CN116426402A - 枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDAAS‑A32，已于2022年10月11号保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62816，保藏中心的具体地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼；还提供了一种枯草芽孢杆菌GDAAS‑A32在制备除臭微生物制剂中的应用，该制剂能以1％的低接种量耐受并高效降解200mg/L的高浓度粪臭素。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
畜禽养殖的过程中会产生大量臭气，污染环境。经过研究发现，臭气中的吲哚类物质虽然浓度较低，但是其臭气贡献率较高，这是由于吲哚类分子极低的嗅阈值、难降解性、持久性、较高的极性和挥发性导致的。距离污染源超过一公里仍能检测到吲哚类臭气。吲哚类臭气来源于色氨酸在动物肠道中的无氧发酵。由于养殖场中吲哚类物质的产生量和浓度远高于自然界，同时吲哚类臭气物质的现场降解难度大，处理吲哚类臭味污染成为目前养殖业所面临的较大挑战。目前也有一些关于使用粪臭素降解菌来降解吲哚类臭味的研究，但是均存在粪臭素耐受性不强(＜150mg/L)、接种量大(5％或10％)和降解效率不强等问题，难以实际应用。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDAAS-A32，已于2022年10月11号保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62816，保藏中心的具体地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼。
还提供了一种枯草芽孢杆菌GDAAS-A32在制备除臭微生物制剂中的应用，该制剂能以1％的低接种量耐受并高效降解200mg/L的高浓度粪臭素。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点提供一种枯草芽孢杆菌GDAAS-A32，枯草芽孢杆菌GDAAS-A32的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDAAS-A32，保藏编号为GDMCC No：62816。
优选的是，所述枯草芽孢杆菌GDAAS-A32的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
提供一种除臭微生物制剂，除臭微生物制剂以枯草芽孢杆菌GDAAS-A32或/和其代谢物为活性成分。
提供一种除臭微生物制剂的制备方法，将所述枯草芽孢杆菌GDAAS-A32接种于培养基中进行培养，培养出的物质即为除臭微生物制剂。
优选的是，所述培养基为LB培养基或M9无机盐培养基。
优选的是，所述枯草芽孢杆菌GDAAS-A32的培养温度为30-50℃，转速为120-250rpm，培养时间为8-24h。
优选的是，所述除臭微生物制剂的OD600为0.5-1.5。
优选的是，所述除臭微生物制剂的活菌数为1-2×109CFU/mL。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、提供了一种枯草芽孢杆菌GDAAS-A32，该菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDAAS-A32，已于2022年10月11号保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62816，保藏中心的具体地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼。
第二、提供一种枯草芽孢杆菌GDAAS-A32在制备除臭微生物制剂中的应用，该制剂能以1％的低接种量耐受并高效降解200mg/L的高浓度粪臭素。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案所述枯草芽孢杆菌GDAAS-A32在LB培养基上的菌落形态照片图；
图2为本发明的其中一种技术方案所述粪臭素标准样品的浓度-峰面积曲线；
图3为本发明的其中一种技术方案所述除臭微生物制剂处理猪粪的粪臭素总排放量测定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本申请的实施例提供了一种枯草芽孢杆菌GDAAS-A32，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDAAS-A32，已于2022年10月11号保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62816，保藏中心的具体地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼。该菌株是申请人从广东广州市养鸡。场收集的鸡粪中分离得到的。该菌以1％的低接种量可有效降解200mg/L的高浓度粪臭素，在LB培养基中24h降解率达51.27％，在粪臭素无机盐培养基中24h降解率达76.99％。
下面将结合实施方式对本申请的实施方案进行详细描述，未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1粪臭素降解菌的筛选与分离
从广东广州市养鸡场采集鸡粪样品5g，以50mL无菌水振荡混匀，静置10min后吸取100μL上清液于100mg/L粪臭素为唯一碳源的M9平板中，37℃培养5天。挑取单菌落接种以10mg/L粪臭素为唯一碳源的M9培养基中，37℃，150rpm培养24h。培养液划线接种到粪臭素M9平板上，37℃培养2天。反复接种液体培养基和平板，3次后分离得到能以粪臭素为唯一碳源生长的菌株若干，其中一株能力较强的命名为GDAAS-A32。该菌株的菌落形态特征如图1所示，在LB和无机盐培养基上为白色圆形菌落，菌落突出不透明，边缘不规则，革兰氏阳性，专性好氧，55℃下生长，能利用葡萄糖、乳糖、果糖、柠檬酸钠和粪臭素作为唯一碳源。
实施例2菌株GDAAS-A32的基因组16S rDNA基因序列鉴定
将粪臭素降解菌株GDAAS-A32接种于LB液体培养液中，37℃培养12h，收集菌体。使用CTAB法进行基因组DNA抽提，随后将初步检验合格的基因组样品送华大基因进行基因组三代测序，通过ANI分析最终确定菌株GDAAS-A32为枯草芽孢杆菌，而且含有一个目前未在其他枯草芽孢杆菌中发现的质粒，在NCBI上的比对结果如表1所示，是归属于枯草芽孢杆菌的一个新菌株，其16S rDNA基因序列为：
agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcg-gacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaac-ctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccg-catggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagc-tagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctga-gagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag-tagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgag-tgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcgaa-tagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccag-cagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcg-caggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcatt-ggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcg-tagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgag-gagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaac-gatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcac-tccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaa-gcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtctt-gacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtg-catggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctt-gatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggag-gaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgc-tacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaa-gccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctg-gaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacac-cgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttag-gagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacct
表1枯草芽孢杆菌GDAAS-A32质粒序列的比对结果a
注：a仅显示相似序列在总长度10％以上的结果。
其中，该菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDAAS-A32，已于2022年10月11号保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62816，保藏中心的具体地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼。
实施例3粪臭素含量测定
1、称取粪臭素标准样品1.00g，加入5mL无水乙醇溶解，转移到10mL容量瓶中并定容至10mL，配制成100g/L标准储液，避光于-20℃保存；
2、储液以蒸馏水稀释成0.1，0.3，0.6，0.8，1和2mg/L标准系列溶液，以3：7的比例加入乙腈，以0.2μm有机相滤膜过滤，HPLC测定其峰面积，以进样浓度和所得峰面积建立线性回归方程，其中，粪臭素标准样品的浓度-峰面积曲线如图2所示；
3、待测样品以无菌水合理稀释后，以3：7的比例加入乙腈，以0.2μm有机相滤膜过滤，HPLC测定其峰面积，以峰面积计算其粪臭素浓度；
4、HPLC条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)，流动相为70％乙腈，柱温35℃，流速1mL/min，荧光检测器，加装荧光信号放大器，发射波长270nm，激发波长350nm。
实施例4枯草芽孢杆菌GDAAS-A32的粪臭素降解能力
将实施例2中获得的培养液按照1％的比例(v/v)接种于以200mg/L粪臭素为唯一碳源的M9培养基和含有200mg/L粪臭素的LB培养基，37℃，150rpm培养24h，以不接菌的培养基作为对照。收集发酵上清，以氯仿对样品进行萃取和HPLC分析，以测定粪臭素浓度。结果如表2所示，枯草芽孢杆菌GDAAS-A32对高浓度粪臭素具有很强的降解能力。
表2枯草芽孢杆菌GDAAS-A32的粪臭素降解能力
注：a以200mg/L粪臭素为唯一碳源的M9培养基。
b含有200mg/L粪臭素的LB培养基；
含有粪臭素的LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCL 10g，粪臭素200mg，加水至1L，调节pH到7.0-7.5；
粪臭素无机盐培养基：(NH4)2SO4 2g,KH2PO4 2g,Na2HPO4·12H2O 3.28g，FeCL30.00025g，粪臭素200mg，加水至1L，调节pH到7.0-7.5。
实施例5除臭微生物制剂的制备及其在猪粪臭味减排中的应用
1、菌剂制备：将枯草芽孢杆菌GDAAS-A32接种于LB培养基或M9无机盐培养基中，37℃，150rpm培养12h，所得即为除臭微生物菌剂。在LB培养基中制备的菌剂以酶标仪检测OD600可超过1.0，以稀释涂布平板法计算活菌数可达2×109CFU/mL。在M9无机盐培养基中制备的菌剂以酶标仪检测OD600可超过0.5，以稀释涂布平板法计算活菌数可达1×109CFU/mL。枯草芽孢杆菌生长速率快，环境适应性强，在施用时容易形成优势菌从而发挥功能，适合在各种复杂的天然环境中应用。
2、除臭微生物制剂在猪粪臭味减排中的应用：收集100g新鲜猪粪置于20L的密闭容器中，加入1×109CFU活菌量(0.5-1mL)的实施例5步骤1除臭微生物制剂，拌匀，以不加菌剂的处理组作为对照。于室温密闭处理24h后，收集容器内气体，以有经验的臭味评定人员用恶臭官能检测法测定臭味等级(0级,无臭；1级,勉强感到轻微臭味；2级,容易感到轻微臭味；3级,明显感到臭味；4级,强烈臭味；5级,无法忍受恶臭)。经过24h处理后，对照组的臭味等级为4级，实验组的臭味等级为3级，经过除臭微生物制剂处理24h排放总臭气的臭味等级下降了1级，明显减轻了猪粪的臭味释放。收集2L气体，缓慢通过氯仿，以HPLC测定氯仿吸收的粪臭素含量，测定结果如表3所示，粪臭素总排放量测定结果如图3所示，结果显示除臭微生物制剂具有较好的猪粪臭味减排效果，由于已经排放到空气中的粪臭素无法重新回到粪便里被细菌处理，67％的粪臭素减排量已经是较好的结果。
表3枯草芽孢杆菌GDAAS-A32对猪粪臭味减排的效果
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (8)
1.枯草芽孢杆菌GDAAS-A32，其特征在于，枯草芽孢杆菌GDAAS-A32的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDAAS-A32，保藏编号为GDMCC No：62816。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌GDAAS-A32在制备除臭微生物制剂中的应用。
3.除臭微生物制剂，其特征在于，除臭微生物制剂以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌GDAAS-A32或/和其代谢物为活性成分。
4.如权利要求3所述的除臭微生物制剂的制备方法，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌GDAAS-A32接种于培养基中进行培养，培养出的物质即为除臭微生物制剂。
5.如权利要求4所述的除臭微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述培养基为LB培养基或M9无机盐培养基。
6.如权利要求4所述的除臭微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌GDAAS-A32的培养温度为30-50℃，转速为120-250rpm，培养时间为8-24h。
7.如权利要求4所述的除臭微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述除臭微生物制剂的OD600为0.5-1.5。
8.如权利要求4所述的除臭微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述除臭微生物制剂的活菌数为1-2×109CFU/mL。
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