CN113151077B - 一种铜绿假单胞菌及其筛选方法与应用 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌及其筛选方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术，具体涉及一种铜绿假单胞菌及其筛选方法与应用，所获得的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，命名为Yong5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.61575，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年3月23日。该菌株筛选容易，能15℃低温条件高效去除水体中的亚硝态氮，去除率高达90％以上，且几乎无中间产物硝态氮和氨态氮的积累，不产生二次污染，对低温水体中亚硝态氮的去除具有良好的应用前景，能很好的应用于养殖水体的微生物修复方案中。

Description

一种铜绿假单胞菌及其筛选方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术，具体涉及一种铜绿假单胞菌及其筛选方法与应用。
背景技术
随着集约化养殖的迅速发展，池塘老化、放养密度过高以及投饲料残饵过多等诸多因素引起了养殖水体中亚硝酸盐逐年升高，导致鱼虾出现组织缺氧，发生病变，甚至死亡，所以亚硝态氮含量过高是水体受污染的重要原因之一。基于亚硝酸盐的危害，为保障水产养殖的安全，需要采取有效方法将亚硝酸盐浓度控制在0.2mg/L以下。
微生物修复技术可通过微生物的同化和反硝化过程有效去除污水中的亚硝酸盐。中国专利200910273046.X公布了一株施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YZN-001(保藏号为CCTCC NO:M209107)，培养温度30℃，18h后对初始浓度为197.82mg/L的亚硝态氮去除率为100％；中国专利201010506931.0公布了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)(保藏号为CCTCC M20100209)，培养温度30℃，24h后对初始浓度为100mg/L的亚硝态氮去除率为17.35％；中国专利201210512246.8公布了一株产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)DF-1(保藏号为CCTCC No.6623)，在35℃时对初始浓度为10mg/L的亚硝态氮去除率高达90％以上，但培养温度为15℃对10mg/L亚硝态氮的去除率仅为20％左右；中国专利201710812319.8公布了一株假单胞菌属(Pseudomonas sp.)DN13-01，培养温度28℃，12h后对初始浓度为14mg/L的亚硝态氮去除率为100％。
综上可以看出，目前已发现的可去除亚硝酸盐的菌都均是在常温下进行的，尚未有关于可在低温条件下高效去除亚硝酸盐的菌株报道。
发明内容
基于上述缺陷，本发明的首要目的在于获得一株能够在低温条件下去除水体亚硝态氮的细菌，且在处理过程中几乎不积累硝态氮与氨态氮，对环境不会造成二次污染。
具体而言，本发明得到一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，该菌株命名为Yong5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.61575,保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年3月23日。
本发明的第二目的在于如何更好实现上述菌株的筛选，具体而言，提出了一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的筛选方法，其关键在于包括以下步骤：
S1：取10g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的10％的无菌磷酸缓存盐溶液中,在25℃、200r/min振荡30min，静置5min，收集土壤悬液；
S2：将收集的悬浮液于5000r/min条件下离心15min，收集上清液10mL于4℃冰箱保存备用；
S3：取2mL制备好的样品加入到100mL含亚硝态氮浓度为100mg/L的液体培养基中进行筛选培养，25℃、180r/min震荡培养48h；
S4：5％的接种量继代培养4次后，用梯度稀释法制备102～106系列的稀释液，取100μL分别涂布到BTB固体培养基中培养；
S5：挑取可在BTB固体培养基上生长的单个菌落，在BTB固体培养基上连续纯化两次，得到所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
所述亚硝态氮浓度为100mg/L的液体培养基具体是K2HPO4·3H2O 7.0g/L、KH2PO43.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.05g/L、NaNO2 0.493g/L、CH3COONa 5.13g/L，按照此比例配置培养基1L，调pH 7.0～7.2，121℃灭菌锅灭菌30min。
可选地，所述BTB固体培养基按照NaNO2 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、FeCl2·4H2O 0.42g/L、CaCl2 0.094g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、琥珀酸钠4.25g/L、BTB(1％溴百里酚蓝溶于无水乙醇)1mL/L配置，pH值为7.0～7.2，最后加2％琼脂，在121℃灭菌锅灭菌30min，倒平板备用。
本发明的第三目的在于提出上述菌株在去除水体中亚硝态氮的应用。
作为优选，应用环境可以在15℃下。
具体而言，将该菌株在以亚硝态氮为唯一氮源的液体培养基中15℃条件下培养48h后，对初始浓度小于50mg/L亚硝态氮的去除率达90％以上。
本发明的效果是：
本发明获得了一种铜绿假单胞菌，筛选容易，能15℃低温条件高效去除水体中的亚硝态氮，去除率高达90％以上，且几乎无中间产物硝态氮和氨态氮的积累，不产生二次污染，对低温水体中亚硝态氮的去除具有良好的应用前景，能很好的应用于养殖水体的微生物修复方案中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明研究的铜绿假单胞菌Yong5对浓度为16.5mg/L亚硝态氮的降解曲线。
图2为本发明研究的铜绿假单胞菌Yong5对浓度为30mg/L亚硝态氮的降解曲线。
图3为本发明研究的铜绿假单胞菌Yong5对浓度为46mg/L亚硝态氮的降解曲线。
图4为本发明研究的铜绿假单胞菌Yong5对浓度为80mg/L亚硝态氮的降解曲线。
图5为菌株Yong5的16S rRNA系统发育进化树。
图6为菌株Yong5在LB培养基上生长状况。
图7为菌株Yong5革兰氏染色。
图8为本发明研究的铜绿假单胞菌Yong5活化时在LB液体培养基上的生长曲线。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本实施例提供了一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，由申请人于2020年11月从中国广西壮族自治区桂林市永福县旱地土壤中分离得到，能在低温条件下对亚硝态氮具有良好降解能力，经形态观察、生理生化和16S rDNA鉴定(其16S rDNA比对鉴定的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示)，菌株在分类学上属于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，申请人将该菌株命名为Yong5，并于2021年3月23日将该菌株送至广东省科学院微生物研究所保藏，其保藏编码：GDMCC No.61575。
上述菌株的筛选过程如下：
S1：取10g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的10％的无菌磷酸缓存盐溶液中,在25℃、200r/min振荡30min，静置5min，收集土壤悬液；
S2：将收集的悬浮液于5000r/min条件下离心15min，收集上清液10mL于4℃冰箱保存备用；
S3：取2mL制备好的样品加入到100mL含亚硝态氮浓度为100mg/L的液体培养基中进行筛选培养，25℃、180r/min震荡培养48h；
S4：5％的接种量继代培养4次后，用梯度稀释法制备102～106系列的稀释液，取100μL分别涂布到BTB固体培养基中培养；
S5：挑取可在BTB固体培养基上生长的单个菌落，在BTB固体培养基上连续纯化两次，得到所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
其中，亚硝态氮浓度为100mg/L的液体培养基具体是K2HPO4·3H2O 7.0g/L、KH2PO43.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.05g/L、NaNO2 0.493g/L、CH3COONa 5.13g/L，按此比例配置培养基1L，调pH7.0～7.2，121℃灭菌锅灭菌30min。
BTB固体培养基按照NaNO2 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、FeCl2·4H2O 0.42g/L、CaCl20.094g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、琥珀酸钠4.25g/L、BTB(1％溴百里酚蓝溶于无水乙醇)1mL/L配置，pH值为7.0～7.2，最后加2％琼脂，在121℃灭菌锅灭菌30min，倒平板备用。
为进一步验证该菌株能在低温环境下高效实现水体亚硝态氮的去除，本实施例中所用降解能力测定方法、分离筛选得到的菌株的特性如下：
(1)菌株降解能力的测定及相关培养基的制备
为测定不同亚硝态氮浓度培养基中亚硝态氮的去除情况，配制了初始浓度为16.5mg/L、30mg/L、46mg/L与80mg/L的亚硝态氮液体培养基。
100mg/L的亚硝态氮液体培养基成分为K2HPO4·3H2O 7.0g/L、KH2PO4 3.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.05g/L、NaNO2 0.493g/L、CH3COONa 5.13g/L。
4个不同梯度的培养基按照此比例得到，调pH 7.0～7.2,121℃灭菌锅灭菌30min。
将在LB液体培养基(胰蛋白胨10.0g/L、酵母浸液5.0g/L、氯化钠10.0g/L，pH在7.0±0.1)中活化好的菌株Yong5接种于上述亚硝态氮液体培养基中(初始OD600为0.2)培养。上述所有培养液均置于带有封口膜的250mL三角瓶中，并在150r/min 15℃条件下培养，以不接种菌株的培养基为空白对照，每个试验设置三个重复。
为了能更好的监测细菌降解亚硝态氮的动态情况，每隔24h取样测定NO2 --N、NO3 --N、NH4 +-N、OD600、pH等指标。NO2 --N测定用N-(1-萘基-乙二胺光度法)，NO3 --N测定用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，NH4 +-N测定用靛酚蓝比色法，OD600用紫外分光光度计于600nm下测定，pH用玻璃电极法测定。
结果发现，15℃下培养48h后，Yong5菌株对16.5mg/L、30mg/L和46mg/L亚硝态氮的去除率达到91.94％、98.14％和95.73％；培养96h后对80mg/L亚硝态氮的去除率达到87.25％。此外，菌株Yong5在去除亚硝态氮过程中仅有少量硝态氮和氨态氮的积累。详细亚硝态氮降解动态可见图1、图2、图3和图4。
(2)菌株Yong5的生物学特征
革兰氏染色阴性、能在NaNO2作为唯一氮源的固体培养基上生长，且培养时，其菌落为圆形，乳白色，不透明，菌落表面湿润光滑隆起，质地粘稠感，细胞呈杆状，能利用作为NaNO2唯一氮源生长。
本发明获得的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)Yong5的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。将该序列在BCBI网站上进行同源性比对分析，下载相对应的序列，构建16S rRNA系统发育树确定Yong5为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，系统发育树如图5所示，菌株在LB培养基上的生长状况如图6所示，菌株的革兰氏染色图片如图7所示，菌株活化时在LB液体培养基上的生长曲线。
综上所述，本发明通过提供一种筛选的铜绿假单胞菌，它能够在15℃低温条件下能高效去除水体中的亚硝态氮，去除率高达90％以上，且几乎无中间产物硝态氮和氨态氮的积累，不产生二次污染，对低温水体中亚硝态氮的去除具有良好的应用前景。
最后需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，比如在菌株筛选过程中适当调整土壤悬液的制备时间或离心速率，适当调整含亚硝态氮浓度或灭菌时间等，这样的变换均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种铜绿假单胞菌及其筛选方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa Yong5)
<400> 1
ggcggggggc gcagctacac atgcagtcga gcggatgaag ggagcttgct cctggattca 60
gcggcggacg ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctggta gtgggggata acgtccggaa 120
acgggcgcta ataccgcata cgtcctgagg gagaaagtgg gggatcttcg gacctcacgc 180
tatcagatga gcctaggtcg gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg 240
atccgtaact ggtctgagag gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc 360
gcgtgtgtga agaaggtctt cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggcagtaa 420
gttaatacct tgctgttttg acgttaccaa cagaataagc accggctaac ttcgtgccag 480
cagccgcggt aatacgaagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg 540
taggtggttc agcaagttgg atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcatccaaa 600
actactgagc tagagtacgg tagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agatatagga aggaacacca gtggcgaagg cgaccacctg gactgatact gacactgagg 720
tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
tcgactagcc gttgggatcc ttgagatctt agtggcgcag ctaacgcgat aagtcgaccg 840
cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900
gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct tacctggcct tgacatgctg 960
agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactcag acacaggtgc tgcatggctg 1020
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct 1080
tagttaccag cacctcgggt gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacggccagg gctacacacg tgctacaatg 1200
gtcggtacaa agggttgcca agccgcgagg tggagctaat cccataaaac cgatcgtagt 1260
ccggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag 1320
aatgtcacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg 1380
ggttgctcca gaagtagcta gtctaaccgc aagggggacg gtaccacgga tatcatgcca 1440

Claims (4)

1.一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其特征在于：该菌株命名为Yong5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.61575,保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年3月23日。
2.如权利要求1所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的应用，其特征在于：应用于去除水体中亚硝态氮。
3.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的应用，其特征在于：应用环境为15℃下。
4.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的应用，其特征在于：将该菌株在以亚硝态氮为唯一氮源的液体培养基中15℃条件下培养48h后，对初始浓度小于50mg/L亚硝态氮的去除率达90％以上。
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