KR20220055664A

KR20220055664A - 악취 제거 또는 저감 효과를 나타내는 바실러스 벨레젠시스 l001 균주, 이를 포함하는 악취 제거 또는 저감용 조성물 및 이를 이용하여 악취를 제거 또는 저감하는 방법

Info

Publication number: KR20220055664A
Application number: KR1020200139987A
Authority: KR
Inventors: 임성일; 박소림
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2022-05-04
Also published as: KR102430375B1

Abstract

본 발명은 악취 제거 또는 저감 효과를 나타내는 바실러스 벨레젠시스 L001 균주, 이를 포함하는 악취 제거 또는 저감용 조성물 및 이를 이용하여 악취를 제거 또는 저감하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 L001 균주는 악취, 암모니아 및 황화수소 제거 효과가 우수하다. 또한, 기존의 균주들이 암모니아 또는 황화수소 둘 중의 하나에 대해 제거 또는 저감 효과를 갖는데 반해, 본 발명의 균주는 암모니아 및 황화수소 양자에 대해 제거 또는 저감 효과를 갖는 것이므로 산업적으로 매우 유용하다. 따라서, 본 발명의 균주를 축산 분뇨 및/또는 축산 분뇨를 이용한 비료에 처리하면 화학적인 처리에 비해 인체, 식물 또는 동물에 안전하고, 경제적인 악취 제거 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 악취 제거 또는 저감용 조성물은 보존성이 높아 산업적으로 매우 유용하다.

Description

악취 제거 또는 저감 효과를 나타내는 바실러스 벨레젠시스 L001 균주, 이를 포함하는 악취 제거 또는 저감용 조성물 및 이를 이용하여 악취를 제거 또는 저감하는 방법{Bacillus velezensis L001 strain having odor removal actibity, Composition for removing or reducing odor comprising the same, and Method for removing or reducing odor using the same}

본 발명은 악취 제거 또는 저감 효과를 나타내는 바실러스 벨레젠시스 L001 균주, 이를 포함하는 악취 제거 또는 저감용 조성물 및 이를 이용하여 악취를 제거 또는 저감하는 방법에 관한 것이다.

최근 축산 농가에서 발생되고 있는 악취는 환경오염은 물론, 주변 마을의 민원 발생률 증가, 및 질병 발생의 원인으로서, 사회적으로 큰 문제가 되고 있다. 축산 농가에서 발생하는 악취의 주원인으로는 가축의 분뇨 생산과 이를 저장 및 처리하는 과정에서의 혐기 발효에 의해 발생된 가스가 있다. 이에, 환경부와 대한한돈협회에서는 암모니아, 황화수소 등을 포함한 12개의 악취물질을 지정하였고, 2010년에는 최종 22개의 지정 악취 물질 및 배출 허용 기준을 제정하였다. 또한, 대한한돈협회에서는 2015~2016년 2년간 133농가를 분석한 결과를 근거로 하여, 축산농가의 악취 관리 기준을 제시한 바 있으며, 이들 중 하나로, 농장 내부의 복합악취 희석배수를 1000배 이하로 관리할 것을 요구하고 있다. 여기서, 복합악취라 함은 두 가지 이상의 악취물질이 복합적으로 존재하면서 사람의 후각을 자극하여 불쾌감과 혐오감을 주는 냄새를 일컫는다.

돈사 내 대표적인 유해 가스이자 악취물질 중 하나인 암모니아 (NH₃)는 자극성이 있는 무색의 유동성 가스로서, 비교적 낮은 농도에서도 이를 감지할 수 있다. 암모니아는 아미노산이 탈아미노화하는 과정에서 생성하는 것으로 알려져 있으며, 또 다른 암모니아 발생원으로는 요소와 질산이 있다. 암모니아 가스는 습한 체조직을 자극하여, 작업자의 눈을 따갑게 하고 돼지의 눈을 충혈시킨다. 돈사 내 암모니아 농도에 따른 돼지 생산성 영향에 대한 연구 자료에 따르면, 암모니아가 50ppm 이상일 경우 자돈 구간에서 약 12%의 성장 지체가 일어나며, 100~150ppm에서는 돼지의 30%가 성장 저해, 호흡기 질환 증상을 보인다.

또 다른 주요 악취가스로는 황화수소(H₂S)가 있으며, 이는 황산염의 환원과정 및 황을 함유한 아미노산의 대사과정에서 생성된다. 황화수소는 유독성 가스이며, 공기보다 무거워 돈사의 슬러리 표면에 깔려있는 것으로 알려져 있으며, 작업자의 두통, 어지러움, 메스꺼움 등을 유발하고, 돼지의 경우 식욕저하, 호흡기 질병 등을 유발시킨다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 축산 농가에서 발생하는 악취를 저감시키기 위하여 예의 노력한 결과, 축산 분뇨로부터 유래하는 암모니아, 황화수소 등의 악취가스를 현격하게 저감시킬 수 있는 바실러스 속 균주를 분리 및 동정하였고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2019-0006594 A

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 악취 제거 또는 저감 효과가 우수한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주, 이를 포함하는 악취 제거 또는 저감용 조성물 및 이를 이용하여 악취를 제거 또는 저감하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 악취 제거 또는 저감 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주 (수탁번호: KFCC11869P)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주 (수탁번호: KFCC11869P) 또는 이의 배양액을 포함하는, 악취 제거 또는 저감용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 축산 분뇨에 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨로부터 악취가 제거 또는 저감된 비료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 축산 분뇨를 이용한 비료에 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨를 이용한 비료의 악취를 제거 또는 저감하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 축산 분뇨에 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨의 악취를 제거 또는 저감하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주는 악취, 암모니아 및 황화수소 제거 효과가 우수하다. 또한, 기존의 균주들이 암모니아 또는 황화수소 둘 중의 하나에 대해 제거 또는 저감 효과를 갖는데 반해, 본 발명의 균주는 암모니아 및 황화수소 양자에 대해 제거 또는 저감 효과를 갖는 것이므로 산업적으로 매우 유용하다. 따라서, 본 발명의 균주를 축산 분뇨 및/또는 축산 분뇨를 이용한 비료에 처리하면 화학적인 처리에 비해 인체, 식물 또는 동물에 안전하고, 경제적인 악취 제거 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 악취 제거 또는 저감용 조성물은 보존성이 높아 산업적으로 매우 유용하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 배지에서의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주의 성장곡선을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 악취 제거 또는 저감 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주 (수탁번호: KFCC11869P)를 제공한다.

본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주는 전통장류로부터 분리하였고, 분리된 균주가 암모니아 및 황화수소 가스 저감 능력이 뛰어나며, 16S rRNA를 분석한 결과 바실러스 벨레젠시스 균주로 확인되어, 상기 균주를 한국미생물보존센터에 2020년 10월 13일자로 기탁하였다(수탁번호: KFCC11869P).

상기 바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 분리 및 증식은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명에서, 상기 바실러스 벨레젠시스 L001 균주는 가축 사육시 발생하는 폐수나 분뇨의 악취 또는 음식물 부패 시에 발생하는 악취, 특히 암모니아 및 황화수소 성분에 대해 강력한 감소 효과를 나타내는 유용 미생물이다.

상기 암모니아 성분은 암모니아성 질소로서 질소 화합물 중 암모니아 또는 암모늄염으로 존재하는 질소이며, 단백질이 분해될 때나 가축의 배설물 또는 가축의 배설물이 비료화되는 과정에서 생성되는 악취의 주된 원인 중 하나이다. 암모니아성 질소가 수질에 흘러 들어갈 경우에는 어패류의 집단 폐사의 원인이 되기도 하며 물의 오염지표로 사용된다. 또한 가축의 면역력을 약화시켜 질병의 발생율을 높이고 가축의 성장을 저하시키는 작용을 한다. 상기 황화수소 성분은 수소의 황화물로 악취를 가진 무색의 유독한 기체이며, 석유정제, 석유화학, 약품제조, 분뇨처리장 등에서 많이 발생하고 있으며, 폭발성이 있는 기체이다. 인체에 미치는 영향을 보면 질식작용, 신경계장애, 호흡 또는 중추마비 등을 일으키고, 두통, 구토, 현기증, 소화기장애, 저혈압증, 보행장애 등을 일으키기도 한다.

본 발명의 바실러스 벨레젠시스 L001 균주는 특별히 제한되지는 않으나, 암모니아 및 황화수소 성분이 다량 함유된 축산 분뇨 유래의 악취에 더욱 효과적이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "축산 분뇨 유래 악취"는 "축산 분뇨로부터 유래하는 악취", "가축 분뇨로부터 유래하는 악취" 또는 "축산 분뇨를 이용한 비료의 악취"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 악취는 가축 분뇨로부터 유래하는 악취가스로부터 발생하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 가축 분뇨의 처리 과정 중 혐기 발효에 의한 악취가스로부터 발생하는 것일 수 있다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "축산 분뇨를 이용한 비료"는 "축산 분뇨의 발효액", "축산 분뇨의 액비", "축산 분뇨의 발효액비", "축산 분뇨를 이용한 퇴비" 또는 "축산 분뇨의 발효비료"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 비료는 가축 분뇨를 발효하여 제조되는 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 배양액으로 처리한 돼지 분뇨의 악취, 암모니아 및 황화수소 수준이 현저히 감소한 것을 확인하였다.

상기 악취 제거 또는 저감용 조성물에서 용어, "바실러스 벨레젠시스 L001 균주", "악취"에 대한 내용은 전술한 바와 같다.

상기 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 또는 이의 배양액은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 2 중량%로 포함될 수 있다. 즉, 상기 악취 제거 또는 저감용 조성물은 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 또는 이의 배양액 자체이거나, 상기 균주 또는 이의 배양액을 다른 부재료 및/또는 첨가물과 혼합하여 제조된 것, 또는 다른 부재료 및/또는 첨가물과 혼합한 후 발효하여 제조된 것일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 배양액은 미생물 배양 배지에 상기 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 미생물 배양방법 (예를 들어, 정치 배양, 교반 배양)에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양액의 제조를 위해, 상기 배양은 24 내지 38 ℃, 바람직하게는 30 내지 38 ℃, 더욱 바람직하게는 32 내지 38 ℃에서 6 내지 36 시간 동안 호기 조건에서 액체배양하는 것일 수 있다.

상기 배양액은 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 6.0 내지 11.0 log cfu/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 7.0 내지 11.0 log cfu/mL, 더욱 바람직하게는 8.0 내지 10.0 log cfu/mL로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 악취 제거 또는 저감용 조성물은 미생물 제제일 수 있고, 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 상기 고체 형태의 미생물 제제의 경우 상기 미생물을 비드 (bead) 형태로 제품화하거나, 분쇄하여 분말 형태로 제품화할 수 있다. 고체 형태로 미생물 제제를 사용하는 경우에는 제조공정이 단순하고 제품 생산비가 낮으며 보존성이 좋다는 장점이 있다. 특히, 본 발명의 고체 형태의 미생물 제제는 다른 고체 형태의 미생물 제제와 같이 수분 함량이 10 중량% 이하가 되도록 건조시키는 공정을 수행하지 않아도 저장기간 동안 균수가 일정 수준 이하로 감소하거나 재활성화 효율이 떨어지거나 악취 제거 효과가 감소하지 않는다. 다만, 상기 미생물 제제는 제조 후 90일 이내, 바람직하게는 60일 이내, 더욱 바람직하게는 45일 이내, 더욱 바람직하게는 30일 이내에 사용하는 것이 바람직하다.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 미강 100 중량부에 대하여 물 30 내지 60 중량부를 포함하는 발효원에 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 배양액을 0.1 내지 5 중량부로 접종한 후 발효시켜 제조된 고체 형태의 미생물 제제일 수 있다.

상기 조성물에서, 상기 발효원은 상기 발효원은 미강 100 중량부에 대하여 당밀 0.1 내지 5 중량부 및 효모추출물 0.01 내지 2 중량부를 더 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 조성물은 물을 미강 100 중량부에 대하여 30 내지 60 중량부, 바람직하게는 40 내지 60 중량부, 더욱 바람직하게는 40 내지 55 중량부, 더욱 바람직하게는 45 내지 55 중량부, 더욱 바람직하게는 48 내지 52 중량부로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 당밀을 미강 100 중량부에 대하여 0.1 내지 5 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 3 중량부, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 2 중량부, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 1.5 중량부로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 효모추출물을 0.01 내지 2 중량부, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량부, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량부, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 0.3 중량부로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 상기 균주 배양액을 미강 100 중량부에 대하여 0.1 내지 5 중량부, 바람직하게는 0.5 내지 3 중량부, 더욱 바람직하게는 1 내지 2 중량부로 포함할 수 있다.

상기 고체 형태의 미생물 제제의 제조를 위해, 상기 발효는 24 내지 38 ℃, 바람직하게는 24 내지 32 ℃, 더욱 바람직하게는 24 내지 28 ℃, 더욱 바람직하게는 24 내지 26 ℃에서 1 내지 6일 동안 호기 조건에서 고상발효시키는 것일 수 있다.

상기 조성물은 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 6.0 내지 11.0 log cfu/mL로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 7.0 내지 11.0 log cfu/mL, 더욱 바람직하게는 7.0 내지 10.0 log cfu/mL로 포함하는 것일 수 있다.

상기 고체 형태의 악취 제거 또는 저감용 조성물은 제조 직후부터 보관 30일까지 바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 균수를 6.0 log cfu/mL 이상, 바람직하게는 7.0 log cfu/mL 이상으로 유지할 수 있어, 보존성이 높다.

상기 보관은 실온 또는 1 내지 5 ℃의 저온에서 보관하거나 수분함량 10% 이하로 건조한 후 실온에서 보관할 수 있고, 실온보관하는 것이 바람직하다.

상기 고체 형태의 악취 제거 또는 저감용 조성물은 악취 제거를 위해 축산 분뇨 또는 이를 이용한 비료에 직접 첨가하여 이용하거나, 악취 제거를 위해 축산 분뇨 또는 이를 이용한 비료에 첨가되는 액체 형태의 미생물 제제를 현장에서 직접 제조하기 위한 종균으로 이용될 수 있으며, 보관이 용이하고 취급이 편리한 장점이 있다.

일 실시예에서, 상기 고체 형태의 악취 제거 또는 저감용 조성물을 종균으로 이용하여 액체 형태의 악취 제거 또는 저감용 조성물을 제조한 후 이를 축산 분뇨 또는 이를 이용한 비료에 첨가하여 이용할 수 있다.

상기 액체 형태의 악취 제거 또는 저감용 조성물은 1% 당밀 100 중량부로 이루어진 배지에 상기 고체 형태의 악취 제거 또는 저감용 조성물 0.5 내지 2 중량부, 바람직하게는 1 중량부를 접종하여 24 내지 38 ℃, 바람직하게는 30 내지 38 ℃, 더욱 바람직하게는 32 내지 38 ℃에서 100 내지 300 rpm, 바람직하게는 150 rpm 또는 폭기를 통해 호기 조건에서 6 내지 36 시간 동안, 바람직하게는 18시간 배양하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 악취 제거 또는 저감용 조성물을 축산 분뇨에 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨로부터 악취가 제거 또는 저감된 비료를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서 용어, "바실러스 벨레젠시스 L001 균주", "악취", "악취 제거 또는 저감용 조성물"에 대한 내용은 전술한 바와 같다.

일 구현예에 있어서, 상기 비료 제조 방법은 (1) 축산 분뇨를 수집한 후 고형분을 제거하는 단계; (2) 상기 고형분이 제거된 축산 분뇨에 상기 악취 제거 또는 저감용 조성물을 혼합하는 단계; 및 (3) 상기 혼합물을 발효시키는 단계;를 포함하여 이루어진 것일 수 있다.

상기 발효는 20 내지 32 ℃, 바람직하게는, 22 내지 32 ℃, 더욱 바람직하게는 24 내지 32 ℃에서 3일 내지 15일, 바람직하게는 4일 내지 12일, 더욱 바람직하게는 6일 내지 10일 동안 호기 조건에서 발효시키는 것일 수 있다.

상기 방법에 따라 제조되는 비료는 상기 방법을 적용하지 않고 제조되는 비료에 비해 축산 분뇨 유래의 악취, 암모니아, 황화수소의 수준이 현저히 제거 또는 저감된 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되어, 악취가 제거 또는 저감된 비료를 제공한다.

상기에서 용어, "바실러스 벨레젠시스 L001 균주", "악취", "악취 제거 또는 저감용 조성물", "비료"에 대한 내용은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명은 상기 악취 제거 또는 저감용 조성물을 축산 분뇨를 이용한 비료에 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨를 이용한 비료의 악취를 제거 또는 저감하는 방법을 제공한다.

일 구현예에 있어서, 상기 축산 분뇨를 이용한 비료의 악취를 제거 또는 저감하는 방법은 (1) 축산 분뇨를 이용한 비료에 상기 악취 제거 또는 저감용 조성물을 혼합하는 단계; (2) 혼합물을 발효시키는 단계;를 포함하여 이루어진 것일 수 있다.

축산 분뇨를 이용한 비료는 기본적으로 축산 분뇨를 이용하여 제조된 것이기 때문에 악취가 강하다. 상기 방법에 따른 비료는 상기 방법을 적용하지 않은 비료에 비해 축산 분뇨 유래의 악취, 암모니아, 황화수소의 수준이 현저히 제거 또는 저감된다.

또한, 본 발명은 상기 악취 제거 또는 저감용 조성물을 축산 분뇨에 살포 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨의 악취를 제거 또는 저감하는 방법을 제공한다.

일 구현예에 있어서, 상기 축산 분뇨의 악취를 제거 또는 저감하는 방법은 (1) 축산 분뇨에 상기 악취 제거 또는 저감용 조성물을 살포 또는 혼합하는 단계; (2) 혼합물을 발효시키는 단계;를 포함하여 이루어진 것일 수 있다.

상기 방법을 이용하는 경우 2차 오염 없이 악취를 감소시킬 수 있으므로 토양 개량 및 환경 개선의 효과가 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 및 비교예>

실시예 : 균주의 분리 및 동정

1-1: 전통발효식품으로부터 균주 수집 및 분리

각 지역 업체로부터 전통청국장 10종을 구입하였다.

상기 구입한 여러 종류의 전통청국장들로부터 균주를 수집하고 분리하기 위하여, 영양분이 풍부한 액체 배지로 리치 미디어(rich media)인 TSB(trytic soy broth, BD Difco, Sparks, MD, USA)를 기반으로 agar배지를 제작하였으며, 해당 배지의 매뉴얼에 소개되어 있는 비율을 유지하여 진행하였다.

상기 TSB 고체배지(TSA)에 전통청국장 시료를 희석한 희석액을 문지른 후, 37 ℃에서 24시간동안 배양한 다음, 각기 다른 모양의 콜로니를 선발하여 순수 분리하였다.

순수분리를 위해, TSA에 스트리킹(streaking)하여 해당 콜로니를 분리한 후, TSA 사면배지(triptic soy agar slant)에 접종하여 37 ℃에서 18 시간동안 배양한 다음, 분리된 균주들을 보관하였다. 그 결과 약 300종의 균주를 1차적으로 선별하였다.

1-2: 축산 분뇨에서 잘 성장하는 균주의 선별

먼저, 돼지 분뇨와 동일량의 멸균수를 혼합하였다. 이 혼합물을 5리터 발효기에 넣고 150rpm 교반 하에 95% 산소를 공급하면서 35℃에서 5일간 배양하여 분뇨시료를 제조하였다.

상기 분뇨 시료를 이용하여 한천 1.5중량%가 포함된 분뇨 배지를 제조하고, 이 한천 분뇨 배지에서 상기 1차 미생물을 배양하여 상기 분뇨 배지에서 잘 성장하는 미생물을 2차 미생물로 선발하였다.

1-3: 악취 제거 또는 저감 활성이 있는 균주 선별

악취 제거 또는 저감 용도로 적합한 균주를 선별하기 위해 상기 2차 선별된 균주들 중에서 암모니아 및 황화수소 제거능이 있는 균주를 선별하고자 하였다.

상기 2차 미생물에 대한 악취저감 효능을 평가하기 위하여 1L 시약병에 50g의 돼지액비를 넣고 상기 2차 미생물의 배양액을 돼지액비 중량대비 1%인 0.5mL를 투입하여 8일간 100rpm의 속도로 스터링(stirring)시켰다. 악취측정은 돼지액비 시약병을 밀폐하여 1분간 300rpm으로 스터링함으로써 냄새를 포집한 다음 다중가스분석기인 Portable Composite Gas Detector, GT-1000-BJM4 [측정범위 : ODOR(종합적 냄새) 0-1000ppm, NH3(암모니아) 0-100ppm, H2S(황화수소) 0-100ppm]로 24시간 마다 황화수소와 암모니아의 발생량을 측정하였다.

상기 2차 미생물 중에서 황화수소와 암모니아의 제거능이 가장 우수한 L001 균주를 본 발명의 악취 제거 또는 저감을 위한 균주로 최종 선별하였다.

1-4: 선별한 균주의 분자생물학적 동정

실시예 1-3에서 선별한 L001 균주의 분자생물학적 특징을 조사하기 위해 균주로부터 염색체 DNA를 분리한 후, 상기 염색체 DNA는 미생물 동정을 위하여 16s rRNA gene의 전체 염기서열 분석을 수행하였다. 상기 동정한 균주는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)에 속하는 균주인 것으로 조사되었고, 상기 동정한 균주의 염기서열(16s rRNA 서열)을 서열번호 1에 나타내었다.

본 발명자들은 상기 균주를 2020년 10월 13일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 하기와 같은 수탁번호를 부여받았다.

바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) - 수탁번호 KFCC11869P(일명 "L001"라고 명명함)

시험예 1: 균주의 효소 활성

바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 대상으로 효소 활성을 특정하기 위해 TSB 배양액의 13,000rpm 원심분리 상등액을 효소액으로 사용하였으며 특이적으로 반응할 기질성분과 반응시켰다.

상기 균주를 TSB에 접종하여 37℃, 200rpm으로 18시간 진탕 배양하여 균주 배양액을 제조하였다.

프로테아제 활성은, 효소액 50㎕을 기질(1% casein + 50mM Tris-HCl buffer pH 8.0) 450 ㎕와 30℃ 에서 30분 반응시킨 후 5% TCA를 750㎕ 혼합 후 30분 실온에서 반응시켜 효소반응을 중지시킨 다음, 10,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 Spectrophotometer를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하였다.

탄수화물 가수분해 효소인 아밀라제, 셀룰라제, 아라비나나아제, 자일라나아제 활성측정은 기질인 soluble starch(2%), CM-cellulose(2%), arabinan(2%), beechwood xylan(1%)를 각각 125㎕씩에 효소액 250 ㎕, 200 mM sodium phosphate buffer pH 7 125 ㎕와 혼합하여 37℃에서 1시간 반응시켜 DNS방법으로 흡광도 555 nm에서 측정하였다.

상기 측정한 효소활성을 하기 표 1에 나타내었다. 본 발명의 균주의 효소 활성에 대한 비교예로 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 효소 활성을 함께 나타내었다.

구분	효소활성 단위 Unit (μmole/min·㎖)
구분	프로테아제	아밀라아제	셀룰라제	아라비나나아제	자일라나제
B. velezensis	1.00	0.91	0.21	0.06	0.74
B. amyloliquefaciens	3.41	6.60	0.04	0.05	0.59

시험예 2: 최적 배양 조건

바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 산업용 저가 배지에서의 최적 배양조건을 알아보고자 하였다.

2-1: 액체 배양 조건

최적 배지를 선정하기 위해 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 당밀, 효모추출물, 및 소이펩톤의 조성을 달리한 배지에 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 접종한 후 200 rpm으로 교반하면서 37 ℃에서 1일 동안 배양하였으며, 상기 배양액 내 포함되어 있는 바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 균체량을 OD 600nm에서 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.

구분	중량부
구분	M1	M2	M3	M4	M5	M6	M7	M8	M9	M10	M11	M12	M13
1% 당밀	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
효모추출물	-	0.1	0.1	0.1	0.1	0.25	0.25	0.25	0.25	0.5	0.5	0.5	0.5
소이펩톤	-	-	0.1	0.25	0.5	-	0.1	0.25	0.5	-	0.1	0.25	0.5
TSB 배양액	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

구분	OD 600nm
구분	M1	M2	M3	M4	M5	M6	M7	M8	M9	M10	M11	M12	M13
배양 0일	0.23	0.23	0.24	0.24	0.25	0.24	0.24	0.25	0.26	0.24	0.25	0.25	0.26
배양 1일	0.74	0.41	0.48	0.44	0.41	0.54	0.43	0.42	0.44	0.40	0.44	0.49	0.48

상기 표 3을 살펴보면, 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 M1 배지(1% 당밀 100 중량부에 대하여 TSB 배양액 1 중량부를 포함함)에서 배양한 경우 가장 높은 OD 값(0.74)이 측정되어, M1 배지가 산업용으로 최적 배지 조성인 것을 확인할 수 있다.

한편, 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 상기 M1 배지에서 접종한 후 37 ℃에서 배양하면서 성장곡선을 확인한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 18 시간 배양시 균수(10.4 log cfu/mL) 및 OD 600nm값이 최대인 것으로 나타났다.

즉, 바실러스 벨레젠시스 L001 균주는 효모추출물 1% 당밀 100 중량부를 포함하는 배지에 접종한 후 37 ℃에서 18 시간 동안 배양하는 것이 산업적으로 최적의 배양 조건인 것을 알 수 있다.

2-2: 고체 배양 조건

바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 사용편의성을 높이기 위해서는 제형화가 필요하다. 따라서 상기 균주의 제형화를 위한 최적 고상발효 조건을 알아보고자 하였다.

최적 배지를 선정하기 위해 하기 표 4 내지 표 7에 나타낸 바와 같이 121 ℃에서 60분간 고압살균한 미강을 배지로 하여 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃의 온도에서 6일 동안 고상발효하면서 최적의 가수 및 온도 조건을 알아보았다.

구분	L1	L2	L3
미강 (kg)	1	1	1
물 (L)	0.35	0.425	0.5
당밀 (g)	3	3	3
배양액 (mL)	10	10	10

구분	균수 (log cfu/g)
구분	L1	L2	L3
25℃	7.97	8.19	8.19
30℃	7.76	7.94	7.60
35℃	7.64	7.75	5.88

상기 표 5를 살펴보면, 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 가수량이 미강 중량 대비 42.5%~50.0%인 L2 또는 L3 배지에 접종한 후 25 ℃에서 배양한 경우 가장 높은 균수가 측정되었다.

한편, 바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 최적 배지 조건을 설정하기 위해 하기 표 6과 같은 다양한 첨가물을 함유하는 배지에 균주를 접종한 후 25 ℃에서 6일 동안 배양하면서 매 3일 마다 바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 균수를 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.

구분	N1	N2	N3	N4
미강	1kg	1kg	1kg	1kg
물	0.5L	0.5L	0.5L	0.5L
당밀	3g	3g	3g	3g
효모추출물	-	2.5g	-	2.5g
소이펩톤	-	-	2.5g	2.5g
배양액	15mL	15mL	15mL	15mL

구분	균수 (log cfu/g)
구분	N1	N2	N3	N4
3일 배양	7.7	8.5	8.2	6.8
6일 배양	7.0	8.5	8.5	7.0

상기 표 7을 살펴보면, 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 N2 배지(효모추출물을 2.5 g 첨가한 미강 배지)에 접종한 후 25 ℃에서 3일간 배양한 경우 가장 높은 균수가 측정되었다.

실시예 2: 악취 제거 또는 저감용 조성물의 제조

고상발효를 위해 접종할 균주는 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 TSB 배지에 접종한 후 200 rpm으로 교반하면서 37 ℃에서 1일 동안 배양하였으며, 이때 배양액 내 균수는 8.5 log cfu/mL이었다.

이후, 미강을 121 ℃에서 60분간 고압살균하였다.

상기 고압살균한 미강 1 kg, 물 0.5 L, 당밀 3 g, 효모추출물 2.5 g 및 상기 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 배양액 15 mL를 혼합한 후 펠렛을 제조한 다음 25 ℃에서 3일 동안 고상발효하여, 악취 제거 또는 저감용 조성물(고체 상태의 미생물 제제)을 제조하였다.

시험예 3: 실시예 2의 조성물의 저장기간별 균수

상기 실시예 2의 조성물을 세 가지 조건(실온보관, 4 ℃에서 보관, 또는 수분함량 10 % 이하로 건조한 후 실온보관)에서 30일 동안 보관하면서 매 10일마다 균수를 측정한 후 하기 표 8에 나타내었다.

구분	균수 (log cfu/mL)
구분	실온보관	4℃ 보관	건조 후 실온보관
저장 0일	7.35	7.35	7.42
저장 10일	9.27	7.16	7.87
저장 20일	9.46	7.14	7.40
저장 30일	7.62	7.36	7.30

상기 표 8을 살펴보면, 본 발명의 악취 제거 또는 저감용 조성물은 4 ℃에서 저온 보관하거나, 수분함량 10% 이하로 건조한 후 실온보관하는 경우에는 균수에서 큰 차이가 나타나지 않았으며, 오히려 실온보관하는 경우 가장 높은 균수를 나타내므로, 보존성(또는 유통편의성)이 매우 높다는 것을 알 수 있다.

또한, 보관 30일까지는 어떠한 조건에서 보관하더라도 균수가 7.0 log cfu/mL 이상을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4: 축산 분뇨에 대한 악취 저감 효과

본 발명의 실시예에 따른 균주가 축산 분뇨에 대하여 악취 제거 또는 저감 효과가 있는지를 확인하고자 다중가스분석기(Portable Composite Gas Detector, GT-1000-BJM4)[측정범위 : ODOR(종합적인 냄새) 0-1000 ppm, 암모니아 0-100 ppm, 황화수소 0-100 ppm]를 이용하여 악취, 암모니아 및 황화수소 감소율을 측정하였다.

돼지 분뇨의 악취 저감 효과를 측정하기 위한 균주 배양액의 제조는 바실러스 벨레젠시스 L001 균주와 바실러스 아밀로리쿼파시엔스를 각각 TSB 배지에 접종한 후 200 rpm으로 교반하면서 37 ℃에서 18시간 동안 배양하였으며 이때 균수는 각각 9.47 log cfu/mL, 8.60 log cfu/mL이었다.

먼저, 돈사에서 배출된 돼지 분뇨를 원심분리하여 고형분을 제거한 액상 시료를 돼지액비 처리장에서 채취하여 실험에 이용하였다. 상기 돼지 분뇨 시료에 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 배양액 1 중량%를 혼합한 후 실온에서 7일 동안 처리시켰으며 악취, 암모니아 또는 황화수소 측정 시 300 rpm으로 1분간 각 성분을 포집한 후 상기 다중가스분석기를 이용하여 2일 간격으로 측정하여 하기 표 9 내지 11에 나타내었다.

구분	악취 (ppm)					감소율(%)
구분	1일	3일	5일	7일	총계	감소율(%)
대조군	256	360	160	140	916.0	0
B. velezensis	129	270	120	95	614.0	33.0
B. amyloliquefaciens	220	350	151	133	854.0	6.8

상기 표 9를 살펴보면, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 이용하여 처리된 돼지 분뇨는 대조군에 비해 악취가 33.0% 감소한 것을 확인하였다. 반면, 비교예인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스는 악취 수준을 6.8% 감소시키는 것에 그쳤다.

구분	암모니아 (ppm)					감소율(%)
구분	1일	3일	5일	7일	총계	감소율(%)
대조군	51.1	25.9	13.2	10.0	100.2	0
B. velezensis	34.4	12.1	4.3	3.7	54.5	45.6
B. amyloliquefaciens	57.3	17.5	8.3	7.8	90.9	9.3

상기 표 10을 살펴보면, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 이용하여 처리된 돼지 분뇨는 대조군에 비해 암모니아 수준이 45.6% 감소한 것을 확인하였다. 반면, 비교예인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스는 암모니아 수준을 9.3% 감소시키는 것에 그쳤다.

구분	황화수소 (ppm)					감소율(%)
구분	1일	3일	5일	7일	총계	감소율(%)
대조군	48.0	7.1	3.7	2.2	61.0	0
B. velezensis	35.4	5.7	2.1	1.2	44.4	27.2
B. amyloliquefaciens	58.0	3.0	2.2	2.0	65.2	-6.9

상기 표 11을 살펴보면, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 이용하여 처리된 돼지 분뇨는 대조군에 비해 황화수소 수준이 27.2% 감소한 것을 확인하였다. 반면, 비교예인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스는 황화수소 수준을 오히려 6.9% 증가시켰다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Bacillus velezensis L001 strain having odor removal actibity, Composition for removing or reducing odor comprising the same, and Method for removing or reducing odor using the same <130> HP9544 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1466 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus velezensis L001 <400> 1 aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg 60 atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 120 ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataaaagg 180 tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240 gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360 ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag 420 ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 480 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat 540 tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 600 ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 660 gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 720 tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780 ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 840 aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960 ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg 1020 acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080 gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140 tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200 acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc 1260 acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc 1320 tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380 gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttta ggagccagcc 1440 gccgaaggtg ggacagatga ttgggg 1466

Claims

악취 제거 또는 저감 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주 (수탁번호: KFCC11869P).
제1항에 있어서,
상기 악취 제거 또는 저감 활성은 암모니아 및 황화수소 중에서 선택되는 1종 이상의 악취가스의 수준을 감소시키는 것인 균주.
제1항의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 악취 제거 또는 저감용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 조성물은 암모니아 및 황화수소 중에서 선택된 1종 이상의 악취가스의 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L001 균주 또는 이의 배양액은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
상기 배양액은 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 6.0 내지 11.0 log cfu/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
상기 조성물은 미강 100 중량부 및 물 30 내지 60 중량부를 포함하는 발효원에 바실러스 벨레젠시스 L001 균주 배양액을 0.1 내지 5 중량부로 접종한 후 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서,
상기 발효원은 당밀 0.1 내지 5 중량부 및 효모추출물 0.01 내지 2 중량부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서,
상기 발효는 24 내지 38 ℃에서 1 내지 6일 동안 호기 조건에서 고상발효시키는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 바실러스 벨레젠시스 L001 균주를 6.0 내지 11.0 log cfu/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 제조 직후부터 보관 30일까지 바실러스 벨레젠시스 L001 균주의 균수가 7.0 log cfu/mL 이상으로 유지되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서,
상기 보관은 실온 또는 1 내지 5 ℃의 저온에서 보관하거나 수분함량 10% 이하로 건조한 후 실온에서 보관하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제3항의 조성물을 축산 분뇨에 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨로부터 악취가 제거 또는 저감된 비료를 제조하는 방법.
제13항의 방법에 따라 제조되어, 악취가 제거 또는 저감된 비료.
제3항의 조성물을 축산 분뇨를 이용한 비료에 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨를 이용한 비료의 악취를 제거 또는 저감하는 방법.
제3항의 조성물을 축산 분뇨에 살포 또는 혼합하는 단계를 포함하는, 축산 분뇨의 악취를 제거 또는 저감하는 방법.