CN102851231B - 一种功能菌株及其菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环保领域，具体地说涉及一株枯草芽孢杆菌属菌株，已于2011年08月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCC No.5140，命名为W58，分类命名为枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)，该菌株对多种恶臭环境起到明显的除臭和抑菌效果，利用枯草芽孢杆菌属菌株W58生产的微生物菌剂，具有较高的NH3平均去除率、H2S平均去除率和臭气浓度平均去除率，可在垃圾、生活污水、畜禽舍空气等的除臭和净化上应用。

Description

一种功能菌株及其菌剂和应用
技术领域
本发明属于环保领域，具体地说涉及一株可对恶臭气体物质进行吸附和降解的枯草芽孢杆菌属菌株，以及利用该功能菌株生产的微生物菌剂及其应用。
背景技术
恶臭是各种气味(异味)的总称，是当今世界大气污染、水质污染、土壤污染、噪音污染等七种典型公害之一，直接作用于人的嗅觉给人造成直接危害。自然界的200多万中化合物中凭人的感觉可认识到4000多种化合物有恶臭，除特定的产业恶臭以外，其中硫化氢、胺类、吲哚类、低级脂肪酸、烃类、醛类等化合物对人体的危害较大。
恶臭污染物质指一切刺激嗅觉器官引起人们不愉快及损害生活环境的气味物质。恶臭污染往往不是单一组分而是多种组分的复合臭，恶臭之间有相抵相加等多重作用。恶臭的来源有天然形成的动植物在环境系统中自然腐败分解、或在加工过程中产生的臭气物质如胺、二氧化硫、醇、醛、低级脂肪酸、酮、醚等，也有动植物体内的有机物在某些微生物的作用下降解成低分子恶臭气体向大气释放，这是生活中臭气的主要来源。恶臭污染不仅会使人们精神不愉快，烦躁不安，而且还会造成人们食欲不振、呕吐、头晕、头疼、视觉模糊。高浓度的恶臭还可使接触者发生肺水肿、甚至窒息死亡。长期反复受恶臭物质刺激，还会引起嗅觉疲劳，导致嗅觉失灵。
目前所采用的除臭方式主要有：1、感官性除臭：利用芳香有机化合物、遮蔽剂、动植物精油等以遮蔽覆盖的方式除臭，如空气清新剂，其通过散发香气来盖住异味，并没有分解、清除空气中的有害气体，只是靠混淆人的嗅觉来“淡化”异味，而且其含有的成分对人体可能带来的伤害；2、物理性除臭：利用吸收、吸附作用使空气中的异味气体与水或与其它化学物质发生反应，生成无味分子，或利用多孔介质对恶臭分子进行吸附，以达到除臭的效果，如采用水洗、有机溶剂溶解等吸收作用，或采用活性碳、沸石、活性白土等吸附作用，只适用于低浓度恶臭气体的处理，且除臭效果一般，投资高；3、生物性除臭：是采用生物法通过专门培养在生物滤池内生物填料上的微生物膜对废臭气分子进行氧化，使其分解成无臭的简单无机物而达到脱臭的目的，是目前最为经济有效的除臭方法，可同时处理含有多种污染物的废气，环保卫生，无二次污染，但其要求被去除的臭味物质由较好的水溶性并可被微生物氧化。
枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉分解色氨酸形成吲哚，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，在遗传学研究中应用广泛。
发明内容
本发明的目的是提供一种对恶臭物质进行吸附、降解并分解成无臭的简单无机物的枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株W58。
本发明所提供的菌株是从生活垃圾样品中筛选得到的。取垃圾样品1g，用灭菌生理盐水稀释成浓度为10-1悬液，连续作10倍比稀释，吸取不同稀释度悬液500μL，分别涂布在营养肉汤琼脂培养基上，37℃培养(需氧或厌氧)3d，挑取不同性状菌落染色镜检后，再进一步进行纯化培养；取纯化菌株分别接种于营养肉汤琼脂培养基，37℃下180r/min培养12小时，取培养菌液按10％接种量加入到含300g生活垃圾的三角瓶中，加塞封口，室温静置15d，打开瓶塞，感官判定并确定菌株对垃圾的除臭等级；选择除臭等级高的菌种液体培养后进行复筛，复筛中不同时间检测备选菌种处理后的氨气和硫化氢含量，挑取去除率最高的一株，该菌株已于2011年08月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏登记号为CGMCC No.5140，命名为W58，分类命名为枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)。
本发明还提供上述枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株W58在生物除臭中的应用。通过对枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株W58进行除臭试验，发现该菌株对多种恶臭环境起到显著的除臭和抑菌效果，具有较高的NH3平均去除率、H2S平均去除率和臭气浓度平均去除率。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株W58，光学显微镜40倍下观察，菌体为杆状，大小为0.7～0.8×2～3微米，营养肉汤琼脂培养基培养8h后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生。在营养肉汤琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株W58的各项生理生化特征如表1所示。
表1枯草芽孢杆菌菌株W58的生理生化特征
  检测项目   生理生化   检测项目   生理生化
  革兰氏染色   +   葡萄糖产酸   +
  淀粉水解   +   木糖产酸   +
  芽孢染色   +   阿拉伯糖产酸   +
  伴孢晶体   -   甘露醇产酸   +
  运动性   +   1％葡萄糖产黑色素   -
  接触酶   +   1％酪氨素产黑色素   -
  厌氧生长   -   柠檬酸盐   +
  V.P.试验   +   产生吲哚   -
  酪素   +   酪氨素   -
  明胶水解   +   7％NaCl   +
  50℃   +   葡萄糖产气   -
本发明的另一目的是提供一种利用本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)菌株属W58生产的可进行生物除臭的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌属菌株W58。
所述微生物菌剂的枯草芽孢杆菌属菌株W58的活菌数大于2×109cfu/g。
所述微生物菌剂为液态制剂。
所述微生物菌剂在垃圾、生活污水、畜禽舍空气的除臭和净化的应用。
一种利用本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株W58生产的微生物菌剂，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化：将-20℃保存的枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株W58接种LB平板培养基上，并在28～32℃下培养20～24小时，得活化的功能菌株；
(2)种子液的制备：挑取单菌落向LB液体培养基接入活化的功能菌株，在28～34℃下震荡培养20～24小时，得种子液；
(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照体积百分比为1～10％比例接入发酵培养基中，再在28～34℃、摇床转速150～200rpm的条件下培养24～30小时，即得功能菌株W58的液体制剂；
其中所述的发酵培养基的组成成分为：K2HPO40.4～0.8％、KH2PO40.1～0.3％、NaCl0.1～0.4％、MgSO4·7H2O0.02～0.04％、CaCl2·2H2O0.015～0.025％、(NH4)2SO40.1～0.3％、蔗糖2％～4％、大豆粉1～3％，余量为水。
上述制备方法中步骤(1)或(2)所述的LB平板培养基或LB液体培养基的组成成分及其制备方法都是本领域技术人员熟知的，可按照通常的方法制备。
上述制备方法中所述的发酵培养基的制备方法，按照重量百分比称取K2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、(NH4)2SO4、蔗糖、大豆粉，然后将它们混合，再加水至所需体积即可。
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株W58，通过对恶臭物质的吸附和降解，将其分解成无臭的简单无机物，对多种恶臭环境起到显著的除臭和抑菌效果，可在垃圾、生活污水、畜禽舍空气等的除臭和净化上应用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。所述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。
实施例一、微生物菌剂的制备：
1、菌种活化：将-20℃保存的枯草芽孢杆菌属菌株W58接种LB平板培养基上，并在30℃下培养22小时，得活化的功能菌株；
2、种子液的制备：挑取单菌落向LB液体培养基接入活化的功能菌株，在28℃下震荡培养24小时，得种子液；
3、发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照体积百分比为4％比例接入发酵培养培养基中，再在30℃、摇床转速170rpm的条件下培养26小时，即得活性成分为枯草芽孢杆菌属菌株W58的液体微生物菌剂。发酵培养基的组成成分为：K2HPO4 0.6％、KH2PO40.1％、NaCl0.3％、MgSO4·7H2O0.02％、CaCl2·2H2O0.025％、(NH4)2SO40.2％、蔗糖4％、大豆粉3％，余量为水。
实施例二、微生物菌剂的制备：
1、菌种活化：将-20℃保存的枯草芽孢杆菌属菌株W58接种LB平板培养基上，并在28℃下培养24小时，得活化的功能菌株；
2、种子液的制备：挑取单菌落向LB液体培养基接入活化的功能菌株，在32℃下震荡培养20小时，得种子液；
3、发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照体积百分比为8％比例接入发酵培养培养基中，再在28℃、摇床转速190rpm的条件下培养28小时，即得活性成分为枯草芽孢杆菌属菌株W58的液体微生物菌剂。发酵培养基的组成成分为：K2HPO40.4％、KH2PO40.3％、NaCl0.2％、MgSO4·7H2O0.04％、CaCl2·2H2O0.020％、(NH4)2SO40.3％、蔗糖3％、大豆粉1％，余量为水。
实施例三：试验
对一堆产生恶臭的垃圾，将实施例一所得液体微生物菌剂(使用前用自来水稀释10倍)用喷雾器喷洒，尽量使制剂喷洒范围遍及垃圾堆放区域。在垃圾周围不同的地点进行采样，测定喷制剂前后20分钟H2S和NH3浓度，采样点离臭源边缘1m，采样高度1m，5点采样，取平均值。臭气浓度采用三点比较式臭袋法(GB/T14675)；氨采用次氯酸钠-水杨酸分光光度计(GB/T 14679)；硫化氢采用聚乙烯醇磷酸铵吸收-亚甲基蓝比色法(GB/T 16489)。所得结果如表2。
表2
  检测项目   喷洒前浓度   喷洒后浓度   平均去除率
  硫化氢   0.048mg/m3   0.00297mg/m3   93.8％
  氨   0.386mg/m3   0.018mg/m3   95.3％
  臭气总浓度   857   24.85   97.1％
注：臭气浓度单位：无量纲
实施例四：试验
取家庭厨房有机污水和下水道污水进行混合，放置几天发出恶臭后，将污水分为等体积的两组，A组加入实施例二所得液体微生物菌剂，加入量为污水体积的1‰。对照加入等体积清水。15分钟后嗅辩，较空白对照，制剂处理的臭味明显减弱。检测其中H2S和NH3浓度，结果如表3。
表3
  检测项目   加入前浓度   加入后浓度   平均去除率
  硫化氢   0.140mg/m3   0.0136mg/m3   90.3％
  氨   0.097mg/m3   0.0073mg/m3   92.5％
实施例五：试验
随机挑选饲养密度相近，面积相等的两个产蛋鸡舍，用实施例一所得液体微生物菌剂稀释10倍进行喷洒。试验期5d，液体微生物菌剂处理组鸡舍每天喷洒一次，对照组喷洒清水，每天9:00～17:00开窗通风换气，其余时间关闭门窗。饲养管理及其其他操作均按常规进行。分别在两鸡舍的中央位置0.3～0.5m高处用CD-1型大气采样器采集气体样本。检测其中氨和硫化氢浓度。结果如表4。
表4
  检测项目   加入前浓度   加入后浓度   平均去除率
  硫化氢   0.398mg/m3   0.03184mg/m3   92％
  氨   0.415mg/m3   0.0353mg/m3   91.5％
结论：由上述试验可以看出，本发明所提供的枯草芽孢杆菌属菌株W58对多种恶臭环境起到明显的除臭和抑菌效果，具有较高的NH3平均去除率、H2S平均去除率和臭气浓度平均去除率，可应用于垃圾、生活污水、畜禽舍空气等的除臭和净化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)属菌株，已于2011年08月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCC No.5140，命名为W58，分类命名为枯草芽孢杆菌(Baillus subtilis)。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌属菌株W58在生物除臭中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌属菌株W58生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌属菌株W58。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂的枯草芽孢杆菌属菌株W58的活菌数大于2×109cfu/g。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂为液态制剂。
6.一种利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌属菌株W58生产微生物菌剂的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化：将-20℃保存的枯草芽孢杆菌属菌株W58接种LB平板培养基上，并在28～32℃下培养20～24小时，得活化的功能菌株；
(2)种子液的制备：挑取单菌落向LB液体培养基接入活化的功能菌株，在28～34℃下震荡培养20～24小时，得种子液；
(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照体积百分比为1～10％比例接入发酵培养基中，再在28～34℃、摇床转速150～200rpm的条件下培养24～30小时，即得功能菌株W58的液体制剂；
其中所述的发酵培养基的组成成分为：K2HPO4 0.4～0.8％、KH2PO4 0.1～0.3％、NaCl 0.1～0.4％、MgSO4·7H2O 0.02～0.04％、CaCl2·2H2O 0.015～0.025％、(NH4)2SO40.1～0.3％、蔗糖2％～4％、大豆粉1～3％，余量为水。
7.根据权利要求7所述的生产微生物菌剂的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的制备方法，是按照重量百分比称取K2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、(NH4)2SO4、蔗糖、大豆粉，然后将它们混合，再加水至所需体积即可。
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