KR20200107777A - 바실러스 서브틸리스 cjbs303 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

바실러스 서브틸리스 cjbs303 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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KR20200107777A
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Abstract

본 출원은 바실러스 서브틸리스 CJBS303 (Bacillus subtilis CJBS303) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 축산 분뇨 유래 악취의 저감 효과를 가지는 균주, 상기 균주를 포함하는 조성물 및 미생물 제제, 및 상기 조성물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

Description

바실러스 서브틸리스 CJBS303 및 이를 포함하는 조성물{Bacillus subtilis CJBS303 and composition comprising the same}
본 출원은 축산 분뇨 유래 악취의 저감 효과를 가지는 바실러스 서브틸리스 CJBS303 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
최근 축산 농가에서 발생되고 있는 악취는 환경 오염은 물론, 주변 마을의 민원 발생률 증가, 및 질병 발생의 원인으로서, 사회적으로 큰 문제가 되고 있다. 축산 농가에서 발생하는 악취의 주 원인으로는 가축의 분뇨 생산과 이를 저장 및 처리하는 과정에서의 혐기 발효에 의해 발생된 가스가 있다. 이에, 환경부와 대한한돈협회에서는 암모니아, 메틸머캅탄, 황화수소 등을 포함한 12개의 악취물질을 지정하였고, 2010년에는 최종 22개의 지정 악취 물질 및 배출 허용 기준을 제정하였다. 또한, 대한한돈협회에서는 2015~2016년 2년간 133농가를 분석한 결과를 근거로 하여, 축산농가의 악취 관리 기준을 제시한 바 있으며, 이들 중 하나로, 농장 내부의 복합악취 희석배수를 1000배 이하로 관리할 것을 요구하고 있다. 여기서, 복합악취라 함은 두 가지 이상의 악취물질이 복합적으로 존재하면서 사람의 후각을 자극하여 불쾌감과 혐오감을 주는 냄새를 일컫는다.
돈사 내 대표적인 유해 가스이자 악취물질 중 하나인 암모니아 (NH3)는 자극성이 있는 무색의 유동성 가스로서, 비교적 낮은 농도에서도 이를 감지할 수 있다. 암모니아는 아미노산이 탈아미노화하는 과정에서 생성하는 것으로 알려져 있으며, 또 다른 암모니아 발생원으로는 요소와 질산이 있다. 암모니아 가스는 습한 체조직을 자극하여, 작업자의 눈을 따갑게 하고 돼지의 눈을 충혈시킨다. 돈사 내 암모니아 농도에 따른 돼지 생산성 영향에 대한 연구 자료에 따르면, 암모니아가 50ppm 이상일 경우 자돈 구간에서 약 12%의 성장 지체가 일어나며, 100~150ppm에서는 돼지의 30%가 성장 저해, 호흡기 질환 증상을 보인다.
또 다른 주요 악취가스로는 휘발성 황화합물이 있으며, 황화수소(H2S)와 메틸머캅탄(CH3SH) 등이 여기에 해당된다. 이러한 휘발성 황화합물은 황산염의 환원과정 및 황을 함유한 아미노산의 대사과정에서 생성된다. 황화수소는 유독성 가스이며, 공기보다 무거워 돈사의 슬러리 표면에 깔려있는 것으로 알려져 있으며, 작업자의 두통, 어지러움, 메스꺼움 등을 유발하고, 돼지의 경우 식욕저하, 호흡기 질병 등을 유발시킨다. 이외에도 축산 농가의 악취가스로는 인돌, 스카톨, p-크레졸 등의 인돌 및 페놀류와 프로피온산, 부티르산, 아세트산 등의 휘발성지방산 (VOCs)이 있으며, 이들 악취가스의 발생을 감소시킬 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 축산 농가에서 발생하는 악취를 저감시키기 위하여 예의 노력한 결과, 축산 분뇨로부터 유래하는 암모니아, 황화수소 등의 악취가스를 현격하게 저감시킬 수 있는 바실러스 속 균주를 분리 및 동정하였고, 이에 기초하여 본 출원을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1229865호
본 출원의 일 목적은 수탁번호 KCCM12435P로 기탁된 바실러스 서브틸리스 CJBS303 (Bacillus subtilis CJBS303) 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 또는 상기 농축물의 건조물을 포함하는, 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 포함하는 축사 악취 제거용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주, 상기 조성물, 또는 상기 미생물 제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체 분뇨의 악취 저감 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 KCCM12435P로 기탁된 바실러스 서브틸리스 CJBS303 (Bacillus subtilis CJBS303) 균주를 배양하는 단계; 및 회수된 균주를 첨가제와 혼합하는 단계;를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원은 일 양상으로 수탁번호 KCCM12435P로 기탁된 바실러스 서브틸리스 CJBS303 (Bacillus subtilis CJBS303) 균주를 제공한다.
상기 균주는 축산 분뇨 유래 악취의 저감 효과를 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 균주는 암모니아, 황화수소, 메틸머캅탄, 인돌, 페놀류, 휘발성지방산(VOCs)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 악취가스의 수준을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "축산 분뇨 유래 악취"는 "축산 분뇨로부터 유래하는 악취", 또는 "가축 분뇨로부터 유래하는 악취"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 악취는 가축 분뇨로부터 유래하는 악취가스로부터 발생하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 가축 분뇨의 처리 과정 중 혐기 발효에 의한 악취가스로부터 발생하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 한국 전통 장류인 된장, 고추장, 및 메주 등의 시료로부터 분리한 총 456종의 균주 중에서 암모니아 소모율이 가장 높은 CJBS303 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주에 대한 16s rDNA 염기서열 분석을 수행하여 서열번호 1의 염기 서열을 확인하였으며, 이는 바실러스 서브틸리스와 99% 상동성을 나타내는 것이었다. 따라서, 상기 균주를 바실러스 서브틸리스 CJBS303으로 명명하였고, 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 한국미생물보존센터에 2019년 2월 13일자로 기탁하고, 수탁번호 KCCM12435P를 부여받았다.
일 구현예에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주는 축산 분뇨로부터 유래하는 악취가스의 수준을 감소시킬 수 있다. 상기 악취가스는 암모니아; 황화수소; 메틸머캅탄; 인돌, 스카톨, p-크레졸 등의 인돌 및 페놀류; 및 프로피온산, 부티르산, 및 아세트산 등의 휘발성지방산 (VOCs) 등일 수 있고, 예를 들어, 암모니아, 황화수소, 메틸머캅탄, 인돌, 페놀류, 휘발성지방산으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 악취가스일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주의 첨가는 양돈 분변 슬러리 유래의 암모니아 수준을 감소시키고, 상기 균주의 급여 역시 분뇨 유래의 암모니아 및 황화수소 수준을 감소시킴을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 출원은 축산 분뇨 유래 악취의 저감 효과를 가지는 신규 균주를 제공할 수 있다.
본 출원은 다른 양상으로 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 또는 상기 농축물의 건조물을 포함하는, 조성물을 제공한다.
상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주는 상기한 바와 같다.
일 구현예에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주의 배양물은 미생물 배양 배지에 상기 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 미생물 배양방법 (예를 들어, 정치 배양, 교반 배양)에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 균주 배양물의 농축물, 및 이들의 건조물 역시 당업계에 공지된 미생물 또는 배양액의 처리, 농축 또는 건조 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주의 급여는 분뇨 유래의 암모니아 및 황화수소 수준을 감소시킴으로써, 축가 환경의 개선 및 가축의 생산성 향상에 기여할 수 있었다. 따라서, 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 또는 상기 농축물의 건조물은 조성물에 포함되어 사료 첨가제로 활용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있고, 필요에 따라, 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 조성물을 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
본 출원의 조성물은, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제, 동결보호제, 또는 부형제 등을 함유할 수 있다. 상기 동결보호제는, 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물에 포함되는 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주의 저하(deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 또한, 상기 동결보호제는 상기 조성물이 건조된 상태일 때 조성물에 포함되는 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주의 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 포유류, 및 가금 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 또는 애완 동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있다.
본 출원은 또 다른 양상으로 상기 조성물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 출원의 사료 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 조성물"은 동물에게 급여되는 먹이를 지칭한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명을 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는 필요한 영양성분을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 사료 조성물 내에 포함되는 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 또는 상기 농축물의 건조물을 포함하는 조성물의 함량은 적용 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예를 들어, 0.01 내지 1%(w/w), 0.01 내지 0.5 %(w/w), 또는 0.15 내지 0.5 %(w/w)로 사용될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본 출원의 사료 조성물은 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 조성물 전체의 중량을 기준으로, 1.0×107 내지 1.0×1011 cfu/kg의 함량으로 포함할 수 있다. 상기 균주의 함량은 1.0×107 내지 5.0×1010, 1.0×107 내지 1.0×1010, 1.0×107 내지 5.0×109, 1.0×107 내지 1.0×109, 1.0×107 내지 5.0×108, 1.0×107 내지 1.0×108, 1.0×107 내지 5.0×107, 1.0×108 내지 5.0×1010, 1.0×108 내지 1.0×1010, 1.0×108 내지 5.0×109, 1.0×108 내지 1.0×109, 1.0×108 내지 5.0×108, 1.0×109 내지 5.0×1010, 1.0×109 내지 1.0×1010, 또는 1.0×109 내지 5.0×109 cfu/kg일 수 있으나, 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라 적절하게 조절 가능하다.
본 출원의 사료 조성물은 투여를 위해서 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 본 출원의 사료 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 또한, 본 출원의 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.
본 출원의 사료 조성물은 가축사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏당 약 10 내지 500 g, 예를 들어, 10 내지 100 g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화 또는 압출 공정을 거칠 수 있다.
본 출원은 또 다른 양상으로 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 포함하는 축사 악취 제거용 미생물 제제를 제공한다.
일 실시예에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주의 급여는 분뇨 유래의 암모니아 및 황화수소 수준을 감소시킬 수 있었으며, 축사 내 암모니아, 황화수소, 메틸머캅탄, 휘발성 유기 화합물, 및 복합 악취를 유의적으로 감소시킬 수 있었다. 따라서, 본 출원의 균주는 축사 악취 제거를 위한 미생물 제제로 활용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본 출원의 미생물 제제는 암모니아, 황화수소, 메틸머캅탄, 휘발성지방산, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 악취가스의 수준을 감소시키는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본 출원의 미생물 제제는 당업계에 알려진 방법에 따라 제조된 고체 또는 액상의 형태일 수 있다. 본 출원의 미생물 제제가 예를 들어, 고체 형태인 경우, 상기 균주를 담체에 부착시킨 후, 미생물 제제 전체 중량을 기준으로, 수분 함량이 0.1 내지 10 중량%가 되도록 건조시키고 비드 (bead) 형태로 제품화하거나, 분쇄하여 분말 형태로 제품화할 수 있다. 상기 담체로는 분말상의 점토류, 활성탄, 코크스, 화산재 및 연소재로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상이 사용될 수 있으며, 상기 점토류로는 제올라이트, 질석, 규조토, 고령토, 옹기토, 장석, 차지토 및 활석으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 고체 형태의 미생물 제제에는 부형제가 추가될 수 있다. 상기 부형제의 경우 아미노산, 비타민C, 비타민E, 키토산 및 포도당을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물 제제가 예를 들어, 액체 형태인 경우, 상기 균주의 배양물을 혼합하고, 미생물을 안정화시키기 위해 포도당이나 글리세린을 혼합하여 제조될 수 있다. 미생물 제제 전체 중량을 기준으로, 배양물의 최종 농도가 5 내지 40 중량%가 되도록 제조할 수 있으며, 예를 들어, 최종 농도가 10 내지 20 중량%가 되도록 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 또 다른 양상으로 상기 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주, 상기 조성물, 또는 미생물 제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체 분뇨의 악취 저감 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개체"는 분뇨의 악취를 저감시키고자 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 비인간 동물일 수 있다. 예를 들어, 상기 비인간 동물은 포유류, 및 가금류를 포함할 수 있고, 상기 포유류는 돼지, 소, 양, 염소, 개, 고양이 등을 포함할 수 있고, 실험용 설치류 또는 애완 동물 등을 포함할 수 있고, 상기 가금류는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원은 또 다른 양상으로 KCCM12435P로 기탁된 바실러스 서브틸리스 CJBS303 (Bacillus subtilis CJBS303) 균주를 배양하는 단계; 및 회수된 균주를 첨가제와 혼합하는 단계;를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 균주의 배양은 당업계에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원일 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 알코올은 글리세롤 또는 에탄올일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.
상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철일 수 있다.
상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.
상기 미생물 제제를 제조하는 방법은 상기 균주를 배양하는 단계 이후에 상기 균주를 배양한 배양물로부터 상기 균주를 회수하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 균주의 회수는 당업계에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면, 상기 배양물을 원심분리 후 발생하는 침전을 회수하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 미생물 제제를 제조하는 방법에 있어서, 상기 첨가제는 동결보호제일 수 있고, 상기 회수된 균주를 첨가제와 혼합하는 단계 이후에, 수득된 혼합물을 동결 건조하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 동결 건조는 당업계에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 동결 건조하는 단계에서 수득한 동결 건조된 미생물 제제 내 균주는 생균 상태인 것일 수 있다. 또한, 상기 동결 건조된 미생물 제제는 제제 내에 포함된 상기 균주의 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 동결 보호제를 포함함으로써, 상기 생균 상태인 균주의 저하가 감소된 것일 수 있다.
상기 미생물 제제를 제조하는 방법에 있어서, 상기 미생물 제제는 미생물 제제 전체의 중량을 기준으로, 1.0×107 내지 1.0×1011 cfu/kg의 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 1.0×107 내지 5.0×1010, 1.0×107 내지 1.0×1010, 1.0×107 내지 5.0×109, 1.0×107 내지 1.0×109, 1.0×107 내지 5.0×108, 1.0×107 내지 1.0×108, 1.0×107 내지 5.0×107, 1.0×108 내지 5.0×1010, 1.0×108 내지 1.0×1010, 1.0×108 내지 5.0×109, 1.0×108 내지 1.0×109, 1.0×108 내지 5.0×108, 1.0×109 내지 5.0×1010, 1.0×109 내지 1.0×1010, 또는 1.0×109 내지 5.0×109 cfu/kg의 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 포함하는 것일 수 있으나, 적용하고자 하는 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라 적절하게 조절 가능하다.
본 출원에 따른 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주는 축산 분뇨 또는 축사로부터 유래하는 악취가스의 발생을 효과적으로 저감시킬 수 있다.
따라서, 상기 균주를 포함하는 조성물 및 미생물 제제는 악취 저감을 통한 축가 환경의 개선에 기여할 뿐만 아니라, 가축의 생산을 향상시킬 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 암모니아 소모능 평가 결과를 나타낸 것으로서, 암모니아의 소모 유무에 따른 배양액의 발색 반응을 육안으로 확인한 결과이다.
도 2는 암모니아 함유 배지에서 배양된 CJ109, CJ251, CJ268, 및 CJBS303 균주의 암모니아 소모율을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 3은 CJBS303 균주의 형태학적 특성을 전자 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 CJBS303 균주의 용혈성 여부를 육안으로 확인한 결과이다.
도 5는 CJBS303 균주의 첨가에 따른 양돈 분변 슬러리 유래의 암모니아 발생량 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 CJBS303 균주의 급여에 따른 분뇨 유래의 암모니아 및 황화수소 발생량 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 CJBS303 균주의 급여에 따른 돈사 내 악취가스 저감 효과를 나타낸 것으로서, 돈사 내 복합악취, 암모니아, 황화수소, 휘발성 지방산, 및 메틸머캅탄의 수준을 시간의 경과에 따라 확인한 결과이다.
도 8은 CJBS303 균주의 급여에 따른 돈사 내 악취가스 저감 효과를 검증하는 것으로서, 돈사 내 암모니아, 황화수소, 메틸머캅탄, 및 복합악취의 수준을 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 축산 분뇨 유래 악취의 저감 효과를 가지는 균주의 분리 및 동정
(1) 시료의 확보 및 균주의 분리
한국 전통 장류인 된장, 고추장, 및 메주 등의 시료를 확보하여, 상기 시료를 단계적으로 희석한 뒤, 이를 3% 염화나트륨이 첨가된 BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 24시간 배양하였다. 각 시료로부터 분리된 균주들은 콜로니에 따라 그룹화하여 분리하였다. 선별된 콜로니는 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리하였으며, 순수 분리되어 배양된 총 465종의 균주를 20% 글리세롤이 첨가된 배지에 담아 영하 70℃이하에서 보관하였다.
(2) 암모니아 소모능 평가에 따른 균주의 선발
악취의 주요 원인인 암모니아를 소모하는 균주를 선별하기 위하여 상기 균주들의 암모니아 소모능을 평가하였다. 암모니아 소모능은 암모니아의 산화물인 아질산과 발색반응을 하는 시약 (sulfanilic acid, N, N-Dimethyl-1-naphthylamine)을 사용하여 정성적인 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 암모니아가 첨가된 이온배지 (4.95g/L의 (NH4)2SO4, 8.82g/L의 K2HPO4, 1.1ml/L의 1M MgSO4 용액, 0.3ml/L의 1M CaCl2 용액, 0.5ml/L의 30mM FeSO4 용액, 0.04ml/L의 50mM CuSO4 용액, 0.7g/L의 NaH2PO4, 및 12ml/L의 5%(W/V) 무수 Na2CO3를 포함)를 제조한 후, 상기 제조된 10ml의 배지에 상기 균주들을 각각 0.01% 농도로 접종하고, 이를 30℃에서 14일간 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 원심분리하여 상등액을 1ml씩 각각 채취한 후, 여기에 상기 아질산과 발색반응을 하는 지시약을 100㎕씩 첨가하였다. 상기 지시약이 첨가된 배양 상등액을 25℃에서 10분간 반응시켜 발색 반응을 유도한 후, 이에 따른 배양액의 발색 여부를 관찰하였다. 한편, 이하의 실시예에서 표준균주로는 대한민국 공개특허 제10-2012-0088436호에서 공지된 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 사용하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 암모니아의 소모 또는 산화에 따라 아질산이 생성된 경우, 배양액은 짙은 자주색으로 발색되었으며, 이러한 발색 반응을 기준으로, 암모니아 소모능을 가지는 균주를 1차적으로 선별하였다. 그 결과, 시료로부터 분리된 총 456종의 균주 중 유의적인 암모니아 소모능을 가지는 4종의 균주, 구체적으로, CJ109, CJ251, CJ268, 및 CJBS303을 선발하였다.
또한, 1차적으로 선발된 상기 4종의 균주를 대상으로, 이들의 암모니아 소모량을 정량적으로 비교하였다. 구체적으로, 상기 균주를 BHI 액체 배지에 0.1%씩 접종한 후, 이를 37℃에서 200rpm에서 15시간 배양하여 균주를 활성화시켰다. 암모니아 함유 배지 (0.5g/L의 (NH4)2SO4, 13.5g/L의 NaH2PO4, 0.7g/L의 K2HPO4, 0.1g/L의 MgSO4ㆍ7H2O, 0.18g/L의 CaCl2ㆍ2H2O, 0.5g/L의 NaHCO3, 0.014g/L의 FeCl3ㆍ6H2O, 0.5g/L의 glucose를 포함)에 상기 활성화 균주를 1%씩 접종한 후, 이를 37℃에서 200rpm으로 6시간 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 원심분리하여, 이로부터 배양 상등액만을 회수하였다. 초기 배지 내 암모니아 함량과 회수된 배양 상등액에서 암모니아 잔여량을 정량하였고, 식 1에 따라 암모니아 소모율을 산출하였다.
[식 1]
암모니아 소모율 (%) = (A-B / A) Х 100
(A: 초기 암모니아 함량, B: 배양 종료 후 암모니아 함량)
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 1차적으로 선발된 4종의 균주 중에서 CJBS303 균주의 암모니아 소모율이 74.3%로 가장 높게 관찰되었다. 따라서, 암모니아 소모율이 가장 높은 CJBS303을 축산 분뇨 유래 악취의 저감 효과를 가지는 균주로 최종 선발하였다.
(3) 형태학적 및 생화학적 특성 분석
CJBS303 균주에 대한 형태학적 및 생화학적 특성 분석을 실시하였다. 구체적으로, 그람 염색법 및 전자 현미경 관찰을 통하여 균주의 형태학적 특성 분석을 실시하였으며, API 50 CHB system (biomerieux Vitek, Inc, 프랑스)을 통하여 균주의 당 발효 패턴을 확인함으로써, 균주의 생화학적 특성을 확인하였다.
그 결과, CJBS303 균주는 그람 양성 균주로서, 도 3에 나타낸 바와 같이, 간균임을 확인하였다. 또한, 표 1에 나타낸 바와 같이, CJBS303 균주는 바실러스 서브틸리스와 유사한 당 발효 패턴을 나타냄을 확인하였다.
시료 발효여부 시료 발효여부
Control - Esculine +
Glycerol + Salicine +
Erythritol - Cellobiose +
D-Arabinose - Maltose +
L-Arabinose - Lactose +
Ribose + Melibiose -
D-Xylose + Saccharose +
L-Xylose - Trehalose +
Adonitol - Inuline -
ß Methyl-xyloside - Melezitose -
Galactose - D-Raffinose +
D-Glucose + Amidon -
D-Fructose + Glycogene -
D-Mannose + Xylitol -
L-Sorbose - ß Gentiobiose -
Rhamnose - D-Turanose -
Dulcitol - D-Lyxose -
Inositol + D-Tagatose -
Mannitol + D-Fucose -
Sorbitol + L-Fucose -
α Methyl-D-mannoside - D-Arabitol -
α Methyl-glucoside + L-Arabitol -
N Acetyl glucosamine - Gluconate -
Amygdaline + 2 keto-gluconate -
Arbutine + 5 keto-gluconate -
(4) 균주의 동정
균주의 동정을 위하여 DNA 염기서열에 의한 분자계통분류학적 분석을 실시하였다. 이를 위하여, PCR premix (바이오니아, 대한민국), 유니버셜 프라이머 27F (5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'), 및 1492R(5' GGTTACCTTGTTACGACTT 3')을 사용하여 16s rDNA의 유전자를 증폭시켰다. 상기 유전자 증폭시, 총 반응액은 20㎕로 설정하였으며, 94℃ 1분, 56℃ 1분, 및 72℃ 1분의 조건으로 총 30회 반복하여 실시하였다. CJBS303 균주의 16s rDNA 염기서열은 서열번호 1과 같으며, 이는 바실러스 서브틸리스와 99% 상동성을 나타내는 것이었다. 이하의 실시예서는 상기 분리된 균주를 '바실러스 서브틸리스 CJBS303' 또는 'CJBS303 균주'로 명명하였다 (수탁번호 KCCM12435P).
실시예 2. CJBS303 균주의 안전성 평가
CJBS303 균주의 안전성을 확인하기 위하여, 균주의 용혈성을 평가하였다. 구체적으로, 혈액한천평판배지 (sheep blood 5%, ㈜한일코메드, 대한민국)에 CJBS303 균주를 선형 접종 (streaking)한 후, 이를 37℃에서 24시간 배양하였다. 이후, 상기 배양된 배지에서의 용혈 여부를 육안으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, CJBS303 균주는 용혈성을 나타내지 않았으며, 이를 통하여, 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주의 안전성을 확인하였다.
실시예 3. CJBS303 균주의 축산 분뇨의 악취 저감 효과 평가
(1) 분변 슬러리 내 악취가스 저감 효과
CJBS303 균주의 양돈 분변 슬러리 내 악취가스의 저감 효과를 표준 균주와 비교하고자 하였다. 구체적으로, CJBS303 균주를 TSB (trypticase soy broth) 배지에서 배양한 후, 400ml의 양돈 분뇨 슬러리에 1Х108 cfu/kg의 CJBS303 균주가 포함된 4ml의 용액을 첨가하고, 이를 120rpm, 39℃의 통성호기성 조건에서 총 48시간 진탕배양하였다. 배양한 시점으로부터 24시간, 및 48시간째, 총 2회에 걸쳐 암모니아 가스량을 휴대용 악취가스 측정기기 (MultiRAE)를 사용하여 측정하였다. 각 처리구 별 2회 측정된 가스량을 합산하여 암모니아의 총 발생량을 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CJBS303 균주는 무첨가된 대조구에 비해 암모니아 가스의 총 발생량이 41% 가량 감소되었으며, 이는 표준 균주에 비해 4배 이상 저감 효과가 있는 것이었다.
(2) 분뇨 유래 악취가스 저감 효과
양돈에 CJBS303 균주를 포함하는 생균제를 급여한 경우, 분뇨 유래 악취가스의 발생량에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 총 32두의 비육돈을 2개의 그룹으로 분류하여 사양시험을 진행하였다. 무첨가 사료를 급여한 군을 대조구로 설정하였으며, 1 pen당 4두씩 총 4 pen의 비육돈에게 대조구 사료를 5주 동안 급여하였다. 한편, 사료 내 1x109 cfu/kg의 CJBS303 균주가 포함된 사료를 급여한 군을 처리구로 설정하였으며, 1 pen당 4두씩 총 4 pen의 비육돈에게 5주 동안 상기 사료를 급여하였다. 급여 2주째부터 대조구 및 처리구로부터 유래하는 분뇨를 매주 샘플링하여 이로부터 발생한 악취가스를 측정하였다. 대조구 및 처리구로부터 각각 샘플링한 분뇨를 일정한 비율 (분변 600g + 12.5% 희석된 뇨 1.2L)로 섞은 후, 이를 Bottle에 300ml씩 소분하여 39℃, 통성호기성 조건에서 총 42시간 정치배양하였다. 배양한 시점으로부터 12시간, 18시간, 36시간, 및 42시간째, 총 4회에 걸쳐 발생된 가스, 즉, 황화수소 및 암모니아 가스량을 휴대용 악취가스 측정기기 (MultiRAE)를 사용하여 측정하였다. 분뇨배양 실험은 매주 분뇨의 샘플링을 실시할 때마다 진행하였으며, 5주째까지의 데이터를 평균화하여 대조구 대비 저감율을 계산하였다.
그 결과, 표 2 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 처리구는 급여 2주째부터 대조구에 비해 암모니아와 황화수소 가스의 농도가 낮게 관찰되었고, 5주째까지 발생한 가스의 농도를 평균화하여 비교했을 때, CJBS303 균주의 급여에 따른 악취가스 저감율이 암모니아는 38.3%, 황화수소는 88.9% 임을 확인하였다.
암모니아 (ppm) 황화수소 (ppm)
대조구 CJBS303 0.1% 대조구 CJBS303 0.1%
2주차 207 140 286 14
3주차 278 152 166 22
4주차 212 135 52 20
5주차 180 113 91 10
평균 219 135 149 16
대조구 대비 저감율 38.30% 88.90%
(3) 돈사 내 악취가스 저감 효과
양돈에 CJBS303 균주를 포함하는 생균제를 급여한 경우, 돈사 내 악취가스 의 발생량에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 총 96두의 74일령 비육돈을 2개의 그룹으로 분류하여 사양시험을 진행하였다. 무첨가 사료를 급여한 군을 대조구로 설정하였으며, 1 pen당 4두, 총 12pen의 육성돈에게 대조구 사료를 4주 동안 급여하였다. 한편, 사료 내 1x109 cfu/kg의 CJBS303 균주가 포함된 사료를 급여한 군을 처리구로 설정하였으며, 1 pen당 4두씩 총 12 pen의 육성돈에게 4주 동안 상기 사료를 급여하였다. 대조구와 처리구는 각각 독립된 돈사에서 사육하였으며, 기존에 남아있는 돈사 내 슬러리에 의한 영향을 배제하기 위하여 시험 개시 전에 대조구와 처리구 돈사의 슬러리를 동시에 비우고 본 시험을 진행하였다. 시험 개시 4일 전부터 매일 오전 9시와 오후 4시에 대조구 및 처리구의 돈사를 대상으로 돈사 내 가스를 측정하였다. 암모니아, 황화수소, 복합악취, 및 휘발성 지방산 (VOCs)은 정밀악취측정기기(Odor Catch, SLC-OP-1350, 과학기술분석센터)를 사용하여 측정하였고, 메틸머캅탄은 휴대용 악취가스 측정기기 (MultiRAE)를 사용하여 측정하였으며, 매일 측정된 데이터는 주 별로 이들의 평균값을 산출하였다.
그 결과, 표 3 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 모든 측정 항목에서 CJBS303 균주의 급여에 따른 악취가스 저감 효과가 관찰되었으며, 이러한 효과는 각각의 사료를 급여한 지 4주째에 보다 확연하게 드러났다. 특히, 처리구에서 황 계열의 악취가스인 황화수소와 메틸머캅탄은 50% 이상 (Duncan, p>0.01), 복합악취는 20% 이상의 저감율을 보였으며 (Duncan, p>0.05), 암모니아, 휘발성 지방산도 각각 17%, 20% 수준의 저감율을 나타내었다.
복합악취
(OU) 		암모니아
(ppm) 		황화수소
(ppm) 		VOCs
(ppm) 		메틸머캅탄
(ppm)
대조구 591a 7.7 0.88 a 2.13 1.6 a
CJBS303 456b 6.4 0.41 b 1.7 0.6 b
저감율(%) 22.80% 17.40% 53.70% 20.10% 60.30%
실시예 4. CJBS303 균주의 급여에 따른 양돈 생산성 평가
양돈에 CJBS303 균주를 포함하는 생균제를 급여한 경우, 양돈 생산성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 상기 실시예 3의 (3)과 동일한 조건으로, 총 96두의 74일령 비육돈을 2개의 그룹으로 분류하여 사양시험을 진행하였다. 사양시험 개시 전과 4주째 시험종료 후에 개체의 체중을 측정하여 일당 증체량 (average daily gain, ADG)을 산출하였고, 매일 사료급여량과 잔량을 측정하여 총 일당 사료 섭취량 (average daily feed intake, ADFI)과 사료효율 (feed conversion ratio, FCR)을 산출하였다.
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, CJBS303 균주를 급여한 처리구는 대조구에 비해 일당 사료 섭취량은 7.3% (Duncan, p<0.1), 일당 증체량은 9.0%(Duncan, p<0.03) 가량 개선되었으며, FCR 역시 0.03 가량 개선되었다. 이러한 실험결과는 CJBS303 균주의 급여는 악취가스의 발생량을 감소시킬 뿐만 아니라, 이로 인한 양돈 생산성에도 긍정적인 효과를 보임을 나타내는 것이다.
대조구 CJBS303
BW
(kg)		 개시 38.69 38.66
4주차 63.77 66.01
ADG (kg) 0.90b 0.98a
ADFI (kg) 2.35b 2.52a
FCR 2.62 2.59
실시예 5. CJBS303 균주의 급여에 따른 돈사 내 악취가스 저감 효과 검증 CJBS303 균주의 급여에 따른 돈사 내 악취가스 저감 효과에 대한 재현성을 확인하기 위하여 양돈장 2곳을 대상으로 급여 테스트를 진행하였다. 첫번째 농가 (A)는 육성돈사 (A-1)와 비육돈사 (A-2)로 선정하였고, 두번째 농가 (B)는 비육돈사로 선정하였으며, 각 농가별 시험대상 및 개체수는 표 5와 같다.
A-1 A-2 B
시험대상 육성돈 비육돈 비육돈
개체수 650두 800두 944두
상기 두 농가 모두 육성돈 또는 비육돈에 사료 내 2x109 cfu/kg의 CJBS303 균주를 포함하는 시험 사료를 3주간 급여하였으며, 시험사료 급여 전과 급여 3주째의 돈사 내 악취가스 농도를 측정하여 저감율을 계산하였다. 암모니아, 황화수소, 및 메틸머캅탄은 휴대용 악취측정기기 (MultiRAE)를 사용하여 측정하였고, 복합악취는 정밀악취측정기기 (Odor Catch, SLC-OP-1350, 과학기술분석센터)를 사용하여 오전 9시에 측정하였다.그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, CJBS303 균주를 급여한 처리구에서, 암모니아는 39% 이상, 황화수소는 26% 이상, 메틸머캅탄은 24% 이상, 복합악취는 21% 이상의 저감율을 보였다. 또한, 이러한 악취가스 저감 효과는 양돈의 성장단계인 육성구간, 또는 비육구간에 상관없이 급여 3주째부터 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12435P 20190213
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Claims (15)

  1. 수탁번호 KCCM12435P로 기탁된 바실러스 서브틸리스 CJBS303 (Bacillus subtilis CJBS303) 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 축산 분뇨 유래 악취의 저감 효과를 갖는 것인, 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 암모니아, 황화수소, 메틸머캅탄, 인돌, 페놀류, 휘발성지방산(VOCs)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 악취가스의 수준을 감소시키는 것인, 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주.
  4. 청구항 1의 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 또는 상기 농축물의 건조물을 포함하는, 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 동결보호제는, 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 조성물.
  7. 청구항 4의 조성물을 포함하는, 사료 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 조성물 전체의 중량을 기준으로, 1.0×107 내지 1.0×1011 cfu/kg의 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 포함하는, 사료 조성물.
  9. 청구항 1의 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 포함하는, 축사 악취 제거용 미생물 제제.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 미생물 제제는 암모니아, 황화수소, 메틸머캅탄, 인돌, 페놀류, 휘발성지방산(VOCs)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 악취가스의 수준을 감소시키는 것인, 미생물 제제.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 하나의 균주, 조성물, 또는 미생물 제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체 분뇨의 악취 저감 방법으로, 상기 개체는 비인간 동물인 방법.
  12. KCCM12435P로 기탁된 바실러스 서브틸리스 CJBS303 (Bacillus subtilis CJBS303) 균주를 배양하는 단계; 및
    회수된 균주를 첨가제와 혼합하는 단계;를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 첨가제는 동결보호제이고, 상기 혼합 단계 이후 수득된 혼합물을 동결 건조하는 단계를 추가로 포함하는, 미생물 제제를 제조하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 동결 건조하는 단계에서 수득한 동결 건조된 미생물 제제 내 균주는 생균 상태인, 미생물 제제를 제조하는 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 미생물 제제는 미생물 제제 전체의 중량을 기준으로, 1.0×107 내지 1.0×1011 cfu/kg의 바실러스 서브틸리스 CJBS303 균주를 포함하는 것인, 미생물 제제를 제조하는 방법.
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