidoglikano polimero kovalentinių ryšių tipus (glikozidinius, amidinius ir peptidinius). Kartu holino ir lizocimo aktyvumas suardo dvi gramneigiamų bakterijų ląstelių membranas ir taip sukelia ląstelių ližę.

E. coli buvo sukonstruota taip, kad ekspresuotų T4 bakteriofago lizinius baltymus tam, kad būtų užtikrinta užprogramuota ląstelių ližė, siekiant pagerinti rekombinantinių baltymų gamybos tolesnio apdorojimo efektyvumą ir ekonomiškumą ( M. Morita, K. Asami, Y. Tanji, and H. Unno, “Programmed Escherichia coli Cell Lysis by Expression of Cloned T4 Phage Lysis Genes,” Biotechnology Progress , vol. 17, (no. 3), pp. 573-576, 2001).

Konstruktai Escherichia coli pagrindu yra auksinis standartas rekombinantinių baltymų gamyboje, kai modifikacijos po transliacijos yra nebūtinos. Pagrindinės E. coli populiarumo priežastys yra dideli augimo tempai ir ekspresijos lygiai, taip pat paprastos ir nebrangios auginimo terpės.

Tačiau E. coli nėra tobulas šeimininkas, nes jos įprastai neišskiria baltymų į tarpląstelinę terpę. Taigi viena problema, susijusi su metodais, kuriuose naudojamos E. coli, yra ta, kad ląstelių ardymo žingsnis tampa ribojimu ir nėra ekonomiškai efektyvus bandomuoju ar pramoniniu mastu, kai siekiama įgyvendinti uždarą ir (arba) nuolatinį proceso vyksmą.

Viena su šiais metodais susijusių problemų yra ta, kad gauti rekombinantiniai baltymai įprastai turi priemaišų. Tai, pavyzdžiui, yra problema gaminant nukleorūgštis modifikuojančius fermentus, nes fermentų preparatai įprastai yra užteršti nukleorūgštimis (pvz., RNR ir DNR). Ši phemaišinė nukleorūgštis gali būti ne tik iš organizmų, kurie yra fermento šaltinis, bet ir iš nežinomų organizmų, esančių reagentuose ir medžiagose, naudojamose fermentui valyti po jo išsiskyrimo iš ląstelių. Tai ypač aktualu atvirkštinės transkriptazės arba DNR polimerazės fermentams, nes jie yra įprastai naudojami nukleorūgščių molekulių amplifikacijos ir sintezės metoduose (pvz., polimerazės grandininėje reakcijoje (PGR), ypač RT-PGR). Tokiame pavyzdyje užterštos DNR arba RNR buvimas fermentų preparatuose yra didelė problema, nes tai gali sukelti klaidingus amplifikacijos arba sintezės rezultatus. Be to, augant fermentų, kaip biokatalizatorių, poreikiui farmacijoje, fermentų preparatų kokybei keliami papildomi reikalavimai, tokie kaip specifiškumas, nuoseklumas pereinant nuo vienos serijos prie kitos, gyvūninės kilmės priemaišų ir antibiotikų nebuvimas, būtinai turi atitikti norminius reikalavimus.

Taigi, išlieka rekombinantinių baltymų, apimančių E. coli, kuriuose iš esmės nėra priemaišų, tokių kaip nukleorūgštys, gamybos metodų poreikis. Šie metodai gali pašalinti užteršimo riziką, pavyzdžiui, iš aplinkos ir personalo, ir įgalinti greitesnį ir lygiagretų gamybos procesą vieno proceso atlikimo įrenginyje.

TRUMPAS IŠRADIMO APRAŠYMAS

Pagal šį išradimą yra pateiktas nuskaidrintos ląstelių kultūros, apimančios rekombinantinį baltymą, gamybos būdas, kur metodas apima:

i) bioreaktoriaus inokuliavimą ląstele šeimininke tam, kad būtų gauta ląstelių kultūra, kur minėta ląstelė šeimininkė yra Escherichia coli, transformuota raiškos sistema, apimančia:

a) nukleorūgštį, koduojančią rekombinantinį baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi, kur baltymas yra 2-O-metiltransferazė (OMT); ir

b) nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, funkcionaliai susietą su antruoju indukuojamu promotoriumi;

ii) ląstelių kultūros fermentavimą, esant tokioms sąlygoms, kurios:

a) suteikia galimybę ekspresuoti rekombinantinį polipeptidą; ir

b) suteikia galimybę prasiskverbti į ląstelę taip, kad susiformuotų sferoplastas, išskiriantis rekombinantinį polipeptidą, kur minėta fermentavimo pakopa apima stabilizuojančio agento pridėjimą į ląstelių kultūrą;

iii) nuskaidrinimą fermentuotos ląstelių kultūros, apimančios išskiriamą rekombinantinį baltymą, kur minėtas nuskaidrinimas apima:

a) flokuliavimo agento pridėjimą į ląstelių kultūrą, kur flokuliavimo agentas yra polietileniminas (PEI);

b) flokuliuotų ląstelių kultūros pirminio nuskaidrinimo etapą, panaudojant pirmąjį nuskaidrinimo filtrą, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai apie 0,4 ųm arba didesnes sulaikymo ribas, kur nuskaidrinimo etapas neapima centrifugavimo.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, metodas papildomai apima antrinį nuskaidrinimo etapą, panaudojant antrąjį filtrą, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai apie 0,22 ųm sulaikymo ribas.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, pirminiame nuskaidrinimo etape naudojamas pirmasis filtras, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai nuo maždaug 0,4 iki maždaug 0,8 pm sulaikymo ribas.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, antrinio nuskaidrinimo etape naudojamas antrasis filtras, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai apie 0,4-0,8 pm, arba mažiausiai nuo maždaug 1,0 iki maždaug 3,0 pm sulaikymo ribas.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, pirminis nuskaidrinimo etapas ir (arba) antrinis nuskaidrinimo etapas yra mikrofiltravimas, kur pasirinktinai mikrofiltravimas yra giluminis filtravimas.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, mikrofiltravimas yra pasirenkamas iš normalaus srauto filtravimo (NFF) arba tangentinio srauto filtravimo (TFF).

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, nuskaidrintos ląstelių kultūros drumstumas yra mažesnis nei maždaug 20 NTU.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, procesas atliekamas uždaroje sistemoje taip, kad tarp bioreaktoriaus ir pirmojo bei antrojo nuskaidrinimo filtrų būtų palaikomas sterilus srautas.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, procesas taip pat apima pakopą, kai su minėta nuskaidrinta ląstelių kultūra vykdomos viena arba daugiau iš minėto rekombinantinio baltymo gryninimo pakopų.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, stabilizuojantis agentas apima sacharozę, Na2SO4 ir Brij 35, pasirinktinai 1 M sacharozę, 0,5 M Na2SO4 ir 0,5 % Brij 35.

Šis išradimas taip pat pateikia baltymo gamybos būdą, apimantį:

i) rekombinantinės Escherichia coli ląstelės kultivavimą tokiomis sąlygomis, kurios:

a) suteikia galimybę ekspresuoti baltymą; ir

b) suteikia galimybę prasiskverbti į ląstelę taip, kad susidarytų sferoplastas, kuris sekretuoja rekombinantinį polipeptidą; ir ii) baltymo išskyrimą iš kultūros be visiško rekombinantinės ląstelės ūžavimo, kur ląstelė apima raiškos sistemą, apimančią:

a) nukleorūgštį, koduojančią baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi, kur baltymas yra 2-O-metiltransferazė (OMT); ir

b) nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, funkcionaliai susietą su antruoju indukuojamu promotoriumi.

Tinkamu būdu, išradimo metodai neapima: (i) mechaninio ląstelių ardymo; (ii) egzogeninio fermento, kuris ardo ląstelės sienelę, pridėjimo; ir (iii) ląstelės transformavimo raiškos vektoriais, kurių sudėtyje yra nukleorūgštis, koduojanti egzogeninį fermentą, kuris ardo citoplazminę membraną.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, nukleorūgštis, koduojanti baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi, yra pirmajame konstrukte, o nukleorūgštis, koduojanti T4 lizocimą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, yra antrajame konstrukte.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, pirmasis indukuojamas promotorius ir antrasis indukuojamas promotorius yra indukuojami nuosekliai.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, pirmasis indukuojamas promotorius ir antrasis indukuojamas promotorius yra indukuojami vienu metu.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, pirmasis indukuojamas promotorius yra IPTG indukuojamas promotorius, pasirinktinai kur IPTG indukuojamas promotorius yra PT7.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, antrasis indukuojamas promotorius yra arabinozės indukuojamas promotorius, kur pasirinktinai arabinozės indukuojamas promotorius yra araB.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, T4 lizocimo fermentą koduoja genas E.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, E. coli yra Escherichia coli JS007 kamienas arba Escherichia coli B kamienas.

Tinkamu būdu, šio išradimo metoduose, fermentavimas arba kultivavimas apima temperatūros pakeitimą iš pirmosios temperatūros į antrąją temperatūrą, kur pasirinktinai antroji temperatūra yra žemesnė nei pirmoji temperatūra.

Išradimas taip pat pateikia rekombinantinį baltymą, pagamintą naudojant šio išradimo metodus.

TRUMPAS BRĖŽINIŲ APRAŠYMAS

Išradimo įgyvendinimo variantai toliau aprašomi kartu su nuoroda į pridedamus brėžinius, kuriuose:

paveiksle parodytos plazmidžių struktūros: (A) tikslinio geno raiškos vektorius pLATE31-VP39delta32-KnR, (B) T4 geno gpe raiškos vektorius pACYC184PT7-pelB-gpe-lacl.

paveiksle parodytas mikroskopinis E. coli ląstelių vaizdas prieš ir po gpe geno raiškos indukcijos.

paveiksle parodytas E. coli JS007/ pLATE31-VP39delta32-KnR/pACYCPT7-pelB-gpe-lacl kultivuojamų ląstelių ekstrakto ir terpės mėginių 12 % SDS-PAGE gelis po 2-0- metiltransferazės indukcijos. (1, 7 ir 13) „PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder“, 10-250 kDa (Thermo Fisher); (2) ląstelių mėginys po 1 valandos baltymų sintezės indukcijos; (3) ląstelių mėginys po 2 valandų baltymų sintezės indukcijos; (4) ląstelių mėginys po 3 valandų baltymų sintezės indukcijos; (5) ląstelių mėginys po 5 valandų baltymų sintezės indukcijos; (6) ląstelių mėginys po 17 valandų baltymų sintezės indukcijos; (8) terpės mėginys po 1 valandos baltymų sintezės indukcijos; (9) terpės mėginys po 2 valandų baltymų sintezės indukcijos; (10) terpės mėginys po 3 valandų baltymų sintezės indukcijos; (11) terpės mėginys po 5 valandų baltymų sintezės indukcijos; (12) terpės mėginys po 17 valandų baltymų sintezės indukcijos; į terpę išsiskirianti 2-O-metiltransferazė pažymėta rodykle.

paveiksle parodyta parodyta OMT raiška Biostat bioreaktoriuje.

paveiksle pateiktas OMT kultūros augimo dinamikos palyginimas Biostat A bioreaktorių sistemose (4 vai. ir maitinimo per naktį (OV) laikas).

paveiksle pateiktas OMT aktyvumo dinamikos palyginimas Biostat A bioreaktorių sistemose be autolizės ir su autolize (4 vai. ir maitinimo per naktį (OV) laikas).

paveiksle pateikta nuskaidrinimo proceso schema, naudojama įvairiems rekombinantiniams baltymams, tokiems kaip OMT (2-O-metiltransferazė), gauti.

DETALUS APRAŠYMAS

Skaitytojo dėmesys nukreipiamas į visus straipsnius ir dokumentus, kurie yra pateikti kartu su šia specifikacija arba iki jos pateikimo, susijusius su šia paraiška, ir kurie yra atviri visuomenei susipažinti su šia specifikacija, o visų tokių straipsnių ir dokumentų turinys čia įtrauktas kaip nuoroda.

Atitinkamai, išradimas pateikia išgrynintos ląstelių kultūros, apimančios rekombinantinį baltymą, gamybos būdą, kur metodas apima:

i) bioreaktoriaus inokuliavimą ląstele šeimininke tam, kad būtų gauta ląstelių kultūra, kur minėta ląstelė šeimininkė yra Escherichia coli, transformuota raiškos sistema, apimančia:

a) nukleorūgštį, koduojančią rekombinantinį baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi, kur baltymas yra 2-O-metiltransferazė (OMT); ir

b) nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, funkcionaliai susietą su antruoju indukuojamu promotoriumi;

ii) ląstelių kultūros fermentavimą, esant tokioms sąlygoms, kurios:

a) suteikia galimybę ekspresuoti rekombinantinį polipeptidą; ir

b) suteikia galimybę prasiskverbti į ląstelę taip, kad susiformuotų sferoplastas, išskiriantis rekombinantinį polipeptidą;

ku r minėta fermentavimo pakopa apima stabilizuojančio agento pridėjimą į ląstelių kultūrą;

iii) nuskaidrinimą fermentuotos ląstelių kultūros, apimančios išskiriamą rekombinantinį baltymą, kur minėtas nuskaidrinimas apima

c) flokuliavimo agento pridėjimą į ląstelių kultūrą, kur flokuliavimo agentas yra polietileniminas (PEI);

d) flokuliuotų ląstelių kultūros pirminio nuskaidrinimo etapą, panaudojant pirmąjį nuskaidrinimo filtrą, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai apie 0,4 ųm arba didesnes sulaikymo ribas, kur nuskaidrinimo etapas neapima centrifugavimo.

Kaip privalumą išradėjai nustatė, kad rekombinantiniai E. coli sferoplastai išskiria baltymą iki ląstelių ližės.

Išradėjai parodė, kad koordinuota nukleorūgšties, koduojančios T4 lizocimą, susietą su pektato liazės B (PelB) sekrecijos signaline seka, raiška kartu su nukleorūgšties, koduojančios rekombinantinį polipeptidą (pvz., 2-O-metiltransferazę), užtikrina labai veiksmingą būdą ekspresuoti didelius rekombinantinio baltymo kiekius, pvz. 2-O-metiltransferazės, be reikmės surinkti rekombinantines ląsteles iš fermentacijos kultūros ir vėliau ląsteles lizuoti mechaniniu arba fermentiniu būdu taip, kad būtų atpalaiduotas rekombinantinis baltymas. Tuo atveju, kai T4 fago lizocimo genas yra klonuojamas po griežtai kontroliuojamo promotoriaus, tokio kaip araB, T4 fago lizocimo periplazminis kaupimasis gali būti sužadintas pridedant induktoriaus (pvz., arabinozės) tinkamu fermentacijos proceso metu. T4 fago lizocimo raiška su PelB signaline seka palengvina T4 lizocimo perkėlimą į periplazminę sritį, kur fermentas suardo peptidoglikano sluoksnį, ir dėl to ląstelėje atsiranda morfologinių pokyčių, dėl kurių susidaro sferoplastas.

Rekombinantinis polipeptido genas, pvz., 2-O-metiltransferazės genas, yra klonuojamas kontroliuojant indukuojamam promotoriui, tokiam kaip PT7 arba lacllV5, polimerazės raiška gali būti indukuojama pridedant induktohų, tokį kaip IPTG, tinkamu fermentacijos proceso momentu. Realizavus rekombinantinio peptido, pvz., 2-Ometiltransferazės ir T4 fago lizocimo, nukleorūgšties raišką taip, kad ji būtų kontroliuojama atskiro promotoriaus, jų ekspresija gali nepriklausomai reguliuoti kiekvieno fermento gamybą fermentacijos metu. Išradėjai parodė, kad T4 lizocimo sukelti sferoplastai išskiria rekombinantinį baltymą, pvz., 2-O-metiltransferazę, į kultūros supernatantą, nereikalaujant sekrecijos signalinės sekos. Išradėjai pastebėjo, kad rekombinantinė raiška rekombinantinio baltymo, pvz., 2-O-metiltransferazės, neturi žalingo poveikio ląstelei šeimininkei. Iš tiesų išradėjai parodė, kad indukuoti sferoplastai galėjo de novo ekspresuoti rekombinantinį peptidą, pvz., 2-Ometiltransferazę, mažiausiai 4 arba 5 valandas po T4 lizocimo indukcijos. Be to išradėjai pademonstravo, kad gautą fermentuotą ląstelių kultūrą galima sėkmingai nuskaidrinti naudojant nuskaidrinimo filtrą, kurio porų dydis neįprastai didelis, kas užtikrina mažiausiai apie 0,4 ųm sulaikymo ribas. Tai buvo visiškai netikėta, nes nustatyti E.coli bakterijai rekomenduojami pirminiai nuskaidrinimo metodai pagrįsti tangentiniu srauto filtravimu, panaudojant filtrą, kurio porų dydis <0,2 ųm, kartu su centrifugavimu tam, kad būtų pašalintos ląstelių nuolaužos.

Papildomai išradėjai įrodė, kad fermentuotos sferoplastų ląstelių kultūros gali būti efektyviai išvalytos neatliekant centrifugavimo. Pašalinus centrifugavimo pakopos būtinumą, fermentacija ir nuskaidrinimas gali būti vykdomi uždaroje sistemoje, tokiu būdu pašalinant išorinio užteršimo riziką.

Taigi E. coli, transformuotų raiškos sistema, kuri sudaro sąlygas ląstelės pralaidumui, derinyje su nuskaidrinimo procesu, kuriam nereikalingas centrifugavimas, ne tik sumažina užteršimo riziką baltymų gamybos metu, bet ir papildomai eliminuoja eilę tolesnių apdorojimo būdų gamybos etapuose, įskaitant: ląstelių surinkimą, mechaninį ir (arba) fermentinį ląstelių ūžavimą, ląstelių nuolaužų atskyrimą, nukleorūgščių nusodinimą, po kurio vyksta atskyrimas naudojant filtravimą arba centrifugavimą. Taigi apibrėžti metodai užtikrina didelę baltymų išeigą esant dideliam ląstelių tankiui ir padidintam mastui. Be to, eliminavus poreikį lizuoti ląsteles šeimininkes ir susijusius centrifugavimo etapus, sutrumpėja didelio masto apdorojimo laikas nei naudojant įprastus metodus ūžavimo pagrindu.

Raiškos sistema

Išradimo būde naudojama raiškos sistema, kuri apima i) nukleorūgštį, koduojančią rekombinantinį baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi; ir ii) nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, funkcionaliai susietą su antruoju indukuojamu promotoriumi, kur baltymas yra 2-O-metiltransferazė (OMT).

Čia vartojamas terminas „2-O-metiltransferazė“ arba „OMT“ reiškia fermentą, kuris prideda metilo grupę pirmojo nukleotido 2'-0 padėtyje, greta kepurės struktūros 5' RNR gale. 2-O-metiltransferazė gali būti gauta iš Vaccinia viruso geno vp39. 2-Ometiltransferazė gali būti optimizuota raiškai E.coli bakterijose. 2-O-metiltransferazė gali būti siejama: NCBI sekos ID: AGJ91263.1, baltymo pavadinimas: daugiafunkcinis poli-A polimerazės mažasis subvienetas VP39 [Vaccinia virus]. Atitinkamai, 2-Ometiltransferazė gali apimti seką SEQ ID Nr. 1.

Čia vartojamas terminas „T4 lizocimas“, „E baltymas“ arba „gpe“ reiškia citoplazminę muramidazę, kuri palengvina T4 fagu užkrėstų bakterijų ląstelių ližę, tokiu būdu atpalaiduojant replikuotas fago daleles (Tsugitaand Inouye, J. Mol. Biol., 37: 20112 (1968); Tsugita and Inouye, J. Biol. Chem., 243: 391-97 (1968), Uniprot accession: D9IEF7), arba mutantą, darinį arba fragmentą, turintį DNR polimerazės aktyvumą. Ją koduoja T4 bakteriofago genas, ir ji hidrolizuoja ryšius tarp N-acetilgliukozamino ir Nacetilmuramo rūgšties liekanų standžiajame E. coli ląstelės apvalkalo peptidoglikano sluoksnyje. Fermentas yra vienos polipeptidinės grandinės, kurios molekulinė masė yra 18,3 kDa. Ji yra maždaug 250 kartų aktyvesnė nei HEW-lizocimas bakterinio peptidoglikano atžvilgiu (Matthews et al., J. Mol. Biol., 147: 545-558 (1981)). Optimali pH vertė T4 lizocimo fermento aktyvumui yra 7,3, o HEW-lizocimui - 9 (The Worthington Manual ; pp 219- 221). T4 fermentas gali turėti seką, apibrėžtą NCBI referentinę seką: NP_049736.1. T4 fermentas gali turėti seką SEQ ID Nr. 2.

Čia vartojamas terminas „rekombinantinis“ reiškia baltymus, kurie yra sukonstruoti, paruošti, ekspresuoti, sukurti, pagaminti ir (arba) išskirti rekombinantinėmis priemonėmis, tokiomis kaip, polipeptidai, ekspresuojami naudojant rekombinantinį raiškos vektorių, transfekuotą į ląstelę šeimininkę. Kai kuriuose įgyvendinimo variantuose rekombinantinis baltymas yra funkcinis variantas, gautas iš žinomo 2-O-metiltransferazės (OMT) polipeptido. Kai kuriuose įgyvendinimo variantuose funkcinio varianto polipeptido seka yra mažiausiai 70 %, 75 %, 80 %, 82 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, identiška 2-O-metiltransferazės (OMT) polipeptido sekai SEQ ID Nr. 1. Dviejų sekų tapatumo procentinė dalis priklauso nuo identiškų sekų padėčių skaičiaus, atsižvelgiant į tarpų skaičių ir kiekvieno tarpo ilgį, kurį reikia įvesti, kad dvi sekos būtų optimaliai suderintos. Sekų palyginimas ir dviejų sekų tapatumo procentinis nustatymas gali būti atliktas naudojant matematinį algoritmą. Priimtiname įgyvendinimo variante dviejų aminorūgščių sekų identiškumo procentas yra nustatomas naudojant (Needleman ir kt. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) algoritmą, kuris buvo įtrauktas į GAP programą GCG programinės įrangos pakete (galima rasti adresu http://www.qcq.com), naudojant BLOSUM 62 matricą arba PAM250 matricą ir tarpo svorį lygų 16, 14, 12, 10, 8, 6 arba 4, o ilgio svorį lygų 1, 2, 3, 4, 5 arba 6. Dar kitame priimtiname įgyvendinimo variante procentinis dviejų nukleotidų sekų tapatumas nustatomas naudojant GAP programą GCG programinės įrangos pakete (galima rasti adresu http://www.gcg.com), naudojant NWSgapdna.CMP matricą ir tarpo svorį lygų 40, 50, 60, 70 arba 80, o ilgio svorį lygų 1, 2, 3, 4, 5 arba 6. Ypač pageidautinas parametrų rinkinys (ir tas, kuris turėtų būti naudojamas, jei specialistas nėra tikras, kokius parametrus reikėtų taikyti, kad nustatytų, ar molekulė išsitenka išradimo sekos tapatumo arba homologijos apribojimuose) yra BLOSUM 62 balų skaičiavimo matrica su tarpo bauda lygia 12, tarpo išplėtimo bauda 4, ir rėmelio poslinkio tarpo bauda lygia 5. Kaip alternatyvą, dviejų aminorūgščių arba nukleotidų sekų procentinį tapatumą galima nustatyti naudojant algoritmą (Meyers ir kt. (1989) CABIOS 4:11-17)), kuris buvo įtrauktas į ALIGN programą (2.0 versija), naudojant PAM120 svorio liekanos lentelę, tarpo ilgio baudą lygią 12 ir tarpo baudą lygią 4.

Raiškos sistemos, skirtos panaudoti pagal šio išradimo būdą, gali būti suformuotos naudojant metodus, kurie yra gerai žinomi šioje srityje. Apskritai, cDNR arba genominė DNR, koduojanti rekombinantinį baltymą, tokį kaip 2-0metiltransferazė arba T4 lizocimas, yra tinkamai įterpiama į replikuojamą vektorių, skirtą raiškai E. coli ląstelėse, kontroliuojant E. coli tinkamu promotoriumi. Tinkami vektoriai yra gerai žinomi šioje srityje, o atitinkamo vektoriaus pasirinkimas priklausys nuo nukleorūgšties, kuri bus įterpiama į vektorių, dydžio ir ląstelės šeimininkės, kuri turi būti transformuojama vektoriumi. Kiekvienas vektorius turi įvairių komponentų. Pavyzdžiui, bakterinės transformacijos vektoriai apims rekombinantinio polipeptido signalinę seką ir taip pat rekombinantinio polipeptido promotorių. Pageidautina, kad jie apimtų replikacijos pradžią ir vieną arba daugiau žymeklių genų.

Pageidautina, kad vektoriai būtų gauti iš rūšių, suderinamų su ląstele šeimininke, ir būtų naudojami kartu su bakteriniais šeimininkais, t. y. vektorius, suderinamas su E. coli. Pageidautina, kad vektoriuje būtų replikacijos vieta ir žymenys, kurie užtikrintų transformuotų ląstelių fenotipinę atranką. Raiškos vektoriai, skirti naudoti šiame išradime, pageidautina turi nukleorūgšties seką, kuri leidžia vektoriui replikuotis vienoje arba keliose pasirinktose ląstelėse šeimininkėse. Yra gerai žinomos tokios įvairių bakterijų sekos.

Raiškos vektoriai, skirti naudoti šiame išradime, pageidautina turi atrankos geną arba atrankai skirtą žymenį. Šis genas koduoja baltymą, būtiną transformuotų ląstelių šeimininkių, auginamų selektyvioje auginimo terpėje, išgyvenimui arba augimui. Ląstelės šeimininkės, netransformuotos vektoriumi, bet turinčios atrankos geną, auginimo terpėje neišgyvena. Tipiški atrankos genai koduoja baltymus, kurie (a) suteikia atsparumą antibiotikams arba kitiems toksinams, pvz., ampicilinui, neomicinui, metotreksatui arba tetraciklinui, (b) papildo auksotrofinius trūkumus arba (c) aprūpina svarbiomis maistinėmis medžiagomis, kurių nėra kompleksinėje terpėje.

Raiškos vektoriai, skirti naudoti šiame išradime, turi indukuojamą promotorių, kurį atpažįsta bakterinis organizmas šeimininkas, ir kuris yra funkcionaliai sujungtas su nukleorūgštimi, koduojančia dominantį polipeptidą, t. y. rekombinantinio baltymo, pvz., 2-O-metiltransferazės arba T4 lizocimo.

Indukuojami promotoriai, tinkami naudoti su bakterinėmis šeimininkėmis, tokiomis kaip E. coli, apima β-laktamazės ir laktozės promotorių sistemas (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), arabinozės promotorių sistemą, įskaitant araBAD promotorių (Guzman et ai., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992); Guzman et ai., J. Bacteriol., 177: 4121-4130 (1995); Siegele and Hu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8168-8172 (1997)), ramnozės promotorių (Haldimann et ai., J. Bacteriol., 180: 1277-1286 (1998)), šarminės fosfatazės promotorių, thptofano (trp) promotoriaus sistemą (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) ir EP 36,776), PLtetO-1 ir Plac/ara-1 promotorius (Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res., 25: 1203-1210 (1997)) ir hibridinius promotorius, tokius kaip tac promotorius (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)).

Čia vartojamas terminas „indukuojamas promotorius“ reiškia promotorių, kuris, prisijungęs prie transkripcijos faktoriaus, nukreipia transkripciją padidintu arba sumažintu greičiu.

Čia vartojamas terminas „transkripcijos faktorius“ reiškia bet kokius faktorius, kurie gali prisijungti prie promotoriaus reguliavimo arba kontrolės srities ir taip paveikti transkripciją. Transkripcijos faktoriaus sintezė arba promotorių surišimo gebėjimas ląstelėje šeimininkėje gali būti kontroliuojamas veikiant šeimininką „induktoriumi“ arba pašalinant „represorių“ iš ląstelės šeimininkės terpės. Atitinkamai, norint reguliuoti indukuojamo promotoriaus raišką, į ląstelės šeimininkės auginimo terpę pridedamas induktohus arba iš jos pašalinamas represorius.

Čia vartojama frazė „sukelti ekspresiją“ arba „indukuoti raišką“ reiškia padidinti transkripciją nuo specifinių genų, veikiant ląsteles, kuriose yra tokių genų, efektoriumi arba induktoriumi.

Čia vartojamas terminas „induktorius“ yra cheminis arba fizinis agentas, kuris, patekęs į ląsteles, padidina transkripcijų nuo specifinių genų kiekį. Tai gali būti mažos molekulės, kurių poveikis būdingas tam tikriems operonams arba genų grupėms ir gali apimti cukrų, alkoholį, metalų jonus, hormonus, šilumą, šaltį ir panašiai. Pavyzdžiui, izopropiltio^-galaktozidas (IPTG) ir laktozė yra lac UV5 promotoriaus induktoriai, o L arabinozė yra tinkamas arabinozės (araB) promotoriaus induktorius.

Čia vartojamas terminas „indukuojamas promotorius“ yra promotorius, kuris, prisijungęs prie transkripcijos faktoriaus, nukreipia transkripciją padidintu arba sumažintu greičiu.

Čia vartojamas terminas „kontroliuojamas (-a)“ reiškia nukleorūgščių seką, funkcionaliai susietą su kita nukleorūgščių seka. Pavyzdžiui, promotorius arba stipriklis yra funkcionaliai susietas su koduojančia seka, jei tai veikia sekos transkripciją. Tam reikia, kad prijungtos DNR sekos būtų viena greta viena kitos ir, jei sekreciniai peptidai yra nuskaitymo rėmelyje.

Atitinkamai E. coli yra transformuojama naudojant pBR322 - plazmidę, gautą iš E. coli rūšių. Žiūr. pvz., Bolivar et ai., Gene, 2: 95 (1977). Plazmidėje pBR322 yra genų, suteikiančių atsparumą ampicilinui ir tetraciklinui tam, kad būtų galima identifikuoti transformuotas ląsteles. Plazmidė pBR322 arba kita mikrobinė plazmidė, arba fagas taip pat įprastai turi arba yra modifikuotas taip, kad jame būtų promotorių, kuriuos bakterinis organizmas gali naudoti atrenkamų žymenų genų raiškai. Išradimo raiškos sistema apima nukleorūgštį, koduojančią rekombinantinį baltymą, funkcionaliai prijungtą prie pirmojo indukuojamo promotoriaus.

Šio išradimo raiškos sistema taip pat apima nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, funkcionaliai susietą su antruoju indukuojamu promotoriumi.

Čia vartojamas terminas „sekrecinis signalinis peptidas“ arba „signalinis peptidas“ reiškia peptidą, kuris gali būti naudojamas rekombinantiniam polipeptidui išskirti į bakterijos šeimininkės periplazmą. Heterologinio polipeptido signalas gali būti endogeninis bakterijoms arba jis gali būti egzogeninis, įskaitant signalus, būdingus polipeptidui, kurį gamina bakterijos šeimininkės. Paprastai signalinė seka gali būti vektoriaus komponentas arba polipeptidinės DNR, įterptos į vektorių, dalis. Pageidautina, kad vektorius turėtų nukleorūgštį, koduojančią signalinę seką T4 lizocimo baltymo N gale. Pageidautina, kad sekrecinis signalinis peptidas būtų pektato liazė B (PelB). Viename įgyvendinimo variante PelB seka gali būti iš Erwinia spp. Atitinkamai, čia atskleista gpe su pelb signaline seka, kuri apima seką SEQ ID Nr. 2. Sekrecijos signalinė seka gali būti tiesiogiai susieta su nukleotidų seka, koduojančia rekombinantinį polipeptidą, pvz. 2-O-metiltransferazę. Kaip alternatyva, tarp sekrecinio signalinio peptido ir nukleotidų sekos, koduojančios rekombinantinį polipeptidą, pvz. 2O-metiltransferazę, gali būti tarpiklis. Tarpiklis gali apimti daugiau arba mažiau nei 9 nukleotidus, tokius kaip, pavyzdžiui, nuo 5 iki 20 nukleotidų.

Konstruojant vektorius, turinčius vieną arba daugiau aukščiau aprašytų komponentų, naudojami gerai žinomi ligavimo metodai. DNR fragmentai suskaidomi ir vėl surišami tokia forma, kuri reikalinga tinkamiems vektoriams sukurti.

Patvirtinimą, kad sukonstruotose plazmidėse ir vektoriuose yra teisingos sekos, galima gauti transformuojant E. coli K12 kamieną 294 (ATCC 31,446) arba kitus tinkamus kamienus, ir atrenkant transformantus pagal atsparumą ampicilinui arba tetraciklinui.

Viename įgyvendinimo variante vektorius ekspresuoja 2-O-metiltransferazę, kontroliuojant IPTG indukuojamam pT7 promotoriui arba IPTG indukuojamam lacllV5 promotoriui. Pageidautina, kad vektorius būtų pLATE31 vektorius. Viename įgyvendinimo variante vektorius yra pBR322 vektorius. Viename įgyvendinimo variante vektorius yra pLATE31-VP39delta32-KnR, kaip aprašyta čia.

Viename įgyvendinimo variante vektorius ekspresuoja T4 fago lizocimą, turintį N gale PelB signalinę seką, kontroliuojamą araB promotoriaus. Pavyzdžiui, T4 bakteriofago lizocimo genas gpe su pelB signaliniu peptidu gali būti klonuojamas į griežtai kontroliuojamą pLATE11 vektorių (kat. K1241, Thermo Fisher) tam, kad būtų sumažinta ližės genų raiška neindukuotose ląstelėse - fragmentas, kuriame yra transkripcijos terminatorius rrnBT1-T2 užkerta kelią bazinei geno raiškai nuo vektoriaus, gauto iš promotoriaus tipo elementų, T7 RNR polimerazės promotorius, kuris valdo klonuoto gpe geno transkripciją, ir dvi šoninės lac operatoriaus sekos užtikrina griežtą genų raiškos kontrolę, Ptet promotorius sumažina bazinę raišką nuo T7 promotoriaus, T7 terminatorius nutraukia transkripciją nuo T7 promotoriaus, o lac represorius, kuris užtikrina griežtą bazinės raiškos kontrolę nuo T7 promotoriaus, gali būti subklonuotas į pACYC184 vektorių, kuris turi p15A replikacijos pradžią ir yra suderinamas su plazmidėmis, turinčiomis ColE1 ori (plazmidė pACYC184) - PT7pelB-gpe-lacl). Atitinkamai, viename įgyvendinimo variante vektorius yra pACYC184PT7-pelB-gpe-lacl. Viename įgyvendinimo variante vektorius yra pLATE11. Viename įgyvendinimo variante vektorius yra pBR322 vektorius. Viename įgyvendinimo variante vektorius yra pET29 vektorius. Viename įgyvendinimo variante vektorius yra pLysS lacl-PcsP-pelB-gpe, kur lacl-PcsP yra šalčiu indukuojamas promotorius csp tandeme su IPTG indukuojamu operonu lacl. Viename įgyvendinimo variante vektorius yra pACYCI 84-lacl-Pcsp-PelB-gpe.

Ląstelė šeimininkė

Išradimo metode panaudojama ląstelė šeimininkė, t. y. E. coli, transformuota arba transfekuota aukščiau aprašytomis raiškos sistemomis.

Čia vartojamas terminas „transformuotas“ arba „transformacija“ reiškia DNR įvedimą į organizmą taip, kad DNR būtų replikuojama arba kaip ekstrachromosominis elementas, arba kaip chromosominė integracija. Priklausomai nuo naudojamos ląstelės šeimininkės, transformacija yra atliekama naudojant standartinius tokioms ląstelėms tinkamus metodus.

Rekombinantinės ląstelės, skirtos naudoti šio išradimo metoduose, gali būti pagamintos panaudojant rekombinantines DNR technologijas, kurios yra žinomos tos srities specialistui (žiūr. pvz., Kotewicz, M. L., et ai., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988); Soltis, D. A., and Skalka, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3372-3376 (1988)). Tokios rekombinantinės ląstelės gali būti auginamos taikant standartinius mikrobiologinius metodus, panaudojant auginimo terpę ir inkubavimo sąlygas, tinkamas tam tikrų rūšių aktyvioms kultūroms auginti, kurios yra gerai žinomos tos srities specialistui (žiūr. pvz., Brock, T. D., and Freeze, H., J. Bacteriol. 98(1):289-297 (1969); Oshima, T., and Imahori, K., Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1):102-112(1974)).

Transformacija reiškia DNR įvedimą į organizmą taip, kad DNR būtų replikuojama kaip ekstrachromosominis elementas, arba kaip chromosominė integracija. Priklausomai nuo naudojamos ląstelės šeimininkės, transformacija atliekama naudojant standartinius tokioms ląstelėms tinkamus metodus. Apdorojimas kalciu naudojant kalcio chloridą, kaip aprašyta Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), įprastai naudojamas bakterijų ląstelėms, kuriose yra esminių ląstelių sienelių barjerų. Kitame transformacijos būde panaudojamas polietileno glikolis/DMSO, kaip aprašyta Chung and Miller, Nucleic Acids Res., 16: 3580(1988). Dar vienas metodas yra technologijos, vadinamos elektroporacija, panaudojimas.

Čia vartojamos sąvokos „ląstelė“, „ląstelių linija“ ir „ląstelių kultūra“ yra vartojamos pakaitomis, ir visos šios sąvokos apima palikuonis. Taigi, žodžiai „transformantai“ ir „transformuotos ląstelės“ apima pirminę ląstelę ir iš jų gautas kultūras, neatsižvelgiant į pasažų skaičių.

Čia vartojama „Escherichia coli“ arba „E. coli“ reiškia gramneigiamą, fakultatyvinę anaerobinę lazdelės formos koliforminę Escherichia genties bakteriją. E. coli kaip šeimininkės kamienai, skirti rekombinantinių DNR produktų fermentacijai, yra gerai žinomi šioje srityje ir apima E. coli B (pvz., BL21(DE3) arba jos darinius, E. coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446) ir E. coli*1776 (ATCC 31,537). Šio išradimo metoduose E. coli B ir E. coli JS007 yra tinkamiausias šeimininkas.

Pagal išradimo būdą E. coli gali būti transformuota vienu arba dviem raiškos vektoriais, turinčiais nukleorūgštį, koduojančią rekombinantinį baltymą, ir nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą. Viename įgyvendinimo variante bakterinės ląstelės transformuojamos dviem vektoriais, atitinkamai turinčiais nukleorūgštį, koduojančią rekombinantinį baltymą, ir nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą. Alternatyviame įgyvendinimo variante nukleorūgštis, koduojanti rekombinantinį baltymą, ir nukleorūgštis, koduojanti T4 lizocimo baltymą, yra viename vektoriuje, kuriuo transformuojamos bakterinės ląstelės.

E. coli ląstelės yra transformuojamos aukščiau aprašytu (-iais) šio išradimo raiškos vektoriumi (-ais) ir kultivuojamos įprastose mitybinėse terpėse, modifikuotose taip, kaip būtų tinkamos įvairiems promotoriams indukuoti, jei indukcija vykdoma.

Viename įgyvendinimo variante ląstelė šeimininkė yra E. coli, pageidautina E. coli B arba E. coli JS007 kamienas, transformuotas vektoriumi, ekspresuojančiu 2-0metiltransferazę, kontroliuojant IPTG indukuojamam PT7 arba IPTG indukuojamam lacllV5 promotoriui. Vektorius gali būti bet koks tinkamas vektorius, pvz., pLATE31 arba pBR322 vektorius.

Viename įgyvendinimo variante ląstelė šeimininkė yra E. coli, pageidautina E. coli B kamienas, toks kaip BL21(DE3) arba pageidautina E. coli JS007 kamienas, transformuotas vektoriumi, ekspresuojančiu T4 fago lizocimą, turintį N galo PelB signalinę seką, kontroliuojamą araB promotoriaus. Vektorius gali būti bet koks tinkamas vektorius, pvz., pLATE11 arba pBR322 vektorius.

Viename įgyvendinimo variante ląstelė šeimininkė yra E. coli, pageidautina E. coli B arba pageidautina E. coli JS007 kamienas, transformuotas vektoriumi, ekspresuojančiu 2-O-metiltransferazę, kontroliuojant IPTG indukuojamam promotoriui, tokiam kaip PT7 arba lacllV5 promotoriui, ir T4 fago lizocimą, turintį N-galinę PelB signalinę seką, kontroliuojant araB promotoriui. Vektorius gali būti bet koks čia aprašytas tinkamas vektorius, pavyzdžiui toks kaip pACYC184 vektorius arba pBR322 vektorius.

Ląstelių kultūra

Aukščiau aprašytos transformuotos ląstelės šeimininkės yra fermentuojamos taip, kad ekspresuotų nukleorūgštį, koduojančią baltymą (pvz., 2-O-metiltransferazę) ir nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimą.

Čia vartojami terminai „fermentavimas“ ir „kultivavimas“ vartojami pakaitomis, norint nurodyti dideliais kiekiais auginamas ląsteles auginimo terpėje. Tai apima eksponentinę fazę, kuriai būdingas ląstelių padvigubėjimas, todėl masinis augimas ir stacionari fazė, kai ląstelių augimo greitis ir žūties greitis yra vienodi, dažnai dėl augimą ribojančio veiksnio, tokio kaip pagrindinės maistinės medžiagos išeikvojimo ir (arba) slopinamojo produkto, tokio kaip organinės rūgšties, susidarymo.

Išradimo procese kiekvieno iš rekombinantinio baltymo ir T4 lizocimo raiška yra kontroliuojama susijusių promotorių indukcijos dėka. Kiekvieno baltymo (pvz., 2-0metiltransferazės) ir T4 lizocimo promotorių indukcija gali būti atliekama nuosekliai arba vienu metu.

Nukleorūgšties, koduojančios rekombinantinį baltymą ir T4 lizocimą, raiškos indukcija yra vykdoma, pageidautina, į kultūrą pridedant induktorių. Paprastai induktorius pridedamas po to, kai ląstelės yra kultivuojamos, kol pasiekiamas tam tikras optinis tankis, pvz. OD600 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 arba didesnis. Viename įgyvendinimo variante T4 lizocimo induktorius yra pridedamas kartu su rekombinantinio baltymo induktoriumi. Viename įgyvendinimo variante T4 lizocimo induktorius yra pridedamas nuosekliai po rekombinantinio baltymo indukcijos.

Viename įgyvendinimo variante kiekvieno rekombinantinio baltymo ir T4 lizocimo promotorių indukcija vyksta vienu metu. Šiame įgyvendinimo variante T4 lizocimo ir polimerazę koduojančios nukleorūgšties promotoriai gali būti identiški. Nors promotoriai gali būti bet kokie šiam tikslui tinkami promotoriai, pageidautina, kad rekombinantinio baltymo ir polimerazės promotoriai būtų IPTG indukuojami promotoriai, pavyzdžiui, T7 promotoriai.

Viename įgyvendinimo variante kiekvieno rekombinantinio baltymo ir T4 lizocimo promotorių indukcija yra nuosekli, o T4 lizocimo promotoriaus indukcija prasideda maždaug po 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 arba daugiau valandų po rekombinantinio baltymo promotoriaus indukcijos. Šiame įgyvendinimo variante T4 lizocimą koduojančios nukleorūgšties ir polimerazę koduojančios nukleorūgšties promotoriai turi būti skirtingi tam, kad nukleorūgšties koduojamo rekombinantinio baltymo raiška būtų indukuota prieš nukleorūgšties koduojamo T4 lizocimo raišką arba daug aukštesniu lygiu, kai promotoriai yra indukuojami. Nors promotoriai gali būti bet kokie šiam tikslui tinkami promotoriai, pageidautina, kad rekombinantinio baltymo ir polimerazės promotoriai būtų atitinkamai arabinozės promotorius ir IPTG indukuojamas promotorius.

Kai T4 lizocimo induktorius pridedamas nuosekliai, tai induktorius įprastai pridedamas po to, kai susikaupia norimas kiekis rekombinantinio baltymo (pavyzdžiui, kai nustatoma pagal optinį tankį, pasiekiantį tikslinį kiekį, kuris buvo pastebėtas praeityje, ir kuris koreliuoja su norimu polipeptido kaupimusi). Įprastai T4 lizocimo indukcija vyksta po inokuliacijos, praėjus maždaug 75-90 %, pageidautina maždaug 80-90 % viso fermentacijos proceso laiko. Pavyzdžiui, T4 lizocimo promotoriaus indukcija gali įvykti praėjus maždaug 30 valandų, pageidautina 32 valandoms, iki maždaug 36 valandų po inokuliacijos fermentacijos procese, trunkančiame 40 valandų. Pavyzdžiui, T4 lizocimo promotoriaus indukcija gali įvykti praėjus maždaug 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 arba daugiau valandų po rekombinantinio baltymo (pvz., 2-Ometiltransferazės) raiškos indukcijos.

T4 lizocimo indukcija ląstelę padaro pralaidžia taip, kad susiformuotų sferoplastas, išskiriantis rekombinantinį baltymą (pvz., 2-O-metiltransferazę). Čia vartojamas terminas „padaro pralaidžia“ reiškia angų padarymą ląstelės sienelėje jos visiškai nepašalinant. „Sferoplastas“ - tai ląstelė, kurioje gramneigiamos bakterijos ląstelės sienelė iš dalies prarandama, ir ji tampa sferine. Sferoplastizacija gali būti atliekama gramneigiamas bakterijas apdorojant lizocimu, penicilinu arba pan. Kadangi sferoplastizuotų gramneigiamų bakterijų ląstelių membrana iš dalies prarandama, informaciją apie tikslinio baltymo ir polipeptido sąveiką (elektrofiziologinius pokyčius) galima analizuoti elektrofiziologiniu metodu. Be to, to paties polipeptido didelė koncentracija yra vienos ląstelės sferoplaste, o tai yra palanki sąlyga išmatuoti polipeptido aktyvumą tiksliniame baltyme. Paprastai sferoplastai, kurie išlaiko iš esmės visas sferoplaste esančias nukleorūgštis, tuo pačiu leidžiant tarpląsteliniams baltymams (įskaitant rekombinantinį baltymą) judėti per sferoplasto membraną.

Įprastai kultivavimo etapas vyksta esant dideliam ląstelių tankiui, tai yra, kai ląstelių tankis yra nuo 15 iki 150 g sausos masės/litre, pageidautina mažiausiai apie 40, labiau pageidautina apie 40-150, labiausiai pageidautina nuo maždaug 40 iki 100. Be to kultivuoti galima naudojant bet kokius, net labai didelius 100 000 litrų tūrius. Pageidautina, kad tūris būtų apie 100 litrų arba didesnis, pageidautina bent apie 500 litrų, o labiausiai pageidautina nuo maždaug 500 litrų iki 100 000 litrų.

E. coli ląstelės, naudojamos šiame išradime aprašytam dominančiam polipeptidui gaminti, yra kultivuojamos tinkamoje terpėje, kurioje promotoriai gali būti indukuojami, kaip įprastai aprašyta, pvz., Sambrook ir kt.

Sąvokos terpė, ląstelių auginimo terpė ir fermentacijos terpė čia vartojamos pakaitomis ir reiškia tirpalą, kuriame yra maistinių medžiagų, reikalingų bakterijoms, t. y. E. coli, augti. Paprastai ląstelių auginimo terpėje yra būtinų ir nepakeičiamų aminorūgščių, vitaminų, energijos šaltinių, lipidų ir mikroelementų, kurių ląstelei reikia minimaliam augimui ir (arba) išgyvenimui. Pageidautina, kad terpė būtų chemiškai apibrėžta tuo, kad visi jos komponentai ir jų koncentracija būtų žinomi. Jei ląstelės kultivuojamos periodinio tiekimo režimu, kaip aprašyta toliau, terminas „kultūros terpė“ reiškia ir bazinę, ir maitinimo terpę, jei nenurodyta kitaip. Terpės pH vertė gali būti bet koks pH nuo 5 iki 9, daugiausia priklausomai nuo šeimininko organizmo.

Norint kaupti rekombinantinį geno produktą, t. y. rekombinantinį baltymą, tokį kaip 2-O-metiltransferazė, ląstelė šeimininkė yra kultivuojama tokiomis sąlygomis, kurių pakanka geno produktui kaupti. Tokios sąlygos apima, pvz., temperatūrą, maistines medžiagas ir ląstelių tankio sąlygas, kurios leidžia ląstelėje ekspresuoti ir kaupti baltymus. Be to, tokios sąlygos yra tokios, kurioms esant ląstelė gali atlikti pagrindines ląstelines funkcijas - transkripciją, transliaciją ir baltymų perėjimą iš vieno ląstelės skyriaus į kitą, skirtą išskiriamiems baltymams, kaip tai žinoma šios srities specialistams.

Galimos skirtingos ląstelių kultūros strategijos, įskaitant kultūrą, auginamą uždarose talpose, perfuzinę kultūrą, nuolatinę kultūrą ir periodinio tiekimo kultūrą.

Viename šio išradimo metodų įgyvendinimo variante temperatūra pakeičiama kultivavimo proceso metu iš pirmosios temperatūros į antrąją, t. y. temperatūra yra aktyviai mažinama. Pageidautina, kad antroji temperatūra būtų žemesnė nei pirmoji. Pirmoji temperatūra gali būti 37 °C ± 0,2 °C. Antroji temperatūra gali būti intervale nuo 25 °C iki 36 °C, pageidautina, kad ji būtų intervale nuo 28 °C iki 36 °C, labiau pageidautina, kad ji būtų nuo 28 °C iki 32 °C, labiausiai pageidautina, kad ji būtų nuo 29 °C iki 31 °C. Antroji temperatūra gali būti 29 °C, 30 °C arba 31 °C. Viename įgyvendinimo variante pirmoji temperatūra yra 37 °C, o antroji temperatūra yra 30 °C.

Genų raiška gali būti matuojama mėginyje tiesiogiai, pavyzdžiui, naudojant įprastą Northern blot metodą, siekiant kiekybiškai įvertinti mRNR transkripciją (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)).

Kai kuriuose įgyvendinimo variantuose bakterijos kultivuojamos bioreaktoriuje. Kaip aprašyta čia, buvo įrodyta, kad išradimo metodai yra ypač tinkami didelio masto gamybai, pvz., bioreaktoriuje arba talpose, kurių tūris didesnis nei 1 I. Kai kuriuose įgyvendinimo variantuose bioreaktorius yra mažiausiai apie 1 I tūrio, mažiausiai apie 5 I tūrio, mažiausiai apie 10 I tūrio, mažiausiai apie 15 I tūrio, mažiausiai apie 20 I tūrio, mažiausiai apie 30 I tūrio, mažiausiai apie 40 I tūrio, mažiausiai apie 50 I tūrio, mažiausiai apie 100 I tūrio, mažiausiai apie 200 I tūrio, mažiausiai apie 250 I tūrio, mažiausiai apie 500 I tūrio, mažiausiai apie 750 I tūrio, mažiausiai apie 1000 I tūrio, mažiausiai apie 1500 I tūrio, mažiausiai apie 2000 I tūrio, mažiausiai apie 2500 I tūrio, mažiausiai apie 3000 I tūrio, mažiausiai apie 3500 I tūrio, mažiausiai apie 4000 I tūrio, mažiausiai apie 5000 I tūrio, mažiausiai apie 7500 I tūrio, mažiausiai apie 10 000 I tūrio, mažiausiai 15 000 I tūrio, mažiausiai 20 000 I tūrio, mažiausiai 30 000 I tūrio, mažiausiai 50 000 I tūrio , mažiausiai apie 100 000 I tūrio, mažiausiai apie 150 000 I tūrio, mažiausiai apie 200 000 I tūrio, mažiausiai apie 250 000 I tūrio, mažiausiai apie 300 000 I tūrio, mažiausiai apie 350 000 I tūrio, mažiausiai apie 400 000 I tūrio, mažiausiai apie 450 000 I tūrio arba mažiausiai apie 500 000 I tūrio.

Kadangi rekombinantinis polipeptidas (pvz., 2-O-metiltransferazė) yra sėkmingai išskiriamas į ląstelių kultūros supernatantą auginimo proceso metu, rekombinantinis polipeptidas gali būti išskirtas auginimo proceso pabaigoje, atskiriant ląstelių kultūros supernatantą, apimantį rekombinantinį baltymą. Šis metodas sėkmingai pašalina poreikį lizuoti transformuotas ląsteles tam, kad būtų galima išskirti rekombinantinį baltymą. Taip sumažinamas ląstelių nuolaužų kiekis ir nukleorūgščių bei kitų molekulių išsiskyrimas, galintis turėti įtakos rekombinantinio baltyminio produkto kokybei.

Ląstelių surinkimas reiškia fermentacijos / kultivavimo pabaigą. Ląstelės gali būti surenkamos bet kuriuo fermentacijos momentu, kuris laikomas pakankamu fermentacijos procesui užbaigti ir ekspresuojamam rekombinantiniam baltymui išgauti. Ląstelių surinkimas gali įvykti tarp 10 ir 60 valandų po sąlygų, leidžiančių ekspresuoti rekombinantinį baltymą, indukcijos. Pavyzdžiui, ląstelės gali būti surenkamos praėjus nuo 15 iki 40 valandų po indukcijos. Ląstelių surinkimo metu fermentuotą auginimo terpė apima ląsteles, kurios buvo autolizuotos, ir kurių membrana padaryta pralaidi. Pavyzdžiui, apie 50% arba daugiau surinktų ląstelių galėjo būti autolizuotos. Kaip alternatyva apie 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 % arba 85 % surinktų ląstelių buvo autolizuotos.

Čia vartojami terminai „ląstelių ūžavimas“, „ližė“ arba „ūžavimas“ reiškia DNR išsiskyrimą iš ląstelės dėl visiško ląstelės membranos pažeidimo. Jei ląstelė netenka DNR, ji gali būti vertinama kaip nebegyvybinga, t. y. mirusi. Priešingai, „membranos pralaidumas“ ir „pralaidumas“ reiškia ląstelės membranos vientisumo sutrikimą, kuris atsiranda dėl rekombinantinio produkto nutekėjimo į ląstelių kultūros supernatantą be visiškos ląstelės membranos ližės. Išradimo būdas leidžia išskirti rekombinantinį baltymą visiškai nesuardant ląstelių. Tiksliau, išradimo būdas numato rekombinantinio baltymo išskyrimą, kuris turi būti atliktas be mechaninio ląstelės ardymo; nepridedant egzogeninio fermento, kuris ardo ląstelės sienelę; be ląstelės transformacijos raiškos vektoriais, turinčiais nukleorūgštį, koduojančią egzogeninį fermentą, kuris ardo citoplazminę membraną, pvz. T4 holino baltymą. Atitinkamai, įgyvendinimo variantuose išradimo būdas neapima nė vieno iš šių veiksmų: (i) mechaninio ląstelių ardymo; (ii) egzogeninio fermento, kuris ardo ląstelės sienelę, pridėjimo; ir (iii) ląstelės transformavimo raiškos vektoriais, turinčiais nukleorūgštį, koduojančią egzogeninį fermentą, kuris ardo citoplazminę membraną, pvz. T4 holino baltymą.

Yra žinomi metodai, skirti stebėti ir rekombinantinio produkto išsiskyrimą, ir ląstelių ližę. Abiem bendras metodas yra žymenų molekulių aptikimas, pvz. užląstelinis produktas, parodantis išsiskyrimą arba DNR ližę. Išsiskyrimo matavimo metodai apima fotomethją (Dietzsch, J. Biotechnol., 163 , pp. 362-370 (2013); Wurm, Eng. Life Sci., 17 pp. 215-222 (2017)) ir didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (Amand, Biotechnol. Prog., 30 , pp. 249-255 (2014); Kaiser Eng. Life Sci., 8 pp. 132-138 (2008);). Ližės matavimo metodai apima kolorimetrinius tyrimus rankiniu būdu valdomais fotometrais (at-line) arba suporuotus su skysčių valdymo sistemomis (at/on-line) (Rajamanickam, Anai. Bioanal. Chem., 409, pp. 667-671 (2017)) ir infraraudonųjų spindulių/ramano spektroskopiją (Abu- Absi, Pharm. Bioprocess., 2 , pp. 267-284 (2014); Buckley, Appl. Spectrosc., 71 , pp. 1085-1116 (2017); ΟΙθββη, Anai. Bioanal. Chem., 409 pp. 651-666 (2017); Sales, Biotechnol. Prog., 33 ,pp. 285-298 (2017)). Autolizė gali būti netiesiogiai nustatoma pagal DNR koncentraciją išgrynintose surinktose ląstelėse arba pagal talpą.

Išskirti rekombinantiniai baltymai yra jautrūs ląstelių kultūros nestabilumui, pavyzdžiui, agreguoja ir suformuoja netinkamą erdvinę struktūrą po sekrecijos / ląstelių ližės. Tam tikrų įgyvendinimo variantų atveju į ląstelių kultūrą pridedama stabilizuojančio agento. Stabilizatorius gali būti pridedamas prieš fermentaciją, jos metu arba po jos. Tinkamų stabilizatorių pavyzdžiai yra kalio chloridas, DTT, natrio chloridas, trehalozė, sacharozė, glicinas, betainas, manitolis, kalio citratas, CuCL, prolinas, ksilitolis, NDSB 201, CTAB, K2PO4 Na2SO4 ir Brij 35. Tam tikruose įgyvendinimo variantuose stabilizuojantis priedas gali apimti aminorūgštis, tokias kaip argininas.

Tam tikruose įgyvendinimo variantuose gali būti naudojamas nukleorūgšties inaktyvavimo agentas (pvz., benzonazė) tam, kad būtų pašalinta laisvą nukleorūgštis (DNR ir (arba) RNR) iš ląstelių kultūros. Nukleorūgšties inaktyvavimo agentas gali būti pridėtas prieš fermentaciją, jos metu arba po jos. Pageidautina, kad prieš nuskaidrinant ląstelių kultūrą nukleorūgščių inaktyvavimo agentas nebūtų centhfuguojamas. Taigi, bet kuris išradimo būdas gali apimti (i) nukleorūgšties (pvz., DNR) inaktyvavimo agento (tokio kaip benzonazės) pridėjimą į ląstelių kultūrą, nesant tolesnio centrifugavimo etapo.

Nuskaidrinimas

Pagal šio išradimo metodus autolizuotos ir (arba) pralaidžios ląstelės yra atskiriamos nuo auginimo terpės prieš produkto išskyrimą ir išgryninimą iš užląstelinės terpės nuskaidrinant.

Čia vartojami terminai „nuskaidrinti“, „nuskaidrinimas“, „nuskaidrinimo pakopa“ reiškia procesą, apimantį vieną arba daugiau pakopų, naudojamą kietoms priemaišoms pašalinti iš ląstelių kultūros tam, kad būtų gautas skystas neapdorotas filtratas, kuriame yra rekombinantinis baltymas.

Nuskaidrinimo pakopos efektyvumas yra labai svarbus siekiant palengvinti tolesnius apdorojimo etapus, kai reikia išvalyti dominančią biomolekulę. Parametrai, galintys turėti įtakos nuskaidrinimo pakopai, apima bendrą ląstelių koncentraciją, ląstelių gyvybingumą, pradinį nuskaidrinimui skirtos ląstelės kultūros drumstumą, kultivuojamų ląstelių gaminamos biomolekulės koncentraciją ir ląstelių liekanų dydį. Čia vartojamas terminas bendra ląstelių koncentracija (TCC) reiškia ląstelių skaičių tam tikrame kultūros tūryje. Čia vartojamas terminas gyvybingų ląstelių koncentracija (VCC) reiškia gyvų ląstelių skaičių tam tikrame kultūros tūryje, nustatytą standartiniais, žinomais, gyvybingumo tyrimais. Čia vartojamas terminas „gyvybingumas“ reiškia gyvų ląstelių procentinį kiekį. Įprastai kuo didesnis TCC, tuo didesnė biomasė, kurią reikia pašalinti iš ląstelių kultūros, ir tuo didesnis poveikis nuskaidrinimui. Čia vartojamas terminas „drumstumas“ reiškia skysčio drumstumą arba miglotumą, kurį sukelia daug atskirų dalelių. Visų pirma, drumstumas rodo medžiagos ir mažų dalelių kiekį skystyje, galinčių išsklaidyti šviesą. Įprastai ląstelių kultūros drumstumas koreliuoja su esančiomis kultūroje ląstelėmis, ląstelių liekanomis, nukleorūgštimis ir ląstelių šeimininkių baltymu (HCP) papildomai prie rekombinantinio polipeptido.

Nuskaidrinimo pakopa sumažina pradinį fermentuotos ląstelių kultūros drumstumą iki mažesnio nuskaidrintos ląstelių kultūros drumstumo tam, kad būtų gauta nuskaidyta ląstelių kultūra su didžiausia dominančios biomolekulės koncentracija ir mažesniu kiekiu kitos ląstelių kultūros medžiagos.

Viename įgyvendinimo variante pradinis fermentuotų ląstelių kultūros drumstumas yra didesnis nei apie 10 000 NTU, apie 20 000 NTU, apie 30 000 NTU. Kai kuriuose įgyvendinimo variantuose pradinis fermentuotų ląstelių kultūros drumstumas yra tarp maždaug 10 000 NTU ir maždaug 150 000 NTU, tiksliau, apima nuo maždaug 30 000 NTU iki maždaug 100 000 NTU.

Viename įgyvendinimo variante nuskaidrintos ląstelių kultūros drumstumas yra lygus arba mažesnis už maždaug 40, 30, 25 arba 20 NTU. Pageidautina, kad nuskaidrintos ląstelių kultūros drumstumas būtų lygus maždaug 20 NTU arba mažesnis.

Tam, kad nuskaidrinimo metodas būtų efektyvus, taip pat svarbu maksimaliai padidinti našumą. Čia vartojami terminai „našumas“ arba „įkrovos talpa“ arba „talpa“ gali būti vartojami pakaitomis, ir nurodo tūrį, nuskaidrintą skaidrinimo funkcionaliajame vienete, pavyzdžiui, per filtrą išfiltruotą tūrį, tiksliau, tūrį, normalizuotą pagal filtro plotą (L/m²).

Išradimo ląstelių kultūros išskaidrinimas apima pirminį nuskaidrinimo etapą. Čia vartojami terminai „pirminis nuskaidrinimas“ reiškia didelių dalelių, tokių kaip visos ląstelės ir ląstelių nuolaužos, pašalinimą. Įgyvendinimo variantuose po pirminio nuskaidrinimo gali sekti antrinis nuskaidrinimo etapas. Čia vartojamas terminas „antrinis nuskaidrinimas“ įprastai reiškia mažesnių dalelių, pvz., dalelių mažesnių nei visos ląstelės, pašalinimą. Kiekviename iš pirminio ir antrinio nuskaidrinimo etapų kaip nuskaidrinimo funkcionalusis vienetas naudojamas filtras.

Tinkamiausiame įgyvendinimo variante pirminis nuskaidrinimo etapas ir (arba) antrinis nuskaidrinimo etapas yra mikrofiltravimas. Įprastai mikrofiltravimas naudojamas 0,1-10 ųm dydžio dalelėms atskirti nuo tirpalo. Dažniausiai jis naudojamas atskirti polimerą, kurio molekulinė masė yra 1 χ 10⁵ g/mol. Be to, mikrofiltravimas gali būti naudojamas nuosėdoms, pirmuoniams, didelėms bakterijoms ir kt. pašalinti. Šiame išradime mikrofiltravimas gali būti lengvai naudojamas ištisoms ląstelėms ir ląstelių nuolaužoms pašalinti. Įprastai mikrofiltravimo procesas atliekamas naudojant slėgio siurblį arba vakuuminį siurblį, kurio greitis yra 0,1-5 m/s, pageidautina 1-3 m/s, ir slėgis 50-600 kPa, pageidautina 100-400 kPa.

Tinkamiausiame įgyvendinimo variante pirminis nuskaidrinimo etapas ir (arba) antrinis nuskaidrinimo etapas yra giluminis filtravimas. Čia vartojamas terminas „filtravimas giluminiu būdu“ reiškia technologiją, kuri išnaudoja tam tikro poėtumo filtrus tam, kad būtų sulaikytos terpės daleles visame filtre, o ne tik ant filtro paviršiaus. Giluminiai filtrai įprastai yra sudaryti iš celiuliozės pluoštų arba sintetinių polimerinių pluoštų, tokių kaip poliakrilas arba polistirenas. Šie pluoštai sudaro trimatį tinklą su tam tikru porėtumu. Giluminis filtras gali būti tinkamas pirminiam ir (arba) antriniam išskyrimui arba tik pirminiam arba antriniam išskyrimui. Filtrai, tinkami pirminiam ir (arba) antriniam regeneravimui, taip pat žinomi kaip vienpakopiai filtrai. Vienpakopiai filtrai gali būti naudojami tiek pirminiam, tiek antriniam išskyrimui atlikti, arba jie gali būti naudojami kaip filtrai pirminiam išskyrimui ir kartu su tolesniu antrinio išskyrimo filtro naudojimu. Tam tikruose įgyvendinimo variantuose šis giluminis filtras yra teigiamai įkrautas. Sąveika tarp teigiamai įkrauto filtro ir koloidinių dalelių fermentuotoje ląstelių kultūroje sėkmingai leidžia pašalinti tokias mažas priemaišas, o didesnes daleles sulaiko filtro matricos porėtumas.

Filtras gali būti sudarytas iš įvairių medžiagų, gerai žinomų šioje srityje. Tokios medžiagos gali apimti, bet neapsiribojant, polimerines medžiagas, tokias kaip nailonas, celiuliozės medžiagas (pvz., celiuliozės acetatą), polivinilideno fluoridą (PVDF), polietersulfoną, poliamidą, polisulfoną, polipropileną ir polietileno tereftalatą. Tam tikrų įgyvendinimo variantų atveju filtrai, naudotini ląstelių lizatams nuskaidrinti, gali apimti, bet neapsiribojant, StaxTM giluminių filtrų sistemas (Pall Life Sciences), ULTIPLEAT PROFILE™ filtrus (Pali Corporation, Port Washington, NY), SUPOR™ membraninius filtrus (Pall Corporation, Port Washington, NY). Prekyboje parduodami giluminiai filtrai apima StaxTM giluminių filtrų sistemas (Pall Life Sciences), Millistak+ Pod giluminių filtrų sistemą, XOHC media (Millipore Corporation), Zeta Plus™ giluminį filtrą (3M Purification Inc.) ir kt.

Įgyvendinimo variantuose pirminis nuskaidrinimas atliekamas pirmuoju filtru, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai apie 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0 ųm (mikrometras) arba didesnes sulaikymo ribas. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 0,4 ųm iki maždaug 20,0 ųm. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 0,4 ųm iki maždaug 9,0 ųm. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 0,4 ųm iki maždaug 3,0 ųm. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 0,4 ųm iki maždaug 0,8 ųm. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 1,0 ųm iki maždaug 3,0 ųm. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 1,0 ųm iki maždaug 20,0 ųm. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 1,0 ųm iki maždaug 9,0 ųm. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 4,0 ųm iki maždaug 20,0 ųm. Kitame įgyvendinimo variante pirmasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 4,0 ųm iki maždaug 9,0 ųm. Tam tikrame įgyvendinimo variante pirmoji nuskaidrinimo pakopa yra atliekama panaudojant pirmąjį giluminį filtravimą.

Nuskaidrinimo efektyvumą galima pagerinti padidinus filtro pralaidumą. Čia vartojami terminai „pralaidumas“ arba „įkrovos talpa“ arba „talpa“ yra vartojami pakaitomis ir nurodo turį, nuskaidrintą funkcionaliu nuskaidrinimo vienetu, pavyzdžiui, per filtrą išfiltruotą tūrį, tiksliau, tūrį, normalizuotą pagal filtro plotą (L/m²).

Viename įgyvendinimo variante pirminio nuskaidrinimo etapo maksimalus pralaidumas yra lygus mažiausiai 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 L/m².

Įgyvendinimo variantuose antrinis nuskaidrinimas atliekamas antruoju filtru, pvz. giluminis filtras, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0 μΜ arba didesnes sulaikymo ribas. Kitame įgyvendinimo variante antrasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina s sulaikymo ribas nuo maždaug 0,4 pm iki maždaug 3,0 pm. Kitame įgyvendinimo variante antrasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 0,4 pm iki maždaug 0,8 pm. Kitame įgyvendinimo variante antrasis filtras turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 1,0 pm iki maždaug 3,0 pm. Tam tikrame įgyvendinimo variante antrasis nuskaidrinimo etapas vykdomas panaudojant antrąjį giluminį filtravimą.

Įgyvendinimo variantuose pirminio nuskaidrinimo ir antrinio nuskaidrinimo etapuose naudojamas tokio paties porų dydžio filtras. Įgyvendinimo variantuose ir pirmasis, ir antrasis filtrai turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 0,4 pm iki maždaug 0,8 pm, tiek pirmasis, tiek antrasis filtrai turi porų dydį, kuris užtikrina sulaikymo ribas nuo maždaug 1,0 pm iki maždaug 3,0 pm.

Viename įgyvendinimo variante antrinio nuskaidrinimo etapo maksimalus pralaidumas yra lygus mažiausiai apie 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 L/m².

Viename šio išradimo įgyvendinimo variante prieš pirminį nuskaidrinimą atliekamas ląstelių kultūros išankstinio apdorojimo etapas, siekiant padidinti nuskaidrinimo efektyvumą, tokį kaip flokuliaciją.

Čia vartojamas terminas „flokuliacija“ reiškia netirpių dalelių, tokių kaip ląstelių medžiaga, įskaitant ląsteles, ląstelių liekanas, ląstelės šeimininkės baltymus, DNR ir kitus komponentus, agregaciją, nusodinimą ir (arba) aglomeraciją, kurią sukelia tinkamo flokuliavimo agento pridėjimas į fermentuotą ląstelių kultūrą. Padidinus netirpių komponentų, esančių fermentuotoje ląstelių kultūroje, dalelių dydį, pagerėja atskyrimo efektyvumas, pavyzdžiui, nuskaidrinimas filtruojant. Flokuliaciją galima inicijuoti žinomais metodais, įskaitant ląstelių kultūros pH vertės sumažinimą arba flokuliavimo agento pridėjimą. Neribojami flokuliavimo agento pavyzdžiai: kalcio fosfatas, kaprilo rūgštis, dvivalenčiai katijonai arba teigiamai įkrauti polimerai, tokie kaip poliaminas, polietileniminas (PEI), chitozanas arba polidialildimetilamonio chloridas (pvz., pDADMAC), kurie sukelia dalelių agregaciją dėl sąveikos su neigiamo krūvio ląstelių paviršiumi ir ląstelių liekanomis. Viename įgyvendinimo variante flokuliavimo agentas yra teigiamai įkrautas polimeras, pageidautina polietileniminas (PEI). Įgyvendinimo variantuose flokuliavimo agentas yra PEI ir yra pridedamas į fermentuotą ląstelių kultūrą nuo maždaug 0,10 % (t/t) iki maždaug 0,50 % (t/t). Įgyvendinimo variantuose flokuliavimo agentas yra PEI ir į fermentuotą ląstelių kultūrą pridedama koncentracija yra nuo maždaug 0,15 % (t/t) iki maždaug 0,25 % (t/t). Įgyvendinimo variantuose flokuliavimo agentas pridedamas į fermentuotą ląstelių kultūrą koncentracija lygia maždaug 0,10 % (t/t), 0,15 % (t/t), 0,20 % (t/t), 0,25 % (t/t) arba 0,30 % (t/t). Įgyvendinimo variantuose flokuliavimo agentas yra PEI ir į fermentuotą ląstelių kultūrą pridedama koncentracija yra lygi maždaug 0,15 % (t/t) arba maždaug 0,25 % (t/t).

Viename įgyvendinimo variante flokuliavimo agentas yra tiesiogiai pridedamas į fermentuotą ląstelių kultūros skystį fermentacijos pabaigoje, o flokuliuota medžiaga, įskaitant ląsteles, yra pašalinama iš ląstelių kultūros skysčio filtruojant. Viename įgyvendinimo variante flokuliavimo agentas pridedamas prieš surenkant ląsteles.

Tinkamiausiuose įgyvendinimo variantuose fermentacija ir nuskaidrinimas atliekami kaip uždaros sistemos metodas. Čia vartojamas terminas „uždaros sistemos metodas“ reiškia metodą arba procesą, kuris atliekamas uždarose steriliose sistemose kontroliuojamos aplinkos sąlygomis, nekeliant jokios išorinio užteršimo iš operatoriaus arba laboratorijos aplinkos rizikos. Kuriant GGP klasės produktus ypač svarbu naudoti uždarą sistemą. Iš esmės pageidaujamuose įgyvendinimo variantuose išradimo metodai yra uždarų sistemų metodai, kurie neapima centrifugavimo, nes centrifugavimas negali būti atliktas uždaroje sistemoje ir reikalauja tarpinio produkto (lizuotų ląstelių) perkėlimo į centrifugavimo indus. Nuskaidrinimas po fermentacijos gali būti atliekamas perduodant fermentuotą kultūrą iš bioreaktoriaus srautu uždarose vamzdelių sistemose į nuskaidrinimo filtrus, be jokio kontakto su operatoriumi.

Tolesnis išvalyto baltymo apdorojimas

Įgyvendinimo variantuose rekombinantinis baltymas gali būti išskirtas tiesiogiai iš nuskaidrintos auginimo terpės. Po rekombinantinio baltymo išskyrimo gali būti atliekamas gryninimas, siekiant užtikrinti tinkamą rekombinantinio baltymo grynumą. Įvairūs baltymų gryninimo būdai yra gerai žinomi šios srities specialistams.

Tinkami valymo būdai apima, bet tuo neapsiriboja, yra nusodinimas amonio sulfatu arba etanoliu, ekstrahavimas rūgštimi, gelio elektroforezė, imunoadsorbcija, anijonų arba katijonų mainų chromatografija, fosfoceliuliozės chromatografija, hidrofobinės sąveikos chromatografija, giminingumo chromatografija, imuninio giminingumo chromatografija, gelfiltracija, skystinė chromatografija (LC), didelio efektyvumo LC (HPLC), aukšto našumo LC (FPLC), hidroksiapatito chromatografija, lėktino chromatografija ir imobilizuoto metalo giminingumo chromatografija (IMAC). Labiausiai pageidautina, kad rekombinantiniai baltymai būtų išgryninti skysčių chromatografijos metodų, įskaitant jonų mainų, giminingumo ir gelfiltraciją.

Taigi išradimo metodai pateikia iš esmės grynus rekombinantinius baltymus. Iš esmės grynas, kaip čia vartojama, reiškia preparatą arba mėginį, kuriame iš esmės nėra priemaišų komponentų, baltymų ir kt.

Visame šios specifikacijos aprašyme ir teiginiuose žodžiai „apima“ ir „sudėtyje yra“ bei jų variantai reiškia „įskaitant, bet neapsiribojant“, ir jie nėra skirti (ir neatmeta) kitų dalių, priedų, komponentų arba pakopų. Visame šios specifikacijos aprašyme ir apibrėžtyje vienaskaita apima daugiskaitą, nebent kontekstas reikalauja kitaip. Visų pirma, kai naudojamas neapibrėžtas artikelis, specifikacija turi būti suprantama kaip apimanti daugiskaitą ir vienaskaitą, nebent kontekstas reikalauja kitaip.

Požymiai, sveikieji skaičiai, charakteristikos, junginiai, cheminės dalys arba grupės, aprašytos kartu su konkrečiu išradimo aspektu, įgyvendinimu arba pavyzdžiu, turi būti suprantami kaip taikytini bet kuriam kitam čia aprašytam aspektui, įgyvendinimui arba pavyzdžiui, nebent jie su jais nesuderinami. Visos savybės, atskleistos šioje specifikacijoje (įskaitant bet kokias kartu pateiktas apibrėžtis, santraukas ir brėžinius) ir (arba) visi taip atskleisto metodo arba proceso etapai gali būti derinami bet kokiu deriniu, išskyrus derinius, kuriuose bent kai kurios iš tokių savybių ir (arba) etapų yra vienas su kitu nesuderinami. Išradimas neapsiriboja bet kokių anksčiau pateiktų įgyvendinimo variantų detalėmis. Išradimas apima bet kurį naują arba bet kokį naują šioje specifikacijoje atskleistų savybių derinį (įskaitant bet kokias kartu esančias apibrėžtis, santraukas ir brėžinius), arba bet kurį naują, arba bet kokį naują bet kurio metodo arba proceso etapų derinį, tokiu būdu atskleistą.

Skaitytojo dėmesys atkreipiamas į visus straipsnius ir dokumentus, kurie yra pateikti kartu su šia specifikacija arba iki jos pateikimo, susijusius su šia paraiška, ir kurie yra atviri visuomenei susipažinti su šia specifikacija, o visų tokių straipsnių ir dokumentų turinys čia įtrauktas kaip nuoroda.

PAVYZDŽIAI pavyzdys

Vaccinia viruso 2-O-metiltransferazės geno vp39 konstravimas

Optimizuotas ekspresijai E. coli vp39 genas buvo klonuotas į pLATE31 vektorių (Thermo Fisher). NCBI sekos ID: AGJ91263.1, baltymo pavadinimas: daugiafunkcis poli-A polimerazės mažasis subvienetas VP39 [Vaccinia virus] (1A pav.). Šiame pavyzdyje panaudota 2-O-metiltransferazės aminorūgščių seka čia atskleista kaip SEQ ID Nr. 1.

T4 bakteriofago lizocimo geno gpe konstravimas

T4 bakteriofago lizocimo genas gpe buvo klonuotas į griežtai kontroliuojamą pLATE11 vektorių (kat. Nr. K1241, Thermo Fisher), siekiant sumažinti ližės genų raišką neindukuotose ląstelėse. Be to pelB signalinis peptidas, skirtas pagaminto baltymo perkėlimui į periplazminę erdvę, buvo sulietas Gpe N gale. Fragmentas, kurio sudėtyje yra transkripcijos terminatorius rrnBT1-T2 užkirto kelią bazinei geno raiškai nuo promotoriaus tipo elementų, kilusių iš vektoriaus, T7 RNR polimerazės promotorius, kuris skatina klonuoto gpe geno transkripciją, ir dvi flanginės lac operatoriaus sekos užtikrina griežtą geno raiškos kontrolę, Ptet promotorius sumažina bazinę raišką nuo T7 promotoriaus, T7 terminatorius, kuris nutraukia transkripciją nuo T7 promotoriaus, ir lac represohus, užtikrinantis griežtą bazinės raiškos kontrolę nuo T7 promotoriaus, buvo subklonuoti į pACYC184 vektorių, kuris turi p15A replikacijos pradžią ir yra suderinamas su plazmidėmis, turinčiomis ColE1 ori (plasmidė pACYC184-PT7-pelBgpe-lacl) (1B pav.).

Šiame pavyzdyje buvo naudojamas modifikuotas polipeptidas, vadinamas Gpe, kurio seka kilusi iš Escherichia coli T4 bakteriofago lizocimo. NCBI referentinė seka: NP_049736.1, baltymo pavadinimas: glikozido hidrolazės šeimos baltymas (Escherichia fagas T4). PelB signalinė seka: 1 - 22, T4 bakteriofago lizocimas 23 164. Gpe baltymo seka su PelB signaline seka čia atskleista kaip SEQ ID Nr. 2.

Raiškos kamieno paruošimas

E. coli kamienas JS007 (Thermo Fisher Scientific) buvo transformuotas plazmide pLATE31-VP39delta32-KnR ir užsėtas ant LB (ne gyvūninės kilmės) AOF agaro su kanamicinu (50 g/l). Raiškos kamienas E. coli JS007 pLATE31-VP39delta32KnR buvo kotransformuotas atskirai su ližės plazmide pACYC-PT7-pelB-gpe-lacl, turinčia T4 bakteriofago lizocimo geno gpe geną. Transform antai su abiem plazmidėmis buvo užsėti ant LB agaro su kanamicinu (50 mg/l) ir chloramfenikoliu (25 mg/l). Abi transformacijos buvo pagrįstos kalcio temperatūrinio šoko metodu. Tyrimo ląstelių bankas (RCB) buvo sukurtas po transformantų 3 valandų kultivavimo skystoje TB4 AOF terpėje su reikalingais antibiotikais 37 °C temperatūroje ir 220 aps./min. Sterilus 50 % glicerolio tirpalas buvo naudojamas 25 % glicerolio RCB gamybai, kuris buvo išpilstytas į khogeninius mėgintuvėlius ir laikomas -70 ° C temperatūroje.

Auginimo terpė

Transformacijos ir plazmidžių dauginimas buvo atliekami kietoje ir skystoje LB AOF terpėje, kurioje buvo peptonas (10 g/l), mielių ekstraktas (5 g/l), NaCI (10 g/l), ir kietoje terpėje, pridedant 15 g/l mikrobiologinio agaro, taip pat reikalingų antibiotikų. Periodinio tiekimo ir auginimo uždarose talpose kultivavimas buvo atliktas glicerolio pagrindu sukurtame (AOF) ne gyvūninės kilmės sultinyje (TB4 AOF ir TB AOF), kurio sudėtis (litre): peptonas 12 g, mielių ekstraktas 24 g, (ΝΗ4)2δθ4 2,68 g, KH2PO4 2,3 g, K2HPO4 12,5 g ir glicerolio nuo 4 iki 10 g. Be to prieš auginimą TB10 terpė buvo papildyta šiais steriliais tirpalais: 3 ml (1 M) MgBO4 ir 2 ml mikroelementų tirpalo, kurio sudėtis (litre): CaCl2 ^x 2H2O 0,5 g, Ζηδθ4 ^x 7H2O 0,18 g, Μηδθ4 ^x H2O 0,1 g, Na2EDTA 20,1 g, FeCI3 ^x 6H2O 16,7 g, CuBO₄ ^x 5H2O 0,16 g, CoCI2 ^x 6H2O 0,18 g; taip pat 1 ml kanamicino (50 mg ml/l) ir 1 ml chloramfenikolio (30 mg/l).

Raiškos ir autolizės sąlygos purtomose kolbose

Inokuliatas, skirtas serijinei baltymų gamybai purtomose kolbose, buvo paruoštas per naktį kultivuojant pasirinktą kloną 250 ml purtomoje kolboje su 50 ml TB4 AOF terpės, kurioje yra 4 g/l augalinio glicerolio 37 °C temperatūroje. Baltymų gamybai atitinkama užsėjimo kultūra buvo perkelta į šviežią TB10 AOF terpę, kurioje yra 10 g/l glicerolio, iki galutinio 50 ml tūrio 250 ml Erlenmejerio purtymo kolbose. Kultūra buvo kultivuojama 37 °C temperatūroje ir 220 aps./min., kol pasiekė ląstelių tankį OD600 1,5-2,0. Indukcija buvo atlikta naudojant 0,1 mM IPTG. Temperatūra indukcijos taške buvo pakeista į 32 °C, ir kultivavimas buvo tęsiamas 17 valandų 220 aps./min.

Raiškos ir autolizės sąlygos bioreaktoriuje

Ląstelių banko kultūros atgaivinimas (preinokuliato paruošimas) buvo atliktas kultivuojant purtomoje kolboje 250 ml Erlenmejerio tipo kolbose su pertvaromis, kuriose yra 50 ml tūrio TB4 AOF terpės su 4 g/l glicerolio, 3 ml/l 1 M MgSO4, 2 ml/l Mkt-MSM, 50 mg/l kanamicino. ir 25 mg/l chloramfenikolio esant 37 °C, 230 aps./min. 4-6 vai. Vėliau inokuliato užsėjimo tūris, apskaičiuotas pagal formulę 0,5/preinokuliato OD, buvo perkeltas į šviežias 2000 ml Erlenmejerio tipo kolbas su pertvaromis, kuriose yra 500 ml tūrio TB4 AOF terpės su 4 g/l glicerolio, 3 ml/l 1 M MgSO4, 2 ml/l Mkt-MSM, 50 mg/l kanamicino ir 25 mg/l chloramfenikolio, skirtas inokuliato kultivavimui 25 °C temperatūroje, 260 aps./min., 16-18 vai.

Periodinio tiekimo kultūros fermentacija buvo vykdoma 5 I Biostat A bioreaktoriuose su TB10 AOF terpe, kurioje yra 10 g/l glicerolio, 3 ml/l 1 M MgSO4, 2 ml/l Mkt-MSM, 3 ml/l 10 mg/ml tiamino-HCI, 50 mg/l kanamicino, 25 mg/l chloramfenikolio ir 0,2 ml/l Pluronic, pradinis kultivavimo tūris 3 I. Faktinis inokuliato užsėjimo tūris, reikalingas sėti į bioreaktorius, buvo apskaičiuotas pagal formulę: (fermentacijos tūris [ml] χ inokuliato tikslinis OD (0,1) )) / išmatuotas inokuliato OD. Pradiniai auginimo parametrai tokie: temperatūra palaikoma 37 °C, pO2 - 30 %, pritaikant maišymo greitį ir automatiškai reguliuojant oro srautą (nuo 500 iki 1600 ccm), pH vertė koreguojama ties 7,0 ± 0,1 pridedant. NFUOH (25 %) arba H3PO4 (42,5 %). Periodinio tiekimo kultūros fazė buvo palaikoma padavimo tirpalu, kuriame yra 60 g/l augalinio peptono tirpalo, 60 g/l mielių ekstrakto, 10,57 g/l (NH4)2SO4, 2 ml/l Mkt-MSM, 80 ml/l 1 M MgSO4 400 g/l glicerolio, 50 mg/l kanamicino ir 25 mg/l chloramfenikolio. Tiekimo profilis buvo nustatytas taip, kad būtų palaikomas 20 ml/val./l terpės tiekimo greitis iš viso 8 valandas su 13,5 % siurblio greičiu. Baltymų raiška ir ląstelių ližės indukcija buvo atliekamos į bioreaktorių įpylus IPTG tirpalo (galutinė koncentracija 0,1 mM), po to per 30 minučių laikotarpį temperatūra sumažinama nuo 37 iki 25 °C, o pO2 sumažinamas nuo 30 % iki 3 % per 30 minučių laikotarpį. Baltymų raiškos ir ląstelių ližės indukcijos trukmė buvo 18-22 vai., o viso proceso metu buvo matuojamas terpės optinis tankis, esant 600 nm (OD600) tam, kad butų įvertinta ląstelių koncentracija.

Siekiant geresnio ląstelių suardymo, buvo atliktas osmosinis šokas pridedant 71,01 g/l 0,5 M NažSCM ir 5 g/l 0,5 % Brij 35. Po osmotikų pridėjimo pOž, pH vertės, temperatūros ir oro srauto automatinis palaikymas buvo išjungtas, ir buvo palaikomas tik 700 aps./min. maišymo greitis. Vėliau visos bioreaktorių suspensijos buvo surinktos ir perkeltos į kitas grupes, kad būtų pradėti nuskaidrinimo etapai.

Baltymų atskyrimo tyrimas naudojant SDS-PAGE analizės metodą

Ląstelės ir terpės frakcijos buvo atskirtos centrifuguojant 30 m in., 14000 aps./min., 4 °C. Terpės frakcijos buvo laikomos 4 °C temperatūroje. Ląstelių mėginiai, paimti iš auginimo kolbos arba fermentatoriaus, buvo resuspenduoti ūžavimo buferyje santykiu: 1 g biomasės resuspenduota 10 ml ūžavimo buferio (50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA). Biomasė buvo apdorojama ultragarsu 60 sekundžių 4 °C temperatūroje. Tirpios ir netirpios baltymų frakcijos buvo atskirtos centrifuguojant 20 min., 14000 aps./min., 4 °C. Bendra baltymų frakciją sudaro ląstelių nuolaužų suspensija (neapdorotas ekstraktas). Ląstelių mėginiai SDS-PAGE atskyrimui buvo paruošti taip: 20 ųl neapdoroto ekstrakto mėginio, 25 ųl 4 χ SDS-PAGE užnešimo buferio, 5 μΙ 2M DTT ir 50 μΙ dejonizuoto vandens taip, kad galutinis mėginio tūris būtų 100 μΙ. Terpės mėginiai SDS-PAGE atskyrimui buvo paruošti taip: 70 μΙ auginimo terpės, 25 μΙ 4 χ SDS-PAGE užnešimo buferio, 5 μΙ 2M DTT taip, kad galutinis mėginio tūris būtų 100 μΙ. Mėginiai buvo kaitinami 10 minučių 95 °C temperatūroje. 10 μΙ mėginio buvo užnešta į kiekvieną 4-12 % gradientinio SDS-PAGE gelio juostos takelį.

Fermentavimo kultūros nuskaidrinimas

Norint nuskaidrinti fermentavimo kultūrą, į bioreaktorių buvo pridėta natrio sulfato iki galutinės 0,5 M koncentracijos ir Brij 35 iki galutinės koncentracijos 0,5 % (m/t), ir viskas maišoma 250-350 aps./min. 30-60 min. 32 °C. Po to į bioreaktorių buvo pridėta PEI (Lupasol, polietileniminas, BASF) iki galutinės koncentracijos 0,25 % (v/v), ir maišymas tęsiamas mažiausiai 10 minučių 250-350 aps./min. Medžiaga iš bioreaktoriaus buvo perkelta į atskirus rezervuarus ir maišoma su vandeniu santykiu 2 : 5 (v/v) 50-100 aps./min., 10-20 min. Kultūra buvo palikta sedimentacijai nuo 3 valandų iki per naktį. Po sedimentacijos viršutinė kultūros dalis buvo nuskaidrinama filtruojant per giluminio filtravimo kapsules K050P (Pall, ID 7007786), o vėliau filtruojama per 0,22 ųm filtro kapsulę (Pall, ID NP6UEAVP1S).

Detaliau nuskaidrinimo procesas apėmė šiuos veiksmus (7 pav.).

E.coli autolizato nuskaidrinimo procesas: pradinė medžiaga: 250 I lizuotų ląstelių kultūros, po 16-18 vai. tikslinio baltymo raiškos maišomuose rezervuaro reaktoriuose. Galutinis ląstelių/ląstelių nuolaužų OD ~ 15-30 OD. Analizė parodė, kad dėl sukeltos ląstelių ližės gautas ląstelių ūžavimo efektyvumas sudarė 75-80 % nuo bendro ląstelių kiekio.

1.0 E.coli lizato paruošimas filtravimui: visų manipuliacijų metu maišomame bioreaktoriuje (HyperformaTM 300 I, Thermofisher Scientific) visi automatiniai valdikliai fermentacijos inde: Oro/Ož srautas, pH vertė. Maišymas buvo palaikomas 375 aps./min., o temperatūra nustatyta < 12 °C.

Ląstelių struktūrų suardymas, fermentų stabilizavimas ir nukleorūgščių flokuliacija. Sausos medžiagos buvo pilamos tiesiai į bioreaktoriaus indą po vieną tam, kad būtų pasiekta galutinė 1 M sacharozės, 0,5 M Na2SO4 ir 0,5 % Brij 35 koncentracija. Didelio klampumo tirpalas kruopščiai maišomas 375 aps./min. 20-40 min. 12 °C temperatūroje. Po to maišymas buvo palaikomas 100 aps./min. greičiu ΙΟΙ 8 vai. < 12 °C. Flokuliacija buvo atlikta pridedant PEI (Lupasol, polietilenimino, BASF) į bioreaktoriaus indą tiek, kad galutinė koncentracija būtų 0,25 % (v/v). Maišymas tęsiamas mažiausiai 15 minučių esant 350 aps./min. Tirpalas iš bioreaktoriaus buvo perkeltas į atskiras talpas, atskiedžiamas vandeniu (molekulinės biologijos grynumo laipsnio) 2,5 karto, maišomas 200-300 aps./min. 10-20 min. Po to maišymas buvo visiškai sustabdomas. Kultūra paliekama sedimentacijai ~ 3 valandoms.

Nuskaidrinimas: filtro paruošimas. STAX filtro kapsulės K050P (Pall, ID 7007786) buvo plaunamos 10 filtro tūrių vandeniu. Neviršijant 0,2 BAR slėgio priešslėgio. Po sedimentacijos viršutinė kultūros dalis buvo nuskaidrinama filtruojant per giluminio filtravimo kapsules K050P (Pall, ID 7007786). Sulaikymas 0,4-0,8 μΜ (1 I fermentacijos terpės filtruoti reikia apie 0,05 m² filtro ploto), neviršijant 1,2 BAR priešslėgio. Antrinis nuskaidrinimas gali būti atliktas naudojant 0,22 ųm filtro kapsulę (Pall, ID NP6UEAVP1S). Tas pats nuskaidrinimo procesas gali būti atliktas naudojant filtravimo sistemas: 1-3 μΜ (P100) (Pall, ID 7007836).

E. coli nėra tobulas šeimininkas, ypač uždarai vienkartinei fermentacijai, nes jis įprastai neišskiria baltymų į tarpląstelinę terpę. Ląstelių ardymo žingsnis tampa ribojimu ir nėra ekonomiškai efektyvus eksperimentiniu arba pramoniniu mastu, kai tikslas yra uždaro ir (arba) tęstinio proceso srauto įgyvendinimas. Šis išradimas pateikia ląstelių ardymo metodą, kuris yra užprogramuota ląstelių ližės sistema, pagrįsta klonuoto T4 bakteriofago geno gpe raiška tam, kad būtų gaminamas ūžavimo baltymas. Genas gpe koduoja lizocimą, kuris ardo E. coli ląstelės sienelės peptidoglikaną.

Buvo sukurta save ardanti Escherichia coli, kuri gamina svetimą tikslinį baltymą. E. coli JS007 buvo kotransformuota kartu su dviem vektorinėmis plazmidėmis - tikslinio geno raiškos vektoriumi pLATE31-VP39delta32-KnR ir ūžavimo geno raiškos vektoriumi pACYC184-PT7-pelB-gpe-lacl. Lizavimo baltymas buvo pagamintas po tikslinio geno raiškos, todėl ląstelių ardymo procesas buvo supaprastintas. Šiame pavyzdyje klonuoto T4 fago geno gpe raiška buvo panaudota E. coli, kurios gamino OMT kaip tikslinį baltymą, suardymui. Geno gpe raiška nesukėlė greito ląstelių ardymo, bet susilpnino ląstelės sienelę. Lizavimo baltymo Gpe perkėlimas iš citoplazmos į periplazmą palengvino mureino sluoksnio, atsakingo už ląstelių struktūros tvirtumo palaikymą, fermentinį skaidymą. Mikroskopinis stebėjimas atskleidė, kad ląstelės, gaminančios Gpe periplazminėje erdvėje po 4 valandų, patyrė morfologinius pokyčius - nuo lazdelės formos iki elipsės formos sferoplastų (2 pav.).

2-O-metiltrasferazės indukcija E. coli JS007/pLATE31-VP39delta32KnR/pACYC-PT7-pelB-gpe-lacl kultūroje buvo atlikta naudojant 0,1 mM IPTG. Lizocimo geno indukcija buvo atlikta vienu metu. Kultūra buvo auginama per naktį 32 °C temperatūroje. Mėginiai iš indukuotos kultūros ir terpės buvo paimti praėjus 1, 2, 3, 5 ir 17 valandų po baltymų sintezės indukcijos. E. coli ląstelių nuolaužos, pastebimos auginimo terpėje, rodė, kad įvyko ląstelių ližė. Didžiausia 2-O-metiltrasferazės išeiga terpėje buvo gauta po 17 valandų raiškos/lizės E. coli JS007/pLATE31-VP39delta32KnR/pACYC-PT7-pelB-gpe-lacl kamieno. 2-O-metiltrasferazės kiekis buvo nustatytas naudojant SDS PAGE (3 pav.).

Periodinio tiekimo kultūros OMT gamyba buvo atlikta 5 I Biostat A bioreaktoriuose, kurių pradinis auginimo tūris buvo 3 I. Kaip parodyta 4 paveiksle, baltymų raiška ir ląstelių lizavimo indukcija buvo atlikta į bioreaktorių įpylus IPTG tirpalo (galutinė koncentracija 0,1 mM). indukcijos taško tikslinis OD600 14 - 17,5. Periodinio tiekimo kultūros fazė buvo pradėta po DO smailės, kuri paprastai atsirasdavo praėjus 10-25 m in. po baltymų raiškos ir ližės indukcijos. Periodinio tiekimo kultūros procesas buvo valdomas automatiškai pagal proceso profilį, kuris palaikė 20 ml/val./1 I terpės tiekimo greitį iš viso 8 valandas, esant 13,5 % siurblio greičiui. Po 15 minučių indukcijos IPTG temperatūra buvo sumažinama nuo 37 iki 25 °C per 30 minučių laikotarpį, o pO2 sumažinamas nuo 30 % iki 3 % praėjus 1 valandai po indukcijos IPTG per 30 minučių laikotarpį. Po baltymų raiškos ir ląstelių lizavimo indukcijos fazės (18-22 vai.) dujų tiekimas, pH vertės ir temperatūros kontrolė buvo išjungiama, ir osmosiniam šokui įvykdyti buvo išlaikomas tik 700 aps./min. maišymo greitis. Po 30 minučių osmosinio šoko buvo surinktos visos bioreaktorių suspensijos, ir pradėti nuskaidrinimo etapai.

Norint palyginti atkartojamumą ir ištirti augimo greitį, fermentacijos procesai buvo atlikti kartu su Biostat A bioreaktoriais. Augimo greitis buvo nustatomas periodiškai matuojant optinį tankį, kas parodyta 5 paveiksle. Rezultatai atskleidė, kad abiejų procesų kultūros augimo greitis yra panašus, tačiau kultūros iš F2 ir F4, maitinamos per naktį, proceso pabaigoje buvo didesnis optinis tankis, nors kultūrų iš F6 ir F3 su 4 vai. maitinimu - didesnis aktyvumas, kai jų vertės buvo 43,7 ir 55,0 U/ųl.

Siekiant ištirti, kaip autolizės sistema ir maitinimo laikas lemia baltymų aktyvumo tendencijas, buvo pradėti panašūs fermentacijos procesai. Nustatyta, kad naudojant autolizės ir periodinio tiekimo kultūros sistemas, OMT išeiga padidėjo 18 kartų, kaip parodyta 6 paveiksle, tačiau pailgėjęs mitinimo laikas jį šiek tiek sumažino.

Biosintezės parametrai, kurie buvo naudojami raidoje, buvo sėkmingai padidinti nuo 5 I Univessel Glass Biostat A bioreaktorių iki 300 I nerūdijančio plieno fermentatoriaus pajėgumų, siekiant užtikrinti, kad optimizuotas procesas būtų perkeltas į gamybos įrenginius. Optimizuoti proceso parametrai buvo įvertinti pagal tikslinę baltymų išeigą. Lyginant senų gamybos technologijų rezultatus su naujo požiūrio technologijų, kur yra E. coli sistema su autolize, buvo nustatyta, kad naudojant autolizės sistemą OMT išeiga padidėjo apie 70 kartų - nuo 857 mg iki 60000 mg (kiekis iš 300 I bioreaktohaus) po nuskaidrinimo ir gryninimo procesų.

Giluminiu filtravimu pagrįstas ląstelių nuolaužų nuskaidrinimas be apdorojimo nukleaze. Čia buvo naudojamas geriausias didelį jonų stiprumą sukuriančių druskų, osmosinių medžiagų ir ploviklio mišinys, skirtas fermentams stabilizuoti, užkirsti kelią nuosėdų susidarymui / agregacijai, užkirsti kelią sąveikai su ypač hidrofobišku lizocimu ir membranos baltymais. Nukleorūgšties flokuliacija taip pat buvo naudojama norint sukurti filtravimo plokštelę, apimančią mažas flokuliacijos daleles. Tai buvo sėkmingai įrodyta naudojant neįprastas 0,4-0,8 pm filtrų poras. Taip pat tai veikė su 1-3 pm porų filtrais. E. coli ląstelės dydis yra: 1,0-2,0 mikrometrų ilgio, o spindulys apie 0,5 mikrometro. Pirminiai valymo metodai, kurie įprastai rekomenduojami E. coli bakterijoms, yra tangentinio srauto filtravimas, kai porų dydis yra mažesnis nei 0,2 mikrometro, arba centrifugavimas, kuris yra labiausiai paplitęs būdas išvalyti ląstelių nuolaužas, didelius arba mažus flokuliantus.

Naujai sukurta raiškos sistema apima genetinius elementus, skirtus tiksliniams baltymams gaminti ir kartu ūžavimo fermentams gaminti kontroliuojamu būdu ląstelės periplazminėje erdvėje norimu augimo periodu, jei reikia. Eksperimentiniai duomenys parodė, kad koekspresuotas fago ūžavimo fermentas nevisiškai suardo ląsteles, o formuoja protoplastų darinius, panašius į ląsteles. Tai leido manyti, kad lizocimo perkėlimas iš citoplazmos į periplazmą palengvino mureino sluoksnio, kuris yra atsakingas už ląstelių struktūros tvirtumo palaikymą, fermentinį skaidymą. Protoplastai atpalaiduoja / sekretuoja tikslinius baltymus į auginimo terpę be sekrecijos lyderinių peptidų pagalbos, gaminant purtomose kolbose ir mikrobiologiniame bioreaktoriuje. Protoplastai išlieka gyvybingi mažiausiai 4 valandas po ūžavimo fermentų indukcijos, t. y, jie de novo gamina ir išskiria dominantį baltymą, todėl laikui bėgant tikslinio baltymo kiekiai auginimo terpėje didėja. OMT baltymo raiška Biostat A fermentatoriuje buvo atlikta panaudojant E. coli JS007 pLATE31-VP39delta32-KnR, pACYC-PT7pelB-gpe-lacl ląsteles, ir vėliau procesai buvo išplėsti iki 300 I vienkartinio naudojimo fermentatoriaus. Iki 70 kartų didesnė išeiga buvo gauta po nuskaidrinimo ir gryninimo procesų, lyginant su raiška be ūžavimo. Įprasta viduląstelinė OMT raiška duoda 857 mg, o su autolize - 60000 mg iš 300 I bioreaktoriaus. Pademonstruotas ląstelės suardymo būdas, kurį lemia klonuoto T4 fago ližės geno raiška, skirtas išskirti viduląstelinius tikslinius baltymus, ir kuris gali būti taikomas kitiems rekombinantiniams baltymams, pakeičiant OMT.

Vienos talpos procesas fermentacijos inde, kuriame gaminami rekombinantiniai baltymai, vykstant ląstelių autolizei, po to stabilizuojant baltymus ir nusodinant nukleorūgštis tam, kad būtų galima eliminuoti mažiausiai 5 atskirai atliekamus tolesnius apdorojimo etapus: ląstelių surinkimą, mechaninę ir (arba) fermentinę ląstelių ližę, ląstelių nuolaužų atskyrimą, nukleino nusodinimą ir po to atskyrimą naudojant filtravimą arba centrifugavimą.

SEKOS vp39 baltymo seka be 32 C-galinių aminorūgščių: 1-301, His žymeklis: 302309: - NCBI sekos ID: AGJ91263.1, baltymo pavadinimas: daugiafunkcinis poli-A polimerazės mažas subvienetas VP39 [Vaccinia virus] mdvvsldkpfmyfeeidneldyepesanevakklpyqgqlklllgelfflsklqrhgildgatvvy igsapgthirylrdhfynlgviikwmlidgrhhdpilnglrdvtlvtrfvdeeylrsikkqlhpsk iilisdvrskrggnepstadllsnyalqnvmisilnpvasslkwrcpfpdqwikdfyiphgnkmlq pfapsysaemrllsiytgenmrltrvtksdavnyekkmyylnkivrnkvvvnfdypnqeydyfhmy fmlrtvycnktfpttkakvlflqqsifrflnipttstghhhhhhg (SEQ ID Nr. 1)

Gpe baltymo seka su PelB signaline seka (NCBI referentinė seka: NP_049736.1, baltymo pavadinimas: glikozido hidrolazės šeimos baltymas (Escherichia fagas T4). PelB signalinė seka: 1-22, T4 bakteriofago lizocimas 23-164):

mkyllptaaagllllaaqpamamnifemlhderlrlkiykdtegyytigighlltkspslnaaks eldkaigrncngvitkdeaeklfnqdvdaavrgilrnaklkpvydsldavrrcalinmvfqmgetg vagftnslrmlqqkrwdeaavnlaksiwynqtpnrakrvittfrtgtwdayknl (SEQ ID Nr. 2)

Claims (21)

1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

   1. Nuskaidrintos ląstelių kultūros, apimančios rekombinantinį baltymą, gamybos būdas, kur būdas apima:

   i) bioreaktoriaus inokuliavimą ląstele šeimininke tam, kad būtų pateikta ląstelių kultūra, kur minėta ląstelė šeimininkė yra Escherichia coli, transformuota raiškos sistema, apimančia:

   a) nukleorūgštį, koduojančią rekombinantinį baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi, kur baltymas yra 2-O-metiltransferazė (OMT); ir

   b) nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimo baltymą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, funkcionaliai susietą su antruoju indukuojamu promotoriumi, ii) fermentavimą ląstelių kultūros, esant tokioms sąlygoms, kurios:

   a) suteikia galimybę ekspresuoti rekombinantinį polipeptidą; ir

   b) suteikia galimybę ląstelę padaryti pralaidžią tam, kad susiformuotų sferoplastas, išskiriantis rekombinantinį polipeptidą, kur minėta fermentacijos pakopa apima stabilizuojančio agento įdėjimą į ląstelių kultūrą;

   iii) nuskaidrinimą fermentuotos ląstelių kultūros, apimančios išskiriamą rekombinantinį baltymą, kur minėtas nuskaidrinimas apima

   e) flokuliavimo agento pridėjimą į ląstelių kultūrą, kur flokuliavimo agentas yra polietileniminas (PEI);

   f) pirminį flokuliuotos ląstelių kultūros nuskaidrinimą, naudojant pirmąjį nuskaidrinimo filtrą, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai apie 0,4 ųm arba didesnes sulaikymo ribas, kur nuskaidrinimo pakopa neapima centrifugavimo.
2. 2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad būdas papildomai apima antrinę nuskaidrinimo pakopą, panaudojant antrąjį filtrą, kurio porų dydis užtikrina mažiausiai apie 0,22 ųm sulaikymo ribas.
3. 3. Būdas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad pirminiame nuskaidrinimo etape naudojamas pirmasis filtras, kurio porų dydis užtikrina sulaikymo ribas mažiausiai nuo apie 0,4 iki apie 0,8 pm.
4. 4. Būdas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad antrojoje nuskaidrinimo pakopoje naudojamas antrasis filtras, kurio porų dydis užtikrina sulaikymo ribas mažiausiai apie 0,4-0,8 pm arba mažiausiai nuo apie 1,0 pm iki apie 3,0 pm.
5. 5. Būdas pagal 1 arba 2 punktų, besiskiriantis tuo, kad pirminė nuskaidrinimo pakopa ir (arba) antrinė nuskaidrinimo pakopa yra mikrofiltravimas, kur pasirinktinai mikrofiltravimas yra giluminis filtravimas.
6. 6. Būdas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad mikrofiltravimas yra pasirinktas iš normalaus srauto filtravimo (NFF) arba tangentinio srauto filtravimo (TFF).
7. 7. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad nuskaidrintos ląstelių kultūros drumstumas yra mažesnis nei maždaug 20 NTU.
8. 8. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad būdas yra vykdomas uždaroje sistemoje taip, kad tarp bioreaktoriaus ir pirmojo bei antrojo nuskaidrinimo filtrų būtų palaikomas sterilus srautas.
9. 9. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad papildomai apima pakopą, kurioje minėtai nuskaidrintai ląstelių kultūrai taikoma viena arba daugiau minėto rekombinantinio baltymo gryninimo pakopų.
10. 10. Budas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad stabilizuojantis agentas apima sacharozę, Na2SO4 ir Brij 35, pasirinktinai 1 M sacharozę, 0,5 M Na2SO4 ir 0,5 % Brij 35.
11. 11. Baltymų gamybos būdas, apimantis:

    i. rekombinantinės Escherichia coli ląstelės kultivavimą esant sąlygoms, kurios:

    a) suteikia galimybę ekspresuoti baltymą; ir

    b) suteikia galimybę ląstelę padaryti pralaidžią tam, kad susiformuotų sferoplastas, kuris išskiria baltymą; ir ii. baltymo išskyrimą iš kultūros be visiško rekombinantinės ląstelės ūžavimo, kur ląstelė apima raiškos sistemą, apimančią:

    a) nukleorūgštį, koduojančią baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi, kur baltymas yra 2-O-metiltransferazė (OMT); ir

    b) nukleorūgštį, koduojančią T4 lizocimą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB sekrecinį signalinį peptidą, funkcionaliai susietą su antruoju indukuojamu promotoriumi.
12. 12. Būdas pagal bet kurį iš 1-11 punktų, besiskiriantis tuo, kad būdas neapima: (i) mechaninio ląstelių ardymo; (ii) egzogeninio fermento, kuris ardo ląstelės sienelę, pridėjimo; ir (iii) ląstelės transformavimo raiškos vektoriais, turinčiais nukleorūgštį, koduojančią egzogeninį fermentą, kuris ardo citoplazminę membraną.
13. 13. Būdas pagal bet kurį iš 1-12 punktų, besiskiriantis tuo, kad nukleorūgštis, koduojanti baltymą, funkcionaliai susietą su pirmuoju indukuojamu promotoriumi, yra pirmajame konstrukte, ir nukleorūgštis, koduojanti T4 lizocimą rėmelyje su nukleorūgštimi, koduojančia PelB. sekrecinį signalinį peptidą, yra antrajame konstrukte.
14. 14. Būdas pagal bet kurį iš 1 -13 punktų, besiskiriantis tuo, kad pirmasis indukuojamas promotorius ir antrasis indukuojamas promotorius yra indukuojami nuosekliai.
15. 15. Būdas pagal bet kurį iš 1 -13 punktų, besiskiriantis tuo, kad pirmasis indukuojamas promotorius ir antrasis indukuojamas promotorius yra indukuojami vienu metu.
16. 16. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad pirmasis indukuojamas promotorius yra IPTG indukuojamas promotorius, pasirinktinai kur IPTG indukuojamas promotorius yra PT7.
17. 17. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad antrasis indukuojamas promotorius yra arabinozės indukuojamas promotorius, pasirinktinai kur arabinozės indukuojamas promotorius yra araB.
18. 18. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad T4 lizocimo fermentą koduoja genas E.
19. 19. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad E. coli yra Escherichia coli JS007 kamienas arba Escherichia coli B kamienas.
20. 20. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad fermentavimas arba kultivavimas apima pirmosios temperatūros pakeitimą į antrąją temperatūrą, pasirinktinai kur antroji temperatūra yra intervale nuo 25 °C iki 36 °C, o pirmoji temperatūra yra intervale nuo 36,8 °C iki 37,2 °C.
21. 21. Rekombinantinis baltymas, pagamintas budu pagal bet kurį iš 1-20 punktų.