KR20190079444A

KR20190079444A - 다기능 신규 균주 바실러스 서브틸리스 ub-156

Info

Publication number: KR20190079444A
Application number: KR1020170181645A
Authority: KR
Inventors: 홍석일; 이주용
Original assignee: 우림바이오 주식회사
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-07-05
Also published as: KR102050083B1

Abstract

본 발명은 친환경 유기농 작물재배 토양에서 분리한 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156 균주에 관한 것이다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 축산 분뇨에서 발생하는 암모니아 가스를 신속하게 제거할 수 있으며, 악취 유발물질을 분해하여 근원적으로 악취를 제거하므로 추가적인 설비를 요하지 않아 경제적 및 효율적으로 악취를 제거할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 배양이 용이하고, 식물병 방제에 효과가 있으며, 단백질 등 유기질 분해 효과가 있어, 기존에 알려진 바실러스 균주들에 비해 다양하고 복합적인 기능을 가지면서도 인축과 환경에 안전하므로 유용한 농업미생물제로 널리 활용될 수 있다.

Description

다기능 신규 균주 바실러스 서브틸리스 UB-156{A novel Bacillus subtilis UB-156 for multi function}

본 발명은 친환경 유기농 작물재배 토양에서 분리한 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바실러스 서브틸리스 UB-156 및 이를 이용한 악취제거용 조성물, 식물병 방제용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 및 미생물 비료에 관한 것이다.

축산업에 있어서 가축분뇨에서 발생되는 악취는 지역 주민들의 불쾌감을 초래하며 많은 민원을 발생시킨다. 이러한 악취는 분뇨가 혐기 조건에서 분해되는 과정에서 발생하는 휘발성 물질 및 그 중간생성물이 대기로 방출되어 사람의 후각을 자극함으로서 발생한다. 분뇨에서 유래한 악취는 축산농장 작업자의 건강뿐 아니라, 사육되는 가축의 건강 및 생산성에도 악영향을 미친다.

또한, 가축으로부터 배출되는 질소의 50% 이상은 소변 내 요소의 형태로 배출되며 배출된 요소는 우레아제 효소에 의해 암모니아로 전환된다. 따라서, 분뇨 유래 암모니아의 발생을 감소시키기 위해서는 우레아제 효소를 억제해야 한다. 이처럼 분뇨는 악취의 근원이며, 분뇨를 통한 질소의 배설을 감소시키기 위해서는 단백질 소화율을 개선할 수 있는 효소제나 미생물제제, 효모제 및 생균제를 이용하거나, 또는 단백질 수준이 낮은 사료를 급이하거나 또는 부족한 아미노산을 추가 급여함으로써 아미노산의 이용률을 향상시키고 질소의 배설량을 감소시켜야 한다. 이외에도 급이 사료에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으며, 특히, 보조 사료로서의 생균제 급여는 축산업뿐만 아니라 축산농장 환경개선에도 많은 영향을 미친다.

또한, 생균제 급여에 따른 가축의 장내 세균 및 환경 개선으로 암모니아 발생량을 저감하고자 하는 연구들이 다양하게 진행되어 왔으며, 생균제 급여 및 살포에 따른 암모니아 저감 효과에 관한 연구는 꾸준히 진행되고 있다. 이와 관련하여 비육돈을 대상으로 한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 알루미늄 실리케이트(aluminum silicate) 및 유장가루가 함유된 제제를 사료에 첨가한 결과, 처리구의 슬러리에서 발생된 암모니아가 감소되는 것으로 알려져 있다.

또한, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 배양액을 육계사료에 1~2% 첨가할 경우 약 36~72%의 암모니아 가스가 감소되었으며(Santoso et al., 1999), 유산균과 Bacillus 제제가 함유된 생균제를 급여한 결과 계분이나 계사의 바닥으로부터의 암모니아 발생이 감소되는 것이 보고된 바 있다.

또한, 관련하여 대한민국 등록특허 제10-1465093호에는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NAAS-1(KACC 91751P) 균주 배양액을 돈분에 살포하여 H₂S 가스 농도를 감소시키는 기술이 개시되어 있다.

또한, 축산 악취의 저감을 위해 개발되고 있는 제품들은 암모니아 저감에 효과적인 제품이 주를 이루고 있다, 보다 실질적으로 향후 축산환경 문제의 해결을 위해 복합 취기의 저감에 효과적인 제품의 개발이 필요하다. 더욱이, 친환경농업의 확산과 화학 제제의 문제점이 대두됨에 따라 보다 환경 친화적인 가축사육과 환경개선에 대한 요구가 절실하다.

한편, 최근에는 친환경농업 육성정책에 따라 화학비료 및 농약절감 녹색기술 소재로 미생물이 부각되고 있으며 축산사료 효율증진과 분뇨처리 및 환경개선제로도 미생물의 활용이 증대되고 있는 추세이다. 하지만, 항균 활성 및 영양 제공 등의 능력을 복합적으로 제공하여 상업적으로 활용될 수 있을 만큼 우수한 복합적 효과를 가지는 미생물에 대하여는 아직까지 연구 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 유용 미생물을 이용한 생물적 방제 및 미생물 비료 분야에 대한 연구를 진행하기 위하여 다양한 자원으로부터 미생물을 수집하여 동정하던 중, 신규 균주인 바실러스 서브틸리스 UB-156이 악취 제거 효율이 높으면서도, 우수한 항균 활성 및 단백질 분해 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 암모니아 가스를 제거하여 주는 균주를 배양 분리하고 이 균주들을 이용하여 축산 분뇨에서 발생하는 암모니아 가스를 신속하게 제거할 수 있는 미생물제제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 가축사육시설 및 가축분뇨에서 발생되는 암모니아를 저감하는 바실러스 서브틸리스 UB-156 균주를 포함하는 미생물제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P)을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 충남 금산군 소재 유기농 재배 토양으로부터 분리하였다. 분리된 균주는 암모니아 저감 능력이 뛰어나며, 16s rDNA를 분석한 결과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주로 확인되었다. 상기 균주를 2017년 10월 16일에 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156 균주로 기탁하여 KACC 92196P로 기탁번호를 부여 받았다.

본 발명에서, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 돈사시설 및 가축분뇨에서 발생하는 악취물질 중 암모니아 성분에 대한 강력하고 신속한 저감 효능을 나타내는 균주이다. 이러한 암모니아는 가축의 소변에 포함된 요소의 분해, 소화가 불충분한 상태에서 배출된 분 내 단백질의 분해로 인해 발생하며(Kim et al., 2007). 신선한 돈분은 시간이 경과됨에 따라서 아미노산의 탈카르복실화가 진행되어 putrescine, cadaverine 및 암모니아를 발생하게 된다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 상기 과정에서 발생하는 암모니아를 신속하고 효과적으로 제거하는 활성이 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P)의 배양액을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 악취제거용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 악취제거용 조성물은 암모니아 악취 발생원에 살포한 후 30분 이내에 암모니아 농도를 89% 이상 저감할 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면, 암모니아 악취를 매우 신속하고 효율적으로 저감시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 악취제거용 조성물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액 이외에 악취 제거능이 있는 공지의 미생물, 예를 들면 바실러스속, 아세토박터 속 등에 속하는 미생물을 하나 이상 더 포함할 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서, 배양물은 특정 미생물을 배양 배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 특정 미생물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있으나, 미생물을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 배양물은 그 제형이 액체 또는 고체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 미생물제제는 고체 또는 액상의 형태일 수 있다. 상기 고체 형태의 미생물제제의 경우는 상기 미생물을 담체에 부착시킨 후 수분 함량이 0.1 내지 10 중량%가 되도록 건조시키고 비드 형태 제품화하거나, 분쇄하여 분말 형태로 제품화할 수 있다.

상기 고체 형태의 미생물제제는 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제의 경우 전분, 아미노산, 비타민 C, 비타민 E, 키토산 및 포도당을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 전분은 당 성분으로 인한 막 형성 방지를 위해 사용될 수 있다. 상기 전분은 10 내지 20 부피%의 양으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전분의 양이 많아질 경우 미생물이 희석되어 총 균수가 낮아진다. 비타민 C(아스코르빈산)의 pH 조절 및 비타민 용도로 사용될 수 있다. 상기 비타민 C는 0.1 내지 0.5 부피%의 양으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비타민 C는 과다 투여 시 pH를 떨어뜨려 균주의 성장과 활성에 영향을 미칠 수 있다.

상기 액상 형태의 미생물제제는 상기 미생물의 배양물을 혼합하고, 미생물을 안정화시키기 위해 포도당이나 글리세린을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 조성물 전체 중량대비 0.05 내지 1.5 중량부로 포함할 수 있으며, 바람직하게 1.0 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 균주가 0.05 중량부 미만인 경우, 악취제거용 조성물의 암모니아 악취 제거 효과가 미미할 수 있으며, 1.5 중량부를 초과하는 경우에는 암모니아 악취 제거 효과의 증가가 미미하여 경제적으로 바람직하지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물에서, 식물병은 스크레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)로 이루어진 군에서 선택된 병원균에 의해 발생될 수 있다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 균주의 안정적인 제형화를 목적으로, 수화제, 입제 또는 캡슐화의 형태로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물에 있어서, 상기 균주 또는 배양액을 식물병 방제용 조성물에 포함된 채로 공급될 수도 있고, 장기간 보존을 위해 별도로 보관하였다가 사용 직전에 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 균주를 장기간 보존하기 위해 별도로 공급되는 경우에는 글리세롤 저장용액에 -70℃ 이하로 보존하거나 -20 내지 -80℃에서 동결건조 보존하여 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 수화제는 균주를 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제 및 증량제/영양제를 첨가하여 혼합하여 제조할 수 있다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린 (dextrin), 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 입제는 균주를 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 첨가하여 제조할 수 있다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트 (bentonite), 탈크 (talc), 다이아라이트 (dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 입제는 미생물에 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것을 추가로 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 식물병 방제용 조성물은 식물의 뿌리 또는 그 주위의 토양에 적용하여 식물 병원균을 방제할 수 있다. 또한 본 발명의 식물병 방제용 조성물을 적용하는 방법으로는, 상기 균주의 배양액 또는 균주를 직접 도말(spreading), 살포(spraying), 침지(soaking)하거나, 상기 균주 배양액 또는 균주를 질석, 규조토, 펄라이트에 흡착시켜 산포하거나, 경작 예정지 관리 시에는 토양을 갈아엎는 중에 균주 배양액 또는 흡착시킨 균주를 섞는 방법을 이용할 수 있다. 이 밖에도 공지의 농약 투여법, 미생물 적용법 등이 이용될 수 있다.

상기 조성물의 적용은 식물의 뿌리나 이에 근접한 토양에 바실러스 서브틸리스 UB-156을 집중하여 살포하고, 미생물의 유효량은 경작지 면적(m²) 당 미생물의 수가 1 X 10⁷ 내지 5 X 10⁷ 농도로 살포되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 4 X 10⁷ 농도일 수 있다.

또한, 미생물의 적용은 조성물에 포함되는 미생물의 유효량이 밀리리터(㎖) 당 1 X 10⁶ 내지 1 X 10⁹ 마리의 미생물 농도로 희석한 용액을 방제 대상 식물의 뿌리에 직접 살포할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

상기 사료는 옥수수, 소맥, 밀, 대두, 콩 또는 쌀로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혼합물을 분쇄하여 얻어지는 분쇄물과 이들을 가공하는 과정에서 얻어지는 쌀겨, 밀겨, 보리겨와 같은 가공 부산물을 혼합하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 가축 사료에는 상기 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주가 사료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 0.3 중량% 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 미생물 제제가 0.01 중량% 미만 포함되는 경우 가축 사료의 악취 제거 효능이 미미할 수 있으며, 0.3 중량% 초과하는 경우 효과가 그 이하일 경우와 거의 동일하며 효과 대비 비경제적이다.

상기 가축 사료는 소, 돼지, 양, 염소 등의 포유류와 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류에 제공하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 가축 사료를 가축이 섭취하는 경우 가축 배설물의 냄새를 제거하거나 감소시키며 축분의 퇴비화를 촉진시키는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 비료를 제공한다.

본 발명에 따른 미생물 비료는 축산 폐수 또는 음식물 쓰레기에 상기 균주, 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 또는 건조물을 처리하여 고체 또는 액상 형태로 제조될 수 있고, 활성이 있는 상기 균주가 포함될 수 있으며, 상기 균주 이외에 종래의 기술을 응용할 수 있다.

상기 미생물 비료는 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하고 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 제조할 수 있다. 상기 담체로는 물, 셀라이트, 제올라이트, 펄라이트, 버미큘라이트, 피트모스, 탈크, 카올리나이트, 벤토나이트, 피그더스트, 피쉬더스트, 치큰더스트, 라이스더스트, 래이프더스트, 본더스트 및 카올린 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 균주는 상기 시판되는 담체를 이용하여 제형화가 가능하고, 제형화된 후에도 활성을 유지하므로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 단백질 분해용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 단백질을 포함하는 유기물 분해 능력이 높아 작물의 생장에 유리하게 작용한다. 이는 단백질성 유기물을 분해하여 식물이 이용가능한 질소원 및 탄소원을 제공하는 물질을 제공하므로 식물 생장에 도움을 준다. 따라서 본 발명은 상기 균주 및 그 배양액을 포함하는 단백질 분해용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 균주 자체 및 이의 배양액을 포함하는 조성물은 암모니아 악취 발생원에 살포한 후 30분 이내에 암모니아 농도를 89% 이상 저감할 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면, 암모니아 악취를 매우 신속하고 효율적으로 저감시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 균주 및 이의 배양액은 대상 식물이 생장하고 있는 환경(토양 등) 또는 성장 중인 식물의 표면에 기능을 나타내기에 적절한 양으로 살포하거나 대상 식물의 근권에 관주 처리함으로써 다양한 식물병을 생물학적으로 방제할 수 있고, 동시에 유기물을 분해하여 토양을 비옥하게 할 수 있다.

또한, 본 발명의 균주는 일반적인 세균 배양기에서 잘 자라고, 장기보존 및 제형화가 용이하다. 이처럼 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156 균주는 배양이 용이하고 적용이 쉬우면서 기존의 균주들보다 다양한 기능을 가지므로, 유용한 농업 미생물제로 개발되어 널리 활용할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 축산 분뇨에서 발생하는 암모니아 가스를 신속하게 제거할 수 있으며, 악취 유발물질을 분해하여 근원적으로 악취를 제거하므로 추가적인 설비를 요하지 않아 경제적 및 효율적으로 악취를 제거할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주는 배양이 용이하고, 식물병 방제에 효과가 있으며, 단백질 등 유기질 분해 효과가 있어, 기존에 알려진 바실러스 균주들에 비해 다양하고 복합적인 기능을 가지면서도 인축과 환경에 안전하므로 유용한 농업미생물제로 널리 활용될 수 있다.

도 1은 TSA 배지에 형성된 U-156 균주의 콜로니 형태를 촬영한 사진이다.
도 2는 탈지 유유를 포함한 TSA 배지에서 U-156 균주(맨 아래쪽)가 갖는 단백질 분해능력을 촬영한 사진이다.
도 3은 U-156 균주와 스크레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum) 병원균을 PDA 배지 상에서 대치배양한 결과를 촬영한 사진이다.
도 4는 충북 괴산면 불정면 소재 불정농협 자원순환센터에서 진행한 U-156 균주의 암모니아 저감능력 실험을 도시한 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 바실러스 서브틸리스 UB-156의 분리 및 동정

1-1. 토양 시료 희석 및 배지 도말

유기물 분해 능력과 항균력이 있는 미생물을 분리하기 위하여 충남 금산군 추부면 소재 친환경 유기농 토양 시료를 채취하여 분석을 하였다

토양 100g을 멸균 증류수 1리터가 들어있는 삼각 플라스크에 넣고 Shaking incubater에서 150rpm으로 20분간 처리를 하였다. 20분 경과 후, 삼각플라스크를 꺼내 무균대(clean bench)로 옮겨 연속 희석(serial dilution)을 실시하였다.

연속 희석은 토양 시료가 들어있는 1리터 삼각 플라스크에서 멸균된 마이크로 파이펫을 이용하여 1,000㎕를 취하고, 9ml 멸균수가 들어있는 캡 튜브(cap tube)로 옮긴 후, 볼텍스 믹서(voltex mixer)를 이용해 균일하게 혼합하고, 이를 다시 1ml 용량으로 채취하여 동일 과정을 반복하면서 시료 내에 있는 미생물의 밀도를 점차적으로 희석을 시키는 방식으로 진행하였다. 상기 과정을 거쳐 최종적으로 미생물의 밀도가 1×10⁷, 1×10⁸, 및 1×10⁹CFU 농도가 되도록 연속 희석을 실시하였다. 희석된 미생물은 캡 튜브에 담아 보관하였다.

1-2. 미생물 관찰 및 순수분리

상기와 같이 연속 희석된 미생물이 보관된 캡 튜브에서 시료 30㎕를 취하여 미리 준비한 TSA(Tryptic soy agar) 배지에 로딩(loading) 한 후, 멸균 스프레더로 배지 표면에 골고루 펴준 후, 30℃ 인큐베이터에서 48시간 배양하여 형성된 콜로니를 관찰하였다.

콜로니의 모양이 일정하지 않고, 찌그러지고 주름진 것을 골라서 새로운 TSA배지에 백금선을 이용해 스트리킹(Streaking)하여 UB-156 균주를 순수 분리하였다(도 1).

실시예 2. 미생물의 특성 관찰

2-1. UB-156 균주 균주의 단백질 분리 능력 측정

순수 분리된 미생물을 1%의 탈지 우유(skim milk)가 들어있는 TSA 배지에서 배양하여 미생물 콜로니 주변에 형성된 클리어 존(clear zone)의 크기를 측정하여 단백질 분해 능력을 확인하였다.

그 결과, 도 2를 참조하면, 탈지 유유를 포함한 TSA 배지에서 단백질 분해 클리어 존(Clear zone)이 뚜렷하게 형성되었으며(맨 아래쪽 균주), 형성된 클리어 존이 다른 대조군에 비해 하고 상대적으로 큰 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 UB-156 균주가 매우 우수한 단백질 분해 능력이 있음을 확인할 수 있었다.

2-2. UB-156 균주의 항균력 측정

유기농 재배시 문제가 되는 고추역병, 시들음병, 잘록병에 대한 병원균인 스크레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)를 농업 현장에서 분리하여, 실시예 1에서 분리된 본 발명의 UB-156 균주가 갖는 항균력을 측정하였다.

항균력 측정은 본 발명의 분리균주를 PDA 배지 상에서 스크레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)의 4종 병원균과 대치배양 하여 병원성 곰팡이의 성장을 억제하는지 여부를 관찰하여 검증하였다.

그 결과, 본 발명의 UB-156 균주는 스크레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)의 4종 병원균의 성장을 저지하는 것으로 관찰되었으며, 유기농 재배시 문제가 되는 병원균에 대해 우수한 항균 활성을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

실시예 3. UB-156 균주의 암모니아 분해 효과 검증

본 발명의 UB-156 균주의 암모니아 분해 효과에 대한 시험은 충북 괴산면 불정면 소재 불정농협 자원순환센터에서 진행하였다.

불정농협 자원순환센터에서는 매일 120톤의 가축분뇨를 처리하고 있으며, 자원순환센터에서 발생하는 암모니아 농도는 암모니아 측정용 검지관으로 측정하였다. 그 결과, 평소 불정농협 자원순환센터의 암모니아 농도는 470ppm으로 측정되었다.

본 발명의 UB-156 균주가 갖는 악취저감효과를 측정하기 위해, 퇴비장에서 에스컬레이터가 설치된 곳의 천장에 팬을 설치하여 바실러스 미생물 배양액을 2배 희석한 용액을 3분씩 30분 간격으로 살포하고, 암모니아 측정용 검지관으로 암모니아 농도를 측정하였다.

최초 1회 살포 후 30분이 경과한 시점에 같은 장소에서 암모니아 냄새를 측정한 결과, 암모니아 농도가 50ppm으로 측정되어, 대략 89.4%의 암모니아가 제거되었음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

이후 주기적으로 바실러스 미생물 배양액을 퇴비장에 살포한 후, 13일이 경과하여 같은 장소에서 암모니아 농도를 측정한 결과, 암모니아 농도가 21ppm으로 측정되어, 본 발명의 UB-156 균주가 95.5%의 암모니아를 제거하여 축산 악취 제거에 효과적임을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 균주 동정

미생물에 대한 동정을 위하여 16S rRNA sequenging을 실시하였다. 분리균주의 16S ribosomal RNA sequencing을 분석하기 위하여 genomic DNA를 추출하여 정제한 후 fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')과 rP2(5‘-ACGGCTACCTTGTTACGAC-3') 프라이머를 사용하였다. PCR은 94℃에서 30초 denaturation, 58℃에서 30초 annealing, 및 68℃에서 1분 extention 조건에서 30 cycle 반복하여 PCR 반응을 통해 증폭하였다. 증폭된 16S rRNA 유전자를 pGEM-T easy vector에 클로닝한 후, 클로닝 된 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다.

분석은 BLASTN 프로그램을 이용하여 NCBI database의 16S rRNA sequencing과 비교하여 동정하였으며, 염기서열 유사도 및 cluster method에 의한 계통도는 vector NTI8을 이용하여 작성하였다.

분석결과 분리한 미생물은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)와 99%의 유사성을 가지고 있는 균주로 확인되었다.

본 발명자들은 우수한 악취저감 및 식물병 방제 활성을 갖는 본 발명의 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156으로 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 기탁번호(KACC 92196P)로 기탁하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC92196P

20171123

Claims

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P).
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P)의 배양액.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 악취제거용 조성물.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 식물병은 스크레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)로 이루어진 군에서 선택된 균에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) UB-156(기탁번호 KACC 92196P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 비료.