KR20200108829A - 저알레르기성 영아용 조제식 및 이의 제조 방법 - Google Patents

저알레르기성 영아용 조제식 및 이의 제조 방법 Download PDF

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루프레히트 줄스 주스트 반 니르벤
말고자타 테오도로비치
헨드릭 알베르투스 코스터스
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프리슬랜드캄피나 네덜란드 비.브이.
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Abstract

본 발명은 영아 조제식 분야, 특히, 우유 알레르기(CMA)가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 우유 단백질에 기반한 저알레르기성 영양 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하기 단계들: (i) 수성 배지에서 1종 이상의 우유 단백질(들)을 포함하는 출발 조성물에 효소적 처리를 실시함으로써 얻은 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 제공하는 단계; (ii) RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 단계; (iii) 선택적으로, 클리어링된 부분적 가수분해물을 농축시키는 단계; 및 (iv) (농축된) 클리어링된 부분적 가수분해물을 CMA가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 영양 조성물로 조제하는 단계를 포함한다.

Description

저알레르기성 영아용 조제식 및 이의 제조 방법
본 발명은 영아용 영양 조제식 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 우유 알레르기(cow's milk allergy: CMA)가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 우유 단백질에 기반한 저알레르기성(hypoallergenic) 영양 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다.
매우 다수의 영아용 조제식이 우유로부터의 단백질에 기반한다. 그러나 우유 단백질은 집단의 적은 백분율에서 알레르기 징후를 일으키는 것으로 알려져 있으며; 추정치는 0.1% 내지 8%의 범위이다.
우유 알레르기(cow's milk allergy: CMA)의 추정 유병률은 0.25% 내지 4.9%로 다르며, 성인보다 아동에게서 더 높다. CMA는 1종 이상의 유즙 단백질에 대한 면역학적 반응으로부터 초래된다. 이 면역학적 기준은 우유 단백질에 대한 다른 유해 반응, 예컨대, 락토스 불내증과 CMA를 구별한다. CMA는 면역글로불린 E(IgE) 또는 비-IgE-매개일 수 있고, 아토피성 체질의 징후이며, 추가적인 식품 알레르기를 수반할 수 있다. (국한성 식이섭취에 따라서) 다른 식품에 대한 반응은 CMA와 조합하여 일어날 수 있다. 비-IgE-매개 장애는 보통, 주로 위장 증상에 존재하고 다양한 식품 알레르기가 발생할 가능성이 적은 T-세포(또는 호산구)를 수반한다. IgE- 및 비-IgE-매개 메커니즘은 아토피 피부염 및 호산성 위장 장애(EGID)의 발병에서 어떤 역할을 할 수 있다. 통상적인 알레르기 반응은 설사, 구토, 장 장애, 호흡 문제, 피부염, 이노성, 불안 및 식욕 부진을 포함한다. 베타-락토글로불린(인간 모유에 없음)은 민간 민감성의 가장 빈번한 원인이다.
우유-단백질 기반 조제식의 알레르기 가능성은 단백질 가수분해에 의해 감소될 수 있다. 사실, 가수분해된 단백질은 우유 단백질에 대한 알레르기로 진단되거나 알레르기 위험군인 것으로 확인된 영아를 위한 조제식에서 필수적이다. 가수분해 과정 동안에, 단백질 상의 알레르기-유발 영역(에피토프)은 파괴되거나 최소로 감소된다. 동물 연구는 부분적 가수분해물이 무손상 단백질에 대한 경구 내성을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다. 경구 내성은 경구로 투여되는 알레르겐에 대한 면역계의 활성 비-반응이다. 경구 내성이 작동하지 않는다면, 식품 알레르기가 생기는데, 이는 경구 내성이 생후 몇 개월 내에 중요한 과정이라는 것을 의미한다.
영아 영양에서 사용하기 위한 2가지의 유즙 단백질 가수분해물이 있다. 광범위 가수분해물에서, 거의 모든 에피토프가 파괴되므로, 이들은 CMA를 앓고 있는 것으로 알려진 영아에서 사용될 수 있다. 대조적으로, 부분적 단백질 가수분해물은 여전히 최소 수의 에피토프를 함유한다. 부분적 가수분해물은 전형적으로 비알레르기 영아, 예를 들어, CMA가 발생하기 쉬운 영아에서 알레르기 예방에 이상적이며 편안한 것으로 간주된다.
인간 모유 조성물을 이상적으로 충족시키기 위해, 영아용 조제식 중의 우유 단백질은 유청 단백질과 카세인을 적절한 비로 함유하여야 한다. 온전한(intact) 유즙 단백질에 기반한 다수의 제품이 바람직한 유청 단백질 대 카세인 비를 충족시키지만, 대다수의 상업적으로 입수 가능한 부분적으로 가수분해된 조제식은 100% 유청 단백질에 기반한다.
부분적 유청 단백질 가수분해물의 제조 공정은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 일반적으로 효소 및/또는 잔여 단백질을 제거하기 위한 가수분해 후에 다단계의 가수분해 및 물리적 분리를 수반한다. 대부분의 공정은 또한 가수분해 동안 일정한 pH 제어를 수반한다.
문헌[Boyle et al. (BMJ 2016;352:i974)]에 의한 간행물은 가수분해된 조제식이 알레르기 또는 자가면역 질환의 위험을 감소시키는 데 효과적인지의 여부에 의문을 제기한다. 19,000명 초과의 참여자를 포함하는, 가수분해 조제식의 37회의 중재 시험에 대한 체계적 검토 및 메타-분석에 기반하여, 부분적으로 또는 광범위하게 가수분해된 조제식이 이들 결과의 높은 이미 존재하는 위험에서 영아의 알레르기 또는 자가면역 결과 위험을 감소시킨다는 전반적인 지속적인 증거가 없다는 결론을 내렸다. 특히, 저자는 부분적으로 가수분해된 조제식이 습진 위험을 감소시킬 수 있다는 미국식품의약국(US Food and Drug Administration)에 의해 승인된 건강정보표시(health claim)도, 또는 가수분해된 조제식이 우유에 대한 알레르기를 일으킨다는 코크런 검토(Cochrane review)의 결론도, 뒷받침하는 증거가 없다는 결론을 내린다.
현재 시판되고 있는 부분적 유즙 단백질 가수분해물의 기능성을 더 양호하게 이해하기 위한 시도에서, 본 발명자들은 면역원성 및/또는 알레르기항원성을 야기하는 잠재적 성분의 존재를 판독하는 것에 착수하였다.
놀랍게도 몇몇 통상적인 부분적 가수분해물은 DC, 대식세포, T 림프구 및 B 세포뿐만 아니라 비만세포 및 호염구 상에서 고도로 발현되는 AGE(최종 당화 산물(advanced glycation end product))에 대한 수용체인 RAGE에 결합할 수 있는 단백질성 응집물을 함유한다는 것이 관찰되었다. 문헌[Teodorowicz et al. (2016) 및 Smith et al. (2017)]에서 논의하는 바와 같이, 규정식 AGE에 의한 RAGE 활성화는 (가공된) 식품 단백질의 알레르기 및 면역원성 효과를 매개하는데 연루되는 것으로 알려져 있다.
추가로, 시험관내 호염구 분석을 이용하여, 부분적 유즙 가수분해물이 알레르기 매개체의 세포외 배출을 초래하는 과정인 탈과립을 유도하는 것이 발견되었다. 특히, 부분적 가수분해물로부터의 고분자량(당화된) 응집물의 제거는 RAGE 결합과 호염구 과립구의 탈과립을 둘 다 유의하게 감소시켰다.
본 명세서와 함께, 본 발명자들은 CMA가 발생할 위험에 있는 영아에서 영양 성분으로서 사용하기 위한 개선된 부분적 유즙 단백질 가수분해물을 제공하였다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "민감한" 및 "위험에 있는"은 달리 구체화되지 않는 한, 질환 또는 병태의 유전적 소인을 갖는 것, 질환 또는 병태의 가족력을 갖는 것 및/또는 질환 또는 병태의 증상을 갖는 것을 비롯하여, 특정 병태 또는 질환에 대해 저항성을 거의 갖지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 적어도 1명의 밀접한 가족 구성원이 알레르기를 겪고 있는 영아는 CMA가 발생할 위험에 있다. 더 나아가 알레르기항원성이 감소된 이러한 영아용 조제식은 다르게는 알레르기의 임상 증상을 야기할 수 있는 감작(sensitization)을 지연시키거나 예방한다는 점에서 예방적 이점을 갖는 것으로 간주된다.
일 실시형태에서, 본 발명은:
(i) 수성 배지에서 1종 이상의 우유 단백질(들)을 포함하는 출발 조성물에 효소적 처리를 실시함으로써 얻은 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 제공하는 단계,
(ii) RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 부분적 가수분해물을 클리어링(clearing)시키는 단계;
(iii) 선택적으로, 클리어링된 부분적 가수분해물을 농축시키는 단계; 및
(iv) (농축된) 클리어링된 부분적 가수분해물을 CMA가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 영양 조성물로 조제하는 단계를 포함하는,
우유 알레르기(CMA)가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 저알레르기성 영양 조성물을 제공하기 위한 방법을 제공한다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 하기 단계들:
(i) 수성 배지에서 1종 이상의 우유 단백질(들)을 포함하는 출발 조성물에 효소적 처리를 실시함으로써 얻은 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 제공하는 단계,
(ii) RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 단계;
(iii) 선택적으로, 클리어링된 부분적 가수분해물을 농축시키는 단계; 및
(iv) (농축된) 클리어링된 부분적 가수분해물을 CMA가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 영양 조성물로 조제하는 단계를 포함하는,
우유 알레르기(CMA)가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 저알레르기성 영양 조성물을 제공하기 위한 방법을 제공하되,
클리어링시키는 단계 (ii)는 분자 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 하기 단계들:
(i) 수성 배지에서 1종 이상의 우유 단백질(들)을 포함하는 출발 조성물에 효소적 처리를 실시함으로써 얻은 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 제공하는 단계,
(ii) RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 단계;
(iii) 선택적으로, 클리어링된 부분적 가수분해물을 농축시키는 단계; 및
(iv) (농축된) 클리어링된 부분적 가수분해물을 CMA가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 영양 조성물로 조제하는 단계를 포함하는,
우유 알레르기(CMA)가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 저알레르기성 영양 조성물을 제공하기 위한 방법을 제공하되,
클리어링시키는 단계 (ii)는 부분적 가수분해물의 크기 배제 크로마토그래피 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 클리어링시키는 단계 (ii)는 분자 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함한다. 본 실시형태에서, 추가로 막은 분자량 컷-오프가 10 내지 50 kDa의 범위, 더 바람직하게는 10 내지 20 kDa의 범위에 있는 것이 바람직하다.
일 실시형태에서, 부분적 가수분해물은 유청 단백질, 산 유청 단백질, 감미 유청 단백질, 유청 단백질 농축물, 유청 단백질 단리물, 탈염 유청 분말 및 카세인염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 우유 단백질(들)로부터 얻어진다. 예를 들어, 부분적 단백질 가수분해물은 부분적 유청 단백질 가수분해물을 포함하거나 부분적 유청 단백질이고, 부분적 단백질 가수분해물은 부분적 베타-락토글로불린 가수분해물 및/또는 부분적 알파-락트알부민 가수분해물을 포함하거나 이들이거나, 또는 부분적 단백질 가수분해물은 부분적 카세인 가수분해물을 포함하거나 부분적 카세인 가수분해물이다.
유청 단백질의 공급원은 산성 유청, 감미 유청, 유청 단백질 단리물 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일 실시형태에서, 단백질 공급원은 유청 단백질 단리물 또는 변형된 감미 유청에 기반한다. 감미 유청은 용이하게 이용 가능한 치즈 제조 부산물이며, 우유에 기반한 영아용 조제식의 제조에서 빈번하게 사용된다. 그러나, 감미 유청은 바람직하지 않게 트레오닌이 풍부하고 트립토판이 부족한 성분인 카세이노-글리코-마크로펩티드(CGMP)를 포함한다. 감미 유청으로부터의 CGMP의 제거는 인간 모유에 더 가까운 트레오닌 함량을 갖는 단백질 분획을 초래한다. 감미 유청으로부터 CGMP를 제거하는 공정은 유럽 특허 제880902호에 기재되어 있다. 변형된 감미 유청 또는 유청 단백질 단리물이 단백질 공급원으로서 사용된다면, 0.1 내지 3중량%의 단백질의 양으로 유리 히스티딘에 의해 보충될 수 있다.
구체적 양상에서, 부분적 가수분해물은 유청 단백질 농축물로부터 얻는다.
본 명세서에서 사용되는 "부분적 가수분해물"이라는 표현은 CMA를 겪고 있는 영아를 위한 영양 성분으로서 당업계에 알려진 광범위하게 가수분해된 단백질 가수분해물과 구별되는 가수분해물을 지칭한다. 일 실시형태에서, 부분적 가수분해물은 가수분해도(degree of hydrolysis: DH)가 약 5 내지 20% 범위에 있되, DH는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 포르말린 적정(formal titration) 또는 AN/TN에 의해 결정된다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 DH가 6 내지 18%, 더 바람직하게는 8 내지 15%인 부분적 가수분해물을 사용한다. 구체적 양상에서, 부분적 가수분해물은 WPC로부터 얻으며, DH는 5 내지 14%, 바람직하게는 7 내지 11%의 범위에 있다.
우유 단백질(들)은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방식으로 가수분해될 수 있다. 전형적으로, 효소 처리는 2.5 내지 24시간의 기간 동안, pH 6 내지 8 및 45 내지 60℃ 범위의 온도에서 1종 이상의 유즙 단백질을 1종 이상의 엔도- 및 엑소프로테아제를 포함하는 출발 조성물에 노출하는 것을 포함한다.
예를 들어, 출발 물질(있는 그대로 또는 적합한 형태, 예컨대, 용액 또는 현탁액으로)은, 이어서, 적어도 1종의 엔도- 및 적어도 1종의 엑소프로테이나제의 조합물로 처리되며, 이때 상기 효소 혼합물은 0.1 내지 5%의 양으로 첨가된다. 일 실시형태에서, 출발 물질은 단백질 함량이 10 내지 20중량% 범위인 수성 매질에서 1종 이상의 유즙 단백질을 포함하는 조성물이다. 엔도- 및 엑소프로테이나제는 순차적으로 - 예를 들어, 둘 이상의 별개의 가수분해 단계로 - 또는 동시에, 예를 들어, 단일 가수분해 단계에서 적합한 혼합물로서, 선택적으로 임의의 남아있는 효소를 이용하여 1회 이상의 추가적인 가수분해 단계와 조합하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 가수분해는 사용될 모든 효소의 조합물을 이용하는 단일 가수분해 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 엔도- 및 엑소프로테이나제로서, (적어도) 효소 알칼라제 및 트립신을 함유하는 효소 혼합물을 비롯한 세린 프로테아제의 적합한 혼합물이 사용된다. 상기 효소 혼합물에서 사용하기에 적합한 다른 효소는 플라보르자임(Flavourzyme)이다. 일 실시형태에서, 알칼라제, 플라보르자임과 트립신의 혼합물이 사용된다.
적절한 효소(들), 예를 들어, 엔도- 및 엑소프로테이나제의 혼합물을 이용하여, 출발 물질은 약 45 내지 60℃, 바람직하게는 50 내지 58℃의 온도에서, 4시간 미만, 바람직하게는 1.5 내지 3시간 동안 가수분해될 수 있다. 가수분해 동안, pH는 전형적으로 6.4 내지 8의 범위에서 유지되고, 바람직하게는 본질적으로 일정하게, 예를 들어, 6.8 내지 7.8의 범위에서 유지된다.
락토스가 실질적으로 없는 출발 물질로서 유청 분획이 사용된다면, 단백질은 가수분해 및 후속적 열 가공 동안 훨씬 더 적은 리신 막힘(lysine blockage)을 겪는다는 것이 발견될 수 있다. 이는 리신 막힘 정도가 총 리신의 약 15중량%으로부터 리신의 약 10중량% 미만까지; 예를 들어 단백질 공급원의 영양 품질을 크게 개선시키는 리신 막힘의 약 7중량%까지 감소되는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 크기가 5 kDa 이상인 적어도 10중량%의 펩티드, 및 크기 범위가 1 내지 최대 5kDa인 적어도 15중량%의 펩티드를 포함하는, 부분적 우유 단백질 가수분해물의 제공을 포함한다.
예를 들어, 부분적 단백질 가수분해물에서 펩티드의 크기 분포는 부분적 단백질 가수분해물에 존재하는 펩티드의 건조 중량에 기반하여, 1 kDa 미만이 40 내지 60%, 1 내지 2 kDa 미만이 10 내지 14%, 2 내지 5 kDa 미만이 8 내지 16%, 5 내지 10 kDa 미만이 3 내지 7%, 및 10 kDa 초과가 8 내지 12%이다.
본 발명의 방법은 최종 당화 산물(AGE)에 대한 수용체인 RAGE에 결합할 수 있는 한 가지 이상의 원치않는 성분(응집물), 즉, 추정컨대 최종 당화 산물(AGE)의 존재에 기인하여 RAGE-결합 특징을 갖고/갖거나 호염구 탈과립 유도 능력을 갖는 성분/응집물로부터 부분적 우유 단백질 가수분해물을 클리어링시켜, 가수분해물의 알레르기유발성/면역원성 잠재력을 감소시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 양상에서, RAGE-결합 활성을 갖는 한 가지 이상의 성분(응집물)이 제거된다. RAGE-결합 성분의 존재(또는 부재)는 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어 인간 ELISA에서 최종 당화 산물의 가용성 수용체(soluble Receptor of Advanced Glycation End-Product: sRAGE)를 이용하여 결정될 수 있다. sRAGE 검사 키트는 바이오벤더(BioVendor)에 의해 시판되고 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, AGE의 존재 및/또는 제거는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, N-카복시메틸리신(CML)은 o-프탈알데하이드 전치칼럼-유도체화에 의한 HPLC/FLD 방법을 이용하여 AGE의 마커로서 분석될 수 있다(Lee et al., 2016 The FASEB Journal, vol. 30 no. 1 Supplement 673.8).
대안적으로 또는 추가적으로, 호염구 탈과립 유도 능력(예를 들어, RBL을 이용하는 공지된 시험관내 분석을 이용하여 증명됨)을 갖는 한 가지 이상의 성분(응집물)은 제거된다. 또 다른 실시형태에서, RAGE-결합 성분(응집물)뿐만 아니라 호염구 탈과립 유도 능력을 갖는 성분이 제거된다.
일 실시형태에서, 클리어링시키는 단계 (ii)는 분자 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함한다. 분자 컷-오프가 10 내지 50 kDa 범위, 바람직하게는 10 내지 20 kDa 범위인 막을 이용하여 양호한 결과가 얻어진다. 바람직한 실시형태에서, 클리어링시키는 단계 (ii)는 분자 컷오프가 10 kDa인 막을 이용하는 부분적 가수분해물의 여과를 포함한다.
당업자는 본 발명에 따라, 임의의 유형의 여과 기술이 한 가지 이상의 원치않는 성분을 제거하는 데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 방법은 미세여과(microfiltration: MF), 한외여과(Ultra filtration: UF), 탄소 여과 또는 광택 여과(polish filtration)를 수반할 수 있다. 한외여과를 이용하여 매우 양호한 결과가 얻어질 수 있다.
여과 후에, 클리어링된 부분적 가수분해물은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 분무 건조와 같은 열 가공에 의해 고건조 고체 내용물로 농축될 수 있다.
당업자는 클리어링시키는 단계 (ii)에서 다른 기법이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 다른 실시형태에서, 클리어링시키는 단계 (ii)는 부분적 가수분해물의 크기 배제 크로마토그래피 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함한다. 본 실시형태에서, 분자량이 100 kDa 이상인 성분은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 제거된다. 클리어링된 부분적 가수분해물은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 분무 건조와 같은 열 가공에 의해 고건조 고체 내용물로 농축될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법의 단계(iv)에서, (농축된) 클리어링된 부분적 우유 단백질 가수분해물은 CMA가 발생할 위험에 있는 영아용 영양 조성물로 조제된다. (농축된) 클리어링된 부분적 우유 단백질 가수분해물은 전형적으로 추가적인 분획화 또는 정제 없이 최종 영양 제품에서 "있는 그대로" 사용된다.
바람직하게는, (농축된) 클리어링된 부분적 우유 단백질 가수분해물은 저알레르기성 영아용 조제식, 더 바람직하게는 4개월령 초과의 영아에 의한 사용을 위한 영아용 조제식으로 조제된다.
따라서 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 방법에 의해 얻을 수 있는 영아용 저알레르기성 영양 조성물을 제공한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 생후 1년 동안에 영아의 특정 영양적 사용을 위한 것으로 의도되고, 1991년 5월 14일자의 유럽연합 집행위원회 지침(European Commission Directive) 91 /321 /EEC에 규정된 바와 같은 개인의 이런 범주의 영양 요구를 단독으로 충족시키는, "저알레르기성 영아용 조제식"으로도 본 명세서에서 지칭되는 저알레르기성 영양 조성물을 지칭한다. "영아용 조제식"이라는 용어는 스타터(starter) 영아용 조제식 및 후속 조제식을 포함한다. 용어 "스타터 영아용 조제식"은 생후 4개월 내지 6개월 동안 영아에 의해 특정 영양 용도용으로 의도되는 식품을 의미한다. 용어 "후속 조제식"은 4개월 내지 6개월, 최대 12개월령의 영아에 의한 특정 영양 용도로 의도되고, 이런 개인 범주의 점진적으로 다양화된 규정식 내 주된 액체 요소를 구성하는 식품을 의미한다.
본 발명의 영아용 조제식은 바로 소모할 수 있는 조제식의 100 ㎖ 당 1.0 내지 2.0 그램의 부분적으로 가수분해된 유청 단백질, 더 바람직하게는 1.5 내지 1.9 g/100 ㎖를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 영아용 조제식은 탄수화물 공급원을 함유할 수 있다. 영아용 조제식에서 통상적으로 발견되는 임의의 탄수화물 공급원, 예컨대, 락토스, 사카로스, 말토덱스트린, 전분 및 이들의 혼합물이 사용될 수 있지만, 탄수화물의 바람직한 공급원은 락토스이다. 바람직하게는 탄수화물 공급원은 조제식의 총 에너지의 35 내지 65%에 기여한다.
영아용 조제식은 일반적으로 지질 공급원을 함유한다. 이 경우에, 지질 공급원은 영아용 조제식에서 사용하기에 적합한 임의의 지질 또는 지방일 수 있다. 바람직한 지방 공급원은 유지방, 홍화유, 난황 지질, 카놀라유, 올리브유, 코코넛유, 팜핵유, 대두유, 어유, 팜올레산, 고올레산 해바라기유 및 고 올레산 홍화유, 및 장쇄, 다불포화 지방산을 함유하는 미생물 발효유를 포함한다. 일 실시형태에서, 무수 유지방이 사용된다. 지질 공급원은 또한 이들 오일로부터 유래된 분획, 예컨대, 팜 올레핀, 중간 사슬 트리글리세라이드, 및 지방산, 예컨대, 아라키돈산, 리놀레산, 팔미트산, 스테아르산, 도코사헥산엔산, 리놀렌산, 올레산, 라우르산, 카프르산, 카프릴산, 카프로산 등의 에스테르의 형태일 수 있다. 또한 다량의 사전형성된 아라키돈산 및 도코사헥사엔산을 함유하는 소량의 오일, 예컨대, 어유 또는 미생물 오일이 첨가될 수 있다. 지방 공급원은 바람직하게는 n-6 대 n-3 지방산의 비가 약 5:1 내지 약 15:1; 예를 들어, 약 8:1 내지 약 10:1이다. 실시형태에서, 영아용 조제식은 에너지 밀도가 600 ㎉/ℓ 내지 780 ㎉/ℓ, 바람직하게는 630 ㎉/ℓ 내지 700 ㎉/ℓ에 포함된다. 전체적으로, 지방 함량은 바람직하게는, 예컨대, 조제식의 총 에너지의 30 내지 55%에 기여한다.
구체적 양상에서, 영아용 조제식은 트리아실글리세롤로 에스테르화된 팔미트산을 포함하는 오일 혼합물을 포함하되, 예를 들어, 트리아실글리세롤의 sn-2 위치에서 에스테르화된 팔미트산은 양이 총 팔미트산의 20중량% 내지 60중량%이고, 트리아실글리세롤의 sn-1/sn-3 위치에서 에스테르화된 팔미트산은 양이 총 팔미트산의 40중량% 내지 80중량%이다.
영아용 조제식은 또한 매일의 규정식에서 그리고 영양적으로 유의한 양으로 필수적인 것으로 이해되는 모든 비타민 및 무기염류를 함유할 수 있다. 특정 비타민 및 무기염류에 대한 최소 필요조건이 확립되었다. 영아용 조제식에 선택적으로 존재하는 무기염류, 비타민 및 기타 영양소의 예는 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 C, 비타민 D, 엽산, 이노시톨, 니아신, 바이오틴, 판토텐산, 콜린, 칼슘, 인, 요오드, 철, 마그네슘, 구리, 아연, 망간, 염화물, 칼륨, 나트륨, 셀레늄, 크롬, 몰리브덴, 타우린 및 L-카르니틴을 포함한다. 무기염류는 보통 염 형태로 첨가된다. 특정 무기염류 및 다른 비타민의 존재 및 양은 의도된 영아 집단에 따라 다를 것이다.
구체적 양상에서, 본 발명에 따른 방법은 갈락토-올리고당(GOS), 인간 모유 올리고당(HMO), 특히 2'-푸코실락토스(2'-FL) 및/또는 6'-시알릴락토스 및 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 성분을 포함시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 영아용 조제식은 적어도 갈락토-올리고당(GOS)을 포함한다.
다른 실시형태에서, 영아용 조제식은 적어도 인간 모유 올리고당 (HMO), 바람직하게는 시알릴락토스, 푸코실락토스, 디-시알릴화된 올리고당, 락토-N-네오-테트라오스(LNnT), 락토-N-테트라오스(LNT), 락토-N-푸코펜타오스(LNFP)-이성질체, 락토-N-디푸코헥사오스(LNDFH)-이성질체, 푸코실락토-N-헥사오스(F-LNH)-이성질체, 디푸코실락토-N-헥사오스(DF-LNH)-이성질체 및 트리푸코실락토-N-헥사오스(TF-LNH)-이성질체로 이루어진 군으로부터 선택되는 HMO를 포함한다(또한 WO2013/025104A1 참조). 시알릴락토스는 우유로부터 유래될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 조제식은 2'-푸코실락토스(2'-FL) 및/또는 6'-시알릴락토스(6'-SL)를 포함한다.
본 발명의 영아용 조제식은 바로 소모할 수 있는 영아용 조제식의 100 ㎖당 50 내지 1000 나노그램의 TGF-β, 더 바람직하게는 50 내지 500 나노그램/100 ㎖ 및 가장 바람직하게는 200 내지 300 나노그램/100 ㎖를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 영아용 조제식은 TGF-β1과 TGF-β2를 둘 다, 더 바람직하게는 1:5 내지 1:50의 비로 함유한다.
TGF-β는, 예를 들어 유럽 특허 제1218410　B1호에 기재된 바와 같은 방법과 같은, 당업계에 공지된 방법에 의해 우유로부터 단리된 폴리펩티드 성장 인자의 형태로 조제식에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 바람직하다면 재조합 TGF-β가 사용될 수 있다.
필요하다면, 영아용 조제식은 유화제 및 안정제, 예컨대, 대두 레시틴, 모노- 및 디-글리세라이드의 시트르산 에스테르 등을 함유할 수 있다.
영아용 조제식은 선택적으로 유리한 효과를 가질 수 있는 다른 물질, 예컨대, 락토페린, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 본 발명은 RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계들:
(i) 수성 배지에서 1종 이상의 우유 단백질(들)을 포함하는 출발 조성물에 효소적 처리를 실시함으로써 얻은 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 제공하는 단계; 및
(ii) RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 단계; 및
(iii) 선택적으로, 클리어링된 부분적 가수분해물을 농축시키는 단계를 포함하되;
클리어링시키는 단계 (ii)는 분자 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함하거나; 또는
클리어링시키는 단계 (ii)는 부분적 가수분해물의 크기 배제 크로마토그래피 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 클리어링시키는 단계 (ii)는 분자 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함한다. 본 실시형태에서, 추가로 막은 분자량 컷-오프가 10 내지 50 kDa의 범위, 더 바람직하게는 10 내지 20 kDa의 범위에 있는 것이 바람직하다.
다른 실시형태에서, 클리어링시키는 단계 (ii)는 부분적 가수분해물의 크기 배제 크로마토그래피 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함한다. 본 실시형태에서, 분자량이 100 kDa 이상인 성분은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 제거된다.
"부분적 가수분해물"이라는 용어는 상기에 더 상세하게 기재되어 있다. 부분적 가수분해물 및 이의 바람직한 실시형태는 상기에 더 상세하게 기재되어 있다. 이들 바람직한 실시형태는 또한 본 발명에 따라 RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 방법에 적용된다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따라 RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 방법에 의해 얻을 수 있는 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CMA가 발생할 유전적 소인이 있고/있거나 가족력이 있는 영아 또는 유아에 대한 투여에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물에 관한 것이다.
도 1. 원심분리 필터 유닛에 대한 유즙 단백질 가수분해물 S100, S375, S8x 및 S6-50의 분획화 후, 상이한 MW 분획의 상대적 기여. 데이터는 얻은 분획의 단백질 농도 및 용적에 기반한다.
도 2. SEC에 의한 유청 단백질 가수분해물 분획의 분석. 유청 단백질 가수분해물(S8x)은 필터 유닛에 의해 분획화된 후에 SEC에 의해 분획 분석되었다. x-축: 필터 유닛에 대한 분획화에 의해 얻은 분획; y-축: SEC로부터의 결과. 데이터를 100%에 정규화시켰다.
도 3. 가수분해물 S8X(패널 A) 및 S100(패널 B)의 상이한 분획에 대한 sRAGE 저해 분석. 유청 유래 단백질 샘플을 MilliQ에 용해시키고 나서, 분획화하고, sRAGE 분석을 실시하였다. 결과는 3회 실행의 평균이다. 유의도 수준은 총 액체에 대해 또는 서로에 대해 주어진다. CML: 카복시-메틸 리신. G90: 양성 대조군. OVA: 음성 대조군(오발부민). 결과를 ANOVA(일원 분산 분석), 다음에 터키 사후 검정(Tukey post-test)으로 분석하였다. 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어(버전 5.03)에서 모든 분석을 수행하였다. 데이터를 평균 + 표준 편차로서 나타낸다. 모든 경우에, 유의도 수준은 별표로 나타낸다, *: p≤0.05; **: p≤0.01; ***: ≤0.001.
도 4. RBL로부터의 β-헥소사미니다제 방출. RBL을 IgG가 고갈된 60x 희석 인간 혈청과 함께 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 가수분해물 S8x의 상이한 분획과 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 모든 값으로부터 (ACB에서의) 자발적 방출을 차감하였다. 절대 방출 값을 유청 단백질 농축물(WPC)의 방출에 대해 표준화하였다. 유의도 수준을 WPC에 대해 나타낸다. 단백질 농도를 나노드랍(Nanodrop)에 의해 결정한다; ACB: 항원 시험감염 완충제. 결과를 ANOVA(일원 분산 분석), 다음에 터키 사후 검정(Tukey post-test)으로 분석하였다. 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어(버전 5.03)에서 모든 분석을 수행하였다. 데이터를 평균과 함께 표준 편차로서 나타낸다. 모든 경우에, 유의도 수준은 별표로 나타낸다, *: p≤0.05; **: p≤0.01; ***: ≤0.001.
실험 부문
실시예 1: 부분적 유즙 단백질 가수분해물의 크기 분리
본 실시예는 부분적 유즙 단백질 가수분해물의 상이한 크기의 분획으로의 분획화를 나타낸다.
다음의 가수분해물을 사용하였다:
S8x, S6-50 및 S375는 유청 단백질 농축물(WPC)로부터 얻고, 가수분해도가 약 9.2%인, 분무 건조시킨 부분적 가수분해물이다.
S100은 WPC로부터 얻고, 가수분해도가 약 15%인 분무-건조시킨 광범위 가수분해물이다.
크기 분획화
50 ㎎/㎖의 단백질 농도에서 4종의 상이한 부분적 유즙 단백질 가수분해물을 MilliQ에 용해시켰다. 진탕 하에 15분 동안 용해시킨 후에, 샘플을 원심분리시켰다(2000 g, 10분, 20℃). 그 후에, 샘플을 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시켜 별개의 수성층 및 지방층이 형성되게 하였다. 수성층을 조심해서 제거하고 나서, 지방층을 버렸다. 남아있는 펠릿을 고정된 용적의 PBS, Tris/요소(0.05M/6M)에서 또는 추가적인 디티오에리트리톨(DTE, 5 ㎎/㎖)과 함께 Tris/요소(0.05M/6M)에서 용해시켰다. 나노드랍 시스템(Nanodrop system)(써모사이언티픽(ThermoScientific))을 이용하여 280 ㎚에서의 흡수 측정에 의해, 얻은 분획의 단백질 농도를 결정하였다.
샘플로부터 얻은 수성층 중의 단백질을 원심분리 필터 유닛을 이용하여 크기를 기준으로 분리시켰다. 필터 세척 후에, 60 ㎎의 용해된 단백질을 아미콘 원심분리 필터 유닛(Amicon Centrifugal Filter Unit)(밀리포어(Millipore))에 장입하였고, 분자량 컷오프는 10 kDa이었다. 샘플을 10분 동안, 3363 g, RT에서 원심분리시켰다. 잔류액을 재현탁시키고 나서, 원심분리 단계를 반복하였다. 각각의 원심분리 단계 후에 투과액의 단백질 농도를 제어하였다. 투과액 중의 단백질 농도가 검출되지 않을 때까지 과정을 반복하였다. 분획을 둘 다(잔류액과 투과액) 수집하고 나서, 분획화 과정을 계속하였다.
10 kDa 필터를 통과한 단백질 분획에 대해 분자량 컷 오프가 3 kDa인 필터 유닛 상의 분획화를 상기 기재한 바와 같이 수행하였다. 10 kDa 필터를 통과하지 않은 분획에 100 kDa 필터 상의 분획화를 실시하였다. 샘플 S100에 100 kDa 필터 상의 분획화를 실시하지 않았다. 10 kDa 필터 상의 분획화를 위해 사용한 고정된 양의 단백질과 대조적으로, 3 kDa 및 100 kDa 필터 상에서 가변적 양의 단백질을 사용하였다. 적절한 분획을 풀링하고 나서, 추가로 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
분획화된 가수분해물의 HPLC 분석
분획화된 샘플의 상이한 분획에 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 실시하였다. 입자 크기가 1.7 ㎛이고 기공 크기가 200 Å인 워터스 액퀴티(Waters Acquity) UPLC 단백질 칼럼을 사용하였다. PBS (100 mM, pH 6.8 + 150 mM NaCl)에 의한 등용매 흐름(0.3 ㎖/분)을 적용하였다. 10 ㎕의 샘플을 주입하고 나서, 214 ㎚에서의 UV 흡광도에 의해 단백질을 검출하였다.
UV-VIS 및 형광 측정
실험적 유즙 가수분해물에 흡광도 및 형광 측정을 실시하였다. 샘플을 MilliQ에서 5.0 또는 2.5 ㎎의 단백질/㎖로 희석시켰다. 96 웰 플레이트의 웰에서 샘플을 피펫팅하였다(낮은 결합, 100 ㎕/웰). 흡광도를 294 ㎚ 및 490 ㎚에서 측정하였다.
병행 실험에서, 샘플을 백색 96 웰 플레이트의 웰에서 피펫팅하였다. 최적의 여기 및 방출 파장을 결정한 후에, 샘플 형광을 440 ㎚에서 평가하고, 여기를 350 ㎚에서 평가하였다.
유즙 단백질 가수분해물의 임의의 크기 의존적 양상을 연구하기 위해, 하기 컷-오프 값으로 아미콘(Amicon) 필터 유닛을 이용하여 샘플을 분획화시켰다: 10 kDa, 3 kDa 및 100 kDa. 상이한 분획의 기여를 도 1에 나타낸다. 가수분해물 S100은 대부분 작은 (3 kDa 미만) 펩티드 및 단백질로 이루어진다. 대조적으로, 가수분해물 S375, S8x 및 S6-50은 상당량의 더 큰 단백질, 특히 크기가 3 내지 10 kDa인 것뿐만 아니라 크기가 100 kDa 초과인 것을 함유한다. S375, S8x 및 S6-50은 유사한 공급원으로부터 유래되기 때문에, 해당 샘플 간의 유사성이 예측된다.
분획화의 정확성을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 제어하고, 결과를 도 2에 제시한다. SEC 분석은 대다수의 단백질이 필터 유닛 분획화에 의해 정확하게 분류된다는 것을 나타낸다. 이는 시험한 샘플 모두에 대해 동일한 크기 분류를 유지한다(3 kDa 미만, 3 내지 10 kDa 및 10 kDa 초과). 3 kDa 필터를 통과한 모든 단백질 중에서, 최대 30%는 분자량이 3 내지 10 kDa이고, 따라서 필터 유닛 분석에 의해 잘못 분류된다. 3 내지 10 kDa 분획 및 10 kDa 초과의 분획은 최대 20%(3 내지 10 kDa 분획) 및 최대 30%(10 kDa 초과의 분획)인 보다 작은 크기의 단백질의 존재도 나타낸다. 종합하면, 데이터는 필터 유닛 원심분리에 의한 단백질 분획화 방법이 약 70%내지 85%의 정확도로 유즙 가수분해물을 분획화시키는 것을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 부분적 유즙 단백질 가수분해물은 sRAGE에 결합하는 응집물을 함유한다.
sRAGE 저해 분석
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요약하면, 높은 단백질 결합 96 웰 플레이트(그레이너 바이오-원(Greiner Bio-one))를 4℃ 및 100 ㎕/웰에서 당화 대두 단백질 추출물(20 ㎍/㎖)로 밤새 코팅시켰다. pH 9.6에서 200 mM 탄산나트륨을 코팅 완충제로서 사용하였다. sRAGE(가용성 최종 당화 산물-특이적 수용체, 이콜라이(E. coli), 바이오벤더(Biovendor)에서 생성됨)를 pH 4.0에서 0.1M 아세트산에 용해시키고, AGE 결합 단백질로서 사용하였다. 샘플 분획을 처음에 1.5% BSA 및 0.025% Tween-20과 함께 PBS에서 희석시켰다. 얻어진 농도를 연속해서 희석시키고, sRAGE(1.25 ㎍/㎖)와 함께 사전인큐베이션시키고 나서, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 45분의 인큐베이션 후에, 200 ㎕의 단백질-sRAGE 혼합물을 코팅 플레이트에 옮겼고, 이를 PBS에서 1시간 동안 3% BSA로 차단시키고, 그 후에 세척하였다. 1시간의 인큐베이션 후에, 37℃에서, 단백질-sRAGE 혼합물을 버리고 나서, 웰을 PBS + 0.05% Tween-20으로 세척하였다. 항-sRAGE 항체(단클론성 마우스 IgG, 0.5 ㎍/㎖)를 웰(0.5 ㎍/㎖, 80 ㎕)에 첨가하고 나서, 플레이트를 실온에서 진탕시키면서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후에, 검출 항체(다클론성 염소 항-마우스, HRP 결합, 0.5 ㎎/㎖)를 첨가하였고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 최종 세척 후에 TMB(80 ㎕/웰)와 함께 3분 동안 인큐베이션시켰다. 100 ㎕의 2% HCl의 첨가에 의해 색 반응을 중단시켰다. 흡광도를 450 ㎚에서 판독하고, 기준값은 620 ㎚에서 판독한다. 결과를 양성 대조군인 G90(50 ㎍/㎖)에 대한 저해%로서 표현한다. 오발부민(인비트로젠(Invivogen))을 음성 대조군으로서 사용하였다.
이 시스템에서, RAGE 결합 응집물의 첨가는 당화 대두와 sRAGE의 상호작용을 저해할 수 있으며, 저해%로서 표현한다.
예시적인 가수분해물 S8x 및 S100의 분획화된 샘플(실시예 1 참조)을 당화된 대두 단백질에 대한 sRAGE 결합의 저해에 대해 시험하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. 비분획화된 부분적 가수분해물은 sRAGE 결합을 유의하게 저해하는 반면, 100 kDa 미만의 단백질에 대해 필터로 클리어링된 모든 분획은 이 저해에 거의 기여하지 않는 것을 발견하였다. 대조적으로, 100 kDa 초과의 분획은 가수분해물을 분리시키지 않은 저해와 유사한 저해를 나타낸다. 10 kDa 초과의 임의의 단백질 분획을 함유하지 않은 가수분해물 S100은 sRAGE 결합을 저해시킬 수 없었다(도 3B).
실시예 3: 유즙 단백질 가수분해물에 존재하는 응집물에 의한 호염기 과립구의 탈과립 유도
유즙 알레르기 환자로부터의 인간 혈청
유즙 알레르기 환자로부터의 인간 혈청을 레인스타테 병원(Rijnstate Hospital)(네덜란드 아른헴에 소재)으로부터 받았다. 3명의 상이한 환자의 동일한 용적을 풀링하였다. 각각의 환자에 대한 특이적 IgE 수준을 결정하였다. 결정한 값을 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
IgG 제거
스핀 원심분리에 의해 인간 혈청으로부터 IgG를 제거하였다. 아가로스에 결합된 단백질 G는 평형상태였고, 프로토콜에 따라 15 ㎖ 수집관에 넣었다. 인간 혈청을 결합 완충제에서 2x 희석시키고, 칼럼 내 아가로스 수지 상에 장입시키고 나서, 10분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후에, 칼럼을 원심분리시키고(1000 g, 1분) 통과액을 저장하였다. 칼럼에 추가적인 결합 완충제를 첨가한 후에 원심분리시킴으로써, 칼럼을 3회 세척하였다. 적절한 세척 분획을 이들의 단백질 농도에 기반하여 풀링시켰다. 용리 완충제를 첨가함으로써, 결합된 IgG를 칼럼으로부터 용리시키고, 그 후에 버렸다.
RBL 분석
인간 IgE 수용체(FcERI)의 알파 소집단으로 형질감염시킨 래트 호염구 백혈병(Rat Basophil Leukemia: RBL) 세포를 사용하여 상이한 유즙 가수분해물 분획의 탈과립 유도 능력을 평가하였다. 37℃, 5% CO2에서 5% 열 비활성화시킨 소태아 혈청(FBS), 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신 및 1% 글루타민이 있는 MEM에서 세포를 성장시켰다. 세포를 MEM으로 세척하고 나서, 플라스크의 바닥으로부터 긁어내었다. 원심분리(400g, 5분, RT) 및 MEM에서의 재현탁에 의해 MEM에서 세포를 2회 세척하였다. 나중에, MEM + 1% 글루타민에서 7.5 x 104/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에서 세포를 파종시켰다.
일단 세포가 웰의 바닥에 부착되면, 우유 알레르기 환자로부터의 인간 혈청을 세포에 첨가하였다. IgG의 제거 후에 3명의 환자로부터 풀링한 혈청을 사용하였다(132 kU/ℓ의 유즙 특이적 IgE의 평균, 표 1 참조). 전형적으로, MEM에서의 40x 및 60x의 희석물을 세포에 적용하였다. 양성 대조군에 대해, 세포를 MEM에서 IgE(100 ng/㎖)와 함께 인큐베이션시켰다. 37℃에서 24시간의 인큐베이션 후에, 세포를 75 ㎕의 타이로드(Tyrode) 세척 완충제(H2O에 용해시킨 137 mM NaCl, 2.69 mM KCl, 0.415 mM NaH2PO4, 0.492 mM MgCl2, 2.72 mM CaCl2, 10.1 mM HEPES, 0.280 mM 글루코스 및 1 g BSA/ℓ)로 부드럽게 3 회 세척하였다. 세척 단계를 완료한 후에, 항-IgE(1.0 내지 32 ㎍/㎖) 또는 희석시킨 유즙 가수분해물 샘플 중 하나를 각각의 웰에서 100 ㎕로 세포에 첨가하였다. 이 단계를 위해, 항-IgE와 유즙 가수분해물을 둘 다 항원 시험감염 완충제(50% H2O 및 50% D2O에 용해시킨 137 mM NaCl, 2.69 mM KCl, 0.415 mM NaH2PO4, 0.492 mM MgCl2, 2.72 mM CaCl2, 10.1 mM HEPES, 0.280 mM 글루코스 및 1 g BSA/ℓ)에 용해시켰다.
50분의 인큐베이션 후에, 100 ㎕ Triton-X100(PBS에서 1%)를 세포에 첨가하였는데, 이는 총 방출을 위한 양성 대조군으로서 작용한다. 1시간의 인큐베이션(37℃, 5% CO2) 후에, 60 ㎕의 세포 상청액을 50 ㎕의 기질 용액(pH 4.5(0.4M 시트르산으로 조절)에서 H2O에 용해시킨 126 mM Na2HPO4 중의 3.80 mM p-나이트로-N-아세틸-β-D-글루코사미니드)과 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 100 ㎕의 글리신(0.2 M, pH 10.7)의 첨가에 의해 반응을 중단시켰다. 흡광도를 405 ㎚에서 측정하고, 기준값은 620 ㎚에서 측정한다.
분획화된 가수분해물과 함께 세포의 인큐베이션 후 RBL 세포로부터의 β-헥소사미니다제의 방출을 평가하였다. 모든 실험에서 유청 단백질 농축물(WPC)을 양성 기준으로서 사용하였다.
결과를 도 4에 나타낸다. 분자량이 100 kDa 초과인 분획을 제외하고 예시적인 가수분해물 S8x의 분획 각각은 WPC보다 유의하게 더 적은 RBL 방출을 유도하였다. 해당 분획은 가장 큰 RBL 방출을 나타내었는데, 이는 WPC에 의해 유도된 방출에 대한 54%의 감소와 동일하다. 대조적으로, 저분자량의 분획은 더 낮은 β-헥소사미니다제 방출을 야기하였고, 분자량이 3 kDa 미만인 단백질을 갖는 분획에 대해 14%의 WPC로 줄어들었다. 펠릿으로부터의 불용성 단백질은 RBL 방출에 거의 기여하지 않았다.
실시예 4: 저알레르기성(HA) 영아용 조제식의 제조.
부분적 가수분해물의 제조
유청 단백질 농축물(WPC) 또는 카세인을 포함하는 유즙 단백질을 50 내지 60℃에서 10 내지 15%(w/w)의 최종 단백질 농도로 물에 용해시킨다. 45% 수산화칼륨(KOH) 또는 수산화나트륨(NaOH)에 의해 단백질 용액의 pH를 pH 6 내지 8로 조절한다). 1:50 내지 1:500의 효소/기질(E/S) 비로 단백질 용액에 엔도펩티다제(알칼라제) 및 엑소펩티다제(플라보르자임)을 첨가함으로써 단백질의 가수분해를 시작한다. 반응 혼합물을 50 내지 60℃에서 4 내지 24시간 동안 유지한다. 반응 혼합물을 90℃까지 가열함으로써 효소 반응을 중단시키고, 후속적으로 혼합물을 90℃에서 적어도 10분 동안 유지시킨다. 가열한 후에 혼합물을 10℃까지 냉각시킨다.
부분적 가수분해물의 클리어링
분자량 컷-오프가 100 kDa(10분, 3363 g, RT)인 아미콘 원심분리 필터 유닛(밀리포어)를 이용하여 부분적 가수분해물을 10℃에서 막을 거쳐서 여과시킨다. 잔류액을 물에서 재현탁시키고, 투과액에서 단백질이 280 ㎚에서 검출 가능하지 않을 때까지 원심분리 단계를 반복한다. 클리어링된 가수분해물을 함유하는 투과액 분획을 풀링하고 나서, 추가적인 하류의 처리를 실시하였다.
클리어링된 부분적 가수분해물의 농도
30℃에서 회전 필름 증발을 이용하고 60 mbar의 진공압을 적용하여 40 내지 60%의 건조 물질 함량이 될 때까지, 클리어링된 가수분해물을 농축시킨다. 농축시킨 가수분해물을 뷰키 벤치-탑(Buchi bench-top) 분무 건조기를 이용하고 200℃의 입구 온도 및 80℃의 출구 온도를 적용하여 분무 건조시킨다.
클리어링된 부분적 가수분해물의 영아용 조제식으로의 조제
클리어링 및 건조시킨 부분적 가수분해물을 표 2에 나타내는 바와 같은 최종 농도로 0 내지 6개월령을 위한 영아용 조제식으로 조제한다. 양호한 맛의 영아 유즙 조제식은 (100 g의 생성물 당) 클리어링된 유청 또는 카세인 단백질 가수분해물 6 내지 16중량%, 지방 성분 18 내지 29중량%, 탄수화물 함량 60중량% 미만, 프리바이오틱(prebiotic) 성분 3 내지 8중량%를 포함한다. 무기염류, 미량원소 및 비타민과 같은 추가적인 성분을 법에 의해 권장되는 양으로 혼입시킨다.
표 2는 본 발명에 따른 예시적인 영양 조제식, 예를 들어, 100 ㎖의 즉석 음료당 영아의 면역계를 지원하거나 향상시키기 위한 0 내지 6개월령 그룹용의 영아용 조제식(HA 영아용 조제식)의 조성을 나타낸다.
Figure pct00002

Claims (18)

  1. 우유 알레르기(cow's milk allergy: CMA)가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 저알레르기성(hypoallergenic) 영양 조성물을 제공하기 위한 방법으로서,
    (i) 수성 배지에서 1종 이상의 우유 단백질(들)을 포함하는 출발 조성물에 효소적 처리를 실시함으로써 얻은 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 제공하는 단계,
    (ii) RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 상기 부분적 가수분해물을 클리어링(clearing)시키는 단계;
    (iii) 선택적으로, 상기 클리어링된 부분적 가수분해물을 농축시키는 단계; 및
    (iv) 상기 (농축된) 클리어링된 부분적 가수분해물을 CMA가 발생할 위험에 있는 영아를 위한 영양 조성물로 조제하는 단계를 포함하되,
    상기 클리어링시키는 단계 (ii)는 분자 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 상기 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함하거나; 또는
    상기 클리어링시키는 단계 (ii)는 상기 부분적 가수분해물의 크기 배제 크로마토그래피 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 클리어링시키는 단계 (ii)는 분자량 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위, 바람직하게는 10 내지 50 kDa의 범위, 더 바람직하게는 10 내지 20 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 상기 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 부분적 가수분해물은 유청 단백질, 산 유청 단백질, 감미 유청 단백질, 유청 단백질 농축물, 유청 단백질 단리물, 탈염 유청 분말 및 카세인염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 우유 단백질(들)로부터 얻어지는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 부분적 단백질 가수분해물은 부분적 유청 단백질 가수분해물을 포함하거나 부분적 유청 단백질 가수분해물이고, 상기 부분적 단백질 가수분해물은 부분적 베타-락토글로불린 가수분해물 및/또는 부분적 알파-락트알부민 가수분해물을 포함하거나 이들이고, 상기 부분적 단백질 가수분해물은 부분적 카세인 가수분해물을 포함하거나 부분적 카세인 가수분해물인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 부분적 가수분해물은 가수분해도(degree of hydrolysis: DH)가 약 5 내지 20%, 바람직하게는 6 내지 18%, 더 바람직하게는 7 내지 11%의 범위에 있는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부분적 가수분해물은 크기가 5 kDa 이상인 적어도 10중량%의 펩티드 및 크기가 1 내지 최대 5 kDa인 적어도 15중량%의 펩티드를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부분적 단백질 가수분해물에서 상기 펩티드의 상기 크기 분포는 부분적 단백질 가수분해물에 존재하는 펩티드의 건조 중량에 기반하여 1 kDa 미만이 40 내지 60%, 1 내지 2 kDa 미만이 10 내지 14%, 2 내지 5 kDa 미만이 8 내지 16%, 5 내지 10 kDa 미만이 3 내지 7%, 및 10 kDa 초과가 8 내지 12%인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 컷-오프가 10 내지 50 kDa 범위, 바람직하게는 10 내지 20 kDa 범위인 막의 사용을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 여과는 미세여과(microfiltration: MF), 한외여과(Ultra filtration: UF), 탄소 여과 또는 광택 여과, 바람직하게는 한외여과를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클리어링된 부분적 가수분해물을 농축시키는 단계 (iii)을 포함하되, 바람직하게는 단계 (iii)은 분무-건조를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)는 상기 농축된 클리어링된 부분적 가수분해물을 탄수화물의 공급원, 지질 및 통상적인 비타민의 공급원, 올리고-요소(oligo-element) 및 무기염류와 합하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)는 갈락토-올리고당(GOS), 인간 모유 올리고당(HMO), 특히 2'-푸코실락토스(2'-FL) 및/또는 6'-시알릴락토스 및 TGFβ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 성분을 포함시키는 것을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 영아용 저알레르기성 영양 조성물.
  14. 제13항에 있어서, CMA가 발생할 유전적 소인이 있고/있거나 가족력이 있는 영아 또는 유아에 대한 투여에서 사용하기 위한, 저알레르기성 영양 조성물.
  15. RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 방법으로서,
    (i) 수성 배지에서 1종 이상의 우유 단백질(들)을 포함하는 출발 조성물에 효소적 처리를 실시함으로써 얻은 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물을 제공하는 단계; 및
    (ii) RAGE에 결합할 수 있고/있거나 호염구 탈과립 유도 능력을 가질 수 있는 한 가지 이상의 성분으로부터 상기 부분적 가수분해물을 클리어링시키는 단계; 및
    (iii) 선택적으로, 상기 클리어링된 부분적 가수분해물을 농축시키는 단계를 포함하되;
    상기 클리어링시키는 단계 (ii)는 분자 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 상기 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함하거나; 또는
    상기 클리어링시키는 단계 (ii)는 상기 부분적 가수분해물의 크기 배제 크로마토그래피 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 클리어링시키는 단계 (ii)는 분자량 컷-오프가 10 내지 100 kDa의 범위, 바람직하게는 10 내지 50 kDa의 범위, 더 바람직하게는 10 내지 20 kDa의 범위에 있는 막을 이용하는 상기 부분적 가수분해물의 여과, 및 클리어링된 부분적 가수분해물을 포함하는 여과액의 회수를 포함하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물.
  18. 제17항에 있어서, CMA가 발생할 유전적 소인이 있고/있거나 가족력이 있는 영아 또는 유아에 대한 투여에서 사용하기 위한, 유즙 단백질(들)의 부분적 가수분해물.
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